JP5737821B2 - 血友病b治療剤及びその製造方法 - Google Patents
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Description
(i) 肝障害免疫不全マウスであるuPA/SCIDマウスにヒト肝細胞を移植してキメラマウスを作製し、このキメラマウスの肝臓で増殖したヒト肝細胞は、血液凝固第IX因子を分泌生産している。
(ii) このキメラマウス体内で増殖したヒト肝細胞は、凝固第IX因子を欠くヒト血漿における止血機能を有している。
(I)血友病B治療剤の製造方法
本発明の血友病B治療剤の製造方法は、免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を回収する工程とを含む方法である。
免疫不全肝障害非ヒト動物は、異種動物由来の細胞に対して拒絶反応を示さない免疫不全であるとともに、その非ヒト動物本来の肝臓の細胞が障害を受けている動物である。その動物本来の細胞が障害を受けていることにより、ヒト肝細胞を移植すれば、その肝機能は移植されたヒト肝細胞によって保たれ、ヒト肝細胞の個体内機能を正確に反映した動物となる。また、移植するヒト肝細胞が増殖し易くなる。
移植に用いるヒト肝細胞は、血友病Bではないヒト、好ましくは正常なヒト(健常人)の肝組織から、コラゲナーゼ灌流法のような常法によって単離したものを用いることができる。また、分離した肝細胞を一旦冷凍保存した後解凍して用いることもできる。
このようなヒト肝細胞は、免疫不全肝障害動物の脾臓を経由して肝臓へ移植することができる。また、直接門脈から移植することもできる。移植するヒト肝細胞の数は、1〜200万個程度、好ましくは50万〜100万個程度とすることができる。
キメラ動物体内で増殖したヒト肝細胞は、例えば、キメラ動物の肝臓組織をコラゲナーゼ処理することにより回収することができる。コラゲナーゼの細胞毒性は、非ヒト動物肝細胞に対する方が、ヒト肝細胞に対するより高いため、コラゲナーゼ処理時間を調節することにより、キメラ動物の肝細胞に障害を与え、実質的にヒト肝細胞だけを分離することができる。コラゲナーゼ処理時間は、ヒト肝細胞と非ヒト肝細胞との存在割合によって異なるが、例えば、血中アルブミン濃度が1〜14mg/ml程度の場合は、濃度0.01〜0.1重量%程度のコラゲナーゼ溶液で10〜30分間程度処理を行えばよい。
剤形
本発明の血友病B治療剤は、免疫不全肝障害非ヒト動物の体内で増殖したヒト肝細胞を含むものである。特に、このヒト肝細胞を有効成分として含む。
代表的には、上記ヒト肝細胞懸濁液を、血友病B患者の門脈系又は脾臓から移植することにより、血友病Bを改善、又は治療することができる。移植されたヒト肝細胞は肝臓に生着して、凝固第IX因子を分泌生産する。これにより、血友病Bが改善、又は治療される。投与量は、症状および疾患の重篤度、患者の年齢、性別もしくは体重、投与経路などにより異なるが、概ね、ヒト肝細胞の投与量が100万個〜10億個/体重キログラム程度となるように投与すればよい。また、この量を複数回投与することにより、一層高い治療効果が期待される。
本発明の血液凝固第IX因子の製造方法は、免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を分離する工程と、このヒト肝細胞が分泌する血液凝固第IX因子を回収する工程とを含む方法である。
以下、本発明を実施例を挙げて、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
(1)免疫不全肝障害マウス
レシピエント動物として使用したuPA-Tg(+/+)/SCID(+/+)マウスは、(株)フェニックスバイオにて繁殖させたものを用いた。
uPA-del-F
5’-TTCTCTTCTCTTGCCCTCTCACA-3’(配列番号1)
uPA-del-R
5’-TTGAGACCCTCAAGACAGCCA-3’ (配列番号2)
Tg-F
5’-ATCCCTGTGACCCCTCCC-3’ (配列番号3)
uPA-hgh-r1
5’-CTCCATACCACCCCCCTC-3’ (配列番号4)
