DE60131676T2 - Verfahren zur herstellung einer maus, die für die aufnahme, differenzierung und proliferation von heterogenen zellen geeignet ist, die hierdurch hergestellte maus und ihre verwendung - Google Patents

Verfahren zur herstellung einer maus, die für die aufnahme, differenzierung und proliferation von heterogenen zellen geeignet ist, die hierdurch hergestellte maus und ihre verwendung Download PDF

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Description

  • FACHGEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer zur Implantation von heterologen Zellen ausgezeichneten Maus, eine durch dieses Verfahren hergestellte Maus und die Verwendung der Maus.
  • STAND DER TECHNIK
  • Labortiere, denen heterologe Zellen, einschließlich menschlicher Zellen, implantiert wurden, sind zur Analyse von Mechanismen für den Ausbruch verschiedener Krankheiten und für die Entwicklung von Arzneimitteln für die Behandlung oder Prävention derselben sehr bedeutend; darum ist die Entwicklung von Tieren als Empfänger eines der Hauptthemen in der Versuchstierwissenschaft. Insbesondere haben in den letzten Jahren Behandlungen etc. (bekannt als Regenerative Medizin), wobei Gewebe oder Zellen, die aus Stammzellen differenziert wurden, transplantiert werden, weltweit Beachtung gefunden; darum sind diese Tiere von zunehmender Bedeutung.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Entwicklung und Verbesserung dieser Labortiere fortgesetzt. Insbesondere haben sie Verbesserungen oder dergleichen an einer Nacktmaus oder einer SCID-Maus vorgenommen, und sie haben bereits eine Patentanmeldung ( Japanische offengelegte Patentanmeldung (kokai) Nr. 9-94040 ) eingereicht, die eine immundefiziente, für diesen Zweck hergestellte Maus etc. betrifft. Vor allem eine NOD/Shi-scid-Maus und eine NOD/LtSz-scid-Maus, die multifunktionelle Immundefizienz (funktionelle Defizienz von T-Zellen und B-Zellen, reduzierte Makrophagenfunktion, reduzierte Komplementaktivität, reduzierte Natürliche Killerzell (NK-Zell)-Aktivität etc.) aufweist, sind als Labortiere, die zur Implantation von heterologen Zellen geeignet sind, besonders erwähnenswert. Da deutlich wurde, dass sie für verschiedene Forschungsgebiete einschließlich Stammzelldifferenzierung und -proliferation eingesetzt werden könnten, nahm der Bereich von Anwendungen, in dem sie verwendet werden, bis auf das derzeitige Niveau zu.
  • Zwar werden menschliche Zellen in die NOD/Shi-scid-Maus mit einer hohen Rate implantiert; es wird jedoch anerkannt, dass das Implantationsvermögen bedeutend variiert.
  • Um das Implantationsvermögen der NOD/Shi-scid-Maus zu erhöhen, wurde bereits aufgezeigt, dass die Reduktion der NK-Zell-Aktivität in der Maus durch Verabreichen von Anti-IL-2-R-β-Ketten-Antikörper (TMβ1), Anti-Asialo-GM1-Antikörpern oder dergleichen wichtig ist (Koyanagi, Y. et al., 1997. "Primary human immunodeficiency virus type 1 viremia and central nervous system invasion in a novel hu-PBL-immunodeficient mouse strain." J Virol 71: 2417; Koyanagi, Y. et al., 1997. "High levels of viremia in hu-PBL-NOD-scid mice with HIV-1 infection." Leukemia 11 Suppl. 3: 109; Yoshino H, et al., 2000. "Natural killer cell depletion by anti-asialo GM1 antiserum treatment enhances human hematopoietic stem cell engraftment in NOD/Shi-scid mice." Bone Marrow Transplant 26: 1211–6.) Allerdings sind diese Antikörper sehr teuer, und es ist bekannt, dass ihre Wirksamkeit zwischen Individuen variiert. Wenn außerdem Anti-Asialo-GM1-Antikörper verwendet werden, sollte dies mit der Häufigkeit von einer Verabreichung an jedem 11. Tag der Experimentalperiode durchgeführt werden, und somit wird ein Grad an Komplexität eingebaut.
  • Darum stellten Dr. Shultz, L. D. et al. von The Jackson Laborstory in den United States durch Kreuzen einer NOD/LtSz-scid-Maus mit hohem Implantationsvermögen für menschliche Zellen mit einer β2mKO-Maus, aus der die NK-Zell-Aktivität eliminiert worden ist, eine NOD/LtSz-scid, β2m null (β2m (null) NOD/SCID)-Maus her (Kollet O, Peled A, Byk T et al., beta2 microglobulin-deficient (B2m(null)) NOD/SCID mice are excellent recipients for studying human stem cell function. Blond 2000; 95(10): 3102–5).
  • Im Fall der NOD/LtSz-scid, β2m null-Maus sind T-Zellen, B-Zellen und natürliche Killer-(NK)-Zellen eliminiert, und die Funktion von Makrophagen und Komplementsystem ist herabgesetzt. Allerdings sind auch andere Zellen (z. B. dendritische Zellen) und Faktoren (z. B. IFN-γ) an der Rejektion von transplantierten heterologen Zellen oder Geweben beteiligt.
  • Das Dokument WO 99/60846 betrifft eine immunkompromittierte Maus. Insbesondere enthält die in diesem Dokument beschriebene immunkompromittierte Maus T-Zellen und B-Zellen, besitzt reduzierte Makrophagenfunktion und reduzierte natürliche Killer-Zell-Aktivität, und ihr Vermögen zur Toleranz beliebiger implantierter Zellen wird durch Reduzieren der Aktivität dendritischer Zellen durch Verabreichen eines gegen die Interleukin 2-Rezeptor-λ-Kette gerichteten Antikörpers erhöht.
  • Demnach ist eine Maus wünschenswert, die, im Vergleich zu der NOD/LtSz-scid, β2m null-Maus, keine Variation im heterologen Zellimplantationsvermögen aufweist, keine Antikörper erfordert und eine ausgezeichnete heterologe Zellimplantation aufweist.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Somit besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Lösung der obigen Probleme und in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung einer Maus mit ausgezeichnetem heterologen Zellimplantationsvermögen, und in einer durch dasselbe Verfahren hergestellten Maus.
  • Die vorliegenden Erfinder haben intensive Studien zur Lösung der obigen Probleme vorgenommen. Demzufolge haben sie als Forschungsergebnis erhalten, dass eine Maus, die keine Variation im Implantationsvermögen von heterologen Zellen aufweist und keine Antikörper erfordert (d. h. sie ist zur Implantation heterologer Zellen geeignet) durch Rückkreuzung einer NOD/Shi-Maus mit einer C.B-17-scid-Maus und weiteres Rückkreuzen der so erhaltenen Maus mit einer Interleukin 2-Rezeptor-γ-Ketten(IL-2Rγ)-Gen-Knockout-Maus erhalten werden kann. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage des obigen Ergebnisses bewerkstelligt.
  • Die vorliegende Erfindung ist nämlich wie folgt:
    • 1. Eine NOG(NOD/Shi-scid,IL-2RγKO)-Maus mit ausgezeichnetem Implantationsvermögen für heterologe Zellen, bei der sowohl die funktionsfähigen T-Zellen als auch die funktionsfähigen B-Zellen deletiert sind, die Makrophagenfunktion reduziert ist, die NK-Zellen oder die NK-Zell-Aktivität eliminiert ist und die Funktion der dentritischen Zellen reduziert ist.
    • 2. NOG-Maus, die unter 1 beschrieben ist, bei der transplantierte humane Stammzellen sich effizient differenzieren und proliferieren, ohne eliminiert zu werden, mit der Maßgabe, dass die humanen Stammzellen keine humanen embryonalen Stammzellen sind.
    • 3. Stammzelltestverfahren, bei dem man der Maus, die unter einem von (1) oder (2) beschrieben ist, humane Stammzellen transplantiert, die Maus tötet, die humanen Stammzellen von der Maus sammelt und die differenzierten und proliferierten Zellen von den transplantierten humanen Stammzellen sammelt, mit der Maßgabe, dass die humanen Stammzellen keine humanen embryonalen Stammzellen sind.
    • 4. Stammzelltestverfahren das unter 3 beschrieben ist, bei dem man die Differenzierung und Proliferation von T-Zellen und B-Zellen analysiert.
    • 5. Verfahren zum Proliferieren von humanen Stammzellen, bei dem man: der Maus, die unter einem von (1) oder (2) beschrieben ist, die humanen Stammzellen transplantiert und dort proliferieren lässt, die Maus tötet, die humanen Stammzellen aus dem Knochenmark der Maus sammelt und wiederholt der Maus, die unter einem von (1) oder (2) beschrieben ist, die humanen Stammzellen transplantiert, mit der Maßgabe, dass die humanen Stammzellen keine humanen embryonalen Stammzellen sind.
    • 6. Verfahren zum Proliferieren von humanen Stammzellen, die unter (5) beschrieben sind, wobei die Häufigkeit der Wiederholung weniger als dreimal beträgt.
    • 7. Verfahren, das unter (5) oder (6) beschrieben ist, wobei die humanen Stammzellen darin eingebrachte Fremdgene aufweisen.
    • 8. Modellmaus für einen humanen Tumor, wobei die Maus eine Maus ist, die in einem von (1) oder (2) beschrieben ist, und humane Tumorzellen hält.
    • 9. Modellmaus für einen humanen Tumor, die unter (8) beschrieben ist, wobei die humanen Tumorzellen von HTLV-1-Leukämie abgeleitet sind.
    • 10. Modellmaus für einen humanen Tumor, die unter (8) oder (9) beschrieben ist, wobei die Maus die humane Tumorzelle an einer Auricula davon aufweist.
    • 11. Verfahren zur Herstellung einer Modellmaus für einen humanen Tumor, bei dem man der Maus, die unter einem von (1) oder (2) beschrieben ist, humane Tumorzellen transplantiert und diese Maus vor der Analyse tötet.
    • 12. Verfahren, das unter (8) beschrieben ist, wobei die humanen Tumorzellen von HTLV-1-Leukämie abgeleitet sind.
    • 13. Verfahren, das unter (11) oder (12) beschrieben ist, bei dem die humanen Tumorzellen an eine Auricula der Maus transplantiert werden.
    • 14. Virusinfizierte Modellmaus, wobei die Maus eine Maus ist, die unter einem von (1) oder (2) beschrieben ist, und sowohl mit einem T-trogen Virus als auch mit einem makrophagen-trogen Virus infizierte T-Zellen hält.
    • 15. Virusinfizierte Modellmaus, die unter (14) beschrieben ist, wobei das Virus HIV ist.
    • 16. Virusinfizierte Modellmaus, die unter (14) beschrieben ist, wobei das Virus HTLV-1 ist.
  • Im Folgenden werden die allgemeinen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben.
  • 1. Herstellung einer NOD/Shi-scid,IL-2RγKO(NOG)-Maus der vorliegenden Erfindung
  • Ein Verfahren zur Herstellung einer NOD/Shi-scid,IL-2RγKO(NOG)-Maus, die zur Implantation von heterologen Zellen geeignet ist, ist durch das Rückkreuzen einer Maus B mit einer Maus A, wie nachstehend beschrieben, gekennzeichnet:
    • A: eine Maus erhalten durch Rückkreuzen einer C.B-17-scid-Maus mit einer NOD/Shi-Maus; und
    • B: eine Interleukin-2-Rezeptor-γ-Ketten-Gen-Knockout-Maus.
  • Hier umfassen Beispiele für die heterologen Zellen oder Gewebe, die aus Säugern, wie Menschen, Mäusen, Ratten, etc. stammen, insbesondere humane Stammzellen, Lymphozyten oder Tumorzellen etc. vom Menschen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, mit der Maßgabe, dass die humanen Stammzellen keine humanen embryonalen Stammzellen sind.
  • Im Fall der Maus A erfolgt ein Rückkreuzen der C.B-17-scid-Maus mit der NOD/Shi-Maus nach Verfahren, die einem Fachmann wohlbekannt sind, beispielsweise Rückkreuzen durch das Cross-Intercross-Verfahren (Inbred Strains in Biomedical Research, M. F. W. Festing, 1979, ISBN 0-333-23809-5, The Macmillan Press, London and Basingstoke). Die C.B-17-scid-Maus wird mit der NOD/Shi-Maus gekreuzt, und die erhaltenen F1-Mäuse werden jeweils miteinander weitergekreuzt. Anschließend wird die Immunglobulin-Menge im Blutserum der so erhaltenen F2-Mäuse gemessen, zur Selektion einer Maus, bei der kein Immunglobulin nachgewiesen werden kann. Die selektierte Maus wird erneut mit einer NOD/Shi-Maus gekreuzt. Die Wiederholung dieses Verfahrens (Cross-Intercross-Verfahren) 9 Mal oder mehr ermöglicht das Erreichen der Rückkreuzung.
  • Eine NOD/Shi-Maus und eine C.B-17-scid-Maus sind beide von der Firma CLEA JAPAN, INC. im Handel erhältlich. Weiterhin umfassen Beispiele für Mäuse, die durch Kreuzen dieser Mäuse miteinander erhältlich sind, eine NOD/Shi-scid-Maus (auch als NOD-scid-Maus bezeichnet) ( japanische offengelegte Patentanmeldung (kokai) Nr. 9-94040 ), welche die vorliegenden Erfinder bereits entwickelt haben. Diese Maus wird von der Firma CLEA JAPAN, INC. bezogen und kann direkt als Maus A eingesetzt werden. Zusätzlich besitzen die vorliegenden Erfinder, abgesehen von den oben erwähnten Mäusen, NOD/Shi-Mäuse und NOD/Shi-scid-Mäuse, die aufgeteilt werden können und wann immer die Notwendigkeit auftritt, bereitgestellt werden können.
  • Ferner wird, im Fall der Maus B, der Knockout eines Interleukin-2-Rezeptor-γ-Ketten(IL-2Rγ)-Gens nach Verfahren durchgeführt, die einem Fachmann wohlbekannt sind, beispielsweise nach einem homologen Rekombinationsverfahren unter Verwendung von Maus-ES-Zellen (Capecchi, M. R., Altering the genome by homologous recombination, Science, (1989) 244, 1288–1292). Nach Substitution eines spezifischen aus der Maus stammenden Gens durch ein homologes Gen, einschließlich eines Gens, das Resistenz gegenüber einem Arzneimittel, beispielsweise Neomycin etc., vermittelt, im ES-Zellstadium werden die ES-Zellen in eine befruchtete Eizelle inseriert, wodurch der Gen-Knockout erzielt wird.
