KR100656795B1 - 인간의 ｃ형 간염 바이러스 감염을 받을 수 있는 키메라동물 모델 - Google Patents

인간의 ｃ형 간염 바이러스 감염을 받을 수 있는 키메라동물 모델 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 향간성 병원체, 특히 인간 C형 간염 바이러스(HCV)에 의한 감염을 받을수 있는, 비인간 동물 모델을 특징으로 한다. 모델은 인간-마우스 키메라 간을 갖는, 비인간, 면역기능저하된 이종유래 트랜스제닉 동물에 기초하는데, 트랜스 유전자는 간에서 우로키나제형 플라스미노겐 활성제를 제공한다. 본 발명은 후보 치료제, 예를 들어, HCV 감염에 대항한 항바이러스 활성을 갖는 약제를 동정하는 방법을 특징으로 한다.
Figure 112002030390203-pct00005
C형 간염, 트랜스제닉 마우스, 면역기능저하, 간이식

Description

인간의 Ｃ형 간염 바이러스 감염을 받을 수 있는 키메라 동물 모델{CHIMERIC ANIMAL MODEL SUSCEPTIBLE TO HUMAN HEPATITIS C VIRUS INFECTION}
본원발명은 일반적으로 감염성 질환의 분야, 특히 바이러스 병원균에 대한 모델에 관한 것이다.
C형 간염 바이러스(HCV)에 의해서 야기되는 인간의 간 질환이 지난 십년 남짓 동안 전세계적으로 의학계에 직면한 가장 어려운 난제중 하나로 부상했다. 1989년에 바이러스 서열의 해명(Choo, et al. Science 244, 359-361(1989))이 HCV의 협동된 연구 시대를 개시하게 하였고; 현재 175,000,000 명까지의 인간이 감염된 것으로 추정된다(Sarbah, et al. Cell 62, 447-456 (1990)). HCV 는 선진국에서 1-2% 로 추정되는 우세한 만성 바이러스성 간염의 가장 일반적인 형태이다. 만성 HCV 간염은 감염된 환자의 적어도 25%에서 간경변을 유발하고, 간경변의 발생 후에, 간세포 암종이 매년 1-4%의 환자를 발생시키는 것으로 추정된다. 북아메리카에서 HCV는 현재 간이식에 대한 가장 일반적인 지표이다.
현재 인터페론 및 리바비린 조합으로의 항바이러스 요법은 선별된 환자에서 효과적이지만, 많은 환자들이 요법에 반응하는데 실패하거나, 요법에 불량하게 내성을 가져서, 개선에 대한 필요성을 강조케한다. 인터페론 단일요법에 대한 지속적 인 반응률은 20-25%로 분포하는 반면에, 인터페론과 리바비린으로의 조합 요법은 40% 이하의 지속적인 반응률을 나타냈다. 바이러스 게놈의 상이한 부분을 표적화하는 더욱 신규한 항바이러스 약제가 개발중에 있지만, HCV의 강건하고 비용 효과적인 동물 모델의 부족으로 진전이 상당히 방해받았다. HCV에 대한 유일한 천연 숙주는 인간 및 침팬지이고, 이것들 중의 어느것도 대규모 항바이러스 시험에 적합하지 않다.
HCV 감염에 대한 재생산 가능한 작은 동물 모델의 부족은 이 질환에 기여하는 다양한 면역 인자의 조사뿐만 아니라 만성 HCV 감염의 면역요법에 대한 백신 후보 약제에 대한 연구를 더욱 제한해왔다. HCV 감염의 경우, 다수의 연구는 HCV 감염된 개체로부터 분리된 T 세포에 대한 시험관내 연구에서 Thl-> Th2 스위치 및 CD4+ 및 CD8+ T 세포 특이적인 HCV 항원의 존재를 증명해 왔다. 다른 한편, 비-바이러스 혈증 HCV 감염된 환자가 감염 수년 후에조차 다수의 HCV 항원에 강한 Th1 반응을 자극한다는 것이 발견되었고, 이것은 HCV 복제 조절은 효과적인 Th1 활성에 의존할 수 있다는 것을 제안한다(Cramp et al. Gut 44 : 424-429 (1999)). HCV에 대한 면역 반응의 더 나은 이해와 이에 따른 유효한 백신 및 요법의 발전에 대한 통찰력을 제공하기 위한 이러한 과제에 대한 해법은 적합한 동물 모델없이는 용이하게 도달할 수 없다.
지난 몇 년 동안, B형 간염 바이러스에 대한 동물 모델의 발전에서 유의한 진전이 있었다. 그러나, 그들의 유사하게 들리는 명칭에도 불구하고, 인간 B형 간염 바이러스(HBV) 및 인간 C형 간염 바이러스(HCV)는 완전히 다른 바이러스이므로 HBV 감염에 관한 연구는 HCV 감염에 대하여 용이하게 추론될 수 없었다. HBV 및 HCV가 간에서 감염되고 복제되기 때문에, 주로 이 두 바이러스를 "간염" 바이러스라고 한다. 이에도 불구하고, HBV 및 HCV는 단지, 각각 면역 체계에 영향을 주는 HIV 및 EBV이상으로 유의하지 않다. 사실, HBV 및 HCV는 매우 상이하여 같은 계통 부류의 구성원조차 아니다. HBV는 이중가닥 DNA 의 게놈을 가진 헤파드나바이러스 (hepadnavirus) 부류의 구성원인 반면에, HCV는 단일 양성 가닥 RNA 게놈에 기초한 플라비바이러스(flavivirus) 부류의 구성원이다.
HBV 및 HCV는 또한 그들의 감염성에서도 다르다. 주사바늘 상처를 받은 병원 환자에서의 획득율에서의 차이로 증명된 대로, HCV는 대등한 투여량의 HBV보다 덜 감염성이다. HBV 감염은 HBV-오염된 주사바늘 사건의 2-40%에서 발생하는 반면에, HCV 감염은 HCV-오염된 주사바늘 사건의 단지 3-10%에서 발생한다. 이러한 관찰은 HCV가 HBV보다 약 3 내지 4배 덜 감염성이라는 것을 시사한다(Shapiro Surgical Clin North Amer. 75 (6) : 1047-56 (1995)).
HBV 및 HCV는 복제에 대한 필요성 뿐만 아니라 감염동안 바이러스 부하에서도 상당히 다르다. HBV는 덜 분화된 시스템에서 복제할 수 있다(예를 들어, HepG2 세포, Sells et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 1005 (1987)). 대조적으로, HCV 복제는 비형질전환된 간세포의 존재에 의존할 수 있다(예를 들어, Ito et al. J. Gen. Virol. 77 : 1043 (1995)참조하시오). HCV로 감염된 환자의 바이러스 적정값은 일반적으로 HBV 감염된 환자의 것보다 낮다. HBV로 감염된 환자는 HCV 감염에 서의 mL 당 102 내지 107 입자에 비교할 때, mL 당 105 내지 109 입자로 분포하는 수준을 가진다. 바이러스 적정값에서의 이러한 차이는 적어도 부분적으로는 바이러스 입자의 상대적 제거율 때문일 수 있다. 게다가, 세포당 바이러스 복제수 역시 HCV 감염에서 매우 낮다(예를 들어, 일반적으로 세포당 20 미만의 복제수(Dhillon et al. Histopathology 26 : 297-309 (1995)). 낮은 바이러스 적정값 및 세포당 낮은 바이러스 복제수의 조합은, 혈청내에서조차 검출되기 위하여는 인간의 간세포의 유의한 수가 감염되고 감염에 대하여 바이러스를 생산하여야만 함을 의미한다.
인간의 HBV 및 인간의 HCV의 제한된 숙주 범위는 감염의 시험관내 및 체내 모델의 발전에서의 문제점을 증명했다. 인간 및 침팬지는 인간 HBV 감염을 받을 수 있는 유일한 동물이다; 인간, 침팬지, 및 나무 뒤쥐는 인간 HCV로 감염을 받을 수 있다 (HCV로의 나무 뒤쥐의 일시적인 감염을 보고하는, Xie et al. Virology 244 : 513-20 (1998)). 인간 HBV는 배양물에서 분리된 인간 간세포를 감염시킬 것이다(예를 들어, Sureau Arch. Virol. 8 : 3-14 (1993) ; Lampertico et al. Hepatology 13 ; 422-6 (1991)참조). HCV가 인간의 간세포의 제1차 배양물을 감염시키는 것이 보고되었다; 그러나, 세포는 자손 비리온의 생산을 지지하지 않는다(Fournier et al. J Gen Virol 79 (Pt 10) : 2367-74 (1998)). 만족스러운 생체내 모델의 개발이 후보 치료제를 분석하는데 더욱 임상적으로 적절한 수단을 제공하기 위해서 요구된다. HBV 및 HCV의 매우 좁은 숙주 범위가 동물 모델을 개발시키는 것을 매우 어렵게 했다. HBV 및 HCV의 현재의 동물 모델의 어느 것은 감염의 일반적인 과정을 포 함하지 않고, 이미 감염된 인간의 간 세포의 사용을 요구하거나, 또는 양자 모두 그러하다(예를 들어, U.S.특허번호 5,709,843; 5,652,373; 5,804,160; 5,849,288; 5,858,328; 및 5, 866,757; 마우스 신장 협막아래로 HBV-감염 사람 간세포를 이식시키는 것에 의한 HBV 감염에 대한 키메라 마우스 모델을 개시; WO 99/16307 및 Galun et al. J. Infect. Dis. 172 : 25-30 (1995), 면역결핍 마우스의 간내로 HCV-감염 사람 간세포의 이식을 개시; Bronowicki et al. Hepatology 28 : 211-8 (1998), SCID 마우스로 HCV-감염 조혈 세포의 복강내 주사를 개시; 및 Lerta et al. Hepatology 28 (4Pt2) : 498A (1998), HCV 게놈에 대하여 트랜스제닉한 마우스를 개시).
인간 HBV에 의한 감염은 우드척(woodchuck) 간염 바이러스(WHV)를 가진 우드척의 감염, 그리고 오리 간염 바이러스(DHV)를 가진 베이징 오리의 감염과 상당히 흡사하다. WHV-감염 우드척 및 DHV감염 오리가 인간의 인간 HBV 감염에 대하여 유효한 약제를 동정하는데 성공적으로 사용되었다. 그러나, 감염의 어떤 유사한 동물 모델도 인간 HCV에 대하여 동정되지 않았다.
실험적 비-인간 숙주의 부재에서, 가장 바람직한 동물 모델은 감염의 일반적인 경로를 통해서 인간 간 세포의 감염을 허용하는 키메라 동물 모델, 바람직하게는 정맥내 접종을 통해서 바이러스 감염을 받을 수 있고, 만성 감염을 지지할 수 있는 동물 모델일 수 있다. 불행하게도, HBV 또는 HCV 감염을 받을 수 있는 인간의 간세포를 가진 키메라 간을 가지고, 임상적으로 상당한, 지속적인 수준으로 바이러스 복제 및 비리온 생산을 지속하는 마우스의 발생이 간단한 문제가 아니라는 것이 증명되었다. 이종 간 이식 분야는 매우 느리게 진전되었고, 많은 난관을 겪었다.
