JP5073836B2 - ヒト肝細胞が移植されたマウス - Google Patents

Description

本発明は、ヒトの肝細胞が移植されたマウスであって、チミジンキナーゼ遺伝子がその肝臓において発現可能に保持され、グアノシンアナログ、及び、ヒトより単離された肝細胞が投与されたマウスに関する。さらに、本発明は、ヒトの肝細胞が移植されたマウスであって、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子がその肝臓において発現可能に保持され、ヒトより単離された肝細胞が投与されたＮＯＧマウスに関する。また、ヒトの肝細胞が移植されたマウスの作製方法であって、チミジンキナーゼ遺伝子がその肝臓において発現可能に保持されるマウスにグアノシンアナログ、及び、ヒトより単離された肝細胞を投与することを含む作製方法に関する。前記のこれらのマウスを用いて被験物質の血漿中動態を測定する方法、被験物質の代謝物を同定する方法、及び、被験物質の代謝速度を測定する方法に関する。さらに、前記のこれらのマウスに肝指向性病原体を感染させたマウスモデル、当該マウスモデルを使用した肝指向性病原体に対する薬剤及びワクチンのスクリーニング方法に関する。

ヒトに特異的な肝炎ウイルスの感染や、投与された薬剤の代謝、又は、ヒト肝臓の増殖を解析することを目的とする、ヒト肝細胞を保持する免疫寛容マウスがいくつかのグループによってこれまでに作出されてきている。これらのマウスはウロキナーゼ型・プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）のトランス遺伝子がその肝臓中で発現するように保持された免疫不全マウスにヒトの肝細胞が移植されたものである。こうしたマウスにはヒトに特異的な肝炎ウイルスが感染できることが知られている（非特許文献１及び２）。また、こうしたマウスから由来する肝細胞はヒト肝臓において見出される酵素を発現し（非特許文献３）、被験物質からヒトに特異的な代謝物が生成される（非特許文献４）ことが知られている。
ヒト肝細胞の置換率が５０％程度と低く、ヒト肝細胞の移植後生存期間が５０日程度のマウスであっても、上記のような肝炎ウイルスの感染試験等の一定の目的には利用できることが知られている（特許文献１及び２）。一方、例えばヒトの治療用薬剤の血漿中動態やその代謝物を測定するという目的のためには、宿主動物由来の肝細胞による影響を可能な限り排除する必要があることから、ヒト肝細胞の置換率の上昇が求められていた。ところが、ｕＰＡトランス遺伝子は肝細胞の増殖に重要なマトリックスメタロプロテアーゼの活性を調節するプラスミノーゲンを活性化するため、ｕＰＡトランス遺伝子の発現はそれ自身、肝幹細胞に対して持続的かつ進行性の傷害を引き起こす。そのため、ｕＰＡトランス遺伝子のホモ接合体の胎生致死率は３０％と高く、また肝細胞の移植時期も５〜１７日齢と制限が認められる（特許文献１）上に、ヘテロ接合体での系統の維持を行った上で得られたホモ接合体を致死に至らしめないためにラットの肝細胞の移植等の処置が必要であり（特許文献２）、その系統の維持には煩雑な作業が必要であるとともに所望の特性を有するマウスを作出する頻度も極めて低頻度であった。また、腎傷害や低繁殖率等の副作用が多いことが知られている。そのため、宿主の成育を促進しヒト肝細胞の置換率を上昇させる試みとして、宿主のマウスに対してヒト補体からの攻撃防御のための薬剤を投与したり（特許文献３）、ヒト成長ホルモンを投与したり（特許文献４）する試みが行われてきている。また、拒絶反応に関わるマウスのＮＫ細胞を除去する抗体である抗アシアロＧＭ１抗体をヒト肝細胞の移植前日に投与することによりヒト肝細胞の置換率を上昇させる試みも実施されている。こうしたマウスにおけるヒト肝細胞の置換率は７０％程度に留まっていることが知られている。
最近、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（Ｆａｈ）ノックアウトマウス（Ｆａｈ^−／−／Ｒａｇ２^−／−／ＩＩ２ｒｇ^−／−）（ＦＲＧマウス）を宿主としたキメラマウスが作出された（非特許文献４）。しかし、アデノウイルス自身には種特異性がないためマウス中のその残存によるヒト肝細胞に対する傷害の可能性が考えられる。事実、ＦＲＧマウスのヒト血清アルブミンのレベルはＦＲＧマウスにおけるヒトの肝細胞の置換レベルから期待される値と比較して低く、ヒトの肝細胞に特異的な薬剤代謝酵素のいくつかの遺伝子はＦＲＧマウスにおけるヒトの肝細胞の置換レベルから期待されるレベルでの発現が観察されなかった（非特許文献５）。

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Ｄａｎｄｒｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（２００５）４２，５４−６０ Ｔａｔｅｎｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００４）１６５，９０１−９１２ Ｋａｔｏｈ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（２００７）９６，４２８−４３７ Ａｚｕｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７）２５，９０３−９１０ Ｓｈａｆｒｉｔｚ，ＤＡ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７）２５，８７１−８７２ Ｓａｎｄｇｒｅｎ，ＥＰ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（１９９１）６６，２４５−２５６

本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、ヒトの肝細胞が移植されたマウスであって、チミジンキナーゼ遺伝子がその肝臓において発現可能に保持され、グアノシンアナログ、及び、ヒトより単離された肝細胞が投与されたマウス、当該マウスの作製方法、ヒトの肝細胞が移植されたマウスであって、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化遺伝子がその肝臓において発現可能に保持され、ヒトより単離された肝細胞が投与されたＮＯＧマウス、前記のこれらのマウスを用いて被験物質の血漿中動態を測定する方法、当該マウスを用いて被験物質の代謝物を同定する方法、当該マウスを用いて被験物質の代謝速度を測定する方法、前記のこれらのマウスに肝指向性病原体を感染させたマウスモデル、当該マウスモデルを使用した肝指向性病原体に対する薬剤及びワクチンのスクリーニング方法を提供することにある。
本明細書はより具体的には、以下の発明；
［１］ 外来チミジンキナーゼ遺伝子がその肝臓において特異的に発現可能に保持され、マウスの肝細胞がヒトの肝細胞に置換された、ヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［２］ 肝臓がヒト肝臓の３次元構造又は機能を有している［１］のヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［３］ チミジンキナーゼ遺伝子が、ヒト単純ヘルペスウイルス１型―チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である［１］又は［２］のヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［４］ マウスの肝細胞の７５％以上がヒトの肝細胞に置換された［１］から［３］のいずれかのヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［５］ マウスの肝細胞の８０％以上がヒトの肝細胞に置換された［１］から［３］のいずれかのヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［６］ マウスの肝細胞の９０％以上がヒトの肝細胞に置換された［１］から［３］のいずれかのヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［７］ マウスの肝細胞の９５％以上がヒトの肝細胞に置換された［１］から［３］のいずれかのヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［８］ マウスが免疫不全マウスである［１］から［７］のいずれかのヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［９］ 免疫不全マウスがＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、ＲＡＧ−２とＩＬ−２Ｒγｃを欠損するｄＫＯマウス（ＲＡＧ−２ ＫＯ、ＩＬ−２Ｒ^ｎｕｌｌ）、又はＮＯＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ^ｎｕｌｌ）マウスである［８］のヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［１０］ ＲＡＧ−２とＩＬ−２Ｒγｃを欠損するｄＫＯマウスが、Ｂａｌｂ／ｃ ｄＫＯマウス（ＲＡＧ−２ ＫＯ、ＩＬ−２Ｒ^ｎｕｌｌ）、又はＮＯＤ ｄＫＯマウス（ＲＡＧ−２ ＫＯ、ＩＬ−２Ｒ^ｎｕｌｌ）である［９］のヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［１１］ ヒトより単離された肝細胞がヒト肝細胞株である［１］から［１０］のいずれかのヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［１２］ ヒト肝細胞株が、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、又はＨｕＨ−７である［１１］のヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［１３］ ヒトより単離された肝細胞が初代培養された肝細胞である［１］から［１０］のいずれかのヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［１４］ チミジンキナーゼ遺伝子がアルブミンプロモーター、ＬＳＴ−１ プロモーター、αフェトプロテインプロモーター、又はα−ＴＴＰプロモーターの制御下に配置されることによりチミジンキナーゼ遺伝子がその肝臓において特異的に発現可能に保持される［１］から［１３］のいずれかのヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［１５］ ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子がその肝臓において特異的に発現可能に保持され、マウスの肝細胞がヒトの肝細胞に置換された、ヒトの肝細胞が移植されたＮＯＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ^ｎｕｌｌ）変異を有するマウス、
［１６］ ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子がマウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子である［１５］に記載のマウス、
［１７］ マウスの肝細胞の７５％以上がヒトの肝細胞に置換された［１５］又は［１６］のヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［１８］ マウスの肝細胞の８０％以上がヒトの肝細胞に置換された［１５］又は［１６］のヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［１９］ マウスの肝細胞の９０％以上がヒトの肝細胞に置換された［１５］又は［１６］のヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［２０］ マウスの肝細胞の９５％以上がヒトの肝細胞に置換された［１５］又は［１６］のヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［２１］ ヒトより単離された肝細胞がヒト肝細胞株である［１５］から［２０］のいずれかのヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［２２］ヒト肝細胞株が、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、又はＨｕＨ−７である［２１］のヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［２３］ ヒトより単離された肝細胞が初代培養された肝細胞である［１５］から［２０］のいずれかのヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［２４］ ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子がアルブミンプロモーター、ＬＳＴ−１プロモーター、αフェトプロテインプロモーター、又はα−ＴＴＰプロモーターの制御下に配置されることによりウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子がその肝臓において特異的に発現可能に保持される［１５］から［２３］のいずれかのヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［２５］ マウスの肝細胞がヒトの肝細胞に置換された、ヒトの肝細胞が移植されたＮＯＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ^ｎｕｌｌ）変異を有するマウス、
［２６］ ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子及び外来チミジンキナーゼ遺伝子がその肝臓において特異的に発現可能に保持された［２４］のマウス、
［２７］ ヒトの肝細胞が移植され、マウスの肝細胞がヒトの肝細胞に置換されたマウスの作製方法であって、マウスにチミジンキナーゼ遺伝子を肝臓において特異的に発現可能に保持されるように導入し、該マウスに自殺基質、及びヒトより単離された肝細胞を投与し、マウス肝細胞を傷害しマウス肝細胞をヒト肝細胞で置換することを含む、ヒトの肝細胞が移植されたマウスの作製方法、
［２８］ チミジンキナーゼ遺伝子が、ヒト単純ヘルペスウイルス１型―チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である［２７］のヒトの肝細胞が移植されたマウスの作製方法、
［２９］ 自殺基質がチミジンキナーゼにより毒性物質に代謝される物質である［２７］又は［２８］のヒトの肝細胞が移植されたマウスの作製方法、
［３０］ 代謝される物質がアシクロビル、又はガンシクロビルである［２９］のヒトの肝細胞が移植されたマウスの作製方法、
［３１］ マウスが免疫不全マウスである［２７］から［３０］のいずれかのヒトの肝細胞が移植されたマウスの作製方法、
［３２］ 免疫不全マウスがＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、ＲＡＧ−２とＩＬ−２Ｒγｃを欠損するｄＫＯマウス（ＲＡＧ−２ ＫＯ、ＩＬ−２Ｒ^ｎｕｌｌ）、又はＮＯＧマウスである［３１］のヒトの肝細胞が移植されたマウスの作製方法、
［３３］ ヒトより単離された肝細胞がヒト肝細胞株である［２７］から［３２］のいずれかのヒトの肝細胞が移植されたマウスの作製方法、
［３４］ ヒト肝細胞株が、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、又はＨｕＨ−７である［３３］の方法、
［３５］ ヒトより単離された肝細胞が初代培養された肝細胞である［２７］から［３２］のいずれかのヒトの肝細胞が移植されたマウスの作製方法、
［３６］ チミジンキナーゼ遺伝子がアルブミンプロモーター、ＬＳＴ−１プロモーター、αフェトプロテインプロモーター、又はα−ＴＴＰプロモーターの制御下に配置されることによりチミジンキナーゼ遺伝子がその肝臓において特異的に発現可能に保持されることを特徴とする［２７］から［３５］のいずれかのヒトの肝細胞が移植されたマウスの作製方法、
［３７］ ［２７］から［３６］のいずれかの方法で得られたヒトの肝細胞が移植されたマウス、
［３８］ ［１］から［２６］及び［３７］のいずれかのマウスを用いて被験物質の血漿中動態を測定する方法、
［３９］ ［１］から［２６］及び［３７］のいずれかのマウスを用いて被験物質の代謝物を同定する方法、
［４０］ ［１］から［２６］及び［３７］のいずれかのマウスから単離された肝細胞を用いて被験物質の代謝物を同定する方法、
［４１］ ［１］から［２６］及び［３７］のいずれかのマウスを用いて被験物質の代謝速度を測定する方法、
［４２］ 以下の工程；
（ｉ） ［１］から［２６］及び［３７］のいずれかのマウスを作製する工程；及び
（ｉｉ） ヒトＨＣＶを（ｉ）に記載のマウスに接種する工程；
を含む、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が感染したマウスを作製する方法、
［４３］ ［４２］の方法で作製されるヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が感染したマウス、
［４４］ 以下の工程；
（ｉ） ［１］から［２６］及び［３７］のいずれかのマウスにヒトＨＣＶを投与する工程；及び
（ｉｉ） 宿主内でヒトＨＣＶの複製が起こる十分な期間をおいた後にヒトＨＣＶを感染宿主から単離する工程；
を含む、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の培養方法、
［４５］ 以下の工程；
（ｉ） ［１］から［２６］及び［３７］のいずれかのマウスに候補薬剤を投与する工程；及び
（ｉｉ） 候補薬剤がＨＣＶ感染に及ぼす作用を分析する工程であって、未投与のマウスに対する、又は候補薬剤投与前のマウスにおける感染量に対するヒトＨＣＶの感染量の低下が、該薬剤の抗ＨＣＶ活性を意味する工程；
を含む、抗ＨＣＶ活性を有する候補薬剤をスクリーニングする方法、
［４６］ 候補薬剤をヒトＨＣＶの感染前に投与する、［４５］の方法、
［４７］ 抗ＨＣＶ活性を有する候補薬剤が抗ＨＣＶ抗体又はそのＨＣＶ結合性断片である、［４５］又は［４６］の方法、
［４８］ 以下の工程；
（ｉ） ［１］から［２６］及び［３７］のいずれかのマウスの免疫を再構成する工程；
（ｉｉ） （ｉ）のマウスに候補ワクチンを投与する工程；及び
（ｉｉｉ） 該ワクチンがＨＣＶ感染に及ぼす作用を分析する工程であって、未投与のマウスに対する、又は該ワクチン投与前のマウスにおける感染量に対するヒトＨＣＶの感染量の低下が、該ワクチンの抗ＨＣＶ活性を意味する工程；
を含む、能動免疫療法に用いる抗ＨＣＶ活性を有する候補ワクチンをスクリーニングする方法、
［４９］ 以下の工程；
（ｉ） ［１］から［２６］及び［３７］のいずれかのマウスの免疫を再構成する工程；
（ｉｉ） （ｉ）のマウスに治療用ワクチン接種用の候補ワクチンを投与する工程；及び
（ｉｉｉ） 該ワクチンがＨＣＶ感染に及ぼす作用を分析する工程であって、未投与のマウスに対する、又は該ワクチン投与前のマウスにおける感染量に対するヒトＨＣＶの感染量の低下が、該ワクチンの抗ＨＣＶ活性を意味する工程；
を含む、抗ＨＣＶ活性を有する治療用ワクチン接種用の候補ワクチンをスクリーニングする方法、
［５０］ ［１］から［２６］及び［３７］のいずれかのマウスを用いて肝幹細胞を探索する方法であって、マウスに生着した肝組織から肝幹細胞を同定することを含む方法、
［５１］ ［１］から［２６］及び［３７］のいずれかのマウスを用いて肝幹細胞を含む細胞集団を採取する方法であって、マウスに生着した肝組織から肝幹細胞を含む細胞集団を採取することを含む方法、
［５２］ ［１］から［２６］及び［３７］のいずれかのマウスを用いて再構築されたヒト肝臓組織、
［５３］ チミジンキナーゼ遺伝子および／またはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子がその肝臓において発現可能に保持され、ヒト肝細胞を肝臓に生着させることができるマウス、
［５４］ チミジンキナーゼ遺伝子が単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼである、［５３］のマウス、
［５５］ マウスが免疫不全マウスである、［５３］または［５４］のマウス、
［５６］ 免疫不全マウスがＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、ＲＡＧ−２とＩＬ−２Ｒγｃを欠損するｄＫＯマウス（ＲＡＧ−２ ＫＯ、ＩＬ−２Ｒ^ｎｕｌｌ）、又はＮＯＧ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ^ｎｕｌｌ）マウスである、［５５］のマウス、並びに
［５７］ ＲＡＧ−２とＩＬ−２Ｒγｃを欠損するｄＫＯマウスが、Ｂａｌｂ／ｃ ｄＫＯマウス（ＲＡＧ−２ ＫＯ、ＩＬ−２Ｒ^ｎｕｌｌ）、又はＮＯＤ ｄＫＯマウス（ＲＡＧ−２ ＫＯ、ＩＬ−２Ｒ^ｎｕｌｌ）である、［５６］のマウス、
を提供する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００９−００８０９７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

