CN102281758B - 移植了人肝细胞的小鼠 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种移植了人肝细胞的小鼠。在所述移植了人肝细胞的小鼠中，外源胸苷激酶基因或尿激酶型纤溶酶原激活物基因保持在小鼠肝脏中且能进行特异性表达，并且小鼠肝细胞被人肝细胞置换。

Description

移植了人肝细胞的小鼠
技术领域
本发明涉及一种移植了人肝细胞的小鼠，在该小鼠中胸苷激酶基因保持在小鼠肝脏中且能进行表达，对该小鼠给予了鸟嘌呤核苷类似物和从人分离出的肝细胞。进而，本发明涉及一种NOG小鼠，所述NOG小鼠移植了人肝细胞，在该小鼠中尿激酶型纤溶酶原激活物因子基因保持在小鼠肝脏中且能进行表达，对该小鼠给予了从人分离出的肝细胞。并且，本发明涉及一种移植了人肝细胞的小鼠的制备方法，该制备方法包含如下步骤：对胸苷激酶基因保持在小鼠肝脏中且能进行表达的小鼠给予鸟嘌呤核苷类似物和从人分离出的肝细胞。本发明还涉及使用上述小鼠测定被测物质在血浆中的动态的方法、鉴定被测物质的代谢物的方法以及测定被测物质的代谢速度的方法。进而，涉及使上述小鼠感染肝指向性病原体而得到的小鼠模型、使用该小鼠模型筛选针对肝指向性病原体的药剂和疫苗的方法。 
背景技术
迄今为止，一些研究小组制备出了保持人肝细胞的免疫耐受小鼠，所述免疫耐受小鼠用于解析人特异性肝炎病毒的感染、给予的药剂的代谢或人肝脏的增殖。这些小鼠是对免疫缺陷小鼠移植人肝细胞而得到的，尿激酶型纤溶酶原激活物因子(uPA)的转基因保持在小鼠肝脏中且能够进行表达。已知上述小鼠能够感染人特异性肝炎病毒(非专利文献1和2)。并且，已知来源于上述小鼠的肝细胞表达在人肝脏中发现的酶(非专利文献3)，由被测物质生成了人特异性代谢物(非专利文献4)。 
已知即使为人肝细胞的置换率低为50％左右、人肝细胞移植后 存活时间为50天左右的小鼠，也能够用于上述肝炎病毒感染试验等一定的目的(专利文献1和2)。另一方面，例如为了测定人的治疗用药剂在血浆中的动态或其代谢物，需要尽可能排除来源于宿主动物的肝细胞所产生的影响，因而寻求提高人肝细胞的置换率。但是，由于uPA转基因激活纤溶酶原，所以uPA转基因的表达对其自身、肝干细胞引起持续性且进行性的损伤，所述纤溶酶原调节对肝细胞增殖重要的基质金属蛋白酶的活性。因此，uPA转基因的纯合子的胚胎致死率高达30％，并且，认为肝细胞的移植时期也限制在5～17日龄(专利文献1)，并且由于在进行了杂合子的系统的维持后得到的纯合子不至于致死，所以需要进行大鼠肝细胞移植等处置(专利文献2)，其系统维持需要繁杂的作业，同时制备出具有所期望的特性的小鼠的频率也极低。另外，已知肾损伤及低繁殖率等副作用多。因此，作为促进宿主成长、提高人肝细胞的置换率的尝试，已经进行了下述尝试：对宿主小鼠给予来自人补体的用于防御攻击的药剂(专利文献3)；给予人成长激素(专利文献4)。另外，还尝试着进行了如下实验：通过在人肝细胞移植前日给与除去与排斥反应相关的小鼠NK细胞的抗体、即抗单唾液酸神经节苷脂(Anti asialo GM1)抗体来提高人肝细胞的置换率。已知上述小鼠中的人肝细胞的置换率保持在70％左右。 
最近，已经制备出以延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)基因敲除小鼠(Fah-/-/Rag2-/-/II2rg-/-)(FRG小鼠)为宿主的嵌合体小鼠(非专利文献4)。但是，由于腺病毒自身没有物种特异性，所以认为其残存在小鼠中有可能导致对人肝细胞的损伤。事实上，FRG小鼠的人血清白蛋白的水平比基于FRG小鼠中人肝细胞的置换水平的期望值低，没有观察到人肝细胞特异性的药物代谢酶的一些基因以基于FRG小鼠中人肝细胞的置换水平所期待的水平进行表达(非专利文献5)。 
专利文献1：国际公开第WO2001067854号说明书 
专利文献2：国际公开第WO2001087059号说明书 
专利文献3：国际公开第WO2003080821号说明书 
专利文献4：国际公开第WO2007004547号说明书 
非专利文献1：Dandri，M.et al.J.Hepatol.(2005)42，54-60 
非专利文献2：Tateno，C.et al.Am.J.Pathol.(2004)165，901-912 
非专利文献3：Katoh，M.et al.J.Pharm.Sci.(2007)96，428-437 
非专利文献4：Azuma，H.et al.Nat.Biotechnol.(2007)25，903-910 
非专利文献5：Shafritz，DA.et al.Nat.Biotechnol.(2007)25，871-872 
非专利文献6：Sandgren，EP.et al.Cell(1991)66，245-256 
发明内容
本发明是鉴于上述状况而完成的，本发明的目的在于提供一种移植了人肝细胞的小鼠，在该小鼠中胸苷激酶基因保持在小鼠肝脏中且能进行表达，对该小鼠给予了鸟嘌呤核苷类似物和从人分离出的肝细胞；该小鼠的制备方法；移植了人肝细胞的NOG小鼠，在该小鼠中尿激酶型纤溶酶原激活物基因保持在小鼠肝脏中且能进行表达，对该小鼠给予了从人分离出的肝细胞；使用上述小鼠测定被测物质在血浆中的动态的方法；使用该小鼠鉴定被测物质的代谢物的方法；使用该小鼠测定被测物质的代谢速度的方法；使上述小鼠感染肝指向性病原体而得到的小鼠模型；使用该小鼠模型筛选针对肝指向性病原体的药剂和疫苗的方法。更具体地说，本说明书提供以下的发明： 
[1]一种移植了人肝细胞的小鼠，其中，外源胸苷激酶基因保持在小鼠肝脏中且能进行特异性表达，小鼠肝细胞被人肝细胞置换； 
[2]如[1]的移植了人肝细胞的小鼠，其中，肝脏具有人肝脏的3维结构或功能； 
[3]如[1]或[2]的移植了人肝细胞的小鼠，其中，胸苷激酶基因为人单纯疱疹病毒1型-胸苷激酶(HSV-tk)基因； 
[4]如[1]至[3]中任一项的移植了人肝细胞的小鼠，其中，小鼠肝细胞的75％以上被人肝细胞置换； 
[5]如[1]至[3]中任一项的移植了人肝细胞的小鼠，其中，小鼠肝细胞的80％以上被人肝细胞置换； 
[6]如[1]至[3]中任一项的移植了人肝细胞的小鼠，其中，小鼠肝细胞的90％以上被人肝细胞置换； 
[7]如[1]至[3]中任一项的移植了人肝细胞的小鼠，其中，小鼠肝细胞的95％以上被人肝细胞置换； 
[8]如[1]至[7]中任一项的移植了人肝细胞的小鼠，其中，小鼠为免疫缺陷小鼠； 
[9]如[8]的移植了人肝细胞的小鼠，其中，免疫缺陷小鼠为NOD/SCID小鼠、缺乏RAG-2和IL-2Rγc的dKO小鼠(RAG-2KO、IL-2Rnull)、或NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠； 
[10]如[9]的移植了人肝细胞的小鼠，其中，缺乏RAG-2和IL-2Rγc的dKO小鼠为Balb/c dKO小鼠(RAG-2KO、IL-2Rnull)或NOD dKO小鼠(RAG-2KO、IL-2Rnull)； 
[11]如[1]至[10]中任一项的移植了人肝细胞的小鼠，其中，从人分离出的肝细胞为人肝细胞株； 
[12]如[11]的移植了人肝细胞的小鼠，其中，人肝细胞株为HepG2、Hep3B或HuH-7； 
[13]如[1]至[10]中任一项的移植了人肝细胞的小鼠，其中，从人分离出的肝细胞为原代培养的肝细胞； 
[14]如[1]至[13]中任一项的移植了人肝细胞的小鼠，其中，在白蛋白启动子、LST-1启动子、α甲胎蛋白启动子或α-生育酚转运蛋白启动子的调节下配置胸苷激酶基因，由此胸苷激酶基因保持在小鼠肝脏中且能进行特异性表达； 
[15]一种移植了人肝细胞的具有NOG(NOD/SCID/γcnull)变异的小鼠，其中，尿激酶型纤溶酶原激活物因子基因保持在小鼠肝脏中且能进行特异性表达，小鼠肝细胞被人肝细胞置换； 
[16]如[15]所述的小鼠，其中，尿激酶型纤溶酶原激活物因子基因为小鼠尿激酶型纤溶酶原激活物因子基因； 
[17]如[15]或[16]的移植了人肝细胞的小鼠，其中，小鼠肝细胞的75％以上被人肝细胞置换； 
[18]如[15]或[16]的移植了人肝细胞的小鼠，其中，小鼠肝细胞的80％以上被人肝细胞置换； 
[19]如[15]或[16]的移植了人肝细胞的小鼠，其中，小鼠肝细胞的90％以上被人肝细胞置换； 
[20]如[15]或[16]的移植了人肝细胞的小鼠，其中，小鼠肝细胞的95％以上被人肝细胞置换； 
[21]如[15]至[20]中任一项的移植了人肝细胞的小鼠，其中，从人分离出的肝细胞为人肝细胞株； 
[22]如[21]的移植了人肝细胞的小鼠，其中，人肝细胞株为HepG2、Hep3B或HuH-7； 
[23]如[15]至[20]中任一项的移植了人肝细胞的小鼠，其中，从人分离出的肝细胞为原代培养的肝细胞； 
[24]如[15]至[23]中任一项的移植了人肝细胞的小鼠，其中，在白蛋白启动子、LST-1启动子、α甲胎蛋白启动子或α-生育酚转运蛋白启动子的调节下配置尿激酶型纤溶酶原激活物因子基因，由此尿激酶型纤溶酶原激活物因子基因保持在小鼠肝脏中且能进行特异性表达； 
[25]一种移植了人肝细胞的具有NOG(NOD/SCID/γcnull)变异的小鼠，其中，小鼠肝细胞被人肝细胞置换； 
[26]如[25]的小鼠，其中，尿激酶型纤溶酶原激活物因子基因和外源胸苷激酶基因保持在小鼠肝脏中且能进行特异性表达； 
[27]一种移植了人肝细胞的小鼠的制备方法，所述制备方法移植人肝细胞使小鼠肝细胞被人肝细胞置换，包含下述步骤：向小鼠导入胸苷激酶基因并使该基因保持在肝脏中且能进行特异性表达，对该小鼠给予自杀底物和从人分离出的肝细胞，损伤小鼠肝细胞， 用人肝细胞置换小鼠肝细胞； 
[28]如[27]的移植了人肝细胞的小鼠的制备方法，其中，胸苷激酶基因为人单纯疱疹病毒1型-胸苷激酶(HSV-tk)基因； 
[29]如[27]或[28]的移植了人肝细胞的小鼠的制备方法，其中，自杀底物是通过胸苷激酶代谢为毒性物质的物质； 
[30]如[29]的移植了人肝细胞的小鼠的制备方法，其中，被代谢的物质为阿昔洛韦或更昔洛韦； 
[31]如[27]至[30]的任一项的移植了人肝细胞的小鼠的制备方法，其中，小鼠为免疫缺陷小鼠； 
[32]如[31]的移植了人肝细胞的小鼠的制备方法，其中，免疫缺陷小鼠为NOD/SCID小鼠、缺乏RAG-2和IL-2Rγc的dKO小鼠(RAG-2KO、IL-2Rnull)、或NOG小鼠； 
[33]如[27]至[32]中任一项的移植了人肝细胞的小鼠的制备方法，其中，从人分离出的肝细胞为人肝细胞株； 
[34]如[33]的方法，其中，人肝细胞株为HepG2、Hep3B或HuH-7； 
[35]如[27]至[32]中任一项的移植了人肝细胞的小鼠的制备方法，其中，从人分离出的肝细胞为原代培养的肝细胞； 
[36]如[27]至[35]中任一项的移植了人肝细胞的小鼠的制备方法，其特征在于，在白蛋白启动子、LST-1启动子、α甲胎蛋白启动子或α-生育酚转运蛋白启动子的调节下配置胸苷激酶基因，由此胸苷激酶基因被保持在小鼠肝脏中且能进行特异性表达； 
[37]一种采用[27]至[36]中的任一方法得到的移植了人肝细胞的小鼠； 
[38]一种使用[1]至[26]和[37]中任一项的小鼠测定被测物质在血浆中的动态的方法； 
[39]一种使用[1]至[26]和[37]中任一项的小鼠鉴定被测物质的代谢物的方法； 
[40]一种使用从[1]至[26]和[37]中任一项的小鼠分离出的肝细 胞来鉴定被测物质的代谢物的方法； 
[41] 一种使用[1]至[26]和[37]中任一项的小鼠测定被测物质的代谢速度的方法； 
[42] 一种制备感染了人C型肝炎病毒(HCV)的小鼠的方法，包含以下的步骤： 
(i)制备[1]至[26]和[37]中任一项的小鼠的步骤；和
 (ii)对(i)所述的小鼠接种人HCV的步骤； 
[43] 一种采用[42]的方法制备的感染了人C型肝炎病毒(HCV)的小鼠； 
[44] 一种人C型肝炎病毒(HCV)的培养方法，包含以下的步骤： 
(i)对[1]至[26]和[37]中任一项的小鼠给予人HCV的步骤；和
(ii)在宿主内放置充分的时间以引发人HCV的复制，然后从感染宿主分离人HCV的步骤； 
[45] 一种筛选具有抗HCV活性的候选药剂的方法，包含以下的步骤： 
(i)对[1]至[26]和[37]中任一项的小鼠给予候选药剂的步骤；和
(ii)分析候选药剂对HCV感染的作用的步骤，其中，人HCV的感染量相对于未给药的小鼠或候选药剂给药前的小鼠的感染量减小意味着该药剂具有抗HCV活性； 
[46] 如[45]的方法，其中，在感染人HCV前给予候选药剂； 
[47] 如[45]或[46]的方法，其中，具有抗HCV活性的候选药剂为抗HCV抗体或其HCV结合性片段； 
[48] 一种筛选用于主动免疫疗法的具有抗HCV活性的候选疫苗的方法，包含以下的步骤： 
 (i)重构[1]至[26]和[37]中任一项的小鼠的免疫的步骤； 
(ii)对(i)的小鼠给予候选疫苗的步骤；和
 (iii)分析该疫苗对HCV感染的作用的步骤，其中，人HCV的感染量相对于未给药的小鼠或该疫苗给药前的小鼠的感染量减小意味着该疫苗具有抗HCV活性； 
[49] 一种筛选具有抗HCV活性的治疗用疫苗接种用的候选疫苗的方法，包含以下的步骤： 
(i)重构[1]至[26]和[37]中任一项的小鼠的免疫的步骤； 
 (ii)对(i)的小鼠给予治疗用疫苗接种用的候选疫苗的步骤；和
(iii)分析该疫苗对HCV感染的作用的步骤，其中，人HCV的感染量相对于未给药的小鼠或该疫苗给药前的小鼠的感染量减小意味着该疫苗具有抗HCV活性； 
[50] 一种使用[1]至[26]和[37]中任一项的小鼠研究肝干细胞的方法，该方法包含下述步骤：从小鼠体内生长的肝组织中鉴定肝干细胞； 
[51] 一种使用[1]至[26]和[37]中任一项的小鼠采集含有肝干细胞的细胞集团的方法，该方法包含下述步骤：从小鼠体内生长的肝组织中采集含有肝干细胞的细胞集团； 
[52] 一种使用[1]至[26]和[37]中任一项的小鼠重建的人肝脏组织； 
[53] 一种小鼠，在该小鼠中胸苷激酶基因和/或尿激酶型纤溶酶原激活物因子基因被保持在小鼠肝脏中且能进行表达，使人肝细胞能够在肝脏中生长；
[54] 如[53]的小鼠，其中，胸苷激酶基因为单纯疱疹病毒1型胸苷激酶； 
[55] 如[53]或[54]的小鼠，其中，小鼠为免疫缺陷小鼠； 
[56] 如[55]的小鼠，其中，免疫缺陷小鼠为NOD/SCID小鼠、缺乏RAG-2和IL-2Rγc的dKO小鼠(RAG-2KO、IL-2Rnull)、或NOG(NOD/S CID/γcnull)小鼠；以及
[57]如[56]的小鼠，其中，缺乏RAG-2和IL-2Rγc的dKO小鼠为Balb/c dKO小鼠(RAG-2KO、IL-2Rnull)或NOD dKO小鼠(RAG-2KO、IL-2Rnull)。 
本说明书包含记载在作为本申请优先权基础的日本专利申请2009-008097号说明书和/或附图中的内容。 
附图说明
图1是表示单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(UL23或HSVtk)基因表达单元的结构的图。 
图2是表示TK-NOG小鼠的转基因的限制图和结构、以及实施例中使用的探针的位置的图。 
图3表示移植了人肝细胞的TK-NOG小鼠的血清中的人白蛋白浓度的图。 
图4是表示移植了人肝细胞的TK-NOG小鼠的血清中的蛋白质的图。 
图5是表示在移植了人肝细胞的TK-NOG小鼠的肝脏中表达的mRNA的图。 
图6是表示移植了人肝细胞的TK-NOG小鼠肝脏的组织学和免疫组织化学染色(immunohistochemical staining)的结果的图。 
