JP4960865B2 - 脱髄に関連する状態の処置 - Google Patents

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Description

（技術分野）
本発明は、神経生物学、神経学および薬理学に関する。より詳細には、本発明は、Ｓｐ３５アンタゴニストの投与により、脱髄および髄鞘形成不全（ｄｙｓｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ）疾患、例えば多発性硬化症を治療する方法に関する。
（発明の背景）
神経系の疾患の多くは、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン分解（ＣＰＭ）、ウォラー変性ならびに一部の遺伝性疾患、例えば副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病およびペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＺ）をはじめとする、脱髄および髄鞘形成不全に関連する。これらの疾患の中でもＭＳは最も一般的であり、世界中で約２５０万人が罹患している。
ＭＳは、一般に、神経障害の再発−弛張パターンで始まり、その後、神経損傷を増しながら慢性期へと進行する。ＭＳは、慢性病変に局在したミエリン、乏突起神経膠細胞および軸索の破壊に関連する。ＭＳにおいて観察される脱髄は、必ずしも永続性とは限らず、この疾患の初期における髄鞘再形成は文献に記載されている。ニューロンの髄鞘再形成には乏突起神経膠細胞が必要である。
コルチコステロイドおよび免疫修飾物質、例えばインターフェロンベータの使用をはじめとする様々な疾患修飾治療をＭＳに利用することができる。加えて、ＭＳにおける乏突起神経膠細胞および髄鞘形成の中心的役割のため、乏突起神経膠細胞数を増加させるまたは髄鞘形成を増進する治療法を開発する努力がなされてきた。例えば、Ｃｏｈｅｎらの米国特許第５，５７４，００９号（特許文献１）；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６５−７３，２００２（非特許文献１）参照。しかし、ＭＳのためのさらなる治療法を考案する必要に依然として迫られている。
米国特許第５，５７４，００９号明細書 Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６５−７３，２００２
発明の簡単な要約
本発明は、Ｓｐ３５（Ｓｐ３５は、文献ではＬＩＮＧＯ−１およびＬＲＲＮ６とも呼ばれている）が乏突起神経膠細胞内で発現され、乏突起神経膠細胞の分化、生存および軸索髄鞘形成を負に調節するという発見に基づく。さらに、Ｓｐ３５の一定のアンタゴニストは、乏突起神経膠細胞の生存、増殖および分化ならびにニューロンの髄鞘形成を促進する。これらの発見を基に、本発明は、一般に、Ｓｐ３５アンタゴニストの投与により脱髄および髄鞘形成不全に関連する状態（例えば、多発性硬化症）を治療する方法に関する。
特定の実施形態において、本発明は、哺乳動物における乏突起神経膠細胞の増殖、分化および生存を促進するための方法を含み、この方法は、治療有効量のＳｐ３５アンタゴニストを投与することを含む。
他の実施形態において、本発明は、哺乳動物におけるニューロンの髄鞘形成を促進するための方法を含み、この方法は、治療有効量のＳｐ３５アンタゴニストを投与することを
含む。特定の実施形態において、前記哺乳動物は、脱髄および髄鞘形成不全に関連する疾患、障害、損傷または状態を有すると診断されたものである。一部の実施形態において、前記疾患、障害、損傷または状態は、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン分解（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）、ウォラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、照射後損傷、化学療法の神経合併症、卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症、ビタミンＥ単独欠乏性症候群、ＡＲ、バッセン・コーンツバイク症候群、マルキアファーバ・ビニャーミ症候群、変染色性白質ジストロフィー、三叉神経痛およびベル麻痺から成る群より選択される。
加えて、本発明は、乏突起神経膠細胞またはミエリンの破壊に関連する哺乳動物における疾患、障害または損傷を治療する方法を含み、この方法は、（ａ）組換えＳｐ３５アンタゴニストを発現する培養宿主細胞を提供すること；および（ｂ）前記哺乳動物における神経系の疾患、障害または損傷部位またはその付近に前記宿主細胞を導入することを含む。一部の実施形態において、前記疾患、障害または損傷は、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン分解（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）およびウォラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、照射後損傷、化学療法の神経合併症、卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症、ビタミンＥ単独欠乏性症候群、ＡＲ、バッセン・コーンツバイク症候群、マルキアファーバ・ビニャーミ症候群、変染色性白質ジストロフィー、三叉神経痛およびベル麻痺から成る群より選択される。一部の実施形態において、前記培養宿主細胞は、治療すべき哺乳動物に由来するものである。
本発明のさらなる実施形態は、乏突起神経膠細胞またはミエリンの破壊に関連する疾患、障害または損傷をインビボ遺伝子療法により治療する方法を含み、この方法は、Ｓｐ３５アンタゴニストをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを哺乳動物の疾患、障害または損傷部位またはその付近に投与して、その損傷部位またはその付近におけるニューロンによる軸索伸長の阻害を低減するために充分な量でＳｐ３５アンタゴニストをその哺乳動物におけるヌクレオチド配列から発現させることを含む。特定の実施形態において、前記ベクターは、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよび単純疱疹ウイルスベクターから成る群より選択されるウイルスベクターである。一部の実施形態において、前記疾患、障害または損傷は、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン分解（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）およびウォラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、照射後損傷、化学療法の神経合併症、卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症、ビタミンＥ単独欠乏性症候群、ＡＲ、バッセン・コーンツバイク症候群、マルキアファーバ・ビニャーミ症候群、変染色性白質ジストロフィー、三叉神経痛およびベル麻痺から成る群より選択される。一部の実施形態において、前記ベクターは、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与および皮下投与から成る群より選択される経路により投与される。
上記方法の様々な実施形態において、Ｓｐ３５アンタゴニストは、乏突起神経膠細胞の生存、増殖および分化ならびにニューロンの髄鞘形成を負に調節するＳｐ３５の能力に干渉するいずれの分子であってもよい。特定の実施形態において、前記Ｓｐ３５アンタゴニストは、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体およびＳｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ干渉）から成る群より選択される。
一定の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠くＳｐ３５ポリペプチドのフラグメント、変異体またはそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、（ｉ）Ｓｐ３５ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン、（ｉｉ）Ｓｐ３５塩基性領域Ｃ末端からＬＲＲまでのドメイン、および（ｉｉｉ）Ｓｐ３５免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含むポリペプチドを含む。一部の実施形態において、前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、Ｓｐ３５ Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５ ＬＲＲドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く。一部の実施形態において、前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、Ｓｐ３５ ＬＲＲドメインを含み、Ｓｐ３５ Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠く。一部の実施形態において、前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基３４〜５３２を含む。
一部の実施形態において、前記Ｓｐ３５アンタゴニストは、ボーラス注射または慢性注入によって投与される。一部の実施形態において、前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、中枢神経系に直接投与される。一部の実施形態において、前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、ＭＳの慢性病変に直接投与される。
一部の実施形態において、前記Ｓｐ３５アンタゴニストは、非Ｓｐ３５部分を含む融合ポリペプチドである。一部の実施形態において、前記非Ｓｐ３５部分は、抗体Ｉｇ部分、血清アルブミン部分、ターゲッティング部分、レポーター部分および精製助長性部分（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）から成る群より選択される。一部の実施形態において、抗体Ｉｇ部分は、ヒンジおよびＦｃ部分である。
一部の実施形態において、本発明のポリペプチドおよび抗体は、ポリマーにコンジュゲートしている。一部の実施形態において、前記ポリマーは、ポリアルキレングリコール、糖ポリマーおよびポリペプチドから成る群より選択される。一部の実施形態において、前記ポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。一部の実施形態において、本発明のポリペプチドおよび抗体は、１、２、３または４つのポリマーにコンジュゲートしている。一部の実施形態において、前記ポリマーの全分子量は、５，０００Ｄａから１００，０００Ｄａである。
（発明の詳細な説明）
定義
別様に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。矛盾する場合、それらの定義を含む本出願が支配する。文脈により別様に必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を包含し、複数形の用語は、その単数形を包含するものとする。本明細書で言及するすべての出版物、特許および他の参照は、個々の出版物または特許出願のそれぞれが参照として援用されると具体的に、個々に示されているかのように、あらゆる目的で、それら全文、参照として援用される。
本明細書で説明するものと同様または同等の方法および材料は、本発明の実施および検査において使用することができるが、適する方法および材料を下で説明する。材料、方法
および実施例は、単に実例となるものであり、限定するためのものではない。本発明の他の特徴および利点は、この詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになろう。
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義を提供する。
用語「ａ」または「ａｎ」実体は、その実体の１つまたはそれ以上を指し、例えば、「（ａｎ）免疫グロブリン分子」は、１つまたはそれ以上の免疫グロブリン分子を表すと理解する。故に、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたはそれ以上」および「少なくとも１つ」は、ここでは同義で用いることができる。
本明細書および特許請求の範囲全体を通して、語「含む（現在形）（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（三人称現在形）（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（進行形）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの語尾変化は、列挙されているあらゆる完全体または完全体の群を包含し、他の完全体または完全体の群を一切排除しないことを示す。
本明細書で用いる場合、「治療有効量」は、必要な投薬量で必要な期間の間、所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。治療結果は、例えば、症状の軽減、生存延長、可動性向上などであり得る。治療結果が「治癒」である必要はない。
本明細書で用いる場合、「予防有効量」は、必要な投薬量で必要な期間の間、所望の予防結果を達成するために有効な量を指す。一般に、予防用量は、疾患の前またはより早期に被験者において使用されるので、予防有効量は、治療有効量より少ないであろう。
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」は、完全長ｃＤＮＡ配列（未翻訳５’および３’配列、コーディング配列を含む）ならびにその核酸配列のフラグメント、エピトープ、ドメインおよび変異体、のヌクレオチド配列を含む場合がある。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシヌクレオチドから成る場合があり、これは未修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであることもあり、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであることもある。例えば、ポリヌクレオチドは、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ；１本鎖領域と２本鎖領域の混合体であるＤＮＡ；１本鎖および２本鎖ＲＮＡ；１本鎖領域と２本鎖領域の混合体であるＲＮＡ；ＤＮＡおよびＲＮＡ（これらは、１本鎖、もしくはより一般的には２本鎖、または１本鎖領域と２本鎖領域の混合体であり得る）を含むハイブリッド分子から成る場合がある。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む３本鎖領域から成る場合がある。ポリヌクレオチドは、１つもしくはそれ以上の修飾塩基、または安定性もしくは他の理由のために修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含有する場合もある。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基および普通でない塩基、例えばイノシンが挙げられる。様々な修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに対して行うことができ、従って、「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的にまたは代謝により修飾された形態を包含する。
本発明において、ポリペプチドは、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチド同配体、によって互いに連結したアミノ酸から成る場合があり、２０種の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸（例えば、非天然アミノ酸）を含有することがある。本発明のポリペプチドは、天然プロセス、例えば後翻訳プロセッシングによって、または当該技術分野では周知の化学修飾法によって、修飾することができる。こうした修飾は、基本テキストおよびより詳細な研究書ならびに豊富な研究文献に充分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端をはじめとする、ポリペプチド内のいずれの場所においても行うことができる。所定のポリペプチド内の幾つかの部位に、同じタイプの修飾が、同じまたは様々な程度で存在することがあることは、理解されるであろう。所定のポリペプチドが、多数のタイプの修飾を含むこともある。
ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として、分枝状である場合もあり、また環状であり、分枝を有するまたは有さない場合もある。環状、分枝状および分枝環状ポリペプチドは、後翻訳天然プロセスの結果、生じることがあり、または合成方法により製造することができる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化、蛋白質分解性プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、転移ＲＮＡにより媒介されるアミノ酸の蛋白質への付加、例えばアルギニル化、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８−６２（１９９２）参照）。
本発明のＳｐ３５アンタゴニストに言及する際の用語「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」および「類似体」は、Ｓｐ３５活性を阻害する少なくとも何らかの能力を保有するあらゆるアンタゴニスト分子を包含する。本明細書に記載する場合のＳｐ３５アンタゴニストは、Ｓｐ３５アンタゴニストがその機能をなお果たす限り、フラグメント、変異体または誘導体分子を制限なく包含する。本発明の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、Ｓｐ３５蛋白質分解性フラグメント、欠失フラグメント、および特に、動物に送達されたとき、より容易に作用部位に到達するフラグメントを包含し得る。さらに、ポリペプチドフラグメントは、線状および三次元エピトープをはじめとする、天然ポリペプチドの抗原性または免疫原性エピトープを含む、ポリペプチドのあらゆる部分を包含する。本発明の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、上に記載したようなフラグメントを含む変異体Ｓｐ３５領域を含むことができ、ならびにアミノ酸置換、欠失または挿入のためにアミノ酸配列が変更されたポリペプチドも含むことができる。変異体、例えば、対立遺伝子変異体は、自然に発生し得る。「対立遺伝子変異体」とは、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子の所期の代替形態である。Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）参照。非天然変異体は、当該技術分野では公知の突然変異誘発法を用いて産生させることができる。可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含むことがある。本発明のＳｐ３５アンタゴニストは、誘導体分子も包含し得る。例えば、本発明の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、天然ポリペプチドにおいては見出せない追加の特徴を示すように改変されたＳｐ３５領域を含むことがある。例としては、融合蛋白質および蛋白質コンジュゲートが挙げられる。
本発明において、「ポリペプチドフラグメント」は、Ｓｐ３５ポリペプチドの短いアミノ酸配列を指す。蛋白質フラグメントは、「独立している」場合もあり、またはそのフラグメントが領域の一部を形成するそれより大きなポリペプチドの中に含まれている場合もある。本発明のポリペプチドフラグメントの代表例としては、例えば、長さで約５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約４０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約６０個のアミノ酸、約７０個のアミノ酸、約８０個のアミノ酸、約９０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸を含むフラグ
メントが挙げられる。
抗体または免疫グロブリン。１つの実施形態において、本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５アンタゴニストは、「抗体」もしくは「免疫グロブリン」分子またはその免疫特異的フラグメント、例えば、天然抗体もしくは免疫グロブリン分子、または抗体分子と同様に抗原に結合する設計製作抗体分子もしくはフラグメントである。用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書では同義で用いる。抗体または免疫グロブリンは、重鎖（Ｈ鎖）の可変ドメインを少なくとも含み、通常は、Ｈ鎖および軽鎖（Ｌ鎖）の可変ドメインを少なくとも含む。脊椎動物系における基本免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）参照。
下でさらに詳細に論じるように、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別することができる、ポリペプチドの５つの大まかなクラスを含む。５つのクラスすべてが、明確に本発明の範囲内であり、以下の論議は、一般に、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関するものとなる。ＩｇＧに関して言えば、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一のＬ鎖ポリペプチド、および分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一のＨ鎖ポリペプチドを含む。一般に、これら４本の鎖は、ジスルフィド結合によって「Ｙ」構造に連結されており、この構造ではＬ鎖がＨ鎖のブラケットになっており、それはその「Ｙ」の口状部で始まって可変領域まで続く。
Ｌ鎖とＨ鎖の両方が、構造的相同領域と機能的相同領域に分けられる。用語「定常的」および「可変的」は、機能的に用いる。これに関して、Ｌ鎖部分の可変ドメイン（ＶＬ）とＨ鎖部分の可変ドメイン（ＶＨ）の両方が抗体認識および特異性を決めることは、理解されるであろう。逆に、Ｌ鎖の定常ドメイン（ＣＬ）およびＨ鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）は、生物学的特性、例えば、分泌、経胎盤移動度、Ｆｃ受容体結合、補体結合などを与える。従来的には、定常領域ドメインの番号付けは、抗原結合部位または抗体のアミノ末端から遠位になるほど大きくなる。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端に定常領域があり、実際、ＣＨ３およびＣＬドメインは、それぞれＨ鎖およびＬ鎖のカルボキシ末端を含む。
Ｌ鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかとして分類される。各Ｈ鎖クラスは、カッパまたはラムダ、いずれかのＬ鎖と結合し得る。一般に、ＬおよびＨ鎖は、互いに共有結合しており、ならびにこれら２本のＨ鎖の「尾」部は、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子操作宿主細胞のいずれかにより産生された場合、共有結合性ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合している。Ｈ鎖におけるアミノ酸配列は、Ｙ構造のフォーク状末端のＮ末端から、各鎖の底部のＣ末端へと進む。Ｈ鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）と分類され、それらの中に幾つかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）があることは、当業者には理解されるであろう。この鎖の特性によって、抗体の「クラス」が、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＥと決められる。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などは、よく特性付けされており、ならびに機能的分化をもたらすことが知られている。これらのクラスおよびアイソタイプの各々の修飾バージョンは、本開示に鑑みて当業者には容易に見分けることができ、従って、本発明の範囲内である。
上に示したように、可変領域により、抗体は抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することができる。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインが協力して可変領域を形成し、その可変領域が三次元抗原結合部位を規定する。この４次抗体構
造が、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬ鎖の各々にある３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって規定される。一部の例、例えば、ラクダ科の種に由来する、またはラクダ科の動物の免疫グロブリンを基に設計製作された一定の免疫グロブリン分子の場合、完全免疫グロブリン分子は、Ｈ鎖のみから成り、Ｌ鎖を有さないことがある。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８（１９９３）参照。
天然抗体では、抗体が水性環境でその三次元構造を呈するように、各抗原結合ドメイン内に存在する６つの「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」は、その抗原結合ドメインを形成するように特異的に配置されているアミノ酸の短い非隣接配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる、抗原結合ドメイン内のアミノ酸の残りは、分子間可変性をあまり示さない。フレームワーク領域は、主としてβシート配座をとり、ＣＤＲは、そのβシート構造に接続し、場合によってはそのβシート構造の一部を成すループを形成する。従って、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によって正しい配向でＣＤＲを位置決めする手だてとなる足場を形成する機能を果たす。位置決めされたＣＤＲにより形成された抗原結合ドメインによって、免疫反応性抗原上のエピトープに対する表面相補性が規定される。この相補性表面は、抗体のその同源エピトープへの非共有結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域をそれぞれ含むアミノ酸は、厳密に定義されているので、通常の当業者は、いずれかの所定のＨまたはＬ鎖可変領域についても容易に同定することができる（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，」Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３） ；およびＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）参照。これらは、それら全文、本明細書に参照として援用される）。
しかし、ラクダ科の種では、ＶＨＨと呼ばれるＨ鎖可変領域が全ＣＤＲを形成する。ラクダ科動物ＶＨＨ可変領域と従来の抗体に由来するもの（ＶＨ）の間の主な違いとしては、（ａ）ＶＨのＬ鎖接触表面における、ＶＨＨにおける対応する領域と比較して疎水性の高いアミノ酸、（ｂ）ＶＨＨにおける、より長いＣＤＲ３、（ｃ）ＶＨＨにおけるＣＤＲ１とＣＤＲ３の間のジスルフィド結合の頻繁な出現が挙げられる。
１つの実施形態において、本発明の抗原結合分子は、抗体分子の少なくとも１つのＨまたはＬ鎖ＣＤＲを含む。もう１つの実施形態において、本発明の抗原結合分子は、１つまたはそれ以上の抗体分子からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。もう１つの実施形態において、本発明の抗原結合分子は、１つまたはそれ以上の抗体分子からの少なくとも３つのＣＤＲを含む。もう１つの実施形態において、本発明の抗原結合分子は、１つまたはそれ以上の抗体分子からの少なくとも４つのＣＤＲを含む。もう１つの実施形態において、本発明の抗原結合分子は、１つまたはそれ以上の抗体分子からの少なくとも５つのＣＤＲを含む。もう１つの実施形態において、本発明の抗原結合分子は、１つまたはそれ以上の抗体分子からの少なくとも６つのＣＤＲを含む。本抗原結合分子に含めることができる少なくとも１つのＣＤＲを含む具体例としての抗体分子は、当該技術分野では公知であり、具体例としての分子を本明細書に記載する。
本発明の方法において使用するための抗体またはその免疫特異的フラグメントとしては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体またはキメラ抗体、１本鎖抗体、エピトープ結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリによって産生されたフラグメント、ならびに抗イデオタイプ（抗Ｉ
ｄ）抗体（例えば、本明細書に開示する結合分子に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は、当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子のいずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであってもよい。
１本鎖抗体をはじめとする抗体フラグメントは、可変領域を単独でまたは次のものの全体もしくは一部との組み合わせで含むことができる：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン。可変領域（複数を含む）とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせも含む抗原結合フラグメントも、本発明に包含される。本明細書に開示する診断および治療方法において使用するための抗体またはそれらの免疫特異的フラグメントは、鳥類および哺乳類をはじめとするあらゆる動物源からのものであり得る。好ましくは、これらの抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマまたはニワトリ抗体である。もう１つの実施形態において、可変領域は、起源がｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ（例えば、サメからのもの）であり得る。本明細書で用いる場合、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ならびに後で記載するような、および例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらにより米国特許第５，９３９，５９８号に記載されたような、ヒト免疫グロブリンライブラリから単離された抗体または１つもしくはそれ以上のヒト免疫グロブリンを遺伝子導入した、内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。
本明細書で用いる場合、用語「Ｈ鎖部分」は、免疫グロブリンＨ鎖に由来するアミノ酸配列を包含する。Ｈ鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上方、中央および／または下方ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはこれらの変異体もしくはフラグメントのうちの少なくとも１つを含む。例えば、本発明において使用するための結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含むことができる。もう１つの実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明において使用するための結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインのすべてまたは一部）を欠く場合がある。上述したように、これらのドメイン（例えば、Ｈ鎖部分）を、それらが天然免疫グロブリン分子からのアミノ酸配列において変化するように、修飾することができることは、通常の当業者には理解されるであろう。
本明細書に開示する治療方法において使用するための一定のＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはそれらの免疫特異的フラグメントにおいて、多量体の１つのポリペプチド鎖のＨ鎖部分は、その多量体の第二のポリペプチド鎖上のものと同一である。あるいは、本発明の方法において使用するためのＨ鎖部分含有単量体は、同一ではない。例えば、各単量体は、例えば二重特異性抗体を形成する異なるターゲット結合部位を含むことがある。
本明細書に開示する診断および治療方法において使用するための結合ポリペプチドのＨ鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来することがある。例えば、ポリペプチドのＨ鎖部分が、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメイン、およびＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むことがある。もう１つの例では、Ｈ鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、一部がＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含む場合がある。もう１つの例では、Ｈ鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、一部がＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジ領域
を含む場合がある。
本明細書で用いる場合、用語「Ｌ鎖部分」は、免疫グロブリンＬ鎖に由来するアミノ酸配列を包含する。好ましくは、Ｌ鎖部分は、ＶＬまたはＣＬドメインの少なくとも一方を含む。
免疫グロブリンに由来するポリペプチドの非天然変異体（例えば、免疫グロブリンＨ鎖部分またはＬ鎖部分）をコードされる単離された核酸分子は、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失が、コード化蛋白質に導入されるように、免疫グロブリンのヌクレオチド配列に１つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することによって産生させることができる。標準的な技法、例えば、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発により、突然変異を導入することができる。好ましくは、１つまたはそれ以上の非必須アミノ酸残基において保存的アミノ酸置換を行う。
本明細書に開示する治療方法において使用するための抗体またはそれらの免疫特異的フラグメントは、本発明のポリペプチドへのそれらの結合親和性に関しても記載または明記することができる。好ましい結合親和性としては、５ｘ１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５ｘ１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５ｘ１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５ｘ１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５ｘ１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５ｘ１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５ｘ１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５ｘ１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５ｘ１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５ｘ１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５ｘ１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５ｘ１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５ｘ１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５ｘ１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数、すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
本明細書に開示する治療方法において使用するための抗体またはそれらの免疫特異的フラグメントは、本明細書に記載するようなＳｐ３５のアンタゴニストとして作用する。例えば、本発明の方法において使用するための抗体は、Ｓｐ３５ポリペプチドの抑制活性を阻止または阻害するアンタゴニストとして機能することができる。
本明細書で用いる場合、用語「キメラ抗体」は、免疫活性領域または部位が第一の種から得られるか、第一の種に由来するものであり、定常領域（無傷であってもよいし、一部であってもよいし、または本発明に従って修飾されていてもよい）が第二の種から得られる、あらゆる抗体を意味すると考える。好ましい実施形態において、ターゲット結合領域または部位は、非ヒト供給源（例えば、マウスまたは霊長類）からのものであり、定常領域は、ヒトからのものである。