図１は、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＵＬ２３又はＨＳＶｔｋ）遺伝子発現ユニットの構造を示す図である。
図２は、ＴＫ−ＮＯＧマウスのトランスジーンの制限地図と構造、および、実施例で用いたプローブの位置を示す図である。
図３は、ヒト肝細胞を移植したＴＫ−ＮＯＧマウスの血清中のヒトアルブミン濃度を示す図である。
図４は、ヒト肝細胞を移植したＴＫ−ＮＯＧマウスの血清中のタンパク質を示す図である。
図５は、ヒト肝細胞を移植したＴＫ−ＮＯＧマウスの肝臓で発現したｍＲＮＡを示す図である。
図６は、ヒト肝細胞を移植したＴＫ−ＮＯＧマウスの肝臓の組織学と免疫組織染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）の結果を示す図である。
図７は、ＣＦＤＡを投与した、ヒト肝細胞を移植したＴＫ−ＮＯＧマウスの肝臓における毛細胆管（ＢＣ）へのカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）の排出を示す図である。
図８は、ＣＦＤＡを投与した、ヒト肝細胞を移植したＴＫ−ＮＯＧマウスの肝臓におけるヒトの肝細胞の移植の５２日後に得た、２匹の異なったＴＫ−ＮＯＧマウスの肝臓ｈ−ＣＫ８／１８免疫組織染色の結果を示す図である。
図９は、ＣＦＤＡを投与した、ヒト肝細胞を移植したＴＫ−ＮＯＧマウスにおける糞へのＣＦ分泌量を示す図である。
図１０は、ＣＦＤＡを投与した、ヒト肝細胞を移植したＴＫ−ＮＯＧマウスにおける胆汁のＣＦ代謝産物の存在を示す図である。
図１１は、ＣＦＤＡを投与した、ヒト肝細胞を移植したＴＫ−ＮＯＧマウスにおける胆汁のマウス及びヒトトランスフェリンの解析結果を示す図である。
図１２は、ヒト肝細胞を移植したＴＫ−ＮＯＧマウスから得た肝臓切片のＨ＆Ｅ及びグルタミン合成酵素（ＧＳ）の免疫組織染色を示す図である。
図１３は、ＨＳＶｔｋ発現ユニットの染色体上の位置を示す図である。
図１４は、ＴＫ−ＮＯＧマウスのトランスジーンの分子分析の結果を示す図である。
図１５は、ＨＳＶｔｋトランスジーン発現のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図である。
図１６は、ガンシクロビル（ＧＣＶ）投与ＴＫ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ ＨＳＶｔｋ）及び非トランスジェニックＮＯＧマウス（ＮＴｇ）における、血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の活性を示す図である。
図１７は、ガンシクロビル（ＧＣＶ）投与ＴＫ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ ＨＳＶｔｋ）の肝臓を示す図である。
図１８は、ＧＣＶを投与した、ヒトの肝細胞を移植したＴＫ−ＮＯＧマウスの血清ヒトアルブミン濃度を示す図である。
図１９は、ＧＣＶを投与した、ヒトの肝細胞を移植したＴＫ−ＮＯＧマウスにおけるヒト血清アルブミン濃度と置換インデックス（ＲＩ）の間の相関関係を示す図である。
図２０は、ＧＣＶを投与した、ヒトの肝細胞を移植しヒト肝細胞が再増殖したＴＫ−ＮＯＧマウスにおけるヒトの遺伝子発現を示す図である。
図２１は、ＧＣＶを投与した、ヒトの肝細胞を移植しヒト肝細胞が再増殖したＴＫ−ＮＯＧマウスにおける腎臓の組織病理学解析の結果を示す図である。
図２２は、ヒトの肝細胞を移植しヒト肝細胞が再増殖したＴＫ−ＮＯＧマウスの肝臓のマウスアルブミン及びヒトアルブミン染色の免疫蛍光２重染色の結果を示す図である。
図２３は、ヒトの肝細胞を移植しヒト肝細胞が再増殖したＴＫ−ＮＯＧマウスにおけるクローン増殖性ヒト肝細胞コロニーの顕微解剖の結果を示す図である。
図２４は、ヒトとマウスの肝細胞の区別のためのＰＣＲ分析の結果を示す図である。
図２５は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）遺伝子発現ユニットの構造を示す図である。
図２６は、ｕＰＡ−ＮＯＧマウスのトランスジーンの制限地図と構造、および、実施例で用いたプローブの位置を示す図である。
図２７は、ｕＰＡトランスジーン発現のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図である。
図２８は、ヘミ接合型（Ｔｇ／＋）及びホモ接合型（Ｔｇ／Ｔｇ）トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウスにおける、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の活性を示す図である。
図２９は、ホモ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／Ｔｇ）肝臓の肉眼像及び肝細胞傷害像を示す図である。図２９のスケールバーは１００μｍである。Ｐは門脈路を示し、Ｃは中心静脈を示す。
図３０は、ｕＰＡ−ＮＯＧマウスに導入されたｕＰＡトランスジーンのサザンブロット法による分子解析の結果を示す図である。
図３１は、ヒトの肝細胞を移植したヘミ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／＋）及びホモ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／Ｔｇ１）の肝臓肉眼像を示す図である。
図３２は、ｕＰＡ−ＮＯＧマウスの血清ヒトアルブミン濃度の推移と体重変化を示す図である。
図３３は、マウス血清、ヒト血清、ヒト肝細胞が移植されたヘミ接合型（Ｔｇ／＋）及びホモ接合型（Ｔｇ／Ｔｇ１及び２）トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウスの血清を免疫ブロット法により解析した結果を示す図である。
図３４は、ヒト肝細胞が移植されたホモ接合型（Ｔｇ／Ｔｇ１及び２）トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス肝臓の組織学と免疫組織染色の結果を示す図である。
図３５は、ヒト化肝臓を有するマウス生体内でのＤｅｂｒｉｓｏｑｕｉｎ及びＳ−Ｗａｒｆａｒｉｎｅの代謝を表す。
図３６は、ヒト化肝臓を有するマウスにおけるＫｉ−６７抗原を発現するヒト増殖性肝細胞の検出を表す。
図３７は、ＴＫ−Ｂａｌｂ／ｃ ｄＫＯマウス及びＮＯＤ ｄＫＯマウスにおける、ヒトサイトケラチン８／１８抗体にて染色されるヒト肝細胞の生着を示す。