图7是表示CFDA给药后在移植了人肝细胞的TK-NOG小鼠的肝脏中羧基荧光素(CF)向毛细胆管(BC)排出的图。 
图8是表示CFDA给药后在移植了人肝细胞的TK-NOG小鼠的肝脏中人肝细胞移植52天后得到的、2只不同的TK-NOG小鼠的肝脏h-CK8/18免疫组织化学染色的结果的图。 
图9是表示CFDA给药后在移植了人肝细胞的TK-NOG小鼠的粪便中的CF分泌量的图。 
图10是表示CFDA给药后在移植了人肝细胞的TK-NOG小鼠的胆汁中存在CF代谢产物的图。 
图11是表示CFDA给药后在移植了人肝细胞的TK-NOG小鼠的胆汁中的小鼠转铁蛋白和人转铁蛋白的解析结果的图。 
图12是表示从移植了人肝细胞的TK-NOG小鼠得到的肝脏切片的H&E和谷氨酰胺合成酶(GS)的免疫组织化学染色的图。 
图13是表示HSVtk表达单元在染色体上的位置的图。 
图14是表示TK-NOG小鼠的转基因的分子分析结果的图。 
图15是表示HSVtk转基因表达的RT-PCR分析结果的图。 
图16是表示在更昔洛韦(GCV)给药后的TK-NOG小鼠(TgHSVtk)和非转基因NOG小鼠(NTg)中、血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的活性的图。 
图17是表示更昔洛韦(GCV)给药后的TK-NOG小鼠(Tg HSVtk)的肝脏的图。 
图18是表示GCV给药后移植了人肝细胞的TK-NOG小鼠的血清白蛋白浓度的图。 
图19是表示GCV给药后在移植了人肝细胞的TK-NOG小鼠中人血清白蛋白浓度与置换指数(RI)间的相关关系的图。 
图20是表示GCV给药后、在进行了人肝细胞移植且人肝细胞发生了再增殖的TK-NOG小鼠中人的基因表达的图。 
图21是表示GCV给药后、TK-NOG小鼠中肾脏的组织病理学解析结果，所述TK-NOG小鼠进行了人肝细胞移植且人肝细胞发生了再增殖。 
图22是表示TK-NOG小鼠的肝脏的小鼠白蛋白和人白蛋白染色的双重免疫荧光染色结果的图，所述TK-NOG小鼠进行了人肝细胞移植且人肝细胞发生了再增殖。 
图23是表示TK-NOG小鼠中克隆增殖性人肝细胞集落的显微解剖结果的图，所述TK-NOG小鼠进行了人肝细胞移植且人肝细胞发生了再增殖。 
图24是表示用于区别人与小鼠肝细胞的PCR分析结果的图。 
图25是表示尿激酶型纤溶酶原激活物因子(uPA)基因表达单元的结构的图。 
图26是表示uPA-NOG小鼠的转基因的限制图和结构、以及实施例中使用的探针的位置的图。 
图27是表示uPA转基因表达的RT-PCR分析结果的图。 
图28是表示半合子型(Tg/+)和纯合子型(Tg/Tg)转基因uPA-NOG小鼠中、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)的活性的图。 
图29是表示纯合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/Tg)肝脏的肉眼图像和肝细胞损伤图像的图。图29的绘制比例尺为100μm。P表示肝门束，C表示中心静脉。 
图30是表示导入到uPA-NOG小鼠中的uPA转基因的利用Southern印迹法的分子解析结果的图。 
图31是表示移植了人肝细胞的半合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/+)和纯合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/Tg1)的肝脏的肉眼观察的图像的图。 
图32是表示uPA-NOG小鼠的人血清白蛋白浓度的推移与体重变化的图。 
图33是表示对小鼠血清、人血清、移植了人肝细胞的半合子型(Tg/+)和纯合子型(Tg/Tg1和2)转基因uPA-NOG小鼠的血清利用免疫印迹法进行解析得到的结果的图。 
图34是表示移植了人肝细胞的纯合子型(Tg/Tg1和2)转基因uPA-NOG小鼠肝脏的组织学和免疫组织化学染色的结果的图。 
图35表示具有人源化肝脏的小鼠生物体内异喹胍(Debrisoquin)和S-华法林(S-Warfarine)的代谢。 
图36表示具有人源化肝脏的小鼠中表达Ki-67抗原的人增殖性肝细胞的检测。 
图37表示TK-Balb/c dKO小鼠和NOD dKO小鼠中、用人细胞角蛋白8/18抗体染色的人肝细胞的生长。 
具体实施方式
以下，详细说明本发明。 
本申请发明中公开的胸苷激酶原本在生物体内具有对胸苷进行磷酸化而合成胸苷酸的酶活性，但在正常的细胞中形成控速阶段，几乎检测不到。因此，被胸苷激酶代谢而发挥毒性的自杀底物仅对导入了胸苷激酶的转基因并具有胸苷激酶活性的细胞发挥细胞毒性，所以可用作仅对靶细胞造成细胞损伤的选择性治疗剂。作为上 述自杀底物，可优选使用鸟嘌呤核苷类似物。更优选的是，作为上述鸟嘌呤核苷类似物，可适宜地举出作为通用的抗病毒药的更昔洛韦(ganciclovir；GCV)、阿昔洛韦(acyclovir)。 
例如，更昔洛韦受到病毒固有的酶即胸苷激酶的磷酸化作用，进而，通过存在于人细胞内的内源性酶即鸟苷酸激酶和胸苷激酶，最终代谢为活性型更昔洛韦-三磷酸。活性型更昔洛韦-三磷酸通过与病毒DNA聚合酶底物即脱氧鸟嘌呤核苷-三磷酸(dGTP)竞争性地拮抗，阻断DNA聚合酶。因此，仅阻断感染了病毒的感染细胞内的病毒复制。基于同样的机理，可知导入了HSV-tk转基因的淋巴细胞也具有下述机制，即，更昔洛韦受到活化，阻断DNA合成，由此选择性地杀死该细胞。 
本发明中，导入外源胸苷激酶基因使其在小鼠肝脏中进行特异性表达。本发明中使用的胸苷激酶基因所来源的生物种类既可以为人或哺乳类，也可以进一步为原核细胞或病毒，对其来源的生物种类没有限制。在本发明中，作为可用作胸苷激酶具体实施方式之一的胸苷激酶，可优选举出人单纯疱疹病毒1型-胸苷激酶(HSV-tk)。例如，对多个细胞组给与更昔洛韦时，仅表达HSV-tk基因的细胞死亡。因此，HSV-tk基因一般被称为“自杀基因”。本申请发明中，HSV-tk基因是指例如序列号1给出的聚核苷酸序列表示的基因，但不限于此。 
已知编码1个氨基酸的密码子存在多个。因此，只要是对通过例如序列号1表示的聚核苷酸序列所编码的氨基酸序列或其酶活性部分进行编码的聚核苷酸序列即可，任一聚核苷酸序列都能够用于本发明的小鼠。一般，即使在胸苷激酶等具有酶活性的多肽的氨基酸序列多少发生改变的情况下，即，在该氨基酸序列中的1个或多个氨基酸被置换或缺失、或者加成1个或多个氨基酸的情况下，该多肽的酶活性有时也得以维持，这是周知的事实。例如，变异体可以含有保存性地置换的序列，这意味着特定的氨基酸残基可以被具有类似的物理化学特征的残基置换。保存性地置换的非限定性的例 子包括：Ile、Val、Leu或Ala相互置换之类的含脂肪族基团的氨基酸残基间的置换、或Lys与Arg间的置换之类的含极性基团的氨基酸残基间的置换。因此，在通过例如序列号1表示的聚核苷酸序列所编码的氨基酸序列或其酶活性部分中增加了上述修饰、并且编码具有胸苷激酶的酶活性的胸苷激酶变异体的DNA，也能够用于本发明的小鼠。 
氨基酸的加成、缺失或置换所形成的变异体可通过对例如编码该变异体的DNA实施例如作为公知技术的位点特异性诱变(例如参照Nucleic Acid Research，Vol.10，No.20，p.6487-6500，1982)很好地制备。本说明书中“1个或多个氨基酸”，是指通过位点特异性诱变法能够加成、缺失或置换的程度的氨基酸的个数，优选为1个或数个、更优选为1～5个、更优选为1～4个、进一步优选为1～3个、再进一步优选为1个或2个。位点特异性诱变法中，例如，除了所期望的变异是特定的不一致外，能够使用与应接受变异的单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引物如下实施。即，使用上述合成寡核苷酸作为引物，通过噬菌体合成互补链形成双链DNA链，用该双链DNA对宿主细胞进行转化。将转化后的细菌的培养物接种到琼脂上，由含有噬菌体的单一细胞形成噬菌斑。理论上，50％的新菌落含有具有变异的噬菌体作为单链，其余的50％具有原来的序列。在与同具有上述所期望的变异的DNA完全一致的部分杂交、但与具有原来的链的部分不杂交的温度下，将所得的噬菌斑与经激酶处理进行了标记的合成探针进行杂交。然后，从与该探针杂交的噬菌斑中回收DNA。 
需要说明的是，作为对酶的氨基酸序列实施不丧失其活性的1个或多个氨基酸的置换、缺失或插入的方法，除上述的位点特异性诱变外，还可优选举出下述方法：用致变物对基因进行处理的方法；和将基因选择性开裂，然后将选择的核苷酸除去、加成或置换，接下来进行连接的方法。 
进而，例如对本说明书中公开的序列号1所记载的编码胸苷激 酶的聚核苷酸序列在温和的或苛刻的严格性条件下进行杂交、且编码生物学活性的胸苷激酶的被分离出的DNA和RNA，也能够用于本发明的小鼠。温和的严格性杂交的条件是指例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ed.Vol.1，pp.1.101-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)中记载的条件。如Sambrook等所定义的那样，温和的严格性条件可举出5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的前清洗用溶液和约55℃、5×SSC、一夜的杂交条件。苛刻的严格性条件包含更高温的杂交和清洗。此时，根据探针的长度等各种要素，可适当调节温度和清洗溶液的盐浓度。可优选举出例如5×SSC以下且20℃以上的范围的条件。 
进而，使用序列号1表示的编码胸苷激酶的聚核苷酸序列和BLAST等(例如，使用既定值即初期设定的参数)计算时具有至少80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选97％以上的同源性、且编码生物学活性的胸苷激酶的被分离出的DNA和RNA，也能够用于本发明的小鼠。 
“胸苷激酶基因保持在小鼠肝脏中且能进行表达”，是指上述的胸苷激酶基因包含在小鼠肝细胞中，在该细胞中进行表达。 
为了使本发明的胸苷激酶基因能够在小鼠肝脏中进行表达，可适当使用在肝脏中发挥作用的调节基因。作为该调节基因，优选使用编码在肝细胞中发挥作用的蛋白质的基因的调节基因。在此“调节基因”，是指对基因转录效率的增减起作用的DNA上的序列，包括启动子、增强子、上游激活序列、沉默基因(silencer)、上游阻抑序列以及弱化子等，但不限于这些。上述调节基因所来源的生物种类并不限于特定的生物种类。为了在小鼠肝脏中能更好地进行表达，可优选使用来源于小鼠的调节基因。 
作为上述的启动子，只要是使胸苷激酶基因在肝脏中表达的启动子即可，就没有特别限定。例如能够举出白蛋白的启动子、有机阴离子转运蛋白LST-1的启动子、甲胎蛋白的启动子、α-生育酚转运蛋白(α-TTP)基因的启动子等。 
对肝脏特异性表达的基因的表达机制(基因的启动子解析)已充分地做了研究。即，已知在肝脏特异性表达的基因的转录起始点的5’上游区域内，普遍存在的转录调节因子的结合部位、和丰富地存在于肝脏的肝脏特异性转录因子的结合部位、应答激素等细胞外刺激的上游激活序列集中存在于较窄的区域。作为上述转录因子的例子，可优选举出HNF-1、HNF-3、HNF-4、HNF-6、C/EBP、DBP等。本发明中，为了使胸苷激酶基因被保留以使其在小鼠肝脏中能进行表达，在小鼠肝脏中发挥作用的上游激活序列上连接胸苷激酶基因。 
因此，通过将例如上述的白蛋白的启动子、有机阴离子转运蛋白LST-1的启动子、α甲胎蛋白的启动子、α-生育酚转运蛋白(α-TTP)基因的启动子区域的一定区域用于上述连接，潜在含有的肝脏特异性转录因子所结合的上游激活序列可得到使用。并且，其他的方式中，通过基因重组方法，可将已鉴定了其序列的肝脏特异性上游激活序列作为外源性基因很好地插入序列中。 
另外，作为使启动子的转录水平增大的增强子，已知其不仅存在于上游激活序列而且还存在于转录起始点的下游。例如，已经确认在具备包含5’上流1.3kb和3’下游区域的全长14kb的人血管紧张素原基因的转基因小鼠中，该基因在肝脏中进行高表达。进而，在来源于人肝癌的HepG2细胞中，在上述基因的转录起始点的下游区域3.8kb的DNA片段上确认存在增强子。本发明中，为了使胸苷激酶基因进行肝脏特异性表达，也可优选使用上述增强子。 
进而，在本发明中，为了使胸苷激酶基因进行肝脏特异性表达，也可优选使用包含附加poly A信号的3’非翻译序列。 
本发明中，为了使胸苷激酶基因保持在小鼠肝脏中且能进行表达，将胸苷激酶基因连接于在小鼠肝脏中发挥作用的上游激活序列上。进而，可适宜地很好地连接增强子、包含附加poly A信号的3’非翻译序列等。通过将这样连接成的基因组插入包含耐药基因等标记基因的载体(vector)中，可以制备调整基因表达单元的重组载体， 所述基因表达单元用于使胸苷激酶基因保持在宿主肝脏中且能进行表达。 
能够制备导入了受该重组载体调整的基因表达单元的转基因小鼠。例如，依据公知方法可很好地制备转基因小鼠(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，7380-4)。 
具体地说，为了使目的胸苷激酶基因保持在宿主肝脏中且能进行表达，将制备的基因表达单元导入小鼠的全能细胞。作为导入了基因的全能细胞，可优选举出受精卵、初期胚胎、以及具有多分化能的ES细胞之类培养细胞等。例如，使正常雄性与给与了排卵诱发剂的雌性小鼠小鼠交配，由此可很好地回收能导入该基因表达单元的受精卵。一般通过向雄性前核进行显微注射，在小鼠受精卵中导入基因表达单元。将受精卵细胞在体外培养后，筛选认为成功导入基因表达单元的细胞。将筛选后的细胞移植到代孕母的输卵管中，之后诞生转基因嵌合体小鼠。作为代孕母，通常使用与切断输精管后的雄鼠交配而成为假孕状态的雌鼠。 
通过从得到的多个个体中挑选出在体细胞和生殖细胞中重组有导入基因的个体，可制备目标转基因小鼠。更具体地说，可通过下述实施例记载的方法制备。 
通常，向小鼠移植人肝细胞时，因对异种细胞移植的免疫反应而使人肝细胞受到排斥，所以本发明中作为移植了人肝细胞的小鼠，可优选使用对异种细胞移植的免疫反应钝化的免疫缺陷小鼠。通过全身照射X射线，可很好地制备上述免疫缺陷小鼠。此外，也优选为遗传性缺乏其免疫功能的小鼠。作为免疫缺陷的动物的例子，可举出通常能够购买到的裸鼠、对SCID小鼠给予asialo GM1抗体或TM β1后的小鼠、以及经X射线照射的小鼠等。 
本发明中，作为遗传性缺乏其免疫功能的免疫缺陷小鼠，可优选举出不具备T细胞、B细胞的NOD/SCID小鼠、Rag2基因敲除小鼠。并且，也可优选使用对这些NOD/SCID小鼠、Rag2基因敲除小鼠进一步实施了IL-2Rγ基因敲除的基因敲除动物(以下称为 dKO(双基因敲除)动物)。例如，能够使用dKO小鼠(Rag2KO、IL-2Rnull)。本发明中，将遗传背景为Balb/c的dKO小鼠称为Balb/c dKO小鼠，将遗传背景为NOD的dKO小鼠称为NOD dKO小鼠。进而，为了排除在该小鼠中确认到的NK细胞等免疫细胞的影响，除了如上所述对SCID小鼠给予asialo GM1抗体来使用的方案外，作为本发明中所使用的其他优选的小鼠，还可优选举出使用对NOD/SCID小鼠进行IL-2受体的γ公共链的基因敲除后的小鼠NOD/SCID/γcnull(也称为NOD/Shi-scid，IL-2RγKO小鼠。以下称为NOG小鼠。“NOG mouse”为注册商标)(日本专利3753321号公报)作为宿主的方式。由于在NOG小鼠中没有确认到淋巴细胞的存在，所以NOG小鼠不显示NK活性，也缺乏树突细胞功能。 