  • Speziell werden beispielsweise aus einer Genombibliothek von einer 129/SV-Maus Genklone, die Maus-IL-2Rγ enthalten, isoliert, unter Verwendung einer humanen IL-2Rγ-cDNA als Sonde. Unter Verwendung eines Fragments von 8.6 kb, das die volle Länge von IL-2Rγ unter den Klonen enthält, wird ein Targeting-Vektor hergestellt. Das heißt, PMC1-neo poly A, die ein Neomycin-Resistenz-Gen exprimiert, wird zwischen die Exons 7 und 8 von IL-2R in das Fragment inseriert, und außerdem wird ein Diphtherietoxin-A-Gen an der 3'-Stelle im Abstand von 1 kb von Exon 8 platziert. Als Nächstes wird der Vektor linearisiert und in 1 × 107 E14-ES-Zellen durch Elektroporation eingeführt. Anschließend werden ES-Klone, die eine homologe Rekombination in der Kulturlösung, die G418 enthält, bewirken, selektiert (bestätigt durch PCR oder Southern-Verfahren), und nach Injektion der ES-Klone in Blastozyten von C57BL/6-Mäusen werden diese in den Uterus von Leihmutter-Mäusen transplantiert. Von den Leihmutter-Mäusen geborene chimäre Mäuse werden weiterhin mit C57BL/6-Mäusen gekreuzt, wodurch IL-2RγKO-hetero-Mäuse erhalten werden, worin der Knockout auf die Keimzellen übertragen worden ist.
  • Alternativ kann ein zuvor etablierter Interleukin-2-Rezeptor-γ-Ketten-Gen(IL-2Rγ)-Knockout-Maus-Stamm direkt vom Hersteller zur Verwendung erhalten werden, und Beispiele für die Mausstämme umfassen Interleukin-2-Rezeptor-γ-Ketten(1L-2Rγ)-Knockout-Mäuse (Ohbo K, Suda T, Hashiyama M et al., Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blond 1996; 87(3): 956–67), die aus IL-2RγKO-Maus-Stämmen hergestellt wurden [Prof. Kazuo Sugamura, Department of Microbiology and Immunology, Tohoku University School of Medicine]. Im Übrigen werden IL-2RγKO-Mäuse derzeit in der Embryonen-Konservierungsbank der Anmelder gespeichert (Central Institute for Experimental Animals), auf Anfrage von Prof. Sugamura, einem Hersteller des Mausstamms, und wenn immer der Bedarf entsteht, können sie als gefrorene Embryonen oder als aufgetaute Mäuse zur Rekonstruktion bereitgestellt werden.
  • Außerdem kann ein Rückkreuzen der Maus B mit der Maus A auf ähnliche Weise, wie vorstehend beschrieben, nach herkömmlichen Verfahren, die einem Fachmann wohlbekannt sind, durchgeführt werden. Beispielsweise gemäß dem oben beschriebenen Rückkreuzen; das heißt eine NOD/Shi-scid-Maus wird mit einer IL-2RγKO-Maus gekreuzt, und die erhaltene F1-Maus wird mit einer NOD/Shi-scid-Maus rückgekreuzt, wodurch die Rückkreuzung erreicht wird.
  • Die erfindungsgemäße Maus wird als eine NOG-Maus (NOG-Maus; NOD/Shi-scid, γc null-Maus; NOD/Shi-scid, IL-2Rγ-Kette –/– Maus; NOD/Shi-scid, IL-2R(γc)null-Maus etc.) bezeichnet.
  • Die erfindungsgemäße Maus ist eine schwerwiegend immundefiziente Maus, in der sowohl die funktionellen T-Zellen als auch die funktionellen B-Zellen deletiert sind, die Makrophagenfunktion reduziert ist und NK-Zellen oder die NK-Zell-Aktivität eliminiert sind. Wenn darum heterologe Zellen (z. B. humane periphere mononukleäre Blutleukozyten) in die erfindungsgemäße Maus eingebracht werden, werden viel höhere Implantations- und Proliferationsraten festgestellt, auch im Vergleich mit herkömmlichen immundefizienten Mäusen, mit denen eine Anti-NK-Zell-Antikörper-Behandlung durchgeführt wird (siehe Beispiel 1, nachstehend beschrieben). Weiterhin sind auch dendritische Zellen der erfindungsgemäßen Mäuse funktionell inkompetent, und die Produktion von Zytokinen ist deutlich reduziert. Somit besitzt die erfindungsgemäße Maus im Vergleich mit herkömmlichen immundefizienten Mäusen ein hochgradig ausgezeichnetes Implantationsvermögen für heterologe Zellen, und sie wird für die Analysen verschiedener eingeführter heterologer Zellen (einschließlich Stammzellen, differenzierter Zellen und Krebszellen), die in diese Maus implantiert werden, als wirksam betrachtet. Zusätzlich ist die Verwendung der Maus möglich, um eine Maus als pathologisches Modell zu entwickeln und einen humanen Antikörper gegen HIV, HTLV-1 oder Krebs zu produzieren.
  • Im Folgenden werden die Anwendungen der erfindungsgemäßen Maus beschrieben. In der Regel ist die zu verwendende Maus vorzugsweise 8 bis 12 Wochen alt, jedoch nicht darauf beschränkt.
  • 2. Entwicklung eines humanen Stammzell-Assay-Systems unter Verwendung der erfindungsgemäßen Maus
  • Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Maus ist die Entwicklung eines humanen Stammzell-Assay-Systems zur Untersuchung von Faktoren und Mechanismen, die an der Differenzierung und Proliferation von humanen Stammzellen beteiligt sind, möglich. Es ist auch möglich, unter Verwendung des humanen Stammzell-Assay-Systems verschiedene therapeutischen Produkte zu erforschen.
  • Das Einbringen humaner Stammzellen in die erfindungsgemäße Maus gestattet die Entwicklung des humanen Stammzell-Assay-Systems. Hier umfassen Stammzellen, zusätzlich zu hämatopoietischen Stammzellen, Stammzellen, die sich nicht aus dem hämatopoietischen System ableiten, wie neurale Stammzellen etc. Humane Stammzellen werden anhand des Vorhandenseins eines Zelloberflächenmarkers identifiziert, der einer spezifischen Epitop-Stelle entspricht, die durch einen Antikörper identifiziert wird, und können beispielsweise als CD34-positive Zellen aus z. B. dem menschlichen Knochenmark, Nabelschnurblut, peripherem Blut etc. isoliert werden.
  • Stammzellen werden in einer Lösung, die auf Zellen und lebende Organismen keinen Einfluss ausübt, wie z. B. physiologische Kochsalzlösung, phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung etc., suspendiert und 1 × 104 bis 1 × 106 Zellen werden der Maus intravenös verabreicht, wodurch die Transplantation durchgeführt wird.
  • Die Zellen werden mehrere Wochen nach dem Transplantieren aus jedem Organ der Maus, in das die Zellen transplantiert wurden, wie z. B. peripheres Blut, Milz, Knochenmark, Thymus etc., gesammelt. Die Oberflächenantigene dieser Zellen werden unter Verwendung von z. B. Durchflusszytometrie (FACS) untersucht; und dadurch wird die Differenzierung der transplantierten Zellen untersucht. In diesem Fall umfassen Beispiele für Zelloberflächen-Antigenmarker, die als Kennzeichen zu verwenden sind: CD34, das Stammzellen betrifft; CD3, CD4, CD8 etc., die T-Zellen betreffen; CD10, CD19, CD20 etc., die B-Zellen betreffen; CD5 etc. die Bla-Zellen betreffen; CD33 etc., die Myeloidzellen betreffen; CD11c etc., die dendritische Zellen betreffen; CD45 etc., welche die gesamten Leukozyten betreffen; CD11a, CD11b etc., die Makrophagen betreffen; CD56 etc., die NK-Zellen betreffen; CD38 etc., die Plasmazellen betreffen; CD41 etc., die Blutplättchen betreffen; und Glycophorin A etc., die Erythrozyten betreffen. Je nach Bedarf können verschiedene verwandte Marker selektiert werden.
  • Die Produktion von Zytokinen, wie Interferon, Interleukin, TNF-α etc., in den gesammelten Zellen wird durch ELISA etc. gemessen; und dadurch wird die Differenzierung der Stammzellen untersucht.
  • Es ist weiterhin möglich, aufeinander folgende Transplantationen von humanen Stammzellen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Maus durchzuführen. Das heißt, es können echte, selbstreplizierende humane Stammzellen erhalten werden. Speziell werden humane Stammzellen in die erfindungsgemäße Maus transplantiert, nach mehreren Wochen werden undifferenzierte humane Stammzellen aus dem Knochenmark der Maus gesammelt, und weiterhin werden die gesammelten Stammzellen in die erfindungsgemäße Maus transplantiert. Durch Wiederholung von Transplantation und Sammlung können humane Stammzellen, die frei von anderen Zellen sind und hohe Reinheit aufweisen, in großen Mengen erhalten werden. Durch aufeinander folgende Transplantationen können humane Stammzellen mit einer Reinheit von mindestens 99% oder mehr, vorzugsweise einer Reinheit von 99,7% oder mehr erhalten werden. Herkömmliche Mäuse lassen eine zweite Transplantation zu; die erfindungsgemäße Maus ermöglicht jedoch mehr als zwei aufeinander folgende Transplantationen.
  • Zur Behandlung von Leukämie oder dergleichen können menschliche Stammzellen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Maus erhalten werden, in Menschen transplantiert werden. Auch ist die Maus zur Gentherapie geeignet, die auf humane Stammzellen abzielt, durch Einbringen eines Fremdgens in humane Stammzellen und ihr Transplantieren in die erfindungsgemäße Maus zur Proliferation. Mit Hilfe von Virus-Vektoren, wie Lentivirus-Vektoren, Retrovirus-Vektoren, Adenovirus-Vektor und Adeno-assoziierter Virus-Vektor kann ein Gen in Stammzellen eingebracht werden. Beispiele für das hier zu verwendende Gen umfassen das ADA-Gen für Adenosindeaminase-Defizienz(ADA)-Patienten. Nach Einbringen dieser Gene in humane Stammzellen werden die Zellen in die erfindungsgemäße Maus zur Proliferation und Reinigung transplantiert und anschließend Patienten verabreicht, wodurch die Gentherapie ermöglicht wird.
  • 3. Herstellung von humanen Antikörpern unter Verwendung der erfindungsgemäßen Maus
  • Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Maus können etablierte humane Zelllinien, die humane Antikörper produzieren, und humane Antikörper erhalten werden. Die oben beschriebenen humanen Stammzellen werden in die erfindungsgemäße Maus transplantiert, und die für die Immunität verantwortlichen Zellen, wie T-Zellen oder B-Zellen, werden differenziert und vermehrt. Alternativ werden die für die Immunität verantwortlichen Zellen, wie humane T-Zellen oder B-Zellen, in die Maus transplantiert und in den Mauskörper implantiert, wodurch eine Maus mit den Zellen erhalten wird, die für die humane Immunität verantwortlich sind und zur Produktion von humanen Antikörpern in der Lage sind. Wenn humane Stammzellen transplantiert werden, werden Differenzierung und Vermehrung von T-Zellen und B-Zellen in 6 bis 8 Wochen realisiert, was die Produktion von humanen Antikörpern ermöglicht.
  • Durch Verabreichen von Antigenen an die Maus mit implantierten und erhaltenen humanen T-Zellen und B-Zellen, ist es möglich, humane Antikörper gegen die Antigene und Zellen zu erhalten, die zur Produktion der Antikörper in der Lage sind. Die Verabreichung der Antigene an die erfindungsgemäße Maus kann durch das gleiche Verfahren, wie es üblicherweise zur Immunisierung einer Maus verwendet wird, durchgeführt werden.
  • Humanantikörper produzierende Zellen können aus jedem Organ der Maus gesammelt werden, insbesondere aus der Milz, den Lymphknoten etc. Wenn der Anteil der Antikörper produzierenden Zellen hoch ist, können die gesammelten Zellen direkt zur Entwicklung einer Zelllinie verwendet werden. Wenn allerdings der Anteil niedrig ist, kann, sofern notwendig, die Reinigung beispielsweise durch das Affinitätssäulen-Verfahren unter Verwendung von anti-humanen B-Zell-Antikörpern durchgeführt werden. Es ist weiterhin wünschenswert, eingeschleppte Mauszellen, beispielsweise durch Zytolyse-Verfahren unter Verwendung von Anti-Maus-Antikörpern und Komplementsystem, zu beseitigen.
  • Aus den so erhaltenen, humane Antikörper produzierenden Zellen wird durch ein Transformationsverfahren unter Verwendung des Epstein-Barr-Virus (EBV), ein Zellfusionsverfahren, bei dem die Zellen mit geeigneten proliferierenden, lebensfähigen Zellen fusioniert werden, oder dergleichen, eine etablierte Zelllinie entwickelt. Anschließend ist eine humane Antikörper produzierende etablierte Zelllinie erhältlich, die während der Produktion von Antikörpern zu mehreren Passagen in der Lage ist.
  • 4. Herstellung einer Maus mit Tumor als pathologisches Modell
  • In die erfindungsgemäße Maus können humane Tumore implantiert und vermehrt werden, und ein tierisches Modell eines humanen Tumors kann durch Transplantieren von Tumorzellen in die erfindungsgemäße Maus erhalten werden. Beispielsweise verursacht die Verabreichung der humanen Tumorzellen deren Proliferation innerhalb des Körpers der Maus und somit kann eine Maus mit einem humanen Tumor erhalten werden. Beispiele für die in diesem Fall zu verwendenden Zellen umfassen subkultivierte Linien humaner Tumore in einer herkömmlichen Nacktmaus und Zelllinien, die sich von HTLV-1-Leukämie ableiten, wie ED-40515(–), MT-1 und TL-OmI. Zusätzlich werden humane Tumorgewebe zu Stücken mit einer Größe von mehreren mm zerhackt, und diese Krebsgewebestücke können direkt in die erfindungsgemäße Maus transplantiert und implantiert werden. In diesem Fall ist die Stelle der Maus, an der Tumorzellen oder Tumorgewebe transplantiert werden, nicht eingeschränkt, jedoch können sie im Fall von Zellen intraperitoneal, intravenös oder subkutan in die Maus transplantiert werden, und im Fall der Gewebe können sie subkutan in die Maus transplantiert werden. Jede subkutane Stelle der Maus kann akzeptabel sein, wie z. B. die subkutane gluteale Region, allerdings ist es wünschenswert, sie subkutan an einer Auricula oder einer dorsalen Region zu transplantieren, da der Tumor dort ohne Einschnitt untersucht werden kann. Um Ergebnisse zu erhalten, die klinische Wirkungen eines Antikrebsmittels widerspiegeln, ist es außerdem wünschenswert, sie an derselben Stelle zu transplantieren wie für den klinischen Test (im Fall von Dickdarmkrebszellen sollen die Zellen in den Dickdarm transplantiert werden). Wenn die Zellen transplantiert werden, wird innerhalb von mehreren Wochen bis Monaten ein Tumor gebildet. Insbesondere, wenn HTLV-1-Zellen subkutan in eine posteriore Auricula transplantiert werden, wird ein Tumor in 2 Wochen gebildet, wodurch die reichliche Produktion einer praktikablen Tumor-Modellmaus ermöglicht wird.