以下、本発明を詳細に説明する。
本願発明において開示される、チミジンキナーゼは元来生体内においてチミジンをリン酸化してチミジル酸を合成する酵素活性を有するが、正常な細胞中では律速段階となっており殆ど検出されない。そのため、チミジンキナーゼによって代謝されることにより毒性を奏する自殺基質は、チミジンキナーゼのトランス遺伝子が導入され、チミジンキナーゼ活性を有する細胞に対してのみ細胞毒性を発揮することから標的細胞のみに細胞傷害を与える選択的治療剤として用いられている。このような自殺基質として、グアノシンアナログが好適に使用され得る。より好ましくは、そのようなグアノシンアナログとして、抗ウイルス薬として汎用されているガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ；ＧＣＶ）、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）が好適に挙げられる。
例えば、ガンシクロビルはウイルスが固有に有する酵素であるチミジンキナーゼによるリン酸化を受け、更に、ヒト細胞内にある内在性酵素であるグアニル酸キナーゼとチミジンキナーゼにより、最終的に活性型ガンシクロビル−三リン酸に代謝される。活性型ガンシクロビル−三リン酸は、ウイルスＤＮＡポリメラーゼの基質であるデオキシグアノシン−三リン酸（ｄＧＴＰ）と競合的に拮抗することによって、ＤＮＡポリメラーゼを阻害する。したがってウイルスに感染した感染細胞内のウイルス複製のみが阻害される。同様のメカニズムにより、ＨＳＶ−ｔｋトランス遺伝子が導入されたリンパ球においても、ガンシクロビルが活性化を受け、ＤＮＡ合成が阻害されることにより、当該細胞が選択的に死滅する機序が明らかとされている。
本発明においては、外来のチミジンキナーゼ遺伝子をマウス肝臓で特異的に発現するように導入する。本発明において使用されるチミジンキナーゼ遺伝子の由来する生物種は、ヒトや哺乳類であってもよいし、さらに原核細胞やウイルスであってもよく、その由来する生物種には制限されない。本発明において、チミジンキナーゼの一具体的態様として用いられるチミジンキナーゼとしては、ヒト単純ヘルペスウイルス１型―チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）が好適に挙げられる。例えば、ガンシクロビルを複数の細胞群に投与したときにＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を発現する細胞のみが死滅する。このため、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子は一般的に「自殺遺伝子」と呼ばれている。本願発明においては、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子とは例えば配列番号１で示されるポリヌクレオチド配列で表される遺伝子をいうが、これに限定されない。
１つのアミノ酸をコードするコドンは複数存在することが知られている。従って、例えば配列番号１で示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列又はその酵素活性部分をコードするものであれば、いずれのポリヌクレオチド配列も本発明のマウスに利用することができる。一般に、チミジンキナーゼ等の酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列が多少変更された場合、即ち、当該アミノ酸配列の中の１又は複数のアミノ酸が置換され若しくは欠失し、あるいは１又は複数のアミノ酸が付加された場合でも当該ポリペプチドの酵素活性が維持される場合があることは周知の事実である。例えば、変異体は保存的に置換された配列を含んでいてもよく、これは、特定のアミノ酸残基が類似の物理化学的特徴を有する残基によって置き換えられていてもよいことを意味している。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａ相互の置換の如き脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、又はＬｙｓとＡｒｇ間の置換の如き極性基含有アミノ酸残基の間の置換が含まれる。したがって、例えば配列番号１で示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列又はその酵素活性部分において、このような修飾が加えられ、かつチミジンキナーゼの酵素活性を有するチミジンキナーゼの変異体をコードするＤＮＡも本発明のマウスに用いることができる。
アミノ酸の付加、欠失又は置換による変異体は、例えばそれをコードするＤＮＡに例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ．６４８７−６５００，１９８２参照）を施すことにより好適に作製され得る。本明細書において「１又は複数のアミノ酸」とは、部位特異的変異誘発法により付加、欠失又は置換できる程度の数のアミノ酸をいい、好ましくは１又は数個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個若しくは２個をいう。部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように実施され得る。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いてファージにより相補的な鎖として合成された二重鎖ＤＮＡで宿主細胞が形質転換される。形質転換された細菌の培養物が寒天に播種され、ファージを含有する単一細胞からプラークが形成される。理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するファージを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、元の鎖を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークがキナーゼ処理により標識した合成プローブとハイブリダイズされる。次に該プローブとハイブリダイズするプラークからＤＮＡが回収される。
なお、酵素のアミノ酸配列にその活性を喪失せしめない１又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異原で処理する方法及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加又は置換し、次いで連結する方法も好適に挙げられる。
さらに、例えば本明細書に開示した配列番号１に記載されるチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチド配列に温和な又は苛酷なストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的に活性なチミジンキナーゼをコードする単離されたＤＮＡ及びＲＮＡも本発明のマウスに利用することができる。温和なストリンジェンシーによるハイブリダイゼーションの条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ ｅｄ．Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１．１０１−１０４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載された条件を意味する。Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより定義されているように、温和なストリンジェンシーの条件には、５×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ，１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄用溶液と約５５℃，５×ＳＳＣ，一晩のハイブリダイゼーション条件が挙げられる。苛酷なストリンジェンシーの条件には、より高温のハイブリダイゼーションと洗浄が含まれる。その際、プローブの長さ等の各種要因に応じて温度及び洗浄溶液の塩濃度は適宜調節され得る。例えば、５×ＳＳＣ以下で２０℃以上の範囲の条件が好適に挙げられる。
さらに、配列番号１に記載されるチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチド配列とＢＬＡＳＴ等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性を有しており、かつ生物学的に活性なチミジンキナーゼをコードする単離されたＤＮＡ及びＲＮＡも本発明のマウスに利用することができる。
「チミジンキナーゼ遺伝子がマウスの肝臓において発現可能に保持される」とは、上記のチミジンキナーゼ遺伝子がマウスの肝細胞に含まれ、該細胞中で発現することをいう。
本発明のチミジンキナーゼ遺伝子がマウスの肝臓において発現可能にするために、肝臓において機能している調節遺伝子が適宜使用され得る。当該調節遺伝子としては、肝細胞で機能しているタンパク質をコードしている遺伝子の調節遺伝子が好適に使用される。ここで「調節遺伝子」とは、遺伝子転写効率の増減に働くＤＮＡ上の配列をいい、プロモーター、並びに、エンハンサー、上流活性化配列、サイレンサー、上流抑制配列、及びアテニュエーター等が含まれるが、これらに限定されない。前記調節遺伝子の由来する生物種は、特定の生物種に限定されるものではない。マウスの肝臓においてより適切に発現可能とするために、マウス由来の調節遺伝子が好適に使用され得る。
上記のプロモーターとしては、チミジンキナーゼ遺伝子が肝臓で発現されるプロモーターであれば特に限定されない。例えば、アルブミンのプロモーター、有機アニオントランスポーターＬＳＴ−１のプロモーター、αフェトプロテインのプロモーター、α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）遺伝子のプロモーターなどが例示できる。
肝臓特異的に発現する遺伝子の発現機構（遺伝子のプロモーター解析）は非常に良く研究されている。すなわち、肝臓特異的に発現する遺伝子の転写開始点の５’上流域に、遍在性の転写調節因子の結合部位や肝臓に豊富に存在する肝臓特異的転写因子の結合部位、ホルモンなどの細胞外刺激に応答する上流活性化配列が、比較的狭い領域に詰め込まれていることが知られている。こうした転写因子の例として、ＨＮＦ−１、ＨＮＦ−３、ＨＮＦ−４、ＨＮＦ−６、Ｃ／ＥＢＰ、ＤＢＰ等が好適に挙げられる。本発明においては、チミジンキナーゼ遺伝子がマウスの肝臓において発現可能に保持されるために、マウスの肝臓で機能する上流活性化配列にチミジンキナーゼ遺伝子が連結される。
したがって、例えば上述のアルブミンのプロモーター、有機アニオントランスポーターＬＳＴ−１のプロモーター、αフェトプロテインのプロモーター、α−トコフェロール輸送タンパク質（α−ＴＴＰ）遺伝子のプロモーター領域の一定の領域が上述した連結に用いられることにより潜在的に含まれる肝臓特異的な転写因子の結合する上流活性化配列が使用され得る。また、別の態様では、既にその配列が同定された肝臓特異的な上流活性化配列が外来性の遺伝子として遺伝子組換え手法により好適に組み込まれ得る。
また、プロモーターからの転写レベルを増大させるエンハンサーとしては、上流活性化配列だけでなく転写開始点より下流にも存在することが明らかとなっている。例えば、５’上流１．３ｋｂ及び３’下流領域を含む全長１４ｋｂのヒトアンギオテンシノーゲン遺伝子を持つトランスジェニックマウスにおいて、肝臓で当該遺伝子の高い発現が認められている。さらに、ヒト肝臓癌由来のＨｅｐＧ２細胞において、前記遺伝子の転写開始点より下流領域である３．８ｋｂのＤＮＡ断片にエンハンサーの存在が確認された。本発明において、チミジンキナーゼ遺伝子を肝臓特異的に発現させるためにそのようなエンハンサーも好適に使用され得る。
さらに、本発明において、チミジンキナーゼ遺伝子を肝臓特異的に発現させるためにポリＡ付加シグナルを含む３’非翻訳配列も好適に使用され得る。
本発明においては、チミジンキナーゼ遺伝子がマウスの肝臓において発現可能に保持されるために、マウスの肝臓で機能する上流活性化配列にチミジンキナーゼ遺伝子が連結される。さらにエンハンサーやポリＡ付加シグナルを含む３’非翻訳配列等が適宜好適に連結され得る。このように連結された遺伝子群は薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を含むベクターに挿入されることによって、チミジンキナーゼ遺伝子が宿主の肝臓において発現可能に保持するための遺伝子発現ユニットを調整する組込みベクターが作製される。
当該組込みベクターより調整された遺伝子発現ユニットが導入されたトランスジェニックマウスを作製することができる。例えば、トランスジェニックマウスは公知の方法に従って好適に作製され得る（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，７３８０−４）。
具体的には、目的のチミジンキナーゼ遺伝子が宿主の肝臓において発現可能に保持されるために作製された遺伝子発現ユニットが、マウスの全能細胞に導入される。遺伝子が導入される全能細胞としては、受精卵や初期胚のほか、多分化能を有するＥＳ細胞のような培養細胞等が好適に挙げられる。例えば、排卵誘発剤が投与されたメスのマウスに正常なオスのマウスを交配させることにより、当該遺伝子発現ユニットの導入が可能な受精卵が好適に回収され得る。マウス受精卵には一般に雄性前核へのマイクロインジェクションにより遺伝子発現ユニットが導入される。受精卵細胞の体外での培養の後に遺伝子発現ユニットの導入に成功したと考えられる細胞がスクリーニングされる。スクリーニングされた細胞は、代理母の卵管に移植され、その後トランスジェニックキメラマウスが誕生する。代理母としては、通常は、精管が切断されたオスと交配させて偽妊娠状態としたメスが使用される。
得られた複数の個体から体細胞及び生殖細胞中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別することによって、目的とするトランスジェニックマウスが作製され得る。より具体的には、後述する実施例記載の方法により作製され得る。
通常、マウスにヒトの肝細胞が移植される場合、異種細胞の移植に対する免疫反応によりヒトの肝細胞は拒絶されるため、本発明においてヒトの肝細胞が移植されるマウスとして、異種細胞の移植に対する免疫反応が不活化された免疫不全マウスが好適に使用され得る。このような免疫不全マウスは、全身にＸ線照射をすることによっても好適に製作し得る。他に好ましくは遺伝的にその免疫機能が欠損したマウスでもあり得る。免疫不全の動物の例としては、一般的に入手可能なヌードマウスやＳＣＩＤマウスにアシアロＧＭ１抗体やＴＭβ１を投与したマウス、さらにＸ線照射マウスなどが挙げられる。
本発明において、遺伝的にその免疫機能が欠損した免疫不全マウスとしては、Ｔ細胞、Ｂ細胞を持たないＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスやＲａｇ２ノックアウトマウスが好適に挙げられ得る。また、これらのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスやＲａｇ２ノックアウトマウスにＩＬ−２Ｒγノックアウトを掛け合わせたノックアウト動物（以下、ｄＫＯ（ダブルノックアウト）動物）も好適に使用され得る。例えば、ｄＫＯマウス（Ｒａｇ２ ＫＯ、ＩＬ−２Ｒ^ｎｕｌｌ）を用いることができる。本発明において、遺伝背景をＢａｌｂ／ｃとするｄＫＯマウスをＢａｌｂ／ｃ ｄＫＯマウス、遺伝背景をＮＯＤとするｄＫＯマウスをＮＯＤ ｄＫＯマウスという。更に、当該マウス中で認められるＮＫ細胞等の免疫細胞による影響を除外するために、前記の様にＳＣＩＤマウスにアシアロＧＭ１抗体が投与されて使用される態様の他に、本発明において使用される別の好適なマウスとして、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス由来でＩＬ−２受容体の共通γ鎖をノックアウトしたマウスであるＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ^ｎｕｌｌ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ，ＩＬ−２ＲγＫＯマウスともいう。以下、ＮＯＧマウスと指称される。「ＮＯＧ ｍｏｕｓｅ」は登録商標）（特許３７５３３２１号公報）を宿主として使用することも好適に挙げられる。ＮＯＧマウスにおいてはリンパ球の存在が認められないため、ＮＯＧマウスはＮＫ活性を示さず樹上細胞機能も欠損している。
本発明のチミジンキナーゼ遺伝子がその肝臓において発現可能に保持されたマウスとして、目的のチミジンキナーゼ遺伝子が宿主の肝臓において発現可能に保持するために設計された遺伝子が前記の免疫不全マウスの受精卵に導入された結果生じるトランスジェニックマウスが好適に挙げられる。その他、前記の免疫不全マウスと当該マウスの近交系であって免疫機能が欠損していないマウスの受精卵に当該遺伝子が導入された結果生じるトランスジェニックマウスとの交配の結果誕生する子孫から、免疫不全マウスの形質を保持し、かつ、目的のチミジンキナーゼ遺伝子が宿主の肝臓において発現可能に保持するものとして選択される免疫不全マウスも好適に使用され得る。さらに、前記の免疫不全マウスと当該マウスの近交系であって免疫機能が一部欠損するマウスの受精卵に当該遺伝子が導入された結果生じるトランスジェニックマウスとの交配の結果誕生する子孫から、免疫不全マウスの形質を保持し、かつ、目的のチミジンキナーゼ遺伝子が宿主の肝臓において発現可能に保持するものとして選択される免疫不全マウスも好適に使用され得る。より具体的には、ＮＯＧマウスとＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの受精卵に当該遺伝子が導入された結果生じるＮＯＤ／ＳＣＩＤトランスジェニックマウスとの交配の結果誕生する子孫から、ＮＯＧマウスの形質を保持し、かつ、目的のチミジンキナーゼ遺伝子が宿主の肝臓において発現可能に保持するものとして選択されるマウス、ＴＫ−ＮＯＧマウスとＢａｌｂ／ｃＡ ｄＫＯマウス（ＲＡＧ−２ ＫＯ、ＩＬ−２Ｒ^ｎｕｌｌ）を交配し、更にＢａｌｂ／ｃＡ ｄＫＯマウスと交配を繰り返すことで作製されるＴＫ−Ｂａｌｂ／ｃＡ ｄＫＯマウス（ＨＳＶ−Ｔｋ（＋）、ＳＣＩＤ ｗｉｌｄ、ＲＡＧ−２ ＫＯ、ＩＬ−２Ｒ^ｎｕｌｌ）、又は、ＴＫ−ＮＯＧマウスとＮＯＤ ｄＫＯマウス（ＲＡＧ−２ ＫＯ、ＩＬ−２Ｒ^ｎｕｌｌ）を交配し更にＮＯＤ ｄＫＯマウスと交配を繰り返すことで作製されるＴＫ−ＮＯＤ ｄＫＯマウス（ＨＳＶ−Ｔｋ（＋）、ＳＣＩＤ ｗｉｌｄ、ＲＡＧ−２ ＫＯ、ＩＬ−２Ｒ^ｎｕｌｌ）等が好適な例として挙げられ得る。本発明において、ＮＯＧマウスの形質を保持し、かつ、目的のチミジンキナーゼ遺伝子が宿主の肝臓において発現可能に保持するものとして選択されるマウスをＴＫ−ＮＯＧマウスという。
本発明のチミジンキナーゼ遺伝子がその肝臓において発現可能に保持されたマウスに対して前記のグアノシンアナログが投与されることにより、グアノシンアナログが当該マウスの肝細胞中において毒性物質に代謝される結果、当該マウスに肝傷害が生じる。前記グアノシンアナログの好適な例として挙げられるガンシクロビルは、マウスの肝細胞中においてガンシクロビル−三リン酸に代謝されマウスに肝傷害を引き起こす。当該マウスへのグアノシンアナログの投与方法は自由に選択され得る。例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、さらには皮膚上への塗布等が適宜選択され得る。これら通常の経路によりマウス体内に投与される他、給餌中に混合することによってもマウス体内に投与され得る。グアノシンアナログの投与量も限定されないが、０．１〜１０ｍｇ／Ｋｇ体重、好ましくは０．５〜１．５ｍｇ／Ｋｇ体重である。
上記の他、本発明のチミジンキナーゼ遺伝子がその肝臓において発現可能に保持されたマウスに対して肝傷害を引き起こす方法としては、前記のガンシクロビルの投与の他、四塩化炭素、Ｄ−ガラクトサミン、ピロロジンアルカロイド、又は２−アセチルアミノフルオレン等の公知の肝傷害誘発物質による処置や外科的肝切除等の外科的処置も好適に挙げられる。さらに、別の態様では、当該マウスに抗マウスＦａｓ抗体を投与することによってもマウスに肝傷害を引き起こすことが可能である。抗マウスＦａｓ抗体は、ヒトの肝細胞において発現するＦａｓ抗原には結合せず、マウスの肝細胞において発現するＦａｓ抗原に結合することによって、マウス肝細胞に特異的にアポトーシスを引き起こす。
さらに上記の他、本発明のチミジンキナーゼ遺伝子の代わりにウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子がその肝臓において発現可能に保持されたＮＯＧ変異を有するマウスも好適に用いられる。すなわちウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子が宿主の肝臓において発現可能に保持するために作製された遺伝子発現ユニットが前記のＮＯＧ変異を有するマウスの全能細胞に導入された結果生じるトランスジェニックマウスが好適に用いられる。ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子としては、例えば、配列番号４７に記載されるマウスのウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコードするポリヌクレオチド配列が使用され得る。その遺伝子発現ユニットの作製に際しては、前記のチミジンキナーゼ遺伝子を用いる方法と同様の方法が好適に用いられる。
さらに、チミジンキナーゼ遺伝子とウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子の両者がその肝臓において発現可能に保持されたＮＯＧ変異を有するマウスも好適に用いられる。チミジンキナーゼの作用により肝傷害が与えられる時期とウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の作用により肝傷害が与えられる時期を適宜選択することによって投与されたヒト肝細胞の生着を最適化することができる。
当該マウスは、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子がその肝臓において発現可能に保持されたマウスとウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子がその肝臓において発現可能に保持されたＮＯＧ変異を有するマウス等を適宜組み合わせて繁殖させ所望の形質、すなわちチミジンキナーゼ遺伝子とウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子の両者がその肝臓において発現可能に保持されかつＮＯＧ変異を有する子孫のマウスを選択する事によって好適に得られる。また、例えば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子が宿主の肝臓において発現可能に保持されるために作製された遺伝子発現ユニットが、チミジンキナーゼ遺伝子が宿主の肝臓において発現可能に保持されたマウスの全能細胞に導入する等の操作によっても作製され得る。
上述のようにマウスに肝傷害を引き起こすことにより、肝傷害を引き起こしたマウスの肝細胞に代わって、当該マウス中に移植されたヒトの肝細胞がマウスの肝臓に生着する。マウスの肝細胞が死滅するのとは反対に、マウス肝臓に生着したヒトの肝細胞が増殖することによりヒトの肝細胞が一定以上の数を占めるキメラマウスが作製される。当該キメラマウスとしてはマウス肝臓の５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上のマウス肝臓がヒトの肝細胞で占有されたマウスが好適に挙げられる。ヒトの肝細胞によって占有された割合は、実施例で好適に示されるように、ヒト及びマウスの肝細胞に特異的なマーカーを認識する抗体の染色像から算出する方法や、ヒト血清アルブミン等の血清マーカーの定量値から算出する方法が公知である。さらに、試験後のキメラマウスの肝臓は公知の方法で解剖検査することによって、より正確な置換率を確認することができる。細胞の置換率をＲＩ（Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｉｎｄｅｘ）と呼ぶ。本発明におけるヒトの肝細胞の置換率が決定される具体的態様として、本発明の実施例では組織免疫染色の切片におけるヒトのサイトケラチンＣＫ８／１８陽性肝細胞によって占有される割合によって決定される態様が記載されている。
本発明において、ヒトの肝細胞をマウスに移植する方法としては、マウスの脾臓を経由して肝臓へ移植する方法のほか、直接門脈から移植する方法も適宜採用され得る。また、腹腔内や静脈内に移植してもよい。一度に移植されるヒトの肝細胞の細胞数は１から２００００００（２ｘ１０^６）細胞の中から適宜選択され得る。
本発明の肝細胞は、血清（例えば、ウシ胎児血清）の存在下で維持（培養、継代、保存を含む）された通常の肝細胞、初代肝細胞、好ましくは株化された肝細胞が好適に使用され得る。移植に供するヒトの肝細胞としては、ヒト肝実質細胞を始めヒト肝臓中の細胞であればいかなる種類の細胞から由来する肝細胞も好適に使用され得る。通常の肝細胞が使用される場合には、被験体の肝組織から得られた肝細胞が好適に使用され得る。肝組織を採取する方法としては、手術の際の切除のほか、公知の方法である生検（バイオプシー）が好適に用いられる。肝生検とは細く長い針が皮膚の表面から直接肝臓に刺され、肝臓の組織を採取する方法をいう。通常、針が穿刺される部位は右胸下部の肋間である。術前に超音波検査装置を用いて穿刺部の安全性が確認された上で、穿刺部が消毒される。更に皮膚から肝臓の表面までが麻酔の対象となり、穿刺部の皮膚が小切開された後に穿刺針が穿刺される。さらに、市販の凍結ヒト肝細胞を用いることもできる。
初代肝細胞が使用される場合には、採取された肝臓又は肝組織から肝細胞が、灌流法又は浸透法等の公知技術を用いて氷冷したハンクス液等に分散された細胞懸濁液を遠心分離等により分画することによって適宜単離される。得られた肝細胞は、適宜ウシ血清が添加されたＷｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ等の培地で５％のＣＯ_２存在下、３７℃において２４時間培養される。さらに、３日毎に培地がＡＳＦ１０４培地（味の素）等に交換され１週間程度まで培養された細胞が使用され得る。培地にはＨＧＦやＥＧＦ等の細胞増殖因子が添加され得るほか、培養マトリックスや三次元培養等が適宜改変され得る。
株化された肝細胞が使用される場合には、肝細胞の種類は特に制限されないが、例えば、ＳＳＰ−２５，ＲＢＥ，ＨｅｐＧ２，ＴＧＢＣ５０ＴＫＢ，ＨｕＨ−６，ＨｕＨ−７，ＥＴＫ−１，Ｈｅｔ−１Ａ，ＰＬＣ／ＰＲＦ／５，Ｈｅｐ３Ｂ，ＳＫ−ＨＥＰ−１，Ｃ３Ａ，ＴＨＬＥ−２，ＴＨＬＥ−３，ＨｅｐＧ２／２．２．１，ＳＮＵ−３９８，ＳＮＵ−４４９，ＳＮＵ−１８２，ＳＮＵ−４７５，ＳＮＵ−３８７，ＳＮＵ−４２３，ＦＬ６２８９１，ＤＭＳ１５３等が好適に挙げられる。これらの細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；住所 １２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）などから入手され得る。例えば、Ｈｅｐ３Ｂ及びＨｅｐＧ２はＡＴＣＣにそれぞれＨＢ−８０６４及びＨＢ−８０６５の登録番号で、ＨｕＨ−７はＪＣＲＢ細胞バンクにＪＣＲＢ０４０３の登録番号で登録されている。
グアノシンアナログとヒト肝細胞は、同時にマウスに投与してもよいし、別々に投与してもよい。例えば、ヒト肝細胞を脾臓や静脈から移植したと同時に、グアノシンアナログをマウスの腹腔内に投与すればよい。
マウスの肝細胞がヒトの肝細胞に置換することをヒトの肝細胞又は肝臓の再構築（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）といい、マウスの肝細胞をヒトの肝細胞に置換したマウスをヒト肝細胞再構築キメラマウス又はヒト肝臓再構築キメラマウスという。また、肝細胞がヒト肝細胞に置換した肝臓をヒト化肝臓（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｌｉｖｅｒ）という。
本発明は上記のマウス中で再構築されたヒト肝臓組織をも包含する。該肝臓組織には、ヒト肝臓の３次元的構造又は機能を有しており、マウスの肝細胞の７５％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上がヒトの肝細胞に置換されて再構築されている。
これらのヒト肝細胞を有するキメラマウスは、例えば、ヒトの肝細胞の移植から６０日程度後に被験物質の投与に供される。被験物質としては、例えば、医薬候補物質が好適に挙げられる。医薬候補物質としては、医薬品開発の過程にある物質であり、ヒトにおける薬物相互作用の予測を必要とする物質が好適に挙げられる。このような物質は、医薬品の薬効に対する主成分物質であり得るし、あるいは主成分物質を含む組成物であり得る。医薬候補物質の投与量は、その物質が対象とする疾患の種類や物質組成の種類、あるいは投与経路等によって異なるが、０．１ｍｇ／ｋｇ体重から２０００ｍｇ／ｋｇ体重程度の範囲から適宜選択され得る。また投与経路は、医薬候補物質の種類やその適した剤型等に応じて、経口、皮下、静脈内又は腹腔内投与等から適宜選択され得る。
キメラマウスの肝臓内における医薬候補物質等の被験物質の代謝の程度、及び代謝物は、マウス血漿における医薬候補物質の濃度を、クロマトグラフ法等の当該技術分野における定法によって適宜測定、及び、同定され得る。また、測定は、候補物質の投与から３０分から２４時間程度までの間から適宜選択された、１又は複数のタイムポイントで測定される経時測定によって実施され得る。
そして、この血漿中の医薬候補物質の濃度、および、肝臓において薬物代謝酵素によって代謝された物質の濃度によって、医薬候補物質が、例えば、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９、又はＣＹＰ２Ｃ１９欠損者で代謝されやすい物質か代謝されにくい物質かが判定され得る。
ヒトの薬物代謝酵素は、ＣＹＰ群酵素に属するＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１０、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ３、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ４Ｆ１、ＣＹＰ４Ａ２、ＣＹＰ４Ａ３等であり、それぞれの指標化合物は、例えば、ＣＹＰ１Ａ２で代謝される指標化合物はカフェイン、ＣＹＰ２Ｃ９はトルブタミド、ＣＹＰ２Ｄ６はデキストロメトルファン、ＣＹＰ２Ｃ１９はオメプラゾール、ＣＹＰ３Ａ４はエリスロマイシン等である。
本発明のキメラマウスに医薬候補物質が投与された後、これらの指標化合物の混合物が投与され、経時的に各化合物の血漿中濃度を測定することによって、医薬候補物質が各酵素の活性を促進する物質か、あるいは阻害する物質であるかが判定され得る。例えば、医薬候補物質を投与した場合にカフェインの代謝が促進して血漿中濃度が減少していれば、当該医薬候補物質はＣＹＰ１Ａ２の活性を特異的に促進する物質であると判定され得る。
すなわち、本発明のマウスを用いてヒトに投与される医薬がヒトの肝臓においてどのように代謝され、どのような代謝物質が生成されるか、すなわち医薬の血漿中動態、代謝物の同定、代謝速度等の評価を行うことができる。代謝の観点から人に投与することが適切な医薬のスクリーニング、及び人に投与される適切な医薬用量の予想が可能になる。また、ヒト肝臓の増殖、再生等の研究に用いることができる。
また、本発明の別の目的として、通常の感染経路によるヒトＨＣＶ等の肝指向性病原体（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ）の感染に感受性のあるマウスモデルを提供することが挙げられる。すなわち、本発明は、マウスモデルが、通常の感染経路によるＨＣＶ等の肝指向性病原体の感染に感受性があり、ＨＣＶ等の肝指向性病原体に感染したヒトとウイルス量が等しくなりうる長期的に一貫して安定に感染する動物モデルを提供する。このようなマウスを用いる別の利点としては、マウスモデルを作製する際に、ＨＣＶ等の肝指向性病原体の感染細胞を入手したり扱ったりする必要がない点が挙げられる。したがって本発明では、ＨＣＶ等の肝指向性病原体に感染したヒトドナーから肝細胞を入手する必要がなく、またインビトロでヒト肝細胞を培養して感染させる必要もない。
本願発明のマウスには、ＨＣＶ等の肝指向性病原体、特に霊長類（例えばヒト）に限定される宿主範囲をもつ肝指向性病原体を感染させることができる。病原体の性質に応じて、慢性感染したマウス宿主は数週間から数か月間維持することができる。例えば肝指向性病原体がＨＣＶの場合には、本願のマウスをＨＣＶに慢性的に感染させ（例えば慢性感染）、また活性型のＨＣＶ感染を少なくとも約５週間、通常は少なくとも約１４〜約２０週間又はそれ以上、最長で約３５週間又はそれ以上の期間、あるいは宿主のマウスの生涯にわたって維持することができる。
感染宿主（マウス）のウイルス負荷は、感染者（ヒト）におけるウイルス負荷と同程度になりうる。例えば、病原体がＨＣＶの場合、宿主のマウスは、血清１ｍｌあたり約１０^３〜約１０^４個から約１０^６個のウイルス粒子、通常は血清１ｍｌあたり約１０^３〜約１０^７個のウイルス粒子濃度で感染を維持することができる。感染宿主におけるウイルス負荷は、長期に渡って実質的に一貫し、慢性的で、且つ安定しており、例えば感染した未投与の宿主の血清から単離可能なウイルス粒子の数は、週毎のサンプリング期間中に大きく変動することはなく、例えば、いったん安定な感染が、通常は感染後の約２〜４週以内に宿主で確立すると、初回サンプリング時に１ｍＬの血清に多数のＨＣＶウイルス粒子を含む本発明のＨＣＶ感染宿主は、次のサンプリング時にＨＣＶ感染陽性を示し、かつ、一般に血清１ｍＬあたりに同じか同等の多量のＨＣＶ粒子を含む。通常、感染宿主のウイルス負荷は大きく変動することはないので、候補抗ウイルス物質の作用の評価が可能となる。
ある態様では、本発明のマウスモデルを用いて、ウイルス性肝炎、より具体的にはＨＣＶ感染によって引き起された症状を改善する薬剤を同定し、及び／又は、より直接的には、感染ウイルスの病原性機構に影響を与える。例えば、ウイルス感染を抑制したり、ウイルスの複製を低下させたり、又はそれ以外ではウイルスの増殖サイクルを破壊したりする。一般的には、候補薬剤を本発明のマウスモデルに投与し、候補薬剤が及ぼす作用を、対照に対して（例えば、未感染マウスに対して、抗ＨＣＶ作用が知られている薬剤（例えばＩＦＮ−α）を投与するＨＣＶ感染マウスに対して等）評価する。例えば候補薬剤を本発明のＨＣＶ感染マウスに投与することが可能であり、投与前のマウスのウイルス量及び／又は対照である未投与ＨＣＶ感染間マウスのウイルス量と投与マウスのウイルス量を（例えば血清試料を対象としたＲＴ−ＰＣＲ法による測定で）比較することができる。一般に、候補薬剤投与後における感染マウスでウイルス量が検出可能な低下、又は有意な低下がみられれば、対象薬剤に抗ウイルス作用があることを意味する。
候補薬剤は、任意の多くの所望の方法、及び／又は薬剤送達に適切な方法で投与することができる。例えば候補薬剤は、注射（例えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は所望の作用を達成するための組織への直接注射）、経口投与、又は他の任意の望ましい方法で好適に投与され得る。通常、インビボにおけるスクリーニング法には、さまざまな量及び濃度の候補薬剤（薬剤非投与から、動物に良好に送達されうる量の上限に至る薬剤量まで）を受ける数種の動物を対象とし、多様な剤形及び経路による薬剤の送達法が含まれる。薬剤は単独で投与することができるほか、特に薬剤の併用投与が相乗効果を生む場合は、２種又はそれ以上の薬剤と組み合わせて投与され得る。
スクリーニングされる候補薬剤としては、合成分子、天然分子、又は組換え的に作製された分子（例えば低分子量の分子；薬物：ペプチド；抗体（抗原結合性の抗体断片、例えば受動免疫をもたらすものを含む）、又は他の免疫療法薬：真核細胞又は原核細胞に含まれる内因性因子（例えばポリペプチドや植物抽出物など）など）が好適に用いられる。ヒト細胞に対する毒性が低い薬剤のスクリーニングアッセイ法は特に重要である。
候補薬剤の活性は、さまざまな方法で評価することが可能である。例えば、宿主動物をＨＣＶ等の肝指向性病原体（例えばＨＣＶなど）に感染させる場合は、薬剤の作用は、血清試料中の病原体の有無（例えばウイルス量における力価）、又は病原体の存在に関連するマーカー（例えば、病原体に特異的なタンパク質、又はそれをコードする核酸など）を調べることで評価され得る。ウイルス感染の有無並びに重症度の定量的及び定性的な検出法及び評価法は当技術分野で周知な方法が採用され得る。ある態様では、ＨＣＶ感染に対する薬剤の活性は、血清試料及び／又は組織切片を対象にウイルスの有無を調べることで（例えばＨＣＶの場合にはＲＴ−ＰＣＲ法などで）評価され得る。また、別の態様では、ウイルス感染に対する薬剤の活性は、血清試料を対象に、ウイルスの核酸（例えばＨＣＶのＲＮＡ）の有無を調べることで評価可能である。例えばＨＣＶのＲＮＡは、例えば逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、競合的ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法による（−）鎖ＲＮＡ（ＨＣＶの複製中間体）の検出、又は治療によって生じるウイルスゲノム上の変異／シフト（準種進化（ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ））を検出するためのウイルスＲＮＡの配列決定により検出することができる。又は／及び、宿主の肝臓を生検対象として、またｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲハイブリダイゼーション法を行うことによって、組織切片に含まれるウイルス粒子量の任意の量的変化又は質的変化が直接的に示され得る。又は／及び、宿主を安楽死させた後に、薬剤によって引き起された感染及び／又は毒性の徴候が肝臓にないか組織学的に調べることも好適に使用され得る。
また、本発明の動物モデルを用いることによって、肝指向性病原体による感染を予防する能力又は改善する能力をもつか否かについて候補ワクチンのスクリーニングが実施され得る。一般的に「ワクチン」とは、投与されることで、標的となる病原体に対する免疫応答を宿主が開始するのを促す物質をいう。ワクチンの投与の結果誘発される液性、細胞性、又は液性／細胞性の免疫応答によって、ワクチン開発の対象となる病原体による感染の抑制が促進され得る。本発明では、肝指向性病原体（例えば、細菌病原体、ウイルス性病原体、又は寄生虫病原体、特に例えばＨＣＶなどのウイルス性病原体）の肝内での複製及び／又は肝指向性病原体による感染を抑制する、防御的な免疫応答を誘発する予防的ワクチンが特に重要である。また本発明では、受動免疫、又は速やかに促進される特異的な能動免疫（例えば、抗ＨＣＶ免疫グロブリンなど）の供給によって肝指向性病原体による感染に対する防御をもたらす治療用ワクチンもまた重要である。
本発明のこの態様では、免疫不全マウスの免疫系は、例えば幹細胞、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、血液の索細胞、造血細胞、又はヒト免疫系を動物にもたらすヒト起源の他の適切な細胞を用いて再構成され得る。ヒト免疫細胞を単離する方法、及び免疫不全マウスの免疫系の再構成（例えば、ヒト免疫系をもつマウス）は当技術分野で周知である（例えばＮａｔｕｒｅ ３３５：２５６〜５９；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（２５）：１４７２０〜２５が適宜参照され得る）。ある態様では、ヒトの免疫細胞は、本願発明にかかるマウスを作製する際に使用されるヒト肝細胞が得られたドナーと同じドナーから得られる。別の態様では、ヒトの免疫細胞は当技術分野で周知の方法（例えば腹腔内注射）によって宿主に導入され得る。
有効なワクチンは上述のスクリーニング法と類似の方法によってスクリーニングされ得る。すなわち、候補ワクチンが、肝指向性病原体の接種前にキメラ動物に投与される。候補ワクチンは通常、単回ボーラス投与（例えば、腹腔内注射、又は筋肉内注射、局所投与若しくは経口投与）に続いて、１回又は複数回の追加免疫を行うことによって投与される。免疫応答の誘導は、当技術分野で周知の方法で、抗原に特異的なＢ細胞及びＴ細胞の応答を調べることにより評価され得る。次に、免疫化した動物に肝指向性病原体が投与される。通常は数匹の免疫化マウスを対象に、病原体の力価を上昇させながら投与が行われる。次いで、免疫化マウス及び免疫化していない対照マウスを対象にして、感染の進行が観察され、感染の重症度が（例えば存在する病原体の力価を評価する、又は、上述したヒト肝細胞の機能に関するパラメータを調べることによって）評価される。候補ワクチンの投与後に生じる病原体感染の有意な低下、及び／又は疾患重症度の有意な低下をもたらすワクチン候補が有効なワクチンとみなされる。
さらに、本発明の別の目的として、細胞移植治療等に用いられる将来肝臓になることが可能な細胞、例えば、肝幹細胞の探索、検出、同定に使用され得るマウスモデルを提供することが挙げられる。肝幹細胞は、将来的に肝細胞に分化すればよく、肝細胞に分化するために必要な世代数等は特に特定されない。すなわち、本発明は、マウスモデルに、ヒト肝組織から取得した初代分離細胞の経脾門脈的移植を行い、生着した肝組織の中からヒト肝幹細胞等の細胞移植治療等に用いられる将来肝臓になることが可能な細胞を探索し、あるいはさらに同定する方法をも提供する。さらに、生着した肝組織の中からヒト肝幹細胞等の細胞移植治療等に用いられる将来肝臓になることが可能な細胞を含む細胞集団を採取することができる。本発明は、この肝幹細胞等の細胞移植治療等に用いられる将来肝臓になることが可能な細胞を含む細胞集団を採取する方法をも提供する。経脾門脈的移植の代わりに同所移植する方法も適宜使用され得る。初代分離細胞の代わりに試験管内で適切な条件下で培養され肝細胞への分化を誘導づけられた幹細胞も本目的のために適宜使用され得る。そのような幹細胞を用いて肝細胞への分化を誘導づける方法は例えば、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００９）１３６，９９０−９９９等に記載されている。肝組織の中から増殖性を指標として肝幹細胞を探索し、同定するために、肝細胞を検出するマーカーを認識する抗原、及び／又は、増殖性細胞を認識する抗体を用いて組織免疫染色を行うことができる。肝細胞を検出するマーカーとして、アルブミン、ｔｙｒｏｓｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ（ＣＦ）ＶＩＩ、ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ ８／１８等から適宜選択され得る。細胞増殖マーカーとして、Ｋｉ−６７抗原、５−ｂｒｏｍｏ−２’ −ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ取り込み能、ＰＣＮＡ等から適宜選択され得る。これらのマーカーを用いることによりヒト肝肝細胞を含む細胞集団を取得することができ、さらに、こうしたマーカーを発現する肝細胞はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）等を用いて適宜単離され、単離された肝幹細胞が細胞移植治療等に適宜供され得る。
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の実施例によって限定して解釈されるものではない。