作为本发明的胸苷激酶基因保持在小鼠肝脏中且能进行表达的小鼠，可优选举出如下所述得到的转基因小鼠：将为了使目的胸苷激酶基因保持在宿主肝脏中且能够进行表达而设计的基因导入到上述免疫缺陷小鼠的受精卵中。此外，也可优选使用下述免疫缺陷小鼠：从上述的免疫缺陷小鼠与为该小鼠近交系的转基因小鼠进行交配所诞生的后代中选出的保持了免疫缺陷小鼠的特性且目的胸苷激酶基因保持在宿主肝脏中且能进行表达，所述转基因小鼠是在免疫功能不缺乏的小鼠的受精卵中导入胸苷激酶基因而形成的。进而，还可优选使用下述免疫缺陷小鼠：从上述免疫缺陷小鼠与为该小鼠近交系的转基因小鼠交配所诞生的后代中选择的保持了免疫缺陷小鼠的特性、且使目的胸苷激酶基因保持在宿主肝脏中且能进行表达，所述转基因小鼠是在部分缺乏免疫功能的小鼠的受精卵中导入该遗传基因而形成的。更具体地说，作为优选例可举出：从NOG小鼠与在NOD/SCID小鼠的受精卵中导入该基因而形成的NOD/SCID转基因小鼠交配所诞生的后代中选择的保持了NOG小鼠的特性、且使目的胸苷激酶基因保持在宿主肝脏中且能进行表达的小鼠；将TK-NOG小鼠与Balb/cA dKO小鼠(RAG-2KO、IL-2Rnull)交配，进而重复与Balb/cA dKO小鼠进行交配，由此制成的TK-Balb/cA dKO 小鼠(HSV-Tk(+)、SCID wild、RAG-2KO、IL-2Rnull)；或将TK-NOG小鼠与NOD dKO小鼠(RAG-2KO、IL-2Rnull)交配，进而重复与NOD dKO小鼠进行交配，由此制成的TK-NOD dKO小鼠(HSV-Tk(+)、SCID wild、RAG-2KO、IL-2Rnull)等。本发明中，将所选择的保持了NOG小鼠的特性、且使目的胸苷激酶基因保持在宿主肝脏中且能进行表达的小鼠称为TK-NOG小鼠。 
通过对本发明的胸苷激酶基因保持在小鼠肝脏中且能进行表达的小鼠给予上述鸟嘌呤核苷类似物，鸟嘌呤核苷类似物在该小鼠肝细胞中代谢为毒性物质，结果对该小鼠产生肝损伤。作为上述鸟嘌呤核苷类似物的优选例而举出的更昔洛韦在小鼠肝细胞中代谢为更昔洛韦-三磷酸，引起小鼠的肝损伤。对该小鼠给予鸟嘌呤核苷类似物的方法可自由选择。可适宜选择例如静脉内、肌肉内、皮下，皮内、腹腔内以及在皮肤上涂布等方法。除通过这些通常的途径向小鼠体内给药外，也可通过混合到饲料中来向小鼠体内给药。对鸟嘌呤核苷类似物的给药量也没有限定，可以为0.1～10mg/Kg体重，优选为0.5～1.5mg/Kg体重。 
除上述方法以外，作为对本发明的胸苷激酶基因保持在小鼠肝脏中且能进行表达的小鼠引起肝损伤的方法，除上述的更昔洛韦给药外，还可优选举出利用四氯化碳、D-氨基半乳糖、吡咯烷生物碱或2-乙酰氨基芴等公知的肝损伤诱发物质进行的处置和外科肝切除等外科处置。进而，其他的方案中，也可以通过对该小鼠给予抗小鼠Fas抗体，引起小鼠的肝损伤。抗小鼠Fas抗体不与在人肝细胞中进行表达的Fas抗原结合，而是与在小鼠肝细胞中进行表达的Fas抗原结合，由此特异性引起小鼠肝细胞凋亡。 
进而，除上述以外，还优选使用具有NOG变异的小鼠，该小鼠中尿激酶型纤溶酶原激活物因子基因代替本发明的胸苷激酶基因被保持在小鼠肝脏中且能进行表达。即，优选使用下述转基因小鼠，所述转基因小鼠是将基因表达单元导入到具有上述NOG变异的小鼠的全能细胞中而形成的，所述基因表达单元是用于将尿激酶型纤 溶酶原激活物因子基因保持在宿主肝脏中且能进行表达所制作的。作为尿激酶型纤溶酶原激活物因子基因，可使用例如序列号47记载的编码小鼠尿激酶型纤溶酶原激活物因子的聚核苷酸序列。在制备该基因表达单元时，优选利用与上述使用胸苷激酶基因的方法相同的方法。 
进而，还优选使用下述具有NOG变异的小鼠：胸苷激酶基因和尿激酶型纤溶酶原激活物因子基因这两基因保持在小鼠肝脏中且能进行表达。通过适宜选择由胸苷激酶的作用造成肝损伤的时期和由尿激酶型纤溶酶原激活物因子的作用造成肝损伤的时期，能够使给予的人肝细胞的生长最适化。 
该小鼠优选如下得到：例如将胸苷激酶基因保持在小鼠肝脏中且能进行表达的小鼠和尿激酶型纤溶酶原激活物因子基因保持在小鼠肝脏中且能进行表达的具有NOG变异的小鼠等适宜组合进行繁殖，选择上述所得的具有所期望的特性、即胸苷激酶基因和尿激酶型纤溶酶原激活物因子基因两基因都被保持在小鼠肝脏中且能进行表达、且具有NOG变异的后代小鼠。并且，也可通过如下操作制备：例如将用于尿激酶型纤溶酶原激活物因子基因保持在宿主肝脏中且能进行表达而制作的基因表达单元导入保持有能在宿主肝脏中进行表达的胸苷激酶基因的小鼠的全能细胞中等。 
通过如上引起小鼠肝损伤，使移植到该小鼠中的人肝细胞代替发生肝损伤的小鼠肝细胞在小鼠肝脏中生长。与小鼠肝细胞灭亡相对，在小鼠肝脏生长的人肝细胞增殖，由此制备人肝细胞占一定以上的数量的嵌合体小鼠。作为该嵌合体小鼠，可优选举出小鼠肝脏的50％以上、优选70％以上、更优选75％以上、进一步优选80％以上、再进一步优选90％以上、特别优选95％以上的小鼠肝脏被人肝细胞占有的小鼠。对于被人肝细胞占有的比例，如实施例中优选示出的那样，公知有如下计算方法：通过识别针对人和小鼠肝细胞特异性标记的抗体的染色图像来计算的方法、由人血清白蛋白等血清标记物的定量值来计算的方法。进而，通过对试验后的嵌合体小鼠 的肝脏用公知方法解剖检验，能够确认更精确的置换率。细胞的置换率称为RI(置换指数，Replacement Index)。作为决定本发明中的人肝细胞的置换率的具体方式，在本发明的实施例中记载了如下方案：通过利用组织免疫染色的切片中人的细胞角蛋白CK8/18阳性肝细胞所占有的比例来决定。 
本发明中，作为将人肝细胞移植到小鼠中的方法，除经小鼠的脾脏移植到肝脏的方法以外，还可适宜采用直接从门静脉移植的方法。并且，也可以移植到腹腔内、静脉内。一次移植的人肝细胞的细胞数可从1至2000000(2×106))细胞中适宜选择。 
本发明的肝细胞可优选使用能够在血清(例如胎牛血清)的存在下维持(包括培养、传代、保存)的通常的肝细胞、初代肝细胞、优选株化肝细胞。作为用于移植的人肝细胞，只要为以人肝实质细胞为首的人肝脏中的细胞即可，可优选使用来源于任何种类的细胞的肝细胞。在使用通常的肝细胞的情况下，可优选使用从受试者的肝组织中得到的肝细胞。作为采集肝组织的方法，优选使用手术时的切除、以及作为公知方法的活组织检查(活检)的方法。肝活检是指细长的针从皮肤表面直接刺入肝脏，采集肝脏组织的方法。通常，针穿刺的部位为右胸下部的肋间。术前使用超声波检查装置确认穿刺部的安全性，并对穿刺部进行消毒。进而，从皮肤至肝脏表面成为麻醉对象，小切口切开穿刺部的皮肤后，用穿刺针穿刺。进而，也可以使用市售的冷冻人肝细胞。 
在使用初代肝细胞的情况下，将采集的肝脏或来自肝组织的肝细胞使用灌流法或渗透法等公知技术分散在冰冷却后的Hanks液等中，将得到的细胞悬浮液通过离心分离等进行分级，由此适宜地进行分离。将所得到的肝细胞在适宜地添加有牛血清的Williams’E等培养基中于5％CO2存在下、在37℃下培养24小时。进而，每3天将培养基更换为ASF104培养基(味之素)等，培养1周左右，可使用这样培养得到的细胞。在培养基中可添加HGF、EGF等细胞增殖因子，此外可适宜改变培养基质或三维培养等。 
在使用株化肝细胞的情况下，对肝细胞的种类没有特别限制，但可优选举出例如SSP-25、RBE、HepG2、TGBC50TKB、HuH-6、HuH-7、ETK-1、Het-1A、PLC/PRF/5、Hep3B、SK-HEP-1、C3A、THLE-2、THLE-3、HepG2/2.2.1、SNU-398、SNU-449、SNU-182、SNU-475、SNU-387、SNU-423、FL62891、DMS153等。这些细胞可购自美国典型培养物保藏机构(ATCC；住所12301Parklawn DriVe，RockVille Maryland20852，United States of America)等。例如，Hep3B和HepG2在ATCC中登记号分别为HB-8064和HB-8065，HuH-7在JCRB细胞库中登记号为JCRB0403。 
鸟嘌呤核苷类似物和人肝细胞既可以同时给予小鼠，也可以分别给予。例如，在从脾脏或静脉移植人肝细胞的同时，将鸟嘌呤核苷类似物向小鼠腹腔内给药即可。
将人肝细胞替代小鼠肝细胞称作人肝细胞或肝脏的重建(repopulation)，将人肝细胞替代小鼠肝细胞后的小鼠称作人肝细胞重建嵌合体小鼠或人肝脏重建嵌合体小鼠。并且，将肝细胞替代为人肝细胞后的肝脏称为人源化肝脏(humanized liver)。 
本发明也包含在上述的小鼠中重建的人肝脏组织。在该肝脏组织中具有人肝脏的3维结构或功能，小鼠肝细胞的75％以上、优选80％以上、更优选90％以上被人肝细胞置换，从而重建人肝脏组织。 
具有这些人肝细胞的嵌合体小鼠在例如人肝细胞移植60天左右后用于进行被测物质给药。作为被测物质，可优选举出例如药物候选物质。作为药物候选物质，可优选举出处于药物品开发过程中的、需要预测人体中药物相互作用的物质。这样的物质既可以为对药物品的药效来说是主成分的物质，也可以为含有主成分物质的组合物。药物候选物质的给药量根据采用该物质的疾病的种类、物质组成的种类、或者给药途径等的不同而不同，可从0.1mg/kg体重至2000mg/kg体重左右的范围中适宜选择。并且，给药途径可根据药物候选物质的种类、其应用的剂型等，从口服、皮下、静脉内或腹腔内给药等中适宜选择。 
对于嵌合体小鼠肝脏内的药物候选物质等被测物质的代谢程度以及代谢物，可通过色谱法等本技术领域中的常用方法对小鼠血浆中的药物候选物质的浓度适宜地测定以及鉴定。并且，测定可以通过经时测定来实施，所述经时测定是在候选物质给药后30分钟至24小时左右的期间适宜选择的1个或多个时间点进行测定。 
并且，根据该血浆中的药物候选物质的浓度和在肝脏中被药物代谢酶代谢的物质的浓度，可判定药物候选物质是易于被例如CYP2D6、CYP2C9或CYP2C19缺乏者代谢的物质还是难以被它们代谢的物质。 
人的药物代谢酶为属于CYP组酶的CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C10、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A3、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP4F1、CYP4A2、CYP4A3等，对于各自的指标化合物，例如被CYP1A2代谢的指标化合物为咖啡因，被CYP2C9代谢的指标化合物为甲苯磺丁脲，被CYP2D6代谢的指标化合物为右美沙芬，被CYP2C19代谢的指标化合物为奥美拉唑，被CYP3A4代谢的指标化合物为红霉素等。
对本发明的嵌合体小鼠给予药物候选物质后，给与这些指标化合物的混合物，经时测定各化合物在血浆中的浓度，由此可判定药物候选物质是促进各酶的活性的物质还是阻断酶活性的物质。例如，给与药物候选物质时，促进咖啡因的代谢，其在血浆中的浓度减少的话，可判定该药物候选物质为特异性地促进CYP1A2活性的物质。 
即，使用本发明的小鼠，能够进行如下评价：给人用的药物在人肝脏中如何代谢、生成何种代谢物质、即药物在血浆中的动态、代谢物的鉴定、代谢速度等。从代谢的观点出发，可以筛选适用于人的药物，以及预知适用于人的药物的用量。并且，能够用于人肝脏的增殖、再生等的研究。 
另外，作为本发明的其他目的，可举出提供一种小鼠模型，所述小鼠模型对由通常的感染途径所致的人HCV等肝指向性病原体 (hepatotrophic pathogen)的感染具有易感性。即，本发明的小鼠模型对由通常的感染途径所致的HCV等肝指向性病原体的感染具有易感性，提供的动物模型可以长期且始终稳定地感染能够使HCV等肝指向性病原体感染的人与病毒量相等。作为使用上述小鼠的其他优点，可举出在制备小鼠模型时不需要获得HCV等肝指向性病原体的感染细胞或对其进行处理。因此，本发明中，不需要从感染HCV等肝指向性病原体的人供体中获得肝细胞，并且也不需要在体外培养人肝细胞并使其感染。 
能够使本申请发明的小鼠感染HCV等肝指向性病原体、特别是宿主限定为灵长类(例如人)的肝指向性病原体。根据病原体的性质，慢性感染的小鼠宿主能够维持数周至数月。例如肝指向性病原体为HCV的情况下，使本申请的小鼠慢性感染(例如慢感染)HCV，并且能够在至少约5周、通常至少约14～约20周或更长、最长约35周或更长的时间、或者宿主小鼠的终生维持活性型的HCV感染。 
 感染宿主(小鼠)的病毒负荷可为与感染者(人)的病毒负荷相同的程度。例如，病原体为HCV时，宿主小鼠能够以每1ml血清中约103～约104个至约106个的病毒粒子、通常每1ml血清中约103～约107个的病毒粒子浓度维持感染。感染宿主中的病毒负荷长期实质上始终是慢性且稳定的，从例如感染后的未给药的宿主血清中可分离的病毒粒子的数量在每周采样期间中没有大的变动，例如，如果一旦稳定的感染通常在感染后的约2～4周以内在宿主中确立，则初次采样时1mL血清中含有大量HCV病毒粒子的本发明的HCV感染宿主在下次的采样时显示HCV感染阳性，且一般每1mL血清中含有相同或同等的大量HCV粒子。通常，由于感染宿主的病毒负荷没有大的变动，所以可以用于评价候选抗病毒物质的作用。 
 某实施方式中，使用本发明的小鼠模型，可以对改善病毒性肝炎的药剂、更具体而言对改善由HCV感染所引起的症状的药剂进行鉴定，和/或更直接地影响感染病毒的病原性机制。例如，抑制病毒感染，减小病毒的复制，或者除此以外破坏病毒的增殖周期。一般 情况下，向本发明的小鼠模型给与候选药剂对，相对于对照(例如，相对于未感染小鼠经抗HCV作用已知的药剂(例如IFN-α)给药后的HCV感染小鼠等)评价候选药剂所产生的作用。例如可以向本发明的HCV感染小鼠给与候选药剂，能够比较给药前的小鼠的病毒量和/或作为对照的未给药HCV感染小鼠的病毒量与给药小鼠的病毒量(例如通过以血清试样为对象的RT-PCR法进行的测定)。通常如果在给与候选药剂后的感染小鼠中观察到可检测的病毒量降低或显著降低，则意味着对象药剂具有抗病毒作用。 
候选药剂能够用任意的多种所期望的方法、和/或适合送达药剂的方法给药。例如候选药剂可优选用注射(例如，静脉内注射、肌肉内注射、皮下注射或向用于达成所期望的作用的组织直接注射)、口服给药或其他任意的理想方法给药。通常，体内的筛选法包含下述药剂送达法，即，以接受各种量和浓度的候选药剂(从不给予药剂至下述药剂量，所述给药量达至可良好地送达给动物的量的上限)的多种动物为对象，通过多种剂型和途径进行。药剂能够单独给药，除此以外，特别是在药剂的合用给药产生协同效应时，可与2种或更多种药剂组合给药。 
作为筛选的候选药剂，可优选使用合成分子、天然分子或重组制备的分子(例如低分子量的分子；药物：肽；抗体(包含抗原结合性的抗体片段，例如产生被动免疫的片段)，或其他的免疫疗法药：真核细胞或原核细胞所含有的内源因素(例如多肽、植物提取物等)等)。对人细胞毒性低的药剂的筛选分析法是特别重要的。 
 候选药剂的活性可以用多种方法评价。例如，在使HCV等肝指向性病原体(例如HCV等)感染宿主动物的情况下，通过研究血清试样中病原体的存在与否(例如病毒量的效价)或与病原体的存在相关的标记物(例如，病原体特异性蛋白质或编码该蛋白质的核酸等)，可评价药剂的作用。有无感染病毒以及重症度的定量的和定性的检测法和评价法可采用本技术领域中周知的方法。某实施方式中，通过研究对象物血清试样和/或组织切片中有无病毒(例如HCV的情况下 用RT-PCR法等)，可评价药剂对HCV感染的活性。并且，其他方式中，通过研究对象物血清试样中有无病毒的核酸(例如HCV的RNA)，可评价药剂对病毒感染的活性。例如HCV的RNA能够通过下属方法检测：例如利用逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、竞争性RT-PCR法、RT-PCR法检测(-)链RNA(HCV的复制中间体)、或通过病毒RNA的序列确定来检测，用于检测因治疗而在病毒基因组上产生的变异/转变(准种进化(quasispecies evolution))。或/和，以宿主肝脏为活检对象，并且进行原位RT-PCR杂交法，由此可直接给出组织切片所含有的病毒粒子量的任意的量变或质变。或/和，还可优选使用对宿主实施安乐死后从组织学上研究由药剂引起的感染和/或毒性的症候是否不存在于肝脏中。