신생아 출혈 장애 및 저피브리노겐증을 연구하기 위해서, 알부민-우로키나제형 플라스미노겐 활성제 구성체(Alb-uPA)에 대한 트랜스제닉 마우스가 개발되었다(Heckel et al. Cell 62 : 447-56 (1990) ; Sandgren et al. Cell 66 : 245-56 (1991)). Alb-uPA 트랜스유전자는 간에 우로키나제 생산의 표적화 및 상당한 저피브리노겐 상태의 생산을 초래하는 알부민 프로모터의 조절하에 있는 마우스 우로키나제 유전자를 포함한다. 이 트랜스유전자는 또한 가속화된 간세포 사멸과 연관되어 있다는 것이 발견되었다. 이러한 트랜스제닉 동물로의 후속 연구는 트랜스유전자를 자발적으로 결실시킨 각각의 간세포는 유의한 생존 및 복제 이점을 획득하여, 비트랜스제닉 세포를 가진 간의 재분포를 초래한다는 것을 증명했다 (Sandgren et al., (1991), 상기참조). Alb-uPA 트랜스제닉 마우스는 비트랜스제닉 마우스로부터의 간 세포의 이식에 적합하다는 것이 증명되었다(Rhim et al. Science 263 : 1149-52 (1994)). Alb-uPA 트랜스제닉 마우스는 또한 래트 간세포를 가지거나(Rhim et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 4942-6 (1995)), 우드척 간세포(Petersen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 : 310-5 (1998)를 가진 키메라 간을 가진 마우스를 생산하는데 성공적으로 사용되었다. 그러나, 이러한 발전은 HCV 감염을 받기 쉬운 동물 모델의 발전과 여전히 거리가 먼 단계이다. 설치류(Rodentia) 과의 다른 원소로부터 이종 이식편을 가진 마우스의 생산은 우리로 하여금 훨씬 덜 높은 정도의 키메라 현상이 이루어지거나, 이러한 키메라 동물이 HCV 감염을 지지한다는 것을 예상케 하는, 예를 들어 인간과 같은 다른 과의 동 물로부터의 이종 이식편을 가지는 마우스의 생산과 같이 어렵거나 기대할 수 없는 것은 아니다. 예를 들어, 간세포 성장 인자(HGF)는 체내에서 간세포 재발생의 가장 유력한 자극이고; 서열 데이타와 비교하여, 마우스 HGF 는 래트 HGF와 98.5% 아미노산 서열 상동성, 그리고 인간의 HGF와 단지 90.9% 의 상동성을 가지는 것을 보였다. (Liu et al. Biochim et Biophys Acta 1216 ; : 299-303 (1993)). 성공에 대한 보장은 없었다.
임상적으로 상당한 수준으로 HCV 및 바이러스 생산을 가진 만성적 감염을 받을 수 있는 인간-마우스 간 키메라 분야에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 이러한 문제에 대해 접근한다.
(발명의 개요)
본원발명은 인간의 향간성 병원균, 특히 인간 C형 간염 바이러스(HCV)에 의한 감염을 받을 수 있는 비-인간 동물 모델을 특징으로 한다. 이 모델은 트랜스유전자가 간에서 우로키나제형 플라스미노겐 활성제의 발현을 제공하는 인간-마우스 키메라 간을 가지는 비-인간, 면역기능저하 트랜스제닉 동물에 기초한다. 본 발명은 또한, 후보 치료제, 예를 들어, HCV 감염에 대하여 항바이러스 활성을 가지는 약제를 동정하는 방법을 특징으로 한다.
본 발명의 제1의 목적은 감염의 일반적인 경로를 통해서 인간의 HCV에 의한 감염을 받을 수 있는 비-인간 동물 모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 이점은 동물 모델이 감염의 일반적인 경로를 통해 HCV에 의한 감염을 받을 수 있고, 더욱이 HCV 감염된 인간에서 바이러스 적정값에 동등할 수 있 는 바이러스 적정값으로 만성적으로, 일정하게, 그리고 안정적으로 감염될 수 있는 동물의 첫번째 예를 제공한다는 것이다.
본 발명의 또 다른 이점은 동물 모델의 생산이 HCV-감염 세포를 획득하거나 다루는 것을 요하지 않는다. 그러므로, 본 발명은 HCV-감염 인간 공여자로부터 간세포를 얻거나, 시험관내에서 인간 간세포를 배양하고 감염시킬 필요가 없다.
본 발명의 이러한 목적, 이점, 및 특징은 하기에 더욱 상세하게 개시될 때, 이것을 이용한 동물 모델 및 방법의 상세한 설명을 읽는 당업자에게 자명할 것이다.
도 1은 Alb-uPA 트랜스유전자를 운반하거나 운반하지 않는 동물에서의 시간 경과에 따른 수여자 혈청 샘플에서 인간 알부민(HA)생산의 웨스턴 블롯이다.
도 2A-2F는 마우스 간에서 인간 키메라현상의 조직화학적 분석 사진이다. 도 2A는 균일한 세포 구조를 보이는, 비이식 동형접합성의 Alb-uPA 간으로부터 채취한 대조표준 마우스 간의 저분해능 H&E 절편이다. 도 2B는 주위의 숙주-유래 실질을 압착하는 조직의 거대 결절을 보여주는 이식된 동형접합성 마우스로부터의 저 분해능 H & E 절편이다. 도 2C 및 2D는 면역조직화학 과정은 인간 세포를 명백하게 염색하지만, 마우스 세포를 염색하지 않는다는 것을 증명하는, 모두 항-인간 간세포 항체로 면역염색된, 마우스 및 인간 간 각각의 대조표준 절편을 도시한다. 도 2E 는 주위 조직을 압착하는 건강한 간세포의 결절을 보여주는 이식된 이형접합성 간의 고분해능 H&E 염색된 절편이다. 도 2F 는 주위의 실질이 마우스 기원인 인간 세 포로 이루어진 더 어두운 결절을 보여주는 인간 간세포 항원에 대하여 면역염색된 연속적인 절편이다.
도 3은 Alb-uPA 트랜스유전자를 운반하는 4 개의 수여자에서 인간의 간세포 이식편으로부터(1x 106 세포) 알부민의 생산을 예증하는 그래프이다.
도 4는 지속적인 신호 강도를 보여주는 이식후의 Alb-uPA 포지티브 수여자 에서의 HA 생산의 웨스턴 블롯이다. HA-인간 알부민 표준(50ng); Con- 비이식 마우스 혈청 대조표준.
도 5는 키메라 간에서 인간의 간세포로부터 생산된 인간의 알부민(HA)의 검출을 도시하는 웨스턴 블롯의 사진이다(샘플은 각각의 마우스를 나타낸다). 야생형(-); 트랜스제닉(+) 수여자. HA-인간 알부민 표준; MS-비이식 마우스 혈청(네가티브 대조표준).
도 6은 게놈 DNA 로부터 Alb-uPA 접합성의 결정을 위한 써던 블롯의 사진이다; 약 2의 T/E 비율은 반적합성 마우스의 특징인 반면에, 동형접합체는 약 4의 비율을 가진다.
도 7은 Alb-uPA 트랜스유전자에 대한 반접합체(+/-) 또는 동형접합체(+/+) 이식편 수여자에서의 장기간 HA 생산을 보여주는 웨스턴 블롯의 사진이다. HA-인간 알부민 표준; MS-비이식 마우스 혈청(네가티브 대조표준).
도 8은 각각의 동형접합체(검은 원) 또는 반접합체(흰 원) 수여자 마우스 혈청 샘플로부터 정량화된 HA 생산의 수직 산재도표를 보여주는 그래프이다. 중앙 기 울기선이 양 군에 대하여 도시된다.
도 9는 HCV 감염된 인간 혈청으로의 접종 후에 동형접합성 트랜스제닉 이식편 수여자에서 접종후 제 4-7 주에 걸쳐 혈청 HCV RNA 적정값이 올라가는 것을 보여주는 그래프이다. 각 라인은 각각의 이식편 수여자로부터의 일련의 적정값을 나타낸다.
도 IOA 는 사슬 특이적인 프라이머를 가진 열안정성 rTth 역전사효소 RNA PCR 프로토콜에 의해 (+) 가닥 RNA(상부 패널) 또는 (-) 가닥 RNA (하부 패널)의 검출을 보여주는 겔 사진이다. 문자 표시는(A 내지 J) 대조군 샘플이고, 숫자 표시(1 내지 10)는 HCV-감염 인간 혈청에 의하여 접종된 동형접합성 마우스 간으로부터 분리된 각각의 RNA 샘플을 나타낸다. A, 비이식, 비감염의 야생형; B, HCV로 접종된 이형접합성 이식된 마우스; C, HCV로 접종되지 않은, 동형접합성 이식된 마우스; D, 감염된 인간으로부터 채취된 혈청; E, 표준 DNA 사다리; F, (+) 가닥(상부 패널) 또는 (-)가닥(하부 패널) 바이러스 RNA 로부터 제조된 표적 DNA 서열에 대한 표지된 프로브의 결합; G, HCV-포지티브 인간으로부터 혈청 RNA 로 도프된 마우스 간 RNA(10㎍); H, 106 복제수의 방사성불활성 안티센스(상부) 또는 센스(하부) 리보프로브로 도프된 마우스 간 RNA (10㎍); I, 106 복제수의 방사성불활성 센스(상부 패널) 또는 안티센스(하부 패널) 리보프로브로 도프된 마우스 간 RNA (10 ㎍); J, 10 ㎍ 마우스 간 RNA 로 혼성화된 리보프로브, 다음의 모든 단계는 RNase 의 첨가를 제외하고는 동일. 도 1OB 는 일련 희석의 분석이다.
도 10B는 열안정성 rTth 역전사효소 RNA PCR 프로토콜을 사용하여 선별된 동물의 일련 희석 분석 겔의 사진이다. 문자와 숫자 표시는 도10A 에서와 같다.
도 10C는 RNase 보호 분석법에 의한 (+) 가닥 HCV RNA(상부 패널), (-)가닥 HCV RNA(중간부 패널) 또는 β-액틴 RNA(하부 패널)의 검출을 도시하는 겔의 사진이다. 대조표준 레인은 상기에 개시된 대로이다; 마우스 10 마리를 RPA 방법으로만 분석했다. 문자와 숫자 표시는 도10A 에서와 같다.
도 11A 및 11B 는 항-HCV 항체를 사용하여 대조표준(도11A) 및 HCV 감염(도11B) 간 절편의 면역조직화학 분석을 도시하는 사진이다.
도 12는 키메라 Alb/uPA, 이식된 동물(레인2)의 혈청에서 Apo B100을 검출하기 위한 웨스턴 블롯의 사진이다. 인간 혈청(레인 1) 및 Alb/uPA 비이식 동물로부터의 혈청(레인 3)이 각각 포지티브 및 네가티브 대조표준으로 기능한다.