ヒト肝細胞としては、BD Gentest社より購入した1才白人男児または6才黒人女児の凍結保存肝細胞を使用した。この凍結肝細胞はChise Tateno, Yasumi Yoshizane, Naomi Saito, Miho Kataoka, Rie Utoh, Chihiro Yamasaki, Asato Tachibana, Yoshinori Soeno, Kinji Asahina, Hiroshi Hino, Toshimasa Asahara, Tsuyoshi Yokoi, Toshinori Furukawa, Katsutoshi Yoshizato: Near-completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol 165:901-912, 2004に記載の方法に従って融解して用いた。
移植後ビタミンC 0.3%含有CRF-1(オリエンタル酵母株式会社)、次亜塩素酸ナトリウム溶液0.0125%添加水道水の自由摂取により飼育した。
上記の置換率が推定されたマウスの12匹から採血し、凝固一段法にて第IX因子活性を測定した。即ち、10倍希釈した被験血漿サンプルに等量のヒト凝固第IX因子(FIX)欠乏血漿(トロンボチェックFactorIX, Sysmex社)、及び等量のリン脂質(MDA-platelin LS regent; bioMerieux Inc, Durham, NC)を加え、そこにCaCl2を添加してから、混合物が凝固するまでの時間を血液凝固自動分析装置(KC10A,アメルング社)を用いて測定した。コントロールとして正常ヒト血漿(Verify1 : bioMerieux Inc, Durham, NC)を段階希釈したものを用いて、上記と同様にして凝固時間を測定し検量線を作成し、それを元に被験血漿サンプルの凝固因子活性を算出した。被験血漿サンプルの第IX因子の活性は、正常ヒト血漿の凝固時間を100%としたときの相対値で表した。
実施例1と同様にしてuPA-Tg(+/+)/SCID(+/+)マウスにヒト肝細胞を移植し、移植後ビタミンC 0.3%含有CRF-1(オリエンタル酵母株式会社)、次亜塩素酸ナトリウム溶液0.0125%添加水道水の自由摂取により飼育した。
キメラマウスのヒト肝細胞置換率は、実施例2と同様にして測定した。また、Asserachrom VIII:Ag ELISA Kit(Diagnostica Stago, France)を用いてキメラマウス血液中のヒト凝固第VIII因子濃度を測定した。このELISA Kitがマウス凝固第VIII因子抗原を検出しないことは確認した。
実施例1でマウスにヒト肝細胞を移植した後、ビタミンC 0.3%含有CRF-1(オリエンタル酵母株式会社)、次亜塩素酸ナトリウム溶液0.0125%添加水道水の自由摂取により飼育する。
Claims (10)
- 重症複合免疫不全症(SCID)肝障害非ヒト哺乳動物の肝臓内で増殖させることにより得られる、ヒト血液凝固第IX因子を分泌するヒト肝細胞を含み、1回当たり当該ヒト肝細胞100万個〜10億個/体重キログラムが移植されるように用いられる、血友病B治療剤。
- ヒト肝細胞が、ELISA法で検出される濃度のヒト血液凝固第VIII因子を前記哺乳動物血漿中で産生しないものである、請求項1に記載の血友病B治療剤。
- ヒト肝細胞が、ヒト血液凝固第VIII因子を産生しないものである、請求項1又は2に記載の血友病B治療剤。
- 哺乳動物がげっ歯類である請求項1〜3のいずれか一項に記載の血友病B治療剤。
- SCID肝障害非ヒト哺乳動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト哺乳動物を作製する工程と、キメラ非ヒト哺乳動物体内で増殖したヒト肝細胞を回収する工程とを含む、血友病B治療剤の製造方法。
- ヒト肝細胞が、ELISA法で検出される濃度のヒト血液凝固第VIII因子を前記哺乳動物血漿中で産生しないものである、請求項5に記載の方法。
- 哺乳動物がげっ歯類である請求項5又は6に記載の方法。
- SCID肝障害非ヒト哺乳動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト哺乳動物を作製する工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を分離する工程と、このヒト肝細胞が分泌する血液凝固第IX因子を回収する工程とを含む、血液凝固第IX因子の製造方法。
- ヒト肝細胞が、ELISA法で検出される濃度のヒト血液凝固第VIII因子を前記哺乳動物血漿中で産生しないものである、請求項8に記載の方法。
- 哺乳動物がげっ歯類である請求項8又は9に記載の方法。
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