本明細書で用いる場合、用語「設計製作抗体（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、特異性がわかっている抗体からの１つまたはそれ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換によって、ならびに必要な場合には、部分的なフレームワーク領域の置換および配列変更によってＨ鎖およびＬ鎖のいずれかまたは両方における可変ドメインが改変されている抗体を指す。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはさらにサブクラスの抗体であってもよいが、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体、好ましくは異なる種からの抗体に由来するものであろうと考えられる。特異性がわかっている非ヒト抗体からの１つまたはそれ以上の「ドナー」ＣＤＲが、ヒトＨまたはＬ鎖フレームワーク領域にグラフトされている設計製作抗体を本明細書では「ヒト化抗体」と呼ぶ。ある可変ドメインの抗原結合能力を別のものに移すために、ドナー可変領域からの完全ＣＤＲですべてのＣＤＲを置換する必要がないこともある。むしろ、ターゲット結合部位の活性を維持するために必要な残基を移すことしか必要でないかもしれない。例えば米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号および同第６，１８０，３７０号に記載の説明からして、慣習的な実験を行うことによりまたは試行錯
誤試験により機能的な設計製作またはヒト化抗体を得ることは、充分に当業者の能力の範囲内であろう。
本明細書で用いる場合、用語「連結された」、「融合された」または「融合」は、同義で用いる。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含む何らかの手段による、２つまたはそれ以上の要素または成分の結合を指す。「フレーム内融合」は、２つまたはそれ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、元のＯＲＦの正しいリーディングフレームを残すような方式で結合させて、より長い連続ＯＲＦを形成することを指す。従って、結果として生じる組換え融合蛋白質は、元のＯＲＦによりコードされたポリペプチドに対応するセグメントを２つまたはそれ以上含有する単一の蛋白質である（前記セグメントは、通常、天然ではそのように連結されない）。このようにリーディングフレームは、融合セグメント全体にわたって連続的に作られるが、それらのセグメントが、例えばフレーム内リンカー配列によって物理的または空間的に分けられていることもある。
ポリペプチドに関連して、「線状（ｌｉｎｅａｒ）配列」または「配列」は、アミノ末端からカルボキシル末端に向かってのポリペプチド内のアミノ酸の順序であり、この場合、その配列内の互いに隣接する残基は、そのポリペプチドの１次構造内で隣接している。
本明細書で用いる場合、用語「発現」は、遺伝子が生化学物質、例えばＲＮＡまたはポリペプチドを生産するプロセスを指す。このプロセスは、遺伝子ノックダウンおよび一過性発現と安定発現の両方を含む（これらに限定されない）、細胞内での遺伝子の機能的存在のあらゆる発現を包含する。これには、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））または他の任意のＲＮＡ産物への遺伝子の転写、およびポリペプチド（複数を含む）へのそうしたｍＲＮＡの翻訳が挙げられるが、これらに限定されない。望まれる最終産物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質および任意の前駆体の産生を含む。
「被験者」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」とは、診断、予後または治療を望むあらゆる被験者、特に哺乳動物被験者を意味する。哺乳動物被験者としては、ヒト、家畜、農場の動物、動物園の動物、競技用動物、ペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、畜牛、；霊長類、例えば類人猿、サル、オランウータンおよびチンパンジー；イヌ科の動物、例えばイヌおよびオオカミ；ネコ科の動物、例えばネコ、ライオンおよびトラ；ウマ科の動物、例えばウマ、ロバおよびシマウマ；食用動物、例えば畜牛、ブタおよびヒツジ；有蹄動物、例えばシカおよびキリン；齧歯動物、例えばマウス、ラット、ハムスターおよびモルモット、などが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、哺乳動物は、ヒト被験者である。
用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、ｓｉＲＮＡによる遺伝子発現のサイレンシングまたは減少を指す。これは、動物および植物における配列特異的、後翻訳遺伝子サイレンシングプロセスであり、その２本鎖領域内のサイレンシングされた遺伝子の配列に相同であるｓｉＲＮＡによって開始される。前記遺伝子は、生物に内在性である場合もありまたは外在性である場合もあり、染色体に組み込まれて存在する場合もありまたはゲノムに組み込まれないトランスフェクションベクター内に存在する場合もある。遺伝子の発現は、完全にまたは部分的に阻害される。ＲＮＡｉは、ターゲットＲＮＡの機能を阻害すると考えることもでき、このターゲットＲＮＡの機能は、完全である場合もあり、または部分的である場合もある。
Ｓｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１／ＬＲＲＮ６）
本発明は、Ｓｐ３５のアンタゴニストが、乏突起神経膠細胞数を、それらの生存、増殖および分化を促進することによって増加させるという発見に基づく。加えて、本発明者らは、Ｓｐ３５のアンタゴニストが、ニューロンの髄鞘形成を促進することを発見した。理論により拘束されるつもりはないが、Ｓｐ３５アンタゴニストにより生じる髄鞘形成促進活性は、乏突起神経膠細胞増殖に対する効果とは別であるようである。
天然ヒトＳｐ３５は、６１４のアミノ酸から成るグリコシル化神経系特異的蛋白質（図１、配列番号２）である。このヒトＳｐ３５ポリペプチドは、１４のロイシンリッチリピートから成るＬＲＲドメイン（Ｎ末端キャップおよびＣ末端キャップを含む）、Ｉｇドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインを含有する（図２）。前記細胞質ドメインは、カノニカルチロシンリン酸化部位を含有する。加えて、天然Ｓｐ３５蛋白質は、シグナル配列、ＬＲＲＣＴとＩｇドメインの間の短い塩基性領域、およびＩｇドメインと細胞質ドメインの間の膜貫通領域を含有する（図２）。ヒトＳｐ３５遺伝子は、選択的翻訳開始（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｔａｒｔ）コドンを含有し、そのため６つの追加のアミノ酸（ＭＱＶＳＫＲ、配列番号５）が、Ｓｐ３５シグナル配列のＮ末端に存在す場合があり、またはしない場合がある。表１は、図１の配列に基づく、アミノ酸残基数によるＳｐ３５ドメインおよび他の領域のリストである。
Figure 0004960865
 Ｓｐ３５の組織分布および発生発現をヒトおよびラットにおいて研究した。Ｓｐ３５の生態は、実験動物（ラット）モデルにおいて研究した。ノーザンブロットおよび免疫−組織化学的染色法によって判定すると、ラットＳｐ３５の発現は、中枢神経系および脳乏突起神経膠細胞に局在している。ラットＳｐ３５ ｍＲＮＡ発現レベルは、発生調節されており、誕生直後に、すなわち生後約１日でピークに達する。ＲＴ−ＰＣＲによって判定すると、ラット脊髄離断損傷モデルではＳｐ３５が損傷部位でアップレギュレートされている。加えて、Ｓｐ３５は、Ｎｏｇｏ６６ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｎｏｇｏ受容体）と相互作用することが証明された。例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００８３２参照。しかし、Ｎｏｇｏ受容体−１は、乏突起神経膠細胞上では発現されず、乏突起神経膠細胞の生態に対するＳｐ３５の何らかの影響が、Ｎｏｇｏ受容体依存性経路によって発生するはずである。
Ｓｐ３５のアンタゴニストを使用する治療方法
本発明の１つの実施形態は、髄鞘形成不全または脱髄に関連する疾患、障害または損傷、例えば多発性硬化症、をそうした疾患に罹患している動物において治療するための方法を提供し、この方法は、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体およびＳｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドから成る群より選択されるＳｐ３５アンタゴニストの有効量を前記動物に投与することを含む、投与することから本質的に成る、または投与すること
から成る。
加えて、本発明は、哺乳動物におけるニューロンの髄鞘形成を促進するための方法に関し、この方法は、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体およびＳｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドから成る群より選択されるＳｐ３５アンタゴニストの治療有効量を投与することを含む、投与することから本質的に成る、または投与することから成る。
本発明のさらなる実施形態は、乏突起神経膠細胞死または分化不足に関連する疾患、障害または損傷、例えば多発性硬化症、ペリツェウス・メルツバッハー病または球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）、をそうした疾患に罹患している動物において治療するための方法を提供し、この方法は、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体およびＳｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドから成る群より選択されるＳｐ３５アンタゴニストの有効量を前記動物に投与することを含む、投与することから本質的に成る、または投与することから成る。
本発明のもう１つの態様は、哺乳動物における乏突起神経膠細胞の増殖、分化および生存を促進するための方法であり、この方法は、この方法は、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体およびＳｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドから成る群より選択されるＳｐ３５アンタゴニストの治療有効量を投与することを含む、投与することから本質的に成る、または投与することから成る。
本明細書に開示する治療方法において使用することができるＳｐ３５アンタゴニスト、例えば、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体およびＳｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドは、乏突起神経膠細胞によるニューロンの髄鞘形成を負に調節するＳｐ３５の能力を停止、低減、予防または阻害する治療薬として調製および使用することができる。加えて、本明細書に開示する治療方法において使用することができるＳｐ３５アンタゴニストは、乏突起神経膠細胞の分化、増殖および生存を負に調節するＳｐ３５の能力を停止、低減、予防または阻害する治療薬として調製および使用することができる。
本発明のさらなる実施形態は、乏突起神経膠細胞またはミエリンの分解に関連する疾患、障害または損傷を治療するために乏突起神経膠細胞の増殖または生存を誘導する方法を含み、この方法は、軸索伸長の阻害を低減し、髄鞘形成を促進するために充分な量で、哺乳動物の前記疾患、障害または損傷部位またはその付近に投与することを含む。
本発明の方法において、Ｓｐ３５アンタゴニストは、患者への可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、Ｓｐ３５抗体およびＳｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドの直接投与によって投与することができる。あるいは、前記Ｓｐ３５アンタゴニストは、特異的Ｓｐ３５アンタゴニストを生産する発現ベクターにより投与することができる。本発明の特定の実施形態において、Ｓｐ３５アンタゴニストは、（１）Ｓｐ３５アンタゴニストを発現する核酸、例えばベクターで、移植可能な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすること、および（２）形質転換された宿主細胞を哺乳動物の疾患、障害または損傷部位に移植することを含む治療方法で投与される。例えば、形質転換された宿主細胞をＭＳの慢性病変部位に移植することができる。本発明の一部の実施形態において、前記移植可能宿主細胞は、哺乳動物から取り出し、一時的に培養し、Ｓｐ３５アンタゴニストをコードする単離された核酸で形質転換またはトランスフェクトし、それを取り出したその同じ哺乳動物に移植して戻す。その細胞は、それを移植するその同じ部位から取り出すことができるが、その部位から取り出さねばならないわけではない。時にはエクスビボ遺伝子療法として知られているこうした実施形態は、Ｓｐ３５アンタゴニストを継続的に供給させ、限られた期間の間、作用部位に局在させることができる。
本発明の方法によって治療または改善することができる疾病または障害としては、哺乳動物ニューロンの髄鞘形成不全または脱髄に関連する疾患、障害または損傷が挙げられる。具体的には、ニューロンを包囲するミエリンが存在しないか、不完全であるか、適正に形成されていないか、劣化している疾患および障害である。こうした疾患としては、多発性硬化症（ＭＳ）（ＭＳの再発弛張、２次進行性および１次進行性形態を含む）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン分解（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）、ウォラー変性、視神経炎および横断脊髄炎が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の方法によって治療または改善することができる疾患または障害には、乏突起神経膠細胞死または乏突起神経膠細胞の増殖もしくは分化不足に関連する疾患、障害または損傷が挙げられる。こうした疾患としては、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン分解（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）およびウォラー変性が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の方法によって治療または改善することができる疾患または障害には、神経変性疾患または障害が挙げられる。こうした疾患としては、筋萎縮性側索硬化症、ハンチングトン病、アルツハイマー病およびパーキンソン病が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の方法によって治療または改善することができるさらなる疾患、障害または損傷の例としては、脊髄損傷、慢性脊髄障害または神経根障害、外傷性脳損傷、運動ニューロン疾患、軸索剪断、挫傷、麻痺、照射後損傷または化学療法の他の神経合併症、卒中、大裂孔（ｌａｒｇｅ ｌａｃｕｎｅｓ）、中から大血管閉塞、ロイコアリアオーシス（ｌｅｕｋｏａｒｉａｏｓｉｓ）、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症（単独欠乏性症候群、ＡＲ、バッセン・コーンツバイク症候群）、Ｂ１２、Ｂ６（ピリドキシン−ペラグラ）、チアミン、葉酸塩、ニコチン酸欠乏症、マルキアファーバ・ビニャーミ症候群、変染色性白質ジストロフィー、三叉神経痛、ベル麻痺、または軸索再生、髄鞘再形成または乏突起神経膠細胞の生存もしくは分化／増殖を必要とするであろうあらゆる神経損傷が挙げられる。
可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド
本発明のＳｐ３５アンタゴニストとしては、天然Ｓｐ３５の生物学的機能を阻止する、阻害するまたはそうした機能に干渉するポリペプチドが挙げられる。具体的には、本発明の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドのフラグメント、変異体またはそれらの誘導体を含む。上の表１には、Ｓｐ３５ポリペプチドの様々なドメインが記載されている。可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、Ｓｐ３５ポリペプチドの細胞内および膜貫通ドメインを欠く。例えば、一定の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、Ｓｐ３５の膜貫通ドメインを含むアミノ酸５５２〜５７６、および／またはＳｐ３５の細胞内ドメインを含むアミノ酸５７７〜６１４を欠く。加えて、一定の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、Ｓｐ３５ポリペプチドのＬＲＲドメイン、Ｉｇドメイン、塩基性領域および／または全細胞外ドメイン（配列番号２のアミノ酸３４から５３２に相当する）を含む。当業者には理解されるであろうが、Ｓｐ３５の全細胞外ドメインは、その細胞外ドメインポリペプチドのＣ末端またはＮ末端いずれかに追加のアミノ酸を含むこともあり、またはより少数のアミノ酸を含むこともある。それ故、本発明の方法において使用するための可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸４１から５２５；配列番号２のアミノ酸４０から５２６；配列番号２のアミノ酸３９から５２７；配列番号２のアミノ酸３８から５２８；配列番号２のアミノ酸３７から５２９；配列番号２のアミノ酸３６から５３０；配列
番号２のアミノ酸３５から５３１；配列番号２のアミノ酸３４から５３１；配列番号２のアミノ酸４６から５２０；配列番号２のアミノ酸４５から５２１；配列番号２のアミノ酸４４から５２２；配列番号２のアミノ酸４３から５２３；および配列番号２のアミノ酸４２から５２４を含む、これらから本質的に成る、またはこれらから成るＳｐ３５ポリペプチド、またはそうしたポリペプチドのフラグメント、変異体もしくは誘導体が挙げられるが、それに限定されない。Ｓｐ３５ポリペプチドアンタゴニストは、表１に記載したようなドメインの任意の組み合わせを包含し得る。
本発明の方法において使用するためのさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸１から３３；配列番号２のアミノ酸１から３５；配列番号２のアミノ酸３４から６４；配列番号２のアミノ酸３６から６４；配列番号２のアミノ酸６６から８９；配列番号２のアミノ酸９０から１１３；配列番号２のアミノ酸１１４から１３７；配列番号２のアミノ酸１３８から１６１；配列番号２のアミノ酸１６２から１８５；配列番号２のアミノ酸１８６から２０９；配列番号２のアミノ酸２１０から２３３；配列番号２のアミノ酸２３４から２５７；配列番号２のアミノ酸２５８から２８１；配列番号２のアミノ酸２８２から３０５；配列番号２のアミノ酸３０６から３２９；配列番号２のアミノ酸３３０から３５３；配列番号２のアミノ酸３６３から４１６；配列番号２のアミノ酸４１７から４２４；配列番号２のアミノ酸４１９から４９３；および配列番号２のアミノ酸４９４から５５１を含む、これらから本質的に成る、またはこれらから成るＳｐ３５ポリペプチド、またはそうしたポリペプチドのフラグメント、変異体もしくは誘導体が挙げられるが、それに限定されない。
本発明の方法において使用するためのさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸１から３３；配列番号２のアミノ酸１から３５；配列番号２のアミノ酸１から６４；配列番号２のアミノ酸１から８９；配列番号２のアミノ酸１から１１３；配列番号２のアミノ酸１から１３７；配列番号２のアミノ酸１から１６１；配列番号２のアミノ酸１から１８５；配列番号２のアミノ酸１から２０９；配列番号２のアミノ酸１から２３３；配列番号２のアミノ酸１から２５７；配列番号２のアミノ酸１から２８１；配列番号２のアミノ酸１から３０５；配列番号２のアミノ酸１から３２９；配列番号２のアミノ酸１から３５３；配列番号２のアミノ酸１から４１６；配列番号２のアミノ酸１から４２４；配列番号２のアミノ酸１から４９３；配列番号２のアミノ酸１から５５１；配列番号２のアミノ酸１から５３１；および配列番号２のアミノ酸１から５３２を含む、これらから本質的に成る、またはこれらから成るＳｐ３５ポリペプチド、またはそうしたポリペプチドのフラグメント、変異体もしくは誘導体が挙げられるが、それに限定されない。
本発明の方法において使用するためのなお、さらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸３４から６４；配列番号２のアミノ酸３４から８９；配列番号２のアミノ酸３４から１１３；配列番号２のアミノ酸３４から１３７；配列番号２のアミノ酸３４から１６１；配列番号２のアミノ酸３４から１８５；配列番号２のアミノ酸３４から２０９；配列番号２のアミノ酸３４から２３３；配列番号２のアミノ酸３４から２５７；配列番号２のアミノ酸３４から２８１；配列番号２のアミノ酸３４から３０５；配列番号２のアミノ酸３４から３２９；配列番号２のアミノ酸３４から３５３；配列番号２のアミノ酸３４から４１６；配列番号２のアミノ酸３４から４２４；配列番号２のアミノ酸３４から４９３；および配列番号２のアミノ酸３４から５５１を含む、これらから本質的に成る、またはこれらから成るＳｐ３５ポリペプチド、またはそうしたポリペプチドのフラグメント、変異体もしくは誘導体が挙げられるが、それに限定されない。
本発明の方法において使用するためのさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸３４から５３０；配列番号２のアミノ酸３４から５３１；配列番号
２のアミノ酸３４から５３２；配列番号２のアミノ酸３４から５３３；配列番号２のアミノ酸３４から５３４；配列番号２のアミノ酸３４から５３５；配列番号２のアミノ酸３４から５３６；配列番号２のアミノ酸３４から５３７；配列番号２のアミノ酸３４から５３８；配列番号２のアミノ酸３４から５３９；配列番号２のアミノ酸３０から５３２；配列番号２のアミノ酸３１から５３２；配列番号２のアミノ酸３２から５３２；配列番号２のアミノ酸３３から５３２；配列番号２のアミノ酸３４から５３２；配列番号２のアミノ酸３５から５３２；配列番号２のアミノ酸３６から５３２；配列番号２のアミノ酸３０から５３１；配列番号２のアミノ酸３１から５３１；配列番号２のアミノ酸３２から５３１；配列番号２のアミノ酸３３から５３１；配列番号２のアミノ酸３４から５３１；配列番号２のアミノ酸３５から５３１；および配列番号２のアミノ酸３６から５３１を含む、これらから本質的に成る、またはこれらから成るＳｐ３５ポリペプチド、またはそうしたポリペプチドのフラグメント、変異体もしくは誘導体が挙げられるが、それに限定されない。
本発明の方法において使用するためのなお、さらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸３６から６４；配列番号２のアミノ酸３６から８９；配列番号２のアミノ酸３６から１１３；配列番号２のアミノ酸３６から１３７；配列番号２のアミノ酸３６から１６１；配列番号２のアミノ酸３６から１８５；配列番号２のアミノ酸３６から２０９；配列番号２のアミノ酸３６から２３３；配列番号２のアミノ酸３６から２５７；配列番号２のアミノ酸３６から２８１；配列番号２のアミノ酸３６から３０５；配列番号２のアミノ酸３６から３２９；配列番号２のアミノ酸３６から３５３；配列番号２のアミノ酸３６から４１６；配列番号２のアミノ酸３６から４２４；配列番号２のアミノ酸３６から４９３；および配列番号２のアミノ酸３６から５５１を含む、これらから本質的に成る、またはこれらから成るＳｐ３５ポリペプチド、またはそうしたポリペプチドのフラグメント、変異体もしくは誘導体が挙げられるが、それに限定されない。
本発明の方法において使用するためのさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸３６から５３０；配列番号２のアミノ酸３６から５３１；配列番号２のアミノ酸３６から５３２；配列番号２のアミノ酸３６から５３３；配列番号２のアミノ酸３６から５３４；配列番号２のアミノ酸３６から５３５；配列番号２のアミノ酸３６から５３６；配列番号２のアミノ酸３６から５３７；配列番号２のアミノ酸３６から５３８；および配列番号２のアミノ酸３６から５３９を含む、これらから本質的に成る、またはこれらから成るＳｐ３５ポリペプチド、またはそうしたポリペプチドのフラグメント、変異体もしくは誘導体が挙げられるが、それに限定されない。
さらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、それらのフラグメント、変異体または誘導体としては、Ｓｐ３５のＩｇドメインを含むポリペプチドが挙げられる。例えば、配列番号２のアミノ酸４１７から４９３；配列番号２のアミノ酸４１７から４９４；配列番号２のアミノ酸４１７から４９５；配列番号２のアミノ酸４１７から４９６；配列番号２のアミノ酸４１７から４９７；配列番号２のアミノ酸４１７から４９８；配列番号２のアミノ酸４１７から４９９；配列番号２のアミノ酸４１７から５００；配列番号２のアミノ酸４１７から４９２；配列番号２のアミノ酸４１７から４９１；配列番号２のアミノ酸４１２から４９３；配列番号２のアミノ酸４１３から４９３；配列番号２のアミノ酸４１４から４９３；配列番号２のアミノ酸４１５から４９３；配列番号２のアミノ酸４１６から４９３；配列番号２のアミノ酸４１１から４９３；配列番号２のアミノ酸４１０から４９３；配列番号２のアミノ酸４１０から４９４；配列番号２のアミノ酸４１１から４９４；配列番号２のアミノ酸４１２から４９４；配列番号２のアミノ酸４１３から４９４；配列番号２のアミノ酸４１４から４９４；配列番号２のアミノ酸４１５から４９４；配列番号２のアミノ酸４１６から４９４；配列番号２のアミノ酸４１７から４９４；および配列番号２のアミノ酸４１８から４９４を含む、これらから本質的に成る、またはこれらから成るＳｐ３５ポリペプチド、またはそうしたポリペプチドのフラグメント、変異体もしくは誘導体。
本発明の方法において使用するためのさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、Ｓｐ３５のＩｇドメインのペプチドを含む、これらから本質的に成る、またはこれらから成るＳｐ３５ポリペプチド、またはそうしたポリペプチドのフラグメント、変異体もしくは誘導体が挙げられる。具体的には、次のポリペプチド配列を含む、次のポリペプチド配列から本質的に成る、または次のポリペプチド配列から成るポリペプチド：ＩＴＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号６）、ＡＣＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号７）、ＶＣＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号８）、およびＳｐＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号９）（この場合、Ｘ１は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ２は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンまたはアスパラギンであり、およびＸ３は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンまたはアスパラギンである）。例えば、Ｓｐ３５ Ｉｇドメインアンタゴニストペプチドとしては、次のポリペプチド配列を含む、次のポリペプチド配列から本質的に成る、または次のポリペプチド配列から成るポリペプチドが挙げられる：ＳＰＲＫＨ（配列番号１０）、ＳＰＲＫＫ（配列番号１１）、ＳＰＲＫＲ（配列番号１２）、ＳＰＫＫＨ（配列番号１３）、ＳＰＨＫＨ（配列番号１４）、ＳＰＲＲＨ（配列番号１５）、ＳＰＲＨＨ（配列番号１６）、ＳＰＲＲＲ（配列番号１７）、ＳＰＨＨＨ（配列番号１８）、ＳＰＫＫＫ（配列番号１９）、ＬＳＰＲＫＨ（配列番号６１）、ＬＳＰＲＫＫ（配列番号８０）、ＬＳＰＲＫＲ（配列番号８１）、ＬＳＰＫＫＨ（配列番号８２）、ＬＳＰＨＫＨ（配列番号８３）、ＬＳＰＲＲＨ（配列番号８４）、ＬＳＰＲＨＨ（配列番号８５）、ＬＳＰＲＲＲ（配列番号８６）、ＬＳＰＨＨＨ（配列番号８７）、ＬＳＰＫＫＫ（配列番号８８）、ＷＬＳＰＲＫＨ（配列番号８９）、ＷＬＳＰＲＫＫ（配列番号９０）、ＷＬＳＰＲＫＲ（配列番号９１）、ＷＬＳＰＫＫＨ（配列番号９２）、ＷＬＳＰＨＫＨ（配列番号９３）、ＷＬＳＰＲＲＨ（配列番号９４）、ＷＬＳＰＲＨＨ（配列番号９５）、ＷＬＳＰＲＲＲ（配列番号９６）、ＷＬＳＰＨＨＨ（配列番号９７）、ＷＬＳＰＫＫＫ（配列番９８）。これらの可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、Ｓｐ３５のＩｇドメイン内に塩基性「ＲＫＨループ」（アルギニン−リシン−ヒスチジン アミノ酸４５６〜４５８）を含む。この塩基性トリペプチドは、天然Ｓｐ３５ポリペプチドへの可溶性Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドの結合に重要であると考えられる。塩基性トリペプチドを含むさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、ＩＴＰＫＲＲ（配列番号２０）、ＡＣＨＨＫ（配列番号２１）およびＶＣＨＨＫ（配列番号２２）である。
本発明の方法において使用するためのさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、Ｓｐ３５のＩｇドメインのペプチドを含む、Ｓｐ３５のＩｇドメインのペプチドから本質的に成る、またはＳｐ３５のＩｇドメインのペプチドから成るＳｐ３５ポリペプチド、またはそうしたポリペプチドのフラグメント、変異体もしくは誘導体が挙げられる。具体的には、次のポリペプチド配列を含む、次のポリペプチド配列から本質的に成る、または次のポリペプチド配列から成るペプチド：Ｘ４Ｘ５ＲＫＨ（配列番号２３）、Ｘ４Ｘ５ＲＲＲ（配列番号２４）、Ｘ４Ｘ５ＫＫＫ（配列番号２５）、Ｘ４Ｘ５ＨＨＨ（配列番号２６）、Ｘ４Ｘ５ＲＫＫ（配列番号２７）、Ｘ４Ｘ５ＲＫＲ（配列番号２８）、Ｘ４Ｘ５ＫＫＨ（配列番号２９）、Ｘ４Ｘ５ＨＫＨ（配列番号３０）、Ｘ４Ｘ５ＲＲＨ（配列番号３１）、およびＸ４Ｘ５ＲＨＨ（配列番号３２）（この場合、Ｘ４は、任意のアミノ酸であり、Ｘ５は、任意のアミノ酸である）。
他の実施形態において、本発明の方法において使用するための可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、Ｓｐ３５のＩｇドメインのペプチドを含む、Ｓｐ３５のＩｇドメインのペプチドから本質的に成る、またはＳｐ３５のＩｇドメインのペプチドから成るＳｐ３５ポリペプチド、またはそうしたポリペプチドのフラグメント、変異体もしくは誘導体が挙げられる。具体的には、次のポリペプチド配列を含む、次のポリペプチド配列から本質的に成る、または次のポリペプチド配列から成るポリペプチド：ＩＴＸ６Ｘ７Ｘ８（配列番号６８）、ＡＣＸ６Ｘ７Ｘ８（配列番号６９）、ＶＣＸ６Ｘ７Ｘ８（配列番号７０）および
ＳＰＸ６Ｘ７Ｘ８（配列番号７１）（この場合、Ｘ６は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ７は、任意のアミノ酸であり、およびＸ８は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンまたはアスパラギンである）。例えば、Ｓｐ３５ Ｉｇドメインアンタゴニストペプチドとしては、次のポリペプチド配列を含む、次のポリペプチド配列から本質的に成る、または次のポリペプチド配列から成るポリペプチドが挙げられる：ＳＰＲＬＨ（配列番号７２）。
本発明の他の実施形態において、本発明の方法において使用するための可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、Ｓｐ３５のＩｇドメイン内にアミノ酸４５２〜４５８を含有するペプチドを含む、前記ペプチドから本質的に成る、または前記ペプチドから成るＳｐ３５ポリペプチドまたはその誘導体が挙げられ、この場合、アミノ酸４５２は、トリプトファンまたはフェニルアラニン残基である。
本発明の方法において使用するためのさらなる可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、Ｓｐ３５の塩基性ドメインのペプチドを含む、前記ペプチドから本質的に成る、または前記ペプチドから成るＳｐ３５ポリペプチドが挙げられる。具体的には、次のポリペプチド配列を含む、次のポリペプチド配列から本質的に成る、または次のポリペプチド配列から成るペプチド：ＲＲＡＲＩＲＤＲＫ（配列番号３３）、ＫＫＶＫＶＫＥＫＲ（配列番号３４）、ＲＲＬＲＬＲＤＲＫ（配列番号３５）、ＲＲＧＲＧＲＤＲＫ（配列番号３６）、およびＲＲＩＲＡＲＤＲＫ（配列番号３７）。
本発明を実施するための様々な例示的可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドならびにこれらの分子を得るための様々な例示的方法および材料は、下で説明し、および／または例えば国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００８３２３（その全文、本明細書に参照として援用される）において見出すことができる。
本明細書に記載する本発明の方法において使用するための可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、環状であってもよい。可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドの環化は、線状ポリペプチドの配座自由度を低減し、より構造的に拘束された分子を生じさせる。多くのペプチド環化法が当該技術分野において知られている。例えば、ペプチドのＮ末端アミノ酸残基とＣ末端アミノ酸残基の間のアミド結合の形成による「骨格−骨格」環化。この「骨格−骨格」環化法としては、２つのω−チオアミノ酸残基（例えば、システイン、ホモシステイン）間のジスルフィド架橋の形成が挙げられる。本発明の一定の可溶性Ｓｐ３５ペプチドは、環状Ｓｐ３５ポリペプチドを形成するための前記ペプチドのＮ末端およびＣ末端に対する修飾を含む。こうした修飾としては、システイン残基、アセチル化システイン残基、ＮＨ２部分およびビオチンを有するシステイン残基が挙げられるが、これらに限定されない。他のペプチド環化法は、Ｌｉ ＆ Ｒｏｌｌｅｒ． Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３：３２５−３４１（２００２）（これは、その全文、本明細書に参照として援用される）に記載されている。
本明細書に記載する本発明の方法において使用するための環状Ｓｐ３５ポリペプチドとしては、Ｃ１ＬＳＰＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｃ２（配列番号９９）が挙げられ（しかし、これに限定されない）、この場合、Ｘ ９ は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ １０ は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ １１ は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミンまたはアスパラギンであり、Ｃ１には、環化を促進する部分（例えば、アセチル基またはビオチン）が場合によっては結合しており、ならびにＣ２には、環化を促進する部分（例えば、ＮＨ２部分）が場合によっては結合している。
本明細書に記載する可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、様々な改変、例えば置換、挿入ま
たは欠失を有することがある。例えば、置換としては次の置換が挙げられるが、これらに限定されない：配列番号２のＳｐ３５ポリペプチドの６位のバリンのメチオニンへの置換；配列番号２のＳｐ３５ポリペプチドの２９４位のセリンのグリシンへの置換；配列番号２のＳｐ３５ポリペプチドの３４８位のバリンのアラニンへの置換；Ｓｐ３５ポリペプチドの４１９位のアルギニンのヒスチジンへの置換；４５６位のアルギニンのグルタミン酸への置換；および配列番号２の４５８位のヒスチジンのバリンへの置換。
本明細書に記載する配列番号２のポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドの対応するフラグメントも考えられる。
当該技術分野では公知であるように、２つのポリペプチド間の「配列同一性」は、あるポリペプチドのアミノ酸配列と別のポリペプチドの配列を比較することにより判定される。本明細書において論じる場合、いずれかの特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるかどうかは、当該技術分野において公知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェア、例えば、限定ではないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）を使用して判定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、２配列間の相同性が最もよいセグメントを見つけるために、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを利用する。特定の配列が、例えば、本発明の参照配列と９５％同一であるかどうかを判定するためにＢＥＳＴＦＩＴまたは他の任意の配列アラインメントプログラムを利用するとき、パラメータは、勿論、同一率がその参照ポリペプチドの完全長にわたって計算されるように、ならびに参照配列における全アミノ酸数の５％以下の相同性のギャップが許容されるように設定する。
本発明の方法において使用するための可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、２つまたはそれ以上の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドの任意の組み合わせを含むことができる。
抗体またはその免疫特異的フラグメント