另外，通过使用本发明的动物模型，针对是否具备预防肝指向性病原体的感染的能力或改善肝指向性病原体的感染的能力，可实施候选疫苗的筛选。通常“疫苗”，是指通过给药而促进宿主开始针对靶向病原体进行免疫应答的物质。通过给予疫苗所诱发的液性、细胞性、或液性/细胞性的免疫应答，可促进对由疫苗开发对象即病原体所引起的感染进行抑制。本发明中，诱发防御性免疫应答的预防性疫苗是特别重要的，所述防御性免疫应答抑制肝指向性病原体(例如，细菌病原体、病毒性病原体或寄生虫病原体、特别是例如HCV等病毒性病原体)在肝内的复制和/或肝指向性病原体所致的感染。并且，本发明中，治疗用疫苗也是重要的，所述治疗用疫苗通过进行被动免疫或快速地促进的特异性主动免疫(例如抗HCV免疫球蛋白等)而产生对抗肝指向性病原体所致的感染的防御。 
本发明的该方式中，可使用例如干细胞、末梢血单个核细胞(PBMC)、血液的索细胞、造血细胞或由人免疫系统传给动物的人起源性的其他的适当的细胞来重构免疫缺陷小鼠的免疫系统。分离人免疫细胞的方法以及免疫缺陷小鼠的免疫系统的重构(例如具备人免疫系统的小鼠)是本技术领域中公知的(可适当参照例如Nature335：256～59；Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(25)：14720～25)。某实施 方式中，人的免疫细胞可从与获得人肝细胞的供体相同的供体得到，所述人肝细胞在制备本申请发明的小鼠时使用。其他方式中，可利用本技术领域中公知的方法(例如腹腔内注射)将人的免疫细胞导入宿主中。 
利用与上述筛选法类似的方法，可筛选有效的疫苗。即，在肝指向性病原体的接种前将候选疫苗给予嵌合体动物。给予候选疫苗时，通常单次bolus给药(例如腹腔内注射或肌肉内注射、局部给药或口服给药)后，接着进行1次或多次追加免疫。免疫应答的诱导可通过利用本技术领域公知的方法研究对抗原特异性的B细胞和T细胞的应答来进行评价。接着，对经免疫的动物给予肝指向性病原体。通常，以数只免疫小鼠为对象，给予病原体使病原体的效价升高同时进行给与。接下来，以免疫小鼠和未免疫的对照小鼠为对象，观察感染的进展，评价感染的重症度(例如通过评价所存在的病原体的效价、或者研究与上述人肝细胞的功能相关的参数来进行评价)。使候选疫苗给药后产生的病原体感染显著降低和/或疾病重症度显著降低的候选疫苗，可看作有效的疫苗。 
进而，作为本发明的其他目的，可举出提供一种小鼠模型，其能够用于探索、检测、鉴定用在细胞移植治疗等中的可成为未来肝脏的细胞、例如肝干细胞。肝干细胞只要将来分化为肝细胞即可，对分化为肝细胞所需的传代数等没有特别限定。即，本发明还提供下述方法，所述方法对小鼠模型进行从人肝组织获取的初代分离细胞的经脾门静脉的移植，之后从生长下来的肝组织中探索人肝干细胞等用于细胞移植治疗等的可成为未来肝脏的细胞、或者进一步进行鉴定。进而，能够从生长下来的肝组织中采集细胞集团，所述细胞集团包含人肝干细胞等用于细胞移植治疗等的可成为未来肝脏的细胞。本发明还提供采集细胞集团的方法，该细胞集团包含肝干细胞等用于细胞移植治疗等的可成为未来肝脏的细胞。代替经脾门静脉的移植，也可适宜使用原位移植的方法。为了本发明的目的，也可适宜使用干细胞代替初代分离细胞，所述干细胞在试验管内于适 当的条件下培养并能诱导向肝细胞分化。使用上述干细胞诱导向肝细胞分化的方法记载在例如Gastroenterology(2009)136，990-999等中。为了以增殖性为指标从肝组织中探索肝干细胞并进行鉴定，能够使用识别检测肝细胞的标记物的抗原、和/或识别增殖性细胞的抗体进行组织免疫染色。作为检测肝细胞的标记物，可从白蛋白、酪氨酸转氨酶、葡萄糖-6-磷酸酶、凝血因子(CF)VII、去唾液酸糖蛋白受体、细胞角蛋白8/18等中适宜选择。作为细胞增殖标记物，可从Ki-67抗原、5-溴-2’-脱氧尿苷(5-bromo-2’-deoxyuridine)摄取能、PCNA等中适宜选择。通过使用这些标记物，能够获得包含人肝干细胞的细胞集团，进而，表达这些标记物的肝细胞可使用FACSCalibur(日本BD(Becton Dickinson)株式会社)等适宜分离出来，分离出的肝干细胞可适宜用于细胞移植治疗等。 
以下，给出实施例更详细且具体地说明本发明，但解释本发明时不受以下的实施例的限定。 
实施例1 
TK-NOG小鼠的制备及其功能的解析 
1.方法 
本实施例用以下方法进行。 
(1)转基因小鼠的制备 
如图1所示，构建单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(UL23或HSVtk)基因表达单元。最先，将42核苷酸的多接头(GATCCAAGCTTATGCAGTCGACCCGGGCATGCGAATTCTCGA：序列号2)导入pBlueScriptII(pBSII；Promega)的Bam HI-Xho I部位(pBSII/linker)。HSVtk基因用以下的引物在退火温度62℃下通过PCR进行扩增。 
HTKF，5’-GCTAGCATGGCTTCGTACCCCTGC-3’(序列号3) 
HTKR，5’-GTCGACTCAGTTAGCCTCCCCCATCTC-3’(序列号4) 
接下来，将扩增产物克隆于pCI质粒(Promega)的Nhe I-Sal I 部位(pCI-TK)。用以下的引物在退火温度60℃下，将人生长激素(hGH)3’侧翼区域通过PCR进行扩增。 
hGHF，5’-GCTCTACTGCTTCAGGAAGGACAT-3’(序列号5) 
hGHR，5’-GAATTCAACAGGCATCTACTGA-3’(序列号6) 
接下来，将扩增产物克隆于pBSII/接头质粒的Sma I-EcoR I部位(pBSII/linker/hGH)。将来源于质粒p2335A-1(Pinkert，C.A.et al.Genes Dev.1，268-276(1987))的小鼠白蛋白增强子/启动子的2,345-bp Not I-BamH I片段和来源于pCI-TK的嵌合内含子/HSVtk的1,456-bp Hind III-Sal I片段克隆在与pBSII/接头/hGH质粒(pmAlbEPintUL23GH；GenBank登记编号AB453181)的对应部位。对pmAlbEPintUL23GH质粒DNA用Not I和KpnI消化，制备得到不含载体部的4.4-kb片段作为HSVtk表达单元。将该表达单元用公知方法显微注射到NOD/Shi小鼠的受精卵中。具有转基因的子孙用PCR进行鉴定(退火温度63℃)，所述PCR中使用了HTKF1正向引物5’-CACGTCTTTATCCTGGATTACG-3’(序列号7)和hGHR1反向引物5’-CACTGGAGTGGCAACTTCCA-3’(序列号8)。在20μl反应混合液中以94℃2分钟、94℃30秒30循环、63℃30秒、72℃30秒、72℃3分钟的条件对从尾组织中提取的基因组DNA进行扩增。转基因DNA在琼脂糖凝胶上以236bp的扩增产物条带的形式被确认到。使雌性转基因小鼠与雄性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/ShiJic(NOG)交配，得到具有scid和IL2Rgnull变异的个体。通过PCR，对scid和IL2Rgnull基因的变异进行基因分型(Maruyama，C.et al.Exp.Anim.51，391-393(2002)：Ito，M.et al.Blood 100，3175-3182(2002))。制备的小鼠的正式系统名用NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugTg(Alb-UL23)7-2/ShiJic表示，将其称为TK-NOG。 
(2)荧光原位杂交分析 
利用荧光原位杂交(FISH)法来确定转基因在染色体中的位置。使 用生物素16dUTP标记pCI-TK质粒，对从取自TK-NOG小鼠的、用促细胞分裂剂活化的脾细胞中得到的9个中期细胞进行分析。利用抗生物素蛋白FITC(Vector Laboratories)将生物素标记DNA可视化，将该细胞用碘化丙锭(Sigma-Aldrich Chemie GmbH)进行对比染色。利用Leica Q550 genetic workstation进行观察。具有荧光信号的染色体利用G显带来鉴定。 
(3)Southern印迹分析 
对12周龄TK-NOG小鼠和非转基因小鼠的肾脏用蛋白酶K消化一夜，进行苯酚∶氯仿∶乙醇提取，由此得到基因组DNA样品。对经限制酶Bam HI、Bgl II、Xba I和Not I plus Kpn I消化的基因组DNA利用0.6％琼脂糖凝胶进行电泳，得到转移到荷正电的尼龙膜(F.Hoffmann-La Roche)上的印迹膜。使用利用PCR DIG ProbeSynthesis Kit(F.Hoffmann-La Roche)制备的DIG标记探针进行该膜的杂交。所用的引物具有以下的序列。 
5’-探针(正向，5’-GTTCTCCAGCTTGGGATCGACCTG-3’(序列号9)；及反向，5’-TTGATAGGAAAGGTGATCTGTGTGCAG-3’(序列号10))；以及 
3’-探针(正向，5’-CACGTCTTTATCCTGGATTACG-3’(序列号11)；及反向，5’-CACTGGAGTGGCAACTTCCA-3’(序列号12)) 
各个探针所识别的位置见图2。 
(4)利用RT-PCR检测HSVtk转录物 
使用RNeasy Mini kit(Qiagen K.K.)从65日龄的TK-NOG小鼠肝脏、肾脏、脾脏、肺、脑、骨骼肌和睾丸中得到总RNA。使用HighCapacity cDNA Reverse Transcription kit(Applied Biosystems)进行RT-PCR。使用pCIspF正向引物5’-GAGGCACTGGGCAGGTGTCC-3’(序列号13)和HTKR1反向引物5’-GTAAGTCATCGGCTCGGGTAC-3’(序列号14)，HSVtk转录物的剪接型作为343bp条带被检测到(退火温度68℃)。将使用G3PDHF正向引物5’-TCACCATCTTCCAGGAGCGAGA-3’(序列号15)和G3PDHR反向引物5’-GAAGGCCATGCCAGTGAGCTT-3’(序列 号16)扩增得到的479bp甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(Gapdh)片段用作内标(退火温度65℃)。 
(5)肝脏损伤的诱发 
将更昔洛韦(GCV)钠(Denosine-IV；Mitsubishi Tanabe Pharma)或载体(生理盐水)用26号针每隔1天向小鼠腹腔内注射2次。溶解于水或生理盐水中的GCV在其给药前经过滤器灭菌。每天对所有的小鼠进行监视。肝脏损伤的程度通过生化血清检验值和病理学分析来研究。GCV给药1周后，为了进行ALT和AST的分析，从下腔静脉采集末梢血，利用FUJI DRI-CHEM7000(Fujifilm)进行临床化学分析。并且，用4％(v/v)磷酸缓冲福尔马林固定，经石蜡包埋的组织用苏木精和曙红(H&E)染色。 
(6)人肝细胞和人大肠癌细胞的移植 
使用3批市售的冷冻人肝细胞(Lonza Walkersville)作为供体细胞。供体的年龄为4～7岁。用以下的通用方法进行移植。在移植前5天和移植前3天，对6～8周龄的成体TK-NOG受体小鼠腹腔内给药GCV(0.5～1.5mg/kg)。细胞数和存活率利用锥虫蓝排除法使用血细胞计数器测定。用带有26号注射针的汉密尔顿氏注射器(Hamilton syringe)，将悬浮于40μl的Hank’s BalancedSolution(HBSS)或William’s medium E中的1～2×106的活肝细胞移植到脾脏内。作为对照，将1×104的人大肠癌细胞株HCT116(AmericanType Culture Collection；ATCC)移植到非转基因NOG小鼠的脾脏内。 
(7)人白蛋白测定 
隔一周从眼底静脉丛中用塑料毛细管采少量血液。采集的血液用含有1％牛血清白蛋白和0.05％Tween20(BSA)的TBS(Tris-buffered saline)稀释500～30000倍，其人白蛋白浓度使用人白蛋白ELISA Quantitation Kit(Bethyl Laboratories)测定。阈值浓度为3×103ng/ml以下。 
(8)免疫印迹法 
将稀释血清和胆汁样品(稀释倍数：3～3000倍)溶解在含5％β巯 基乙醇的SDS样品缓冲液中，用于SDS-PAGE后转录于Hybond-ECL膜(GE Healthcare Bio-Sciences)上。将转录的膜与羊抗小鼠白蛋白多克隆抗体(A90-234A；Bethyl Laboratories)、羊抗人白蛋白多克隆抗体(A80-229A；Bethyl Laboratories)、羊抗小鼠转铁蛋白多克隆抗体(I-20；Santa Cruz Biotechnology)、兔抗人转铁蛋白多克隆抗体(H-65；Santa Cruz Biotechnology)、小鼠抗补体C3多克隆抗体(A01；Abnova)、羊抗人补体C3多克隆抗体(D-19；Santa CruzBiotechnology)和羊抗铜蓝蛋白3多克隆抗体(H-60；Santa CruzBiotechnology)一起培养，清洗后，将该膜与针对抗羊IgG(BethylLaboratories)、小鼠IgG(GE Healthcare Bio-Sciences)或兔IgG(GEHealthcare Bio-Sciences)的辣根过氧物酶标记二次抗体一起培养60分钟。接下来，对使用了ECL Western Detection System(GE HealthcareBio-Sciences)和Hyperfilm ECL(GE Healthcare Bio-Sciences)的显色进行检测。 
(9)人肝细胞特异性基因表达的RT-PCR 
用RNeasy mini kit(Qiagen K.K.)分离总RNA。使用High CapacitycDNA Reverse Transcription kit(Applied Biosystems)和随机引物，合成互补DNA。对小鼠Gpdh、白蛋白(Alb)、人GAPDH、ALB、酪氨酸氨基转移酶(TAT)、甲状腺素转运蛋白(TTR)、毛细管特异性有机阴离子转运蛋白ATP结合盒、亚家族C(CFTR/MRP)、成员2(ABCC2；MRP2)、胆盐输出泵ATP结合盒、亚家族C(MDR/TAP)、成员11(ABCB11)、胆红素UDP葡萄糖醛酸基转移酶(UGT1A1)和细胞色素P450家族(CYP1A1、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4)基因的表达用RT-PCR进行分析。在表1中给出所用的引物信息(靶向基因、序列)、退火温度、扩增产物大小等。 
表1 
(10)组织学和免疫组织染色 