ＴＫ−ＮＯＧマウスの作出とその機能の解析
１．方法
本実施例は以下の方法で行った。
（１）トランスジェニックマウスの作出
単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＵＬ２３又はＨＳＶｔｋ）遺伝子発現ユニットは図１のようにして構築された。最初に４２ヌクレオチドのポリリンカー（ＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＣＡＧＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧＣＡＴＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＧＡ：配列番号２）がｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ（ｐＢＳＩＩ；Ｐｒｏｍｅｇａ）のＢａｍ ＨＩ−Ｘｈｏ Ｉ部位（ｐＢＳＩＩ／ｌｉｎｋｅｒ）に導入された。ＨＳＶｔｋ遺伝子が以下のプライマーを用いてアニーリング温度６２℃でＰＣＲで増幅された。
次いで、増幅産物がｐＣＩプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＮｈｅ Ｉ−Ｓａｌ Ｉ部位（ｐＣＩ−ＴＫ）にクローニングされた。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）３’フランキング領域が以下のプライマーを用いてアニーリング温度６０℃にてＰＣＲで増幅された。
次いで、増幅産物がｐＢＳＩＩ／リンカープラスミドのＳｍａ Ｉ− ＥｃｏＲ Ｉ部位（ｐＢＳＩＩ／ｌｉｎｋｅｒ／ｈＧＨ）にクローニングされた。プラスミドｐ２３３５Ａ−１（Ｐｉｎｋｅｒｔ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１，２６８−２７６（１９８７））由来のマウスアルブミンエンハンサー／プロモーターの２，３４５−ｂｐ Ｎｏｔ Ｉ− ＢａｍＨ Ｉフラグメント及びｐＣＩ−ＴＫ由来のキメライントロン／ＨＳＶｔｋの１，４５６−ｂｐ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−Ｓａｌ ＩフラグメントがｐＢＳＩＩ／リンカー／ｈＧＨプラスミド（ｐｍＡｌｂＥＰｉｎｔＵＬ２３ＧＨ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ４５３１８１）の対応部位にクローニングされた。ｐｍＡｌｂＥＰｉｎｔＵＬ２３ＧＨプラスミドＤＮＡがＮｏｔ Ｉ及びＫｐｎＩで消化され、ベクター部を含まない４，４−ｋｂフラグメントがＨＳＶｔｋ発現ユニットとして調製された。この発現ユニットが公知の方法でＮＯＤ／Ｓｈｉマウスの受精卵にマイクロインジェクトされた。トランスジーンを有する産仔がＨＴＫＦ１フォワードプライマー５’−ＣＡＣＧＴＣＴＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＴＴＡＣＧ−３’（配列番号７）及びｈＧＨＲ１リバースプライマー５’−ＣＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＣＡ−３’（配列番号８）を用いたＰＣＲで同定された（アニーリング温度６３℃）。尾組織から抽出したゲノムＤＮＡが２０μｌ反応混液中で、９４℃２分、９４℃３０秒３０サイクル、６３℃３０秒、７２℃３０秒、７２℃３分の条件で増幅された。トランスジーンＤＮＡはアガロースゲル上で２３６ｂｐの増幅産物バンドとして確認された。雌のトランスジェニックマウスを雄のＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＳｈｉＪｉｃ（ＮＯＧ）と交配させｓｃｉｄ及びＩＬ２Ｒｇ^ｎｕｌｌの変異を有する個体が得られた。ｓｃｉｄ及びＩＬ２Ｒｇ^ｎｕｌｌ遺伝子の変異がＰＣＲによりジェノタイピングされた（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．５１，３９１−３９３（２００２）：Ｉｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １００，３１７５−３１８２（２００２））。作製したマウスの正式系統名は、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}Ｔｇ（Ａｌｂ−ＵＬ２３）７−２／ＳｈｉＪｉｃで表され、これをＴＫ−ＮＯＧと称する。
（２）蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析
トランスジーンの染色体中の位置は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法により決定された。ＴＫ−ＮＯＧマウスから採取し、マイトジェンで活性化した脾細胞から得られた９個のメタフェーズ細胞がビオチン１６ｄＵＴＰ標識ｐＣＩ−ＴＫプラスミドを用いて分析された。ビオチン標識ＤＮＡはアビジンＦＩＴＣ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により可視化し、当該細胞がヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）で対比染色された。観察はライカＱ５５０サイトジェニックワークステーションを用いて行われた。蛍光シグナルを有する染色体がＧバンディングスタンダードにより同定された。
（３）サザンブロット分析
ゲノムＤＮＡサンプルは１２週齢ＴＫ−ＮＯＧマウス及び非トランスジェニックマウスの腎臓を一晩プロテイナーゼＫで消化を行い、フェノール：クロロフォルム：エタノール抽出することにより得られた。制限酵素Ｂａｍ ＨＩ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｘｂａ Ｉ及びＮｏｔ Ｉ ｐｌｕｓ Ｋｐｎ Ｉで消化したゲノムＤＮＡが０．６％アガロースゲルで電気泳動し、陽性荷電ナイロン膜（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）にトランスファーされたブロット膜が得られた。ＰＣＲ ＤＩＧ Ｐｒｏｂｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）を用いて調製したＤＩＧ標識プローブを用いて当該膜のハイブリダイゼーションが行われた。用いたプライマーは以下の配列：
を有するものであった。
それぞれのプローブが認識する位置を図２に示す。
（４）ＲＴ−ＰＣＲによるＨＳＶｔｋトランスクリプトの検出
６５日齢のＴＫ−ＮＯＧマウス肝臓、腎臓、脾臓、肺、脳、骨格筋及び睾丸からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｋ．Ｋ．）を用いてトータルＲＮＡが得られた。ＲＴ−ＰＣＲはＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行われた。ｐＣＩｓｐＦ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’−ＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＧＴＧＴＣＣ−３’（配列番号１３）及びＨＴＫＲ１ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’−ＧＴＡＡＧＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＧＧＴＡＣ−３’（配列番号１４）を用いてＨＳＶｔｋトランスクリプトのスプライス型が３４３ｂｐバンドとして検出された（アニーリング温度６８℃）。Ｇ３ＰＤＨＦ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’−ＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＡ−３’（配列番号１５）及びＧ３ＰＤＨＲ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’−ＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴ−３’（配列番号１６）を用いて増幅した４７９ｂｐグリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ）フラグメントが内部標準として用いられた（アニーリング温度６５℃）。
（５）肝臓傷害の誘発
ガンシクロビル（ＧＣＶ）ナトリウム（Ｄｅｎｏｓｉｎｅ−ＩＶ；Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｔａｎａｂｅ Ｐｈａｒｍａ）又はベシクル（生理食塩水）が２６ゲージ針を用いて１日おきに２回、マウスの腹腔内に投与された。水又は生理食塩水に溶解されたＧＣＶは、その投与前にフィルター滅菌された。すべてのマウスが毎日モニターされた。肝臓傷害の程度は生化学的血清検査値及び病理学的分析により調べられた。ＧＣＶ投与１週間後、ＡＬＴ及びＡＳＴの分析のために下大静脈から末梢血が採取され、ＦＵＪＩ ＤＲＩ−ＣＨＥＭ７０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）により臨床化学分析が行われた。また、４％（ｖ／ｖ）リン酸緩衝化フォルマリンで固定、パラフィン包埋された組織の、ヘモトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色が行われた。
（６）ヒト肝細胞及びヒト大腸癌細胞の移植
市販の凍結ヒト肝細胞（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）３ロットがドナー細胞として用いられた。ドナーの年齢は４〜７歳であった。以下の一般的な方法で移植が行われた。移植５及び３日前に、６〜８週齢の成体ＴＫ−ＮＯＧレシピエントマウスにＧＣＶ（０．５〜１．５ｍｇ／ｋｇ）が腹腔内に投与された。細胞数及び生存率はトリパンブルー排除法により血球計算盤を用いて測定された。４０μｌのＨａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）又はＷｉｌｌｉａｍ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ Ｅに浮遊させた１〜２×１０^６の生肝細胞が２６ゲージの注射針をつけたハミルトンシリンジを用いて脾臓内に移植された。コントロールとして、１×１０^４のヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ）が非トランスジェニックＮＯＧマウスの脾臓内に移植された。
（７）ヒトアルブミン測定
小量の血液が隔週で眼底静脈叢からプラスティックキャピラリーを用いて採取された。採取された血液は、１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＢＳＡ）を含むＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で５００〜３００００倍に希釈され、そのヒトアルブミン濃度がヒトアルブミンＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定された。閾値濃度は〜３×１０^３ｎｇ／ｍｌであった。
（８）イムノブロッティング
希釈血清及び胆汁サンプル（希釈倍率：３〜３０００倍）が５％βメルカプトエタノールを含むＳＤＳサンプルバッファーに溶解され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供された後にＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に転写された。転写された膜がポリクローナルヤギ抗マウスアルブミン抗体（Ａ９０−２３４Ａ；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ポリクローナルヤギ抗ヒトアルブミン抗体（Ａ８０−２２９Ａ；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ポリクローナルヤギ抗マウストランスフェリン抗体（Ｉ−２０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ポリクローナルウサギ抗ヒトトランスフェリン抗体（Ｈ−６５；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ポリクローナルマウス抗補体Ｃ３抗体（Ａ０１；Ａｂｎｏｖａ）、ポリクローナルヤギ抗ヒト補体Ｃ３抗体（Ｄ−１９；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びポリクローナルヤギ抗セルロプラスミン３抗体（Ｈ−６０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共にインキュベーションされ、洗浄後の当該膜は、ヤギＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マウスＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はウサギＩｇＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する西洋ワサビペルオキシダーゼ標識２次抗体と共に６０分間インキュベーションされた。次いで、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＨｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた発色が検出された。
（９）ヒト肝細胞特異的遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ
ＴｏｔａｌＲＮＡがＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｋ．Ｋ．）を用いて単離された。相補ＤＮＡがＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びランダムプライマーを用いて合成された。マウスＧｐｄｈ、アルブミン（Ａｌｂ）、ヒトＧＡＰＤＨ、ＡＬＢ、チロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、毛細管特異的有機アニオントランスポーターＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＣ（ＣＦＴＲ／ＭＲＰ）、メンバー２（ＡＢＣＣ２；ＭＲＰ２）、胆汁塩輸送ポンプＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＣ（ＭＤＲ／ＴＡＰ）、メンバー１１（ＡＢＣＢ１１）、ビリルビンＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ１Ａ１）及びチトクロームＰ４５０ファミリー（ＣＹＰ１Ａ１，ＣＹＰ１Ａ２，ＣＹＰ２Ｃ９，ＣＹＰ２Ｃ１９，ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ３Ａ４）遺伝子の発現がＲＴ−ＰＣＲで分析された。表１に、用いたプライマー情報（ターゲット遺伝子、配列）、アニーリング温度、増幅産物サイズ等を示す。
（１０）組織学及び免疫組織染色
フォルマリン固定された肝臓及び腎臓がパラフィンに包埋され、その５μｍ切片が調製された。切片のいくつかはｔａｒｇｅｔ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．１Ｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ６．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ９．０）に浸漬され１０分間オートクレーブの処理を受けた後に２０分間室温に置かれた。モノクローナルマウス抗ヒトＣＫ８／１８抗体（ｃｌｏｎｅ ５Ｄ３；Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、モノクローナルマウス抗ヒトＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩ−Ａ，Ｂ，Ｃ抗体（ｃｌｏｎｅ ＥＭＲ８−５；Ｈｏｋｕｄｏ）、ポリクローナルヤギ抗ヒトアルブミン抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びポリクローナルウサギ抗ヒトＧＬＵＬ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が１次抗体として用いられた。明視野免疫組織染色のために、ヤギ、ウサギ及びマウスＩｇがアミノ酸ポリマー／ペルオキシダーゼ複合体標識抗体（Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｉｎ Ｍｏｕｓｅ ＭＡＸ ＰＯ（Ｇ，Ｒ，ａｎｄ Ｍ）；Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びジアミノベンジジン（ＤＡＢ；Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）基質（０．２ｍｇ／ｍｌ ３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド，０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，ａｎｄ ０．００５％ Ｈ_２Ｏ_２）を用いて可視化された。切片がヘマトキシリンを用いて対比染色された。過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）染色キット（Ｍｕｔｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）がグリコーゲンの可視化に用いられた。ＡｘｉｏＣａｍ ＨＲｍ及びＡｘｉｏＣａｍ ＭＲｃ５ ＣＣＤ ｃａｍｅｒａｓ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を備えた直立顕微鏡Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて撮像された。レシピエント肝臓におけるドナーヒト肝細胞の割合である置換インデックス（ＲＩ：ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎｄｅｘ）は、免疫組織染色切片中の全面積中のヒトＣＫ８／１８陽性肝細胞により占められる面積の割合で表された。凍結切片を作製するために用いた肝臓はＯＣＴコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｃｈｅｍｉｃａｌｓ）中に包埋され、液体窒素中で凍結され、５〜１０μｍの厚さで切片化された。ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ Ｍｉｎｉ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて標識したビオチン化ポリクローナルヤギ抗ヒトアルブミン抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４標識ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＦＩＴＣ標識ポリクローナルヤギ抗マウスアルブミン抗体（Ａ９０−２３４Ｆ；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて免疫蛍光染色が行われた。
（１１）レーザーマイクロダイセクション解析（ＬＣＭ）
連続凍結組織切片（１０μｍ）がエタノールで固定され、次いで固定液中のエタノール濃度が段階的に減らされ、最終的に該切片はＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅを含まない水に浸漬された。次いで、モノクローナルマウス抗ヒトＣＫ８／１８抗体（ｃｌｏｎｅ；５Ｄ３；Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて前記切片の免疫組織染色が行われた。切片化組織中の抗ヒトＣＫ８／１８抗体の陽性及び陰性染色領域が顕微鏡を用いてＬＣＭのためにマッピングされた。それぞれの領域の切りだし捕捉はＡｕｔｏＰｉｘ ＬＣＭ ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて行われた。ゲノムＤＮＡがＴＰＭＫ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，５０ｍＭ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＣｌ_２，ａｎｄ ４０μｇ／ｍｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）を用いて抽出された。５５℃で一晩インキュベーションが行われ、９５℃５分間のサンプルの熱処理によりプロテイナーゼＫが不活性化された。緩衝液の一部がゲノムＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして用いられ、ヒトとマウスの肝細胞が区別された。ヒト及びマウスβアクチン遺伝子は以下の配列；
を有するプライマーを用いてＰＣＲにより増幅された（アニーリング温度６０℃）。
このプライマーセットによりヒトβアクチンだけでなく、マウスβアクチン遺伝子（それぞれ、２４５ｂｐ及び２７１ｂｐ）が増幅された。コントロールプラスミド（ｐＢＳＩＩ−ｈｍ／β−ＡＣＴ）はヒト及びマウスＤＮＡ由来の対応配列をそれぞれｐＢＳＩＩベクターのＳｍａ Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入することにより調製された。
（１２）５−カルボキシフルオレセインジアセテートを用いた胆汁排出試験
カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）はＭｒｐ２を介して様々な細胞から排出される有機アニオンである。この色素のエステル前駆体である５−カルボキシフルオレセインジアセテート（５−ＣＦＤＡ，０．５ｎｍｏｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が尾部から静脈注射により投与された。５−ＣＦＤＡ投与の１０分後、肝臓が５０ｎｍｏｌ／Ｌ５−ＣＦＤＡ溶液で３分間かん流され、当該肝臓がＯＣＴコンパウンド中に包埋され、液体窒素で凍結された。この試薬はその易脂溶性のため容易に肝細胞中に侵入し、エステラーゼにより加水分解され、ＣＦ（水溶性蛍光基質）を形成し、次いで胆汁中に排出される。
１０μｍ厚の連続凍結切片が調製され、空気乾燥された。ＣＦの蛍光シグナルはＡｘｉｏＣａｍ ＨＲｍ及びＡｘｉｏＣａｍ ＭＲｃ５ ＣＣＤ ｃａｍｅｒａｓ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を備えた直立顕微鏡Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて観察、撮影が行われた。蛍光顕微鏡写真の撮影後、組織切片がエタノールで固定され、固定液のエタノール濃度が段階的に減らされ、該切片は最終的にＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅを含まない水に浸漬された。次いで、モノクローナルマウス抗ヒトＭＲＰ２抗体（Ｃｌｏｎｅ Ｍ２ ＩＩＩ−６；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｉｎ Ｍｏｕｓｅ ＭＡＸ ＰＯ（Ｍ）（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＤＡＢ基質を用いて免疫組織染色が行われた。切片がヘマトキシリンを用いて対比染色された。他の組織切片は４％パラホルムアルデヒド液で固定され、モノクローナルヤギ抗ヒトＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩ−Ａ，Ｂ，Ｃ抗体（ｃｌｏｎｅ ＥＭＲ８−５；Ｈｏｋｕｄｏ）及びテキサスレッド標識ストレプトアビジン−（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて免疫蛍光染色が行われた。他の組織切片はヘモトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色が行われた。きわめて置換度の高いヒト化肝臓ＮＯＧマウス＃２−１１−５及びヒト化の程度が極めて低いヒト化肝臓ＮＯＧ＃４８−Ｌ５から採取した胆汁及び糞サンプルが０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で希釈され、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＢｉｏＬｕｍｉｎ ９６０ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてその蛍光が測定された。蛍光イメージはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＦｌｕｒｏＩｍａｇｅｒ ５９５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて得られた。糞サンプル中のＣＦ濃度は０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の既知濃度のＣＦに基づいて算出され、サンプルの湿重量により標準化された。
２．結果
結果は以下のとおりであった。
（１）ＴＫ−ＮＯＧマウスへのヒト肝細胞移植
ＴＫ−ＮＯＧマウスの血清中のヒトアルブミンは、ヒトの肝細胞移植の後に図３に示したタイミングにてＥＬＩＳＡにより測定された。結果を図３に示す。黒丸、黒三角、黒四角は、それぞれマウス＃１２−１４、＃６−６−１０及び＃２−４−７を用いて行われたアッセイの結果を示す。
３匹のＴＫ−ＮＯＧマウスの血清中のタンパク質がヒト肝細胞移植後７０、４４及び４１日目に免疫ブロット法により測定された。マウス及びヒト血清が陽性及び陰性コントロールとして用いられた。結果を図４に示す。
コントロールと３匹のＴＫ−ＮＯＧマウスの肝臓で発現したｍＲＮＡはヒト肝細胞移植後７０、４４及び４１日目にＲＴ−ＰＣＲで測定された。マウス及びヒト肝臓ＲＮＡがコントロールサンプルとして用いられた。結果を図５に示す。
ヒト肝細胞移植後それぞれ７０、４４、及び４１日後に得られた、ＴＫ−ＮＯＧマウスの肝臓の組織学と免疫組織染色の結果を示す。連続切片はＨ＆Ｅ、ｈ−ＣＫ８／１８、ＨＬＡ、ｈ−アルブミン及びＰＡＳ染色された。結果を図６に示す。図６には、＃１２−１４（７０日）、＃６−６−１０（４４日）及び＃２−４−７（４１日）のＨＥ染色（それぞれ、Ａ、Ｃ及びＥ）及び抗ヒトＣＫ８／１８抗体染色（それぞれ、Ｂ、Ｄ及びＦ）の結果を示す。ＧからＫは、Ｈ＆Ｅ、ｈ−ＣＫ８／１８、ＨＬＡ、ｈ−アルブミン及びＰＡＳ染色した連続切片を示す。
（２）ヒト化肝臓の解剖学的及び機能的な分析
図７に毛細胆管（ＢＣ）へのカルボキシフルオレセイン（ＣＦ）排出を示す。ヒトの肝細胞移植の４２日後のＴＫ−ＮＯＧマウス（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）又はヒトの大腸癌細胞株（ＨＣＴ−１１６、Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨ）移植の２１日後のＮＯＧマウスに５−ＣＦＤＡを投与し、肝臓が得られた。ヒト肝臓が再構築されたＴＫ−ＮＯＧ又は大腸癌が移植されたコントロールＮＯＧマウス肝臓の連続切片が作製され、蛍光代謝産物の存在が観察された。ヒト肝臓が再構築したＴＫ−ＮＯＧマウスでは、５−ＣＦＤＡの代謝産物（ＣＦ）が、ヒト肝細胞コロニーの小葉上にハチの巣状に認められ、その毛細胆管内（ＢＣ）への排出が確認された。対照的に、ＨＣＴ−１１６大腸癌増殖巣では、このハチの巣パターンが全く認められなかった。他の切片について、Ｈ＆Ｅ染色、ＨＬＡ及びヒト−ＭＲＰ２染色が行われた。
図８にヒト肝細胞の移植から５２日後に得た、２匹の異なるヒト肝臓再構築ＴＫ−ＮＯＧマウス肝臓のヒトＣＫ８／１８免疫組織染色の結果を示す。＃２−１１−５マウスの肝臓はヒト肝細胞でほぼ完全に置換されていた（ＲＩ＞９０％）が、＃４８−Ｌ５ではマウス肝臓が部分的にヒト肝細胞で置換されているだけであった（ＲＩ〜２０％）。５−ＣＦＤＡ投与後、２匹の再構築ＴＫ−ＮＯＧマウスについて、糞へのＣＦ排泄量が測定された。図９に結果を示す。
図１０に、５−ＣＦＤＡ投与１０時間後に回収したほぼ完全にヒト化された＃２−１１−５ ＴＫ−ＮＯＧマウス胆汁中の代謝産物ＣＦの蛍光イメージを示す。
ヒト化されたＴＫ−ＮＯＧマウス＃２−１１−５における胆汁中のマウス及びヒトトランスフェリンの解析結果を図１１に示す。図１１に示すように、ヒトトランスフェリンは、ほぼ完全にヒト化された＃２−１１−５マウス由来の胆汁中には認められたが、コントロールＮＯＧマウスでは認められなかった。
図１２にヒトの肝細胞移植の６週間（Ａ及びＢ）又は１６週間（Ｃ及びＤ）後のＴＫ−ＮＯＧマウスから得られた肝臓切片のＨ＆Ｅ（Ａ及びＣ）及びグルタミン合成酵素（ＧＳ）（Ｂ及びＤ）の免疫組織染色を示す。図１２に示すように移植後６週間のヒト肝細胞巣にある中心静脈域にはＧＳ発現が認められなかった。対照的に、移植後１６週が経過したＴＫ−ＮＯＧマウス肝臓のヒト肝細胞巣中では、中心静脈の周辺にＧＳの発現が認められた。図１２Ｂの挿入図は、抗ＧＳ抗体で染色したコントロールＮＯＧ（マウス）及び、図１２Ｄの挿入図は、ヒト肝臓での染色結果を示す。Ｐは門脈路を示し、Ｃは中心静脈を示す。
（３）ＨＳＶｔｋトランスジェニックＮＯＧマウスのキャラクタライゼーション
ＨＳＶｔｋのトランスジーン構造はマウスアルブミンエンハンサ／プロモーター（Ａｌｂ Ｅｎ／Ｐｒｏ）、キメライントロン、ＨＳＶｔｋ ｃＤＮＡ、及びポリアデニル化シグナル（ｈＧＨｐＡ）と共にヒト成長ホルモンの遺伝子の３’−ＵＴＲからなる。図１にその構造を示す。矢尻はトランスジーン特異的な転写物を検出するのに使用したプライマーの位置と方向を示す。それぞれの矢の先はオリゴヌクレオチドの３’末端を表す。ＮＯＧ系統ではｓｃｉｄ変異が引き起こすＤＮＡ再構成の欠陥により、遺伝子断片をマイクロインジェクトしても得られる産仔の数がきわめてすくない。そのためはじめに、ＮＯＤ／Ｓｈｉ系統でＨＳＶｔｋ−遺伝子トランスジェニックマウスが確立された（ＨＳＶｔｋ−トランスジェニック；系統７−２）。ＮＯＧマウスの遺伝背景はＮＯＤ／Ｓｈｉ系統そのものであり、ｓｃｉｄとＩＬ２Ｒｇ^ｎｕｌｌ変異が唯一の違いであるため、その後、ＮＯＧ系統と交配することにより、ｓｃｉｄとＩＬ２Ｒｇ^ｎｕｌｌ変異を保有させ、重度の免疫不全系統であるＮＯＧ−Ｔｇ（Ａｌｂ−ＵＬ２３）７−２／ＳｈｉＪｉｃ（正式には、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ} Ｔｇ（Ａｌｂ−ＵＬ２３）７−２／ＳｈｉＪｉｃ，ａｂｒｉｄｇｅｄ ｎａｍｅ：略してＴＫ−ＮＯＧと呼ぶ）が得られた。ＨＳＶｔｋ遺伝子を有する雄トランスジェニックマウスは不妊になることが一般的に知られており、雄ＴＫ−ＮＯＧマウスも不妊であった。
図１３に、遺伝子導入されたＨＳＶｔｋ発現ユニットの染色体上の位置を示す。図１３に示すようにＴＫ−ＮＯＧマウスは染色体１Ｇ座にＨＳＶｔｋ発現ユニットを有していた。
図１４に、ＴＫ−ＮＯＧマウスに導入されたＨＳＶｔｋトランスジーンの分子分析の結果を示す。非トランスジェニックＮＯＧマウス腎臓（Ｎ）とＴＫ−ＮＯＧマウス腎臓（Ｔ）からのゲノムＤＮＡサンプルはサザンブロット解析のためにＢａｍ ＨＩ（Ｂａ）、Ｎｏｔ ＩとＫｐｎ Ｉ（ＮＫ）、Ｂｇｌ ＩＩ（Ｂｇ）、及びＸｂａ Ｉ（Ｘｂ）で消化された。
図２に、ＴＫ−ＮＯＧマウスのトランスジーンの制限地図と構造を示す。クローニングベクター（影付きのボックスはクローニングベクターを示す）が２つのＨＳＶｔｋトランスジーンで挟まれたｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌタンデムアレイ構造（黒のボックスは転写セグメントを示す）でマウスゲノムに組み込まれていた。ベクターを有しないＨＳＶｔｋ発現ユニット（Ｎｏｔ Ｉ−Ｋｐｎ Ｉ ｆフラグメント）がマイクロインジェクトされたがＮｏｔ Ｉ−Ｋｐｎ Ｉ制限酵素で切断された少量のベクターが混入した可能性があり、ＨＳＶｔｋ発現ユニットがｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ構造中でタンデムにベクターと繋がったと考えられる。アスタリスクはＤＩＧによってラベルされたプローブ（＊；５’プローブ、＊＊；３’プローブ）で認識された位置を示す。
図１５に、ＨＳＶｔｋトランスジーン発現をＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す。ＨＳＶｔｋトランスジーンの検出は、正確にスプライシングされたキメライントロンの配列を特異的に認識するプライマーを用いて行われた。試験された組織は、非トランスジェニックＮＯＧマウス肝臓（ｎＬｉ）、ＴＫ−ＮＯＧマウス肝臓（Ｌｉ）、腎臓（Ｋｉ）、脾臓（Ｓｐ）、肺（Ｌｕ）、脳（Ｂｒ）、骨格筋（Ｓｍ）、睾丸（Ｔｅ）であった。グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ）が内部標準として使用された。
図１６は、ガンシクロビル（ＧＣＶ）投与ＴＫ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ ＨＳＶｔｋ）及び非トランスジェニックＮＯＧマウス（ＮＴｇ）における、血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の活性を示す図である。図１６に示すように、ＴＫ−ＮＯＧマウスの「プロドラック」ＧＣＶ投与はゆるやかな用量依存性肝細胞傷害をもたらした。細胞傷害像を図１７に示す。
図１７Ａは、ガンシクロビル投与の陰性対照としてＰＢＳを投与したＴＫ−ＮＯＧマウス肝臓のＨ＆Ｅ染色像を示す。
図１７Ｂ〜Ｄは、１．５ｍｇ／ｋｇのＧＣＶ投与（図１７Ｂ）、５０ｍｇ／ｋｇのＧＣＶ投与（図１７Ｃ）のＴＫ−ＮＯＧマウス肝臓のＨ＆Ｅ染色像、及び５０ｍｇ／ｋｇのＧＣＶ投与（図１７Ｄ）の非トランスジェニックＮＯＧマウス肝臓のＨ＆Ｅ染色の結果である。ＧＣＶ（投与量、ｍｇＧＣＶ／ｋｇ体重）は１日おきに計２回投与され、１４日後に血液検体、組織検体が採取された。ＧＣＶ処理トランスジェニックマウス肝臓は肝細胞メガロサイトーシス、重度から中度の細胞質空胞変性及び病巣細胞の死を示した。しかしながら、精巣以外の他のほとんどの組織では明確な細胞又は組織傷害は観察されなかった。図１７のスケールバーは２００μｍである。Ｐは門脈路を示し、Ｃは中心静脈を示す。
（４）ＴＫ−ＮＯＧマウスへのヒト肝細胞の移植と肝再構築
図１８に種々の濃度でＧＣＶが投与され、ヒトの肝細胞が移植されたＴＫ−ＮＯＧマウスの血清ヒトアルブミン濃度を示す。図１８に示すように、１．５ｍｇのＧＣＶが投与された群のヒト血清アルブミン濃度は、５ｍｇ／ｋｇのＧＣＶを投与した群より有意に高かった（Ｐ＝０．０４０４、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ−ｔｅｓｔ）。０．５ｍｇ／ｋｇと１．５ｍｇ／ｋｇのＧＣＶ投与群では血清ヒトアルブミン濃度に有意な差は認められなかった。
図１９にヒト血清アルブミン濃度と置換インデックス（ＲＩ）の相関関係を示す。図１９に示すように、ＲＩ値とヒトの血清アルブミン濃度は強く相関していた（Ｒ^２＝０．９０４３）。
図２０に、ヒト肝細胞で再構築されたＴＫ−ＮＯＧマウス肝臓におけるヒトの遺伝子発現を示す。ヒト及びマウスｍＲＮＡがそれぞれ陽性及び陰性コントロールとして用いられた。
図２１にヒト肝細胞を移植したマウスから採取した腎臓の組織病理学解析の結果を示す。図２１に示すように、肝臓が再構築されたＴＫ−ＮＯＧマウスの腎臓（Ａ及びＢ）及び非トランスジェニックＮＯＧマウスの腎臓（Ｃ及びＤ）のＨ＆Ｅ及びＰＡＳ染色では、腎不全は認められなかった。バーは１００μｍである。
図２２から２４は、再構築したＴＫ−ＮＯＧマウスの肝臓が細胞融合によるものではないことを示す。
図２２は、マウスアルブミン（緑色）及びヒトアルブミン（赤）の免疫蛍光２重染色の結果を示す。図２２に示すようにほとんどすべてのマウスアルブミン陽性肝細胞ではヒトアルブミンは陰性であり、ほとんどのヒトアルブミン陽性肝細胞ではマウスアルブミンは陰性であった。マウスアルブミン陽性肝細胞がヒト肝細胞コロニー中に点在して見られた。ヒトアルブミン陽性肝細胞は図２２Ｂ中、白で示され、黒はマウスアルブミン陽性肝細胞を示す。
図２３は、クローン増殖性ヒト肝細胞コロニーをレーザーマイクロダイセクション法で捕捉した結果を示す。抗ヒトＣＫ８／１８染色凍結切片のレーザーマイクロダイセクション法による捕捉前（Ａ）及び捕捉後（Ｂ）を示す。図２３Ａの破線はヒト及び非ヒトターゲット（図２３ＢのＩ及びＩＩ）からなる捕捉領域の境界を示す。
図２４にレーザーマイクロダイセクション法で捕捉した肝細胞がヒトであるかマウスであるかを区別のために行ったＰＣＲ解析の結果を示す。用いたプライマーセットは、ヒトβアクチンだけではなくマウスβアクチン遺伝子も同様に増幅し、それぞれサイズの異なる産物が得られた（それぞれ、２４５ｂｐ及び２７１ｂｐ）。ヒトＣＫ８／１８陽性コロニーからは（図２３Ａ）２４５−ｂｐバンドのヒトβアクチンアンプリコンのみが検出され、逆に、ヒトＣＫ８／１８陰性領域（図２３Ｂ）からは２７１ｂｐバンドのマウスβアクチンアンプリコンのみが検出された（図２４、レーン「領域ＩＩ（ｒｅｇｉｏｎ ＩＩ）」）。マウス及びヒトのＤＮＡがコントロールサンプルとして用いられた。また、マウス及びヒトのＤＮＡの両方のターゲット配列を含むプラスミドもコントロールとして用いられた。
ガンシクロビル（ＧＣＶ）投与及びヒト肝細胞移植後のヒト血清アルブミンの産生をモニターしたところ、０．５〜１．５ｍｇ／ｋｇの量のＧＣＶがヒト肝細胞の移植に最適であることがわかった。６０のレシピエントすべてで程度に差があったものの、移植後４週間以内で被験レシピエントにおいてヒト血清アルブミンが最初に検出され、徐々に上昇し数週間後に１１．５ｍｇ／ｍｌの最高濃度に達した（図３）。移植されたヒト肝細胞は完全にレシピエントマウスの肝臓構造中に組み込まれた（図６）。置換インデックス（ＲＩ）（免疫組織染色切片中のＣＫ８／１８陽性肝細胞により占められる面積の比）は、測定されたヒト血清アルブミン濃度と強く相関していた（Ｒ^２＝０．９０４３）（図１９）。ヒト血清アルブミン濃度が＞１ｍｇ／ｍｌであるマウスにおいては、ＲＩ＞１０％である。これに基づけば、移植レシピエントの６３％（３８／６０）の肝臓は１２週間以内に１０％を超えるヒト肝細胞が再増殖した（図３）。１１例では高度に再増殖し（ＲＩ＞４０％、ヒト血清＞４ｍｇ／ｍｌ）、５例はさらに高度に再増殖した（ＲＩ＞８０％、ヒト血清＞８ｍｇ／ｍｌ）。本実施例では、凍結肝細胞を用いて、移植も１回しか行われなかった（生着したＴＫ−ＮＯＧマウスからヒト肝細胞を分離し、再度移植する連続移植法を実施していないことを意味する）にも係らずＴＫ−ＮＯＧマウスの肝臓でのヒト肝細胞の高レベルの再増殖が認められた。
異なった程度に（ＲＩが１０％、３０％及び８５％）ヒト肝細胞が再構築された３匹のＴＫ−ＮＯＧマウスを用いて、肝臓組織学、ＲＮＡ及びＤＮＡ、並びに血清タンパク質についての詳細な解析が行われた。イムノブロット解析により、複数の異なったヒトタンパク質（アルブミン、トランスフェリン、補体Ｃ３及びセルロプラスミン）がこれらのマウスの血清で検出された（図３）。Ｃ３前駆タンパク質がＣ４ｂ−Ｃ２ａ複合体（Ｃ３転換酵素）によりプロセシングされたことを示す１０５ｋＤａのヒトのＣ３α’鎖の存在は興味深い。ｕＰＡトランスジェニックマウスではヒトＣ３の血清濃度上昇が腎不全発症に寄与していると考えられており、免疫抑制剤の投与によりこれを抑制している（Ｔａｔｅｎｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６５，９０１−９１２（２００４））。しかしながら、驚くべきことにＴＫ−ＮＯＧマウスでは腎不全を発症せず、免疫抑制剤も必要としない。成熟肝細胞に存在している複数のヒトｍＲＮＡはＴＫ−ＮＯＧマウスの肝臓中でも多量に発現した（図５）。また、複数の薬剤代謝酵素（ＵＧＴ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ３Ａ４）やトランスポーターＡＢＣＣ２；ＭＲＰ２、ＡＢＣＢ１１；ＭＤＲ／ＴＡＰ）のヒトｍＲＮＡの発現がＴＫ−ＮＯＧマウスの肝臓中で確認された（図２０）。ヘマトキシリン及びエオシン染色切片において、ヒト（ＣＫ８／１８陽性）肝細胞はサイズと白っぽい細胞質によってマウス肝細胞と明確に区別された（Ａｚｕｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５，９０３−９１０（２００７）；Ｍｅｕｌｅｍａｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４１，８４７−８５６（２００５））（図６）。ヒトＣＫ８／１８陽性肝細胞はＨＬＡやヒト特異的アルブミン抗体でも染色された。これはヒトＣＫ８／１８陽性肝細胞がマウスのものではなく、紛れもなくヒト肝細胞であることを示している（図６）。グリコーゲン蓄積はヒト肝細胞の細胞質のみで見られた。再構築された肝臓はヒトとマウスの肝細胞が融合することにより生じた可能性も考えられた。しかしながら、ヒト又はマウスのアルブミンに特異的な抗体を用いた免疫蛍光２重染色及びレーザーマイクロダイセクション法で捕捉した組織中のゲノムをＰＣＲで解析した結果により、ヒトとマウスの細胞融合は否定された。
ほとんどのヒト肝細胞が移植後６週間以内に宿主肝組織の中でクローン性増殖したような小さな増殖巣として存在していた（図６）。再構築したＴＫ−ＮＯＧ肝臓中の胆管又は毛細胆管ネットワークが機能的なものであるかを評価するために、胆汁の排泄テストが蛍光代謝マーカーである５−カルボキシルフォレセインジアセテート（５−ＣＦＤＡ）を用いて行われた。５−ＣＦＤＡは脂溶性のために容易に肝細胞に入り、そこでエステラーゼにより水溶性の蛍光代謝物質（ＣＦ）に代謝され（Ｍｏｒ−Ｃｏｈｅｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，３６９２３−３６９３０（２００１））、有機アニオントランスポーターであるＭｒｐ２によって胆汁中に排出される。５−ＣＦＤＡ投与の１５分後に、５−ＣＦＤＡ代謝物質は急速に小葉上にハチの巣構造として観察され、代謝物ＣＦが毛細胆管（ＢＣ）に排出されている様子を示す（図７）。このハチの巣パターンは、ヒト特異的な抗ＨＬＡ及び抗ＭＲＰ２抗体で染色された領域中にも存在した（図７）。対照的に、ヒト大腸癌細胞株（ＨＣＴ−１１６）を移植した非トランスジェニックＮＯＧマウス肝臓に形成されたヒト大腸癌増殖巣では、ヒト特異的な抗ＨＬＡ染色で陽性を示したが、ＣＦ排泄を示すハチの巣構造は認められなかった。さらにヒト大腸癌の増殖巣では抗ヒトＭＲＰ２抗体も陰性であった（図７）。次いで、肝又は胆管システムが機能しているか、すなわち、胆汁が総胆管を通って胆嚢に集まり、十二指腸から腸管に排泄されているかが調べられた。ヒト肝細胞により排泄されたことを示すため、肝臓の９０％以上がヒト肝細胞からなるＴＫ−ＮＯＧマウス（図８）を用い、腸管への５−ＣＦＤＡ代謝物質（水溶性ＣＦ）の排泄が調べられた。５−ＣＦＤＡ投与の６時間後まで糞中にＣＦに由来する蛍光は観察されなかったが、７時間後にピークに達した（図９）。糞中でのシグナルは、５−ＣＦＤＡ投与後１０時間以内に排除されたが、このマウスの胆汁中に５−ＣＦＤＡの代謝物質がわずかに検出された（図１０）。さらに、ヒトの胆汁タンパク質（トランスフェリン）が同じ胆汁サンプル中で検出された（図１１）。マウス肝臓の９０％以上の肝細胞がヒト肝細胞に置換しているので、このマウスの腸管に排泄されたＣＦは、実質上ヒト肝細胞により代謝され、排泄されたと考えられる。これらのデータは肝胆管システムが解剖学的に正常に構築されており、異物排泄機能も正常に働いていることを示す。このことから薬物など代謝物が腸肝循環する生体機能もヒト肝再構築ＴＫ−ＮＯＧマウスは備えると考えられる。
ＴＫ−ＮＯＧマウスで再構築された肝臓が成熟ヒト肝臓の３次元構造的特性を有しているかを決定する必要があった。そこで、肝小葉内で分布特性が異なる酵素（グルタミン合成酵素（ＧＳ））の発現パターンが調べられ、再構築された肝臓で形成された小葉構造が生理機能（中心静脈域と門脈域での栄養又は酸素濃度勾配により誘導される酵素の発現）を反映しているか評価された。通常、ＧＳは中心静脈域のすぐ近くの肝細胞で発現する（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｄ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，１６０−１６４（１９８８））。移植６週間後のヒト肝細胞を含む肝小葉内にはＧＳの発現が認められず、この時点（移植から６週間）では機能的に未成熟であることを示唆する（図１２）。対照的に、移植１６週間経過した再構築肝臓では中心静脈周辺でＧＳの発現が認められた（図１２）。ヒト肝細胞で再構築された肝臓は、多数の肝臓特異的ヒト遺伝子を発現し、ヒト血清タンパク質も分泌し、また、部分的に胆管ネットワークを形成しているものの、生理的な肝機能の成熟化には移植６週間では不十分であった。異種であるヒト肝細胞により肝臓が再構築され、さらに成熟したヒト肝臓構造が形成されるまでに８〜１２週が必要であった。この結果は、マウスを用いた自己肝移植の研究（Ｂｒａｕｎ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６，３２０−３２６（２０００））において、実質の再構成が起こるのに移植から８週間を要するという報告と一致している。
これらの特性は、ＴＫ−ＮＯＧマウスに再構築されたヒト肝臓は成熟した「ヒトの肝臓という器官」であること示す。成熟肝臓の特徴である胆管ネットワークや機能的小葉構造（小葉内部位特異的酵素発現）などの３次元構造を有する新規ＴＫ−ＮＯＧプラットホームは、ヒト肝臓の移植に用いられていた公知のｕＰＡトランスジェニックマウス及びＦａｈノックアウトマウスの限界を克服する。肝胆汁ネットワークや機能的小葉構造等成熟肝臓が持つ機能は、３次元構造（細胞間）を持たない初代培養肝細胞などｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では決して再現できない。ＴＫ−ＮＯＧマウスに再構築されたヒト化肝臓は薬剤代謝や肝臓研究に好ましいプラットホームになる。