본 발명을 개시하기 전에, 본 발명은 개시된 특정 형태학, 프로토콜, 세포계, 동물종 또는 속, 구성체, 및 시료에 제한되지 않고, 그 자체로 당연히 다양하다는 것이 이해되어야 한다. 본원발명의 목적이 수록된 청구항으로 제한되지 않기때문에, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술할 목적으로 이해되고, 제한 할 의도는 아니다.
수치값의 범위가 제공되는 경우에, 본원에서 명백하게 달리 언급하지 않는 한, 그 범위의 상부 및 하부 한계간의 각 사이값은 하부 한계 단위의 1/10 까지 또한 구체적으로 개시된다. 어떤 언급된 값 또는 언급된 범위내의 사이값과 어떤 다 른 언급되거나 언급된 범위내의 사이값 사이의 각각의 더작은 범위가 본 발명에 포함된다. 이러한 더 작은 범위의 상부 및 하부 한계는 독립적으로 범위에 포함되거나 배제될 수 있고, 양 한계 중 어느 하나, 또는 모든 한계 또는 어느 한계도 포함되지 않거나 포함되는 경우도 언급된 범위내에서 명백하게 배제된 한계가 아닌 한, 본 발명내에 포함된다. 언급된 범위가 한계의 한쪽 또는 양자 모두를 포함하는 경우에, 포함된 한게의 어느 하나 또는 양자를 배제하는 범위가 또한 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술상 및 과학 용어는 본원발명이 속하는 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본원에 개시된 것에 유사하거나 등가의 어떤 방법 및 물질이 본 발명을 수행하거나 시험하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 이하에서 기술된다. 본원에 언급된 모든 문헌은 문헌에 언급된 것과 연관된 방법 및/또는 물질을 개시 및 기술하기 위해서 본원에 통합된다.
본원에 사용될 때 그리고 첨부된 청구항에서 단수형태는 본원에서 다르게 지적하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다는 것을 이해해야만 한다. 따라서, 예를 들어, "간세포"의 언급은 다수의 이러한 간세포를 포함하고, "비-인간 동물"의 언급은 당업자 등에 알려진 하나 이상의 비-사람 동물 및 이것의 등가물에 관한 언급을 포함한다.
본원에 논의된 간행물은 본원의 출원일전에 그것의 개시를 위하여만 제공된다. 종래 기술에 의하여 본원이 이러한 간행물이 앞선 것으로 인정하는 것으로 해 석되지 않는다. 더욱이, 제공된 공개일은 각각 입증될 필요성이 있는, 실제의 공개일과 다를 수 있다.
정의
본원에 사용될 때, "키메라"(예를 들어, "키메라 동물"또는 "키메라 간")는 이종 조직 또는 세포를 포함하는 기관 또는 동물을 기술하도록 의미된다. 특정 관심의 것은 키메라 동물이고, 이 동물은 동물의 간에 이식된 인간 간세포의 존재 때문에 키메라이다.
"면역기능저하"는 동물이 예를 들어, 숙주 동물의 면역 반응이 이식된 세포의 거부반응에서 비효과적인 것과 같은, 이종 조직 또는 세포에 대하여 완전하거나 유의한 반응을 증가시킬 수 없는 것을 의미한다.
본원에 사용될 때, 용어 "트랜스유전자"는 포유동물의 게놈, 특히 살아있는 동물의 포유동물 세포의 게놈에 인공적으로 삽입되었거나, 삽입되려고 하는 유전 물질을 기술하도록 사용된다.
"트랜스제닉 동물"은 그것의 세포 부분에 또는 그것의 생식세포계 DNA에(즉, 대부분의 또는 모든 그것의 세포의 게놈 서열에) 안정하게 통합된 염색체외 요소로서 존재하는 비-내인성(즉, 이형) 핵산 서열을 가지는, 비-인간 동물, 일반적으로 포유동물을 의미한다. 이형 핵산은 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 방법에 따라서 숙주 동물의 배아 또는 배아 근간 세포의 유전적 조작으로 이러한 트랜스제닉 동물의 생식세포계열에 도입된다.
"트랜스유전자"는 이러한 이형핵산, 예를 들어, (예를 들어, "녹-인(konck- in)"트랜스제닉 동물의 생산을 위한)발현 구성체의 형태에서 이형 핵산 또는 (예를 들어, "녹-아웃(knock-out)"트랜스제닉 동물의 생산을 위한)표적 유전자내 또는 이에 인접하여 삽입될 때, 표적 유전자 발현의 감소를 초래하는 이형 핵산을 말하도록 의도된다.
유전자의 "녹-아웃"은 표적 유전자의 기능의 감소를 초래하는 유전자의 서열에서의 변형, 바람직하게는 표적 유전자 발현이 검출가능하지 않거나 유의하지 않도록 하는 것을 의미한다. 트랜스제닉 녹-아웃 동물은 표적 유전자의 이형접합성 녹-아웃, 또는 표적 유전자의 동형접합성 녹-아웃을 포함할 수 있다. 본원에 사용될 때 "녹-아웃"은 또한, 표적 유전자의 변형이 예를 들어, 표적 유전자 변형, 표적 유전자 부위(예를 들어, Cre-lox 시스템에서 Cre)에서 재조합을 촉진하는 효소의 도입을 촉진하는 물질에 동물의 노출시에, 또는 출생후에 표전 유전자 변형을 지시하는 다른 방법에서 발생하는 경우에, 조건부 녹-아웃을 포함한다.
표적 유전자의 "녹-인"은 표적 유전자의 추가적인 복제의 도입에 의해서, 또는 표적 유전자의 내인성 복제의 향상된 발현을 제공하는 조절 서열을 작동가능하게 삽입함에 의해서 표적 유전자의 변형된 발현(예를 들어, (전위를 포함하여 ) 증가되거나 감소된 발현)을 초래하는 숙주 세포 게놈에서의 변형을 의미한다. "녹-인" 트랜스제닉은 표적 유전자의 이형접합 녹-인 또는 표적 유전자의 동형접합성 녹-인을 포함할 수 있다. "녹-인"은 또한 조건부 녹인을 포함한다.
"작용가능하게 연결된"은 DNA 서열 및 조절 서열이 적절한 분자(예를 들어, 전사 활성 단백질)가 조절 서열에 연결된 경우에 유전자 발현을 허용하는 방식으로 연결된 것을 의미한다.
"작용가능하게 삽입된"은 관심의 뉴클레오티드 서열이 관심의 도입된 뉴클레오티드 서열의 전사 및 번역을 지시하는 뉴클레오티드 서열에 인접하여 위치된 것을 의미한다.
본원에 사용될 때, 용어 "치료제"는 반드시 이에 제한되지는 않지만, HCV에의 감염을 포함하는 간상태와 같은 질환 또는 상태의 치료에 유용한 예를 들어, 단백질 또는 작은 분자, 약제 화합물, 항체, 안티센스 분자, 리보자임 등과 같은 어떤 분자를 말한다. 예를 들어, 본 발명의 치료제는 바이러스 감염, 및 특히 HCV와 연관된 징후를 차단, 개선, 또는 경감시키는 분자를 포함한다.
본원에 사용될 때, 용어 "단위 투여 형태"는 피험자(예를 들어, 동물, 일반적으로 인간)에 대한 단위 투여로서 적합한, 물리적으로 구별되는 단위를 말하고, 각 단위는 약제학적으로 허용가능한 희석제, 운반제 또는 매개체와 연관되어원하는 효과를 나타내기에 충분한 양으로 약제의 미리 결정된 양을 함유한다. 본 발명의 신규한 단위 투약 형태에 대한 상세한 설명은 반드시 이에 제한되는 것은 아니지만, 사용된 특정 약제 및 획득될 수 있는 효과, 및 숙주에서의 각 화합물과 연관된 약물동역학을 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다.
본원에 사용될 때, 용어 "치료", "치료하는 것"등은 일반적으로 원하는 약물학적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 의미한다. 이 효과는 질환 또는 그것의 징후를 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고/또는 질환 및/또는 질환에 기여할 수 있는 역효과를 부분적으로 또는 완전히 치료하는 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용될 때, "치료"는 동물에서의, 특히 인간에서의 어떤 질환의 치료를 의미하고, (a) 아직 질환을 가진 것으로 진단되지는 않았지만 질환을 가질 수 있는 피험자에서 발생하는 질환을 예방하고 (b) 질환의 차단, 즉 그것의 발생을 중지시키거나; (c) 질환의 완화, 즉 질환의 경감을 야기하는 것을 포함한다.
개관
본 발명은 C형 간염 바이러스(HCV)에 대한 마우스 동물 모델의 발생에 기초한다. 마우스 동물 모델은 일반적으로 숙주의 발생의 적합한 단계, 바람직하게는 숙주의 출생 단기간 후 트랜스제닉 마우스의 간으로의 인간 간세포 이식을 포함한다. 이론에 국한되지 않고, 모델의 발전에서의 성공은 적어도 부분적으로 하기: 1) 이종(인간)세포의 면역 파괴를 피하도록, 면역결핍 백그라운드를 가지는 숙주를 사용; 2) 간세포 성장 및 세포 분열에 대한 계속적인 유력한 자극을 제공하도록, 이형접합 상태에서 존재하는, 알부민 프로모터에 연결된 우로키나제에 대한 트랜스유전자를 함유하는 트랜스제닉 동물을 사용; 3) 숙주에서 많은 수 및/또는 많은 비율의 사람 세포의 생존을 제공하기 위해서, 간세포 생존 주기의 적절한 시기 및 숙주 동물 발생의 초기 단계에 숙주 동물로 생존가능한 인간의 간세포 도입 때문이다.
본 발명자의 지식이 닿는 한, 본원발명은 최초로 감염의 일반적인 경로(예를 들어, 정맥내 또는 복강내 접종)를 통해 감염될 수 있는 HCV 감염 모델로서 비-영장류 숙주를 이용에 제공한다. 본 발명의 이 양태는 특히 항바이러스 약제 개발에의 사용에 중요하다. 더욱이, 본 발명의 동물 모델은 사전-감염된 인간 간세포의 사용을 요구하지 않으므로, 인간 공여자로부터 분리된 감염된 조직을 다루거나, 이식전에 시험관내에서 인간 간세포를 감염시킬 필요가 없다.
따라서, 본 발명은 상기에 개시된 대로 키메라 동물 뿐만 아니라 면역기능저하, 알부민 연결된 우로키나제 트랜스유전자 함유 동물의 간으로 인간 간세포를 이식시킴으로써 키메라 동물을 생산하는 방법을 특징으로 한다. 게다가, 본 발명은 향간성 미생물 병원체의 감염 치료를 위한 약제를 동정하는 방법을 포함하여 본원에 개시된 키메라 동물 모델을 사용하는 방법을 특징으로 한다.