本発明の方法において使用するためのＳｐ３５アンタゴニストは、Ｓｐ３５活性のアンタゴニストである、Ｓｐ３５特異的抗体または抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体も含む。例えば、Ｓｐ３５への一定のＳｐ３５抗体の結合は、乏突起神経膠細胞上で発現されると、乏突起神経膠細胞の成長もしくは分化の阻害を阻止し、またはＣＮＳニューロンの脱髄もしくは髄鞘形成不全を阻止する。
本明細書に記載する方法において使用するための一定のアンタゴニスト抗体は、特定のＳｐ３５ポリペプチドフラグメントまたはドメインに特異的にまたは優先的に結合する。こうしたＳｐ３５ポリペプチドフラグメントとしては、配列番号２のアミノ酸３４から３５２、３４から４１７、３４から４２５、３４から４９３、６６から５３２、６６から４１７（ＬＲＲドメイン）、６６から４２６、６６から４９３、６６から５３２、４１７から５３２、４１７から４２５（Ｓｐ３５塩基性領域）、４１７から４２４（Ｓｐ３５塩基性領域）、４１７から４９３、４１７から５３２、４１９から４９３（Ｓｐ３５ Ｉｇ領域）もしくは４２５から５３２を含む、これらから本質的に成る、もしくはこれらから成るＳｐ３５ポリペプチド、または配列番号２のアミノ酸３４から５３２、３４から４１７、３４から４２５、３４から４９３、６６から５３２、６６から４１７、６６から４２６、６６から４９３、６６から５３２、４１７から５３２、４１７から４２５（Ｓｐ３５塩
基性領域）、４１７から４９３、４１７から５３２、４１９から４９３（Ｓｐ３５ Ｉｇ領域）もしくは４２５から５３２に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％同一であるＳｐ３５変異体ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の一定のＳｐ３５特異的抗体またはそれらの抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体が結合する、さらなるＳｐ３５ペプチドフラグメントとしては、Ｓｐ３５の１つまたはそれ以上のロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を含む、前記ＬＲＲから本質的に成る、または前記ＬＲＲから成るものが挙げられるが、これらに限定されない。こうしたフラグメントとしては、例えば、配列番号２のアミノ酸６６から８９、６６から１１３、６６から１３７、９０から１１３、１１４から１３７、１３８から１６１、１６２から１８５、１８６から２０９、２１０から２３３、２３４から２５７、２５８から２８１、２８２から３０５、３０６から３２９または３３０から３５３を含む、これらから本質的に成る、またはこれらから成るフラグメントが挙げられる。配列番号２のアミノ酸６６から８９、６６から１１３、９０から１１３、１１４から１３７、１３８から１６１、１６２から１８５、１８６から２０９、２１０から２３３、２３４から２５７、２５８から２８１、２８２から３０５、３０６から３２９または３３０から３５３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である変異体Ｓｐ３５ポリペプチドの対応するフラグメントも考えられる。
本発明の一定の抗体またはそれらの抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体が結合する、さらなるＳｐ３５ペプチドフラグメントとしては、Ｓｐ３５のＬＲＲに隣接する１つまたはそれ以上のシステインリッチ領域を含む、前記領域から本質的に成る、または前記領域から成るものが挙げられるが、これらに限定されない。こうしたフラグメントとしては、例えば、配列番号２のアミノ酸３４から６４（Ｎ末端ＬＲＲ隣接領域（ＬＲＲＮＴ））を含む、これらから本質的に成るもしくはこれらから成るフラグメント、または配列番号２のアミノ酸３６３から４１６（Ｃ末端ＬＲＲ隣接領域（ＬＲＲＣＴ））を含む、これらから本質的に成るもしくはこれらから成るフラグメントが挙げられる。配列番号２のアミノ酸３４から６４および３６３から４１６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である変異体Ｓｐ３５ポリペプチドの対応するフラグメントも考えられる。
他の実施形態において、本発明は、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体を含み、この場合、前記エピトープは、配列番号２の少なくとも約４個から５個のアミノ酸、配列番号２の少なくとも７個、少なくとも９個、または少なくとも約１５個〜約３０個の間のアミノ酸を含む、これらから本質的に成る、またはこれらから成る。記載したような配列番号２の所定のエピトープのアミノ酸は、隣接していてもよいし、線状であってもよいが、そうである必要はない。特定の実施形態において、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープは、細胞の表面で発現された場合のまたは例えばＩｇＧ Ｆｃ領域に融合している可溶性フラグメントとしてのＳｐ３５の細胞外ドメインによって形成された非線状エピトープを含む、前記非線状エピトープから本質的に成る、または前記非線状エピトープから成る。従って、特定の実施形態において、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープは、配列番号２の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５個から約３０個の間、または少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個もしくは１００個の隣接または非隣接アミノ酸を含む、これらから本質的に成るまたはこれらから成り、この場合、非隣接アミノ酸は、蛋白質フォールディングによってエピトープを形成する。
他の実施形態において、本発明は、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体を含み、この場合、前記エピトープは、上に記載したような配列番号２の１個、２個、３個、４個、５個、６個またはそれ以上の隣接または非隣接アミノ酸に加えて、蛋白質を修飾する追加の部分を含み、これらから本質的に成り、またはこれらから成り、例えば、Ｓｐ３５抗体が、修飾されたターゲット蛋白質に、その蛋白質の非修飾バージョンに結合するより高い親和性で結合するように、炭水化物部分を含めることができる。あるいは、Ｓｐ３５抗体は、ターゲット蛋白質の非修飾バージョンには全く結合しない。
特定の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体は、上に記載したＳｐ３５もしくはフラグメントもしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合し、すなわち、そうしたエピトープに、無関係もしくはランダムエピトープに結合するより容易に結合し；または上に記載したＳｐ３５もしくはフラグメントもしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに優先的に結合し、すなわち、そうしたエピトープに、無関係、同類、相同のもしくは類似エピトープに結合するより容易に結合し；または上に記載したＳｐ３５もしくはフラグメントもしくは変異体の一定のエピトープに特異的にもしくは優先的に結合する参照抗体の結合を競合的に阻害し；または上に記載したＳｐ３５もしくはフラグメントもしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに、約５ｘ１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５ｘ１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５ｘ１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５ｘ１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５ｘ１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５ｘ１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５ｘ１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５ｘ１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５ｘ１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５ｘ１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５ｘ１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５ｘ１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５ｘ１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５ｘ１０−１５Ｍ、もしくは約１０−１５Ｍ未満の解離定数ＫＤを特徴とする親和性で結合する。特定の態様において、前記抗体またはそのフラグメントは、マウスＳｐ３５ポリペプチドまたはそのフラグメントに比べ、ヒトＳｐ３５ポリペプチドまたはそのフラグメントに優先的に結合する。
抗体結合解離定数に関して用いる場合、用語「約」により、抗体親和性を測定するために利用される方法に固有の変動度が許される。例えば、使用される機器の精度の水準、測定されるサンプル数に基づく標準誤差、および丸めの誤差に依存して、用語「約１０−２Ｍ」は、例えば、０．０５Ｍから０．００５Ｍを包含する。
特定の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体は、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはそれらのフラグメントもしくは変異体に、５ｘ１０−２秒−１、１０−２ 秒−１、５ｘ１０−３ 秒−１または１０−３秒−１であるか、それ未満のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合する。あるいは、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体は、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはそれらのフラグメントもしくは変異体に、５ｘ１０−４秒−１、１０−４ 秒−１、５ｘ１０−
５ 秒−１、１０−５秒−１、５ｘ１０−６ 秒−１、１０−６ 秒−１、５ｘ１０−７秒
−１または１０−７ 秒−１であるか、それ未満のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合する
。
他の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体は、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは誘導体に１０３Ｍ−１ 秒−１、５ｘ１０３ Ｍ−１ 秒−１、１０４Ｍ−１秒−１または５ｘ１０４Ｍ−１ 秒−１であるか、それ未満のオン速度（ｋ（ｏｎ））で結合する。あるいは、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、変異体もしくは誘導体は、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは誘導体に１０５Ｍ−１秒−１、５ｘ１０５Ｍ−１ 秒−１、
１０６Ｍ−１秒−１、５ｘ１０６Ｍ−１ 秒−１または１０７Ｍ−１秒−１であるか、そ
れ未満のオン速度（ｋ（ｏｎ））で結合する。
１つの実施形態において、本発明の方法において使用するためのＳｐ３５アンタゴニストは、抗体分子またはその免疫特異的フラグメントである。明確な注記がない限り、本明細書で用いる場合、抗体に関しての「そのフラグメント」は、免疫特異的フラグメント、すなわち抗原特異的フラグメントを指す。１つの実施形態において、本発明の抗体は、二重特異性結合分子、結合ポリペプチド、または抗体、例えば二重特異性抗体、低分子抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ドメイン欠失抗体、または１つより多くのエピトープ（例えば、１つより多くの抗原、または同じ抗原上の１つより多くのエピトープ）に対して結合特異性を有する融合蛋白質である。１つの実施形態において、二重特異性抗体は、Ｓｐ３５上の少なくとも１つのエピトープに特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する。二重特異性抗体は、Ｓｐ３５のエピトープに特異的な２つのターゲット結合ドメインおよび別のターゲットに特異的な２つのターゲット結合ドメインを有する四価抗体であり得る。従って、四価二重特異性抗体は、各特異性について二価であり得る。
本発明の特定の実施形態が、Ｓｐ３５アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的フラグメントの投与を含む場合、定常領域ドメイン１つまたはそれ以上の少なくとも１つの画分は、所望の生化学的特性（例えば、ほぼ同じ免疫原性の完全未改変抗体と比較して、エフェクタ機能の低下、非共有結合で二量体化する能力、腫瘍部位に局在する能力の増大、血清半減期減少、または血清半減期増加）をもたらすように欠失または別様に改変されている。例えば、本明細書に記載の治療方法において使用するための一定の抗体は、免疫グロブリンＨ鎖と同様のポリペプチド鎖を含むが、１つまたはそれ以上のＨ鎖ドメインの少なくとも１部を欠くドメイン欠失抗体である。例えば、一定の抗体では、その修飾抗体の定常領域の完全ドメイン１つが欠失している、例えば、ＣＨ２ドメインのすべてまたは一部が欠失しているであろう。
本明細書に記載する治療方法において使用するための一定のＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはそれらの免疫特異性フラグメントにおけるＦｃ部分は、当該技術分野において公知の技法を用いて、エフェクタ機能を低下させるように突然変異させることができる。例えば、定常領域ドメインの（点突然変異または他の手段による）欠失または不活性化は、循環性修飾抗体のＦｃ受容体結合を減少させることができ、それによって腫瘍局在化を増加させることができる。他の場合、本発明に準じた定常領域修飾は、補体結合を抑えることができ、従って血清半減期および抱合毒素の非特異的会合を減少させることができる。さらに他の定常領域修飾を用いてジスルフィド結合または乏突起神経膠細胞部分を修飾することができ、これは、抗原特異性増加または抗体柔軟性増加のため、局在化を増進することができる。修飾の結果として生じる生理学的プロフィール、バイオアベイラビリティおよび他の生化学的効果、例えば腫瘍局在化、生体分布および血清半減期は、周知の免疫学的技法を用い、過度の実験を伴わず、容易に測定および定量することができる。
本明細書に開示する診断および治療方法において使用するための抗体またはその免疫特異的フラグメントの被修飾形態は、当該技術分野では公知の技法を用いて、全前駆体または親抗体から作製することができる。具体例としての技法は、本明細書中でさらに詳細に論じる。
特定の実施形態において、本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはそれらの免疫特異的フラグメントの可変領域および定常領域は、両方とも、完全ヒト性である。完全ヒト抗体は、当該技術分野において公知である技法および本明細書に記載する技法を用いて作製することができる。例えば、特異的抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原攻撃に応答するような抗体を生産するように修飾されている
が、内因性因子座が使用不能にされているトランスジェニック動物にその抗原と投与することにより作製することができる。そうした抗体を作製するために使用することができる具体例としての技法は、米国特許第６，１５０，５８４号、同第６，４５８，５９２号および同第６，４２０，１４０号に記載されている。他の技法は、当該技術分野では公知である。完全ヒト抗体は、本明細書の他の箇所でさらに詳細に説明するような様々なディスプレイ法、例えばファージディスプレイまたは他のウイルスディスプレイシステムによっても生産することができる。
本明細書に開示する診断および治療方法において使用するためのＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはそれらの免疫特異的フラグメントは、当該技術分野において公知である技法を用いて作製または製造することができる。特定の実施形態において、抗体分子またはそれらのフラグメントは、「組換え生産」される、すなわち、組換えＤＮＡ技術を用いて生産される。抗体分子またはそのフラグメントを作製するための具体例としての技法は、本明細書の他の箇所でさらに詳細に論じる。
本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはそれらの免疫特異的フラグメントは、例えば、抗体がその同源エピトープに特異的に結合することをその共有結合が妨げないように抗体に任意のタイプの分子を共有結合で結合させることによって修飾されている誘導体を包含する。例えば、限定としてではないが、前記抗体誘導体は、例えばグリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知保護またはブロック基による誘導体化、蛋白質分解性切断、細胞性リガンドまたは他の蛋白質への連結などによって修飾されている抗体を含む。非常に多数の化学修飾はいずれも、公知の技法によって行うことができ、そうした技法としては、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、前記誘導体は、１つまたはそれ以上の非古典的アミノ酸を含有していてもよい。
好ましい実施形態において、本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはその免疫特異的フラグメントは、治療すべき動物、例えば人間において有害な免疫反応を惹起しないであろう。１つの実施形態において、本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはそれらの免疫特異的フラグメントは、当該技術分野において認知されている技法を用いてそれらの免疫原性を低下させるように修飾されている。例えば、人化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）抗体またはキメラ抗体であり得る抗体を作製することができる。これらのタイプの抗体は、親抗体の抗原結合特性を保有または実質的に保有しているが、ヒトでは、然程、免疫原性でない非ヒト抗体、典型的にはマウスまたは霊長類抗体に由来する。これは、（ａ）ヒト定常領域に完全非ヒト可変ドメインをグラフトしてキメラ抗体を作製する方法；（ｂ）ヒトフレームワーク、および重要なフレームワーク残基を保有しているまたはしていない定常領域に、１つまたはそれ以上の非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部をグラフトする方法；あるいは（ｃ）完全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によってそれらをヒト様セクションで「覆い隠す」方法をはじめとする様々な方法によって実現することができる。こうした方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４）、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号および同第６，１９０，３７０号に開示されており、これらのすべてが、それら全文、本明細書に参照として援用される。
脱免疫化を用いて、抗体の免疫原性を低下させることもできる。本明細書で用いる場合、用語「脱免疫化」は、Ｔ細胞エピトープを修飾するように抗体を改変することを包含する（例えば、国際公開パンフレット第９８５２９７６号Ａ１および同第００３４３１７号Ａ２参照）。例えば、出発抗体からのＶＨおよびＶＬ配列を分析する。各Ｖ領域からのヒトＴ細胞エピトープ「マップ」は、その配列内の相補性決定領域（ＣＤＲ）および他の重要な残基に関してのエピトープの位置を示す。そのＴ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープを分析して、最終抗体の活性を変える危険性が低い代替アミノ酸置換を特定する。アミノ酸置換の組み合わせを含む一定範囲の代替ＶＨおよびＶＬ配列を設計し、その後、これらの配列を一定範囲の結合ポリペプチド、例えば本明細書に開示する診断および治療方法において使用するためのＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはそれらの免疫特異的フラグメント、に組み込み、その後、それらを機能を検査する。一般には、１２個と２４個の間の変異抗体を産生させ、検査する。その後、修飾ＶおよびヒトＣ領域を含む完全ＨおよびＬ鎖遺伝子を発現ベクターにクローニングし、その後、細胞株にプラスミドを導入して全抗体を生産する。その後、それらの抗体を適切な生化学的および生物学的アッセイで比較し、最適な変異体を特定する。
本発明の方法において使用するためのＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはそれらのフラグメントは、当該技術分野において公知の任意の適する方法によって産生させることができる。ポリクローナル抗体は、当該技術分野において周知の様々な手順によって生産することができる。例えば、ウサギ、マウス、ラットなどをはじめとする（しかし、これらに限定されない）様々な宿主動物にＳｐ３５免疫特異的フラグメントを投与して、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の生産を誘導することができる。宿主の種に依存して様々なアジュバントを用いて免疫学的応答を増大させることができ、そうしたアジュバントとしては、フロイント（完全および不完全）アジュバント、無機質ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（カルメット・ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。こうしたアジュバントは、当該技術分野においても周知である。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換え法およびファージディスプレイ法またはこれらの組み合わせをはじめとする、当該技術分野では公知の多種多様な技法を用いて作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当該技術分野において公知の技法および例えばＨａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，５６３−６８１（１９８１）に教示されている技法をはじめとする、ハイブリドーマ法を用いて生産することができる（前記参照は、それら全文、参照として援用される）。本明細書で用いる場合の用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ法によって生産される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、あらゆる真核性クローン、原核性クローンまたはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体を指し、それが生産される方法を指さない。それ故、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ法によって生産された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換え法およびファージディスプレイ法の使用を含む、当該技術分野において公知の多種多様な技法を使用して作製することができる。
当該技術分野において認知されているプロトコルを用いて、一例では、関連抗原（例えば、精製Ｓｐ３５抗原またはそうした抗原を含む細胞もしくは細胞抽出物）およびアジュバントの多重皮下または腹腔内注射により哺乳動物において抗体を産生させる。一般に、この免疫化は、活性化脾細胞またはリンパ球からの抗原反応性抗体の生産を含む免疫反応を惹起する。結果として生じた抗体をその動物の血清から回収してポリクローナル製剤を得ることができるが、脾臓、リンパ節または末梢血から個々のリンパ球を単離してモノクローナル抗体（ＭＡｂ））の均質製剤を得ることが、多くの場合、望まれる。好ましくは、リンパ球は、脾臓から得る。
この周知のプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５））では、抗原を注射した哺乳動物からの比較的寿命が短い、すなわち短命のリンパ球を不朽腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合させ、従って、不朽でもあり、Ｂ細胞の遺伝的にコードされた抗体を生産することもできるハイブリッド細胞、すなわち「ハイブリドーマ」を生産する。結果として生じるハイブリッドは、単一抗体の形成のための特異的遺伝子を含む個々の株各々での選択、希釈および再成長によって、単一遺伝子株に分離する。それらは、所望の抗原に対して均質である、またそれらの純粋な遺伝的血統に関連して「モノクローナル」と呼ばれる、抗体を生産する。
融合していない親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つまたはそれ以上の物質を好ましくは含有する適する培地に、このように作製されたハイブリドーマ細胞を接種し、成長させる。ハイブリドーマの形成、選択および成長のための試薬、細胞株および培地が、多数の供給業者から市販されていること、ならびに標準化されたプロトコルが充分に確立されていることは、当業者には理解されるであろう。一般に、ハイブリドーマ細胞が成長している培地を、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の生産についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産されるモノクローナル抗体の結合特異性は、インビトロアッセイ、例えば免疫沈降法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって判定する。所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞を特定した後、それらのクローンを限界希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ ５９−１０３（１９８６））によって成長させる。さらに、サブクローニングによって分泌されたモノクローナル抗体を従来の精製手順、例えばプロテイン−Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析または親和性クロマトグラフィーなど、によって培地、腹水または血清から分離できることは、理解されるであろう。
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技法によって産生させることがえきる。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生産するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生産するため）などの酵素を使用する免疫グロブリン分子の蛋白質分解性切断によって生産することができる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、Ｌ鎖定常領域、およびＨ鎖のＣＨ１ドメインを含有する。
抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡも抗体ファージライブラリから誘導できることも、当業者には理解されるであろう。特に、そうしたファージは、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えば、ヒトまたはマウス）から発現された抗原結合ドメインを提示するために利用することができる。対象となる抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合しているもしくは捕捉されている抗原を使用して、選択または特定することができる。典型的に、これらの方法において使用される
ファージは、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩ蛋白質、いずれかに組換え融合しているＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む線状ファージである。具体例としての方法は、例えば、欧州特許第３６８ ６８４号Ｂ１；米国特許第５，９６９，１０８号；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ Ｃｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３７１（２０００）；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）；Ｈｕｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：２６８２（２００１）；Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３（２００２）に記載されており、これらの各々が本明細書に参照として援用される。幾つかの出版物（例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２））には、連鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）による高親和性ヒト抗体の生産、ならびに大きなファージライブラリを構築するための戦略としてコンビナトリアル感染およびインビボ組換えが記載されている。もう１つの実施形態では、リボソームディスプレイ法を用いて、ディスプレイプラットホームとしてバクテリオファージを置換することができる（例えば、Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７（２０００）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：３７５０（２００１）；またはＩｒｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：３１（２００１）参照）。さらにもう１つの実施形態では、細胞表面ライブラリを抗体についてスクリーニングすることができる（Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１０７０１（２０００）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４３：２１１（２０００））。こうした手順は、モノクローナル抗体の単離およびその後のクローニングのための伝統的なハイブリドーマ法の代替となる。
ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面に提示される。特に、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列が、動物ｃＤＮＡライブラリ（例えば、リンパ組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリ）または合成ｃＤＮＡライブラリから増幅される。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡをｓｃＦｖリンカーによってまたはＰＣＲによって互いに連結し、ファージミドベクター（例えば、ｐ ＣＡＮＴＡＢ ６またはｐＣｏｍｂ ３ ＨＳＳ）にクローニングする。このベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）にエレクトロポレートし、その大腸菌をヘルパーファージで感染させる。これらの方法に用いるファージは、典型的に、ｆｄおよびＭ１３を含む線状ファージであり、通常、そのＶＨまたはＶＬ領域は、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換え融合されている。対象となる抗原（すなわち、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはそのフラグメント）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合しているもしくは捕捉されている抗原を使用して、選択または特定することができる。
抗体を作製するために用いることができるファージディスプレイ法の追加例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ国際公開パンフレット第９０／０２８０９号、同第９１／１０７３７号、同第９２／０１０４７号、同第９２／１８６１９号、同第９３／１１２３６号、同第９５／１５９８２号、および同第９５／２０４０１号；な
らびに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号、および同第５，９６９，１０８号（これらの各々が、その全部、本明細書に参照として援用される）に開示されているものが挙げられる。
上記参照に記載されているように、ファージ選択後、そのファージから抗体コーディング領域を単離し、ヒト抗体をはじめとする全抗体または任意の望ましい抗体結合フラグメントを産生させるために使用し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌をはじめとする任意の望ましい宿主において発現させることができる。例えば、ＰＣＴ国際公開パンフレット第９２／２２３２４号；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；Ｓａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；およびＢｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）に開示されているものなどの当該技術分野において公知の方法を用いる、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２を組換え生産するための技法も利用することができる（前記参照は、それら全文、参照として援用される）。
１本鎖Ｆｖおよび抗体を生産するために用いることができる技法の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；ならびにＳｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載されているものが挙げられる。人間における抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイをはじめとする、一部の用途については、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体を使用するほうが好ましい場合がある。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。キメラ抗体を生産するための方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、および同第４，８１６３９７号参照（これらは、それら全文、本明細書に参照として援用される）。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する、所望の抗原に結合する非ヒト種からの抗体分子である。多くの場合、前記ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を改変、好ましくは改善するために、前記ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野では周知の方法によって、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を特定するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデリング、および特定の位置において普通でないフレームワーク残基を特定するための配列比較によって、特定することができる（例えば、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）参照。これらは、それら全文、本明細書に参照として援用される）。例えば、ＣＤＲグラフト法（欧州特許第２３９，４００号；ＰＣＴ国際公開パンフレット第９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号および同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリングまたはリサーフェーシング（欧州特許第５９２，１０６号、同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））、ならびに連鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）をはじめとする当該技術分野において公知の様々な技法を用いて、抗体をヒト化することができる。
完全ヒト抗体は、人間の患者の治療的処置に特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを使用して、上に記載したファージディスプレイ法をはじめとする当該技術分野において公知の様々な方法により作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号；ならびにＰＣＴ国際公開パンフレット第９８／４６６４５号、同第９８／５０４３３号、同第９８／２４８９３号、同第９８／１６６５４号、同第９６／３４０９６号、同第９６／３３７３５号、および同第９１／１０７４１号も参照（これらの各々が、本明細書に参照として援用される）。
ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができる、トランスジェニックマウスを使用して生産することもできる。例えば、ヒトＨおよびＬ鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、マウス胚性幹細胞にランダムにまたは相同組換えによって導入することができる。あるいは、ヒトＨおよびＬ鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入することができる。そのマウスＨおよびＬ鎖免疫グロブリン遺伝子を、相同組換えによるヒト免疫グロブリン座の導入で、別々にまたは同時に非機能性にすることができる。特に、ＪＨ領域の同型接合性欠失は、内因性抗体生産を妨げる。それらの被修飾胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞に微量注入してキメラマウスを生産する。その後、それらのキメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現する同型接合子孫を生産する。選択抗原、例えば所望のターゲットポリペプチドのすべてまたは一部を用いて正規のやり方でそれらのトランスジェニックマウスを免疫する。従来のハイブリドーマ法を用いて、それらの被免疫トランスジェニックマウスからその抗原に対するモノクローナル抗体を得ることができる。それらのトランスジェニックマウスが宿しているヒト免疫グロブリントランスジーンは、Ｂ細胞分化中に再配列し、その後、クラス転換され、体細胞突然変異を受ける。従って、こうした技法を用いて、治療に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を生産することができる。ヒト抗体を生産するためのこの技法の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのこの技法ならびにそうした抗体を生産するためのプロトコルについての詳細な考察については、例えば、ＰＣＴ国際公開パンフレット第９８／２４８９３号、同第９６／３４０９６号、および同第９６／３３７３５号；米国特許第５，４１３，９２３号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号、および同第５，９３９，５９８号を参照のこと（これらは、それら全文、本明細書に参照として援用される）。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ）およびＧｅｎＰｈａｒｍ（カリフォルニア州、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）などの会社は、上で説明したものに類似した技法を用いて選択抗原に対するヒト抗体を生じさせることに従事している。
選択エピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイド選択法（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技法を用いて産生させることができる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドする。（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８）。）米国特許第５，５６５，３３２号も参照。
もう１つの実施形態では、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体のＨおよびＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを容易に単離し、配列決定することができる。単離されサブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、そうしたＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離したら、ＤＮＡを発現ベクター内に配置し、その後、それを、別様に免疫グロブリンを生産しない原核または真核宿主細胞、例えば大腸菌細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞にトランスフェクトする。より詳細には、単離したＤＮＡ（本明細書に記載するとおり合成することができる）を用いて、１９９５年１月２５日出願のＮｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号（これは、本明細書に参照として援用される）に記載されているように製造抗体についての定常および可変領域配列をクローニングすることができる。本質的に、これは、選択細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの転化、およびＩｇ特異的プライマーを使用するＰＣＲによる増幅を必要とする。このために適するプライマーは、米国特許第５，６５８，５７０号にも記載されている。下でさらに詳細に論じるように、所望の抗体を発現する形質転換細胞を比較的大量に成長させて、免疫グロブリンの臨床および市場供給をもたらすことができる。
特定の実施形態では、当該技術分野において周知の方法により、例えば、他のＨおよびＬ鎖可変領域のわかっているアミノ酸配列と比較して配列超可変性領域を決定することにより、Ｈおよび／またはＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を検査して、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を特定することができる。慣習的な組換えＤＮＡ法を用いて、１つまたはそれ以上のＣＤＲをフレームワーク領域内に、例えばヒトフレームワーク領域に挿入して、非ヒト抗体をヒト化することができる。前記フレームワーク領域は、天然フレームワーク領域またはコンセンサスフレームワーク領域、好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、ヒトフレームワーク領域の一覧表については、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、フレームワーク領域とＣＤＲを組み合わせることによって産生されるポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド、例えばＳｐ３５、の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードしている。好ましくは１つまたはそれ以上のアミノ酸置換をそれらのフレームワーク領域内で行うことができ、好ましくは、前記アミノ酸置換によって、抗体のその抗原への結合が改善される。加えて、こうした方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に関与している１つまたはそれ以上の可変領域システイン残基をアミノ酸置換または欠失させて、１つまたはそれ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体を産生させることができる。ポリヌクレオチドに対する他の改変は、本発明に包含され、ならびに当業者の範囲内である。
加えて、適切な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子と適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子とを互いにスプライシングさせることによる、「キメラ抗体」を生産するために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））を用いることができる。本明細書で用いる場合、キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えばマウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの、例えばヒト化抗体である。
あるいは、１本鎖抗体の生産について記載された技法（米国特許第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５
５４（１９８９））を改変して、１本鎖抗体を生産することができる。１本鎖抗体は、アミノ酸架橋によりＦｖ領域のＨ鎖フラグメントとＬ鎖フラグメントを連結させ、その結果として１本鎖抗体を得ることによって形成される。大腸菌において機能的Ｆｖフラグメントを組み立てるための技法も用いることができる（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
Ｓｐ３５アンタゴニスト抗体は、内因性免疫グロブリン生産ができないトランスジェニック動物（例えば、マウス）において産生されたヒト抗体または実質的ヒト抗体（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，５９１，６６９号および同第５，５８９，３６９参照。これらの各々が、本明細書に参照として援用される）であってもよい。例えば、キメラおよび生殖細胞系突然変異マウスにおける抗体Ｈ鎖連結領域の同型接合性欠失は、内因性抗体生産の完全阻害を生じさせることが記載されている。そうした生殖細胞系突然変異マウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子アレイの移入の結果、抗原攻撃するとヒト抗体の生産が生じることとなる。ＳＣＩＤマウスを使用してヒト抗体を産生させるもう１つの好ましい手段が、米国特許第５，８１１，５２４号に開示されている。この特許は、本明細書に参照として援用される。これらのヒト抗体に関連した遺伝物質を、本明細書に記載するように単離し、操作できることも理解されるであろう。
組換え抗体を産生させるためのさらにもう１つの非常に有効な手段が、Ｎｅｗｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４５５−１４６０（１９９２）により開示されている。具体的には、この技法は、サル可変ドメインおよびヒト定常配列を含有する霊長類化抗体を産生させる。この参照は、その全文、本明細書に参照として援用される。さらに、この技法は、本発明の同一人に譲渡された米国特許第５，６５８，５７０号、同第５，６９３，７８０号、および同第５，７５６，０９６号（これらの各々が、本明細書に参照として援用される）にも記載されている。
もう１つの実施形態では、マイクロマニュピュレーションによりリンパ球を単離し、可変部遺伝子を単離することができる。例えば、末梢血単核細胞を免疫化哺乳動物から単離し、インビトロで約７日間、培養することができる。これらの培養物を、スクリーニング基準に見合う特異的ＩｇＧについてスクリーニングすることができる。ポジティブウエルからの細胞を単離することができる。個々のＩｇ生産性Ｂ細胞をＦＡＣＳによって、または補体媒介溶血プラークアッセイでそれらを特定することによって、単離することができる。Ｉｇ生産性Ｂ細胞を試験管へとマイクロマニュピュレートし、例えばＲＴ−ＰＣＲを用いてＶＨおよびＶＬ遺伝子を増幅させることできる。それらのＶＨおよびＶＬ遺伝子を抗体発現ベクターにクローニングし、発現のために細胞（例えば、真核細胞または原核細胞）にトランスフェクトすることができる。
あるいは、当業者には周知の技法を用いて抗体生産細胞株を選択し、培養することができる。こうした技法は、様々な実験マニュアルおよび基本的な出版物に記載されている。これに関して、下で説明するような本発明での使用に適する技法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１）に記載されており、これらは、付録を含めてその全文、本明細書に参照として援用される。
本明細書に開示する治療方法において使用するための抗体は、抗体を合成するための当該技術分野では公知の任意の方法によって、特に、化学合成によってまたは好ましくは本明細書において説明するような組換え発現法によって生産することができる。
本発明の範囲が、抗原結合ＤＮＡ配列のすべての対立遺伝子、変異体および突然変異体をさらに包含することは、さらに理解されるであろう。
よく知られているように、ＲＮＡは、標準的な技法、例えば、イソチオシアン酸グアニジニウム抽出および沈降、その後の遠心分離またはクロマトグラフィーによって、当初のハイブリドーマからまたは他の形質転換細胞から単離することができる。望ましい場合には、標準的な技法、例えばオリゴｄＴセルロースでのクロマトグラフィーによって、ｍＲＮＡを全ＲＮＡから単離してもよい。適する技法は、当該技術分野においてよく知られている。
１つの実施形態において、抗体のＬおよびＨ鎖をコードするｃＤＮＡは、周知の方法に従って逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを使用して、同時にまたは別々に作製することができる。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーによって、または出版物に掲載されているＨおよびＬ鎖ＤＮＡならびにアミノ酸配列を基に特異性がより高いプライマーによって、開始させることができる。上で論じたように、ＰＣＲを用いて、抗体ＬおよびＨ鎖をコードするＤＮＡクローンを単離することもできる。この場合、コンセンサスプライマーまたはより大きな相同プローブ、例えばマウス定常領域プローブによってライブラリをスクリーニングすることができる。
当該技術分野において公知の技法を用いて、ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡを細胞から単離し、例えば組換えＤＮＡ法に関連する上記参照に、詳細に記載されている標準的で公知の技法に従って制限地図を作成し、配列決定することができる。勿論、単離プロセスまたはその後の分析中の任意の時点で本発明に従ってＤＮＡを合成することができる。
抗体またはそのフラグメント、誘導体もしくは類似体、例えばＳｐ３５アンタゴニストである抗体のＨまたはＬ鎖、の組換え発現には、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築が必要である。本発明の抗体分子または抗体のＨもしくはＬ鎖あるいはそれらの部分（好ましくは、ＨまたはＬ鎖可変領域を含有するもの）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、当該技術分野において周知の技法を用いて組換えＤＮＡ法により抗体分子生産のためのベクターを生産することができる。それ故、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含有するポリヌクレオチドを発現させることによる蛋白質の作製方法を個々で説明する。当業者には周知である方法を用いて、抗体コーディング配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ法、合成法、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。故に、本発明は、プロモータに作動可能に連結された、本発明の抗体分子またはそのＨもしくはＬ鎖またはＨもしくはＬ鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能ベクターを提供する。こうしたベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＰＣＴ国際公開パンフレット第８６／０５８０７号および同第８９／０１０３６号、ならびに米国特許第５，１２２，４６４号参照）を含むことができ、抗体分子の可変領域は、例えば全ＨまたはＬ鎖を発現させるためにそうしたベクターにクローニングすることができる。
その発現ベクターを従来の技法によって宿主細胞に移入し、その後、それらのトランスフェクトされた細胞を従来の技法によって培養して、本明細書に記載する方法において使用するための抗体を生産する。従って、本発明は、異種プロモータに作動可能に連結された、本発明の抗体またはそのＨもしくはＬ鎖をコードしているポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を包含する。２本鎖抗体の発現のための好ましい実施形態では、下で詳述するように、Ｈ鎖とＬ鎖の両方をコードするベクターを全免疫グロブリン分子の発現のために
宿主細胞において共発現させることができる。
様々な宿主−発現ベクター系を利用して、本明細書に記載する方法において使用するための抗体分子を発現させることができる。そうした宿主−発現系は、対象となるコーディング配列を生産し、その後、精製することができるビヒクルによって代表されるが、適切なヌクレオチドコーディング配列で形質転換またはトランスフェクトされたとき、インサイチューで本発明の抗体分子を発現することができる細胞によっても代表される。これらには、抗体コーディング配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された微生物、例えば細菌（例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；抗体コーディング配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ））；抗体コーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；抗体コーディング配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させた、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモータ（例えば、メタロチオネインプロモータ）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモータ（例えば、アデノウイルス後期プロモータ；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）を含有する組換え発現構築体を宿している哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、組換え抗体分子の発現には、細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、特に、全組換え抗体分子の発現にはさらに好ましくは真核細胞を使用する。例えば、ヒトサイトメガロウイルスからの主要中間体初期遺伝子プロモータ要素などのベクターと併用での哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）は、抗体のための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
細菌系では、抗体分子の発現を意図した用途に依存して、多数の発現ベクターを選択できることが有利である。例えば、抗体分子の医薬組成物の生成のために大量のそうした蛋白質を生産しなければならないとき、容易に精製される高レベルの融合蛋白質産物の発現を命じるベクターが望ましい場合がある。こうしたベクターとしては、抗体コーディング配列を、ｌａｃＺコード領域を有するフレーム内のベクターに個々にライゲートして、融合蛋白質を生産することができる大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ
ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ
＆ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９）；などが挙げられるが、これらに限定されない。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質として外来ポリペプチドを発現させるためにｐＧＥＸベクターを使用することもできる。一般に、こうした融合蛋白質は、可溶性であり、ならびにマトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、その後の遊離グルタチオン存在下での溶離によって溶解細胞から容易に精製することができる。トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むようにｐＧＥＸベクターを設計して、クローン化ターゲット遺伝子産物をそのＧＳＴ部分から遊離させることができる。
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして一般に使用される。このウイルスは、ツマヨウジクサヨウトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞内で成長する。抗体コーディング配列をそのウイル
スの非必須領域（例えば、ポロヘドリン遺伝子）に個々にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモータ（例えば、ポリヘドリンプロモータ）の制御下に置くことができる。
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルス系発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、対象となる抗体コーディング配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモータおよび３分節系リーダー配列、にライゲートすることができる。その後、このキメラ遺伝子をインビトロまたはインビボ組換えによりそのアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）への挿入により、感染した宿主において生育可能であり、抗体分子を発現することができる組換えウイルスが生じることとなる（例えば、Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１９８４）参照）。挿入された抗体コーディング配列の効率的な翻訳に特定の開始シグナルが必要な場合もある。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、この開始コドンは、全挿入物が確実に翻訳されるように、所望のコーディング配列のリーディングフレームと同相でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然と合成、両方の様々な起源のものであり得る。適切な転写エンハンサ要素、転写ターミネータなどを含めることにより、発現効率を向上させることができる（Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１−５４４ （１９８７）参照）。
加えて、挿入された配列の発現を変調する、または所望される特定のやり方で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする、宿主細胞株を選択することができる。蛋白質産物のこうした修飾（例えば、グリコシル化）および処理（例えば、切断）は、蛋白質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、蛋白質および遺伝子産物の後翻訳プロセッシングおよび修飾のための特有、且つ、特異的なメカニズムを有する。発現された外来蛋白質が確実に正しく修飾およびプロセッシングされるように、適切な細胞株または宿主系を選択するとができる。この目的のために、１次転写産物の適切なプロセッシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。こうした哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、ならびに特に、乳癌細胞株（例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ）および正常乳腺細胞株（例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。
組換え蛋白質の長期高収率生産のために、安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞株を設計製作することができる。ウイルス性複製起点を有する発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御要素（例えば、プロモータ、エンハンサ、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）および選択可能マーカーによって制御されたＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡ導入後、設計製作された細胞を強化培地中で１〜２日成長させることができ、その後、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択可能マーカーにより、その選択に対する耐性が付与され、細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定して組み込み、成長させて細胞増殖巣を作ることができ、そしてまたそれらの巣をクローニングし、細胞株へと増殖させることができる。有利には、この方法を用いて、抗体分子を安定して発現する細胞株を設計製作することができる。
単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：８１７ １９８０）遺伝子（それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞において用いることができる）を含むが、これらに限定されない多数の選択系を使用することができる。また、次の遺伝子についての選択の基準として代謝拮抗物質耐性を用いることができる：メトトレキセートに対する体制を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３））；ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（Ｍａｙ，１９９３））；およびヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４）。用いることができる、組換えＤＮＡ法の技術分野で一般に知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｌｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されており、これらは、それら全文、本明細書に参照として援用される。
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増加させることができる（概要については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３．（１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系内のマーカーが、増幅可能であるとき、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤レベルが増加すると、マーカー遺伝子のコピー数が増加することとなる。増幅領域は抗体遺伝子と関連しているので、抗体の生産も増加することとなる（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター（Ｈ鎖由来ポリペプチドをコードする第一ベクターおよびＬ鎖由来ポリペプチドをコードする第二ベクター）で同時トランスフェクトすることができる。これら２つのベクターは、Ｈ鎖ポリペプチドとＬ鎖ポリペプチドを等しく発現することができる同一の選択可能マーカーを含有し得る。あるいは、Ｈ鎖ポリペプチドとＬ鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターを使用してもよい。こうした状況では、毒性の遊離のＨ鎖過多を避けるために、Ｈ鎖より先にＬ鎖を配置すると有利である（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））。Ｈ鎖およびＬ鎖についてのコーディング配列が、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むこともある。
本発明の抗体分子を組換え発現させると、免疫グロブリン分子を精製するための当該技術分野では公知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、特にプロテインＡ後の特異的抗原に対する親和性によるもの、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、分別溶解によって、または蛋白質の精製のための他の任意の標準的な技法によってそれを精製することができる。あるいは、本発明の抗体の親和性を増大させるための好ましい方法は、米国特許第２００２ ０１２３０５７号Ａ１に開示されている。
１つの実施形態において、本発明の方法において使用するための結合分子または抗原結合分子は、１つまたはそれ以上のドメインが、部分的にまたは完全に欠失している合成定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。特定の実施形態において、相溶性修飾抗体は、全ＣＨ２ドメインが除去されているドメイン欠失構築体または変異体（ΔＣＨ２構築体）を含むであろう。他の実施形態については、短い連結ペプチドによりその欠失ドメインを置換して、可変領域の可撓性および移動自由度をもたらすことができる。抗体の異性化率に対するＣＨ２ドメインの調節特性のため、こうした構築体が特に好ましいことは、当業者には理解されるであろう。
特定の実施形態において、本明細書に開示する方法において使用するための修飾抗体は、低分子抗体である。低分子抗体は、当該技術分野において説明されている方法を用いて作製することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号または国際公開パンフレット第９４／０９８１７号Ａ１参照）。
もう１つの実施形態において、本明細書に開示する方法において使用するための修飾抗体は、当該技術分野において公知であるＣＨ２ドメイン欠失抗体である。ドメイン欠失構築体は、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクター（例えば、Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄからのもの）を使用して誘導することができる（例えば、国際公開パンフレット第０２／０６０９５５号Ａ２および同第０２／０９６９４８号Ａ２参照）。この具体例としてのベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失させ、ＩｇＧ１定常領域を欠失したドメインを発現する合成ベクターを生じさせるように、設計製作されたものである。
１つの実施形態において、本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５アンタゴニスト抗体またはそのフラグメントは、単量体サブユニット間の会合が可能である限り少数のまたはそれどころか単一のアミノ酸の欠失または置換を有する免疫グロブリンＨ鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択エリアにおける単一のアミノ酸の突然変異は、Ｆｃ結合を実質的に低下させ、それによって腫瘍局在化を増大させるために充分であり得る。同様に、変調すべきエフェクタ機能（例えば、補体結合）を制御する１つまたはそれ以上の定常領域の一部を単に欠失させることが望ましい場合もある。定常領域のこうした部分的欠失は、対象定常領域ドメインに関連した他の望ましい機能を無傷で残しながら、抗体の選択された特性（血清半減期）を向上させることができる。さらに、上で示したように、本開示抗体の定常領域は、結果として生じる構築体のプロフィールを向上させる１つまたはそれ以上のアミノ酸の突然変異または置換によって、合成することができる。これに関しては、修飾された抗体の立体配置および免疫原性プロフィールを実質的に維持しながら、保存結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって提供される活性を破壊することができる場合もある。さらに他の実施形態は、エフェクタ機能などの所望の特性を向上させるために、またはより多くの細胞毒素もしくは炭水化物を結合させるために、定常領域への１つまたはそれ以上のアミノ酸の付加を含む。こうした実施形態では、選択された定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入または複製することが望ましい場合がある。
本発明は、本明細書に記載する抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含む、それらから本質的に成る、またはそれらから成る抗体の使用も提供し、前記抗体またはそのフラグメントは、Ｓｐ３５ポリペプチドに免疫特異的に結合する。アミノ酸置換を結果としてもたらす部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発を含む（しかし、これらに限定さらない）当業者には公知の標準的な技法を用いて、結合分子をコードするヌクレオチド配列に突然変異を誘導することができる。好ましくは、前記変異体（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２またはＶＬＣＤＲ３を基準にして、５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、または２未満のアミノ酸置換をコードする。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を、同様の電荷の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することである。同様の電荷の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝型側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。あるいは、例えば飽和突然変異誘発によって、突然変異をコーディング配列のすべてまたは一部に沿ってランダムに誘導することができ、得られた突然変異体の生物活性をスクリーニングして、活性を保有する突然変異体を特定することができる。
例えば、抗体分子のフレームワーク領域のみまたはＣＤＲ領域のみに突然変異を導入することができる。誘導される突然変異は、サイレントまたは中立ミスセンス突然変異であり得、すなわち、抗原に結合する抗体の能力に対して影響を及ぼさないか、殆ど影響を及ぼさない。これらのタイプの突然変異は、コドン使用の最適化、またはハイブリドーマ抗体生産の向上に有用であり得る。あるいは、非中性ミスセンス突然変異によって、抗原に結合する抗体の能力を変えることができる。大部分のサイレントおよび中立ミスセンス突然変異の位置は、フレームワーク領域内である可能性が高く、一方、大部分の非中立突然変異の位置は、ＣＤＲ内である可能性が高いが、これは絶対要件ではない。当業者は、所望の特性を有する、例えば、抗原結合活性の改変または結合活性の改変（例えば、抗原結合活性の強化または抗体特異性の変化）がない突然変異体分子を設計し、検査することができるであろう。突然変異誘発後、コードされた蛋白質を慣習的に発現させ、本明細書に記載する技法を用いて、または当該技術分野では公知の慣習的に修飾法により、コードされた蛋白質の機能および／または生物活性を判定することができる。
融合蛋白質ならびにコンジュゲートポリペプチドおよび抗体
本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５ポリペプチドおよび抗体は、さらに、異種ポリペプチドのＮもしくはＣ末端に融合させることまたはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的にコンジュゲートすること（共有結合性および非共有結合性コンジュゲーションを含む）ができる。例えば、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体は、検出アッセイにおいて標識として有用な分子、およびエフェクタ分子（例えば、異種ポリペプチド、薬物、放射性核種または毒素）に組換え融合またはコンジュゲートすることができる。例えば、ＰＣＴ国際公開パンフレット第９２／０８４９５号、同第９１／１４４３８号および同第８９／１２６２４号、米国特許第５，３１４，９９５号ならびに欧州特許第３９６，３８７号参照。
本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドおよび抗体は、修飾されている（すなわち、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体がＳｐ３５の生物学的機能を阻害することをその共有結合が妨げないように、任意のタイプの分子を共有結合で結合させることにより修飾されている）誘導体を含む。例えば、限定としてではないが、本発明のＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドおよび抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、ホスフィル化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、公知保護基／ブロッキング基による誘導体化、蛋白質分解性切断、細胞性リガンドまたは他の蛋白質への連結などによって修飾されている。非常に多数の化学修飾はいずれも、公知の技法によって行うことができ、そうした技法としては、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、前記誘導体は、１つまたはそれ以上の非古典的アミノ酸を含有していてもよい。
本明細書に開示する治療方法において使用するためのＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドおよび抗体は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチド同配体によって互いに連結したアミノ酸から成り得、ならびに２０種の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含有していてもよい。Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドおよび抗体は、天然プロセス、例えば後翻訳プロセッシングによって、または当該技術分野では公知である化学修飾法によって、修飾することができる。こうした修飾は、基本テキストおよびより詳細な研究書ならびに豊富な研究文献に充分に記載されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノもしくはカルボキシル末端をはじめとする、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体内、または炭水化物などの部分上のいずれの場所においても行うことができる。所定のＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体内の幾つかの部位に、同じタイプの修飾が、同じまたは様々な程度で存在することがあることは、理解されるであろう。所定のＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体が、多数のタイプの修飾を含むこともある。Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体は、例えばユビキチン化の結果として分枝状である場合もあり、また環状であり、分枝を有するまたは有さない場合もある。環状、分枝状および分枝環状Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドおよび抗体は、後翻訳天然プロセスから得ることができ、または合成方法により作製することができる。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化、蛋白質分解性プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、転移ＲＮＡにより媒介されるアミノ酸の蛋白質への付加、例えばアルギニル化、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２ｎｄ