  • Zudem werden, wenn ein Tumor in die erfindungsgemäße Maus transplantiert wird, Metastasen von Tumorzellen, wie z. B. leukämische Veränderungen, beobachtet, und die Maus ist als ein Modelltier für die Tumormetastase geeignet.
  • Unter Verwendung der so erhaltenen menschlichen Tumor-Modellmaus kann ein Screening eines Antikrebsmittels, eines antimetastatischen Arzneimittels etc. durchgeführt werden. Als ein Verfahren dafür wird ein Kandidatenmittel einer Maus mit einem gebildeten Tumor durch ein geeignetes Verfahren, z. B. orale, transdermale Verabreichung oder dergleichen, verabreicht. Anschließend lässt sich durch Beobachtung der Größe des Tumors, der Größe und Anzahl von metastatischen Foci, der Überlebensfähigkeit der Maus etc. die Wirkung des Arzneimittels beurteilen.
  • 5. Herstellung einer Modellmaus für Virusinfektionskrankheiten
  • Die Verwendung der erfindungsgemäßen Maus ermöglicht den Erhalt einer Modellmaus für Virusinfektionskrankheiten. Es ist nämlich durch Transplantieren von Zellen in die erfindungsgemäße Maus, die mit einem humanen Virus infiziert sein können, und Infizieren der Zellen mit dem Virus oder Transplantieren von mit einem Virus infizierten Zellen der Erhalt eines Modelltieres für Virusinfektionskrankheiten möglich, welches implantierte und erhaltene virusinfizierte Zellen aufweist.
  • In einer herkömmlichen Maus kann nur ein M-tropes Virus, das Makrophagen infiziert, proliferieren; unter Verwendung der erfindungsgemäßen Maus wird jedoch die Proliferation von T-trogen Viren, wie HIV, HTLV-1, die T-Zellen infizieren, möglich.
  • Beispielsweise werden der erfindungsgemäßen Maus 1 × 107 bis 1 × 108 humane periphere mononukleare Blutleukozyten intraperitoneal verabreicht, und nach mehreren Tagen wurden einige hundert bis tausend TCID50 von HIV eingeimpft, wodurch eine HIV-infizierte Modellmaus mit humanen Zellen, die mit HIV infiziert waren, erhalten wurde. Die HIV-Infektion kann durch die Expression von HIV-Antigenen, wie z. B. p24-positiven Zellen, als Kennzeichen nachgewiesen werden.
  • Anstelle von HIV erlaubt die Impfung mit HTLV-1 den Erhalt einer HTLV-1-infzierten Modellmaus.
  • Die Verwendung des tierischen Krankheitsmodells, das erfindungsgemäß erhalten wurde, gestattet die In-vivo-Erforschung der Proliferationsmechanismen von HIV, HTLV-1 etc., weiterhin die Entwicklung von Therapien für Virusinfektionen, das Screening von therapeutischen Produkten für Virusinfektionen oder dergleichen.
  • 6. Herstellung einer Maus mit erhöhtem Implantationsvermögen für heterologe Zellen unter Verwendung einer NOG-Maus
  • Die Verwendung der erfindungsgemäßen NOG-Maus ermöglicht die Herstellung einer Maus mit einer verbesserten heterologen Zellimplantation. Beispielsweise kann eine solche Maus durch Rückkreuzung einer Maus, in der ein Gen, welches das Maus-Immunsystem betrifft, ausgeschaltet ist, mit der erfindungsgemäßen NOG-Maus erhalten werden. Beispiele für die Gene, die das Immunsystem betreffen, umfassen Zytokin-Rezeptor-Gene, Zytokin-Gene etc.
  • Weiterhin ist es durch Einbringen eines humanen Zytokin-Gens, welches die Differenzierung und Proliferation von humanen Zellen betrifft, oder dergleichen (z. B. hGM-CSF oder hSCF etc.) möglich, eine Maus mit verbesserter heterologer Zellimplantation herzustellen. Beispielsweise wird nach einem Verfahren von Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380–7384, 1980, oder dergleichen das obige Gen in eine befruchtetes Pronukleus-Eizelle der Maus inseriert, und ein Individuum, bei dem dieses eingeführte Gen darin inkorporiert ist, wird selektiert, wodurch eine Maus hergestellt wird, die ein humanes Zytokin-Gen etc. exprimiert. Anschließend werden diese Maus und die erfindungsgemäße NOG-Maus miteinander gekreuzt, wodurch eine Maus mit erhöhter heterologer Zellimplantation hergestellt wird.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt das Schema der Rückkreuzung zur Herstellung einer NOG-Maus.
  • 2 zeigt den zeitlichen Verlauf der Änderungen von humanen CD45-positiven Zellen und humanen CD41-positiven Zellen nach deren Einbringen in peripheres Blut der NOG-Maus, der CD34-positive Zellen transplantiert wurden.
  • 3 zeigt den Anteil von CD45-positiven Zellen im Knochenmark und in der Milz der NOG-Maus, der CD34-positive Zellen transplantiert wurden.
  • 4 zeigt den jeweiligen Anteil von CD45-positiven Zellen in peripherem Blut von Mäusen in einem Vergleichstest zwischen der NOG-Maus und einer β2-Microglobulin-defizienten NOD-SCID-Maus (NOD/LtSz-scid, β2m null-Maus).
  • 5 zeigt FACS-Profile von NK-Zellen und dendritischen Zellen in Milzzellen, die aus jedem Mausstamm erhalten wurden.
  • 6 zeigt die Ergebnisse von ELISA zum Nachweis der Produktionsmenge an Zytokin unter der Stimulation von Listeria monocytogenes-Antigenen in Milzzellen, die aus jedem Mausstamm erhalten wurden.
  • 7 zeigt die Entfernung der NK-Zell-Aktivität in der NOG-Maus und der NOD/LtSz-scid, β2m null-Maus.
  • 8 zeigt die Ergebnisse von FACS, wobei Knochenmarkszellen aus primären, sekundären und tertiären Mäusen, in die humane CD34-positive Zellen transplantiert wurden, mittels humanem CD45 gefärbt wurden.
  • 9 zeigt die Implantation und Differenzierung von humanen Zellen im Thymus der NOG-Maus, in die CD34-positive Zellen eingebracht wurden.
  • 10 zeigt die Implantation und Differenzierung von humanen Zellen im Thymus der NOG-Maus, in die humane CD34-positive Zellen eingebracht wurden.
  • 11 zeigt die Implantation und Differenzierung von humanen Zellen in der Milz der NOG-Maus, in die humane CD34-positive Zellen eingebracht wurden.
  • 12 zeigt die Implantation und Differenzierung von humanen Zellen in der Milz der NOG-Maus, in die humane CD34-positive Zellen eingebracht wurden.
  • 13 zeigt die Implantation und Differenzierung von humanen Zellen in peripherem Blut der NOG-Maus, in die humane CD34-positive Zellen eingebracht wurden.
  • 14 zeigt die Implantation und Differenzierung von humanen Zellen im Knochenmark der NOG-Maus, in die humane CD34-positive Zellen eingebracht wurden.
  • 15 zeigt die Fähigkeit zur Produktion von menschlichen Antikörpern in der NOG-Maus.
  • 16 zeigt die Tumorbildungen nach Transplantation von LM-2-JCK in jeden Mausstamm.
  • BESTE AUSFÜHRUNGSWEISE FÜR DIE ERFINDUNG
  • Als Nächstes wird die Erfindung im Einzelnen unter Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben.
  • Beispiel 1
  • Herstellung einer immundefizienten Maus (NOG-Maus) mit Deletion der NK-Zell-Aktivität und herabgesetzter dendritischer Zellfunktion, Untersuchung der heterologen Zellimplantation in der Maus und Entwicklung eines Assay-Systems für humane Stammzellen unter Verwendung der Maus.
  • (1) Produktion einer immundefizienten Maus (NOG-Maus) mit Elimination der NK-(Zell)-Aktivität und reduzierter dendritischer Zellfunktion
  • Um multifunktionelle immundefiziente Mäuse mit verminderter NK-Zell-Aktivität zu erhalten, wurden Interleukin-2-Rezeptor-γ-Ketten-Knockout-Mäuse(IL-2RγKO-Mäuse) (8 Wochen alt), die von Prof. Kazuo Sugamura (Department of Microbiology and Immunology, Tohoku University, School of Medicine) übernommen wurden, mit NOD-Shi-scid-Mäusen (8 Wochen alt) rückgekreuzt, die im Central Institute for Experimental Animals gehalten wurden (auch von CLEA JAPAN, INC. erhältlich), und dadurch wurden F1-Mäuse mit einem darin eingebauten IL-2Rγ-mutanten Gen hergestellt. Das Einbringen des mutanten IL-2Rγ-Ketten-Gens in die F1-Mäuse wurde durch PCR-Amplifikation und -Nachweis des Gens bestätigt. Insbesondere wurden zunächst die DNAs durch einen automatischen DNA-Extraktor (MagExtractor hergestellt von TOYOBO) aus 100 μl Blut extrahiert, das aus dem Augenhintergrund der F1-Mäuse entnommen wurde. PCR-Pufferlösung, die 23,5 μl 1,5 mM MgCl2, 0,4 mM dNTP und zwei Primer-Paare zu je 25 pmol (die folgenden Primer PI and PIII wurden zur Bestimmung des Wildtyps verwendet und ein Paar der folgenden Primer PI und PII wurde zur Bestimmung des Mutantentyps verwendet) wurde zu 1,5 μl dieser DNA zugesetzt, und die PCR wurde unter den folgenden Amplifikationsbedingungen zur Bestimmung durchgeführt, ob IL-2Rγ-Ketten-Gene vom Wildtyp oder vom Mutantentyp waren. (Primer)
    Figure 00130001
  • (PCR-Amplifikationsbedingungen)
  • Die Bedingungen waren: 5 Minuten erhitzen bei 94°C; 30 bis 35 Zyklen von einer Minute bei 94°C, 1 Minute bei 55°C, und 1 Minute bei 72°C; und anschließend 10 Minuten erhitzen bei 72°C.
  • Die durch die obige PCR erhaltenen PCR-Produkte wurden der Elektrophorese in 2-%igem Agarosegel unterzogen und nach der Größe der Färbungsbande, die nach Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen wurde, gemessen. Die Größen der Banden, etwa 660 bp für den Wildtyp und etwa 350 bp für den Mutantentyp, wurden festgestellt.
  • (Rückkreuzung)
  • Als Nächstes wurden die F1-Mäuse, in die das mutante IL-2Rγ-Gen eingebaut worden war, mit NOD/Shi-scid-Mäusen gekreuzt, wodurch F2-Mäuse erhalten wurden. Außerdem wurde durch den Nachweis des Einbaus des mutanten IL-2Rγ-Ketten-Gens in die F2-Mäuse auf dieselbe Weise wie oben und Nachweis von Immunglobulinen in Serum durch ein Immundiffusionsverfahren Mausindividuen, die das mutante IL-2Rγ-Ketten-Gen aufweisen und ein homozygotes scid-Gen besitzen, selektiert. Danach wurden die Mausindividuen mit NOD/Shi-scid-Mäusen gekreuzt, und unter den geborenen Mäusen wurden Mäuse mit dem mutanten IL-2Rγ-Ketten-Gen weiterhin mit NOD/Shi-scid-Mäusen gekreuzt.
  • Das obige Rückkreuzen wurde mindestens 9 Mal wiederholt, wodurch NOG(NOG)-Mäuse hergestellt wurden (1 zeigt das Schema). Hier ist es wirksam, da das IL-2Rγ-Ketten-Gen auf dem X-Chromosom vorliegt, männliche IL-2RγKO-Mäuse zu verwenden.
  • (2) Untersuchung über das Implantationsvermögen von heterologen Zellen in NOG-Mäusen
  • Als Nächstes wurden unter Verwendung der durch das obige Kreuzen erhaltenen NOG-Mäuse und herkömmlicher immundefizienter Mäuse, NOD/Shi-scid-Mäuse, Untersuchungen hinsichtlich der Stärke des Einflusses, den die Anti-NK-Antikörperbehandlung auf die Implantation von heterologen Zellen in diesen Mäusen besitzt, durchgeführt.
  • ➀ (Monoklonale Anti-IL-2-Rezeptor-β-Ketten-Antikörper)
  • Monoklonale Anti-IL-2-Rezeptor-β-Ketten-Antikörper (Klon TMβ1) wurden aus Hybridomen produziert, die von Prof. Masayuki Miyasaka, School of Medicine, Osaka University (Tanaka T, Tsudo M, Karasuyama H et al., A novel monoclonal antibody against murine IL-2Receptor beta-chain. Characterization an of receptor expression in normal lymphoid cells and EL-4 cells. J Immunol 1991; 147(7): 2222–8) produziert und bereitgestellt wurden. Insbesondere wurden die Hybridome BALG/cA-nu-Mäusen intraperitoneal verabreicht und nach mehreren Wochen aus Ascites gesammelt.
  • Fünf NOD/Shi-scid-Mäusen (8 bis 12 Wochen alt) und drei NOG-Mäusen (8 bis 12 Wochen alt) wurde 1 mg der Antikörper pro Maus intraperitoneal verabreicht. Weiterhin wurde als Kontrolle ohne Verabreichung der Antikörper vier NOG-Mäusen (8 bis 12 Wochen alt) physiologische Kochsalzlösung verabreicht.