将福尔马林固定后的肝脏和肾脏用石蜡包埋，制备其5μm切片。将几片切片浸在target retrieval solution(0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH6.0；1mM EDTA，pH9.0)中，进行10分钟高压釜处理后，在室温下放置20分钟。使用小鼠抗人CK8/18单克隆抗体(clone 5D3；Novocastra Laboratories)、小鼠抗人HLA-classI-A，B，C单克隆抗体(clone EMR8-5；Hokudo)、羊抗人白蛋白多克隆抗体(BethylLaboratories)和兔抗人GLUL多克隆抗体(Sigma-Aldrich)作为一次 抗体。为了进行明视野免疫组织染色，用氨基酸聚合物/过氧化物酶配合物标记抗体(Histofine Simple Stain Mouse MAX PO(G，R，and M)；Nichirei Bioscience)和二氨基联苯胺(DAB；Dojindo Laboratories)底物(0.2mg/ml 3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐，0.05M Tris-HCl，pH7.6和0.005％H2O2)使羊、兔子和小鼠Ig进行可视化。用苏木素对切片做对比染色。将高碘酸-雪夫(periodic acid-Schiff、PAS)染色试剂盒(Muto Pure Chemicals)用于糖原的可视化。使用具备AxioCam HRm和AxioCam MRc5 CCD cameras(Carl Zeiss)的正置式显微镜AxioImager(Carl Zeiss)进行拍摄。作为受体肝脏中的供体人肝细胞的比例的置换指数(RI：replacement index)用免疫组织化学染色切片的总面积中人CK8/18阳性肝细胞所占的面积比例来表示。用于制备冷冻切片的肝脏包埋在OCT复合物(Sakura Finechemicals)中，在液氮中冷冻，制成厚5～10μm的切片。使用经FluoReporter Mini-Biotin-XXProtein Labeling Kit(Invitrogen)标记的生物素化羊抗人白蛋白多克隆抗体、Alexa Fluor 594标记链霉亲和素(Invitrogen)和FITC标记羊抗小鼠白蛋白多克隆抗体(A90-234F；Bethyl Laboratories)进行免疫荧光染色。 
(11)激光显微切割解析(LCM) 
将连续的冷冻组织切片(10μm)用乙醇固定，接下来阶段性地减小固定液中的乙醇浓度，最终将该切片浸渍在不含DNase和RNase的水中。接着，使用小鼠抗人CK8/18单克隆抗体(clone；5D3；Novocastra Laboratories)对上述切片进行免疫组织染色。使用显微镜将切片化组织中的抗人CK8/18抗体的阳性和阴性染色区域编图以进行LCM。用AutoPix LCM system(Molecular Devices)进行各个区域的切割捕获。用TPMK缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2mM MgCl2和40μg/ml蛋白酶K)提取基因组DNA。在55℃下培养一夜，通过在95℃下将样品热处理5分钟，使蛋白酶K失活。将一部分缓冲液用作基因组PCR的模板DNA，区分人和小鼠肝细胞。人和小鼠β肌动蛋白基因使用具有以下序列的引物利用PCR进行扩增 (退火温度60℃)。 
正向引物，5’-TAGGTACTAACACTGGCTCGTGTGACAA-3’(序列号17)； 
反向引物，5’-GGTGTTGAAGGTCTCAAACATGATCTGTA-3’(序列号18) 
利用该引物对(primer set)将人β肌动蛋白以及小鼠β肌动蛋白基因(分别为245bp和271bp)进行扩增。将来源于人和小鼠DNA的对应序列分别插入pBSII载体的Sma I和HindIII部位，由此制备对照质粒(pBSII-hm/β-ACT)。 
(12)使用了5-羧基荧光素二乙酸酯的胆汁排出试验 
羧基荧光素(CF)是通过Mrp2从各种细胞排出的有机阴离子。从尾部静脉注射该色素的酯前体即5-羧基荧光素二乙酸酯(5-CFDA，0.5nmol；Sigma-Aldrich)。5-CFDA给药10分钟后，用50nmol/L 5-CFDA溶液对肝脏进行3分钟灌流，该肝脏被包埋在OCT复合物中，用液氮冷冻。由于该试剂易溶于脂，所以容易侵入肝细胞中，并被酯酶水解，形成CF(水溶性荧光底物)，接着被排到胆汁中。 
制备厚10μm的连续冷冻切片，进行空气干燥。使用具备AxioCam HRm和AxioCam MRc5CCD cameras(Carl Zeiss)的正置式显微镜Axio Imager(Carl Zeiss)观察CF的荧光信号，并进行拍摄。拍摄荧光显微镜照片后，用乙醇对组织切片进行固定，阶段性地减小固定液的乙醇浓度，最终将该切片浸渍在不含DNase和RNase的水中。接下来，使用小鼠抗人MRP2单克隆抗体(Clone M2III-6；Millipore)、Histofine Simple Stain Mouse MAX PO(M)(NichireiBioscience)和DAB底物进行免疫组织染色。用苏木素对切片做对比染色。将其他的组织切片用4％多聚甲醛液固定，使用羊抗人HLA-classI-A，B，C单克隆抗体(clone EMR8-5；Hokudo)和德克萨斯红标记链霉亲和素-(GE Healthcare Bio-Sciences)进行免疫荧光染色。对其他的组织切片进行苏木精和曙红(H&E)染色。将从置换度极高的人源化肝脏NOG小鼠#2-11-5和人源化程度极低的人源化肝脏NOG#48-L5中采集的胆汁和粪便样品用0.1M Tris-HCl(pH8.0)稀 释，使用Molecular Dynamics BioLumin 960 spectrophotometer(GE Healthcare Bio-Sciences)测定其荧光。用Molecular DynamicsFluroImager 595(GE Healthcare Bio-Sciences)得到荧光图像。根据0.1M Tris-HCl(pH8.0)中的已知浓度的CF，计算出粪便样品中的CF浓度，并按照样品的湿重进行标准化。 
2.结果 
结果如下。 
(1)对TK-NOG小鼠的人肝细胞移植 
TK-NOG小鼠的血清中的人白蛋白在人肝细胞移植后在图3所示的时间点通过ELISA来测定。结果如图3所示。黑圆、黑三角、黑四边形分别表示使用小鼠#12-14、#6-6-10和#2-4-7进行实验得到的结果。 
在人肝细胞移植后第70天、第44天和第41天通过免疫印迹法测定3只TK-NOG小鼠血清中的蛋白质。将小鼠血清和人血清用作阳性和阴性对照。结果如图4所示。 
在人肝细胞移植后第70天、第44天和第41天用RT-PCR测定对照和3只TK-NOG小鼠的肝脏中表达的mRNA。将小鼠肝脏RNA和人肝脏RNA用作对照样品。结果如图5所示。 
图5给出人肝细胞移植后70天、44天和41天得到的、TK-NOG小鼠的肝脏的组织学和免疫组织染色的结果。对连续切片进行H&E、h-CK8/18、HLA、h-白蛋白和PAS染色。结果如图6所示。图6给出#12-14(70天)、#6-6-10(44天)和#2-4-7(41天)的HE染色(分别为A、C和E)和抗人CK8/18抗体染色(分别为B、D和F)的结果。G至K表示经过H&E、h-CK8/18、HLA、h-白蛋白和PAS染色的连续切片。 
(2)人源化肝脏的解剖学分析和功能分析 
图7给出羧基荧光素(CF)向毛细胆管(BC)的排出。对人肝细胞移植42天后的TK-NOG小鼠(A、B、C和D)或人大肠癌细胞株(HCT-116、E、F、G和H)移植21天后的NOG小鼠给予5-CFDA，得 到肝脏。制备重建了人肝脏的TK-NOG或经大肠癌移植后的对照NOG小鼠的肝脏的连续切片，可以观察到荧光代谢产物的存在。在重建了人肝脏的TK-NOG小鼠中，在人肝细胞集落的小叶上可见蜂巢状的5-CFDA代谢产物(CF)，可以确认其向毛细胆管内(BC)排出。作为对照，在HCT-116大肠癌增殖灶中，完全没有观察到该蜂巢图案。对于其他切片，进行H&E染色、HLA和人-MRP2染色。 
图8给出人肝细胞移植52天后得到的、2只不同的人肝脏重建TK-NOG小鼠肝脏的人CK8/18免疫组织染色的结果。#2-11-5小鼠的肝脏几乎完全被人肝细胞置换(RI＞90％)，但#48-L5小鼠肝脏仅部分被人肝细胞置换(RI～20％)。给予5-CFDA后，对2只重建TK-NOG小鼠，测定CF向粪便中的排泄量。结果示于图9。 
图10给出5-CFDA给药10小时后回收的几乎完全人源化的#2-11-5TK-NOG小鼠胆汁中的代谢产物CF的荧光图像。 
将人源化的TK-NOG小鼠#2-11-5的胆汁中的小鼠转铁蛋白和人转铁蛋白的解析结果示于图11。如图11所示，在来源于几乎完全人源化的#2-11-5小鼠的胆汁中可见人转铁蛋白，但在对照NOG小鼠中没有确认到人转铁蛋白。 
图12给出从人肝细胞移植6周(A和B)或16周(C和D)后的TK-NOG小鼠得到的肝脏切片的H&E(A和C)和谷氨酰胺合成酶(GS)(B和D)的免疫组织染色。如图12所示，在位于移植后6周的人肝细胞灶的中心静脉区域，未见有GS表达。作为对照，在移植后经过16周的TK-NOG小鼠肝脏的人肝细胞灶中，在中心静脉的周边确认到GS的表达。图12B的插图表示用抗GS抗体染色后的对照NOG(小鼠)的染色结果，图12D的插图表示人肝脏的染色结果。P表示肝门束，C表示中心静脉。 
(3)HSVtk转基因NOG小鼠的特性描述 
HSVtk的转基因结构是由人生长激素的基因的3’-UTR与小鼠白蛋白增强子/启动子(Alb En/Pro)、嵌合内含子、HSVtk cDNA和多聚腺苷化信号(hGHpA)一起构成的。在图1中给出其结构。箭头表示 用于检测转基因特异性转录物的引物的位置和方向。各个箭头的前端表示寡核苷酸的3’末端。NOG系统中，由于scid变异所引起的DNA重构的缺陷，所以即使显微注射基因片段，所得到的子孙的数也极少。因此，首次用NOD/Shi系统确立了HSVtk-基因转基因小鼠(HSVtk-转基因；系统7-2)。NOG小鼠的遗传背景是NOD/Shi系统自身，scid和IL2Rgnull变异是唯一的不同，所以其后通过与NOG系统交配，保有scid和IL2Rgnull变异，得到了重度免疫缺陷系统NOG-Tg(Alb-UL23)7-2/ShiJic(正式的名称为：NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugTg(Alb-UL23)7-2/ShiJic，简称为：TK-NOG)。通常已知具有HSVtk基因的雄性转基因小鼠不育，雄性TK-NOG小鼠也不育。 
图13给出基因导入后的HSVtk表达单元在染色体上的位置。如图13所示，TK-NOG小鼠在染色体1G座具有HSVtk表达单元。 
图14给出导入到TK-NOG小鼠中的HSVtk转基因的分子分析结果。为了进行Southern印迹解析，对来自非转基因NOG小鼠肾脏(N)和TK-NOG小鼠肾脏(T)的基因组DNA样品用Bam HI(Ba)、NotI和Kpn I(NK)、Bgl II(Bg)以及Xba I(Xb)消化。 
图2给出TK-NOG小鼠的转基因的限制图和结构。克隆载体(带阴影的方块表示克隆载体)以被夹在2个HSVtk转基因中间的head-to-tail串联排列结构(黑方块表示转录片段)的形式插入到小鼠基因组中。显微注射不具有载体的HSVtk表达单元(Not I-Kpn I f片段)，但有可能混入被Not I-Kpn I限制酶切断的少量载体，认为HSVtk表达单元在head-to-tail结构中随机地与载体连接。星号表示被DIG标记的探针(*：5’探针、**：3’探针)所识别的位置。 
图15给出利用RT-PCR对HSVtk转基因表达进行解析得到的结果。HSVtk转基因的检测使用下述引物来进行，所述引物特异性识别经过精确剪接的嵌合内含子的序列。试验的组织为非转基因NOG小鼠肝脏(nLi)、TK-NOG小鼠肝脏(Li)、肾脏(Ki)、脾脏(Sp)、肺(Lu)、脑(Br)、骨骼肌(Sm)、睾丸(Te)。使用甘油醛-3-磷酸脱氢 酶(Gapdh)作内标。 
图16是表示更昔洛韦(GCV)给药后的TK-NOG小鼠(Tg HSVtk)和非转基因NOG小鼠(NTg)中、血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的活性的图。如图16所示，TK-NOG小鼠的“前药”GCV给药导致缓慢的用量依赖性肝细胞损伤。细胞损伤图像如图17所示。 
图17A表示给予PBS作为更昔洛韦给药的阴性对照时TK-NOG小鼠肝脏的H&E染色图像。 
图17B～D是1.5mg/kg的GCV给药(图17B)、50mg/kg的GCV给药(图17C)的TK-NOG小鼠肝脏的H&E染色图像以及50mg/kg的GCV给药(图17D)的非转基因NOG小鼠肝脏的H&E染色的结果。GCV(给药量、mgGCV/kg体重)每隔1天给药2次，14天后采集血液样品、组织样品。GCV处理转基因小鼠肝脏显示肝细胞的巨细胞症、重度至中度的细胞质空泡变性和病灶细胞的死亡。但是，在除睾丸以外的其他的大多数组织中没有确认到明确的细胞或组织损伤。图17的绘制比例尺为200μm。P表示肝门束，C表示中心静脉。 
(4)人肝细胞向TK-NOG小鼠中的移植和肝重建 
图18给出以各种浓度给予GCV时移植了人肝细胞的TK-NOG小鼠的人血清白蛋白浓度。如图18所示，1.5mg/kg GCV给药组的人血清白蛋白浓度显著高于5mg/kg GCV给药组(P＝0.0404、Mann-Whitney U-test)。0.5mg/kg GCV给药组与1.5mg/kg GCV给药组的人血清白蛋白浓度不存在显著差异。 
图19给出人血清白蛋白浓度与置换指数(RI)的相关关系。如图19所示，RI值与人血清白蛋白浓度高度相关(R2＝0.9043)。 
图20给出用人肝细胞重建的TK-NOG小鼠肝脏中人的基因表达。将人mRNA和小鼠mRNA分别用作阳性对照和阴性对照。 
图21给出从移植了人肝细胞的小鼠中采集的肾脏的组织病理学解析结果。如图21所示，肝脏重建后的TK-NOG小鼠的肾脏(A和B)和非转基因NOG小鼠的肾脏(C和D)的H&E和PAS染色中，未 见肾功能不全。线段为100μm。 
图22至图24表示重建后的TK-NOG小鼠的肝脏并不是细胞融合形成的肝脏。 
图22表示小鼠白蛋白(绿色)和人白蛋白(红色)的双重免疫荧光染色结果。如图22所示，几乎所有的小鼠白蛋白阳性肝细胞中，人白蛋白为阴性；大多数的人白蛋白阳性肝细胞中，小鼠白蛋白为阴性。观察到小鼠白蛋白阳性肝细胞散布在人肝细胞集落中。在图22B中，用白色表示人白蛋白阳性肝细胞，黑色表示小鼠白蛋白阳性肝细胞。 
图23表示对克隆增殖性人肝细胞集落用激光显微切割法捕获的结果。并给出抗人CK8/18染色冷冻切片的利用激光显微切割法的捕获前(A)和捕获后(B)的情况。图23A的虚线表示由人和非人靶材(图23B的I和II)构成的捕获区域的边界。 
图24给出为了区别激光显微切割法所捕获的肝细胞为人肝细胞还是为小鼠肝细胞而进行的PCR解析的结果。所用的引物不仅将人β肌动蛋白扩增，而且将小鼠β肌动蛋白基因也同样地扩增，得到各自尺寸不同的产物(分别为245bp和271bp)。从人CK8/18阳性菌落中仅检测到(图23A)245-bp条带的人β肌动蛋白扩增子，相反，从人CK8/18阴性区域(图23B)仅检测到271bp条带的小鼠β肌动蛋白扩增子(图24，泳道“区域II(region II)”)。使用小鼠和人的DNA作为对照样品。并且，还使用包含小鼠和人的DNA这两种靶材序列的质粒作为对照。 