이하에서 본 발명이 더욱 상세히 개시될 것이다.
숙주 동물
숙주 동물은 일반적으로, 간에서 우로키나제형 플라스미노겐 활성제(uPA)의 증가된 생산을 가지고, 인간 간세포가 이식되고 지속될 수 있는 비인간, 면역기능저하 동물이다. 기제가 될 수 있는 본 발명의 동물 모델에서 대표적인 비-인간 동물은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터, 양, 피그, 영장류 등을 포함한다. 한 구체예에서, 숙주 동물은 설치류 속, 바람직하게는 마우스이다. 바람직한 구체예에서, 숙주 동물은 면역기능저하 마우스이고, 바람직하게는 우로키아제형 플라스미노겐 활성제(uPA)에 대한 면역기능저하 트랜스제닉 마우스, 더욱 바람직하게는 uPA 의 간 특이적 생산을 제공하는 트랜스유전자를 포함하는 면역기능저하 마우스이다(예를 들어, Alb-uPA 트랜스유전자, 예를 들어, Heckel et al Cell 62 : 447 (1990)참조하시오). 본 발명에의 사용에 적합한 마우스는 반드시 제한되지는 않지만, 균주 C.B-17, C3H, BALB/c, C57131/6, AKR, BA, B10, 129, 등을 포함하는 어떤 다양한 백그라운드 균주로부터 생산될 수 있다. 숙주 동물은 수컷이거나 암컷일 수 있다.
면역기능저하 백그라운드
상기에 언급된대로, 숙주 동물은 바람직하게는 면역기능저하성이다.
이식에 적합하고 원하는 면역 불능을 가지는 면역기능저하 포유동물 숙주가 이용가능하다. 대안으로, 덜 바람직하지만, 면역기능저하 동물은 예를 들어, 하나 이상의 화합물(예로서, 사이크로스포린)의 투여 및 당업계에 잘 알려진 다른 방법에 의해서 면역적격성 동물로부터 제조될 수 있다. 일반적으로, 면역기능저하 숙주는 이종 조직 또는 세포에 대해 완전한 면역 반응을 일으킬 수 없다. 특히 관심의 것은 면역글로불린 및 T-세포 항원 리셉터를 코딩하는 좌위에서 생식계열 DNA 재배열 수행의 불능을 초래하는 유전적 결함때문에 면역기능저하된 동물이다. 또한 관심의 것은 유의하게 감소된 수의, 또는 검출가능하지 않은 기능하는 T 세포, B 세포, 및 정상 세포에 대한 천연 킬러(NK)세포를 유발하는 하나 이상의 유전적 결함을 가지는 면역기능저하 동물이다.
특히 관심의 것은 scid 좌위(scid/scid)에서 동형접합성의 돌연변이를 가지는 마우스이다. scid 돌연변이는 DNA 의존성 단백질 키나제 촉매 단위에서의 결핍과 연관되고, 면역글로불린 및 T-세포 리셉터 유전자에서의 VDJ 재조합을 방해한다. scid 돌연변이에 동형접합성인 동물은 기능적으로 재조합된 면역글로블린 및 T 세포 리셉터가 결여되어서 T 및 B 세포 계통이 결핍된다. scid/scid 돌연변이가 이용가능하거나, 예를 들어, CB. 17, ICR (이계교배), C3H, BALB/c, C57B1/6, AKR, BA, B10, 129 등과 같은 많은 상이한 유전적 백그라운드내로 교배될 수 있다. 본 발명은 또한 천연 킬러(NK)세포 결함과 연관된 베이지 돌연변이(bg)를 가지는 동물을 이용할 수 있다. 한 구체예에서, scid 돌연변이 및 bg 베이지 돌연변이 모두를 가지는 마우스가 생산되어, 유기체에 도입된 동종 또는 이종 세포 또는 조직에 유효한 면역반응을 일으키지 않는 동물을 초래한다.
현재 이용가능한 다른 대표적인 면역기능저하 숙주는 RAG-1 및/또는 RAG-2(예를 들어, 시판되는 TIMTM RAG-2 트랜스제닉)과 연관된 재조합효소 기능이 결여되도록, 클래스 I 및/또는 클래스 II MHC 항원(예를 들어, 시판되는 C1D 및 C2D 트랜스제닉 균주)가 결핍여도록, 또는 Bcl-2 프로토온코진의 발현이 결여되도록 유전적으로 조작된 트랜스제닉 마우스를 포함한다. 수여자로서 유용할 수 있는 다른 마우스는 NOD scid/scid ; SGB scid/scid, bh/bh ; CB.17 scid/hr; NIH-3 bg/nu/xid 및 META nu/nu 이다. CD3F-유전자에서의 동형 파괴때문에 기능성 B 세포 및 T 세포가 결여된 트랜스제닉 마우스, 래트 및 피그가 이용가능하다. 면역기능저하 래트는 HsdHan: RNU-rnu; HsdHan: RNU-rnu/+; HsdHan: NZNU-rnu; HsdHan: NZNU-rnu/+; LEW/HanHsd-rnu ; LEW/HanHsd-rnu/+ ; WAG/HanHsd-rnu 및 WAG/HanHsd-rnu/+ 를 포함한다.
우로키나제의 트랜스제닉 발현
상기에 개시된 대로, 본 발명의 키메라 동물은 또한 우로키나제-형 플라스미노겐 활성제(uPA)의 발현을 위한 "녹-인" 트랜스제닉이다. 한 구체예에서, 트랜스 유전자는 뮤린 알부민 인핸서/프로모터, 영역을 코딩하는 뮤린 uPA 유전자, 및 3'비번역 및 성장 호르몬 유전자의 양측에 배열된 서열로 이루어진 Alb-uPA 트랜스유전자이다. (Heckel et al. Cell 62 : 447-56 (1990) ; Sandgren et al. Cell 66 : 245-56 (1991)). 바람직하게는 동물은 우로키나제형 플라스미노겐 활성제 트랜스유전자에 대하여 이형접합성보다는 동형접합성이다. Alb-uPA 트랜스유전자는 그것을 운반하는 간세포에 치명적인 공격을 초래하고, 또한 우로키나제의 높은 국부성(간내) 농축을 초래하고, 이것은 차례로 간내에 그것의 활성형에 대한 간세포 성장 인자를 프로세싱하게 한다. 이론에 국한되지 않고, Alb-uPA 트랜스제닉 동물 발생의 적당한 시기에 도입된 생존가능한 동종 또는 이종 세포가 이러한 환경에서 복제되도록 자극된다. 따라서, 공여 세포는 트랜스유전자의 치명적인 공격의 결과로 사멸하는 내인성 간세포를 "치환하도록" 배양된다.
이식에 적합한 인간 간세포 및 다른 세포의 분리
숙주 동물에의 이식을 위한 인간 간세포가 당업계에 알려진 어떤 편리한 방법으로 인간 간 조직으로부터 분리된다. 일반적으로, 인간 간세포는 신선한 조직(예를 들어, 사망 후 수시간내에 획득), 또는 신선하게 냉동된 조직(예를 들어, 약 0℃ 또는 그 이하에서 냉동 및 유지된 조직)일 수 있다. 이상적으로, 사용된 세포는 신선하게 얻어진 인간의 간 조직으로부터 최근에 분리된 것이다(즉, 2 내지 4시간내). 특정 동결보존 배지에 놓인 인간의 간세포는 장기간동안 저장될 수 있고(예를 들어, 액체 질소), 필요할때 해동될 수 있어서 보존된 간세포 은행의 발생을 허용한다. 일반적으로, 분리 과정 및 조작 및 저장 프로토콜은 간으로의 혈류 정지에 따른 온허혈을 최소화하고(예를 들어, 일반적으로 약 30분 내지 60분 미만, 바람직하게는, 약 20분 내지 40분 미만), 보존으로부터 야기될 수 있는 냉허혈을 최소화하는 기능을 한다(예를 들어, 약 12시간미만, 일반적으로 약 1시간 내지 2시간 미만). 한 구체예에서, 검출가능한 병원체를 가진 인간 조직이 일반적이다(형태, 조직, 및 필수적으로 무질환). 일반적으로 온허혈 노출의 기간은 단지 약 20-50분 미만이다.
간 조직이 단일 세포의 현탁을 제공하기 위해서 기계적으로 또는 효소적으로 분리될 수 있거나, 완전한 인간의 간조직 단편이 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 간세포는 일반적인 콜라겐아제 관류(Ryan et al. Meth. Cell Biol. 13 : 29 (1976))에 이어서 낮은 속도의 원심분리로 공여자 조직으로부터 분리된다. 그다음, 간세포는 스텐레스 스틸 그물(예를 들어, 100 ㎛)을 통하여 여과시키고, 이어서 밀도-구배 원심분리로 정제된다. 대안으로, 예를 들어, 형광 활성 세포 선별, 패닝(panning), 자석 비드 분리, 원심분리기장내의 세광등과 같은 간세포를 농후시키는 다른 방법이 사용될 수 있다. 이식에 사용된 최종 현탁은 일반적으로 80-99%의 트립판 블루 배제에 의한 생존성을 가진 적어도 약 50-75% 간세포, 일반적으로 적어도 약 80-99% 간세포로 이루어진다.
다른 구체예에서, 이식될 수 있는 세포는 숙주 동물 간으로의 이식후에 HCV 감염을 받을 수 있는 인간 간세포로 발생 또는 분화될 수 있는 인간 근간 세포 또는 간세포 전구체 세포이다. 특정 구체예에서, 인간의 근간 세포는 인간의 제대혈 세포로부터 얻어진다. 인간의 제대혈 세포는 간세포의 근간 세포 재구성에 대한 공 급원일뿐만 아리라 면역 체계의 재구성에 대한 공급원이다(예를 들어, Verstegen et al. Blood. 91 (6) : 1966-76 (1998)참조).
숙주에의 인간 간세포 또는 다른 적합성 세포의 이식
트랜스제닉, 면역기능저하 숙주에의 공여자 간세포의 도입 시기는 키메라 간이 향간성 병원체에 의한 감염을 받을 수 있게 하고, 병원체의 복제를 지지하기에 충분한 많은 인간 간세포로 집단화된 키메라 간의 생산에 중요할 수 있다. 이것은 특히 향간성 병원체가 낮은 감염성 및/또는 낮은 복제율(예를 들어, HCV)를 나타내는 경우에도 적용될 수 있다. 동물이 뮤린인 경우에(예를 들어, 마우스), 이식시에 숙주는 이상적으로는 생후 10일 미만에서 2 주까지이고, 최적으로는 생후 약 7 일 내지 10 일, 또는 약 1 주 미만(즉, 5 일 미만 또는 약 5 일 내지 7 일 또는 그보다 어린)이다. 일반적으로, 이식은 생후 약 8-10 일 및 15일내에서 바람직하게 수행된다. 이식을 위한 구멍은 양호한 결과를 유지하면서 유연성을 얻기 위해서 약 7-18 일까지 확장될 수 있다. 이론에 국한되지 않고, 본원에 나타난 이식 시기는 매우 조기 이식(즉, 동물의 작은 크기에 기인)과 연관된 극히 기술적인 치명성과 최대 복제 자극을 위한 시간과(예를 들어, 이식 전에 발생하는 수여자 간에서 세포 분열의 수는 공여 인간 세포의 이식의 성공 및 정도에 영향을 줄 수 있다.)의 타협점이다. 더욱이, 이식 시기는 트랜스유전자에 의해 제공된 간 세포 재분포를 위한 자극이 시간에 따라 감소되고, 일반적으로 수여자가 약 6 주이상 된 후에 결핍되기 때문에 또한 중요하다. (Rhim et al. (1994) Science 263 : 1149-52 ; 동형접합체에 대하여 약 10-12주)
인간 간세포(또는 다른 적합한 세포, 예를 들어, 간세포 전구체 또는 근간 세포)는 당업계에 알려진 다른 적합한 방법을 사용하여 이식될 수 있다. 바람직하게는, 인간 간세포가 예를 들어, 하부의 비장극으로 비장내로 주사된다.