  • Ferner wurden durch die Verwendung von Dichtegradienten-Zentrifugation unter Verwendung von Lymphoprep humane periphere Blutlymphozyten aus Blut gesammelt, das Freiwilligen entnommen wurde.
  • 1 × 107 der erhaltenen humanen peripheren mononuklearen Blutleukozyten wurden den obigen Mäusen am zweiten Tag nach der Verabreichung von TMβ1 intraperitoneal verabreicht.
  • Zwei Wochen nach der Verabreichung der humanen peripheren Blutlymphozyten wurden die Mäuse getötet, und die Ascites, welche die gesamten peritonealen Exsudatzellen enthielten, wurden vollständig mit RPMI-1640-Kulturmedium gewaschen und dadurch gesammelt. Von allen peritonealen Zellen wurden alle peritonealen Exsudatzellen durch Durchflusszytometrie gezählt, und in Abhängigkeit von ihrer Menge wurde die Implantation und Proliferation von menschlichen Zellen in den Mäusen bestimmt. Die gleichen Vorgänge wurden für Kontrollmäuse ohne Verabreichung der Antikörper durchgeführt. Ihre Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Auswirkung von Anti-NK-Zell-Antikörpern (TMβ1) auf die Implantation und Proliferation von humanen mononuklearen peripheren Blutleukozyten in NOD/Shi-scid-Mäusen und NOG-Mäusen
    Mausstamm TMβ1-Behandlung Anzahl der Mäuse Anzahl der gesammelten Zellen (× 106, Verteilung) humane Zellen %
    HLA+ (Verteilung) hCD4+ hCD8+
    NOD/Shi-scid + 5 4.8 (2.77–6.8) 41.1 (4.2–65) ND ND
    NOG + 3 11.1 (8.3–15.0) 61.9 (47.4–74.6) 19.8 28.2
    – 4 11.2 (7.9–20) 63.3 (51.4–69.7) 34.3 25.9
  • Aus den in Tabelle 1 gezeigten Ergebnissen ist ersichtlich, dass in NOG-Mäusen, in die humane mononukleare periphere Blutleukozyten eingeführt wurden, im Vergleich mit herkömmlichen TMβ1-behandelten Mäusen, extrem hohe Anteile von humanen Zellen differenziert, implantiert und vermehrt wurden, auch ohne die Behandlung mit Antikörpern.
  • ➁ (Anti-Asialo-GM1-Antikörper)
  • Als Nächstes wurden unter Verwendung von NOG-Mäusen und NOD/Shi-scid-Mäusen Untersuchungen zur Stärke des Einflusses auf das Implantationsvermögen von Zellen, die aus humanem Nabelschnurblut stammten, der durch Anti-Asialo-GM1-Antikörper (AGM1) (Kaninchen) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 014-09801) erreicht werden würde, in diesen Mäusen vorgenommen.
  • Als Erstes wurden NOG-Mäuse (8 bis 12 Wochen alt) und NOD/Shi-scid-Mäuse (8 bis 12 Wochen alt), die wie in Tabelle 2 angegeben nummeriert waren, mit 2,4 Gy Röntgenstrahlung bestrahlt. Anschließend wurden diesen Mäusen pro Maus 20 μl Anti-Asialo-GM1-Antikörper, verdünnt mit 400 μl PBS, unmittelbar vor der Verabreichung der aus menschlichem Nabelschnurblut stammenden Zellen verabreicht. Auch wurde Kontrollmäusen (Mäuse Nr. 5, 6, 10, 11, 15, 16 in Tabelle 2) physiologische Kochsalzlösung ohne Verabreichung der Antikörper intraperitoneal verabreicht.
  • Im Fall der CD34-positiven Zellen aus menschlichem Nabelschnurblut wurden mononukleare Leukozyten durch Ficoll-Hypaque-Gradienten-Zentrifugation aus Nabelschnurblut gesammelt, das Freiwilligen entnommen wurde, deren Zustimmung zuvor erhalten wurde. Weiterhin wurden CD34-positive Zellen durch Dynabeads M-450 CD34 und DETACHaBEAD CD34 (Dynal As, Oslo, Norwegen). (Ueda T, Tsuji K, Yoshino H et al., Expansion of human NOD/SCID-repopulating cells by stem cell factor, Flk2/Flt3 ligand, thrombopoietin, IL-6, and soluble IL-6 receptor. J Clin Invest 2000; 105(7): 1013–21) isoliert.
  • 1 × 105 der erhaltenen CD34-positiven Zellen, die aus humanem Nabelschnurblut stammten, wurden über die Schwanzvene der Mäuse unmittelbar nach der Verabreichung von Anti-Asialo-GM1-Antikörpern verabreicht.
  • Die Mäuse wurden 4 Wochen nach der Verabreichung von CD34-positiven Zellen, die aus humanem Nabelschnurblut stammten, getötet, ihr peripheres Blut wurde gesammelt, und humane Zellen (CD45+) in mononukleären Leukozyten und humane Blutplättchen (CD41+) im Vollblut wurden durch Durchflusszytometrie gezählt. In Abhängigkeit von ihrer Menge wurden das Implantationsvermögen und die Proliferation von humanen Zellen in Mäusen bestimmt. Die gleichen Vorgänge wurden für Kontrollmäuse ohne Verabreichung der Antikörper durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Figure 00170001
  • Figure 00180001
  • Aus den in Tabelle 2 gezeigten Ergebnissen ist klar ersichtlich, dass in NOG-Mäusen, in die CD34-positive Zellen, die humanem Nabelschnurblut entstammten, eingebracht wurden, im Vergleich mit herkömmlichen Mäusen, die mit Anti-Asialo-GM1-Antikörpern behandelt wurden, extrem hohe Anteile von humanen Zellen differenziert, implantiert und vermehrt wurden, auch ohne die Behandlung mit Antikörpern.
  • (3) Entwicklung eines Assay-Systems für humane Stammzellen unter Verwendung von NOG-Mäusen
  • Hier zu verwendende Mäuse waren NOD/Shi-scid-Mäuse und NOG-Mäuse der vorliegenden Erfindung. 1 × 105 CD34-positive Zellen, die aus humanem Nabelschnurblut (CB) entnommen wurden, wurden in die obigen Mäusen transplantiert, die 2,4 Gy Bestrahlung erhalten hatten.
  • Humane Zellen in peripherem Blut, Knochenmark, Milz und Thymusdrüsen wurden durch FACS analysiert. Die Anteile von CD45-positiven Zellen in peripherem Blut betrugen 8 Wochen nach der Transplantation 37% für NOG-Mäuse und 7% für NOD/Shi-scid-Mäuse. Im Knochenmark betrugen die Anteile 65% bzw. 20%. Zusätzlich zu einer hohen Chimärismus-Rate wurde festgestellt, dass in peripherem Blut, Knochenmark, Milz und Thymusdrüsen der NOG-Mäuse 3 Monate nach der Transplantation Differenzierung in verschiedene Zelllinien, einschließlich B- und T-Lymphozyten auftrat. Es wurde festgestellt, dass humane CD33+-Knochenmarkzellen, CD19+-B-Zellen, CD3+-T-Zellen, CD56+-NK-Zellen, CD41a+-Riesennukleoplasmazellen und Glycophorin A+-Erythrozyten im Knochenmark vorhanden waren. Außerdem ist es interessant festzustellen, dass obwohl eine kleine Anzahl an humanen T-Zellen in den Thymusdrüsen nachgewiesen wurde, CD4+/CD8–-T-Zellen, CD4-/CD8+-T-Zellen und CD4+/CD8+-T-Zellen in der Milz nachgewiesen wurden. Dies zeigt an, dass humane hämatopoetische Stammzellen an Stellen außerhalb des Thymus in reife Stammzellen differenzieren und proliferieren.
  • Nabelschnurblut wurde bei der Geburt eines gesunden Neugeborenen von einer normalen schwangeren Mutter erhalten, deren Zustimmung zuvor erhalten wurde. Das Nabelschnurblut wurde heparinisiert und aufbewahrt und durch den nachstehend beschriebenen Vorgang innerhalb von 24 Stunden nach dem Sammeln behandelt. Anschließend wurde es für einen Transplantattest verwendet.
  • Die Reinigung von CD34-positiven Zellen wurde wie folgt durchgeführt. Das heparinisierte Nabelschnurblut wurde mit einer Pufferlösung, hergestellt durch Vermischen von phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 5% fetalem Rinderserum, verdünnt und anschließend wurden mononukleare Leukozyten unter Verwendung von Ficoll isoliert. Aus den mononuklearen Leukozyten wurden CD34-positive Zellen durch die Verwendung von DynabeadsTM M-450 CD34, erhältlich von Dynal Biotech, Ltd., gereinigt. Obwohl das Verfahren dafür den Angaben von Dynal Biotech, Ltd. entspricht, wird es wie folgt zusammengefasst. Unter Verwendung von phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung, die 2% Rinderserumalbumin und Natriumcitrat enthielt, wurde die Konzentration der mononuklearen Leukozyten so eingestellt, dass sie 4 × 107/ml betrug. 100 μl gut suspendierter Dynabeads CD34 wurden pro 1 ml der mononuklearen Leukozytensuspension zugesetzt, sie (die Suspensionen) wurden gemischt und man ließ sie auf Eis 30 Minuten miteinander reagieren. Die Beads, die mit den Zellen Rosetten bildeten, wurden unter Verwendung eines Magneten gesammelt. Anschließend setzte man den mit den Zellen Rosetten bildenden Beads eine erforderliche Menge an DetachabeadTM CD34 zu und ließ sie damit reagieren, wobei 15 Minuten lang bei 37°C gemischt wurde. Als CD34-positive Zellen aus den Beads freigesetzt worden waren, wurde ein Magnet verwendet, um nur die Beads zu entfernen, wodurch CD34-positive Zellen erhalten wurden.
  • Zum Transplantieren wurden 8 bis 12 Wochen alte NOD/Shi-scid-Mäuse, NOG-Mäuse und NOD/LtSz-scid, β2m null-Mäuse, alle in einer SPF (spezifischen pathogenfreien) Umgebung verwendet. Diese Mäuse wurden in der Tierversuchsanlage der Kyoto University, School of Medicine, unter den Auflagen der Anlage aufgezogen.
  • In einem Vergleichstest für die vorhergehenden beiden Typen von Mäusen wurden die Mäuse zweimal mit 1,2 Gy Gammastrahlung (Gamma Cell 137Cs) bestrahlt, und pro Maus wurden 100 000 CD34-positive Zellen durch die Schwanzvene transplantiert. Für die NOD/Shi-scid-Mäuse wurden 200 μg Anti-Asialo-GM1-Antikörper (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) unmittelbar vor der Transplantation und nach der Transplantation alle 11 Tage intraperitoneal verabreicht.
  • In einem Vergleichstest zwischen NOG-Mäusen und NOD/LtSz-scid, β2m null-Mäusen wurden die Mäuse zweimal mit 1,2 Gy Gammastrahlung auf die gleiche Weise wie vorstehend bestrahlt, und anschließend wurden 40 000 oder 10 000 CD34-positive Zellen durch die Schwanzvene transplantiert.
  • Nach der Transplantation wurden dem Trinkwasser der Mäuse 732 mg/l Neomycinsulfat zum Schutz gegen Infektionen zugesetzt
  • Die Mäuse wurden zu den angegebenen Zeitpunkten mit Äther anästhesiert, und anschließend wurde peripheres Blut aus dem Venengeflecht der Orbita zur Messung des definitiven Anteils der menschlichen Hämozyten unter Verwendung von Durchflusszytometrie gesammelt. Obwohl die Durchflusszytometrie nach einem weit verbreiteten allgemeinen Verfahren durchgeführt wurde, ist sie nachstehend wie folgt zusammengefasst. Das gesammelte Blut wurde sofort gut mit EDTA-2Na vermischt und bei Raumtemperatur bis zur Analyse stehen gelassen. Man setzte eine optimale Menge an Antikörper zu und ließ mit 50 bis 100 μl des Vollbluts bei 4°C 30 Minuten reagieren.
  • Anschließend wurden Hämolyse und Immobilisierung unter Verwendung von FACS-Lösung (Becton Dickinson und Co.) durchgeführt, und der Anteil wurde unter Verwendung von FACS Calibur (Becton Dickinson and Co.) gemessen. Im Fall von Knochenmark und Milz wurden die Mäuse durch zervikale Dislokation getötet und Femora und Milz wurden herausgenommen. Anschließend wurden Knochenmark- und Milzzellen jeweils in Kulturlösung, die 5% fetales Rinderserum enthielt, freigesetzt und anschließend wurden sie als Zellsuspensionen auf die gleiche Weise wie peripheres Blut behandelt und mittels Durchflusszytometrie ausgewertet.
  • Zur Analyse zu verwendende Antikörper waren FITC-konjugierte Antihuman-CD45-Antikörper, PE-konjugierte Antihuman-CD10-Antikörper, PE-konjugierte Antihuman-CD33-Antikörper, PE-konjugierte Antihuman-CD3-Antikörper, PE-konjugierte Antihuman-CD34-Antikörper, PE-konjugierte Antihuman-CD41-Antikörper (Beckton, Dickinson and Co.), PC5-konjugierte Antihuman-CD38-Antikörper, PC5-konjugierte Antihuman-CD56-Antikörper, PC5-konjugierte Antihuman-CD19-Antikörper (Immunotech), APC-konjugierte Anti-Maus-CD45-Antikörper, und FITC-konjugierte Anti-Maus-CD41-Antikörper (BD Pharmingen).
  • Im Fall humaner CD45-positiver Zellen und humaner CD41-positiver Zellen in peripherem Mäuseblut wurden Änderungen in den Anteilen (%) und in den absoluten Anzahlen (/μl) alle 4 Wochen bis zur 12. Woche untersucht (2A und 2B). Wie in den 2A und 2B gezeigt, wurden bei NOG-Mäusen signifikant hohe Anteile und absolute Anzahlen festgestellt. Die Mäuse wurden ab 12 Wochen nach der Transplantation getötet, und als das Verhältnis von humanen CD45-positiven Zellen in Knochenmark und in der Milz auf die gleiche Weise wie vorstehend untersucht wurde, wiesen die NOG-Mäuse sehr hohe positive Anteile auf (3).
  • In dem Vergleichstest zwischen NOG-Mäusen und NOD/LtSz-scid, β2m null-Mäusen wurden die definitiven Anteile von humanen CD45-positiven Zellen in peripherem Mäuseblut untersucht (4). Wie in 4 gezeigt, wiesen die NOG-Mäuse einen höheren definitiven Anteil humaner Zellen auf und zeigten ein besseres Implantationsvermögen humaner Zellen als NOD/LtSz-scid, β2m null-Mäuse.