Ｅｄ．，（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８−６２（１９９２）参照。）
本発明は、Ｓｐ３５機能を阻害するＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体融合体を含む、それらから本質的に成る、またはそれらから成る融合蛋白質についても提供する。好ましくは、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体を融合させる異種ポ
リペプチドは、機能に有用であるか、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体のターゲッティングに有用である。本発明の特定の実施形態では、可溶性Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド、例えば、ＬＲＲドメイン、Ｉｇドメインまたは全細胞外ドメイン（配列番号２のアミノ酸３４から５３２に対応する）を含むＳｐ３５ポリペプチドを異種ポリペプチド部分と融合させてＳｐ３５アンタゴニスト融合ポリペプチドを形成する。Ｓｐ３５アンタゴニスト融合蛋白質および抗体は、様々な目的、例えば、血清半減期増加、バイオアベイラビリティ改善、特異的器官または組織タイプへのインビボターゲッティング、組換え発現効率向上、宿主細胞分泌向上、精製の容易さ、およびより高い結合力を達成するために使用することができる。達成すべき目的（複数を含む）に依存して、前記異種部分は、不活性である場合もあり、または生物活性である場合もある。また、これは、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドもしくは抗体に安定して融合するように、またはインビボもしくはインビトロで切断できるように選択することができる。これらの他の目的を達成するための異種部分は、当該技術分野において公知である。
Ｓｐ３５アンタゴニスト融合ポリペプチドまたは抗体の発現の代替として、選択された異種部分を予め形成し、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に化学的にコンジュゲートさせることができる。ほとんどの場合、選択される異種部分は、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に融合していようと、コンジュゲートしていようと、同様に機能するであろう。従って、異種アミノ酸配列についての以下の考察では、別様に注記しない限り、異種配列は、融合蛋白質の形態で、または化学的コンジュゲートとして、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に連結させることができると理解しなければならない。
薬理活性ポリペプチド、例えばＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体は、急速なインビボクリアランスを示すことが多く、従って、体内で治療有効濃度を達成するためには大きな用量を必要とする。加えて、約６０ｋＤａより小さいポリペプチドは、糸球体濾過を受ける可能性があり、時として腎毒性を導く。比較的小さいポリペプチド、例えばＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体、の融合またはコンジュゲーションを利用して、こうした腎毒性のリスクを低減または回避することができる。治療用ポリペプチドのインビボ安定性、すなわち血清半減期を増加させるための様々な異種アミノ酸配列、すなわち、ポリペプチド部分または「担体」が知られている。
その長い半減期、広いインビボ分布、および酵素または免疫グロブリン機能欠如のため、本質的に完全長のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはＨＳＡフラグメントが、通常、異種部分として使用される。Ｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１９０４−０８（１９９２）およびＳｙｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８９：３２４３−５２（１９９７）に教示されているものなどの方法および材料の適用により、ＨＳＡを使用して、Ｓｐ３５部分によって薬理活性を示す一方で（例えば、１０倍から１００倍高い）インビボ安定性の有意な増大を示すＳｐ３５アンタゴニスト融合ポリペプチドもしくは抗体またはポリペプチド／抗体コンジュゲートを形成することができる。ＨＳＡのＣ末端を可溶性Ｓｐ３５部分のＮ末端に融合させることができる。ＨＳＡは、自然分泌蛋白質であるので、ＨＳＡシグナル配列を利用して、可溶性Ｓｐ３５融合蛋白質が真核性（例えば、哺乳動物）発現系において生産されたときに細胞培養培地にその可溶性Ｓｐ３５融合蛋白質が分泌されるようにすることができる。
前記シグナル配列は、小胞体膜を横断する蛋白質輸送を開始させるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。イムノヒュージン（ｉｍｍｕｎｏｆｕｓｉｎ）を構築するために有用なシグナル配列としては、抗体Ｌ鎖シグナル配列、例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１２５：１９１−２０２（１９８９））、抗体Ｈ鎖シグナル配列、例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体Ｈ鎖シグナル
配列（Ｓａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８６：５７７４（１９８０））が挙げられる。あるいは、他のシグナル配列を使用することができる。例えば、Ｗａｔｓｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：５１４５（１９８４）参照。シグナルペプチドは、通常、シグナルペプチダーゼにより小胞体の内腔において切断される。この結果、Ｆｃ領域および可溶性Ｓｐ３５部分を含有するイムノヒュージン蛋白質が分泌される。
一部の実施形態において、ＤＮＡ配列は、分泌カセットと可溶性Ｓｐ３５部分の間に蛋白質分解性切断部位をコードすることができる。こうした切断部位は、コードされた融合蛋白質の蛋白質分解性切断を規定することができ、従って、Ｆｃドメインとターゲット蛋白質を分けることができる。有用な蛋白質分解性切断部位としては、蛋白質分解酵素、例えばトリプシン、プラスミン、トロンビン、Ｘａ因子またはエンテロキナーゼＫ、によって認識されるアミノ酸配列が挙げられる。
分泌カセットを複製可能発現ベクターに組み込むことができる。有用なベクターとしては、線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミドなどが挙げられる。具体例としての発現ベクターは、ｐｄＣであり、これは、そのイムノヒュージンＤＮＡの転写が、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサまたはプロモータの制御下に置かれている。例えば、Ｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０８８：７１２（１９９１）；およびＬｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １１：４９５−５００（１９９８）参照。可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドをコードし、その可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドの発現および分泌に使用することができるＤＮＡで、適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができる。一般に使用される宿主細胞としては、不朽ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、およびＣＯＳ細胞が挙げられる。
１つの実施形態において、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、ヒンジおよびＦｃ領域、すなわち、Ｉｇ Ｈ鎖定常領域のＣ末端部分、に融合している。Ｓｐ３５−Ｆｃ融合の潜在的な利点としては、溶解度、インビボ安定性および多価、例えば二量体化が挙げられる。用いられるＦｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＧ Ｆｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）であり得る。あるいは、ＩｇＥまたはＩｇＭ Ｆｃ領域（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４）であり得る。ＩｇＧ Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域が一般に用いられる。１つの実施形態において、ＩｇＧ Ｆｃを化学的に規定するパパイン切断部位（すなわち残基２１６；Ｋａｂａｔシステムに従って１１４になるようにＨ鎖定常領域の第一残基を取る）または他の免疫グロブリンの類似部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まる配列が、融合に利用される。融合がなされる正確な部位は重要ではない。個々の部位は周知であり、それらを選択して、その分子の生物活性、分泌または結合特性を最適化することができる。Ｆｃ融合体をコードするＤＮＡを構築および発現させる材料および方法は、当該技術分野において公知であり、それらを適用して、過度の実験を伴わずに可溶性Ｓｐ３５融合体を得ることができる。本発明の一部の実施形態は、Ｃａｐｏｎらの米国特許第５，４２８，１３０号および同第５，５６５，３３５号に記載されているものなどのＳｐ３５融合蛋白質を利用する。
完全に無傷の野生型Ｆｃ領域は、本発明の方法において使用されるＦｃ融合蛋白質において通常必要ではなく、望ましくないエフェクタ機能を提示する。従って、一般に、分泌カセットの構築中にＦｃ領域から一定の結合部位を欠失させる。例えば、Ｌ鎖と共発現する必要がないので、Ｈ鎖結合蛋白質のための結合部位、Ｂｉｐ（Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ８：１１１−１４（１９８７））をＩｇＥのＦｃ領域のＣＨ２ドメインから欠失させて、この部位がイムノヒュージンの有効な分泌に干渉しないようにする。ＩｇＭに存在するものなどの膜貫通ドメイン配列も、一般に、欠失させる。
ＩｇＧ１ Ｆｃ領域が、最も頻繁に用いられる。あるいは、免疫グロブリンガンマの他のサブクラス（ガンマ−２、ガンマ−３およびガンマ−４）のＦｃ領域を分泌カセットにおいて用いることができる。免疫グロブリンガンマ−１のＩｇＧ１ Ｆｃ領域が、分泌カセットにおいて一般に用いられ、これは、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。一部の実施形態において、免疫グロブリンガンマ−１のＦｃ領域は、ヒンジ領域の少なくとも一部およびＣＨ３領域を含むが、ＣＨ２領域を含まない、ＣＨ２欠失Ｆｃである。ＣＨ２欠失Ｆｃは、Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ １：４７（１９９０）により記載されている。一部の実施形態では、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭのうちの１つのＦｃ領域を用いる。
Ｓｐ３５−Ｆｃ融合蛋白質は、幾つかの異なる立体配置で構築することができる。１つの立体配置では、可溶性Ｓｐ３５部分のＣ末端が、Ｆｃヒンジ部分のＮ末端に直接融合している。僅かに異なる立体配置では、短いポリペプチド、例えば２〜１０個のアミノ酸が、可溶性Ｓｐ３５部分のＮ末端とＦｃ部分のＣ末端の間の融合に組み込まれている。こうしたリンカーは、配座的柔軟性をもたらし、これは、一部の環境では生物活性を改善し得る。ヒンジ領域の充分な部分が、Ｆｃ部分に保持されている場合、Ｓｐ３５−Ｆｃ融合体は、二量体化することとなり、従って二価分子を形成することとなる。単量体Ｆｃ融合体の均質集団は、単一特異性二価二量体を生じさせるであろう。各々が異なる特異性を有する２つの単量体Ｆｃ融合体の混合物は、二重特異性二価二量体を生じさせるであろう。
対応するアミノ反応性基およびチオール反応性基を含有する多数の架橋剤のうちのいずれかを用いて、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドを血清アルブミンに連結させることができる。適するリンカーの例としては、チオール反応性マレイミドを挿入するアミン反応性架橋剤、例えばＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳおよびＧＭＢＳが挙げられる。他の適するリンカー、例えばＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢは、チオール反応性ハロアセテート基を挿入する。スルフヒドリル基との反応に保護または非保護チオールを提供して還元可能な連結を生じさせるリンカーとしては、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡおよびＳＡＴＰが挙げられる。こうした試薬は、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
コンジュゲーションは、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドのＮ末端または血清アルブミン上のチオール部分を関係させる必要がない。例えば、可溶性Ｓｐ３５−アルブミン融合体は、可溶性Ｓｐ３５部分を血清アルブミン遺伝子のＮ末端、Ｃ末端または両方に融合させる遺伝子操作法を用いて得ることができる。
可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドを異種ペプチドに融合させて、その可溶性Ｓｐ３５部分の精製または特定を助長することができる。例えば、ヒスチジンタグを可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドに融合させて、市販のクロマトグラフィー媒質の使用により精製を助長することができる。
本発明の一部の実施形態では、可溶性Ｓｐ３５融合構築物を使用して、細菌における可溶性Ｓｐ３５部分の生産を増進させる。こうした構築物では、高レベルで正常に発現および／または分泌された細菌性蛋白質を可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドのＮ末端融合パートナーとして利用する。例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ６７：３１（１９８８）；Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４（１９８８）；Ｌａ Ｖａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１８７（１９９３）参照。
適する融合パートナーのアミノおよびカルボキシ末端での可溶性Ｓｐ３５部分の融合に
より、二価形または四価形の可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドを得ることができる。例えば、可溶性Ｓｐ３５部分をＩｇ部分のアミノおよびカルボキシ末端に融合させて、２つの可溶性Ｓｐ３５部分を含有する二価単量体ポリペプチドを生産することができる。Ｉｇ部分によりこれらの単量体の２つが二量体化すると、四価形の可溶性Ｓｐ３５部分が得られる。こうした多価形を用いて、ターゲットに対する結合親和性の増大を達成することができる。多価形の可溶性Ｓｐ３５は、単独で利用することができる、またはＩｇもしくはＨＳＡなどの融合パートナーに融合させることができるコンカテマーを形成するように可溶性Ｓｐ３５をタンデムに配置することによっても得ることができる。
コンジュゲートポリマー（ポリペプチド以外）
本発明の一部の実施形態は、１つまたはそれ以上のポリマーがＳｐ３５ポリペプチドまたはＳｐ３５抗体にコンジュゲート（共有結合）している可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドを含む。こうしたコンジュゲーションに適するポリマーの例としては、ポリペプチド（上で説明したもの）、糖ポリマーおよびポリアルキレングリコール鎖が挙げられる。典型的に、しかし必須ではないが、以下の１つまたはそれ以上の改善を目的として可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドまたはＳｐ３５抗体にポリマーをコンジュゲートさせる：溶解度、安定性またはバイオアベイラビリティ。
Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体へのコンジュゲーションに一般に用いられるポリマーのクラスは、ポリアルキレングリコールである。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が最もよく用いられている。ＰＥＧ部分、例えば、１、２、３、４または５個のＰＥＧポリマーを各Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体にコンジュゲートさせて、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体単独と比較して血清半減期を増加させることができる。ＰＥＧ部分は、非抗原性であり、本質的に生物不活性である。本発明の実施の際に用いるＰＥＧ部分は、分枝状であってもよいし、非分枝状であってもよい。
Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に結合させるＰＥＧ部分の数および個々のＰＥＧ鎖の分子量は、様々であり得る。一般に、ポリマーの分子量が高いほど、ポリペプチドに結合させるポリマーの数は少ない。通常、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に結合させる全ポリマー質量は、２０ｋＤａから４０ｋＤａである。従って、１つのポリマー鎖が結合している場合、その鎖の分子量は、一般に、２０〜４０ｋＤａである。２本の鎖が結合している場合、各鎖の分子量は、一般に１０〜２０ｋＤａである。３本の鎖が結合している場合、その分子量は、一般に、７〜１４ｋＤａである。
ポリマー、例えばＰＥＧは、ポリペプチド上の任意の適する露出反応性基によりＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体に連結させることができる。この（これらの）露出反応性基は、例えば、分子内リシン残基のＮ末端アミノ基もしくはイプシロンアミノ基または両方であり得る。活性化ポリマーは、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体上の任意の遊離アミノ基で反応し、共有結合することができる。Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体の遊離カルボン酸基、適切に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化された炭水化物部分およびメルカプト基（利用可能な場合）も、ポリマーを結合させるための反応性基として用いることができる。
コンジュゲーション反応には、ポリペプチド濃度に依存して、ポリペプチドのモル当たり約１．０から約１０ｍｏｌの活性化ポリマーが、一般に利用される。通常、選択される比率は、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体の所望の薬理活性を付与することができる、反応を最大にすると同時に副反応（多くの場合、非特異的なもの）を最小にするバランスを表す。好ましくは、（例えば、本明細書に記載するまたは当該技術分野に
おいて公知のアッセイのいずれかにおいて実証されるような）Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体の生物活性の少なくとも５０％が維持され、最も好ましくはほぼ１００％が維持される。
ポリマーは、通常の化学作用を用いてＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体にコンジュゲートすることができる。例えば、ポリアルキレングリコール部分は、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体のリシンイプシロンアミノ基にカップリングさせることができる。リシン側鎖への連結は、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、例えばＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）およびスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）を用いて行うことができる。適するポリアルキレングリコール部分としては、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳおよびノルロイシン−ＮＨＳ，ＳＣが挙げられる。これらの試薬は、市販されている。追加のアミン反応性ＰＥＧリンカーでスクシンイミジル部分を置換してもよい。これらには、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカーボネート（ＰＮＰ）、エポキシ化合物、ベンゾトリアゾールカーボネート、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾールおよびＰＮＰカーボネートが挙げられる。通常、反応の選択性および程度を最大にするように条件を最適化する。反応条件のこうした最適化は、通常の当業者の範囲内である。
ＰＥＧ化は、当該技術分野において公知のＰＥＧ化反応のいずれによって行ってもよい。例えば、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３：４−１０（１９９２）、ならびに欧州特許出願第０ １５４ ３１６号および同第０ ４０１ ３８４号参照。ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を用いて行うことができる。
アシル化によるＰＥＧ化は、一般に、ポリエチレングリコールの活性エステル誘導体を反応させることを含む。任意の反応性ＰＥＧ分子をこのＰＥＧ化に利用することができる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とエステルを形成したＰＥＧは、頻繁に用いられる活性化ＰＥＧエステルである。本明細書で用いる場合、「アシル化」は、治療用蛋白質と水溶性ポリマー、例えばＰＥＧ、の間の次のタイプの連結が挙げられるが、それらに限定されない：アミド、カルバメート、ウレタンなど。例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０，１９９４参照。反応パラメータは、一般に、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドを損なうまたは不活性化する温度、溶媒およびｐＨ条件を避けるように選択される。
一般に、連結基はアミドであり、結果として生じる生成物の少なくとも９５％は、モノ、ジまたはトリＰＥＧ化されている。しかし、用いられる特定の反応条件に依存する量で、より高いＰＥＧ化度を有する何らかの化学種が形成されることがある。場合によっては、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水性交換クロマトグラフィーおよび電気泳動をはじめとする従来の精製法によって、精製ＰＥＧ化種をその混合物、特に未反応の化学種から分離する。
アルキル化によるＰＥＧ化は、一般に、還元剤の存在下でＰＥＧの末端アルデヒド誘導体とＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体を反応させることを含む。加えて、実質的にＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体の末端アミノ基のみでのＰＥＧ化、すなわちモノＰＥＧ化蛋白質、をもたらすように反応条件を操作することができる。モノＰＥＧ化またはポリＰＥＧ化、いずれの場合においても、ＰＥＧ基は、一般に、−ＣＨ２−ＮＨ−基により蛋白質に結合させる。特に−ＣＨ２−基に関して、このタイプの連結は、「アルキル」連結として知られている。
Ｎ末端をターゲットにしてモノＰＥＧ化した生成物を生成するための還元的アルキル化による誘導体化は、誘導体化に利用できる、異なるタイプの第一アミノ基（リシン対Ｎ末端）の異なる反応性を活用する。反応は、リシン残基のイプシロン−アミノ基間のｐＫａ差およびその蛋白質のＮ末端アミノ基のｐＫａを利用することができるｐＨで行う。こうした選択的誘導体化により、蛋白質への反応性基（例えば、アルデヒド）を含有する水溶性ポリマーの結合を制御する：ポリマーとのコンジュゲーションは、その蛋白質のＮ末端で主として発生し、他の反応性基、例えばリシン側鎖アミノ基の有意な修飾は起こらない。
アシル化アプローチとアルキル化アプローチの両方において用いるポリマー分子は、水溶性ポリマーの中から選択される。典型的に、選択されるポリマーは、本方法において規定されるとおり重合度を制御することができるように、単一の反応性基、例えばアシル化については活性エステルまたはアルキル化についてはアルデヒド、を有するように修飾されている。具体例としての反応性ＰＥＧアルデヒドは、水溶性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであるか、そのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である（例えば、Ｈａｒｒｉｓらの米国特許第５，２５２，７１４号参照）。このポリマーは、分枝状であってもよいし、非分枝状であってもよい。アシル化反応のために選択されるポリマーは、典型的に、反応性エステル基を有する。還元アルキル化のために選択されるポリマーは、典型的に、単一の反応性アルデヒド基を有する。一般に、前記水溶性ポリマーは、天然グリコシル残基からは選択されないであろう。これらは、通常、哺乳動物組換え発現系によってより適便に作られるためである。
ＰＥＧ化可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドまたは抗体を作製する方法は、一般に、（ａ）Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体とポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とを、その分子が１つまたはそれ以上のＰＥＧ基に結合するようになる条件下で反応させる段階、および（ｂ）反応生成物（複数を含む）を得る段階を含む。一般に、アシル化反応のための最適な反応条件は、公知のパラメータおよび所望の結果に基づいてケースバイケースで決定されるであろう。例えば、ＰＥＧの蛋白質に対する比率が大きいほど、一般に、ポリＰＥＧ化生成物の割合が大きくなる。
モノ−ポリマー／可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドまたはＳｐ３５抗体の実質的に均質な集団を生成するための還元アルキル化は、一般に、（ａ）可溶性Ｓｐ３５蛋白質またはポリペプチドと反応性ＰＥＧ分子とを、還元アルキル化条件下、そのポリペプチドまたは抗体のＮ末端アミノ基のｐｅｎ−ｎｉｔ選択的修飾に適するｐＨで反応させる段階、および（ｂ）反応生成物（複数を含む）を得る段階を含む。
モノ−ポリマー／可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドまたはＳｐ３５抗体の実質的に均質な集団のための還元アルキル化反応条件は、そのポリペプチドまたは抗体のＮ末端への水溶性ポリマー部分の選択的結合を可能ならしめる条件である。こうした反応条件は、一般に、リシン側鎖アミノ基とそのＮ末端アミノ基の間のｐＫａ差を規定する。本発明のために、ｐＨは、一般に３〜９、典型的には３〜６の範囲内である。
可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドまたは抗体は、タグ、例えば蛋白質分解によって後に放出させることができる部分、を含むことができる。例えば、リシン部分は、リシンとＮ末端の両方と反応するであろう低分子量リンカー、例えばトラウト試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｐｉｅｒｃｅ）で修飾されたＨｉｓタグと先ず反応させること、次にそのＨｉｓタグを放出させることによって、選択的に修飾することができる。その時、このポリペプチドは、チオール反応性頭部（ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐ）、例えばマレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基または遊離もしくは保護ＳＨ、を含有するＰＥＧで
選択的に修飾することができる、遊離ＳＨ基を含有するであろう。
トラウト試薬は、ＰＥＧを結合させるための特異的部位を設定することとなる任意のリンカーで置換することができる。例えば、トラウト試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡまたはＳＡＴＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）で置換することができる。同様に、マレイミドを挿入するアミン反応性リンカー（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳもしくはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基を挿入するアミン反応性リンカー（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）またはビニル基を挿入するアミン反応性リンカーと蛋白質を反応させ、結果として生じる生成物を、遊離ＳＨを含有するＰＥＧと反応させることができる。
一部の実施形態では、ポリアルキレングリコール部分をＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドまたは抗体のシステイン基にカップリングさせる。カップリングは、例えばマレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基またはチオール基を用いて、行うことができる。
場合によっては、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドまたは抗体を不安定な結合によってポリエチレングリコール部分にコンジュゲートさせる。例えば、生化学的加水分解、蛋白質分解またはスルフヒドリル切断で、その不安定な基を切断する。例えば、その結合は、インビボ（生理）条件下で切断することができる。
これらの反応は、生物活性材料を不活性ポリマーと反応させるために用いられる任意の適する方法により、その反応性基がアルファアミノ基上のＮ末端にある場合には、一般に、約ｐＨ５〜８、例えばｐＨ５、６、７または８で行うことができる。一般に、このプロセスは、活性化ポリマーを調製すること、その後、蛋白質をその活性化ポリマーと反応させて、調合に適する可溶性蛋白質を生成することを含む。
Ｓｐ３５ポリヌクレオチドアンタゴニスト
特定の実施形態は、脱髄または髄鞘形成不全を治療する方法を含み、この方法は、Ｓｐ３５をコードするポリヌクレオチドに特異的に結合する核酸分子を含むＳｐ３５ポリヌクレオチドアンタゴニストの有効量を投与することを含む。前記Ｓｐポリヌクレオチドアンタゴニストは、Ｓｐ３５の発現を防止する（ノックダウン）。Ｓｐ３５ポリヌクレオチドアンタゴニストとしては、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびＲＮＡｉが挙げられるが、これらに限定されない。典型的に、こうした結合分子は、動物に別々に投与される（例えば、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１））が、こうした結合分子は、宿主細胞によって吸収され、インビボで発現されるポリヌクレオチドからインビボで発現されることもある。例えば、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）も参照。
ＲＮＡｉは、被ターゲティングｍＲＮＡの発現に干渉しないＲＮＡの発現を指す。具体的には、ＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；短鎖干渉ＲＮＡ）により特定のｍＲＮＡ（例えば、Ｓｐ３５）と相互作用することによって、被ターゲティング遺伝子を沈黙させる。その後、そのｄｓＲＮＡ複合体を細胞による分解にターゲッティングする。さらなるＲＮＡｉ分子としては、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられ、これは、短鎖干渉ヘアピンとも呼ばれる。ｓｈＲＮＡ分子は、ループにより連結されたターゲット遺伝子からのセンスおよびアンチセンス配列を含有する。ｓｈＲＮＡは、核から細胞質に輸送され、ｍＲＮＡと一緒に分解される。Ｐｏ１ ＩＩＩまたはＵ６プロモータを用いて、ＲＮＡｉのためのＲＮＡを発現させることができる。
ＲＮＡｉは、それらの「ターゲット」ｍＲＮＡへの配列特異的相同性を有する２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子によって媒介される（Ｃａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：９７４２−９７４７，２００１）。ショウジョウバエ無細胞溶解産物に関する生化学的研究は、ＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングの媒介因子が、２１〜２５のヌクレオチド「小分子干渉性（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）」ＲＮＡ２本鎖（ｓｉＲＮＡ）であることを示している。従って、ｓｉＲＮＡ分子は、本発明の方法において有利に利用される。ｓｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−３６６，２００１）として知られているＲＮアーゼによるｄｓＲＮＡのプロセッシングから誘導される。ｓｉＲＮＡ２本鎖産物は、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体）と呼ばれる多蛋白質ｓｉＲＮＡ複合体に補充されると思われる。いずれの特定の理論による拘束も望まないが、ＲＩＳＣは、ターゲットｍＲＮＡへ誘導されると考えられ、この場合、ｓｉＲＮＡ２本鎖は、配列特異的に相互作用して、触媒的に切断を媒介する（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−３６６，２００１；Ｂｏｕｔｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：１７７６−１７８０，２００１）。
ＲＮＡｉは、非限定的な例としてニューロン（Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１１９２６−１１９２９，２００２）を含む哺乳動物細胞において、遺伝子機能を分析し、必須遺伝子を特定するために用いられている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６：１９９−２１３，２００２；Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１４：４５５７−４５６５，２００１）。ＲＮＡｉは、ポリオウイルス（Ｇｉｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１８：３７９−３８０，２００２）およびＨＩＶ（Ｃａｐｏｄｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：５１９６−５２０１，２００２）をはじめとする（しかし、これらに限定されない）ウイルスの感染、複製および／または成長の阻害または遮断、ならびに癌遺伝子（例えば、ｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子；Ｓｃｈｅｒｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｐ ２６ ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ，２００２）の発現減少などの、治療様式についても評価されている。ＲＮＡｉは、哺乳動物（マウス）および両生類（アフリカツメガエル）の胚において遺伝子発現を変調させるために用いられており（それぞれ、Ｃａｌｅｇａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１４２３６−１４２４０，２００２；およびＺｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：１６６４−１６６９，２００２）、出生後のマウスにおいて遺伝子発現を変調するために用いられており（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３２：１０７−１０８，２００２）、ならびに成熟トランスジェニックマウスにおいてトランスジーンの発現を減少させるために用いられている（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１８：３８−３９，２００２）。細胞培養およびインビボでのｓｉＲＮＡの有効度および特異性を判定するための方法が記載されている（例えば、Ｂｅｒｔｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９６：１０００−１００４，２００２；Ｌａｓｓｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ ＳＴＫＥ ２００２（１４７）：ＰＬ１３，２００２；およびＬｅｉｒｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９５：７４４−７４８，２００２参照）。