监测更昔洛韦(GCV)给药和人肝细胞移植后的人血清白蛋白的产生，结果可知0.5～1.5mg/kg的量的GCV对人肝细胞移植是最佳的。虽然60个受体都存在一定程度的差异，但移植后4周以内在被测受体中最先检测到人血清白蛋白，并慢慢升高，数周后达到11.5mg/ml的最高浓度(图3)。移植后的人肝细胞完全插入到受体小鼠的肝脏结构中(图6)。置换指数(RI)(免疫组织化学染色切片中的CK8/18阳性肝细胞所占的面积之比)与测定得到的人血清白蛋白浓 度高度相关(R2＝0.9043)(图19)。人血清白蛋白浓度＞1mg/ml的小鼠中，RI＞10％。基于此，移植受体的63％(38/60)的肝脏在12周以内超过10％的人肝细胞发生再增殖(图3)。11例高度再增殖(RI＞40％、人血清＞4mg/ml)，5例更高度地再增殖(RI＞80％、人血清＞8mg/ml)。本实施例中，无论是否使用冷冻肝细胞仅进行一次移植(是指：未实施从生长下来的TK-NOG小鼠中分离人肝细胞进行再次移植的连续移植法)，都可见人干细胞在TK-NOG小鼠的肝脏中高水平的再增殖。 
使用以不同程度(RI为10％、30％和85％)重建了人肝细胞的3只TK-NOG小鼠，进行有关肝脏组织学、RNA和DNA、以及血清蛋白质的详细解析。通过免疫印迹解析，在这些小鼠的血清中检测到多种不同的人蛋白质(白蛋白、转铁蛋白、补体C3和铜蓝蛋白)(图3)。105kDa人C3α’链的存在意义深远，其表示C3前体蛋白质通过C4b-C2a配合物(C3转换酶)进行加工。一般认为在uPA转基因小鼠中人C3的血清浓度升高有助于肾功能不全发病，通过给予免疫抑制剂，可对其进行抑制(Tateno，C.et al.Am.J.Pathol.165，901-912(2004))。但是，令人吃惊的是，在TK-NOG小鼠中没有发生肾功能不全的病症，也不需要给予免疫抑制剂。存在于成熟肝细胞的多种人mRNA在TK-NOG小鼠的肝脏中也大量进行表达(图5)。并且，在TK-NOG小鼠的肝脏中确认到多种药物代谢酶(UGT1A1、CYP1A1、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4)、转运蛋白ABCC2；MRP2、ABCB11；MDR/TAP)的人mRNA的表达(图20)。在苏木素和曙红染色切片中，人(CK8/18阳性)肝细胞根据大小和泛白的细胞质可与小鼠肝细胞明确区分开(Azuma，H.et al.Nat.Biotechnol.25，903-910(2007)；Meuleman，P.et al.Hepatology 41，847-856(2005))(图6)。人CK8/18阳性肝细胞也可以通过HLA、人特异性白蛋白抗体进行染色。这表示，人CK8/18阳性肝细胞不是小鼠的肝细胞，毫无疑义地为人肝细胞(图6)。糖原蓄积仅出现在人肝细胞的细胞质中。认为也有可能是通过人肝细胞与小鼠肝细胞的融 合而产生重建的肝脏。但是，根据使用对人或小鼠的白蛋白特异性抗体的双重免疫荧光染色和激光显微切割法捕获的组织中的基因组的PCR解析结果，可以否定人细胞与小鼠细胞的融合。 
大多数的人肝细胞在移植后6周以内在宿主肝组织中以克隆性增殖那样的小的增殖灶的形式存在(图6)。为了评价重建的TK-NOG肝脏中的胆管或毛细胆管网状结构是否具有功能，使用荧光代谢标记物即5-羧基荧光素二乙酸酯(5-CFDA)进行胆汁的排泄试验。由于5-CFDA具有脂溶性，所以易于进入肝细胞，因此受到酯酶的作用而代谢为水溶性荧光代谢物质(CF)(Mor-Cohen，R.et al.J.Biol.Chem.276，36923-36930(2001))，并在有机阴离子转运蛋白即Mrp2的作用下被排出到胆汁中。5-CFDA给药15分钟后，5-CFDA代谢物质迅速在小叶上作为蜂巢结构被观察到，表示代谢物CF排出到毛细胆管(BC)中(图7)。该蜂巢图案也存在于人特异性抗HLA和抗MRP2抗体染色的区域中(图7)。作为对照，对于在移植了人大肠癌细胞株(HCT-116)的非转基因NOG小鼠肝脏中形成的人大肠癌增殖灶，经过人特异性抗HLA染色显示阳性，但没有观察到表示CF排泄的蜂巢结构。进而，对于人大肠癌的增殖灶，抗人MRP2抗体也为阴性(图7)。接下来，研究肝或胆管系统是否发挥功能，即，胆汁是否经由总胆管集聚在胆囊中并从十二指肠排泄到肠道。由于显示通过人肝细胞进行排泄，所以使用肝脏的90％以上由人肝细胞构成的TK-NOG小鼠(图8)，研究5-CFDA代谢物质(水溶性CF)向肠道的排泄。直至5-CFDA给药后6小时，在粪便中没有观察到来源于CF的荧光，但在给药7小时后达到峰值(图9)。粪便中的信号在5-CFDA给药后10小时以内被排除，但在该小鼠的胆汁中检测到微量的5-CFDA的代谢物质(图10)。进而，在相同的胆汁样品中检测到人的胆汁蛋白质(转铁蛋白)(图11)。由于小鼠肝脏的90％以上的肝细胞置换为人肝细胞，所以一般认为排泄到该小鼠肠道中的CF实质上是被人肝细胞代谢并排泄的。这些数据表示，在解剖学上正常构建了肝胆系统，异物排泄功能也正常发挥作用。由此，认为 人肝重建TK-NOG小鼠也具备将药物等代谢物进行肠肝循环的生物体功能。 
用TK-NOG小鼠重建的肝脏需要确定是否具有成熟人肝脏的3维结构的特性。因此，对肝小叶内分布特性不同的酶(谷氨酰胺合成酶(GS))的表达图案进行研究，评价重建的肝脏中形成的小叶结构是否反映生理功能(通过中心静脉区域和门静脉区域的营养或氧浓度梯度所诱导的酶的表达)。通常，GS在中心静脉区域的很近的肝细胞中表达(Smith，D.D.J.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，160-164(1988))。在移植6周后的包含人肝细胞的肝小叶内未发现GS的表达，暗示在该时刻(移植后6周)功能未成熟(图12)。作为对照，在移植后经过16周后的重建肝脏中在中心静脉周边发现GS的表达(图12)。人肝细胞重建后的肝脏虽然表达大量的肝脏特异性人基因，也分泌人血清蛋白质，并且部分形成胆管网状结构，但是在移植后6周生理性的肝功能没有充分成熟。利用异种的人肝细胞重建肝脏，进而直至形成成熟的人肝脏结构，这需要8～12周的时间。该结果与使用小鼠进行的自体肝移植的研究(Braun，K.M.et al.Nat.Med.6，320-326(2000))中的报告是一致的，其中表明为了进行实质的重构需要从移植开始经过8周的时间。 
这些特性表明TK-NOG小鼠所重建的人肝脏是成熟的“称为人肝脏的器官”。具有作为成熟肝脏特征的胆管网状结构、和功能性小叶结构(小叶内部特异性酶表达)等3维结构的新型TK-NOG平台，克服了用于人肝脏移植的公知的uPA转基因小鼠和Fah基因敲除小鼠的制约。肝胆网状结构、和功能性小叶结构等成熟肝脏所具备的功能绝不会在不具备3维结构(细胞间)的初代培养肝细胞等体内(in vitro)实验中再现。由TK-NOG小鼠重建的人源化肝脏成为药物代谢、和肝脏研究优选的平台。 
实施例2uPA-NOG小鼠的制备及其功能解析 
1.方法 
本实施例用以下方法进行。 
(1)转基因小鼠的制备 
如图25所示构建小鼠尿激酶型纤溶酶原激活物因子(Plau或uPA)基因表达单元。首先，用以下引物在退火温度60℃下将小鼠uPA基因进行PCR扩增。 
MuPA-Nhe1-F，5’-GCTAGCGGCACTACCATGAAAGTC-3’(序列号48)MuPA-Sal1-R，5’-AATTAAGTCGACAACAAGTGACCC-3’(序列号49) 
将实施例1中记载的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因表达质粒(pmAlbEPintUL23GH)用限制酶Nhe I·Sal I进行双重消化，由此除去单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因部分，然后，在对应部位克隆经该酶处理的上述小鼠uPA基因(序列号47)，得到质粒(pmAlbEPintPlauGH；GenBank登记编号AB453180)。将pmAlbEPintPlauGH质粒DNA用Not I和Kpn I消化，制备得到不含载体部的4.6-kb片段作为uPA表达单元。将该表达单元用公知方法显微注射到NOD/Shi小鼠的受精卵中。具有转基因的子孙用PCR进行鉴定(退火温度63℃)，所述PCR中使用MuPAF1正向引物5’-AGTGTATGCAGCCCCACTACTATG-3’(序列号50)和hGHR1反向引物5’-CACTGGAGTGGCAACTTCCA-3’(序列号8)。在20μl反应混合液中以94℃2分钟、94℃30秒35循环、63℃20秒、68℃60秒、68℃3分钟的条件对从尾组织中提取的基因组DNA进行扩增。转基因DNA在琼脂糖凝胶上以383bp的扩增产物条带的形式被确认到。使雄性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/ShiJic(NOG)与雌性转基因小鼠交配，得到具有scid和IL2Rgnull变异的个体。通过PCR，将scid和IL2Rgnull基因的变异进行基因分型(Maruyama，C.et al.Exp.Anim.51，391-393(2002)：Ito，M.et al.Blood 100，3175-3182(2002))。制备的小鼠的正式系统名用NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugTg(Alb-Plau)11-4/ShiJic表示，将其称为uPA-NOG。 
(2)利用RT-PCR进行的导入基因(小鼠uPA cDNA)转录物的检测 
使用RNeasy Mini kit(Qiagen K.K.)从29周龄的uPA-NOG小鼠肝脏、肾脏和脾脏中得到总RNA。使用HighCapacity cDNA ReverseTranscription kit(Applied Biosystems)进行RT-PCR。使用pCIspF正向引物5’-GAGGCACTGGGCAGGTGTCC-3’(序列号13)和MuPAR反向引物5’-AGGGCCGACCTTTGGTATCAGTG-3’(序列号51)，以365bp条带的形式检测到导入基因(小鼠uPA cDNA)转录物的剪接型(退火温度65℃)。使用G3PDHF正向引物5’-TCACCATCTTCCAGGAGCGAGA-3’(序列号15)和G3PDHR反向引物5’-GAAGGCCATGCCAGTGAGCTT-3’(序列号16)扩增得到的479bp甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶(Gapdh)片段被用作内标(退火温度65℃)。 
(3)自然发病肝脏损伤 
通过利用FUJI DRI-CHEM7000(Fujifilm)进行的生化血清检查(丙氨酸氨基转移酶，alanine aminotransferase(ALT)值的变动)来研究肝脏损伤的程度。 
(4)Southern印迹分析 
对8周龄uPA-NOG小鼠和非转基因小鼠的肝脏和肾脏用蛋白酶K消化一夜，进行苯酚∶氯仿∶乙醇提取，由此得到基因组DNA样品。对经限制酶XbaI、XhoI、BglII和BamHI消化的基因组DNA利用0.6％琼脂糖凝胶进行电泳，转移到荷正电的尼龙膜(F.Hoffmann-La Roche)上。使用利用PCR DIG Probe Synthesis Kit(F.Hoffmann-La Roche)制备的DIG标记探针进行杂交。所用的引物具有以下的序列。图26中的*表示探针识别的位置。 
正向，5’-GTTCTCCAGCTTGGGATCGACCTG-3’(序列号9) 
反向，5’-TTGATAGGAAAGGTGATCTGTGTGCAG-3’(序列号10) 
(5)人肝细胞的移植 
使用市售的冷冻人肝细胞(Lonza Walkersville)作为供体细胞，用以下的常用方法进行移植。作为受体，使用6周龄的成体半合子型和纯合子型uPA-NOG小鼠。细胞数和存活率利用锥虫蓝排除法使 用血细胞计数器测定。用带有26号注射针的汉密尔顿氏注射器，将悬浮于40μl的Hank’s Balanced Solution(HBSS)或William’s medium E中的1～2×106的活肝细胞移植到脾脏内。 
(6)人白蛋白测定 
隔一周使用塑料毛细管从眼底静脉丛中采少量血液。采集的血液用含有1％牛血清白蛋白和0.05％Tween20(BSA)的TBS(Tris-buffered saline)稀释500～30000倍，其人白蛋白浓度使用人白蛋白ELISA Quantitation Kit(Bethyl Laboratories)测定。阈值浓度为3×103ng/ml以下。 
(7)免疫印迹法 
将稀释血清样品(稀释倍数：2000倍)溶解在含5％β巯基乙醇的SDS样品缓冲液中，用于SDS-PAGE后，转录于Hybond-ECL膜(GE Healthcare Bio-Sciences)上。将转录的膜与生物素标记羊抗小鼠白蛋白多克隆抗体(A90-234A；Bethyl Laboratories)和生物素标记羊抗人白蛋白多克隆抗体(A80-229A；Bethyl Laboratories)一起培养，清洗后，将该膜与辣根过氧物酶(HRP)标记链霉亲和素(GE HealthcareBio-Sciences)一起培养60分钟。利用FluoReporter Mini-Biotin-XX Protein Labeling Kit(Invitrogen Corp.，CA，USA)进行生物素标记，对使用了ECL Western Detection System(GE Healthcare Bio-Sciences)和Hyperfilm ECL(GE Healthcare Bio-Sciences)的显色进行检测。 
(8)组织学和免疫组织染色 
将福尔马林固定后的组织用石蜡包埋，制备5μm切片，进行苏木素和曙红染色(H&E)以及用羊抗人白蛋白多克隆抗体(BethylLaboratories)作为1次抗体的免疫组织染色。用氨基酸聚合物/过氧化物酶配合物标记抗体(Histofine Simple Stain Mouse MAX PO(G)；Nichirei Bioscience)和二氨基联苯胺(DAB；Dojindo Laboratories)底物(0.2mg/ml 3，3’-二氨基联苯胺四盐酸，0.05M Tris-HCl，pH7.6，and0.005％H2O2)使羊Ig可视化，用苏木素对切片做对比染色。 
2.结果 
结果如下所述。 
(1)uPA转基因NOG小鼠的特征描述 
uPA的转基因结构是由人生长激素的基因的3’-UTR与小鼠白蛋白增强子/启动子(Alb En/Pro)、嵌合内含子、mouse uPA cDNA以及多聚腺苷化信号(hGHpA)一起构成的。图25给出其结构。箭头表示用于检测转基因特异性转录物的引物的位置和方向。各个箭头的前端表示寡核苷酸的3’末端。NOG系统中，由于scid变异所引起的DNA重构的缺陷，所以即使显微注射基因片段，所得到的子孙的数也极少。因此，首次用NOD/Shi系统确立了uPA-基因转基因小鼠(uPA-转基因；系统11-4)。NOG小鼠的遗传背景是NOD/Shi系统自身，scid和IL2Rgnull变异是唯一的不同，所以其后通过与NOG系统交配，保有scid和IL2Rgnull变异，可以得到重度免疫缺陷系统即NOG-Tg(Alb-Plau)11-4/ShiJic(正式的名称为：NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1SugTg(Alb-Plau)11-4/ShiJic，简称为：uPA-NOG)。在纯合子型转基因uPA-NOG小鼠中没有观察到现有技术中所见的uPA转基因的胚胎致死，令人吃惊的是，uPA-NOG小鼠可以在该纯合子系统中维持。 