  • Beispiel 2
  • Untersuchungen zur funktionellen Inkompetenz dendritischer Zellen von NOG-Mäusen bezüglich NK-Zell-Aktivität und Zytokinproduktion.
  • Drei weibliche NOG-Mäuse (10 bis 12 Wochen alt) der vorliegenden Erfindung, vier weibliche und vier männliche NOD/Shi-scid-Mäuse (10 bis 12 Wochen alt), erhalten durch Rückkreuzung von C.B-17-scid-Mäusen mit NOD/Shi-Mäusen, und zwei weibliche und zwei männliche NOD/LtSz-scid,β2m null-Mäuse (10 bis 12 Wochen alt) (auch als nullβ2m(null)NOD/LtSz-SCID, β2m-Microglobulin-defiziente NOD/SCID-Mäuse bezeichnet; hergestellt von Dr. Shultz, L. D. et al. von The Jackson Laborstory (Kollet O, Peled A, Byk T et al., beta2 microglobulin-deficient (βß2m(null))NOD/SHI-SCID mice are excellent recipients for studying human stem cell function. Blond 2000; 95(10): 3102–5) wurden für die folgenden Untersuchungen verwendet.
  • Nach der Behandlung der NOD/Shi-scid-Mäuse mit Anti-Asialo-GM1-Antikbrpern (αAGM), wurden Milzzellen gesammelt. Die erhaltenen Zellen wurden in zwei Gruppen eingeteilt, und CD11c-Antigen-positive Zellen (als dendritische Zellen betrachtet) wurden aus einer von beiden unter Verwendung eines magnetischen Zellsortierers (MACS) entfernt. Gleichermaßen wurden Milzzellen aus nicht behandelten NOD/LtSz-scid, β2m null-Mäusen und NOG-Mäusen gesammelt. Eine kleine Menge dieser Zellen wurde aus jeder dieser Mäuse entnommen und der FACS-Analyse bereitgestellt. Weiterhin wurden diese vier Arten von Zellen in die drei folgenden Gruppen eingeteilt: Gruppe I: NOG-Mäuse (3 Mäuse); Gruppe II: nicht αAGM-behandelte NOD/Shi-scid-Mäuse (2 männlich), αAGM-behandelte NOD/Shi-scid-Mäuse (3 Mäuse), und NOD/Shi-scid-Mäuse (3 Mäuse), die mit αAGM behandelt wurden und aus denen weiterhin CD11c entfernt war; und Gruppe III: NOD/LtSz-scid, β2m null-Mäuse (4 Mäuse). Sie (die Zellsuspensionen) wurden so eingestellt, dass sie eine Zellkonzentration von 1 × 107/ml in RPMI-1640 aufwiesen, und jeweils 100 μl von jeder (Suspension) wurde in eine Vertiefung gegeben, durch eine gleichwertige Menge von Listeria monocytogenes(LM)-Antigenen stimuliert und kultiviert (wobei eine dreifache Ausführung verwendet wurde). Da LM(-Lösung) 1011 Einheiten/ml aufweist, wurde sie vor Gebrauch mit RPMI-1640 auf 2 × 107 Einheiten/ml verdünnt. In diesem Fall wurden Proben ohne LM-Zugabe als Kontrolle verwendet. Nach 24 Stunden wurden die Überstände gesammelt, und die Mengen von Zytokinen, wie z. B. IFN-γ, wurden durch ELISA bestimmt.
  • Unterklassen (insbesondere CD11c, CD11b) in Milzzellen wurden durch FACS analysiert.
  • FITC-markiertes CD3 und Biotin-markiertes Pan-NK(DX5) wurden als T-Zellmarker bzw. NK-Zellmarker verwendet. FITC-markiertes Anti-CD11c und PE-markiertes Anti-CD11b wurden als Makrophagenmarker und als Marker für dendritische Zellen verwendet.
  • Weiterhin wurde die NK-Zell-Aktivität in NOG-, C.B-17-scid-, NOD/Shi-scid-, und NOD/LtSz-scid, β2m null-Mäusen (10 bis 12 Wochen alt) durch einen Zytotoxizitätstest, der auf 51Cr-markierte NK-empfindliche YAC-1 Zellen abzielt, untersucht. Und zwar wurden Milzzellen aus den Mäusen isoliert und mit 51Cr-markierten YAC-1-Zellen in verschiedenen Verhältnissen untereinander gemischt und kultiviert. Nach Kultivieren bei 37°C für 4 Stunden bei 5% CO2 wurde die Radioaktivität in den Überständen durch einen Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen. Die NK-Zell-Aktivität wird nach dem folgenden Berechnungsverfahren angegeben. % spezifische Zytotoxizität = (spezifische Radioaktivität – Hintergrundradioaktivität)/(Maximale Radioaktivität – Hintergrundradioaktivität) × 100
  • Die 5A und 5B zeigen FACS-Profile der aus jedem Mausstamm erhaltenen Milzzellen.
  • NK-Zellen wurden in NOD/Shi-scid- und NOD/LtSz-scid, β2m null-Mäusen nachgewiesen, obwohl NK-Zellen überhaupt nicht in NOD/Shi-scid-Mäusen, die [nicht] mit Anti-Asialo-GM1-Antikörper behandelt wurden, und NOG-Mäusen nachgewiesen wurden. CD11c-positive Zellen, die als ein dendritischer Zellmarker verwendet wurden, wurden in sämtlichen Mäusen in extrem hohen Anteilen nachgewiesen. Es wurde bestätigt, dass CD11c-positive Zellen fast vollständig aus den Milzzellen der NOD/Shi-scid-Mäuse entfernt waren, die [nicht] mit Anti-Asialo-GM1-Antikörper mittels magnetischer Beads behandelt worden waren.
  • Die 6A, 6B und 6C zeigen die Ergebnisse des Nachweises der Produktionsmenge von Zytokinen durch ELISA in den obigen Milzzellen unter der LM-Stimulierung. Es wurde Folgendes festgestellt: Obwohl IFN-γ-Produktion in nicht mit Anti-Asialo-GM1-Antikörper behandelten NOD/Shi-scid-Mäusen und NOD/LtSz-scid, β2m null-Mäusen festgestellt wurde, wurde bei NOG-Mäusen kein Nachweis erbracht; und, wie bei NOG-Mäusen, wurde durch die Entfernung von CD11c-positiven Zellen aus den NOD/Shi-scid-Mäusen, die [nicht] mit Anti-Asialo-GM1-Antikörper behandelt wurden, keine IFN-γ-Produktion festgestellt.
  • 7 zeigt die NK-Zell-Aktivität der aus jedem Mausstamm erhaltenen Milzzellen.
  • Im Vergleich mit C.B-17-scid-Mäusen wurde eine Reduktion der NK-Zell-Aktivität in NOD/Shi-scid-Mäusen festgestellt, allerdings wurde absolut keine NK-Zell-Aktivität in NOG-Mäusen und NOD/LtSz-scid, β2m null-Mäusen festgestellt.
  • Angesichts des Vorgenannten wird klar, dass NOG-Mäuse und NOD/LtSz-scid, β2m null-Mäuse ihre NK-Zell-Aktivität vollständig verloren haben. Allerdings wurde laut dem Ergebnis der FACS-Analyse ersichtlich, dass die NOG-Mäuse NK-Zellen verloren hatten, aber die NOD/LtSz-scid, β2m null-Mäuse in sich NK-Zellen aufwiesen, jedoch die NK-Zell-Aktivität verloren hatten.
  • Weiterhin wurde gezeigt, dass die funktionelle Inkompetenz der dendritischen Zellen eine Ursache für den Zytokin-Produktionsabfall in Milzzellen war, der in NOG-Mäusen beobachtet wurde. Andererseits gab es Anzeichen, dass die NOD/LtSz-scid, β2m null-Mäuse fast die gleichen FACS- und Zytokinproduktionsprofile aufwiesen wie die Anti-Asialo-GM1-Antikörper-[nicht]-behandelten NOD/Shi-scid-Mäuse. Es war offensichtlich, dass die NOD/LtSz-scid, β2m null-Mäuse NK-Zellen verloren hatten, und dass ihre dendritischen Zellen normal waren.
  • Beispiel 3
  • Sukzessive Transplantation menschlicher Stammzellen unter Verwendung von NOG-Mäusen
  • Um die Selbstreplizierbarkeit von humanen Stammzellen zu untersuchen, in die ein Gen eingeschleust wurde, wurden Nabelschnurblut-Stammzellen in NOG-Mäuse transplantiert, und es wurde untersucht, ob sekundäre oder tertiäre Transplantation möglicht ist oder nicht.
  • Nabelschnurblut wurde von schwangeren Frauen mit ihrer Einwilligung und Genehmigung zur Verwendung in dem Test erhalten. Nach Isolierung mononuklearer Zellen aus dem Nabelschnurblut unter Verwendung von Ficoll-Hypaque (Lymphoprep, 1.077 ± 0.001 g/ml; Nycomed, Oslo, Norwegen) wurden CD34-positive Zellen unter Verwendung einer CD34-positiven Trennsäule (MACS, Miltenyi Biotec, Gladbach, Deutschland) gereinigt. Die CD34-positiven Zellen wiesen eine Reinheit von 96 ± 3% auf.
  • Der Lentivirus-Vektor pCS-CG war ein Vektor, der die Expression eines GFP-Gens durch einen CMP-Promoter ermöglichte, und er wurde von Dr. Miyoshi (Immunology, Medical Branch, University of Tsukuba) zur Verfügung gestellt. Nach Kultivierung der CD34-positiven Nabelschnurblut-Zellen für 24 Stunden in serumfreiem StemPro-TM-34SFM-Medium (Gibco BRL), das jeweils 50 ng/ml von TPO, SCF und Flk-2/Flt-3-Ligand (FL) enthielt, wurden sie einer fünfstündigen Infektion mit rekombinantem Lentivirus CS-CG bei einer MOI 30 (Kawada H et al., Exp. Hematol. 27: 904–915, 1999) unterworfen. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und einer fünftägigen extrakorporalen Amplifikationskultur in dem gleichen serumfreien Medium wie vorstehend in Gegenwart von murinen Knochenmarkstromazellen HESS-5 (Oki M et al., Exp. Hematol. In press. 2001) unterworfen.
  • Nachdem mit 7 Wochen alten NOD/Shi-scid-Mäusen eine Bestrahlung mit 3Gy durchgeführt worden war, wurden 3 × 105 Zellen, in die das Gen eingeschleust worden war und die durch Kultur amplifiziert worden waren, über die Schwanzvene eingebracht. Nach 6 Wochen wurden Oberflächen-Antigene muriner Knochenmarkzellen analysiert, und 1 × 107 Zellen wurden in bestrahlte NOG-Mäuse eingebracht (Sekundärtransplantation). Nach 6 Wochen wurde die gleiche Analyse durchgeführt, und 1 × 107 Zellen wurden in bestrahlte NOG-Mäuse eingebracht (Tertiärtransplantation). Weiterhin wurde nach 6 Wochen die gleiche Analyse durchgeführt.
  • Die Analyse von Oberflächen-Antigenen wurde unter Verwendung von FACS Calibur (Becton, Dickinson and Co.) durchgeführt. Die hier verwendeten Antikörper waren FITC-markierter Antihuman-CD45(-Antikörper) (T-200), PE-markierter Antihuman-CD2 (39C1.5), -CD3(UCHT1), -CD4(SK3), -CD14(LeuM3), -CD19(4G7), -CD20(2H7), -CD33(WM53), -CD41(P2), -CD56(N901), und -Glycophorin A (KC16)(-Antikörper), und alle wurden von der Firma Becton, Dickinson and Co. bezogen.
  • Die Gen-Einschleusungseffizienz in CD34-positive Zellen betrug 40 ± 5% (n = 5). 8 zeigt das Ergebnis von FACS, wobei Maus-Knochenmarkzellen von primären, sekundären und tertiären Transplantationsmäusen mittels humanem CD45 gefärbt wurden. Es wurde festgestellt, dass menschliche Zellen mit eingeschleustem Gen in sämtlichen Mäusen vorkamen.
  • Unter Verwendung von erfindungsgemäßen NOG-Mäusen als Wirt wurden die Erfinder zu den ersten der Welt, die erfolgreich die Einschleusung eines Gens erreichten, das in hämatopoetischen Stammzellen exprimiert werden kann, die bis in einen dritten Wirt transplantiert werden können. Die Verwendung von herkömmlichen NOD-scid-Mäusen gestattete bis zu zwei Transplantationen (Guenechea G et al., Nature Immunol, 2, 75–82, 2001), und darüber hinaus wurde gezeigt, dass die vorliegenden Mäuse empfindlicher waren und als ein Assay-System für hämatopoetische Stammzellen geeignet waren.
  • Beispiel 4
  • Produktion von vollständigen humanen Antikörpern unter Verwendung von NOG-Mäusen
  • Nachdem NOG-Mäuse (8 Wochen alt) und NOD/Shi-scid-Mäuse (8 Wochen alt) mit 2,5 Gy bzw. 3,5 Gy bestrahlt wurden, wurde mit ihnen eine intravenöse Transplantation von 1 × 106 CD34+-Zellen durchgeführt, die mit Magnet-Beads aus menschlichem Nabelschnurblut (bereitgestellt von Tokai University, Cell Transplant Research Center, mit der Einwilligung und Genehmigung der schwangeren Frauen) aufgereinigt wurden. Insbesondere wurden MNCs aus Nabelschnurblut unter Verwendung von Ficoll isoliert, und anschließend wurden CD34+-Zellen durch ein immunomagnetisches MACS-Trennsystem (Miltenyi Biotec, Gladbach, Deutschland) isoliert. Nach Bestätigung, dass die CD34+-Zellen laut FACS eine Reinheit von 97% oder mehr aufwiesen, wurden sie zur Transplantation verwendet.
  • Blut, das in chronologischer Weise aus Orbitas entnommen wurde, wurde, nachdem die MNC-Fraktion durch Ficoll erhalten wurde, mit fluoreszenzmarkierten CD45-, CD19-, und CD3-Antikörpern (Becton Dickinson, San Jose, CA) gefärbt. Die Rekonstruktion von humanen Lymphozyten, und die Anteile von B-Zellen und T-Zellen wurden mit CD45-, und fluoreszenzmarkierten CD19- bzw. CD3-Antikörper durch FACS bestätigt.