ｓｉＲＮＡをはじめとする（しかし、これに限定されない）、ＲＮＡｉを媒介する分子は、化学的合成（Ｈｏｈｊｏｈ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５２１：１９５−１９９，２００２）、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：９９４２−９９４７，２００２）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼでのインビトロ転写（Ｄｏｎｚｅｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ４６，２００２；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：６０４７−６０５２，２００２）、および大腸菌ＲＮアーゼＩＩＩなどのヌクレアーゼを用いる２本鎖ＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：９９４２−９９４７，２００２）によってインビトロで生産することができる。
ｓｉＲＮＡ分子は、２つのオリゴヌクレオチドを互いにアニーリングすることによっても形成することができ、典型的に、２本鎖部分と１本鎖部分の両方を含む次の一般構造を有する：
Figure 0004960865
 上記構造において、Ｎ、ＸおよびＹは、ヌクレオチドであり、Ｘ水素は、Ｙに結合し、「：」は、二塩基間の水素結合を意味し、ｘは、１と約１００の間の値を有する自然数であり、ならびにｍおよびｎは、独立して、０と約１００の間の値を有する全整数である。一部の実施形態において、Ｎ、ＸおよびＹは、独立して、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴまたはＵである。特に合成ｓｉＲＮＡ（すなわち、２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングした産物）の場合、非天然塩基およびヌクレオチドが存在し得る。２本鎖中央セクションは、「コア」と呼ばれ、測定単位として塩基対（ｂｐ）を有し；１本鎖部分は、オーバーハングと呼ばれ、測定単位としてヌクレオチド（ｎｔ）を有する。示されているオーバーハングは、３’オーバーハングであるが、５’オーバーハングを有する分子も本発明の範囲内である。オーバーハングを有さないｓｉＲＮＡ（すなわち、ｍ＝０およびｎ＝０）ならびにコアの一方の端にオーバーハングを有するが、他方には有さないもの（例えば、ｍ＝０およびｎ≧１、またはその逆）も本発明の範囲内である。
最初、ＲＮＡｉ法は、哺乳動物系に容易に適用できるとは考えられなかった。これは、哺乳動物ではｄｓＲＮＡがｄｓＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を活性化し、その結果、アポトーシスカスケードおよび細胞死が生じるためである（Ｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：３２７９−３２８３，１９９７）。加えて、哺乳動物細胞ではｄｓＲＮＡがインターフェロンカスケードを活性化し、それが細胞生理の変化を導く場合もあることは、以前から知られている（Ｃｏｌｂｙ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：３３３，１９７１；Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：５１７，１９７２；Ｌａｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５８Ｌ７８２，１９６７；Ｌｏｍｎｉｃｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８：５５，１９７０；およびＹｏｕｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９２：８６２，１９６６）。しかし、ＰＫＲおよびインターフェロンカスケードのｄｓＲＮＡ媒介活性化は、約３０塩基対より長いｄｓＲＮＡを必要とする。対照的に、長さが３０塩基対未満のｄｓＲＮＡが哺乳動物細胞においてＲＮＡｉを生じさせないことは実証されている（Ｃａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９７４２−９７４７，２００１）。従って、より長いｄｓＲＮＡ分子に付随する望ましくない非特異的な効果は、より長いｄｓＲＮＡが実質的に無い短いＲＮＡを作製することによって、回避することができる。
ｓｉＲＮＡに関する参照：Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９
：３６３−３６６，２００１；Ｂｏｕｔｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：１７７６−１７８０，２００１；Ｃｕｌｌｅｎ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５９７−５９９，２００２；Ｃａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：９７４２−９７４７，２００１；Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：９５０−９５２，１９９９；Ｎａｇａｓｅ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓ．６：６３−７０，１９９９；Ｎａｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ ２：２７９−２８９，１９９０；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ １３：６７−７３，２００２；Ｐａｒｒｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６：１０７７−１０８７，２０００；Ｒｏｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６：３３４３−３３５３，１９９２；Ｔａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ９９：１２３−１３２，１９９９；およびＴｕｓｃｈｌ，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２：２３９−２４５，２００１。
Ｐａｄｄｉｓｏｎら（Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８，２００２）は、ＲＮＡｉをもたらすための手段としてヘアピン形に折り畳まれた小さなＲＮＡ分子を使用した。従って、こうした短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子も、本発明の方法において有利に利用される。機能的ｓｈＲＮＡの幹およびループの長さは様々であり、幹の長さは、約２５から約３０ｎｔの範囲であり得、ループのサイズは、サイレンシング活性に影響を及ぼさない、４〜約２５ｎｔの間の範囲であり得る。いずれの特定の理論による拘束も望まないが、これらのｓｈＲＮＡは、ＤＩＣＥＲ ＲＮアーゼのｄｓＲＮＡ産物に似ており、少なくとも、特定の遺伝子の発現の阻害に関して同じ能力を有すると考えられる。
本発明の一部の実施形態において、ｓｈＲＮＡは、実施例１において説明するようにレンチウイルスベクター（ｐＬＬ３．７）から発現される。
アンチセンス法を用いて、アンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡによりまたは三重らせん形成により遺伝子発現を制御することができる。アンチセンス法は、例えば、Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９８８）において論じられている。三重らせん形成は、例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；およびＤｅｒｖａｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３００（１９９１）において論じられている。これらの方法は、相補ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。
例えば、Ｓｐ３５をコードするポリヌクレオチドの５’コーディング部分を用いて、長さ約１０から４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計することができる。転写に関与する遺伝子の領域に相補的になるようにＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計し、それによってターゲット蛋白質の転写および生産を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ターゲットポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳を阻止する。
１つの実施形態では、Ｓｐ３５遺伝子に特異的なアンチセンス核酸を、外因性配列からの転写により、細胞内で生産する。例えば、ベクターまたはその一部を転写し、それによってアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生産する。こうしたベクターは、転写させて、所望のアンチセンスＲＮＡを生産できるのであれば、エピソームのままであってもよいし、または染色体によって組み込んでもよい。こうしたベクターは、当該技術分野では標準的な組換えＤＮＡ法によって構築することができる。ベクターは、脊椎動物細胞における複製および発現に用いられる、プラスミドベクター、ウイルスベクター、または当該技術分野で
は公知の他のベクターであり得る。アンチセンス分子の発現は、脊椎動物、好ましくはヒト細胞、例えば本明細書中の他の場所で説明されているもの、において作用することが当該技術分野において知られている任意のプロモータによる発現であり得る。
アンチセンス分子の絶対相補性は、好ましいが、欠かせないものではない。Ｓｐ３５をコードするＲＮＡの少なくとも一部に相補的な配列とは、ＲＮＡでハイブリダイズして安定な２本鎖を形成することが可能であるために充分な相補性を有する配列を意味し、すなわち、３本鎖の形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補度と長さの両方に依存するであろう。一般に、ハイブリダイズする核酸が大きく、塩基のミスマッチが多いほど、安定な２本鎖（または場合によっては３本鎖）を含有およびさらに形成するこができる。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を判定する標準的な手順を用いることにより、許容できるミスマッチ度を突き止めることができる。
メッセンジャーＲＮＡの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド、例えば、ＡＵＧ開始コドンまでの（前記コドンを含む）５’非翻訳配列は、翻訳阻害時に最も効率的に働くであろう。しかし、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列もｍＲＮＡの翻訳阻害時に有効であることが証明された。一般に、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７２：３３３−３３５（１９９４）参照。従って、５’−非翻訳非コーディング領域または３’−非翻訳非コーディング領域のいずれに相補的なオリゴヌクレオチドも、Ｓｐ３５の翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチにおいて用いることができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの補体を含むであろう。ｍＲＮＡコーディング領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、あまり有効な翻訳阻害剤でないが、本発明に従って用いることができる。アンチセンス核酸は、長さが少なくとも６ヌクレオチド、好ましくは、長さが６から約５０ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の態様において、前記ヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
本明細書に開示する治療方法において使用するためのポリヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖の、ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾バージョンであり得る。本オリゴヌクレオチドをその塩基部分、糖部分またはリン酸骨格において修飾して、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを向上させることができる。本オリゴヌクレオチドは、他の結合する基、例えば、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞受容体をターゲティングするため）、または細胞膜を横断する輸送を助長する物質（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２（１９８７））；１９８８年１２月１５日発行のＰＣＴ国際公開パンフレット第８８／０９８１０号参照）または血液脳関門を横断する輸送を助長する物質（例えば、１９８８年４月２５日発行のＰＣＴ国際公開パンフレット第８９／１０１３４号参照）、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤（例えば、Ｋｒｏｌ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
６：９５８−９７６（１９８８）参照）、または挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ
ａｇｅｎｔｓ）を含むことができる。（例えば、Ｚｏｎ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９（１９８８）参照。）この目的のために、本オリゴヌクレオチドを、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発型架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤などにコンジュゲートさせてもよい。
本明細書に開示する治療方法において使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、５フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシ
ル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ−６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３（３−アミノ−３−Ｎ２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む（しかし、これらに限定されない）群から選択される少なくとも１つの修飾塩基部分を含むことができる。
本明細書に開示する治療方法において使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む（しかし、これらに限定されない）群から選択される少なくとも１つの修飾糖部分も含むことができる。
さらにもう１つの実施形態において、本明細書に開示する治療方法において使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびこれらのホルムアセタールまたは類似体を含む（しかし、それらに限定されない）群から選択される少なくとも１つの修飾リン酸骨格を含む。
さらにもう１つの実施形態において、本明細書に開示する治療方法において使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補ＲＮＡと特異的な２本鎖ハイブリッドを形成し、この場合、通常の状況に反して、鎖は互いに平行になる（Ｇａｕｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１（１９８７））。このオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８（１９８７））またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０（１９８７））である。
本発明のポリヌクレオチドは、当該技術分野では公知の標準的な方法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから市販されている）を使用することによって合成することができる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎらの方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８））によって合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、細孔が制御されたガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１（１９８８））などを使用することによって作製することができる。
本明細書に開示する治療方法において使用するためのポリヌクレオチド組成物としては、さらに、触媒性ＲＮＡ、すなわちリボザイム（例えば、１９９０年１０月４日発行のＰＣＴ国際公開パンフレット第９０／１１３６４号；Ｓａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２４７：１２２２−１２２５（１９９０）参照）が挙げられる。ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、ターゲットｍＲＮＡと相補塩基対を形成する領域に隣接させることにより命ぜられた位置でｍＲＮＡを切断する。唯一必要なことは、そのターゲットｍＲＮＡが、次の二塩基配列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築および生産は、当該技術分野では周知であり、Ｈａｓｅｌｏｆｆ ａｎｄ Ｇｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１（１９８８）に、さらに充分に記載されている。好ましくは、このリボザイムは、切断認識部位が、ターゲットｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように、すなわち、効率を増し、非機能的ｍＲＮＡ転写産物の細胞内蓄積を最小にするように、設計製作する。
アンチセンスアプローチの場合のように、本明細書に開示する診断および治療方法において使用するためのリボザイムは、（例えば、安定性、ターゲッティングなどを改善するために）修飾されたオリゴヌクレオチドから成り得、ならびにインビボでＳｐ３５を発現する細胞に送達することができる。リボザイムをコードするＤＮＡ構築物は、アンチセンスコーディングＤＮＡの導入について上で説明したのと同じ方法で細胞に導入することができる。好ましい送達方法は、トランスフェクトされた細胞が、内因性Ｓｐ３５メッセージを破壊し、翻訳を阻害するために充分な量のリボザイムを生産することとなるように、例えばｐｏｌ ＩＩＩまたはｐｏｌ ＩＩプロモータなどの強力な構成プロモータの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を使用することを含む。アンチセンス分子とは異なり、リボザイムは触媒性であるので、効率のために必要とされる細胞内濃度は、より低い。
ベクター
Ｓｐ３５アンタゴニストをコードする核酸を含むベクターも、本発明の方法において使用するためのアンタゴニストを生産するために使用することができる。そうした核酸が作動可能に連結しているベクターおよび発現制御配列の選択は、所望される機能的特性、例えば蛋白質の発現、および形質転換すべき宿主細胞に依存する。
作動可能に連結されているコーディング配列の発現の調節に有用な発現制御要素は、当該技術分野では公知である。例としては、誘導性プロモータ、構成プロモータ、分泌シグナルおよび他の調節要素が挙げられるが、これらに限定されない。誘導性プロモータを使用するとき、例えば、宿主細胞培地における栄養状態の変化または温度の変化によって、それを制御することができる。
前記ベクターは、原核性レプリコン、すなわち、細菌宿主細胞における組換えＤＮＡ分子の自律複製および維持を染色体外的に命令する能力を有するＤＮＡ配列、を含むことができる。こうしたレプリコンは、当該技術分野では周知である。加えて、原核性レプリコンを含むベクターは、その発現が検出可能マーカー、例えば薬物耐性をもたらす遺伝子も含むことができる。細菌性薬物耐性遺伝子の例は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性をもたらすものである。
原核性レプリコンを含むベクターは、細菌宿主細胞におけるコーディング遺伝子配列の発現を命令するための原核性またはバクテリオファージプロモータも含むことができる。細菌宿主と共存できるプロモータ配列は、発現させるＤＮＡセグメントを挿入するための適便な制限部位を含有するプラスミドベクター内に一般に供給される。こうしたプラスミドベクターの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、ｐＰＬおよびｐＫＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。任意の適する原核宿主を使用して、本発明の方法において使用される蛋白質をコードする組換えＤＮＡ分子を発現させることができる。
本発明のために、非常に多数の発現ベクター系を利用することができる。例えば、あるクラスのベクターは、動物ウイルス、例えば、ウシ乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶもしくはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。他は、内在性リボソーム結合部位を有する多シストロン性の系の使用を伴う。加えて、ＤＮＡがそれらの染色体と一体化している細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞を選択することができる１つまたはそれ以上のマーカーを導入することによって、選択することができる。前記マーカーは、栄養要求性宿主への原栄養、殺菌剤耐性（例えば抗生物質）または銅などの重金属に耐性のために用いることができる。選択可能マーカー遺伝子は、発現させるＤＮＡ配列に直接連結させてもよいし、共形質転換により同じ細胞に導入してもよい。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子は、選択可能マーカー遺伝子の一例である（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２））。ｍＲＮＡの最適な合成にさらなる要素が必要とされる場合もある。これらの要素としては、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモータ、エンハンサおよび終止シグナルを挙げることができる。
１つの実施形態では、ＮＥＯＳＰＬＡと呼ばれるＢｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の特許取得発現ベクター（米国特許第６，１５９，７３０号）を使用することができる。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモータ／エンハンサ、マウスベータグロビン主プロモータ、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ・エクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子およびリーダー配列を含有する。このベクターは、ＣＨＯ細胞におけるトランスフェクション、その後のＧ４１８含有培地中での選択およびメトトレキセート増幅によって、非常に高レベルの発現することが証明された。勿論、真核細胞において発現を惹起することができる任意の発現ベクターを本発明において使用することができる。適するベクターの例としては、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（カリフォルニア州、Ｓａｎ ＤｉｅｇｏのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、ならびにプラスミドｐＣＩ（ウィスコンシン州、ＭａｄｉｓｏｎのＰｒｏｍｅｇａから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる真核細胞発現ベクターは、当該技術分野では公知であり、市販されている。典型的に、こうしたベクターは、所望のＤＮＡセグメントを挿入するための適便な制限部位を含有する。具体例としてのベクターとしては、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ｐＢＰＶ−１、ｐｍｌ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ ３１２５５）、レトロウイルス発現ベクターｐＭＩＧおよびｐＬＬ３．７、アデノウイルスシャトルベクターｐＤＣ３１５、ならびにＡＡＶベクターが挙げられる。他の具体例としてのベクター系は、例えば米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
一般に、安定して高レベルのアンタゴニストを発現するものについて大量の形質転換細胞をスクリーニングすることは日常的な実験であり、例えばロボットシステムによって行うことができる。
哺乳動物宿主細胞発現のために頻繁に使用される調節配列としては、哺乳動物細胞において高レベルの蛋白質発現を命令するウイルス要素、例えば、レトロウイルスＬＴＲに由来するプロモータおよびエンハンサ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモータおよびエンハンサ（例えば、ＣＭＶプロモータ／エンハンサ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモータおよびエンハンサ（例えば、ＳＶ４０プロモータ／エンハンサ）、アデノウイルスに由来するプロモータおよびエンハンサ（例えば、アデノウイルス主後期プロモータ（ＡｄｍｌＰ））、ポリオーマおよび強力哺乳動物プロモータ
、例えば天然免疫グロブリンおよびアクチンプロモータが挙げられる。ウイルス性調節要素およびそれらの配列のさらなる説明については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉの米国特許第５，１６８，０６２号；Ｂｅｌｌの米国特許第４，５１０，２４５号；およびＳｃｈａｆｆｎｅｒの米国特許第４，９６８，６１５号を参照のこと。
組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能マーカー遺伝子を有することができる。この選択的マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を助長する（例えば、Ａｘｅｌの米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号参照）。例えば、典型的に、この選択可能マーカーは、ベクターが導入された宿主細胞に対して薬物、例えばＧ４１８、ヒグロマイシンまたはメトトレキセート、への耐性を付与する。頻繁に使用されている選択可能マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅でｄｈｆｒ−宿主細胞において使用するためのもの）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のためのもの）が挙げられる。
Ｓｐ３５アンタゴニストをコードするベクターは、適する宿主細胞の形質転換のために使用することができる。形質転換は、任意の適する方法によるものであり得る。外因性ＤＮＡを哺乳動物細胞に導入するための方法は、当該技術分野では周知であり、そうした方法としては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチド（複数を含む）の封入、および核へのＤＮＡの直接微量注入が挙げられる。加えて、核酸分子をウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入することができる。
宿主細胞の形質転換は、利用するベクターおよび宿主細胞に適する従来どおりの方法によって達成することができる。原核宿主細胞の形質転換には、エレクトロポレーションおよび塩処理方法を利用することができる（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０−１４（１９７２））。脊椎動物細胞の形質転換には、エレクトロポレーション、カチオン性脂質または塩処理方法を利用することができる。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７（１９７３）；Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１３７３−７６（１９７９）参照。
蛋白質発現に使用される宿主細胞株は、哺乳動物起源のものが最も好ましい。当業者には、発現させる所望の遺伝子産物に最も適する特定の宿主細胞株を好適に決定する能力があると考えられる。具体例としての宿主細胞株としては、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系統、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頚癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系統）、ＣＯＳ（ＳＶ４０ Ｔ抗原でのＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎系統）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞株は、一般には、商業サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたは出版文献から入手することができる。
生産細胞株からのポリペプチドの発現は、公知の技法を用いて増進させることができる。例えば、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）系は、一定の条件下での発現を増進させるために一般に使用されている。例えば、欧州特許第０ ２１６ ８４６号、同第０ ２５６
０５５号および同第０ ３２３ ９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号参照。
宿主細胞
本発明の方法において使用するためのＳｐ３５アンタゴニストを発現させるための宿主細胞は、原核性であってもよいし、真核性であってもよい。具体例としての真核宿主細胞としては、酵母および哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＣＬ６１）、ＮＩＨ Ｓｗｉｓｓマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ１６５８）および仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の有用な真核宿主細胞としては、昆虫細胞および植物細胞が挙げられる。具体例としての真核宿主細胞は、大腸菌およびストレプトミセス属である。
遺伝子療法
乏突起神経膠細胞の生存、増殖および分化を促進することまたはニューロンの髄鞘形成を促進することが治療に有益であろう、神経系の疾患、障害または損傷の治療の遺伝子療法アプローチを用いて、哺乳動物、例えばヒト患者においてインビボでＳｐ３５アンタゴニストを生産することができる。これは、適する発現制御配列に作動可能に連結された適するＳｐ３５アンタゴニストコード核酸の投与を含む。一般に、これらの配列は、ウイルスベクターに組み込まれる。こうした遺伝子療法のための適するウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、エンテロウイルスベクター、ペスチウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純疱疹ウイルスベクターが挙げられる。前記ウイルスベクターは、複製能欠失ウイルスベクターであってもよい。そのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子が欠失しているアデノウイルスベクターが、典型的に使用される。アデノウイルスベクターが使用されるとき、そのベクターは、通常、選択可能マーカー遺伝子を有さない。
医薬組成物
本発明の方法において使用するＳｐ３５アンタゴニストは、ヒトをはじめとする哺乳動物に投与するための医薬組成物に調合することができる。本発明の方法において使用する医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含み、こうした担体としては、例えば、イオン交換樹脂、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清蛋白質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩類または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン・ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
本発明の方法において使用する組成物は、任意の適する方法によって投与する、例えば非経口投与、脳室内投与、経口投与、吸入スプレーにより投与、局所投与、直腸内投与、経鼻投与、口腔内投与、経膣投与または移植レザバー経由で投与することができる。本明細書で用いる場合、用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病変内および頭蓋内注射または注入技法を包含する。前に説明したように、本発明の方法において使用するＳｐ３５アンタゴニストは、神経系において、乏突起神経膠細胞の生存、増殖および分化ならびにニューロンの髄鞘形成を促進するように作用する。従って、本発明の方法において、Ｓｐ３５アンタゴニストは、それらが血液脳
関門を横断するように投与される。この横断は、Ｓｐ３５アンタゴニスト分子それ自体に固有の物理化学的特性によって生じることもあり、医薬調合物中の他の成分によって生じることもあり、血液脳関門を侵害するような機械装置、例えば針、カニューレまたは手術器具の使用によって生じることもある。Ｓｐ３５アンタゴニストが、血液脳関門を生得的に横断しない分子、例えば横断を助長する部分への融合体、である場合、適する投与経路は、例えば、髄腔内投与経路または頭蓋内投与経路、例えばＭＳの慢性病変に直接投与する経路である。Ｓｐ３５アンタゴニストが、血液脳関門を生得的に横断する分子である場合、投与経路は、下で説明する様々な経路のうちの１つまたはそれ以上によるものであり得る。
本発明の方法において使用する組成物の滅菌注射用形態は、水性または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適する分散または湿潤剤および懸濁化剤を使用し、当該技術分野において公知の技法に従って調合することができる。滅菌注射用製剤は、非毒性で非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の懸濁液、であってもよい。利用することができる許容されるビヒクルおよび溶媒には、リンガー溶液および等張食塩液などがある。加えて、滅菌固定油が、溶媒または懸濁媒体として、従来、利用されている。このために、合成モノまたはジグリセリドをはじめとするあらゆる無菌固定油を利用することができる。脂肪酸、例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体は、薬学的に許容される天然油、例えばオリーブ油またはヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンである場合、注射用薬物の調製に有用である。これらの油性溶液または懸濁液は、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、またはエマルジョンおよび懸濁液をはじめとする薬学的に許容される剤形の調合の際に一般に用いられている同様の分散剤も含有することがある。他の一般に用いられている界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、および薬学的に許容される固体、液体または他の剤形の製造の際に一般に用いられている、他の乳化剤またはバイオアベイラビリティ向上剤も、調合のために使用することができる。
非経口調合物は、単回ボーラス用量であってもよいし、注入または負荷ボーラス用量、それに続く維持用量であってもよい。これらの組成物は、特定の固定または不定間隔で、例えば１日１回または「必要に応じて」、投与することができる。
本発明の方法において使用する一定の医薬組成物は、許容される剤形で経口投与することができ、こうした剤形としては、例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液が挙げられる。一定の医薬組成物は、鼻用エーロゾルまたは吸入によって投与することもできる。こうした組成物は、ベンジルアルコールもしくは他の適する保存薬、バイオアベイラビリティを向上させるための吸収促進剤、および／または他の従来どおりの可溶化もしくは分散剤を利用して、食塩水中の溶液として調製することができる。