图27给出利用RT-PCR对uPA转基因表达进行解析的结果。uPA转基因的检测使用引物来进行，所述引物特异性识别经过精确剪接的嵌合内含子的序列。对非转基因NOG小鼠(Wild)、半合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/+)、纯合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/Tg)的肝脏(Liver)、肾脏(Kidney)、脾脏(Spleen)进行该检测，在半合子型和纯合子型转基因uPA-NOG小鼠的肝脏中确认到uPA转基因的表达。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)作为内标。 
图28是表示半合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/+)和纯合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/Tg)中肝损伤标记·血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)的活性的图。半合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/+)的肝损伤标记值相对于虚线表示的非转基因NOG小鼠(Wild)的值不存在显著差异。另一方面，确认到纯合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/Tg) 中的ALT活性在出生6周后相对于半合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/+)和非转基因NOG小鼠(Wild)显著升高，并且持续至14周。 
将纯合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/Tg)肝脏的肉眼观察的图像(图29A)和肝细胞损伤图像(图29B和C)示于图29。对于非专利文献6的uPA转基因小鼠，有报道指出会发生肝脏本身的白色变性，但令人吃惊的是，本发明的uPA-NOG小鼠即使是在出生后6周的纯合子型小鼠(Tg/Tg)的肝脏中也没有发现肉眼可见的异常。将出生后6周的纯合子型小鼠(Tg/Tg)的肝脏的H&E染色图像示于图29B中。主要在中心静脉区域观察到肝细胞的退行性变灶、或嗜酸体。对于出生后16周的纯合子型，明显可见与嗜酸体的增加相伴的肝细胞的巨细胞症(图29C)。 
图30给出导入到uPA-NOG小鼠的uPA转基因通过Southern印迹法进行分子解析的结果。为了进行Southern印迹解析，对来自非转基因NOG小鼠肾脏(Kid.(W))以及uPA-NOG小鼠肾脏(Kid.(Tg))和uPA-NOG小鼠肝脏(Liv.(Tg))的基因组DNA样品用Xba I和Xho I消化(图30左)。将用于基因导入的4.6-kb的uPA表达单元(Cont.)用作阳性对照。对于非专利文献6的uPA转基因小鼠，有报道指出在肝脏中存在转基因缺失，但令人吃惊的是，本发明的uPA-NOG小鼠未见肝脏中发生转基因缺失。为了进行Southern印迹解析，对来自非转基因NOG小鼠肾脏(Wild)和uPA-NOG小鼠肾脏(Tg)的基因组DNA样品用Bgl II和Bam HI消化(图30右)。由解析结果可知，uPA-NOG小鼠保有至少3个复制的uPA表达单元。 
图26给出uPA-NOG小鼠的转基因的限制图和结构。并给出Xba I(Xb)、Bgl II(Bg)、Bam HI(Ba)和Xho I(Xh)的切断部位。星号表示DIG标记探针所识别的位置。 
(2)对uPA-NOG小鼠的人肝细胞移植和肝重建 
图31给出移植了人肝细胞的半合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/+)(图31A)和纯合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/Tg1)(图31B)的肝脏的肉眼观察图像。令人吃惊的是，即使在人肝细胞移植10周 后，也未见非专利文献6中报告的白色变性。 
图32给出uPA-NOG小鼠的人血清白蛋白浓度的推移(图32A)和体重变化(图32B)。半合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/+)中的人血清白蛋白浓度与虚线表示的非转基因NOG小鼠(Wild)的人血清白蛋白浓度值在相同水平，没有确认到人肝细胞生长。另一方面，纯合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/Tg1和2)中的人血清白蛋白浓度从人肝细胞移植后约4周开始升高，在进行了移植的2例中2例的人血清白蛋白浓度都为1mg/ml以上，即人肝细胞所致的置换率为10～15％。1例的人血清白蛋白浓度进一步继续升高，达到6.5mg/ml。人肝细胞移植后的纯合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/Tg1和2)的成长良好。利用免疫印迹法对这些小鼠血清进行解析，所得结果如图33所示。将小鼠血清和人血清用作阳性对照和阴性对照。对于抗人白蛋白抗体，仅人肝细胞移植后的纯合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/Tg1和2)和人血清观察到了65kDa的条带。对于抗小鼠白蛋白抗体，除人血清以外都观察到了65kDa的条带。 
将人肝细胞移植10周后的纯合子型转基因uPA-NOG小鼠(Tg/Tg1和2)的抗人白蛋白抗体的免疫染色和H&E染色结果示于图34。Tg/Tg1纯合子型转基因uPA-NOG小鼠中的人血清白蛋白浓度达到1.8mg/ml，抗人白蛋白抗体染色中切片上的约20％为人肝细胞(图34A)。另一方面，人血清白蛋白浓度达到6.5mg/ml的Tg/Tg2纯合子型转基因uPA-NOG小鼠的抗人白蛋白抗体染色中，切片上的约80％为人肝细胞(图34B)。Tg/Tg1纯合子型转基因uPA-NOG小鼠中的抗人白蛋白抗体染色阳性部(图34C)在H&E染色中观察到细胞质是透明的(图34D)。由于非专利文献2和4中指出蓄积在人肝细胞中的糖原颗粒通过H&E染色变得透明，所以上述观察与非专利文献2和4的报告是一致。 
实施例3药物在血浆中的动态、代谢物的鉴定、代谢速度等的评价 
1.异喹胍(DB)或S-华法林(WF)在具有人源化肝脏的小鼠生物 体内的代谢试验 
对肝脏的50％以上被人肝细胞置换的嵌合体小鼠(hu-Liver：血液中的人白蛋白浓度为4.5mg/mL以上)，以2.0mg/kg的用量强制口服给予DB(Research Biochemicals International)，或以30mg/kg的容量腹腔内给予WF(和光纯药工业株式会社)。在DB或WF给药后0、0.5、1、2、4、7和24小时后通过眼窝采血回收40μl体积的血液试样，通过离心分离从该血液中分离血浆。 
2.利用LC-MS/MS进行的DB、4-羟基DB(4-OH DB)、WF和7-羟基WF(7-OH WF)的定量 
DB和4-OH DB在血浆中的浓度用以下方法测定。在小鼠血浆5μL中添加蒸馏水150μL，混入作为内标物质的20nM丙咪嗪的乙醇溶液20μl，然后实施固相提取。用5％甲醇清洗后，用2-丙醇/乙腈混合液洗脱。洗脱液用LC-MS/MS进行定量。对于DB，观测到离子m/z 176和134，对于4-OH DB，观测到离子m/z 192和132，对于内标物质，观测到离子m/z 281和86。 
WF和7-OH WF在血浆中的浓度用以下方法测定。在小鼠血浆5μL中添加蒸馏水150μL，混入作为内标物质的50nM 2-苄基苯酚的乙醇溶液20μl，然后实施固相提取。用5％甲醇清洗后，用2-丙醇/乙腈混合液洗脱。与上述相同，洗脱液用LC-MS/MS进行定量。 
3.药物动力解析 
使用解析软件WInNonlin，根据DB、4-OH DB、WF和7-OHWF在血浆中的浓度，计算出血浆中药物浓度下面积(AUC)。用SAS程序实施统计分析。经过指定时间后的异喹胍和由CYP2D6产生的其代谢产物4’-羟基异喹胍在血液中的浓度分别示于图35A和图35B。异喹胍在血液中的浓度变化在作为对照的NOG和hu-Liver之间未见差异(图35A)，但4’-羟基异喹胍在任一时间在hu-Liver中都以高于在NOG中的高浓度被检测到(图35B)。对于计算出的AUC值，hu-Liver的值显著高于NOG的值(图35C)。同样，给予华法林时，CYP2C9产生的其代谢产物7-羟基华法林的AUC值在 hu-Liver中显示为高于对照的值(图35D)。已知CYP2D6和CYP2C9所致的代谢反应在小鼠中难以进行，与对照相比，在hu-Liver中检测到大量异喹胍和华法林在这些酶的作用下产生的各代谢产物，该结果暗示，生长到嵌合体小鼠中的人肝细胞在小鼠生物体内也保持了功能性，有助于这些代谢反应。 
实施例4供体细胞中的增殖性细胞(肝干细胞、肝前体细胞等)的检测 
1.人正常肝细胞的移植 
使用市售的冷冻人肝细胞作为供体细胞，用以下的普通方法进行移植。TK-NOG小鼠中，使用6～8周龄的成体作为受体，在移植前5天和前3天腹腔内给予GCV(0.5～1.5mg/kg)。uPA-NOG中，使用6周龄的成体纯合子作为受体。用带有26号注射针的汉密尔顿氏注射器，将悬浮于40μl的Hank’s Balanced Solution(HBSS)或William’s medium E中的1～2×106的肝细胞移植到脾脏内。 
2.增殖性人细胞的检测 
将福尔马林固定后的肝脏用石蜡包埋，制备其5μm切片。将切片浸在target retrieval solution(0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH6.0；1mMEDTA，pH9.0)中，接受10分钟高压釜处理后，在室温下放置20分钟。使用小鼠抗人Ki-67抗原单克隆抗体(clone MIB-1；Dako)作为1次抗体。为了进行明视野免疫组织染色，用氨基酸聚合物/过氧化物酶配合物标记抗体(Histofine Simple Stain Mouse MAX PO(M)；Nichirei Bioscience)和二氨基联苯胺(DAB；Dojindo Laboratories)底物(0.2mg/ml 3，3’-二氨基联苯胺四盐酸，0.05M Tris-HCl，pH7.6，and0.005％H2O2)使小鼠Ig可视化。用苏木素对切片做对比染色。 
3.具有人源化肝脏的小鼠中的人增殖性肝细胞的检测 
将在TK-NOG和uPA-NOG小鼠肝脏中生长下来的人正常肝细胞用细胞增殖标记(MIB-1)进行免疫染色，所得结果示于图36。Ki-67抗原在功能方面存在很多不明之处，但据报道在S期引起表达量增加，在M期成为最大。因此，观察到Ki-67抗原表达的细 胞表示进入了细胞周期。图36A中，在形成于TK-NOG小鼠肝脏的人肝细胞集落中，观察到大量细胞增殖标记(抗人Ki-67抗原)阳性细胞。并且，在形成于uPA-NOG小鼠肝脏的人肝细胞集落中也同样观察到细胞增殖标记阳性细胞(图36B)。 
市售的人正常肝细胞(通过酶处理而将肝脏分散后的细胞)包含肝脏中的所有细胞集团。在以该细胞为供体细胞，移植到TK-NOG和uPA-NOG小鼠中的任一情况下，在肝脏内都形成了人肝细胞集落。进而，在人肝细胞集落中观察到人特异性细胞增殖标记染色阳性的细胞。这表示，在供体细胞中存在具有分裂增殖能力的肝细胞、或肝前体细胞、肝干细胞，通过使用本发明的小鼠，可以评价容易地评价供体细胞中的肝前体细胞、肝干细胞的存在。 
实施例5使用了TK-Balb/c dKO小鼠以及TK-NOD dKO小鼠的人肝脏重建嵌合体小鼠的制备 
1.TK-Balb/c dKO小鼠的制备 
将TK-NOG小鼠与Balb/cA dKO小鼠(RAG-2KO，IL-2Rnull)交配，将得到的F1代小鼠重复与Balb/cA dKO小鼠交配，由此可制备TK-Balb/c dKO小鼠。在与Balb/cA dKO小鼠回交的过程中，检查子孙小鼠的HSV-Tk、SCID、RAG-2以及IL-2R基因，得到遗传背景为Balb/c的TK-Balb/c dKO小鼠(HSV-Tk(+)，SCID wild，RAG-2KO，L-2Rnull)。 
2.TK-NOD dKO小鼠的制备 
将TK-NOG小鼠与NOD dKO小鼠(RAG-2KO，IL-2Rnull)交配，将得到的F1代小鼠重复与NOD dKO小鼠交配，由此制备TK-dKO小鼠。在与NOD dKO小鼠回交的过程中，检查子孙小鼠的HSV-Tk、SCID、RAG-2以及IL-2R基因，得到遗传背景为NOD的TK-NOD dKO小鼠(HSV-Tk(+)，SCID wild，RAG-2KO，IL-2Rnull)。可以将下述序列表示的引物用于PCR反应，所述PCR反应基于实施例1所记载的PCR中所使用的方法，所述引物为：具有下述序列的HSV-tk基因型检查用引物； 
HTKF1：CACGTCTTTATCCTGGATTACG(序列号7) 
hGHR：GAATTCAACAGGCATCTACTGA(序列号6) 
具有以下序列的scid基因型检查用引物； 
mPkcs-R：CCTAAGAGTCACTTTCTCCATTTACACAGTGAAGTGCC(序列号52) 
mPkcs-F：GAGAAAAGGAGGATCATGGATTCAAGAAATAAATGTAACG(序列号53) 
mPkcs-MR：TGGCCCCTGCTAACTTTCTCTTAGCT(序列号54) 
mPkcs-WF：TGGTATCCACAACATAAAATACGCTAT(序列号55) 
具有以下序列的RAG2/IL-2R基因型检查用引物； 
RAG2-F：GATTCCTGCTACCTCCCACCT(序列号56) 
RAG2-R：TCACTCAAATCCTCTTCAGAGCATCTC(序列号57) 
PI(mγ3’)：CTGCTCAGAATGCCTCCAATTCC(序列号58) 
PII(Mp-b)：CCTCCGTGCAATCCATCTTGTTCAAT(序列号59) 
PIII(mγBam)：GATCCAGATTGCCAAGGTGAGTAG(序列号60) 
具有以下序列的IL-2R基因型检查用引物； 
PI(mγ3’)：CTGCTCAGAATGCCTCCAATTCC(序列号61) 
PII(Mp-b)：CCTCCGTGCAATCCATCTTGTTCAAT(序列号62) 
PIII(mγBam)：GATCCAGATTGCCAAGGTGAGTAG(序列号63) 
3.使用了TK-Balb/c dKO小鼠以及TK-NOD dKO小鼠的人肝脏重建嵌合体小鼠的制备 
依据TK-NOG小鼠中的方法制备人肝嵌合体小鼠。每隔一天对TK-Balb/c dKO小鼠和TK-NOD dKO小鼠的腹腔内以5mg/kg给药GCV两次。在第2次GCV给药后的第3天，使用具备26G注射针的汉密尔顿氏注射器经小鼠脾门部植入悬浮在HBSS中的人肝细胞。基于对血中GPT值的经时观察，确认到无论是否检测到高度肝损伤，具有该肝损伤的小鼠都没有明显的体重减小。将血液中确认到人白蛋白的个体实施安乐死，采集其肝脏。由采集的肝脏，制备被石蜡包埋的组织切片，对该切片实施利用抗人细胞角蛋白8/18抗体的免疫组织化学染色。人肝细胞移植后的TK-Balb/c dKO小鼠和NOD dKO小鼠的肝脏的通过抗人细胞角蛋白8/18抗体得到的免 疫组织化学染色图像分别示于图37A和图37B。确认到，TK-Balb/cdKO小鼠和NOD dKO小鼠中的、通过人细胞角蛋白8/18抗体染色的人肝细胞生长下来。 