성공적인 이식은 예를 들어, 인간 혈청 알부민(HA), 또는 인간 알파-1 항트립신과 같은 숙주 혈청에서 인간의 간-특이적 단백질의 수준을 검사하는 것과 같은 종래의 방법으로 모니터될 수 있다. 키메라 숙주가 적절한 때에, (예를 들어, 후보 약제등을 스크리닝하기 위해 향간성 병원체로의 감염을 위해) 실험에 사용될 수 있다. 동물이 상대적으로 낮은 감염성 및/또는 낮은 복제능의 향간성 약제로 감염된 경우에, 키메라 동물은 이식후 약 4 내지 6 주내에, 일반적으로 이식후 약 6 주내에 접종될 수 있고, 이식후 3주내와 같이 초기일 수 있다.
일반적으로, 동물 숙주는 그것의 간내에서 인간의 키메라현상을 발생시켜서 인간 간세포인 간 세포의 비율이 적어도 약 20% 내지 50%, 일반적으로 약 40% 내지 60%이상이고, 90% 이상으로 최적화될 수 있다. 키메라 동물은 적어도 몇 주, 일반적으로 적어도 약 5주, 더욱 일반적으로는 적어도 약 12 주 내지 24주, 8개월 미만 또는 그 이상동안 기능적으로 이식된 간세포와 함께 유지될 수 있고, 숙주의 수명동안까지 일 수도 있다. 키메라 동물은 향간성 병원체(예를 들어, HCV), 특히 영장류, 특히 인간에 제한된 숙주 범위를 가지는 향간성 병원체로 감염될 수 있다. 병원체의 성질에 의존하여, 만성적으로 감염된 키메라 숙주가 수주 내지 수개월의 기간동안 유지될 수 있다. 예를 들어, 향간성 병원체가 HCV 인 경우에, 키메라 동물은 HCV 로 만성적으로 감염될 수 있고(예를 들어, 만성적으로 감염), 적어도 약 5 주, 일반적으로 적어도 약 14 주 내지 약 20 주 이상, 약 35 주 미만 또는 그 이상동안 활성 HCV 감염이 유지될 수 있고, 숙주의 수명동안까지 일수도 있다.
감염된 숙주의 바이러스 부하가 확립되어서 이것은 감염된 인간의 바이러스 부하에 유사하다. 예를 들어, 병원체가 HCV 인 경우에, 숙주 동물은 약 103 또는 약 104 또는 약 106 바이러스 입자/ml 혈청의 수준, 일반적으로 약 103 내지 약 107 바이러스 입자/ml 혈청으로 감염을 지지할 수 있다.
장시간동안 감염된 숙주의 바이러스 부하는 예를 들어, 감염된 것으로부터 분리될 수 있는 바이러스 입자의 수와 같이, 실질적으로 일정하고, 만성적이고, 안정하다. 비치료된 숙주의 혈청은 매주 샘플링 기간간에 급진적으로 동요하지 않는다. 예를 들어, 일단 일반적으로 감염 후 약 2 내지 4 주내에 숙주에서 안정한 감염이 확립된다면, 최초의 샘플링시에 혈청의 mL 당 많은 수의 HCV 바이러스 입자를 함유하는 본 발명의 HCV 감염 숙주는 연이은 샘플링시에 HCV 감염에 대하여 포지티브하고, 일반적으로 혈청의 mL 당 동등하거나 유사하게 높은 수준의 HCV 입자를 가진다. 일반적으로, 감염된 숙주의 바이러스 부하는 급격히 동요하지 않아서, 후보 항바이러스 약제 효과의 평가를 허용하고, 예를 들어, 바이러스 적정값 효과의 분석이 만성적이고 합당하게 일정하다.
스크리닝 분석
본 발명의 키메라 동물은 다른 다양한 스크리닝 분석에 사용될 수 있다. 예를 들어, 간질환을 유발하거나 기여하는 것으로 의심되는 다양한 어떤 후보 약제 뿐 아니라, 길항제와 차단 치료제도 키메라 동물에 투여하여 이들 약제의, 이식된 인간 세포의 기능에 대한 효과를 평가함으로써 스크리닝될 수 있다. 본 발명의 키메라 동물 모델은 또한 간의 이상의 치료 또는 어떤 간 특이적이 아닌 인간 질병를 위한 소분자 치료법을 포함하는 간세포에 대한 독성에 대하여 화합물을 스크리닝하는데도 사용될 수 있다. 일반적으로, 어떤 화합물도 간세포에 대한 독성을 평가하기 위하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 암에 대한 중요한 잠재적 치료법의 평가가 먼저 본발명의 동물 모델에서 간 독성에 대하여 스크리닝 될 수 있다. 이식된 인간 간세포의 기능은 상기된 바와 같이 (예를 들어, 인간 혈청 알부민 또는 숙주 형청내의 α-1 항트립신 수준을 평가함에 의하여) 평가될 수 있다. 간세포 손상은, 간중 인간 세포에 대한 손상의 증거에 대한 조직학적 평가와 결합하여 형청내 간 특이적 효소(ALT-알라닌 아미노트랜스퍼라제)의 분석에 의하여 평가될 수 있다. 요약하면, 간독성을 평가하기 위한 분석은 기능적, 조직학적 또는 둘 모두일 수 있다.
특히 관심있는 구체예에서, 본 발명의 동물 모델은, 예를 들어, 향간성 감염원(예를 들어, 박테리아, 바이러스, 기생체, 특히 HCV 같은 향간성 바이러스)의 복제 또는 이것에 의하여 유발되는 질병 증상에 의한 감염을 저해하거나 예방하는 후보 약제를 동정하기 위하여 사용될 수 있다. 여기에 제공된는 예는 일반적으로 단일 향간성 병원체를 가진 키메라 마우스 숙주의 사용에 관한 것이지만, 본 발명은 단일 후보 약제 또는 둘 이상의 향 간성 약제에 의한 감염에 대항한 활성을 가진 후보 약제 칵테일을 동정하기 위하여도 또한 사용될 수 있다.
"후보 약제"는 전신성, 자연적 발생의, 또는 재조합적으로 합성된 분자(예를 들어, 소분자; 약물; 펩티드; (예를 들어, 수동 면역을 제공하기 위한 항원-결합 항체 단편을 포함하는)항체 또는 다른 면역요법제; 진핵 또는 원핵 세포내 내인성 인자(예를 들어, 폴리펩티드, 식물추출물 등) 등)을 포함하려는 의도이다. 인간 세포에 대하여 낮은 독성을 가진 약제에 대한 스크리닝 분석에 특히 관심이 있다.
후보 약제는, 전형적으로 유기 분자, 바람직하게는 분자량 50 달톤 초과 2500 달톤 미만의 작은 유기화합물이지만, 다수의 화학적 부류를 포괄한다. 후보 약제는 단백질과의 구조적 상호작용, 특히 수소결합에 필수적인 작용기를 포함하고, 전형적으로 적어도 아민, 카르보닐, 히드록실 또는 카르복실기, 바람직하게는 적어도 작용화학기의 적어도 두가지를 포함한다.
후보 약제는 종종 고리 탄소 또는 헤테로고리 구조 및/또는 하나 이상의 상기 작용기로 치환된 방향성 또는 폴리방향성 구조를 포함한다. 후보 약제는 또한: 펩티드, 당류, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 그것의 유도체, 구조적 유사체 또는 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 생물학적 분자 중에서 발견된다. 후보약제는 합성 또는 자연적 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위한 기원으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 무작위 올리고뉴클레오티드 및 올리고펩티드의 발현을 포함하는 광범위한 유기화합물과 생물학적 분자의 무작위 및 지시된 합성에 대한 다수의 수단이 이용가능하다. 대안으로, 박테리아, 균류, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연적 화합물의 라이브러리가 구입가능하거나 생산가능하다. 또한, 자연적 또는 합성 제작된 라이브러리 및 화합물은 종래 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통하여 변형되기 쉽고, 조합적 라이브러리를 생산하는데 사용될 수 있다. 기지의 약제는 구조적 유사체를 제작하기 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화 등 같은 지시된 또는 무작위 변형을 받을 수 있다.
후보 항-HCV 약제의 스크리닝
한 구체예에서, 본 발명의 동물 모델은 바이러스성 간염, 더 구체적으로 HCV 감염에 의하여 유발되는 증상을 경감시키는 약제를 동정하고/또는 감염 바이러스의 병원성 기작에 더 직접적으로 영향을 미치기 위하여, 예를 들어 바이러스 감염을 저해하거나, 바이러스 복제를 감소시키거나, 아니면 바이러스 증식의 주기를 파괴시키기 위하여 사용된다. 일반적으로, 후보 약제는 본 발명의 동물 모델에 투여되고, 그 후보 약제의 효과는 대조표준에 상대적으로 (예를 들어, 비감염 동물에 상대적으로, 기지의 항-HCV 효과를 가진 약제(예를 들어, IL-2α)로 치료된 HCV-감염 동물 등에 상대적으로) 평가된다. 예를 들어, 후보 약제는 본 발명의 HCV- 감염 동물에 투여되고 치료 동물의 바이러스 적정값이 치료전 동물의 바이러스 적정값 및/또는 대조표준인 미처리 HCV-감염 동물과 비교될 수 있다. 일반적으로, 후보 약제로 치료한 후 감염된 동물의 바이러스 정정값의 검출가능하고 유의한 감소는 약제의 항 바이러스 활성의 지표이다.
후보 약제는 소망의 결과를 가져오기 위하여 약제의 수송에 바람직하고/또는 적당한 어떤 수단으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 후보 약제는 주사에 의하여 (예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하 또는 소망의 효과를 성취하기 위한 조직 내로의 직접 주사에 의하여), 경구, 또는 다른 바람직한 수단에 의하여 투여될 수 있다. 일반적으로, 생체내 스크리닝은 (약제 없음으로부터 동물에게 성공적으로 송달될 수 있는 최대 임계량에 근접하는 양의 약제까지) 다수의 다양한 양과 농도의 후보 약제를 받은 동물을 포함할 것이며, 상이한 제제 및 경로의 약제 송달을 포함한다. 약제는 단독으로 또는, 특히 약제의 조합이 상승 효과를 결과하는 경우, 둘 이상의 조합으로 배합될 수 있다.