  • Ferner wurden Thymusdrüse und Milz aus diesen Mäusen extrahiert, die Zellen wurden daraus präpariert, die Anzahlen der Zellen wurden gezählt, und sie wurden mit verschiedenen Fluoreszenz-Antikörpern (Becton Dickinson, San Jose, CA) gefärbt. Anschließend wurden sie durch FACS auf die gleiche Weise wie bei der vorstehenden Rekonstruktionsbestätigung analysiert
  • Ab 6 oder 8 Wochen nach der Transplantation wurden diesen Mäusen Antigene verabreicht. Als ein Antigen wurde DNP-KLH verwendet. Die Immunisierung wurde intraperitoneal mit 100 μg/Maus DNP-KLH zusammen mit einem Adjuvans aus Aluminiumhydroxid (ALUM) durchgeführt. Die gleiche Immunisierung wurde alle zwei Wochen durchgeführt, und Serum wurde zum Messen des Antikörper-Titers durch ELISA entnommen.
  • Zu diesem kritischen Zeitpunkt wurde ein ELISA wie folgt durchgeführt.
  • Eine 96-Weltplatte wurde mit Antihuman-IGs (ICN, Aurora, Ohio) oder DNP-KLH beschichtet, und Blockieren und Waschen wurde mit 3% BSA durchgeführt. Verdünntes Antiserum wurde hinzugegeben. Nach der Reaktion für 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Waschen durchgeführt. Anschließend wurden die biotinylierten monoklonalen Antihuman-IgM- oder Antihuman-IgG-Antikörper (Pharmingen, San Diego, CA) zugesetzt. Nach Reaktion für 2 Stunden bei 37°C wurde das Waschen durchgeführt. Anschließend wurde avidinylierte Peroxidase für eine einstündige Reaktion bei Raumtemperatur zugesetzt. Die Platte wurde gewaschen, und TMB-Peroxidase-EIA-Substrat-Kit-Lösung (Bio-Rad Laborstories, USA) wurde zur 30-minütigen Reaktion bei Raumtemperatur zugesetzt. Anschließend wurde die Reaktion mit 10% HCl inhibiert und die Extinktion bei 450 nm gemessen. Die Ig-Konzentration wurde gemäß der Standardkurve berechnet.
  • (1) Wirksamkeit von Transplantation und Rekonstitution von aus Nabelschnurblut stammenden CD34+-Zellen
  • Betreffs des Anteils von humanen CD45+-Zellen in den NOG-Mäusen nach Transplantieren der Nabelschnurblut-Zellen nahm der Anteil von humanem CD45 in peripherem Blut nach und nach ab 4 Wochen ab. Allerdings wurde ab 12 Wochen aufwärts stieg plötzlich die Rate der Zunahme von T-Zellen an, und gleichzeitig hiermit wurde festgestellt, dass der Anteil von humanem CD45 ebenfalls in einigen Mäusen anstieg (Tabelle 3). Die Zunahmen der CD45+-Anteile, die durch eine solche T-Zellzunahme hervorgerufen wurden, wurden bisher noch nicht in peripherem Blut der existierenden NOD/Shi-scid-Maus beobachtet. Diese NOG-Mäuse waren bis zur 14. Woche noch nie von Graft-versus-Host-Reaktion, GVHD, betroffen.
  • Figure 00270001
  • Figure 00280001
  • (2) T-Zell-Differenzierung in NOG-Mäusen
  • A. T-Zell-Differenzierung im Thymus
  • Die 9A, 9B, 10A und 10B zeigen T-Zell-Differenzierungsprofile in Thymusdrüsen. Wie in den FIGUREN gezeigt, waren CD3-positive Zellen in den Thymusdrüsen dieser Mäuse differenziert, und es wurde gezeigt, dass diese Zellen CD4/CD8-DN (doppel-negative), -DP (doppel-positive), und -SP (einzel-positive) Zellen enthielt, sowie diejenigen Zellen in einer normalen Thymusdrüse, oder nachgewiesen durch hu/m-RTOC, enthielten, und ein Teil von ihnen war in der 11. oder 13. Woche nach der Transplantation zu CD1a-armen T-Zellen maturiert. Die Anzahl dieser Thymuszellen betrug 1 bis 2 × 106 und dies war etwa ein Hundertstel der Anzahl von Thymuszellen in einer normalen Maus. Dieses Phänomen wurde auch in NOD/Shi-scid-Mäusen beobachtet, allerdings war seine Häufigkeit bemerkenswert gering, wie z. B. 8/28 (28,6%). Im Gegensatz hierzu wiesen NOG-Mäuse eine Häufigkeit von 7/7 (100%) auf.
  • B. T-Zellen in Peripherien
  • Die 11A, 11B, 12A, 12B, 13A, und 13B zeigen weitere Analysen bezüglich T-Zellen in Milzzellen oder peripherem Blut. CD3-positive Zellen wurden auch in den Peripherien der Mäuse nachgewiesen, bei denen T-Zell-Differenzierung in den Thymusdrüsen beobachtet wurde. Diese stellen eine Gruppe von CD4/CD8-positiven Zellen dar, und dies zeigte, dass die Möglichkeit bestand, dass sie Zellen enthielten, die in Thymusdrüsen differenziert waren.
  • (3) B-Zell-Differenzierung in NOG-Mäusen
  • A. Untergruppendifferenzierung von B-Zellen
  • Die 14A und 14B zeigen auch die Expressionsraten von CD5 auf B-Zellen unter den Knochenmarkzellen. Im Knochenmark war die Differenzierung von CD5-positiven Zellen, sogenannten B1a-Zellen, nicht erleichtert und Gruppen von CD19-positiven oder IgM-positiven Zellen waren dominant. Weiterhin exprimierten Zellen in einer Gruppe, in der IgM stark positiv ist, CD20. Es wurde keine Abnormalität bei der Differenzierung menschlicher B-Zellen im Knochenmark dieser Mäuse nachgewiesen. Dieses Phänomen wird auch bei der B-Zell-Differenzierung in NOD/Shi-scid-Mäusen festgestellt, und somit wird es als allgemeine Eigenschaft angesehen.
  • B. B-Zellen in der Peripherie
  • Die 13A und 13B zeigen FACS-Profile von B-Zellen in ihren Peripherien. Die Verhältnisse von B-Zellen waren fast die gleichen wie diejenigen bei NOD/Shi-scid-Mäusen. Allerdings waren in der Milz CD5-positive Zellen, sogenannte B1a-Zellen, die eine Untergruppe der B-Zellen darstellen, dominant, und ein großer Unterschied wurde in den Differenzierungsprofilen im Knochenmark nachgewiesen. Andererseits wurden auch IgM-positive CD5-negative Zellgruppen in einem Anteil von etwa 20% nachgewiesen und somit zeigte dies, dass außer B1a-Zellen auch andere Zellen nachgewiesen wurden.
  • (4) Antikörper-Produktionsvermögen in NOG-Mäusen
  • DNP-KLH wurde diesen Mäusen als Antigen verabreicht, und IgM- und IgG-Antikörperproduktionsmengen wurden in chronologischer Weise gemessen. Als Ergebnis wurden nicht Antigen-spezifisches IgM und IgG-Antigen-spezifisches IgM durch wiederholte 3-malige Verabreichung nachgewiesen. Obwohl T-Zellen in Thymusdrüsen und in den Peripherien nachgewiesen wurden, wurde keine Antigen-spezifische IgG-Produktion nachgewiesen. (15A, 15B und 15C). Die 15A, 15B und 15C zeigen auch die Ergebnisse von Mäusen, in die CD34+-Zellen transplantiert wurden, die aus dem Knochenmark (BM) (15B) und aus dem peripheren Blut (PBSC) (15C) stammten. Im Knochenmark und im peripheren Blut wurde eine Neigung zu niedrigeren Produktionen von spezifischem IgM und nicht-spezifischem IgG im Vergleich mit der Produktion im Nabelschnurblut festgestellt.
  • Die obigen Ergebnisse zeigen, dass in der vorliegenden Maus menschliche T-Zellen und menschliche B-Zellen differenzieren und dass die Maus zur Verwendung in humanen Antikörperproduktionssystemen wertvoll ist.
  • Beispiel 5
  • Neoplasma-Proliferationssystem
  • Es wurden NOD/Shi-scid-Mäuse, NOG-Mäuse, BALG/cAJcI-nu-Mäuse (bezogen von CLEA) und C.B-17/Icr-scid-Mäuse (bezogen von CLEA) verwendet. Alle verwendeten Mäuse waren 5 Wochen alt oder älter.
  • Als in die Mäuse zu transplantierende Zellen wurde eine humane Transplantations-Tumorzelllinie, LM-2-JCK, verwendet. LM-2-JCK war eine Zelllinie, die aus Lymphoblasten-Lymphomen eines 13 Jahre alten weiblichen Patienten etabliert und durch aufeinanderfolgende Heterotransplantationen in Nacktmäuse erhalten wurde. Es wurde berichtet, dass obwohl LM-2-JCK die T-Zell-Antigene CD4 und CD5 exprimiert, es keine anderen Zellantigene, einschließlich Antikörper, exprimiert.
  • Ein solider Tumor, der 12-mal subkutan in Nacktmäusen passagiert wurde, wurde für den Heterotransplantations-Assay verwendet. Der Tumor wurde in angereichtertem Nährmedium F-10 (GIBCO BRL) mit Scheren in Stücke zerkleinert und mit einer Pipette vollständig dispergiert, und anschließend wurde mittels Passieren durch ein Nylonsieb eine Zellsuspension hergestellt. Die Konzentration an überlebensfähigen Zellen in der Suspension wurde durch Trypanblaufärbung (GIBCO BRL) ermittelt. Nach Zentrifugation wurden die Tumorzellen bei Konzentrationen von 1 × 107 und 1 × 106 lebensfähigen Zellen/ml in physiologischer Kochsalzlösung dispergiert. Die Tumorzelldispersionsflüssigkeit wurde unter Verwendung einer 1 ml-Spritze, ausgestattet mit einer 25er Nadel, subkutan in einer Menge von 0,1 ml in beide Flanken der Mäuse injiziert. Nach der Injektion der Tumorzellen wurden die Größe des Tumors und das Körpergewicht in Abständen von einer Woche gemessen. Am 21. Tag, nachdem die 1 × 106 Zellen transplantiert worden waren, als der Tumor groß wurde, wurden die Mäuse getötet, und Gewicht und Größe der Tumore wurde gemessen.
  • Der Unterschied in der Transplantierbarkeit von LM-2-JCK bei Mäusen mit verschiedenem Hintergrund ist in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Heterotransplantation von LM-2-JJCK auf Mäuse mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund
    Mausstamm Anz. von transplantierten Zellen Beobachtungszeitraum Anz. von Tumor-implantierten Mäusen mit implantiertem Tumor/Anz. von transplantierten Mäusen Gewicht von Tumor a)
    NOG 106 21 10/10 (100%) 3.97 ± 2.10 b)
    NOD/Shi-scid 106 21 10/10 (100%) 1.34 ± 0.77
    C.B-17/Icr-scid 106 21 8/10 (80%) 1.21 ± 1.06
    NOG 105 < 9 8/8 (100%) c) n. t.
    NOD/Shi-scid 105 < 9 5/10 (50%) n. t.
    C.B-17/Icr-scid 105 < 9 0/10 (0%) n. t.
    • a) Das Gewicht des Tumors wurde 21 Tage nach der Transplantation gemessen und als Durchschnitt ± SD (g) angegeben.
    • b) Hinsichtlich NOD/Shi-scid und C.B-17/Icr-scid wird ein signifikanter Unterschied festgestellt, wenn p < 0,05 (t-Test).
    • c) Hinsichtlich NOD/Shi-scid (p < 0,05) und C.B-17/Icr-scid wird ein signifikanter Unterschied festgestellt, wenn (p < 0,01) (χ2-Test)
    • n. t.: nicht getestet
  • Im Fall einer Transplantation von 1 × 106 Zellen wurden sämtliche Tumore in NOG-Mäuse und NOD/Shi-scid-Mäuse implantiert. Im Gegensatz dazu betrug die Implantationsrate für C.B-17/Icr-scid 80%.
  • Die Tumorimplantationsraten in diesen Stämmen waren im Fall einer Transplantation von 1 × 105 Zellen geringer, insbesondere wurde keine Tumorproliferation in C.B-17/Icr-scid-Mäusen festgestellt.
  • Für den Fall einer Transplantation von 1 × 106 Zellen sind die Wachstumskurven der Tumore in 16 gezeigt.
  • Die Tumorproliferation in NOG-Mäusen übertraf diejenige der anderen zwei Stämme.
  • Am 21. Tag wiesen die NOG-Mäuse ein 2,89- und 3,97-fach größeres durchschnittliches Tumorvolumen auf als die NOD/Shi-scid-Mäuse bzw. die C.B-17/Icr-scid-Mäuse am gleichen Tag aufwiesen, und durch den Student's t-Test wurden signifikante Unterschiede festgestellt (p < 0,001).
  • Kein signifikanter Unterschied zwischen Tumoren, die in NOD/Shi-scid-Mäuse implantiert wurden und Tumoren, die in C.B-17/Icr-scid-Mäuse implantiert wurden, wurde im durchschnittlichen Volumen am 21. Tag festgestellt.
  • Beispiel 6
  • Entwicklung eines HIV-Infektionsmodellsystems unter Verwendung von NOG-Mäusen
  • Die Entwicklung eines HIV-Infektionsmodellsystems unter Verwendung von NOG-Mäusen wurde durch die Verwendung verschiedener HIV-Linien untersucht. Typische Bespiele sind nachstehend gezeigt.
  • In diesem Beispiel wurden NOG-Mäuse verwendet. Zum Vergleich wurden auch NOD/Shi-scid-Mäuse verwendet, die zuvor durch Rückkreuzen von sowohl Mutanten von C.B-17-scid-Mäusen als auch NOD/Shi-Mäusen miteinander hergestellt wurden.
  • HIV-1, das hier verwendet wurde, war ein JRFL-Virus, das aus dem Frontallappengewebe eines Patienten mit AIDS-assoziierter Enzephalopathie isoliert wurde, und das Infektiosität gegenüber DNA-klonierten Makrophagen und T-Zellen besaß. Weiterhin wurde ein GFP-HIV-1, in das ein JRFL-Virus und ein GFP-Gen in die env-V3-Region bzw. downstream von gp41 eingeschleust wurden, verwendet.