ｕＰＡ−ＮＯＧマウスの作出とその機能解析
１．方法
本実施例は以下の方法で行った。
（１）トランスジェニックマウスの作出マウスウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（Ｐｌａｕ又はｕＰＡ）遺伝子発現ユニットは図２５のように構築された。はじめにマウスｕＰＡ遺伝子が以下のプライマー；
を用いてアニーリング温度６０℃にてＰＣＲで増幅された。実施例１で記載された単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ遺伝子発現プラスミド（ｐｍＡｌｂＥＰｉｎｔＵＬ２３ＧＨ）が制限酵素Ｎｈｅ Ｉ・Ｓａｌ Ｉによって二重に消化されることによって、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ遺伝子部分が取り除かれた後に、対応部位に同酵素で処理した上記マウスｕＰＡ遺伝子（配列番号４７）がクローニングされたプラスミド（ｐｍＡｌｂＥＰｉｎｔＰｌａｕＧＨ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ４５３１８０）が得られた。ｐｍＡｌｂＥＰｉｎｔＰｌａｕＧＨプラスミドＤＮＡがＮｏｔ Ｉ及びＫｐｎ Ｉで消化され、ベクター部を含まない４．６−ｋｂフラグメントがｕＰＡ発現ユニットとして調製された。当該発現ユニットが公知の方法でＮＯＤ／Ｓｈｉマウスの受精卵にマイクロインジェクトされた。トランスジーンを有する産仔がＭｕＰＡＦ１フォワードプライマー５’−ＡＧＴＧＴＡＴＧＣＡＧＣＣＣＣＡＣＴＡＣＴＡＴＧ−３’（配列番号５０）及びｈＧＨＲ１リバースプライマー５’−ＣＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＡＡＣＴＴＣＣＡ−３’（配列番号８）を用いたＰＣＲで同定された（アニーリング温度６３℃）。尾組織から抽出したゲノムＤＮＡが２０μｌ反応混液中で、９４℃２分、９４℃３０秒３５サイクル、６３℃２０秒、６８℃６０秒、６８℃３分の条件で増幅された。トランスジーンＤＮＡはアガロースゲル上で３８３ｂｐの増幅産物バンドとして確認された。雌のトランスジェニックマウスを雄のＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ}／ＳｈｉＪｉｃ（ＮＯＧ）と交配させｓｃｉｄ及びＩＬ２Ｒｇ^ｎｕｌｌの変異を有する個体が得られた。ｓｃｉｄ及びＩＬ２Ｒｇ^ｎｕｌｌ遺伝子の変異がＰＣＲによりジェノタイピングされた（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．５１，３９１−３９３（２００２）：Ｉｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １００，３１７５−３１８２（２００２））。作製したマウスの正式系統名は、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ} Ｔｇ（Ａｌｂ−Ｐｌａｕ）１１−４／ＳｈｉＪｉｃで表され、これをｕＰＡ−ＮＯＧと称する。
（２）ＲＴ−ＰＣＲによる導入遺伝子（マウスｕＰＡ ｃＤＮＡ）トランスクリプトの検出
２９週齢のｕＰＡ−ＮＯＧマウス肝臓、腎臓及び脾臓からＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｋ．Ｋ．）を用いてトータルＲＮＡが得られた。ＲＴ−ＰＣＲはＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行われた。ｐＣＩｓｐＦ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ５’−ＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＧＴＧＴＣＣ−３’（配列番号１３）及びＭｕＰＡＲ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’−ＡＧＧＧＣＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＴＧ−３’（配列番号５１）を用いて導入遺伝子（マウスｕＰＡ ｃＤＮＡ）トランスクリプトのスプライス型が３６５ｂｐバンドとして検出された（アニーリング温度６５℃）。Ｇ３ＰＤＨＦ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ５’−ＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＡ−３’（配列番号１５）及びＧ３ＰＤＨＲ ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ５’−ＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴ−３’（配列番号１６）を用いて増幅した４７９ｂｐグリセルアルデヒド−３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ）フラグメントが内部標準として用いられた（アニーリング温度６５℃）。
（３）自然発症肝臓傷害
肝臓傷害の程度はＦＵＪＩ ＤＲＩ−ＣＨＥＭ７０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）による生化学的血清検査（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ）値の変動）により調べられた。
（４）サザンブロット分析
ゲノムＤＮＡサンプルは８週齢ｕＰＡ−ＮＯＧマウス及び非トランスジェニックマウスの肝臓及び腎臓を一晩プロテイナーゼＫで消化を行い、フェノール：クロロフォルム：エタノール抽出することにより得られた。制限酵素ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで消化したゲノムＤＮＡが０．６％アガロースゲルで電気泳動され、陽性荷電ナイロン膜（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）にトランスファーされた。ＰＣＲ ＤＩＧ Ｐｒｏｂｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）を用いて調製したＤＩＧ標識プローブを用いてハイブリダイゼーションが行われた。用いられたプライマーは以下の配列；
を有するものであった。プローブが認識する位置を図２６中の＊で示す。
（５）ヒト肝細胞の移植
市販の凍結ヒト肝細胞（Ｌｏｎｚａ Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）をドナー細胞として用い、以下の一般的な方法で移植が行われた。６週齢の成体ヘミ接合型及びホモ接合型ｕＰＡ−ＮＯＧマウスがレシピエントとして用いられた。細胞数及び生存率はトリパンブルー排除法により血球計算盤を用いて測定された。４０μｌのＨａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）又はＷｉｌｌｉａｍ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ Ｅに浮遊させた１〜２×１０^６の生肝細胞が２６ゲージの注射針をつけたハミルトンシリンジを用いて脾臓内に移植された。
（６）ヒトアルブミン測定
小量の血液が隔週で眼底静脈叢からプラスティックキャピラリーを用いて採取された。採取された血液は、１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＢＳＡ）を含むＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で５００〜３００００倍に希釈され、そのヒトアルブミン濃度がヒトアルブミンＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定された。閾値濃度は〜３×１０^３ｎｇ／ｍｌであった。
（７）イムノブロッティング
希釈血清サンプル（希釈倍率：２０００倍）が５％βメルカプトエタノール含有ＳＤＳサンプルバッファーに溶解され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供された後に、Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に転写された。転写された膜がビオチン標識ポリクローナルヤギ抗マウスアルブミン抗体（Ａ９０−２３４Ａ；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びビオチン標識ポリクローナルヤギ抗ヒトアルブミン抗体（Ａ８０−２２９Ａ；Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベーションされ、洗浄後の当該膜は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に６０分間インキュベーションされた。ビオチン標識はＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ Ｍｉｎｉ−Ｂｉｏｔｉｎ−ＸＸ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，ＣＡ，ＵＳＡ）により行われ、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＨｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた発色が検出された。
（８）組織学及び免疫組織染色
フォルマリン固定した組織がパラフィンに包埋され、５μｍ切片を調製してヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）、及びポリクローナルヤギ抗ヒトアルブミン抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１次抗体とした免疫組織染色が行われた。ヤギＩｇがアミノ酸ポリマー／ペルオキシダーゼ複合体標識抗体（Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｉｎ Ｍｏｕｓｅ ＭＡＸ ＰＯ（Ｇ）；Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びジアミノベンジジン（ＤＡＢ；Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）基質（０．２ｍｇ／ｍｌ ３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド，０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，ａｎｄ ０．００５％ Ｈ_２Ｏ_２）を用いて可視化され、ヘマトキシリンを用いて対比染色が行われた。
２．結果
結果は以下のとおりであった。
（１）ｕＰＡトランスジェニックＮＯＧマウスのキャラクタライゼーション
ｕＰＡのトランスジーン構造はマウスアルブミンエンハンサ／プロモーター（Ａｌｂ Ｅｎ／Ｐｒｏ）、キメライントロン、ｍｏｕｓｅ ｕＰＡ ｃＤＮＡ、及びポリアデニル化シグナル（ｈＧＨｐＡ）と共にヒト成長ホルモンの遺伝子の３’−ＵＴＲからなる。図２５にその構造を示す。矢尻はトランスジーン特異的な転写物を検出するのに使用したプライマーの位置と方向を示す。それぞれの矢の先はオリゴヌクレオチドの３’末端を表す。ＮＯＧ系統ではｓｃｉｄ変異が引き起こすＤＮＡ再構成の欠陥により、遺伝子断片をマイクロインジェクトしても得られる産仔の数がきわめてすくない。そのためはじめに、ＮＯＤ／Ｓｈｉ系統でｕＰＡ−遺伝子トランスジェニックマウスが確立された（ｕＰＡ−トランスジェニック；系統１１−４）。ＮＯＧマウスの遺伝背景はＮＯＤ／Ｓｈｉ系統そのものであり、ｓｃｉｄとＩＬ２Ｒｇ^ｎｕｌｌ変異が唯一の違いであるため、その後、ＮＯＧ系統と交配することにより、ｓｃｉｄとＩＬ２Ｒｇ^ｎｕｌｌ変異を保有させ、重度の免疫不全系統であるＮＯＧ−Ｔｇ（Ａｌｂ−Ｐｌａｕ）１１−４／ＳｈｉＪｉｃ（正式には、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｓｕｇ} Ｔｇ（Ａｌｂ−Ｐｌａｕ）１１−４／ＳｈｉＪｉｃ，ａｂｒｉｄｇｅｄ ｎａｍｅ：略してｕＰＡ−ＮＯＧと呼ぶ）が得られた。従来技術で観察されていたようなｕＰＡトランスジェニックな胎生致死はホモ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウスでは観察されず、驚くべきことにｕＰＡ−ＮＯＧマウスはそのホモ系統での維持が可能であった。
図２７に、ｕＰＡトランスジーン発現をＲＴ−ＰＣＲで解析した結果を示す。ｕＰＡトランスジーンの検出は、正確にスプライシングされたキメライントロンの配列を特異的に認識するプライマーを用いられた。非トランスジェニックＮＯＧマウス（Ｗｉｌｄ）、ヘミ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／＋）、ホモ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／Ｔｇ）の肝臓（Ｌｉｖｅｒ）、腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）についてその検出が行われ、ヘミ接合型及びホモ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウスの肝臓においてその発現が確認された。グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ）が内部標準として使用された。
図２８は、ヘミ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／＋）及びホモ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／Ｔｇ）における肝傷害マーカー・血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の活性を示す図である。ヘミ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／＋）における肝傷害マーカー値は、点線で示す非トランスジェニックＮＯＧマウス（Ｗｉｌｄ）の値に対し有意な差は認められなかった。一方、ホモ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／Ｔｇ）におけるＡＬＴ活性は生後６週以降、ヘミ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／＋）及び非トランスジェニックＮＯＧマウス（Ｗｉｌｄ）に対し有意な上昇が認められ、１４週まで継続することが認められた。
ホモ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／Ｔｇ）肝臓の肉眼像（図２９Ａ）及び肝細胞傷害像（図２９Ｂ及びＣ）を図２９に示す。非特許文献６のｕＰＡトランスジェニックマウスでは肝臓自体の白色変性が報告されているが、驚くべきことに本発明のｕＰＡ−ＮＯＧマウスでは生後６週のホモ接合型マウス（Ｔｇ／Ｔｇ）の肝臓でも肉眼的異常は認められなかった。生後６週のホモ接合型マウス（Ｔｇ／Ｔｇ）の肝臓のＨ＆Ｅ染色像を図２９Ｂに示す。主として中心静脈域に肝細胞の退行変性巣やエオシン好性体が見られた。生後１６週のホモ接合型ではエオシン好性体の増加を伴う肝細胞メガロサイトーシスが顕著に認められた（図２９Ｃ）。
図３０に、ｕＰＡ−ＮＯＧマウスに導入されたｕＰＡトランスジーンのサザンブロット法による分子解析の結果を示す。非トランスジェニックＮＯＧマウス腎臓（Ｋｉｄ．（Ｗ））とｕＰＡ−ＮＯＧマウス腎臓（Ｋｉｄ．（Ｔｇ））及びｕＰＡ−ＮＯＧマウス肝臓（Ｌｉｖ．（Ｔｇ））からのゲノムＤＮＡサンプルをサザンブロット解析のためにＸｂａ Ｉ及びＸｈｏ Ｉで消化した（図３０左）。遺伝子導入に使用した４．６−ｋｂのｕＰＡ発現ユニット（Ｃｏｎｔ．）が陽性対照として使用された。非特許文献６のｕＰＡトランスジェニックマウスでは肝臓でのトランスジーン欠失が報告されているが、驚くべきことに本発明のｕＰＡ−ＮＯＧマウスでは肝臓でのトランスジーン欠失は認められなかった。非トランスジェニックＮＯＧマウス腎臓（Ｗｉｌｄ）及びｕＰＡ−ＮＯＧマウス腎臓（Ｔｇ）からのゲノムＤＮＡサンプルをサザンブロット解析のためにＢｇｌ ＩＩ及びＢａｍ ＨＩで消化した（図３０右）。解析の結果、ｕＰＡ−ＮＯＧマウスは少なくとも３コピーのｕＰＡ発現ユニットを保有することが明らかとなった。
図２６に、ｕＰＡ−ＮＯＧマウスのトランスジーンの制限地図と構造を示す。Ｘｂａ Ｉ（Ｘｂ）、Ｂｇｌ ＩＩ（Ｂｇ）、Ｂａｍ ＨＩ（Ｂａ）及びＸｈｏ Ｉ（Ｘｈ）による切断部位を示す。アスタリスクはＤＩＧによってラベルされたプローブで認識される位置を示す。
（２）ｕＰＡ−ＮＯＧマウスへのヒト肝細胞の移植と肝再構築
図３１にヒトの肝細胞を移植したヘミ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／＋）（図３１Ａ）及びホモ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／Ｔｇ１）（図３１Ｂ）の肝臓肉眼像を示す。驚くべきことに、ヒト肝細胞の移植から１０週後においても、非特許文献６で報告されている白色変性は認められなかった。
図３２にｕＰＡ−ＮＯＧマウスの血清ヒトアルブミン濃度の推移（図３２Ａ）と体重変化（図３２Ｂ）を示す。ヘミ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／＋）における血清ヒトアルブミン濃度は、点線で示す非トランスジェニックＮＯＧマウス（Ｗｉｌｄ）の値と同レベルであり、ヒト肝細胞の生着が確認されなかった。一方、ホモ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／Ｔｇ１及び２）における血清ヒトアルブミン濃度はヒト肝細胞移植後約４週から上昇し、移植した２例中２例とも血清ヒトアルブミン濃度が１ｍｇ／ｍｌ以上、すなわち、ヒト肝細胞による置換率が１０〜１５％となった。１例は更に上昇を続け、血清ヒトアルブミン濃度が６．５ｍｇ／ｍｌにまで達した。ヒト肝細胞が移植されたホモ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／Ｔｇ１及び２）の成長は良好であった。これらのマウス血清を免疫ブロット法により解析した結果を図３３に示す。マウス及びヒト血清が陽性及び陰性コントロールとして用いられた。抗ヒトアルブミン抗体ではヒト肝細胞が移植されたホモ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／Ｔｇ１及び２）とヒト血清のみで６５ｋＤａのバンドが認められた。抗マウスアルブミン抗体ではヒト血清以外で６５ｋＤａのバンドが認められた。
ヒト肝細胞移植１０週後のホモ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウス（Ｔｇ／Ｔｇ１及び２）の抗ヒトアルブミン抗体による免疫染色及びＨ＆Ｅ染色結果を図３４に示す。Ｔｇ／Ｔｇ１ホモ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウスにおける血清ヒトアルブミン濃度は１．８ｍｇ／ｍｌに達し、抗ヒトアルブミン抗体染色では切片上の約２０％がヒト肝細胞であった（図３４Ａ）。一方、血清ヒトアルブミン濃度が６．５ｍｇ／ｍｌに達したＴｇ／Ｔｇ２ホモ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウスの抗ヒトアルブミン抗体染色では切片上の約８０％がヒト肝細胞であった（図３４Ｂ）。Ｔｇ／Ｔｇ１ホモ接合型トランスジェニックｕＰＡ−ＮＯＧマウスにおける抗ヒトアルブミン抗体染色陽性部（図３４Ｃ）はＨ＆Ｅ染色において細胞質が透明でああることが観察された（図３４Ｄ）。上記の観察はヒト肝細胞中に蓄積したグリコーゲン顆粒がＨ＆Ｅ染色で透明になるという非特許文献２及び４の報告と一致する。