후보 약제의 활성은 다양한 방법에 의하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 숙주 동물이 향간성 병원체(예를 들어 HCV 등)에 의하여 감염된 경우, 약제의 효과는 병원체의 존재(예를 들어, 바이러스 적정값으로서의 적정값) 또는 병원체의 존재와 연관된 마커(예를 들어 병원체-특이적 단백질 또는 코딩 핵산 등)에 대하여 혈청샘플을 시험함으로써 평가될 수 있다. 바이러스 감염의 존재 및 중한 정도의 검출 및 평가의 정성적 및 정량적 방법은 당업계 주지이다. 한 구체예에서, HCV 감염에 대항한 약제의 활성은 혈청 샘플 및/또는 조직 절편을 바이러스(예를 들어 HCV를 RT-PCR 등에 의하여)의 존재에 대하여 시험함으로써 평가될 수 있다. 다른 구체예에서, 바이러스 감염에 대항한 약제의 활성은 바이러스 핵산(예를 들어, HCV RNA)의 존재에 대하여 혈청 샘플을 시험함에 의하여 평가될 수 있다. 예를 들어, HCV RNA는, 예를 들어, 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR 또는 분지-DNA (bDNA) 분석, RT-PCR에 의한 네거티브-사슬 RNA (HCV의 복제 중간체)의 검출, 또는 치료중의 바이러스 게놈의 돌연변이/변화("유사종 진화")를 검출하기 위한 바이러스 RNA의 서열결정을 사용하여 검출될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 직접적으로 조직 절편 내의 바이러스 입자의 양의 어떤 정성적 또는 정량적 변화를 설명하기 위하여 숙주 간은 생검되고 제자리 RT-PCR 혼성화가 수행될 수 있다. 대안으 로 또는 추가적으로, 숙주는 안락사되고 간을 감염 및/또는 약제에 의하여 유발된 독성의 징후 관점에서 조직학적으로 시험할 수 있다.
동정된 약제
소망의 약학적 활성을 가지는 화합물은 치료를 위하여 생리학적으로 허용되는 담체 중에 숙주에게로 투여된다. 치료 약제는 경구, 국소, 주사, 예를 들어 피하, 복강내, 정맥내, 흡입 등의 다양한 경로로 투여된다. 도입 방식에 따라, 화합물은 다양한 방법으로 조제된다. 제제내 치료학적으로 활성인 농도는 약 0.1-100 중량%로 다양하다.
약제학적 조성물은 과립, 정제, 알약, 좌약, 캡슐, 현탁액, 연고, 로션 등의 다양한 유형으로 제조될 수 있다. 경구 및 국소 사용에 적당한 약제학적 등급의 유기 또는 무기 담체 및/또는 희석제가 치료학적으로 활성인 화합물을 함유하는 조성물을 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 당업계 공지의 희석제는 수성 매체, 야채 및 동물 오일 및 지방을 포함한다. 안정화제, 습윤제 및 에멀전화제, 삼투압을 변화시키기 위한 염 또는 적당한 pH값을 유지시키기 위한 완충액, 및 피부투과성 증강제가 보조제로서 사용될 수 있다.
백신 개발
약간의 변형으로, 본 발명의 동물 모델은 향간성 병원체에 의한 감염을 예방 또는 완화시키기 위한 능력에 대하여 후보 약제를 스크리닝하기 위하여 또한 사용될 수 있다. 일반적으로, "백신"은 투여 후, 숙주가 표적 병원체에 대항한 면역반응을 증가시키기 용이하게 하는 약제이다. 유도된 체액성, 세포성, 또는 체액/세포 성 면역반응은, 대항하여 백신이 개발된 병원체에 의한 감염의 저해를 용이하게 한다. 본 발명에서 특히 관심있는 것은 향간성 병원체, 예를 들어, 미생물성, 바이러스성, 또는 기생체적 병원체, 특히 바이러스성 병원체, 예를 들어, HCV에 의한 감염 및/또는 그것의 간내 복제를 저해하는 방어적 면역 반응을 도출하는 예방적 백신이다. 또한 관심있는 것은 수동 면역성 또는 신속하게 상향조절된 특이적 능동 면역성(예를 들어, 항-HCV 면역글로불린 등)의 제공을 통하여 방어를 제공하는 치료적 백신이다.
본 발명의 이 구체예에서, 면역기능저하된 키메라 동물의 면역체계는 예를 들어 근간(stem)세포, 말초혈 단핵세포(PBMCs), 제대혈세포, 조혈세포, 또는 동물에서 인간 면역체계를 제공하기 위한 인간 기원의 다른 적당한 세포를 사용하여 재구성된다. 인간 면역세포를 분리하고 면역기능저하된 동물의 면역체계 재구성하는 예를 들어, 인간 면역체계를 가진 마우스를 만드는 방법은 당업계 주지이다(예를 들어, Nature 335 : 256-59 ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (25) : 1472025 참조). 한 구체예에서, 인간 면역세포는 키메라 간의 생산에 사용된 인간 간세포와 동일한 공여자로부터 얻는다. 한 구체예에서, 인간 면역세포는 당업계 주지의 방법에 따라서, 예를 들어, 복강내 주사에 의하여 숙주내로 도입된다.
효과적 백신을 위한 스크리닝은 상기된 스크리닝 방법과 유사하다. 요약하면, 향간성 병원체로 접종시키기 전에 후보 백신을 키메라 동물에 투여한다. 후보 백신은 일반적으로 단일 볼루스(예를 들어, 복강내 또는 근육내 주사, 국소투여, 또는 경구 투여)를 제공함으로써 투여된 후 하나 이상의 면역 보조제 투여로 이어 진다. 면역반응의 유도는 당업계 주지의 방법에 따라 항원에 특이적인 B 및 T 세포 반응을 시험함으로써 평가될 수 있다. 면역화된 동물은 그 후 향간성 병원체에 의하여 항원자극된다; 일반적으로 몇 마리의 면역화된 동물이 적정값을 증가시킨 병원체로 면역자극된다. 면역화된 동물 및 비-면역화 대조표준 동물은 그 후 감염의 발전에 대하여 관찰되고, (예를 들어 존재하는 병원체의 적정값을 평가하거나, 상기된 바와 같이 인간 간세포 기능 매개변수를 시험하는 것 등에 의하여) 감염의 중한 정도가 평가된다. 병원체에 의한 감염의 유의한 감소 및/또는 후-면역자극을 결과하는 질병의 중한 정도의 유의한 감소를 제공하는 백신 후보는 실행가능한 백신으로 식별된다.
다른 용도
상기된 것의 변형인 또는 추가적인 본 발명의 키메라 동물의 용도는 본원 명세서를 읽은 후 통상적 지식을 가진 숙련자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 키메라 동물은 향간성 약제로 감염될 수 있고, 바람직하게는 만성적으로 감염될 수 있고 약제가 그 분리될 수 있는 공급원으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 키메라 동물의 이런 용도는, 예를 들어, 병원체의 분리가 인간 환자로부터의 생검을 요하거나 유용한 분량을 얻는 것이 어려운 경우; 병원체가 시험관내 배양할 수 있기 쉽지 않은 경우; 병원체의 시험관내 배양(예를 들어, 육즙배양내 성장 또는 배양된 세포로서 성장)이 그것의 병원성 및/또는 임상적 적합성에 영향을 미치는 병원체의 변형을 가져오는 경우 등에 특히 유용하다. 일반적으로, 키메라 동물은 적당한 경로(예를 들어, 정맥내, 근육내, 복강내, 또는 경구 투여)에 의하여, 바람직하게는 인간 질 병에서의 자연적인 감염경로와 가장 잘 대응하는 감염 경로에 의하여, 분리된 병원체로 접종시킨다. 병원체가 인간 간세포의 감염을 성취한 다음, 그리고 병원체의 복제를 허용할만큼 충분한 시간이 경과한 다음, 적당한 방법(예를 들어, 혈샘플, 간 등으로 부터의 분리)에 의하여 병원체를 감염된 키메라 동물로부터 분리한다.
간질환 진단. 키메라 동물은 인간의 간질환의 진단의 과정에서 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 환자가 미지의 기원의 간질환을 앓는 경우 또는 병원체의 배양을 하지않은 진단이 결정적이 아닌 경우, 원인 작용제를 함유하는 것으로 의심되는 샘플은 (예를 들어, 환자의 혈청 또는 간 생검으로부터) 환자로부터 분리될 수 있다. 샘플은 의심되는 작용제에 대하여 집적되고, 분획되고, 또는 그렇지 않으면 투여가능한 유형으로 제공하기 위하여 처리되고, 키메라 동물에 투여될 수 있다. 키메라 동물은 그 후 이식된 인간 간세포에 대한 샘플 투여의 영향을 평가하기 위하여 평가될 수 있다. 인간 간세포에 대한 영향은, 예를 들어, 이식된 인간 간세포의 기능을 평가하고/또는 동물 혈청 중의 병원체를 검출하기 위하여 (예를 들어, HCV 또는 다른 미생물 병원체의 존재를 검출하기 위하여), 예를 들어, 키메라 동물로부터의 혈청샘플을 분리하고 시험함으로써 달성될 수 있다. 인간 간세포는, 환자 샘플의 영향을 결정하기 위하여 조직학적으로 또한 시험될 수 있다.
환자 샘플을 사용한 스크리닝. 본 발명은 또한 개별적인 기반에 기초하여 고안된 진단 및 논리 치료를 제공하는데 적용될 수 있다. 예를 들어, 환자의 생검(예를 들어, 경피적 바늘 생검)에 의하여 얻어진 인간 간세포는 키메라 마우스 숙주를 생산하기 위하여 사용될 수 있다. 이 키메라 마우스 숙주는 그 후 환자에 감염된 향간성 병원체를 평가하고, 병원체의 치료제에 대한 감수성에 대하여 평가하고, 이와 같은 치료법에 대한 환자의 간세포의 잠재 독성을 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 개인 특이적 향간성 병원체 복합체에 대항한 (예를 들어, 하나 이상의 감염 향간성 병원체에 대항한) 가장 효과적인 치료법의 변형을 용이하게 하기 위하여 고안될 수 있다.