  • (1) Herstellung von Mäusen (hu-PBL-NOG-Mäuse), in die humane mononukleare Lymphozyten transplantiert wurden
  • Pro Maus wurden 1 × 107 periphere humane Blutlymphozyten (PBL), von einer gesunden Person mit Einwilligung und Genehmigung zur Testverwendung bereitgestellt, intraperitoneal direkt in NOG-Mäuse inokuliert. Zum Vergleich wurden PBL aus dem gleichen Donor intraperitoneal in NOD/Shi-scid-Mäuse mit einer normalen IL-2Rγ-Kette inokuliert.
  • (2) Infektion von Mäusen mit HIV-1
  • Am 6. Tag nach der PBL-Inokulation wurden 1.000 TCID50 der Viren intraperitoneal in Mäuse inokuliert. Die Mäuse wurden 2 Wochen nach der Virusinfektion getötet, und Ascites einschließlich abdominaler Exsudat-Zellen wurden gesammelt. Die Anzahl von humanen Zellen in den Ascites wurde durch FACS ermittelt. Außerdem wurde die Milz extrahiert und mit Paraformaldehyd fixiert, und anschließend zu Paraffin-eingebetteten Schnitten verarbeitet.
  • (3) Pathologische Auswertung
  • Die Milzgewebeschnitte wurden der HE-Färbung unterzogen und weiterhin der Immunfärbung unter Verwendung von Antikörpern gegen humane CD3-, CD4-, CD8-, und HIV-1p24-Antigene. Zur immunhistologischen Färbung wurden zusätzlich zu dem herkömmlicherweise beschriebenen ABC-Verfahren das EPOS-Verfahren und das Envisiont-Verfahren eingesetzt.
  • Die Implantation von humanen Zellen in hu-PBL-NOG-Mäuse wurde bewertet.
  • Eine Reihe von Untersuchungsergebnissen ist in Tabelle 5 dargestellt.
  • Tabelle 5
  • HIV-1-Infektionsttest in humanen PBMC-implantierten weiblichen NOG-Mäusen ohne TMβ1, nicht existent, PBL
  • NOG-Mäuse
    • PBL Transplantation, gesamte PBL 160 mL 4.37 × 108 Zellen
    • 2 × 107 Zellen pro Maus
    • Donor A
    • 14 NOG-Mäuse (6 männlich, 8 weiblich)
    • Infektion
  • NOG-Mäuse
    JRFL M-trog 3 männlich
    NL4-3 T-trog 3 männlich
    JRCSF M-trog 3 weiblich
    NLCSFV3EGFP M-trog 2 weiblich
    MOCK 3 weiblich
    Tag 13 nach Infektion
    Zellanzahl × 104 Zellen %HLA %CD4 %CD8 p24
    1. Mock ♀
    Ascites 75 67.7 21.4 56.4
    Milz 510 71.8 13.8 45.5
    PBL 430 77.9 16.8 49.9 0
    2. Mock ♀
    Asciles 130 67.6 14.8 60.5
    Milz 698 63.3 12.7 49.2
    PBL 86 66.6 11.6 55.5 0
    3. Mock ♀
    Ascites 110 62.3 36.4 44.2
    Milz 434 61.3 20.9 45.2
    PBL 93 34.7 20.6 44.7 0
    4. JRFL ♂
    Ascites 152 75.5 1.7 53.9
    Milz 335 54.6 2.8 64.6
    PBL 210 42.8 2.1 77.3 3,090
    5. JRFL ♂
    Ascites 220 75.8 1.8 57
    Milz 12 75.8 1.65 79.6
    PBL 870 81.1 1.8 77.9 5,445
    6. JRFL ♂
    Ascites 178 36.3 1.79 54.1
    Milz 418 65.3 1.1 74.4
    PBL 65 33.1 1.72 75.6 1,961
    HIV-Infektion von humanen PBNC-implantierten NOG-Mäusen (2)
    Zellanzahl × 104 %HLA %CO4 %CD8 p24
    7. NL4-3 ♂
    Ascites 120 7.6 9.74 74.1
    Milz 14 ein FACS
    PBL nicht existent
    8. NL4-3 ♂
    Ascites 84 75.5 1.43 45.7
    Milz 465 53 1.64 60.0
    PBL 26 11.3 4.59 49.3 118
    9. NL4-3 ♂
    Ascites 110 8.1 9.33 80.6
    Milz 17 14.8 19.1 23.5
    PBL 3 0.6 13.0 27.8 0
    3 männlichen NL4-3-Mäusen wurden die Ohren abgeschnitten
    10. JRCSF ♀
    Ascites 320 29.9 0.77 93.7
    Milz 230 67 1.85 74.9
    PBL 49 33.7 0.48 71.7 3,132
    11. JRCSF ♀
    Ascites 63 68.5 3.18 41.6
    Milz 390 68.7 3.58 85.8
    PBL 121 2.9 4.5 31.5 4,180
    12. JRCSF ♀ schlechter Aufbau
    Ascites 110 15.2 23.0 62.4
    Milz 380 14.5 2.98 89.8
    PBL 110 44.1 2.06 89.4 864
    13. NLCSFV3EFFP ♀ GFP+ von Milz und PLB betragen 0,1% oder weniger
    Ascites 43 72.5 2.26 69.8
    Milz 250 50.8 0.77 67.7
    PBL 124 76.5 5.07 63.3 271
    14. NLCSFV3EGFP ♀ GFP+ von Ascites, Milz und PLB betragen 0,2 bis 0,3% oder weniger
    Ascites 110 44.3 6.36 76.3
    Milz 560 2.7 23.3 44.4
    PBL 127 3.4 5.26 84.2 114
    13. NLCSFV3EFFP ♀ GFP+ von Milz und PLB betragen 0,1% oder weniger
    Ascites 43 72.5 2.26 69.8
    Milz 250 50.8 0.77 67.7
    PBL 124 76.5 5.07 63.3 271
    14. NLCSFV3EGFP ♀ GFP+ von Ascites, Milz und PLB betragen 0,2 bis 0,3% oder weniger
    Ascites 110 44.3 6.36 76.3
    Milz 560 2.7 23.3 44.4
    PBL 127 3.4 5.26 84.2 114
  • CD4-positive Zellen wurden spezifisch durch alle HIV-Viren abgetötet. Gewöhnlich wurde beschrieben, dass nur M-trope Viren in Mäusen proliferieren können und CD4-positive Zellen getötet werden, T-trope Viren können jedoch in NOG-Mäusen proliferieren.
  • Es wurde festgestellt, dass humane CD4-positive T-Zellen und CD8-positive T-Zellen jeweils rund um die Zentralarterien der Milz der Mäuse implantiert waren, denen humanes peripheres Blut transplantiert wurde. Bezüglich der Anzahl von humanen CD3-positiven Zellen wiesen NOG-Mäuse offensichtlich eine größere Anzahl an humanen Zellen auf als NOD/Shi-scid-Mäuse. Der Messung durch FACS zufolge befanden sich im Durchschnitt 1 × 107 oder mehr CD4-positive Zellen in Ascites.
  • Andererseits wurden CD4-positive Zellen kaum aus NOD/Shi-scid-Mäusen nachgewiesen, und fast alle nachgewiesenen Zellen waren CD8-positive Zellen. In dem zuvor beschriebenen Beispiel wurden die Antikörper (TMβ-1) (0,5 mg pro Maus), die gegen die Maus-IL-2-Rezeptor-β-Kette gerichtet waren, und welche die Differenzierung von NK-Zellen hemmten, 3 Tage vor der Inokulation mit humanen PBL intraperitoneal in die NOD/Shi-scid-Mäuse injiziert. Allerdings wurde diese Behandlung in diesem Beispiel nicht durchgeführt. Es hat sich bereits in anderen Tests bestätigt, dass Antikörper-behandelte Mäuse viele in sie implantierte CD4- und CD8-positive humane Zellen aufweisen. Dennoch war die Anzahl von humanen Zellen aus NOG-Mäusen offenbar immer noch 3- bis 4-mal größer als die Anzahl von Zellen aus NOD/Shi-scid-Mäusen, welche der Antikörperbehandlung unterzogen wurden.
  • In den HIV-infizierten Mäusen wurden die p24-positiven Zellen, die gegen HIV-Antigene gerichtet waren, rund um die Milzarterien nachgewiesen. Weiterhin wurden in der Milz und in Ascites der HIV-infizierten Mäuse, die GFP exprimieren, Zellen mit GFP-Expression eindeutig nachgewiesen. Die Anzahl der virusinfizierten Zellen in NOG-Mäusen war offensichtlich größer als diejenige in NOD/Shi-scid-Mäusen.
  • Beispiel 7
  • Entwicklung des HTLV-1-Infektionsmodellsystems unter Verwendung von NOG-Mäusen
  • Pro Maus wurden 2 × 107 MT-2-Zellen, welches HTLV-1-Leukämie abgeleitete Zelllinien sind, in NOG-Mäuse transplantiert.
  • In der 4. Woche nach der Transplantation wurde die Anzahl von Mäusen mit darin ausgebildeten Lymphomen gezählt (Tabelle 6), und es wurde mittels Southernblot und PCR überprüft, ob die Lymphom-Mäuse mit einem HTLV-Gen infiziert waren oder nicht. Als Ergebnis der pathologischen Untersuchung werden Hautlymphome und posteriore intraperitoneal-bilaterale Lymphome festgestellt. Die Mäuse mit einem großen Tumor wiesen Metastasen in Lymphknoten rund um den Magen auf und wiesen in einer Pleura davon infiltrierte Krebszellen auf. Außerdem nahmen HTLV-positive Zellen in peripherem Blut zu. Dies zeigte einen typischen Ausbruch von Leukämie an. Ferner wurde auch eine interstitielle Invasion der Lunge festgestellt. Alle diese Zellen exprimierten Tax-Protein, allerdings bestand keine intrazerebrale Invasion. Tabelle 6 Transplantation von HTLV-infizierten Zellen in NOG-Mäuse 2 × 107 Zellen pro Maus.
    Anz. der Mäuse TMβ-1 Zellbehandlung durch γ-Strahlung Anz. von Mäusen mit Lymphom (nach 1 Monat)
    NOD/Shi-scid-Mäuse 5 - - 0
    NOG-Mäuse 40 - - 33 (82,5%)
    NOG-Mäuse 4 - 20 000 rad 0
    NOG-Mäuse (keine Zellen transplantiert) 2 - - 0
  • Beispiel 8
  • Untersuchung von leukämischen Veränderungen durch Einbringen neoplastischer Zellen und der Transplantierbarkeit von HTLV-1-positiven Zellen unter Verwendung von NOG-Mäusen
  • Transplantationstests mit verschiedenen HTLV-1-Zelllinien und Tumorbildungstests wurden an NOG-Mäusen durchgeführt, und die Brauchbarkeit der Mäuse wurde untersucht.
  • Unter Verwendung von drei Proben von HTLV-1-Leukämie-abgeleiteten Zelllinien [L = leukämische Zelllinien: ED-40515(–), MT-1 und TL-OmI] wurden 6 Proben von HTLV-1-infizierten Zelllinien [IT = infizierte transformierte Zelllinien: SLB-1, M8116, HUT-102, MT-2, MT-4 und TY9-31MT], 107-8 Zellen/0,5 ml, in NOG-Mäuse und NOD/Shi-scid-Mäuse subkutan in ihre linke posteriore Auricula und bei einigen von ihnen subkutan in ihre gluteale Region transplantiert. Anschließend wurden die Tumorgröße in den Mäusen, das Gewebebild und die Mäuse mit und diejenigen ohne Leukämie in chronologischer Weise zur Untersuchung verglichen, und die Relationen zwischen diesen (Faktoren) und Transkriptionsfaktoren, wie NFκB, oder die Fluktuation von Tax-Protein wurden ebenfalls analysiert.
  • Innerhalb von 2 Wochen bildete sich in sämtlichen Fällen der HTLV-1-Leukämie-abgeleiteten Zelllinien [L] und ausnahmsweise in der HTLV-1-infizierten Zelllinie SLB-1 [IT] ein Tumor mit einer Größe von 24 × 17 × 11 mm. Im Gegensatz dazu bildete sich in 5 von 6 Fällen von IT ein Tumor mit einer Größe von höchstens 10 × 10 × 7 mm, und in dem Fall von M8116 oder TY9-31MT bestand fast keine Tumorbildung (Tabelle 7).
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • Der Fall dieser tumorigenen Zelllinie zeigte, dass der Grad des Auftretens von leukämischen Zellen in peripherem Blut und die Invasion von Organen relativ hoch waren, allerdings wiesen einige Fälle von nicht tumorigenen Zelllinien davon höhere Grade auf (z. B. HUT-102, MT-2 etc.). Somit bestanden nicht notwendigerweise Korrelationen zwischen Tumorigenizität und dem Grad des Auftauchens von leukämischen Zellen in peripherem Blut und der Invasion von Organen (Tabelle 8).