医薬の血漿中動態、代謝物の同定、代謝速度等の評価
１．ヒト化肝臓を有するマウス生体内でのＤｅｂｒｉｓｏｑｕｉｎ（ＤＢ）又はＳ−Ｗａｒｆａｒｉｎｅ（ＷＦ）の代謝試験
肝臓の５０％以上がヒト肝細胞によって置換されたキメラマウス（ｈｕ−Ｌｉｖｅｒ：血液中のヒトアルブミン濃度が４．５ｍｇ／ｍＬ以上）に対し、ＤＢ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）が２．０ｍｇ／ｋｇの用量にて強制経口投与、又は、ＷＦ（和光純薬工業株式会社）が３０ｍｇ／ｋｇの容量にて腹腔内投与された。ＤＢ又はＷＦ投与後０、０．５、１、２、４、７及び２４時間後に４０μｌ容量の血液試料が眼窩採血により回収され、当該血液より血漿が遠心分離によって分離された。
２．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＤＢ、４−ヒドロキシＤＢ（４−ＯＨ ＤＢ）、ＷＦ及び７−ヒドロキシＷＦ（７−ＯＨ ＷＦ）の定量
ＤＢ及び４−ＯＨ ＤＢの血漿中濃度は以下の方法で測定された。マウス血漿５μＬに蒸留水１５０μＬを添加し、内標準物質である２０ｎＭ ｉｍｉｐｒａｍｉｎｅのエタノール溶液が２０μｌ混入された後に、固相抽出にかけられた。５％メタノールで洗浄した後、２−プロパノール／アセトニトリル混液で溶出された。溶出液がＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて定量された。観測イオンはＤＢに対してはｍ／ｚ １７６及び１３４、４−ＯＨ ＤＢに対してはｍ／ｚ １９２及び１３２、内標準物質に対してはｍ／ｚ ２８１及び８６であった。
ＷＦ及び７−ＯＨ ＷＦの血漿中濃度は以下の方法で測定された。マウス血漿５μＬに蒸留水１５０μＬを添加し、内標準物質である５０ｎＭ ２−ｂｅｎｚｙｌｐｈｅｎｏｌのエタノール溶液が２０μｌ混入された後に、固相抽出にかけられた。５％メタノールで洗浄した後、２−プロパノール／アセトニトリル混液で溶出された。溶出液が前記と同様にＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて定量された。
３．薬物動態解析
解析ソフトＷＩｎＮｏｎｌｉｎを用いてＤＢ、４−ＯＨ ＤＢ、ＷＦ及び７−ＯＨ ＷＦの血漿中濃度から、血漿中薬物濃度下面積（ＡＵＣ）が算出された。統計解析はＳＡＳプログラムを用いて実施された。指定時間経過後のｄｅｂｒｉｓｏｑｕｉｎ、および、ＣＹＰ２Ｄ６によるその代謝産物４’−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｂｒｉｓｏｑｕｉｎの血液中濃度がそれぞれ図３５Ａ及び図３５Ｂに示される。Ｄｅｂｒｉｓｏｑｕｉｎの血液中濃度変化は、コントロールであるＮＯＧとｈｕ−Ｌｉｖｅｒの間に差を認めなかったが（図３５Ａ）、４’−ｈｙｄｒｏｘｙｄｅｂｒｉｓｏｑｕｉｎは、いずれの時間においてもＮＯＧに比べｈｕ−Ｌｉｖｅｒにて高濃度で検出された（図３５Ｂ）。算出されたＡＵＣ値は、ＮＯＧに比べｈｕ−Ｌｉｖｅｒで有意に高値であった（図３５Ｃ）。同様に、ｗａｒｆａｒｉｎを投与したとき、ＣＹＰ２Ｃ９によるその代謝産物７−ｈｙｄｒｏｘｙｗａｒｆａｒｉｎのＡＵＣ値はコントロールに比べｈｕ−Ｌｉｖｅｒで高値を示した（図３５Ｄ）。ＣＹＰ２Ｄ６、および、ＣＹＰ２Ｃ９による代謝反応は、マウスでは進行しにくいことが知られており、Ｄｅｂｒｉｓｏｑｕｉｎ、および、Ｗａｒｆａｒｉｎのこれら酵素による各代謝産物がコントロールに比較してｈｕ−Ｌｉｖｅｒにおいてより多量に検出された結果は、キメラマウスに生着したヒト肝細胞がマウス生体内においても機能性を保持し、これら代謝反応へ寄与していることを示唆するものである。