単一剤形を製造するために担体材料と併せることができるＳｐ３５アンタゴニストの量は、治療する宿主、使用するアンタゴニストのタイプおよび特定の投与形式に依存して変わるであろう。本組成物は、単回用量として投与することができ、複数回用量として投与することができ、または既定の期間にわたって注入で投与することができる。最適な望ましい応答（例えば、治療または予防応答）を生じさせるように、投薬計画を調整することもできる。
本発明の方法は、「治療有効量」または「予防有効量」のＳｐ３５アンタゴニストを使用する。こうした治療または予防有効量は、個体の病状、年齢、性別および体重などの因子によって変わり得る。治療または予防有効量は、治療恩恵効果があらゆる毒性または有害効果に勝る量でもある。
いずれの特定の患者のための具体的な投薬および治療計画も、使用する特定のＳｐ３５アンタゴニスト、その患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別および食事、投与回数、排泄率、薬の組み合わせ、ならびに治療する特定の疾患の重症度をはじめとする、様々な因子に依存するであろう。医学的な面倒をみる人によるこうした因子の判断は、通常の当業者の範囲内である。量は、治療すべき個々の患者、投与経路、調合のタイプ、使用する化合物の特性、疾患の重症度および所望の効果にも依存するであろう。使用する量は、当該技術分野では周知の薬理学および薬物動力学の原理によって決定することができる。
本発明の方法において、一般に、Ｓｐ３５アンタゴニストは、神経系に直接投与、脳室内投与、または髄腔内投与、例えば、ＭＳの慢性病変に投与される。本発明の方法に従って投与するための組成物は、１日につき体重のｋｇ当たり０．００１〜１０ｍｇの投薬量のＳｐ３５アンタゴニストポリペプチドが投与されるように調合することができる。本発明の一部の実施形態において、投薬量は、１日につき体重のｋｇ当たり０．０１〜１．０ｍｇである。一部の実施形態において、投薬量は、１日につき体重のｋｇ当たり０．００１〜０．５ｍｇである。
Ｓｐ３５アンタゴニスト抗体で治療するための投薬量は、例えば、宿主の体重のｋｇ当たり、約０．０００１から１００ｍｇ、より通常には０．０１から５ｍｇ（例えば、０．０２ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、０．７５ｍｇ、１ｍｇ、２ｍｇなど）の範囲であり得る。例えば、投薬量は、体重のｋｇ当たり、１ｍｇもしくは１０ｍｇ、または１〜１０ｍｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇであり得る。上記範囲の中間の用量も本発明の範囲内であると考える。そうした用量を、毎日、隔日で、１週間に１回、または経験的な分析により決定される他の任意のスケジュールに従って被験者に投与することができる。具体例としての治療は、長期間にわたって、例えば少なくとも６ヶ月の長期間にわたって、多数回投薬で投与することを必要とする。さらなる具体例としての治療計画は、２週間に１回、または１ヶ月に１回、または３から６ヶ月に１回投与することを必要とする。具体例としての投薬スケジュールとしては、連日１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、隔日で３０ｍｇ／ｋｇ、または１週間に１回６０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。一部の方法では、異なる結合特異性を有する２つまたはそれ以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合、投与する各抗体の投薬量は、示した範囲内である。
特定の実施形態において、Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドをコードする核酸分子で被験者を治療することができる。核酸の用量は、患者１人当たり、約１０ｎｇから１ｇ、１００ｎｇから１００ｍｇ、１μｇから１０ｍｇ、または３０〜３００μｇのＤＮＡの範囲である。感染性ウイルスベクターの用量は、１用量当たり１０〜１００ビリオンまたはそれ以上にわたる。
本発明の方法において使用する組成物に補助活性化合物を組み込むこともできる。例えば、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドまたは融合蛋白質を１つまたはそれ以上のさらなる治療薬と併用調合および／または併用投与することができる。
本発明は、選択されたターゲット組織へのＳｐ３５アンタゴニストのあらゆる適する送達方法を包含し、そうした方法としては、水溶液のボーラス注射または制御放出系の移植が挙げられる。制御放出インプラントの使用により、繰り返し注射する必要が低減される。
本発明の方法において使用するＳｐ３５アンタゴニストは、脳に直接注入することができる。化合物の直接脳注入のための様々なインプラントが知られており、神経疾患に罹患している人間の患者への治療化合物の送達に有効である。これらには、ポンプを使用する脳への慢性注入、定位移植、短期介在（ｔｅｍｐｏｒａｒｙ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ
）カテーテル、永久頭蓋内カテーテルインプラント、および手術移植型生分解性インプラントが挙げられる。例えば、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，上記；Ｓｃｈａｒｆｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｏｄｉｎｅ−１２５ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｉｍｐｌａｎｔ Ｆｏｒ Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．２４（４）：５８３−５９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ １２５Ｉ Ｉｍｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−９８２（１９９９）；ｃｈａｐｔｅｒ ６６，ｐａｇｅｓ ５７７−５８０，Ｂｅｌｌｅｚｚａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）；およびＢｒｅｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ
Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｗｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｔｒｉａｌ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２６：１１１−２３（１９９５）参照。
本組成物は、化合物のために適する送達または支持システムとして機能する生体適合性担体材料中に分散されたＳｐ３５アンタゴニストも含むことができる。持続放出性担体の適する例としては、座剤またはカプセルなどの成形品の形態での半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。移植可能またはマイクロカプセル型持続放出性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号、欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ−Ｄ−（−）−３ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が挙げられる。
本発明の一部の実施形態において、Ｓｐ３５アンタゴニストは、脳の適切な領域に直接注入することにより、患者に投与される。例えば、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ ｂｒａｉｎ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）参照。代替技術を利用することができ、本発明のＳｐ３５アンタゴニストの投与に適用することができる。例えば、カテーテルまたはインプラントの定位配置は、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−ＭｕｎｄｉｎｇｅｒユニットおよびＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的定位ユニットを使用して達成することができる。１２０ｍＬのオムニパーク、３５０ｍｇのヨウ素／ｍＬを注入する、２ｍｍのスライス厚でのコントラスト増強コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンにより、三次元多断面処理プランニング（ＳＴＰ；ドイツ、ＦｒｅｉｂｕｒｇのＦｉｓｃｈｅｒ）を可能にすることができる。この装置は、磁気共鳴撮像試験を基にプランニングして、はっきりとターゲットを確認できるようにＣＴおよびＭＲＩのターゲット情報をマージすることができる。
ＧＥ ＣＴスキャナー（ウィスコンシン州、ＭｉｌｗａｕｋｅｅのＧｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｌｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）と共に使用するために改造されたＬｅｋｓｅｌｌ定位システム（ジョージア州、ＤｅｃａｔｕｒのＤｏｗｎｓ Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ならびにＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌ（ＢＲＷ）定位システム（マサチュー
セッツ州、ＢｕｒｌｉｎｇｔｏｎのＲａｄｉｏｎｉｃｓ）をこのために用いることができる。例えば、移植する朝にＢＲＷ定位フレームの環状ベースリングを患者の頭蓋骨に取り付けることができる。ベースプレートに圧締めされたグラファイトロッドローカライザーフレームで（ターゲット組織）領域を通して３ｍｍ間隔で連続ＣＴ断面図を得ることができる。ＣＴスペースとＢＲＷスペースの間のマップに対するグラファイトロッド画像のＣＴ座標を用いるコンピュータ処理プランニングプログラムを、ＶＡＸ １１／７８０コンピュータ（マサチューセッツ州、ＭａｙｎａｒｄのＤｉｇｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でランすることができる。
本明細書に記載するような脱髄または髄鞘形成不全の治療方法は、一般に、インビトロで検査し、その後、許容される動物モデルで所望の治療または予防活性についてインビボで検査した後、人間で使用する。トランスジェニック動物をはじめとする適する動物モデルは、通常の当業者にはわかるであろう。例えば、Ｓｐ３５アンタゴニストの分化および生存効果を実証するためのインビトロアッセイを本明細書において説明する。軸索の髄鞘形成に対するＳｐ３５アンタゴニストの効果は、実施例で説明するようにインビトロで検査することができる。最後に、インビボ検査は、Ｓｐ３５アンタゴニストを発現するトランスジェニック動物を産生させることにより、または本明細書で説明するようなモデルでマウスまたはラットにＳｐ３５アンタゴニストを投与することにより行うことができる。
（実施例１）
Ｓｐ３５は乏突起神経膠細胞生態に関与する
乏突起神経膠細胞は、（Ａ２Ｂ５を発現する）Ａ２Ｂ５前駆細胞から、（Ｏ１およびＯ４を発現する）髄鞘形成前乏突起神経膠細胞に分化し、最終的に（Ｏ１、Ｏ４およびＭＢＰを発現する）成熟髄鞘形成乏突起神経膠細胞に分化する幾つかの発育段階を通して成熟する。従って、Ａ２Ｂ５、Ｏ１、Ｏ４およびＭＢＰマーカーの存在および不在をモニターすることにより、乏突起神経膠細胞生態における所定の細胞発育段階を決定することおよびＳｐ３５−Ｆｃの役割を評価することができる。乏突起神経膠細胞生態の一般的な論評については、例えば、Ｂａｕｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｈａｍ−Ｄｉｎｈ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１：８７１−９２７（２００１）を参照のこと。
Ｏ４、ＭＢＰおよびＣＮＰアーゼに対するモノクローナル抗体は、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓからのものであり、ＡＰＣに対する抗体（クローンＣＣ−１；ｒｅｆ．２９）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍからのものであった。他の抗体は、βＩＩＩチューブリンに対する抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）、Ｓｐ３５に対する抗体（Ｂｉｏｇｅｎ
Ｉｄｅｃ）、Ｆｙｎに対する抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびホスホ−Ｆｙｎに対する抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）であった。Ａ２Ｂ５に対するモノクローナル抗体は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎから入手した。
Ｓｐ３５は乏突起神経膠細胞において発現される
精製ラットＰ１３ ＣＧニューロン、Ｐ２乏突起神経膠細胞およびＰ４神経膠星状細胞培養物におけるＳｐ３５の発現を、逆転写後のポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した。Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．からのキットを使用して、その製造業者のインストラクションに従ってラットの脳細胞からｍＲＮＡを抽出した。フォワードプライマー
Figure 0004960865
 およびリバースプライマー
Figure 0004960865
 を使用して半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行い、ニューロンにおける発現が高く、乏突起神経膠細胞における発現がより少なく、神経膠星状細胞における発現がないことがわかった（図５）。
成熟ラット視神経に由来する切片において、乏突起神経膠細胞におけるＳｐ３５の発現をインサイチューハイブリダイゼーションにより確認した。Ｍｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｐ３５ ｉｓ ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｇｏ−６６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ｐ７５ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ，”Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２８（２００４）に記載されているようにラット視神経切片を作製および処理し、Ｓｐ３５コーディング配列の最初の５００ヌクレオチドを使用してジゴキシゲニン標識Ｓｐ３５アンチセンスまたはセンスＲＮＡでプローブした。Ｔｙｒａｍｉｄｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および蛍光抗ジゴキシゲニン複合体抗体キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用し、それらの製造業者のインストラクションに従って、前記切片を染色した。併用インサイチューおよび免疫蛍光分析のために、それらの切片を先ずジゴキシゲニン標識ＲＮＡでプローブし、次に抗体、例えばＣＣ１抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；成熟乏突起神経膠細胞のマーカー）または抗Ｓｐ３５抗体でプローブした。アンチセンスＳｐ３５プローブにハイブリダイズした乏突起神経膠細胞もＣＣ１に対する抗体と共に染色されることが観察された（データは示さない）。センスＳｐ３５プローブを使用して、非特異的標識を観察した。乏突起神経膠細胞におけるＳｐ３５発現は、Ｐ７ラット皮質の脳側室領域からの組織切片の免疫組織化学試験によっても確認した。ＣＣ１抗体で標識した皮質細胞の大部分をＳｐ３５抗体でも標識した。データは示さない。Ｓｐ３５−Ｆｃを抗Ｓｐ３５抗体に予め吸収させ（実施例２参照）、それのシグナルを除去することにより、相互作用の特異性を確認した。
Ｓｐ３５発現のＳｐ３５特異的ＲＮＡｉノックダウンは、乏突起神経膠細胞の成長および分化を促進する
Ｓｐ３５特異的ＲＮＡｉを使用して乏突起神経膠細胞前駆体細胞におけるＳｐ３５発現を除去して、乏突起神経膠細胞の成長および分化にＳｐ３５がいかに寄与するか調査した。５０，０００のＡ２Ｂ５乏突起神経膠細胞前駆体細胞を、次のとおり作製したＳｐ３５特異的ＲＮＡｉ配列または対照ＲＮＡｉを有するレンチウイルスに感染させた。
マウスＳｐ３５ ＤＮＡ配列とラットＳｐ３５ ＤＮＡ配列を比較して、候補短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）に使用するための相同領域を見つけた。Ｓｐ３５ ＲＮＡｉのレンチウイルス発現のために、オリゴヌクレオチドＬＶ１−０３５およびＬＶ１−０３６をアニールし、ＨｐａＩおよびＸｈｏＩ消化ｐＬＬ３．７にライゲートすることにより、ＣＨ３２４を構築した。ｐＬＬ３．７ベクター、さらなる方法論およびウイルス生産は、Ｒｕｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３，４０１−０６（２００３）に記載されているとおりであった。Ｓｐ３５ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドは、ＭＷＧから購入した。それらは次の配列を有する：ＬＶ１−０３５（センスオリゴ）
Figure 0004960865
 およびＬＶＩ−０３６（アンチセンスオリゴ）
Figure 0004960865
 対照ＲＮＡｉは、小文字で示されているヌクレオチド変更を除き、同じオリゴヌクレオチド配列で設計した：
Figure 0004960865
 レンチウイルスを産生させる前に、ｐＬＬ３．７からのＤＮＡまたはｐＬＬ３．７における候補ｓｈＲＮＡを、マウスＳｐ３５−ＨＡ標識プラスミドと共に、５：１の比率で、６ウエル形式でＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞溶解産物からのＳｐ３５−ＨＡタグのウエスタンブロット検出により、ならびに二重重複ウエルから作製した全ＲＮＡのノーザンブロットにより、ノックダウンを分析した。Ｓｐ３５ ｃＤＮＡのフラグメントでブロットをプローブした。トランスフェクションの４８時間後にアッセイを行った。予想どおり、ＣＨ３２４ ＲＮＡｉ処理ＣＨＯ細胞では、対照処理細胞を基準にして、Ｓｐ３５ ｍＲＮＡが十分の一に減少した。データは示さない。緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を有するＲＮＡｉレンチウイルスをＲｕｂｉｎｓｏｎらの文献に記載されているとおり作製した。対照またはＳｐ３５ ＲＮＡｉのいずれかで処理した培養物では、乏突起神経膠細胞の約８０％が、ＧＦＰポジティブであった。全細胞数は、ＲＮＡｉ処理によって変わらなかった。分化に対するＲＮＡｉの効果を定量するために、ＧＦＰ発現乏突起神経膠細胞のみを計数した。
以下のように修正して、Ｃｏｎｎ，Ｍｅｔｈ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：１−４（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；１９９０）に記載されているように、乏突起神経膠細胞の富化集団を雌Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓ Ｐ２ラットから成長させた。簡単に言うと、前脳を切開し、ハンクス緩衝塩類溶液（ＨＢＳＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に入れた。組織を１ｍｍフラグメントに切断し、０．０１％トリプシンおよび１０μｇ／ｍＬＤＮアーゼ中、３７℃で１５分間インキュベートした。解離した細胞をポリ−Ｌ−リシン被覆Ｔ７５組織培養フラスコでプレーティングし、２０％ウシ胎仔血清を伴うＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃で１０日間成長させた。３７℃、２００ｒｐｍで一晩そのフラスコを振盪することにより、乏突起神経膠細胞前駆体（Ａ２Ｂ５＋）を回収し、純度９５％の集団を得た。培養物を、ＦＧＦ／ＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を伴う高グルコースダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で１週間維持した。ＦＧＦ／ＰＤＧＦを除去すると、３〜７日後、Ａ２Ｂ５＋細胞はＯ４＋髄鞘形成前乏突起神経膠細胞に分化することができ、７〜１０日後、Ｏ４＋ およびＭＢＰ＋ 成熟乏突起神経膠細胞に分化することができた。これらの分化状態は、形態変化から容易にわかる：Ａ２Ｂ５＋細胞は形が二極性であり、Ｏ４＋ 髄鞘形成前乏突起神経膠細胞は、より長く、より枝分れし
た突起を有し、ならびにＭＢＰ＋成熟乏突起神経膠細胞は、突起間にミエリンシート構造を含有する。
Ａ２Ｂ５乏突起神経膠細胞前駆体細胞を、ＣＨ３２４ ＲＮＡｉを含有するレンチウイルスに感染させた。結果として生じた細胞を３日間培養し、Ｏ４ポジティブ（乏突起神経膠細胞の分化についてのマーカー）乏突起神経膠細胞の数を数えた。内因性Ｓｐ３５発現
を、Ｓｐ３５ ＲＮＡｉレンチウイルスでの感染によって減少させ、ＲＴ−ＰＣＲによって確認した（図６Ａ）。細胞の突起の長さの増加および豊富なミエリンシート構造の存在により明らかに分かるように、Ｓｐ３５減少の結果、対照感染細胞と比較して非常に分化した成熟乏突起神経膠細胞が生じた（データは示さない）。Ｓｐ３５ ＲＮＡｉを発現した細胞には、対照培養物の３倍の多さの成熟（Ｏ４ポジティブ）乏突起神経膠細胞が存在した（図６Ｂ）。これらのデータは、Ｓｐ３５が乏突起神経膠細胞の分化を負に調節できることを示している。
ドミナントネガティブＳｐ３５は、乏突起神経膠細胞の成長および分化を促進する
野生型およびドミナントネガティブ型のＳｐ３５を発現するレンチウイルスベクターを構築した。マウス完全長Ｓｐ３５（ＦＬ−Ｓｐ３５、配列番号２のアミノ酸残基３４〜６１４）をコードするＤＮＡ配列を、プライマー
Figure 0004960865
 を使用してＰＣＲにより増幅させ、ＨＲＳＴ−ＩＲＥＳｅＧＦＰレンチウイルスベクターのＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ部位に挿入した。同様に、ドミナントネガティブＳｐ３５（ＤＮ−Ｓｐ３５、配列番号２のアミノ酸残基３４〜５８１）をコードするＤＮＡ配列を、プライマー
Figure 0004960865
 を使用してＰＣＴにより増幅させた。Ｒｕｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｓｉｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｂｙ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，”Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−０６（２００３）により記載されているように、ＦＬ−Ｓｐ３５およびＤＮ−Ｓｐ３５プラスミドを２９３細胞にトランスフェクトして、レンチウイルスを生産した。（実施例４において説明するとおり作製した）乏突起神経膠細胞をレンチウイルスで、１細胞当たり２のＭＯＩで感染させ、ウエスタンブロットによりＦＬ−Ｓｐ３５およびＤｎ−Ｓｐ３５の発現を確認した。
ＤＮ−Ｓｐ３５は、乏突起神経膠細胞の分化を促進して、成熟乏突起神経膠細胞数の増加を生じさせた。対照的に、完全長Ｓｐ３５（ＦＬ−Ｓｐ３５）の過発現は、対照と比較したときの成熟乏突起神経膠細胞数の減少により明らかに分かるように、逆効果を有し、分化を抑制した（データは示さない）。
（実施例２）
Ｓｐ３５−Ｆｃ融合蛋白質の構築および精製
ヒトＳｐ３５の細胞外部分（残基１〜５３２）をヒトＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃ領域
に融合することにより構築物を作製して、Ｓｐ３５の生物学的機能を研究した。フォワードプライマー
Figure 0004960865
 を使用するクローン２２７．２からのＰＣＲにより、ヒトＳｐ３５の部分コーディング配列を得た。
平滑末端ＰＣＲ産物をＰＣＲ ＳＣＲＩＰＴ ＡＭＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｒｆＩ部位にサブクローニングして、ＰＣＲ ＳＣＲＩＰＴ ＡＭＰ−Ｓｐ３５を作製した。ＳａｌＩフラグメントをＰＣＲ ＳＣＲＩＰＴ ＡＭＰ−Ｓｐ３５から単離し、ＰＣＲＣＡＭＰ Ｉｇベクター（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅベクターＰＣＲ ＳＣＲＩＰＴ
ＡＭＰの誘導体）にサブクローニングした。ＰＣＲＣＡＭＰ Ｉｇベクターでは、ヒンジおよびＦｃガンマ配列をＳａｌＩ（５’）からＮｏｔＩ（３’）フラグメントとしてサブクローニングする。ＳａｌＩ Ｓｐ３５フラグメントをＰＣＲＣＡＭＰ ＩｇベクターのＳａｌＩ部位にサブクローニングし、それによってフレーム内のＳｐ３５シグナル配列および細胞外ドメイン（コドン１〜５３２）と、ヒトＩｇ１のヒンジおよびＦｃ領域をコードする配列とを融合させた。正しい（ｃｏｒｒｅｃｔ）単離体を特定し、Ｓｐ３５ Ｆｃフラグメントを包含するＮｏｔＩフラグメントをＣＨＯ発現ベクター、ＰＶ９０（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）のシグナルＮｏｔＩクローニング部位にサブクローニングした。結果として生じたプラスミドをＤＮＡ塩基配列決定により確認し、ＧＴ１２３と呼んだ。
プラスミドＧＴ１２３でのＣＨＯ宿主細胞のエレクトロポレーションにより、Ｓｐ３５−Ｆｃ融合蛋白質を発現する安定な細胞株を産生させた。トランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、１０％透析血清および４ｍＭ グルタミンが存在する状態のアルファマイナスＭＥＭ中で培養して、ヌクレオシド依存性成長を選択した。トランスフェクションの１４日後、細胞に新たな培地を供給した。Ｓｐ３５−Ｆｃを発現する細胞をスクリーニングするために、ＣＨＯ細胞をフィコエリトリン（ＰＥ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）で標識し、ＦＡＣＳ Ｍｏ−Ｆｌｏ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）での高速フローサイトメトリー選別に付した。最高レベルのＳｐ３５−Ｆｃを発現した細胞を選択した。これらの細胞を７日間培養で増幅させ、その後、再び標識し、再び選別した。最高レベルのＳｐ３５−Ｆｃを発現する細胞を９６ウエルプレートに個々のクローンとして単離した。これらのクローンを２週間成長させ、その後、新たな培地を供給し、その翌日、ＦＡＣＳ分析に付して発現レベルをチェックした。最高レベルのＳｐ３５−Ｆｃを発現したクローンを増幅させ、冷凍細胞バンクを樹立した。細胞株を、無血清培地ＢＣＭ１６中での懸濁培養法で成長するようさせた。これらのクローンによって生産されたＳｐ３５−Ｆｃの力価は、４〜５継代にわたって３７℃で細胞株を成長させ、その後、５０％最大細胞密度に細胞を成長させ、１０〜１５日間、生細胞密度が７５％に低下するまで、２８℃でそれらを培養することによって、判定した。この時点で、培養培地を回収し、細胞および破壊片を遠心分離によって除去し、プローブとして抗ヒトＩｇ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ）を使用してウエスタンブロット分析により培養上清のＳｐ３５−Ｆｃレベルの力価測定を行った。
Ｓｐ３５−Ｆｃ融合蛋白質は、精澄（ｃｌａｒｉｆｉｅｄ）培地から次のように精製した：９ｍＬの１ＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を９００ｍＬの調製培地に添加した。この培地を、３時間、４℃で、３ｍＬのプロテインＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に一斉に充填（ｂａｔｃｈ ｌｏａｄ）した。その樹脂を１．５ｃｍ（内径）カラム内に回収し、３ｍＬのＰＢＳで４回、８００ｍＭＮａＣｌを含有する４ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、その後、再び３ｍＬのＰＢＳで洗浄した。１．５ｍＬの画分中、２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ２．８）および１００ｍＭのＮａＣｌでそのカラムからＳｐ３５−Ｆｃを溶離し、７５μＬの０．５ＭＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．６）の添加により中和した。ピーク蛋白質含有画分を２８０ｎｍでの吸収により特定し、プールし、１ｍＬプロテインＡカラムでのさらなる精製に付した。ローディングする前、ＮａＣｌを６００ｍＭまで添加し、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を５０ｍＭまで添加した。そのカラムを６００μＬの１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）および１Ｍ ＮａＣｌで２回洗浄し、その
後、１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。ＳＰ３５−Ｆｃを、２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ２
．８）および１００ｍＭ ＮａＣｌでそのカラムから溶離し、０．５ｍＬの画分を回収し、２５μＬの０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．６）の添加により中和した。ピーク蛋白質含有画分を２８０ｎｍでの吸収により特定し、プールした。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、Ｓｐ３５−Ｆｃ蛋白質は、９０ｋＤａの見掛け質量で単一バンド（純度＞９５％）として泳動した。非還元条件下、この蛋白質は、１８０ｋＤａのおおよその質量を有する二量体としてランした。精製Ｓｐ３５−Ｆｃ蛋白質をアリコートに分け、−７０℃で保管した。
（実施例３）
外因性Ｓｐ３５−Ｆｃは、乏突起神経膠細胞の生存／増殖／分化を促進する
様々な発育段階の乏突起神経膠細胞におけるＳｐ３５ ｍＲＮＡの発現を次の方法によって評価した。実施例１において説明したように乏突起神経膠細胞を分化するように誘導し、Ａｍｂｉｏｎキットを使用してｍＲＮＡを単離した。Ｓｐ３５ ｍＲＮＡの発現の定量は、次のプライマー：
Figure 0004960865
 を使用し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者の仕様書に従って使用して行った。データを内部対照としてのＧＡＰＤＨレベルに正規化した。初期前駆乏突起神経膠細胞（Ａ２Ｂ５＋）および髄鞘形成前乏突起神経膠細胞（Ｏ４＋）は、等レベルのＳｐ３５ ｍＲＮＡを示したが、成熟乏突起神経膠細胞（ＭＢＰ＋）の２倍より高いＳｐ３５ ｍＲＮＡのレベル
を示した。図７。
実施例１において説明したように作製したＡ２Ｂ５＋ 乏突起神経膠細胞を、漸増濃度のＳｐ３５−Ｆｃまたは対照Ｆｃで３日間処理した（Ｓｐ３５−Ｆｃは、実施例２において説明したとおり作製した）。分化を評価するために、Ａ２Ｂ５＋ 細胞を、１０ｎｇ／ｍＬ ＣＮＴＦおよび１５ｎＭ トリヨード−Ｌ−サイロニンを補足したＦＧＦ／ＰＤＧＦ不含成長培地中、４ウエルスライドチャンバ内にプレーティングし、漸増濃度のＳｐ３５−Ｆｃまたは対照Ｆｃで直ちに処理した。４８時間（ＲＮＡｉについては７２時間）後
、培養物をＯ４に対する抗体で染色し、全Ｏ４＋および成熟Ｏ４＋ 乏突起神経膠細胞数を定量した。サンプルは、二重重複で分析した。Ｓｐ３５−Ｆｃは、Ａ２Ｂ５＋ 細胞のＯ４＋ 細胞への分化を濃度依存的に促進した。図８。
成熟乏突起神経膠細胞は、約４８から７２時間のインビトロ半減期を有し、典型的に、細胞は、７２時間後にアポトーシスを被る。乏突起神経膠細胞培養物をＳｐ３５−Ｆｃで処理した（１０μｇ／ｍＬ、５日間）とき、生細胞染色により判定すると、対照Ｆｃで処理した対照と比較して有意に上昇した成熟乏突起神経膠細胞生存率が観察された。成熟乏突起神経膠細胞についてのマーカーとしてＭＢＰの発現をモニターした。細胞染色および抗ＭＢＰ抗体を使用するウエスタンブロットにより、対照Ｆｃ処理細胞と比較して約３倍増加したＭＢＰ蛋白質発現がＳｐ３５−Ｆｃ処理細胞において観察された。
（実施例４）
Ｓｐ３５アンタゴニストは、ＲｈｏＡおよびＦｙｎを調節する
乏突起神経膠細胞の分化の制御に関係するシグナル伝達経路の強力な候補は、ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーである。Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼは、細胞の形態を調節し、乏突起神経膠細胞の分化に必要とされるＲｈｏＡ−ＧＴＰ量を低減させる。Ｌｉａｎｇ，Ｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：７１４０−７１４９（２００４）参照。Ｓｐ３５がＲｈｏＡ経路によりシグナル伝達するかどうかを判定するために、Ｓｐ３５−Ｆｃで処理した乏突起神経膠細胞の細胞溶解産物中のＲｈｏＡ ＧＴＰレベルを、ウエスタンブロッティングにより、対応する対照中のレベルと比較した。Ｓｐ３５−Ｆｃ後、ＲｈｏＡ−ＧＴＰの有意な三分の一への減少が見られた（図９Ａ）。これは、Ｓｐ３５機能の減弱が、ＲｈｏＡ ＧＴＰのダウンレギュレーションにより乏突起神経膠細胞の分化とその後のＭＢＰ発現増加を誘導し得ることを示している。ＲｈｏＡ ＧＴＰ量の同様の減少が、乏突起神経膠細胞をＤＮ−Ｓｐ３５またはＳｐ３５ ＲＮＡｉで処理したときに見られた（データは示さない）。
ＲｈｏＡ ＧＴＰアーゼの活性は、Ｆｙｎキナーゼによって調節される。Ｌｉａｎｇ，Ｘ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：７１４０−７１４９（２００４）参照。Ｆｙｎ発現およびリン酸化の増加は、乏突起神経膠細胞の分化と相関する。同典拠。Ｏｓｔｅｒｈｏｕｔ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４５：１２０９−１２１８（１９９９）も参照。Ｓｐ３５アンタゴニストがＦｙｎの機能に影響を及ぼすかどうかを検査するために、Ｆｙｎの発現およびリン酸化をウエスタンブロッティングにより直接測定した。実施例１で説明したようなＤＮ−Ｓｐ３５処理の結果、Ｆｙｎ蛋白質およびＦｙｎリン酸化が２倍増加した（図９Ｂ）。逆に、ＦＬ−Ｓｐ３５を発現する細胞を分析したところ、Ｆｙｎの発現およびリン酸化は、二分の一に減少した（図９Ｂ）。
（実施例５）
Ｓｐ３５−Ｆｃは、インビトロで髄鞘形成を促進する
後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンと乏突起神経膠細胞の共培養物をＳｐ３５−Ｆｃで処理し、免疫組織化学および電子顕微鏡により髄鞘形成を検査することによって、髄鞘形成におけるＳｐ３５の役割を調査した。これらの試験には、ＤＲＧニューロンおよび乏突起神経膠細胞の初代培養物を先ず作製することが必要であった。
Ｐｌａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：６０８３−９１（２００２）によって記載されているとおり、雌Ｌｏｎｇ ＥｖａｎｓラットＥ１４〜Ｅ１７胚性後根神経節を培養した。切開したＤＲＧを、２日目〜６日目はフルオロデオキシウリジンの存在下、および８日目〜１１日目は１ｘＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦを含有するＮＬＡ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、２週間にわたってポリ−Ｌ−リシン被覆カバーガラス上にプレーティング（１００μｇ／ｍＬ）した。
Ａ２Ｂ５＋ 乏突起神経膠細胞は、実施例１において説明したとおり作製し、トリプシン処理により回収した。
共培養試験のため、Ａ２Ｂ５＋ 乏突起神経膠細胞を、１０μｇ／ｍＬＳｐ３５−Ｆｃが存在するまたは不在の状態のＤＲＧニューロン・ドロップ培養物に添加した。培地（Ｂ２７および１００ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦを補足したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地）を交換し、新たなＳｐ３５−Ｆｃを３日ごとに細胞に添加した。髄鞘形成の変化を特定するために、２週間経た培養物を、抗βＩＩＩ−チューブリン抗体での神経フィラメントの免疫組織化学染色（「ＩＨＣ」）により染色して軸索を特定するか、抗ＭＢＰ抗体での神経フィラメントの免疫組織化学染色（「ＩＨＣ」）により染色して乏突起神経膠細胞を特定し、４週間経た培養物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付し、その後、ウエスタンブロット分析に付して、ＭＢＰを定量した。選択された実施例では、電子顕微鏡試験のため、２．５％グルタルアルデヒドをカバーガラス上に直接添加することにより細胞を固定した。２週間経た培養物中の髄鞘形成済軸索を、単一ＭＢＰ＋ 乏突起神経膠細胞に由来する髄鞘形成済節間束数を数えることにより定量した。サンプルは、二重重複で分析した。エラーバーは、個々の測定値を示す。すべての試験におけるＰ値は、片側分散分析を用いて決定した。