혈중 지질을 감소시키는 약제에 대한 스크리닝. 본 발명은 인간 죽상경화성 (동맥혈관을 포함한)혈관 질환의 잠재적 치료법의 평가를 위한 시스템으로서 또한 적용될 수 있다. 죽상경화증은 서양에서 심장마비와 협심증의 주요 원인이고 캐나다에서 궁극적으로 사망원인의 거의 절반에 해당된다. (Ross (1993) Nature 362 : 801-809). 저밀도 지질단백질(LDL)의 높은 수준과 죽상경화증 사이의 포지티브 상관관계가 수십년동안 알려졌다 (Brown et al. Ann. Rev. Biochem. 52 : 223-261 (1983)). LDL은 하이드로라제가 관련된 복잡한 일련의 반응과 지질단백질 중의 지질과 아포단백질의 전달에 의하여 순환계의 초저밀도 지질단백질로부터 유래한다. (Fielding et al. (1996) In "Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes", (D. E. Vance and J. E. Vance eds.) pp495-516, Elsevier Science Publishers, Amsterdam). VLDL은 복잡한 분비 경로를 통하여 혈류내로 분비된다(Gibbons, Biochem. J., 268 : 1-13 (1990) ; Dixon et al. J. Lipid Res. 34 : 185-1 (1993) ; Sniderman et al. Arterioscler. Thromb. 13 : 629-636 (1993) ; Yao et al. Biochim. Biophys. Acta. 1212 : 152166 (1994) ; Davis et al.. (1996) In "Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes" (D. E. Vance and J. E. Vance eds.) pp. 473-493, Elsevier, Amsterdam ; Innerarity et al., J. Biol. Chem. 271 : 2353-2356 (1996)).
아포 지질단백질(apo)B는 VLDL의 주요 아포단백질이고, LDL의 유일한 아포단백질이다. 혈장내 apo B의 높은 수준과 동맥혈관 질병의 위험 사이의 상호관계가 밝혀져 왔다 (Sniderman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 604-608 (1980)). 혈장 apo B 질병 또한 유발하는 지질 저하 약물로 과도하게 치료된 사람에서 관상동맥 질환의 회귀가 관찰되었다 (Brown et al., N. Engl. J. Med. 323 : 1289-98 (1990)). 따라서, 간으로부터 apo B의 분비, 혈장내 apo B 함유 지질단백질의 순환 농도 및 죽상경화증의 발생 사이에는 포지티브 연관관계가 있다. apo B는 식사에 의한 및 내인성 기원의 트리글리세리드와 콜레스테롤을 포함하는 지질의 회합 및 분비에서 중요한 큰 당단백질이다. 또한, apo B는 특정 부류의 지질단백질의 혈관내 수송 및 리셉터-매개 섭취 및 송달에서 중요하다. 그러므로 apo B의 중요성은 음식의 지질의 흡수와 처리로부터 순환하는 지질단백질 수준의 조절에 이르는 범위의 기능을 망라한다. 이 후자의 특성은 죽상경화증 감수성 측면에서 적당함의 근거가 된다.
apo B 두가지 유형이 포유동물에서 존재한다. Apo B100은 4536 개의 아미노산을 함유하는 전장 단백질이고 인간 간에서만 합성되는 고유의 유형이다 (Young, Circulation 82 : 1574-1594 (1990)). Apo B100은 LDL의 주요 단백질 성분이고 지질단백질 종의 LDL 리셉터와의 상호작용에 요구되는 도메인을 함유한다 (Young, 1990, 상기). 또한, Apo B 100은 위치 4326에서 apo (a)와 공유적 상호작용을 매개 하여 그것에 의하여 Lp (a)라 지칭하는 다른 별개의 동맥경화 유발 지질단백질을 생성시키는, 짝짓지 않은 시스테인 잔기를 함유한다 (Callow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 2130-2134 (1994) ; McCormick et al., J. Biol. Chem. 271 : 28294-28299 (1996)). 모든 포유동물의 소장 뿐 아니라 특정 종의 간은 apo B48를 합성시킨다. 인간에서, apo B48은 킬로미크론과 킬로미크론 잔존물과 결합하여 순환하고, 그것의 apo E의 내용물에 의하여 이들 입자는 LDL-리셉터 관련 단백질로 지칭되는, 구별되는 리셉터에 의하여 청징화된다 (Herz et al. Curr. Opin. Lipidol 6 : 97-103 (1995)).
인간에서, 현재까지의 증거는 동맥경화유발에 대한 감수성은 몇몇 경로의 유전자에 영향을 주는 돌연변이의 바람직하지 않은 조합 때문이라는 것이 가장유력하지만, 어느 유전자가 관련된 것인가에 대한 우리의 지식은 제한되어 있다 (상기 Ross, 1993). 유전자를 도입하거나 돌연변이화시킬 수 있는 능력 때문에, 마우스는 죽상경화증 연구에서 가장 일반적인 실험 동물 모델이 되어 왔다. 평범한 식사를 하는 야생형 마우스는 동맥경화를 앓지 않는다. 마우스에서 죽상경화증을 유도하는 세가지 방법은: 음식-유도 (Paigen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 3763-3767 (1987)), apo E 결핍유도 (Piedrahita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 : 4471-4475 (1992) ; Plump et al., Cell 71 : 343-353 (1992) ; Zhang et al., Science 258 : 468-471 (1992)), 및 LDL 리셉터 결핍 유도 (Ishibashi et al., J. Clin. Invest. 92 : 883-893 (1993))이다. 그러므로, 지질단백질 기작에 관련된 인간 유전자를 발현하는 마우스 트랜스제닉 마우스 모델은 정상 및 질환의 인간 혈청 지질 프로필의 스펙트럼이 모방될 수 있는 경우에 작은 포유동물 모델로서 역할이 더욱 증가되었고, 몇몇 예에서 죽상경화성 병소의 형성을 설명하였다. 예를 들어, apo E-결핍 마우스에서 죽상경화성 병소는 우수하게 특성결정되었고, 선호 위치 및 섬유증식기로의 발전 측면에서 인간 병소와 유사하다. 죽상경화증의 이들 마우스 모델은 죽상경화증 감수성을 변형시키는 유전자를 동정하기 위하여 및 죽상경화증 치료의 개발에서 사용되고 있다.
본 발명의 동물 모델은 고지혈증과 죽상경화증에 대한 동물 모델로서 마찬가지로 역할을 할 수 있고 이와 같은 질병의 위험을 줄이거나 (예를 들어, 예방적 치료에 유용하거나), (예를 들어, 혈중 지질을 낮춤에 의하여) 이와 같은 질병을 치료하는 활성을 가지는 후보 약제를 동정하기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명의 키메라, 트랜스제닉 동물 모델로부터의 혈청의 연구는 인간 지질단백질 apoB100의 존재를 설명하였다. 이 분자는 인간 죽상경화성 혈관 질병의 발생에서 중요한 병인학적 인자로서 확립되기 때문에, (정량적 또는 정성적) apoB100 수준에 영향을 주는 약제에 대한 스크리닝은 혈중 지질 수준을 변화시키고, 따라서 인간에서 질병에 대한 치료를 제공할 수 있는 약제를 동정하는 역할을 할수 있다. 이와 같은 스크리닝 분석의 포지티브 대조표준은 인간 혈청일 수 있고, 비-이식 동형 Alb/uPA 마우스 혈청은 네거티브 대조표준으로 역할을 할 수 있다.
apo B100의 검출을 위한 방법은 당업계 주지이다. 일반적으로, 분석법은 동물로부터의 생물학적 샘플(예를 들어, 혈, 혈청, 혈장 등)을 apoB100과 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시킨 후 항체-apoB100 복합체의 형성의 검출과 관련된다. 항- apoB100 복합체의 형성의 검출은 다양한 방법(예를 들어 웨스턴 블롯, 도트 블롯, RIA 등)으로 성취될 수 있다.
다음 실시예는 당업계 통상의 숙련자에게 본 발명을 어떻게 실시하고 사용하는지의 완전한 개시 및 기재를 제공하도록 기재되며, 발명자들이 발명으로 인정하는 범위를 제한하려는 의도도 아니고 하기 실험이 수행된 전체 또는 유일한 실험임을 나타내려는 의도도 아니다. 사용된 수(예를 들어, 양, 온도 등)를 고려하여 정확도를 보증하기 위하여 노력이 기울여졌으나, 약간의 실험 오차와 편차는 고려되어야 한다. 다르게 지시되지 않는한 부분은 중량 대비 부분, 분자량은 평균 분자량, 온도는 섭씨 온도, 및 압력은 근대기압이다.
실시예 1: Alb-uPA 트랜스제닉 마우스의 제작
인간 조직 이식편에 내성인 Alb-uPA 트랜스제닉 마우스를 제작하기 위하여, 트랜스유전자에 대한 이형접합체 (계통 TgN (AlblPlau) 144Bri (The Jackson Laboratory))를 C. b-17/SCID-베이지 마우스계 (계통 C. b-17/GbmsTac- scid-bgN7 (Taconic Farms), 동형접합체)로부터의 동물과 교배시켰다. 일련의 역교배를 통하여, 당업계 주지의 방법에 따라 마우스 IgG를 검출하기 위하여, 샌드위치 ELISA 기술을 사용하여 전체 혈청 IgG의 정량에 의하여 확인된 바와 같이, SCID베이지 형질을 교배로 동형접합성으로 얻었다. IgG의 정량은 마우스 IgG 표준 (Cappel)을 사용하여 각 플레이트에 대하여 제작된 표준곡선으로부터 계산되었다. SCID-베이지 형질의 "루출성(leakiness)"은 > 정상 혈청의 1%로 정의되었다 (Bosma et al. Ann. Rev. Immun. 9 : 323 (1991)) ; 혈청 IgG 수준이 이 컷오프를 초과하는 마우스는 안락사되었다. 각 단계에서, Alb-uPA 트랜스유전자를 운반하는 동물은, 꼬리 생검으로부터 추출된 게놈 DNA의, 트랜스유전자 구성체의 3'UTR로부터의 151 bp 산물을 증폭시키는 두개의 18-mer 프라이머를 사용한 PCR 분석에 의하여 식별되었다 (Jackson Laboratories technical support). 동형접합성 Alb/uPA 형질은 출혈합병증과 간부전보다 중요하지 않은 높은 주산기 사망률과 이전에 관련되었지만 (Heckel et al. Cell 62 : 447 (1990)), 우리는 우리의 scid/bg/Alb-uPA 동물 콜로니 신생아 사망률이 약 30 %인 것을 발견하였다. 동물을 제공하는 콜로니는 초기에 이형접합성 번식동물과 온화한 출생 사망률의 동형접합성 마우스로 발전되었고, 콜로니는 완전 동형접합성으로 발전하였다. 동물은 무-바이러스/항원 조건에서 수용되고 Canadian Council on Animal Care (1993)에 의하여 확립된 지침서에 따라 사육되었다. 여기에서 기재된 모든 동물 실험은 University of Alberta Animal Welfare Committee로부터의 승인에 따라서 수행되었다.