ドナー細胞中の増殖性細胞（肝幹細胞、肝前駆細胞等）の検出
１．ヒト正常肝細胞の移植
市販の凍結ヒト肝細胞がドナー細胞として用いられ、以下の一般的な方法で移植が行われた。ＴＫ−ＮＯＧマウスにおいては、６〜８週齢の成体がレシピエントとして用いられ、移植の５及び３日前にＧＣＶ（０．５〜１．５ｍｇ／ｋｇ）が腹腔内に投与された。ｕＰＡ−ＮＯＧにおいては、６週齢の成体ホモ接合体がレシピエントとして用いられた。４０μｌのＨａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）又はＷｉｌｌｉａｍ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ Ｅに浮遊させた１〜２×１０^６の肝細胞が２６ゲージの注射針をつけたハミルトンシリンジを用いて脾臓内に移植された。
２．増殖性ヒト細胞の検出
フォルマリン固定された肝臓がパラフィンに包埋され、その５μｍ切片が調製された。切片はｔａｒｇｅｔ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．１Ｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ６．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ９．０）に浸漬され１０分間オートクレーブの処理を受けた後に２０分間室温に置かれた。モノクローナルマウス抗ヒトＫｉ−６７ａｎｔｉｇｅｎ抗体（ｃｌｏｎｅ ＭＩＢ−１；Ｄａｋｏ）が１次抗体として用いられた。明視野免疫組織染色のために、マウスＩｇがアミノ酸ポリマー／ペルオキシダーゼ複合体標識抗体（Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｔａｉｎ Ｍｏｕｓｅ ＭＡＸ ＰＯ（Ｍ）；Ｎｉｃｈｉｒｅｉ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びジアミノベンジジン（ＤＡＢ；Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）基質（０．２ｍｇ／ｍｌ ３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド，０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．６，ａｎｄ ０．００５％ Ｈ_２Ｏ_２）を用いて可視化された。切片がヘマトキシリンを用いて対比染色された。
３．ヒト化肝臓を有するマウスにおけるヒト増殖性肝細胞の検出
ＴＫ−ＮＯＧ、および、ｕＰＡ−ＮＯＧマウス肝臓に生着したヒト正常肝細胞を細胞増殖マーカー（ＭＩＢ−１）で免疫染色した結果を図３６に示した。Ｋｉ−６７抗原は機能面で不明な点も多いが、Ｓ期で発現量の増加がおこり、Ｍ期で最大となるといわれている。そのため、Ｋｉ−６７抗原の発現が見られた細胞は、細胞周期に入っていることを表わしている。図３６ＡではＴＫ−ＮＯＧマウス肝臓に形成されたヒト肝細胞コロニー中に、細胞増殖マーカー（抗ヒトＫｉ−６７抗原）陽性細胞が多数認められた。また、ｕＰＡ−ＮＯＧマウス肝臓に形成されたヒト肝細胞コロニー中にも細胞増殖マーカー陽性細胞が同様に認められた（図３６Ｂ）。
市販のヒト正常肝細胞（肝臓を酵素処理で分散した細胞）は肝臓中のすべての細胞集団を含んでいる。この細胞をドナー細胞としてＴＫ−ＮＯＧ、および、ｕＰＡ−ＮＯＧマウスに移植したいずれの場合も肝臓内にヒト肝細胞コロニーが形成された。更にヒト肝細胞コロニー中にはヒト特異的な細胞増殖マーカー染色陽性の細胞が認められた。このことはドナー細胞中に分裂増殖する能力を有する肝細胞、あるいは肝前駆細胞、肝幹細胞が存在することを示し、本発明のマウスを用いることにより、容易にドナー細胞中の肝前駆細胞や肝幹細胞の存在を評価することが可能となる。