产业上的可利用性 
本发明的小鼠是肝脏细胞被人肝脏细胞置换了的小鼠，并且具有人肝脏的结构或功能。使用本发明的小鼠，可以分析人特异性肝炎病毒的感染、给予的药剂的代谢或人肝脏的增殖。 
本发明的移植了人肝细胞的小鼠可发挥人肝脏的功能，能够评价药物在人肝脏中容易代谢的程度等。 
序列表自由文本 
序列号2～46、48～63引物 
将本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请直接作为参考引入本说明书中。 

Claims (22)

1.一种移植了人肝细胞的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的肝脏，其中，人单纯疱疹病毒1型-胸苷激酶(HSV-tk)基因保持在该肝脏中且能进行特异性表达，小鼠肝细胞的90％以上被人肝细胞置换，经人肝脏重建的该肝脏具有人肝脏的3维结构以及人肝脏的功能。
2.权利要求1所述的移植了人肝细胞的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的肝脏，其构建了人肝脏的肝胆管系统，具有人肝脏的功能性小叶结构，肝脏的异物排泄功能正常发挥作用。
3.如权利要求1或2所述的移植了人肝细胞的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的肝脏，其中，人肝细胞为人肝细胞株。
4.如权利要求3所述的移植了人肝细胞的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的肝脏，其中，人肝细胞株为HepG2、Hep3B或HuH-7。
5.如权利要求1或2所述的移植了人肝细胞的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的肝脏，其中，人肝细胞为原代培养的肝细胞。
6.如权利要求1或2所述的移植了人肝细胞的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的肝脏，其中，在白蛋白启动子、LST-1启动子、α甲胎蛋白启动子或α-生育酚转运蛋白启动子的调节下配置人单纯疱疹病毒1型-胸苷激酶(HSV-tk)基因，由此人单纯疱疹病毒1型-胸苷激酶(HSV-tk)基因被保持在该肝脏中且能进行特异性表达。
7.一种移植了人肝细胞的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的制备方法，所述移植了人肝细胞的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠中，人单纯疱疹病毒1型-胸苷激酶(HSV-tk)基因保持在该肝脏中且能进行特异性表达，小鼠肝细胞被置换为人肝细胞，经人肝脏重建的该肝脏具有人肝脏的3维结构以及人肝脏的功能，小鼠肝细胞的90％以上被人肝细胞置换，所述制备方法包含下述步骤：
(i)将人单纯疱疹病毒1型-胸苷激酶(HSV-tk)基因显微注射到NOD/Shi小鼠的受精卵中，
(ii)将通过步骤(i)得到的具有人单纯疱疹病毒1型-胸苷激酶(HSV-tk)基因的NOD/Shi小鼠与NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠交配，得到为NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug Tg(Alb-UL23)7-2/ShiJic小鼠(TK-NOG)的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠，及
(iii)对通过步骤(ii)得到的所述NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠给予自杀底物和从人分离出的肝细胞，损伤小鼠肝细胞，用人肝细胞置换小鼠肝细胞。
8.如权利要求7所述的移植了人肝细胞的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的制备方法，其中，自杀底物是通过胸苷激酶代谢为毒性物质的物质。
9.如权利要求8所述的移植了人肝细胞的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的制备方法，其中，被代谢为毒性物质的物质为阿昔洛韦或更昔洛韦。
10.如权利要求7～9中任一项所述的移植了人肝细胞的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的制备方法，其中，人肝细胞为人肝细胞株。
11.如权利要求10所记载的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的制备方法，其中，人肝细胞株为HepG2、Hep3B或HuH-7。
12.如权利要求7～9中任一项所述的移植了人肝细胞的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的制备方法，其中，人肝细胞为原代培养的肝细胞。
13.如权利要求7～9中任一项所述的移植了人肝细胞的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的制备方法，其特征在于，在白蛋白启动子、LST-1启动子、α甲胎蛋白启动子或α-生育酚转运蛋白启动子的调节下配置人单纯疱疹病毒1型-胸苷激酶(HSV-tk)基因，由此人单纯疱疹病毒1型-胸苷激酶(HSV-tk)基因被保持在该肝脏中且能进行特异性表达。
14.一种制备感染了人C型肝炎病毒(HCV)的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的方法，包含以下的步骤：
(i)制备具有权利要求1～6中任一项所述的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的肝脏的小鼠的步骤；和
(ii)对(i)所述的小鼠接种人HCV的步骤。
15.一种采用权利要求14所记载的方法制备的感染了人C型肝炎病毒(HCV)的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的肝脏。
16.一种人C型肝炎病毒(HCV)的培养方法，包含以下的步骤：
(i)对具有权利要求1～6中任一项所述的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的肝脏的小鼠给予人HCV的步骤；和
(ii)在宿主内放置充分的时间以引发人HCV的复制，然后从感染宿主中分离人HCV的步骤。
17.一种筛选具有抗HCV活性的候选药剂的方法，包含以下的步骤：
(i)对具有权利要求1～6中任一项所述的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的肝脏的小鼠给予候选药剂的步骤；和
(ii)分析候选药剂对HCV感染的作用的步骤，其中，人HCV的感染量相对于未给药的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠或候选药剂给药前的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的感染量减小意味着所述药剂具有抗HCV活性。
18.如权利要求17所述的方法，其中，在感染人HCV前给予候选药剂。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中，具有抗HCV活性的候选药剂为抗HCV抗体。
20.一种筛选用于主动免疫疗法且具有抗HCV活性的候选疫苗的方法，包含以下的步骤：
(i)重构具有权利要求1～6中任一项所述的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的肝脏的小鼠的免疫的步骤；
(ii)对(i)所述的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠给予候选疫苗的步骤；和
(iii)分析所述疫苗对HCV感染的作用的步骤，其中，人HCV的感染量相对于未给药的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠或所述疫苗给药前的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的感染量减小意味着所述疫苗具有抗HCV活性。
21.一种筛选具有抗HCV活性的治疗用疫苗接种用的候选疫苗的方法，包含以下的步骤：
(i)重构具有权利要求1～6中任一项所述的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的肝脏的小鼠的免疫的步骤；
(ii)对(i)所述的小鼠给予治疗用疫苗的候选疫苗的步骤；和
(iii)分析所述疫苗对HCV感染的作用的步骤，其中，人HCV的感染量相对于未给药的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠或所述疫苗给药前的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的感染量减小意味着所述疫苗具有抗HCV活性。
22.一种使用具有权利要求1～6中任一项所述的NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的肝脏的小鼠采集含有肝干细胞的细胞集团的方法，所述方法包含下述步骤：从NOG(NOD/SCID/γcnull)小鼠的肝脏中生长的肝组织中采集含有肝干细胞的细胞集团。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102586325A (zh) * 2012-01-19 2012-07-18 浙江大学 抑制CYP3A4的shRNA表达质粒及构建和应用
JP5871412B2 (ja) * 2012-03-27 2016-03-01 株式会社トランスジェニック ヒト化マウス
JP5976380B2 (ja) 2012-04-27 2016-08-23 公益財団法人東京都医学総合研究所 ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータートランスジェニックマウス
CN103690997B (zh) * 2013-12-05 2016-06-29 南方医科大学珠江医院 用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒及其使用方法
JP6566464B2 (ja) * 2014-10-24 2019-08-28 国立大学法人広島大学 急性重症肝炎モデル非ヒト動物の作製方法、劇症肝炎治療薬のスクリーニング方法およびｂ型劇症肝炎治療薬
EP3850946B1 (en) * 2014-12-05 2023-09-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
WO2016203597A1 (ja) * 2015-06-18 2016-12-22 株式会社トランスジェニック 臓器ヒト化マウス
CN108504624A (zh) * 2018-04-08 2018-09-07 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种免疫缺陷小鼠模型的新应用
JP6935383B2 (ja) * 2018-09-27 2021-09-15 公益財団法人実験動物中央研究所 免疫不全マウス
CN113613490A (zh) * 2018-12-14 2021-11-05 公益财团法人实验动物中央研究所 移植有人肝细胞的非人脊椎动物及其制造方法
CN109735485B (zh) * 2019-01-29 2021-04-16 深圳市拓普生物科技有限公司 人源化肝脏动物模型及其构建方法和应用
CN110823655A (zh) * 2019-11-06 2020-02-21 南通大学 一种激光显微切割获取抗体标记组织单细胞的方法
JP7136509B2 (ja) * 2019-12-27 2022-09-13 学校法人高崎健康福祉大学 肝細胞培養膜、それを備えた薬物輸送能評価キット、及び薬物輸送能評価方法
CN116103379A (zh) * 2023-01-18 2023-05-12 广东医科大学附属医院 一种动物体内人源细胞的检测方法及用途
JP7471704B1 (ja) 2023-08-17 2024-04-22 協和ステンレス株式会社 ステンレスタンク用電解研磨装置、およびステンレスタンクの電解研磨方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6525242B1 (en) * 1999-11-02 2003-02-25 The University Of Connecticut Propagation of human hepatocytes in non-human mammals
US6509514B1 (en) * 2000-03-17 2003-01-21 Kmt Hepatech, Inc. Chimeric animal model susceptible to human hepatitis C virus infection
DE60131676T2 (de) * 2000-12-01 2008-10-30 Central Institute For Experimental Animals Verfahren zur herstellung einer maus, die für die aufnahme, differenzierung und proliferation von heterogenen zellen geeignet ist, die hierdurch hergestellte maus und ihre verwendung
CA2480559A1 (en) * 2002-03-25 2003-10-02 Japan Science And Technology Agency Antibody recognizing proliferative human liver cells, proliferative human liver cells and functional human liver cells
CN1189076C (zh) * 2002-06-15 2005-02-16 浙江大学 一种筛选抗丙型肝炎病毒药物的方法
CN100540660C (zh) * 2004-08-27 2009-09-16 上海交通大学附属儿童医院 一种转基因小鼠肝病动物模型、其制备方法及应用
CN1732942A (zh) * 2005-08-08 2006-02-15 湖北科益药业股份有限公司 更昔洛韦在制备治疗肿瘤药物中的应用
JP5497639B2 (ja) * 2007-06-05 2014-05-21 オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティ 生体内でヒト肝細胞を増大させる方法

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