  • Figure 00430001
  • 107 Zellen vom tumorigenen Typ ED-40515(–) wurden subkutan in die linke posteriore Auricula von NOG-Mäusen und NOD/Shi-scid-Mäusen transplantiert, und sie wurden in der Tumorigenizität in der 2. Woche verglichen. Ein Tumor mit einer Größe von 22 × 17 × 10 mm bildete sich in den NOG-Mäusen, und im Gegensatz dazu bildete sich in allen NOD/Shi-scid-Mäusen kaum ein Tumor. Dies ergab, dass NOG-Mäuse zur Tumorbildung neigten (Tabelle 9). Tabelle 9 Vergleich der Tumorbildung zwischen NOG-Mäusen und NOD/Shi-scid-Mäusen, denen der ED-40515(–)-Zelltyp transplantiert wurde
    Mausstamm Anz. von Mäusen Inokulierte Zellen (× 107) Überlebensdauer (Tage) Tumor
    NOG-Maus 3 1 15 +++
    NOD/Shi-scid-Maus 3 1 15 –
    • +++ Tumor ist zur visuellen Beobachtung groß genug
    • – Tumor, der visuell nicht beobachtet werden kann
  • Um zu untersuchen, ob NOG-Mäuse zur Tumorbildung im B-Zelltyp sowie im T-Zelltyp neigen oder nicht, wurden 7 × 10 BJAB-Zellen, die nur mit EBER (EBV-Encoded SmaII RNA) oder Vektor transformiert waren, subkutan in die linke posteriore Auricula von NOG-Mäusen transplantiert. In der 3. Woche wurden sie bezüglich der Tumorigenizität verglichen. Ein signifikant großer Tumor (26 × 18 × 7/13 × 18 × 3 mm) bildete sich in den Mäusen mit BJAB-EBER im Vergleich zu den Mäusen mit BJAB-VEKTOR. Die Tumorgröße hierbei war mit derjenigen in dem Fall von ED-40515(–) im obigen Beispiel vergleichbar (Tabelle 10). Tabelle 10 Proliferation der BJAB-EBER-Zelllinie und der BJAB-VEKTOR-Zelllinie in NOG-Mäusen
    Zelllinie Gen-Einschleusung Anz. von Mäusen inokulierte Zellen (× 107) Art und Stelle der Inokulation Überlebensdauer (Tage) Tumorgröße (mm) Tumorgewicht
    BJAB-EBER Gen eingeschleust 3 7 s. c. post-aurikular 21 26 × 18 × 7 2,86 g
    BJAB-VEKTOR Gen nicht eingeschleust 3 7 s. c. post-aurikular 21 13 × 18 × 3 0,73 g
  • Unter der Annahme, dass eine wirksame Tumorbildung durch 107 ED-40515(–)(-Zellen) in NOG-Mäusen der aktiven Neogenese von Tumorgefäßen durch den CXCR4 von Tumorzellen zuzuschreiben war, wurde erwartet, dass die Tumorbildung gehemmt sein würde, solange eine kontinuierliche Verabreichung von KRH-1636, einem zu SDF-1 kompetitiven Mittel, welches ein Ligand davon (von CXCR4) in Endothelzellen ist, andauerte. Im Fall von ED-40515(–) und SLB-1 (histologisch angiotrop) der durch eine Blutung begleitet war, bildeten die Mäuse jedoch Tumore mit Größen von 25 × 18 × 12 mm und 20 × 10 × 18 mm entsprechend denjenigen der nicht behandelten Gruppe, obwohl KRH-1636 jeden Tag intraperitoneal verabreicht wurde (Tabelle 11).
  • Figure 00460001
  • Unter Verwendung von Cytospin-Proben von In-vitro-Kulturzellen und gefrorenen Schnitten von in-vivo tumorbildenden Zellen aus sowohl ED-40515(–) als auch SLB-1 wurde das Immunfärbungsverhalten bezüglich CD4, CD8, CD3, CXCR4, CCR5 und SDF-1 vergleichend durch ein Enzym-Antikörper-Verfahren getestet. Sämtliche Fälle bezüglich CD4, CD3, CXCR4 und SDF-1 waren fast gleichmäßig positiv, und alle Fälle von CCR5 waren negativ. CD8 war in vitro negativ, allerdings in vivo positiv (Tabelle 12). Tabelle 12 In-vitro- und In-vivo-Untersuchung von HTLV-1-infizierten NOG-Mäusen nach Transplantation von Zelllinien durch FACS, WB, EMSA und Immunhistochemie
    Immunhistochemie
    CD4 CD8 CD3 CXCR4 CCR5 SDF-1
    in vitro
    ED-40515(–) ++ – + + – ++
    SLB-1 ++ – + + – ++
    in vivo
    ED-40515(–) +++ + + + – +++
    SLB-1 +++ + + + – +++
    • +++ stark positiv
    • ++ positiv
    • + schwach positiv
    • – negativ
  • Unter Verwendung von In-vitro-Kulturzellen und in vivo tumorbildenden ED-40515(–)-Zellen wurden Western-Blot-Analysen bezüglich Tax, CXCR4, OX40 und OX40L durchgeführt. Alle Fälle bezüglich Tax waren negativ. Allerdings waren alle Fälle bezüglich CXCR4, OX40 und OX40L positiv, und es bestand kein signifikanter Unterschied in ihrer Stärke (Tabelle 13). Tabelle 13 In-vitro- und In-vivo-Untersuchugen von HTLV-1-infizierten NOG-Mäusen nach Transplantation von Zelllinien durch FACS, WB, EMSA und Immunhistochemie
    Figure 00480001
  • Unter Verwendung von In-vitro-Kulturzellen und in vivo tumorbildenden ED-40515(–)-Zellen wurde die Transkriptionsfaktoraktivität von NFκB durch einen elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) untersucht, obwohl dabei kein Unterschied festgestellt wurde (Tabelle 14). Tabelle 14 In-vitro- und In-vivo-Untersuchung von HTLV-1-infizierten NOG-Mäusen nach Transplantation von Zelllinien durch FACS, WB, EMSA und Immunhistochemie
    EMSA in vitro in vivo
    NFκB NFκB
    ED-40515(–) +++ +++
    SLB-1 +++
  • Die folgenden Punkte wurden in dem System erkannt, wobei die Transplantation subkutan an den posterioren Auriculas der NOG-Mäuse durchgeführt wurde.
    • 1) Es wurde mit Sicherheit bestätigt, dass sich in den NOG-Mäusen innerhalb sehr kurzer Zeiträume, wie 15 Tage nach der Inokulation, große Tumore bildeten, was nicht erwartet worden war. Umgekehrt bildeten NOD/Shi-scid-Mäuse (IL-2Rγ-Kette+/+) keinerlei Tumore.
    • 2) Es wurde festgestellt, dass die NOG-Mäuse NK-Zellen genetisch deletieren und dass sie darum keine Vorbehandlung gegen Anti-NK-Zellen unter Verwendung monoklonaler Antikörper etc. erfordern, was im Falle von C.B-17/Icr-scid- oder NOD/Shi-scid-Mäusen (IL-2Rγ-Kette+/+) essenziell ist.
    • 3) Die Transplantation wurde subkutan an einer posterioren Auricula durchgeführt, das heißt unter Selektion einer Stelle, die anatomisch eine niedrigere Anzahl von NK-Zellen aufweist als eine intraperitoneale Stelle, und dies gestattet, dass sich leicht ein Tumor bildet. Demzufolge konnte die Größe des Tumors leicht anhand des äußeren Erscheinungsbilds beurteilt werden, ohne dass ein Einschnitt benötigt wurde.
    • 4) Obwohl Uchiyama et al. berichteten, dass MT-1, T-2 und TL-OmI keine Tumore bildeten, wurden in dem vorliegenden Fall relativ kleine Tumore in ihnen gebildet (Imada K, Takaori-Kondo A, Akagi T, Shimotohno K, Sugamura K, Hattori T, Yamabe H, Okuma M, Uchiyama T: Tumorigenicity of human T-cell leukemia virus type I-infected cell lines in severe combined immunodeficient mice and characterization of the cells proliferating in vivo. Blond 86: 2350–7, 1995; Uchiyama, T: Human T cell leukemia virus type I (HTLV-I) and human diseases. Annu Rev Immunol 15: 15–37, 1997).
  • Darum ist das System, bei dem die Transplantation subkutan in den posterioren Auriculas der NOG-Mäuse durchgeführt wird, ein innovatives Tumortransplantationssystem. Weiterhin wurde festgestellt, dass es auf die gleiche Weise sowohl mit B-Zell-Tumoren als auch mit T-Zell-Tumoren funktionieren kann. Dies zeigt nämlich auch, dass dieses System ein wertvolles Transplantationssystem zur Transplantation von Krebszellen oder von normalem humanem lymphatischem Gewebe ist.
  • Zusätzlich kann, wo kein Labortiermodell vorhanden ist, oder wo es schwierig ist, auch wenn ein Tiermodell vorhanden ist, dieses in eine praktische Anwendung umzusetzen, ein menschliches Krankheitsmodell durch Transplantieren menschlicher Zellen oder Gewebe in diese NOG-Maus entwickelt werden, wodurch Forschungen mit einem Testsystem, das einem unbegrenzten menschlichen In-vivo-Test nahe kommt, zu Krankheiten ermöglicht werden, für die es bisher keine andere Wahl gab als die Abhängigkeit von In-vitro-Tests. Somit wird davon ausgegangen, dass diese Maus große Beiträge zu der Aufklärung der Mechanismen des Krankheitsausbruch, der Entwicklung von Therapien, etc. leistet. Beispielsweise ist, abgesehen von der potenten HAART-Therapie gegen HIV-1-Infektion, das Auftreten einer Virämie mit wiederkehrendem oder mutantem Virus von primärer Bedeutung. Das Reservoir für infektiöse Viren dafür sind bekanntlich FDC (follikuläre dendritische Zellen) des lymphatischen Follikels, und zu seiner Erforschung ist es unerlässlich, eine humanisierte Modellmaus zu entwickeln, in die lymphatische Gewebe, einschließlich des humanen lymphatischen Follikels, transplantiert werden. Hierzu ist die NOG-Maus geeignet.
  • Des Weiteren wurden, bezüglich einer Ursache, die dieses System gegenüber der Bildung eines Tumors anfällig macht, Untersuchungen dazu vorgenommen, welcher Faktor in transplantierten Zellen im Vergleich mit In-vitro-Kulturzellen erhöht oder aktiviert ist. Alle in den obigen Beispielen verwendeten Zelllinien waren IL-2-unabhängig, IL-2-produzierend, weiterhin wurde festgestellt, dass das Tax- und CXCR4-SDF-1-System nicht direkt damit zusammenhing. Allerdings gab es innerhalb der von den vorliegenden Erfindern vorgenommenen Untersuchung keinen Faktor, außer dem oben erwähnten, von dem die Erfinder erkannten, dass er einen signifikanten Unterschied im Vergleich zwischen In-vitro-Kulturzellen und in vivo tumorbildenden Zellen anzeigte.
  • INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von NOG-Mäusen bereit, die zur Implantation heterologer Zellen, insbesondere humaner Zellen besser geeignet sind, im Vergleich zu einer NOD/Shi-scid-Maus und einer NOD/LtSz-scid, β2m null Maus, die beide herkömmlicherweise als eine immundefiziente Maus bekannt sind, und eine durch das Verfahren hergestellte Maus. Das Transplantieren humaner Stammzellen auf die so erhaltenen Mäuse ermöglicht die Entwicklung eines humanen Stammzell-Assay-Systems. Außerdem gestattet das Transplantieren humaner Zellen, die für die Immunität verantwortlich sind, die Produktion humaner Antikörper unter Verwendung der erfindungsgemäßen Maus. Außerdem kann eine humane Tumormodellmaus durch Transplantieren und Implantieren menschlicher Tumore auf die Maus hergestellt werden, und die Maus kann für Tumortherapien, Screening von therapeutischen Mitteln und dergleichen eingesetzt werden. Ferner ist die Herstellung einer HIV- oder HTLV-1-infizierten Modellmaus möglich, der ein HIV- oder HTLV1-infizierter humaner Lymphozyt implantiert wurde, und es können Untersuchungen über den In-vivo-Proliferationsmechanismus von HIV-1, HTLV-1 etc. vorgenommen werden. Es ist auch möglich, die Entwicklung einer Therapie gegen Virusinfektion, das Screening eines therapeutischen Mittels gegen Virusinfektion oder dergleichen durchzuführen. SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00510001
    Figure 00520001

Claims (17)

  1. NOD/Shi-scid,IL-2RγKO(NOG)-Maus, bei der sowohl die funktionsfähigen T-Zellen als auch die funktionsfähigen B-Zellen deletiert sind, die Makrophagenfunktion reduziert ist, die NK-Zellen oder die NK-Aktivität eliminiert sind und die Funktion der dentritischen Zellen reduziert ist.
  2. NOG-Maus nach Anspruch 1, bei der transplantierte humane Stammzellen sich effizient differenzieren und proliferieren, ohne eliminiert zu werden, mit der Maßgabe, daß die humanen Stammzellen keine humanen embryonalen Stammzellen sind.
  3. NOG-Maus nach Anspruch 2, wobei die humanen Stammzellen humane hämatopoietische Stammzellen sind.
  4. Stammzelltestverfahren, bei dem man der Maus nach einem der Ansprüche 1 bis 3 humane Stammzellen transplantiert, die Maus tötet, die humanen Stammzellen aus der Maus sammelt und die differenzierten und proliferierten Zellen von den transplantierten humanen Stammzellen analysiert, mit der Maßgabe, daß die humanen Stammzellen keine humanen embryonalen Stammzellen sind.
  5. Stammzelltestverfahren nach Anspruch 4, bei dem man die Differenzierung und Proliferation von T-Zellen und B-Zellen analysiert.
  6. Verfahren zum Proliferieren von humanen Stammzellen, bei dem man: der Maus nach einem der Ansprüche 1 bis 3 die humanen Stammzellen transplantiert und dort proliferiert, die Maus tötet, die humanen Stammzellen aus dem Knochenmark der Maus sammelt und wiederholt der Maus nach einem der Ansprüche 1 bis 3 die humanen Stammzellen transplantiert, mit der Maßgabe, daß die humanen Stammzellen keine humanen embryonalen Stammzellen sind.
  7. Verfahren zum Proliferieren von humanen Stammzellen nach Anspruch 6, wobei die Häufigkeit der Wiederholung wenigstens dreimal beträgt.
  8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die humane Stammzelle ein darin eingebrachtes Fremdgen aufweist.
  9. Modellmaus für einen humanen Tumor, wobei die Maus eine Maus nach einem der Ansprüche 1 bis 3 ist und eine humane Tumorzelle enthält.
  10. Modellmaus für einen humanen Tumor nach Anspruch 9, wobei die humane Tumorzelle von HTLV-1-Leukämie abgeleitet ist.
  11. Modellmaus für einen humanen Tumor nach Anspruch 9 oder 10, wobei die Maus die humane Tumorzelle an einer Auricula davon aufweist.
  12. Verfahren zur Herstellung einer Modellmaus für einen humanen Tumor, bei dem man der Maus nach einem der Ansprüche 1 bis 3 humane Tumorzellen transplantiert und diese Maus vor der Analyse tötet.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die humanen Tumorzellen von HTLV-1-Leukämie abgeleitet sind.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, bei dem die humanen Tumorzellen an eine Auricula der Maus transplantiert werden.
  15. Virusinfizierte Modellmaus, wobei die Maus eine Maus nach einem der Ansprüche 1 bis 3 ist und eine sowohl mit einem T-trogen Virus als auch mit einem Makrophagen-trogen Virus infizierte T-Zelle enthält.
  16. Virusinfizierte Modellmaus nach Anspruch 15, wobei das Virus HIV ist.
  17. Virusinfizierte Modellmaus nach Anspruch 15, wobei das Virus HTLV-1 ist.
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