ＴＫ−Ｂａｌｂ／ｃ ｄＫＯマウス、及び、ＴＫ−ＮＯＤ ｄＫＯマウスを用いたヒト肝臓再構築キメラマウスの作製
１．ＴＫ−Ｂａｌｂ／ｃ ｄＫＯマウスの作製
ＴＫ−Ｂａｌｂ／ｃ ｄＫＯマウスは、ＴＫ−ＮＯＧマウスとＢａｌｂ／ｃＡ ｄＫＯマウス（ＲＡＧ−２ ＫＯ，ＩＬ−２Ｒ^ｎｕｌｌ）を交配した結果得られたＦ１世代マウスと、Ｂａｌｂ／ｃＡ ｄＫＯマウスとの交配を繰り返すことにより作製された。Ｂａｌｂ／ｃＡ ｄＫＯマウスによる戻し交配の過程において、産仔マウスのＨＳＶ−Ｔｋ、ＳＣＩＤ、ＲＡＧ−２、及び、ＩＬ−２Ｒ遺伝子の検査が行われ、遺伝背景をＢａｌｂ／ｃとするＴＫ−Ｂａｌｂ／ｃ ｄＫＯマウス（ＨＳＶ−Ｔｋ（＋），ＳＣＩＤ ｗｉｌｄ，ＲＡＧ−２ ＫＯ，ＩＬ−２Ｒ^ｎｕｌｌ）が得られた。
２．ＴＫ−ＮＯＤ ｄＫＯマウスの作製
ＴＫ−ｄＫＯマウスは、ＴＫ−ＮＯＧマウスとＮＯＤ ｄＫＯマウス（ＲＡＧ−２ ＫＯ，ＩＬ−２Ｒ^ｎｕｌｌ）を交配した結果得られたＦ１世代マウスと、ＮＯＤ ｄＫＯマウスとの交配を繰り返すことにより作製された。ＮＯＤ ｄＫＯマウスによる戻し交配の過程において、産仔マウスのＨＳＶ−Ｔｋ、ＳＣＩＤ、ＲＡＧ−２、及び、ＩＬ−２Ｒ遺伝子の検査が行われ、遺伝背景をＮＯＤとするＴＫ−ＮＯＤ ｄＫＯマウス（ＨＳＶ−Ｔｋ（＋），ＳＣＩＤ ｗｉｌｄ，ＲＡＧ−２ ＫＯ，ＩＬ−２Ｒ^ｎｕｌｌ）が得られた。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子型検査用プライマーとして以下の配列；
ｓｃｉｄ遺伝子型検査用プライマーとして以下の配列；
ＲＡＧ２／ＩＬ−２Ｒ遺伝子型検査用プライマーとして以下の配列；
ＩＬ−２Ｒ遺伝子型検査用プライマーとして以下の配列；
が、実施例１に記載されたＰＣＲで使用された方法に準じたＰＣＲ反応に用いられた。
３．ＴＫ−Ｂａｌｂ／ｃ ｄＫＯマウス、及び、ＴＫ−ＮＯＤ ｄＫＯマウスを用いたヒト肝臓再構築キメラマウスの作製
ヒト肝キメラマウスはＴＫ−ＮＯＧマウスでの方法に準じて作製された。ＴＫ−Ｂａｌｂ／ｃ ｄＫＯマウス、及び、ＴＫ−ＮＯＤ ｄＫＯマウスの腹腔内にＧＣＶが５ｍｇ／ｋｇで隔日にて２回投与された。２回目のＧＣＶ投与後の３日目に、ＨＢＳＳに懸濁されたヒト肝細胞が２６Ｇの注射針を備えたハミルトンシリンジを用いてマウス脾門部より移植された。血中ＧＰＴ値の経過観察に基づくと、高い肝傷害がモニターされたにもかかわらず当該肝傷害を有するマウスの著しい体重減少は認められなかった。血液中にヒトアルブミンが確認された個体は安楽死され、その肝臓が採取された。採取された肝臓から、パラフィン包埋された組織切片が作製され、当該切片に対して抗ヒトサイトケラチン８／１８抗体による免疫組織染色が行われた。ヒト肝細胞を移植したＴＫ−Ｂａｌｂ／ｃ ｄＫＯマウス、及び、ＮＯＤ ｄＫＯマウスの肝臓の抗ヒトサイトケラチン８／１８抗体による免疫組織染色像が、それぞれ図３７Ａ、及び、図３７Ｂに示される。ＴＫ−Ｂａｌｂ／ｃ ｄＫＯマウス、及び、ＮＯＤ ｄＫＯマウスにおける、ヒトサイトケラチン８／１８抗体にて染色されるヒト肝細胞の生着が確認された。

本発明のマウスは肝臓細胞がヒト肝臓細胞に置換されたマウスであり、ヒトの肝臓の構造又は機能を有するマウスである。本発明のマウスを用いてヒトに特異的な肝炎ウイルスの感染や、投与された薬剤の代謝、又は、ヒト肝臓の増殖を解析することが可能である。
本発明のヒトの肝細胞が移植されたマウスは、ヒトの肝臓の機能を発揮し得、医薬のヒト肝臓における代謝のされやすさ等を評価することができる。

配列番号２〜４６、４８〜６３ プライマー
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］

Claims (32)

1. ヒト単純ヘルペスウイルス１型-チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子がその肝臓において特異的に発現可能に保持され、マウスの肝細胞の80％以上がヒトの肝細胞に置換され、ヒト肝臓が再構築され該肝臓がヒト肝臓の３次元的構造及びヒト肝臓の機能を有している、ヒトの肝細胞が移植されたNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウス。
2. マウスの肝細胞の90%以上がヒトの肝細胞に置換された請求項１に記載のヒトの肝細胞が移植されたNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウス。
3. ヒト肝臓の肝胆管システムが構築され、ヒト肝臓の機能的小葉構造を有し、肝臓の異物排泄機能が正常に働いている、請求項１又は２に記載のヒトの肝細胞が移植されたNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウス。
4. ヒトの肝細胞がヒト肝細胞株である請求項１から３のいずれか１項に記載のヒトの肝細胞が移植されたNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウス。
5. ヒト肝細胞株が、HepG2、Hep3B、又はHuH-7である請求項４に記載のヒトの肝細胞が移植されたNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウス。
6. ヒトの肝細胞が初代培養された肝細胞である請求項１から３のいずれか１項に記載のヒトの肝細胞が移植されたNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウス。
7. ヒト単純ヘルペスウイルス１型-チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子がアルブミンプロモーター、LST-1プロモーター、αフェトプロテインプロモーター、又はα-TTPプロモーターの制御下に配置されることによりヒト単純ヘルペスウイルス１型-チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子がその肝臓において特異的に発現可能に保持される請求項１から６のいずれか１項に記載のヒトの肝細胞が移植されたNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウス。
8. さらに、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子遺伝子がその肝臓において特異的に発現可能に保持された請求項１から７のいずれか１項に記載のヒトの肝細胞が移植されたNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウス。
9. ヒト単純ヘルペスウイルス１型-チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子がその肝臓において特異的に発現可能に保持され、マウスの肝細胞がヒトの肝細胞に置換され、ヒト肝臓が再構築され該肝臓がヒト肝臓の３次元的構造及びヒト肝臓の機能を有しており、マウスの肝細胞の80%以上がヒトの肝細胞に置換された、ヒトの肝細胞が移植されたNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスの作製方法であって、
   (i) ヒト単純ヘルペスウイルス１型-チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子をNOD/Shiマウスの受精卵にマイクロインジェクトする工程、
   (ii) (i)の工程で得られた、ヒト単純ヘルペスウイルス１型-チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子を有するNOD/ShiマウスをNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスと交配させ、NOD.Cg-Prkdc ^scid Il2rg ^tm1Sug Tg(Alb-UL23)7-2/ShiJicマウス（TK-NOG)であるNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスを得る工程、及び
   (iii) 該マウスに自殺基質、及びヒトより単離された肝細胞を投与し、マウス肝細胞を傷害しマウス肝細胞をヒト肝細胞で置換する工程を含む、ヒトの肝細胞が移植されたNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスの作製方法。
10. 自殺基質がチミジンキナーゼにより毒性物質に代謝される物質である請求項９に記載のヒトの肝細胞が移植されたNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスの作製方法。
11. 毒性物質に代謝される物質がアシクロビル、又はガンシクロビルである請求項１０に記載のヒトの肝細胞が移植されたNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスの作製方法。
12. ヒトの肝細胞がヒト肝細胞株である請求項９から１１のいずれか１項に記載のヒトの肝細胞が移植されたNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスの作製方法。
13. ヒト肝細胞株が、HepG2、Hep3B、又はHuH-7である請求項１２に記載のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスの作製方法。
14. ヒトの肝細胞が初代培養された肝細胞である請求項９から１１のいずれか１項に記載のヒトの肝細胞が移植されたNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスの作製方法。
15. ヒト単純ヘルペスウイルス１型-チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子がアルブミンプロモーター、LST-1プロモーター、αフェトプロテインプロモーター、又はα-TTPプロモーターの制御下に配置されることによりヒト単純ヘルペスウイルス１型-チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子がその肝臓において特異的に発現可能に保持されることを特徴とする請求項９から１４のいずれか１項に記載のヒトの肝細胞が移植されたNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスの作製方法。
16. 請求項９から１５のいずれか１項に記載の方法で得られたヒトの肝細胞が移植されたNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウス。
17. 請求項１から８及び１６のいずれか１項に記載のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスを用いて被験物質の血漿中動態を測定する方法。
18. 請求項１から８及び１６のいずれか１項に記載のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスを用いて被験物質の代謝物を同定する方法。
19. 請求項１から８及び１６のいずれか１項に記載のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスから単離された肝細胞を用いて被験物質の代謝物を同定する方法。
20. 請求項１から８及び１６のいずれか１項に記載のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスを用いて被験物質の代謝速度を測定する方法。
21. 以下の工程；
    (i) 請求項１から８及び１６のいずれか１項に記載のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスを作製する工程；及び
    (ii) ヒトHCVを(i)に記載のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスに接種する工程；
    を含む、ヒトＣ型肝炎ウイルス（HCV）が感染したNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスを作製する方法。
22. 請求項２１に記載の方法で作製されるヒトＣ型肝炎ウイルス（HCV）が感染したNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウス。
23. 以下の工程；
    (i) 請求項１から８及び１６のいずれか１項に記載のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスにヒトHCVを投与する工程；及び
    (ii) 宿主内でヒトHCVの複製が起こる十分な期間をおいた後にヒトHCVを感染宿主から単離する工程；
    を含む、ヒトＣ型肝炎ウイルス（HCV）の培養方法。
24. 以下の工程；
    (i) 請求項１から８及び１６のいずれか１項に記載のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスに候補薬剤を投与する工程；及び
    (ii) 候補薬剤がHCV感染に及ぼす作用を分析する工程であって、未投与のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスに対する、又は候補薬剤投与前のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスにおける感染量に対するヒトHCVの感染量の低下が、該薬剤の抗HCV活性を意味する工程；
    を含む、抗HCV活性を有する候補薬剤をスクリーニングする方法。
25. 候補薬剤をヒトHCVの感染前に投与する、請求項２４記載の方法。
26. 抗HCV活性を有する候補薬剤が抗HCV抗体又はそのHCV結合性断片である、請求項２４又は２５に記載の方法。
27. 以下の工程；
    (i) 請求項１から８及び１６のいずれか１項に記載のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスの免疫を再構成する工程；
    (ii) (i)に記載のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスに候補ワクチンを投与する工程；及び
    (iii) 該ワクチンがHCV感染に及ぼす作用を分析する工程であって、未投与のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスに対する、又は該ワクチン投与前のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスにおける感染量に対するヒトHCVの感染量の低下が、該ワクチンの抗HCV活性を意味する工程；
    を含む、能動免疫療法に用いる抗HCV活性を有する候補ワクチンをスクリーニングする方法。
28. 以下の工程；
    (i) 請求項１から８及び１６のいずれか１項に記載のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスの免疫を再構成する工程；
    (ii) (i)に記載のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスに治療用ワクチン接種用の候補ワクチンを投与する工程；及び
    (iii) 該ワクチンがHCV感染に及ぼす作用を分析する工程であって、未投与のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスに対する、又は該ワクチン投与前のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスにおける感染量に対するヒトHCVの感染量の低下が、該ワクチンの抗HCV活性を意味する工程；
    を含む、抗HCV活性を有する治療用ワクチン接種用の候補ワクチンをスクリーニングする方法。
29. 請求項１から８及び１６のいずれか１項に記載のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスを用いて肝幹細胞を探索する方法であって、NOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスに生着した肝組織から肝幹細胞を同定することを含む方法。
30. 請求項１から８及び１６のいずれか１項に記載のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスを用いて肝幹細胞を含む細胞集団を採取する方法であって、NOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスに生着した肝組織から肝幹細胞を含む細胞集団を採取することを含む方法。
31. 請求項１から８及び１６のいずれか１項に記載のNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスを用いて再構築されたヒト肝臓組織。
32. (i) ヒト単純ヘルペスウイルス１型-チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子をNOD/Shiマウスの受精卵にマイクロインジェクトする工程、及び
    (ii) (i)の工程で得られた、ヒト単純ヘルペスウイルス１型-チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子を有するNOD/ShiマウスをNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウスと交配させる工程により得られる、
    ヒト単純ヘルペスウイルス１型-チミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子がその肝臓において発現可能に保持され、ヒト肝細胞を肝臓に生着させることができるNOD.Cg-Prkdc ^scid Il2rg ^tm1Sug Tg(Alb-UL23)7-2/ShiJicマウス（TK-NOG)であるNOG（NOD/SCID/γc ^null ）マウス。