ラット初代乏突起神経膠細胞および後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンの培養物において、低い基底量の髄鞘形成が観察された。対照的に、Ｓｐ３５−Ｆｃ処理培養物中で用量依存的に発育したＭＢＰ＋ 髄鞘形成済軸索の存在（図１０Ａ）により明らかに分かるように、Ｓｐ３５−Ｆｃでの２週間の処理よって、頑強な軸索髄鞘形成が生じた。ウエスタンブロット分析は、Ｓｐ３５−Ｆｃ処理培養物においてＭＢＰ（ミエリンの主要蛋白質成分）の発現が増加されたことを示した（図１０Ｂ）。Ｓｐ３５−Ｆｃの存在下での髄鞘形成を共焦点顕微鏡によってさらに確認し、ＭＢＰが軸索を被包していたことを検証した（データは示さない）。Ｓｐ３５−Ｆｃで処理した培養物において、電子顕微鏡により多数の形のよい節間、ならびにランビエ絞輪にそっくりな構造が観察された（図１０Ｃ）。対照培養物では、たまにしか髄鞘形成済セグメントが検出されず、ランビエ絞輪は全く検出されなかった（図１０Ｄ）。
ＤＮ−Ｓｐ３５を用いて、軸索髄鞘形成に対するＳｐ３５アンタゴニストの効果をさらに確認した。ＤＮ−Ｓｐ３５の発現は、髄鞘形成性ＭＢＰ＋細胞の総数を対照と比較して５から１０倍増加させた（図１０Ｅ）。対照的に、ＦＬ−３５の過発現は、髄鞘形成性ＭＢＰ＋細胞の数を対照と比較して二分の一に減少させた（図１０Ｅ）。ウエスタンブロット分析を用いて培養物中のＭＢＰを定量した。ＤＮ−Ｓｐ３５は、ＭＢＰの１０倍増加を生じさせ、これに対してＦＬ−Ｓｐ３５は、ＭＢＰを二分の一に減少させる原因となった（図１０Ｆ）。培養物のＦＬ−Ｓｐ３５およびＤＮ−ＳＰ３５蛋白質の発現をウエスタンブロッティングによって確認した（図１０Ｆ）。これらの試験は、内因性Ｓｐ３５が髄鞘形成を阻害することおよびＳｐ３５に対する拮抗によりその阻害を逆転させることができることをさらに示している。
（実施例６）
Ｓｐ３５のＩｇドメインペプチドは、インビトロで髄鞘形成を促進する
実施例５で説明したように、後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンと乏突起神経膠細胞の共培養物をＳｐ３５ Ｉｇペプチドで処理し、髄鞘形成について検査することにより、Ｓｐ３５のＩｇドメインの一部を含有する幾つかのペプチドを調査した。
共培養試験のため、Ａ２Ｂ５＋ 乏突起神経膠細胞を、１０μｇ／ｍＬＳｐ３５−Ｉｇ−Ｆｃ（Ｆｃに融合したＳｐ３５アミノ酸４１７〜４９３）が存在するまたは不在の状態のＤＲＧニューロン・ドロップ培養物に添加した。培地（Ｂ２７および１００ｎｇ／ｍＬ
ＮＧＦを補足したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地）を交換し、新たなＳｐ３５−Ｉｇ−Ｆｃを３日ごとに細胞に添加した。髄鞘形成の変化を特定するために、２週間経た培養物を、抗βＩＩＩ−チューブリン抗体での神経フィラメントの免疫組織化学染色（「ＩＨＣ」）により染色して軸索を特定するか、抗ＭＢＰ抗体での神経フィラメントの免疫組織化学染色（「ＩＨＣ」）により染色して乏突起神経膠細胞を特定し、４週間経た培養物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付し、その後、ウエスタンブロット分析に付して、ＭＢＰを定量した。
ウエスタンブロット分析は、Ｓｐ３５−Ｉｇ−Ｆｃ処理培養物においてＭＢＰ（ミエリンの主要蛋白質成分）の発現が増加されたことを示した（図１５）。突然変異Ｓｐ３５−Ｉｇ−Ｆｃも同じアッセイで検査した。４５６位のアルギニンおよび４５８位のヒスチジンをそれぞれグルタミン酸およびバリンに突然変異させたとき、それらのペプチドは、Ｓｐ３５−Ｉｇ−Ｆｃペプチドと比較して髄鞘形成を促進しなかった（図１５）。４５６位のアルギニンは、Ｓｐ３５のＩｇドメイン内の「ＲＫＨループ」（アルギニン−リシン−ヒスチジン アミノ酸４５６〜４５８）の一部であり、Ｓｐ３５アンタゴニストポリペプチド結合にとって重要であると考えられる。Ｓｐ３５−Ｉｇ−Ｆｃの存在下でのＭＢＰ蛋白質の増加は、Ｓｐ３５−Ｆｃ分子の存在下でのＭＰＢ蛋白質の増加に匹敵する（図１５）。
Ｓｐ３５ Ｉｇドメインの一部を含有する環状ペプチドも、実施例５において説明したアッセイで、髄鞘形成を促進するそれらの能力について検査した。Ｓｐ３５ペプチドＬＳＰＲＫＨ（アミノ酸４５４〜４５８）（配列番号６１）を、Ｎ末端にシステインおよびＣ末端にシステイン残基を付加させることによって環化した。そのペプチドのＮ末端をアセチル（Ａｃ）基でおよびそのＣ末端をＮＨ２部分でキャップした。加えて、Ｎ末端にアミノ酸リンカーＧＳＧＣによって連結されたビオチン基およびＣ末端にシステイン残基−ＮＨ２を有するＬＳＰＲＫＨ（配列番号６１）ペプチドも合成し、環化した。結果として生じた環状Ｓｐ３５ペプチド、Ａｃ−ＣＬＳＰＲＫＨＣ（配列番号６６）およびビオチン−ＧＳＧＣＬＳＰＲＫＨＣ（配列番号６３）は、ウエスタンブロットで示されるように、処理した培養物ではＭＢＰ（ミエリンの主要蛋白質成分）の発現を増加させた。（図１６）。他の環状ペプチドを対照として用いた：ビオチン−ＧＳＧＣＬＳＰＥＫＶＣ（配列番号６５）、ビオチン−ＧＳＧＣＫＨＳＰＬＲＣ（配列番号６４）およびＡｃ−ＣＬＳＰＥＫＶＣ（配列番号６７）。処理した共培養物では、すべての対照ペプチドが、ＭＢＰの増加を示さなかった。（図１６）。
これらの試験は、Ｓｐ３５のＩｇドメインの、より小さなペプチドが、Ｓｐ３５による髄鞘形成阻害に関してＳｐ３５アンタゴニストとして作用し得ることをさらに示している。
（実施例７）
ＤＮ−Ｓｐ３５は、ＤＲＧニューロンおよび乏突起神経膠細胞において髄鞘形成を促進するように作用する
乏突起神経膠細胞と比較してＤＲＧニューロンにおけるＳｐ３５の髄鞘形成プロセスへの相対的寄与を扱う実験を行った。実施例１において説明したＦＬ−Ｓｐ３５およびＤＮ−Ｓｐ３５レンチウイルスベクターでＤＲＧニューロン、乏突起神経膠細胞および共培養物（実施例５において説明したとおり調製したもの）を感染させ、２週間後、髄鞘形成済ＭＢＰ＋細胞の免疫組織化学染色を行った。両方の細胞がＤＮ−Ｓｐ３５を発現する共培養物ではＭＢＰレベルが２倍に増加し、両方の細胞がＦＬ−Ｓｐ３５を発現する共培養物ではＭＢＰレベルが二分の一に減少することが観察された（図１０Ｇ）。
いずれかのまたは両方の細胞タイプにおけるＦＬ−Ｓｐ３５の過発現は、対照（空ベクター）との比較で、基底髄鞘形成レベルを有意に減少させた。一方、いずれかのまたは両
方の細胞タイプにおけるＤＮ−Ｓｐ３５の過発現は、対照と比較して２から３倍、基底髄鞘形成レベルを増加させた（図１０Ｇ）。内因的に付加されたＳｐ３５−Ｆｃは、いずれかのまたは両方の細胞タイプにおけるＦＬ−Ｓｐ３５の過発現による髄鞘形成の阻害を逆転させた。加えて、外因性Ｓｐ３５−Ｆｃは、いずれかの細胞タイプがＤＮ−Ｓｐ３５のみを過発現する場合には髄鞘形成をさらに増進し、両方の細胞タイプがＤＮ−Ｓｐ３５を過発現する場合にはわずかな効果しか有さなかった。これらの試験は、両方の乏突起神経膠細胞におけるおよびＤＲＧニューロンにおけるドミナントネガティブＳｐ３５蛋白質の発現、またはＳｐ３５−Ｆｃ蛋白質での処理が、有効な髄鞘形成に寄与することを示している。
（実施例８）
Ｓｐ３５ノックアウトマウスは、早期発現性髄鞘形成を示す
Ｓｐ３５ノックアウトマウスは、Ｓｃｈｉｅｍａｎｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９３：２１１１−２１１４（２００１））によって記載されたように、Ｓｐ３５の全、単一エキソンコーディング配列をターゲットにするＧＦＰ／Ｎｅｏ（緑色蛍光蛋白質／ネオマイシン）置換ベクターを用いて産生させた。マウスゲノム１２９／ＳｖＪ ＤＮＡをラムダゲノムライブラリ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＃９４６３１３）から単離した。１４．６ｋｂ ＥｃｏＲＶフラグメントをｐＢＳＫ＋にサブクローニングし、その後、細菌における相同組換えによってターゲッティングして、開始ＡＴＧでｅＧＦＰ Ｑ４０レポーター遺伝子を挿入した。最終構築物は、Ｓｐ３５の単一エキソンコーディング配列の全１〜１，８４１ヌクレオチドを欠失していた。この構築物を用いて、Ｄ３（１２９／Ｓｖ）胚性幹細胞におけるＳｐ３５の座をターゲッティングした。正しくターゲッティングされた細胞をＥｃｏＲＩ消化胚性幹細胞ＤＮＡのサザンブロッティングにより特定し、Ｃ５７Ｂ１／６胚盤胞に注入してキメラマウスを産生させた。キメラをＣ５７Ｂ１／６に交雑させて、ヘテロ接合性初代マウスを産生させた。尾ＤＮＡの３プライマーＰＣＲにより遺伝子型を決定した。フォワードプライマー、
Figure 0004960865
 ならびに２つのリバースプライマー、
Figure 0004960865
 によって、３５サイクルの反応（９４の２０秒間の１Ｃ、６５の３０秒間の１Ｃ、７２の３０秒間の１Ｃ）で、２７５ｂｐの野生型対立遺伝子産物および３５６ｂｐの突然変異対立遺伝子産物をそれぞれ得た。Ｍｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）参照。Ｓｐ３５遺伝子欠失の確認は、サザンブロット、ＲＴＰＣＲおよびノーザンブロット分析によって達成した。顕著なバンドが、野生型マウスのノーザンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲにおいて検出されたが、ノックアウトマウスではバンドの完全不在が見られた。ヘテロ接合体のノーザンブロットは、野生型対立遺伝子と改変Ｓｐ３５対立遺伝子を両方を示した。Ｓｐ３５ノックアウトマウスは、明らかな身体的異常または挙動、歩行運動もしくは生殖能の変化がなく、正常であるように見えた。ヘテロ接合性Ｆ１子孫同腹子のサイズは、様々であった。
Ｓｐ３５ノックアウトマウスからの培養乏突起神経膠細胞を、分化の潜在的な変化につ
いて、ＩＨＣにより評価した。Ｓｐ３５ノックアウトにおいて、野生型同腹子からの培養物におけるより高度に分化した、成熟乏突起神経膠細胞の比率が高い乏突起神経膠細胞が、観察された。正常なマウスの発育における髄鞘形成の発現は、典型的に生後（Ｐ）５日目で発生するため、次に、電子顕微鏡により、野生型およびノックアウトマウスからのＰ１脊髄における髄鞘形成を調査した。インビトロ培養物と一致して、Ｓｐ３５ノックアウトマウスからの脊髄は、それらの野生型同腹子より多くの髄鞘形成済軸索線維を含有していた。図１１。ノックアウトマウスにおいて抹消神経系坐骨神経の明らかな変化は検出されず、これは、髄鞘形成効果がＣＮＳに限られることを示唆していた。
ノックアウトマウスからの共培養ＤＲＧ−乏突起神経膠細胞は、より大きなＤＲＧと乏突起神経膠細胞の相互作用および髄鞘形成を示した。Ｓｐ３５ノックアウトマウスからの共培養ＤＲＧ−乏突起神経膠細胞は、より多くの乏突起神経膠細胞の分化および髄鞘形成を示した。ノックアウトマウスからの脊髄組織を電子顕微鏡で調査すると、新生Ｓｐ３５ノックアウトマウス（生後１日目（Ｐ１）および６日目（Ｐ６））は、それらの野生型同腹子より多くの髄鞘形成線維を示した。
Ｈｏｇａｎ Ｂ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ．
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８６），ｐｐ．１５３−１８３の方法に従って、野生型Ｓｐ３５を過発現するトランスジェニックマウスも産生させた。Ｓｐ３５を過発現するトランスジェニックマウスを電子顕微鏡で調査したところ、新生マウス（生後８日目（Ｐ８））は、それらの野生型同腹子より少ない髄鞘形成線維を示した。
（実施例９）
Ｓｐ３５−Ｆｃは、インビボで乏突起神経膠細胞の生存および髄層形成を促進する
成熟野生型Ｃ５７Ｂ１／６雄マウスに６週間、クプリゾン（０．２重量％、マウス用粉砕飼料と共に製粉したもの）を与えて、脳梁内の脱髄を誘導した。２、２．５および３週間クプリゾン給餌した時点で、Ｓｐ３５−Ｆｃを脱髄している脳梁に定位注入した。対照マウスには、Ｓｐ３５−Ｆｃを含有しない滅菌培地を同じ間隔で定位注入した。６週間のクプリゾン給餌の後、マウスを２、４および６週間、正常食（マウス用粉砕飼料のみ）に戻して、再び髄鞘形成させた。
クプリゾン処理マウスをケタミン（体重のｋｇ当たり８０ｍｇ）およびキシラジン（体重のｋｇ当たり１０ｍｇ）で麻酔し、定位手術用に設計された固定装置（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に配置した。頭皮を切開し、１．７ｍｍの深さでブレグマの０．７ｍｍ後方、０．３ｍｍ側方の定位座標を用いて滅菌化合物（１ｍＬのＨＢＳＳ中、１μＭ）を１０ｍＬハミルトンシリンジで野生型受容マウスの急性脱髄脳梁の片側に注入した（Ｍｅｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．６３（２）：３１３−１８（１９９９））。加えて、化合物を含有しないＨＢＳＳを対照受容マウスに定位注入した。頭皮の切開部にジェルフォームを詰め、その領域をペニシリンおよびステプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）でぬぐい、創傷を縫合した。注入後、その実験の１週ごとにマウスを犠牲にし、脳を取り出し、分子分析、生化学分析および組織分析のために処理した。
Ｓｐ３５−Ｆｃ治療を受けた動物は、抗ＭＢＰ蛋白質抗体またはルクソール・ファスト・ブルーを使用するＩＨＣにより、増加した成熟乏突起神経膠細胞の生存（ＣＣ１抗体染色に基づく；図１２）および軸索髄鞘形成を示した（データは示さない）。
（実施例１０）
Ｓｐ３５形質転換細胞のインビボ移植
脊髄損傷におけるＳｐ３５の生物学的機能も調査した。ラットの脊髄の損傷中心に送達するために、Ｓｐ３５を発現するレトロウイルスまたはレトロウイルス対照で皮質初代培養細胞（混合培養）を感染させる。２ｘ１０６の細胞を導入し、１０日目にラットを犠牲にする。脊髄を４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、その後、７０％エタノール、続いて９５％エタノール中で脱水する。組織サンプルをパラフィンに包埋する。切片（１０マイクロメートル厚）を免疫組織化学的染色に用いる。Ｓｐ３５を受けている損傷ラットにおける乏突起神経膠細胞の生存および軸索髄鞘形成をモニターする。Ｓｐ３５を発現する細胞を受けている動物において、より多くの乏突起神経膠細胞および軸索髄鞘形成ならびにより少ない軸索退縮が見られる。
これらの実験のためのＳｐ３５レトロウイルス構築物は、次のように作製した。ＸｈｏＩ部位を含有するプライマー
Figure 0004960865
 およびＥｃｏＲＩ部位を含有するプライマー
Figure 0004960865
 を使用して、Ｓｐ３５遺伝子をＰＣＲ増幅した。そのＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、その後、事前にＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで切断されたレトロウイルスベクターｐＭＩＧ（ＩＲＥＳ−ＧＦＰ含有）にライゲートした。この新たなベクターをｐＭＭＣ０７８と名づけた。ｐＭＭＣ０７８のすべての単離体は、偶発性点突然変異を有し、そのためｐＭＭＣ０７８の２つの単離体を互いにライゲートした。ｐＭＭＣ０７８．６をＸｈｏＩおよびＡｃｃＩで切断し、ｐＭＭＣ０７８．７をＸｈｏＩおよびＡｃｃＩで切断した。これら２つのフラグメントを互いにライゲートして、最終的な正しいプラスミド、ｐＭＭＣ０８９を作製した。その挿入物のＤＮＡ配列をＤＮＡ塩基配列決定により確認した。Ｓｐ３５レトロウイルスは、説明したとおり作製した。トランスフェクションの前日に２９３Ｇ細胞を分解した。８μｇのＳｐ３５−レトロウイルスＤＮＡを用いて、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により５ｘ１０６の細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの９２時間後に調整培地を回収した。その調整培地を５０００ｇで１０分間、遠心分離し、上清をＳｐ３５レトロウイルス保存液として用いた。この保存液を４℃で１週間、または−８０℃で６ヶ月保存した。
（実施例１１）
Ｓｐ３５−Ｆｃは、インビボで脊髄損傷（ＳＣＩ）後にニューロンおよび乏突起神経膠細胞の生存を促進する
成体雌Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓラット（１９０〜２１０ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）において脊髄損傷を誘導した。Ｔ６／Ｔ７で背側の半側切除を行って、主背内側皮質脊髄路（ＣＳＴ）成分と副側背皮質脊髄路（ＣＳＴ）成分を完全に遮った。マイクロメスを使用してその脊髄を表面から１．８ｍｍの深さで定位的に離断した。ＣＳＴ離断直後、クモ膜下カテーテルをＴ７でクモ膜下腔に挿入し、皮下腔に挿入されたプライミング済みミニ浸透圧ポンプ（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．のＡｌｚｅｔ ｍｏｄｅｌ ２００４）に接続した。このミニ浸透圧ポンプにより、０．２５μＬ／時の２５μＭ Ｓｐ３５−Ｆｃ融合蛋白質、または対照としてヒトＩｇＧ（５ｍｇ／ｍＬ）もしくはＰＢＳを送達した。術後処置は、手術後３日間、８〜１２時間おきの無痛法（Ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ／Ｂｕｐｒｅｎｅｘ、Ｒｅｃｋｉｔｔ Ｂｅｎｃｋｉｓｅｔ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｔｄ．、皮下に０．０５ｍｇ／ｋｇ）および手術後７日間の抗生物質治療（アンピシリン、Ｂｒｉ
ｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、１日２回、皮下に１００ｍｇ／ｋｇ）を含んだ。試験期間（４週間）の間または機能が元に戻るまで、１日２回、手作業で膀胱をしぼり出した。試験完了時、ラットを麻酔し、ヘパリン添加食塩水、その後４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を心臓経由で潅流させた。脊髄を除去し、パラフィンに包埋し、組織分析のために１０μｍ切片を切り出した。
ＳＣＩ後のアポトーシス細胞死を定量するために、ＳＣＩの３または７日後に動物を安楽死させ、抗活性化Ｃａｓｐａｓｅ−３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＴＵＮＥＬ染色（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて染色した。それらの切片を抗ＮｅｕＮ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）および抗ＣＣ１抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）でも染色して、それぞれ、ニューロンおよび乏突起神経膠細胞を特定した。
ＳＣＩの３日後に離断部位に対して頭側と尾側の両方の広範なＴＵＮＥＬ染色、ならびにニューロンと乏突起神経膠細胞の両方が共局在した活性化Ｃａｓｐａｓｅ−３染色が観察された。活性化Ｃａｓｐａｓｅ−３−ポジティブニューロンおよび乏突起神経膠細胞の数は、ＳＣＩの３日後、対照におけるよりＳｐ３５−Ｆｃ処理動物におけるほうが有意に少なかった。さらに、ＳＣＩの４週間後、抗βＩＩＩ−チューブリン抗体（ニューロンの生存）および抗Ｏ４抗体（乏突起神経膠細胞の生存）での染色に基づき、対照におけるよりＳｐ３５−Ｆｃ処理動物におけるほうが病変部位を包囲する脊髄組織内に多くのニューロンおよび乏突起神経膠細胞が生存していた。
（実施例１２）
Ｓｐ３５−Ｆｃは、インビトロでＣａｓｐａｓｅ−３活性化および細胞死を減少させる
５％ ウシ胎仔血清、１０％ ウマ血清、２ｍＭ グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリ
ンおよび１００ｍｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（２００ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦを含有）を補足したＲＰＭＩ−１６４０倍地中で７日間、ＰＣ１２細胞（Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ）を分化させた。実験のために、その培地を、Ｓｐ３５−Ｆｃ、負の対照としてヒトＩｇＧ（０．１〜１０μＭ）または正の対照としてｚＶＡＤ（０．１μＭ）を含有するＮＧＦ不含培地で置換した。ＮＧＦ除去の１８時間後、Ｃａｓｐａｓｅ ３／７ Ｇｌｏ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）をその製造業者のインストラクションに従って使用して、活性化Ｃａｓｐａｓｅ−３を定量した。ＮＧＦ除去の４２時間後、細胞死検出ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ）をその製造業者のインストラクションに従って使用して、アポトーシス細胞死を定量した。
培地からＮＧＦを除去した１８時間後、栄養の援助に恵まれない分化ＰＣ１２細胞において、０．１μＭのＳｐ３５−Ｆｃは、Ｃａｓｐａｓｅ−３の活性化を減少させることが観察された。Ｃａｓｐａｓｅ−３の活性化に対するＳｐ３５−Ｆｃの効果は、用量依存性であり、より高い用量（１または１０μＭ）では、カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ（０．１μＭ）の神経保護用量と同様に有効であった（図１４）。細胞死のさらなる計測として、ＴＵＮＥＬ ＥＬＩＳＡ法を用いてアポトーシスを定量し、Ｓｐ３５−Ｆｃは、ＮＧＦの除去の４２時間後に測定した細胞死を有意に減少させたことが判明した（図１３）。
明瞭に理解するために実例および実施例として上記発明を多少詳しく説明したが、本発明の教示に鑑みて、添付のクレームの精神または範囲を逸脱することなく一定の変更および変形を行うことができることは、当業者には容易にわかることであろう。
本明細書において言及したすべての出版物および特許出願は、個々の出版物または特許出願のそれぞれが参照として援用されると具体的に、個々に示されているかのように、それと同程度に、参照として本明細書に援用される。
完全長ヒトＳｐ３５ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）である。 完全長ヒトＳｐ３５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２）である。 完全長マウスＳｐ３５ポリペプチドをコードする配列のヌクレオチド配列（配列番号３）である。 完全長マウスＳｐ３５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号４）である。 Ｓｐ５（ＬＩＮＧＯ−１）は乏突起神経膠細胞において発現される。Ｐ１３ ＣＧニューロン（ｐ１３ＣＧＮ）、乏突起神経膠細胞および神経膠星状細胞培養物におけるＬＩＮＧＯ−１ ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。内部対照として同サンプルからのＧＡＰＤＨ発現を分析した。 （Ａ）ＲＮＡｉに感染させた乏突起神経膠細胞および未感染対照からのＳｐ５（ＬＩＮＧＯ−１）ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。β−アクチンを内部標準として使用した。（Ｂ）ＲＮＡｉで処理した培養物における成熟乏突起神経膠細胞の定量。 様々な発育段階での乏突起神経膠細胞におけるＳｐ３５（ＬＩＮＧＯ−１）ｍＲＮＡ発現。乏突起神経膠細胞を分化するように誘導し、ＲＴ−ＰＣＲによりＳｐ３５の定量を行った。データは、内部対照としてのＧＡＰＤＨレベルに正規化した。初期前駆乏突起神経膠細胞（Ａ２Ｂ５＋）および髄鞘形成前乏突起神経膠細胞（Ｏ４＋）は、同等のＳｐ３５ ｍＲＮＡレベルを示したが、成熟乏突起神経膠細胞（ＭＢＰ＋）の倍より多いＳｐ３５ ｍＲＮＡレベルを示した。 対照−Ｆｃポリペプチドでの処理と比較した外因性ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ処理後の乏突起神経膠細胞の用量依存性分化。成熟乏突起神経膠細胞（ミエリンシートの存在により特定）の数を数えることにより、全Ｏ４＋乏突起神経膠細胞の百分率としてデータを定量した。各サンプルにつき約８００の細胞を計数した。 ＬＩＮＧＯ−１（Ｓｐ５）アンタゴニストは、ＲｈｏＡおよびＦｙｎを調節する。（Ａ）ウエスタンブロッティングにより検出された、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃで処理した乏突起神経膠細胞におけるＲｈｏＡ−ＧＴＰ量。（Ｂ）ウエスタンブロッティングにより検出された、ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−１、ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−１または対照プラスミドを有するレンチウイルスに感染させた乏突起神経膠細胞におけるＦｙｎ発現およびリン酸化（ｐＦｙｎ）。 図１０Ａ：ＬＩＮＧＯ−１アンタゴニストは、乏突起神経膠細胞による軸索髄鞘形成を促進する。ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ（１０μｇ／ｍＬ）で２週間処理した共培養物における髄鞘形成の定量分析。各サンプルにつき、ＭＢＰ＋が染色された細胞の１０の領域を計数した。 図１０Ｂ：抗ＭＢＰ抗体を使用してＭＢＰ蛋白質の存在を検出するにことによる、外因性ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃおよび対照−Ｆｃポリペプチドで処理した４週培養物のウエスタンブロット。 図１０Ｃおよび１０Ｄ：ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ（Ｃ）または対照Ｆｃ（Ｄ）で４週間処理した共培養物の電子顕微鏡分析。ランビエ絞輪構造を指摘する。縮尺棒、１．５μｍ。 図１０Ｅおよび１０Ｆ：ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−１、ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−１および対照レンチウイルスに２週間感染させた共培養物における髄鞘形成。ＭＢＰ＋細胞を免疫蛍光法により計数した（Ｅ）。赤血球凝集素タグに対する抗体を使用してＭＢＰおよびＬＩＮＧＯ−１について分析した、ＦＬ−ＬＩＮＧＯ−１、ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−１および対照レンチウイルスに感染させた培養物からのウエスタンブロット（Ｆ）。 図１０Ｇ：後根神経節細胞（ＤＲＧ感染）もしくは乏突起神経膠細胞（オリゴ感染）のみまたは両方（両方感染）をＦＬ−ＬＩＮＧＯ−１、ＤＮ−ＬＩＮＧＯ−１および対照レンチウイルスに感染させた共培養物における髄鞘形成。 Ｐ１マウスからのＬＩＮＧＯ−１ノックアウトおよび野生型脊髄における髄鞘形成済軸索線維の（Ａ）目視での分析および（Ｂ）定量分析を示す電子顕微鏡検査。４つの脊髄を分析し、各サンプルにつき、１０の領域からの髄鞘形成軸索線維を計数した。示されているデータは、すべての測定からの平均値である。 本明細書において説明するように、クプリゾン処理マウスにＳｐ５−Ｆｃ（ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ）または対照ポリペプチドを外科的に注入した。Ｓｐ３５−Ｆｃ治療を受けた動物は、成熟乏突起神経膠細胞の生存の増加を示した（ＣＣ１抗体染色に基づく）。 ＮＧＦ除去の１８時間後にＳｐ３５−Ｆｃ（ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ）または対照で処理した分化ＰＣ１２細胞のＴＵＮＥＬアッセイ。Ｓｐ５−Ｆｃで処理した細胞のほうが、アポトーシスを被る細胞が少なかった。 Ｓｐ３５−Ｆｃ（ＬＩＮＧＯ−１）、カスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤまたは対照ポリペプチドで処理した、培地からのＮＧＦ除去の１８時間後の栄養の援助に恵まれない分化ＰＣ１２細胞のアポトーシス。対照ポリペプチドで処理した細胞が、最も多くの細胞死を示した。 抗ＭＢＰ抗体を使用してＭＢＰ蛋白質の存在を検出することによる、外因性ＬＩＮＧＯ−１−Ｉｇ−Ｆｃ、突然変異体ＬＩＮＧＯ−１−Ｉｇ−Ｆｃ（４５６位のアルギニンがヒスチジンに変わったもの）、ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃおよび対照Ｆｃポリペプチドで処理した共培養物のウエスタンブロット。 抗ＭＢＰ抗体を使用してＭＢＰ蛋白質の存在を検出することによる、実施例６で説明するような外因性ＬＩＮＧＯ−１−Ｉｇ環状ペプチドおよび突然変異ＬＩＮＧＯ−１−Ｉｇ環状ペプチドで処理した４つの共培養物のウエスタンブロット。

Claims (28)

  1. 乏突起神経膠細胞の分化または生存を促進するためのインビトロでの方法であって、前記乏突起神経膠細胞と、
    （ｉ）可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドであって、該可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸３４〜５３２および配列番号２のアミノ酸４１７〜４９３からなる群より選択されるフラグメント、または配列番号６１のペプチド配列を含む可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド；
    （ｉｉ）Ｓｐ３５抗体またはそのフラグメントであって、該Ｓｐ３５抗体またはそのフラグメントは、配列番号２のアミノ酸３４〜５３２および配列番号２のアミノ酸４１７〜４９３からなる群より選択されるポリペプチドフラグメントに特異的に結合するＳｐ３５抗体またはそのフラグメント；
    （ｉｉｉ）配列番号４０、配列番号４１またはそれらの組み合わせのヌクレオチド配列を含むＳｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド；ならびに
    （ｉｖ）前記Ｓｐ３５アンタゴニストのうちの２つまたはそれ以上の組み合わせ
    から成る群より選択されるＳｐ３５アンタゴニストを含む組成物とを接触させることを含む方法。
  2. 哺乳動物におけるＳｐ３５を発現する乏突起神経膠細胞の分化または生存を促進するための薬学的組成物であって、
    （ｉ）可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドであって、該可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸３４〜５３２および配列番号２のアミノ酸４１７〜４９３からなる群より選択されるフラグメント、または配列番号６１のペプチド配列を含む可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド；
    （ｉｉ）Ｓｐ３５抗体またはそのフラグメントであって、該Ｓｐ３５抗体またはそのフラグメントは、配列番号２のアミノ酸３４〜５３２および配列番号２のアミノ酸４１７〜４９３からなる群より選択されるポリペプチドフラグメントに特異的に結合するＳｐ３５抗体またはそのフラグメント；
    （ｉｉｉ）配列番号４０、配列番号４１またはそれらの組み合わせのヌクレオチド配列を含むＳｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチド；ならびに
    （ｉｖ）前記Ｓｐ３５アンタゴニストのうちの２つまたはそれ以上の組み合わせ
    から成る群より選択されるＳｐ３５アンタゴニストを含む、薬学的組成物。
  3. 前記Ｓｐ３５アンタゴニストが、可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドを含む、請求項２に記載の薬学的組成物。
  4. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、Ｓｐ３５膜貫通ドメインおよびＳｐ３５細胞質ドメインを欠く、請求項３に記載の薬学的組成物。
  5. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、
    （ｉ）Ｓｐ３５ ＬＲＲドメインまたはそのフラグメント、
    （ｉｉ）Ｓｐ３５塩基性領域Ｃ末端からＬＲＲまでのドメインまたはそのフラグメント、および
    （ｉｉｉ）Ｓｐ３５免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインまたはそのフラグメント、
    を含む、請求項３または４に記載の薬学的組成物。
  6. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、Ｓｐ３５ Ｉｇドメイン、Ｓｐ３５塩基性領域、Ｓｐ３５膜貫通ドメイン、およびＳｐ３５細胞質ドメインを欠く、請求項３または請求項４に記載の薬学的組成物。
  7. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基３４〜５３２を含む、請求項３または４に記載の薬学的組成物。
  8. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、Ｓｐ３５ Ｉｇドメインまたはそのフラグメントを含む、請求項３または４に記載の薬学的組成物。
  9. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸４１７〜４９３を含む、請求項８に記載の薬学的組成物。
  10. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、
    ペプチド配列ＬＳＰＲＫＨ（配列番号６１）を含む、請求項３または４に記載の薬学的組成物。
  11. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、環状ペプチドである、請求項３から１０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  12. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、非相同なポリペプチドをさらに含む、請求項３から１１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  13. 前記非相同なポリペプチドが、抗体Ｉｇポリペプチド、血清アルブミンポリペプチド、ターゲッティングポリペプチド、レポーターポリペプチド、１個以上のシステイン残基および精製助長性ポリペプチドから成る群より選択される、請求項１２に記載の薬学的組成物。
  14. 前記非相同なポリペプチドが、免疫グロブリンＦｃ、ヒト血清アルブミンまたはそれらのフラグメント、およびヒスチジンタグからなる群より選択される、請求項１３に記載の薬学的組成物。
  15. 前記可溶性Ｓｐ３５ポリペプチドが、ポリマーにコンジュゲートしている、請求項３から１４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  16. 前記Ｓｐ３５アンタゴニストが、Ｓｐ３５抗体またはそのフラグメントを含む、請求項２に記載の薬学的組成物。
  17. 前記Ｓｐ３５抗体またはそのフラグメントが、乏突起神経膠細胞の成長または分化の阻害を阻止する、請求項１６に記載の薬学的組成物。
  18. 前記Ｓｐ３５抗体またはそのフラグメントが、ＣＮＳニューロンの脱髄もしくは髄鞘形成不全を阻止する、請求項１６に記載の薬学的組成物。
  19. 前記Ｓｐ３５抗体が、５ｘ１０−２Ｍ未満の解離定数ＫＤを特徴とする親和性でＳｐ３５の少なくとも１つのエピトープに結合する、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  20. 前記Ｓｐ３５アンタゴニストが、
    （ｉ）アンチセンスポリヌクレオチド；
    （ｉｉ）短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）；および
    （ｉｉｉ）短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌ−ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）（ｓｈＲＮＡ）から成る群より選択されるＳｐ３５アンタゴニストポリヌクレチドである、請求項２に記載の薬学的組成物。
  21. 前記Ｓｐ３５アンタゴニストポリヌクレオチドが、Ｓｐ３５ ｍＲＮＡのコーディング部分に相補的な塩基を少なくとも１０含むアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項２０に記載の薬学的組成物。
  22. 前記Ｓｐ３５アンタゴニストが、ヌクレオチド配列：
    Figure 0004960865
    （配列番号４０）を含むｓｈＲＮＡである、請求項２１に記載の薬学的組成物。
  23. 前記哺乳動物が、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン分解（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハー病（ＰＭＺ）、ウォラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチングトン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、外傷性脳損傷、照射後損傷、化学療法の神経合併症、卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏症、ビタミンＥ単独欠乏性症候群、ＡＲ、バッセン・コーンツバイク症候群、マルキアファーバ・ビニャーミ症候群、変染色性白質ジストロフィー、三叉神経痛およびベル麻痺から成る群より選択される疾患、障害または損傷を有すると診断されている、請求項２に記載の薬学的組成物。
  24. 前記疾患、障害または損傷が、多発性硬化症（ＭＳ）である、請求項２３に記載の薬学的組成物。
  25. （ａ）発現制御配列への作動可能な連結により前記Ｓｐ３５アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドで前記乏突起神経膠細胞をトランスフェクトすること、および（ｂ）前記Ｓｐ３５アンタゴニストを発現させることを含む、請求項１に記載のインビトロでの方法。
  26. 発現制御配列に作動可能に連結された前記Ｓｐ３５アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２に記載の薬学的組成物。
  27. 前記ポリヌクレオチドを含む培養宿主細胞を含む、請求項２６に記載の薬学的組成物であって、該培養宿主細胞が前記Ｓｐ３５アンタゴニストを発現する、薬学的組成物。
  28. 前記培養宿主細胞が、治療すべき哺乳動物に由来する、請求項２７に記載の薬学的組成物。
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