이식을 위한 인간 간세포는 University of Alberta Faculty of Medicine Research Ethics Board로부터의 승인에 의하여 얻어졌다. 개복술로 얻어진 인간 간조직 절편(15-20 cm3)을 0.5mM Na2EDTA를 함유하는 무-Ca/Mg 빙냉 PBS로 관류시켰다. 돌출 관류용기를 카뉼라 삽입시키고 조직을 30 분간 0.38 mg/mL Liberase CI 콜라게나제(Boeringer-Mannheim)를 함유한 담체 용액(35 mM NaCl, 3. 5 mM KCI, 2. 5 mM CaCl2, 50mM HEPES, pH 7. 6)을 재순환시킴으로써 관류시켰다 (Ryan et al. Surgery 113 : 48 (1993) ; Seglen et al. Meth. Cell Biol. 13 : 29 (1976)). 간세포를 100 ㎛ 스텐레스 스틸 그물을 통하여 여과시키고, 400 g에서 5 분간 밀도-구배 원심분리(Percoll, 밀도 1.04 g/mL ; Sigma)에 의하여 정제하고, 이식전 단기간 저장을 위하여 Belzer University of Wisconsin 용액 (DuPont)에서 0 ℃에서 현탁 전에 빙냉 HBSS에서 두 차례 세척한다. 세포수와 생존률은 트립판블루 배제에 의하여 확인되었다 최종 생존률은 일상적으로 > 80%였다.
최초실험에서, SCID 형질에 대하여 동형접합성이고 Alb-uPA 트랜스 유전자에 대하여 이형접합성인 동물을 교배시켜, 7일령 자손을 1 x 106의 신선한 생존가능한 인간 간세포로 이식시켰다. 이식은 비장내 주사에 의하여 성취되었다. 비장내 주사된 간세포는 문맥 정맥계를 통하여 신속하게 간으로 옮겨졌고 말단 문맥소정맥을 둘러싼 실질내로 이식되었다 (Ponder et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 1217 (1991) ; Gupta et al. Transplantation 50 : 472 (1990)). 비장내 주사와 관련된 사망률은 작기때문에, 비장은 체내이식의 최적 부위로 선택되었다. 따라서, (5-17일령의) 자손을 할로탄/02 마취시키고, 작은 좌측복부절개를 수행하였다. 수술 확대경 하에서, 1 x 106 개의 생존가능한 간세포를 하부 비장극 내로 27g 나비 주사 세트(Becton Dickinson)로 주사하였고, 지혈을 위하여 단일 멸균 티타늄 클립을 주사부위에 걸쳐 배치하였다. 비장을 복부로 되돌리고 복부절개부위는 두겹으로 봉합하였다.
알부민의 생산은 간세포 고유의 성질이므로(Clement et al, Hepatology 4 : 373 (1984) ; Gunsalas et al. Nature Medicine 3 : 48 (1997)), 선택적 면역침강과 웨스턴 블롯에 의한 혈청 샘플 내 인간 알부민 (HA)의 검출이 이식편 세포기능의 지표로서 채용되었다. 수용체 마우스는 목정맥 천자에 의하여 최초에 이식후 4주에서 및 그 후로 매주 간격으로 샘플채취되었다. 마우스 혈청의 알리쿼트(20 ㎕)를 항-인간 알부민 단일클론 항체 (Clone HSA-9 ; Sigma)와 함께 항온처리하였고, 항원-항체 복합체를 단백질 G-한천 비드(Boehringer-Mannheim)로 침강시켰다. 면역침강물을 98 ℃에서 5 분간 0.2 M 디티오트레이톨을 함유한 SDS 완충액에서 가열시켰고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 분리시키고 니트로셀룰로스로 전달시켰다. 1차 항체로 비오틴에 융합된 제 2의 항-인간 알부민 단일클론 항체(Clone HSA-11 ; Sigma)를 사용하여, 표준 방법(Coligan et al. Current Protocols in Immunology (Wiley, New York, 1997), vol. 2, chap. 8. 10. 7)에 따라 웨스턴 블롯이 제작되었다. 신호검출을 위하여 스트랩트아비딘-HRP 융합체(Pierce)를 2차 항체로서 채용하였고 화학발광제(Pierce)를 사용하였다.
강한 HA 신호가 이식된 한배새끼들 중 4/7의 혈청에서 나타났고, 이는 유의한 수의 기능하는 인간 간세포의 존재를 나타내는 것이다; 후속의 유전자형 분석은 모든 HA-포지티브 동물이 Alb-uPA 트랜스유전자를 운반하는 반면, HA에 대하여 네거티브인 모든 동물은 트랜스유전자에 대하여도 네거티브인 것을 나타내었다. 깨끗한 HA 밴드를 이식-후 2주만에 검출하였고 4-6주 시점이 지나서 강도가 증가하였으며, 이는 1차 세포 이식편의 건강한 확장을 시사한다 (도 1). 이들 발견은 Alb-uPA 간내의 미세환경이 신속한 증식을 시작하도록 인간 간세포를 자극하기에 충분하다 는 것과 장기간 인간 이식편의 확립을 지지할 잠재성이 있음을 나타내었다.
증식을 확인하고 마우스 실질의 인간-유래 세포로의 대체의 정도를 추산하기 위하여, 수용체 간의 포르말린 고정, 파라핀 충전 절편을 이식후 다양한 시점에서 얻고 인간 간세포에 특이적인 단일클론 항체로 면역염색하였다. 마우스 간의 절편을 10 % 포르말린에서 고정하고 파라핀에서 충전하였다. 5 μ 두께의 절편을 표준방법으로 헤마톡실린과 에오신(H & E)으로 염색하였다. 선택된 절편을 내인성 아비딘/비오틴 차단 키트(Zymed Laboratories, Inc.)로 처리하였고 항-인간 간세포 단일클론항체(DAKO, 1 : 20 dilution)로 염색하였다; 결합된 항체를 Super Sensitive Immunodetection System (BioGenex)을 사용하여 검출하였다.
결과는 도 2A-2F에서 나타낸다. 트랜스유전자를 운반하는 동물에서, 항-인간 간세포 항체로 포지티브 염색된 세포(어둡게 염색된 세포)의 배양물은 이식후 2주에서의 숙주 간 전반에서 균일하게 분산되어 분포되었고 전체 간세포의 2-3%로 추산되는 양을 차지하였다. 제 4주에서 포지티브-염색 세포는 증가하였고, 개개 절편의 전체 표면 면적의 20 내지 60 %를 차지하였다. 인간과 마우스 세포 사이의 경계는 주변의 마우스 실질내로 확장된 인간 세포의 골로 구별되었다. 비록 재형성 결절에서 입구 3중 구조는 결여되었지만, 개개의 인간 세포는 정상적 외형을 유지하였고 싸인곡선 구조를 발전시켰다. 인간-유래 결절은 개개의 간세포의 클론 확장의 결과이므로 이 후자의 관찰은 예상외의 것이 아니였다 (Sandgren et al. Cell 68 : 245 (1991)). 이들 결절은 담관이나 내피 전구세포를 함유하지 않았다; 이같은 구조는 숙주-유래의 것일 것이고 따라서 증식하는 인간 조직 주위에서 방치되었다.
인간 간세포 조직편 기능의 분석. 우리의 키메라 마우스에서의 인간 간세포 조직편을 평가하기 위하여 두가지 상이한 혈청-기초 분석이 사용되었다. 제 1의 분석은 인간 혈청 알부민을 측정하는 도트블롯 분석이고; 제 2의 분석은 인간 α-1 항트립신(hAAT)을 측정하는 ELISA 분석이다. 이식후 6주와 12주에서 동일한 마우스를 분석하였다.
2 ㎕의 샘플 또는 표준(표준= 마우스 혈청이 없는 중의 기지 양의 인간 알부민)을 40 ㎕의 환원 완충액내에서 희석시키고 100도에서 5분간 가열함으로써 도트 블롯 분석을 수행하였다. 2 ㎕ 부피의 용액을 니트로셀룰로스막 상에 블롯팅하여 15분간 건조되도록 두었다. 막을 웨스턴 전달 용액내에서 10 분간 적신 후, 3% TBST에서 1 시간동안 차단하였다. 막을 세척하고, 단일클론 항체를 환원된 인간 알부민에 1 : 5000에서 2 시간동안 적용하였다. 세척 후, 고추냉이페르옥시다제-스트랩트아비딘으로 1 : 10000에서 1시간동안 적용한 후, 세척하고 ECL-PLUS 화학발광 용액으로 현상하였다. 그 후, 막을 포스포이미저를 사용하여 판독하였다. 표준을 사용하여 표준곡선을 제작하여 샘플 값을 계산하였다.
플레이트를 폴리클론 염소-항-hAA 항체로 1:1000에서 하룻밤 피복시키고, 세척한 후 TBST/우유 완충액으로 하룻밤 차단시킴으로써 ELISA를 수행하였다. 세척 후, 우유 완충액에서 적당하게 희석된 표준과 샘플을 배치시키고 항온에서 2시간동안 항온처리하였다. 세척 후, HRP에 결합된 2차 항체를 (우유 완충액에 희석된) 1:300 에서 적용시키고 실온에서 2 시간동안 항온처리하였다. 세척 후, TBMD 기질 을 첨가하였고, 1 M H2SO4를 첨가함으로써 반응을 5분에서 멈추었다. 플레이트를 450 nm에서 판독하였다. 표준을 사용하여 표준곡선을 제작하여 샘플 값을 계산하였다.
하기 표는 각 분석으로 얻어진 결과를 나타낸다.
Figure 112005025030346-pct00018
동형은 동물이 트랜스유전자에 대하여 동형접합성임을 나타내고; 이형은 동물이 트랜스유전자에 대하여 이형접합성임을 나타낸다. 두 분석 모두 일반적으로 경향성은 동일함을 나타내며, 인간-유래 단백질이 uPA 트랜스유전자에 대한 이형접합체와 비교하여 동형접합체에서 훨씬 더 많은 생산을 나타낸다.
결론. 이 실시예는 면역기능저하된 scid/bg/Alb-uPA 마우스의 인간 간세포로의 이식이 성공적임을 설명한다.
실시예 2: 이식된 인간 간세포의 지속성과 증식
초기의 성공적 이식과 증식의 장기간 결과를 측정하기 위하여, 유사한 방식으로 제 2의 한배새끼 8 마리 동물을 이식하였다. 이번 실험에 사용하는데 이용가 능한 간세포는 B형 간염 바이러스의 만성 보균자인 환자로부터 얻었다. 환자는 혈청 HBsAg 수준 포지티브와 혈청 HBV DNA 네거티브를 나타냈고, 이는 활동성 바이러스 복제가 없는 만성 보균자 상태임을 나타낸다 (Davis, South. Med. J. 90 : 866 (1997)).
두마리의 무작위 선택된 동물은 제 4 주에 조직학적 분석을 위하여 희생시켰고 잔존 6 마리는 매주 간격으로 동일하게 수행하였다. 혈청 샘플은 상기한 바와 같이 웨스턴블롯을 받았고, 웨스턴 블롯으로부터의 HA 밴드는 영상 분석 소프트웨어와 밴드 밀도측정기(Umax Astra 1200S scanner and VistaScan DA v. 1. 2. 2 imaging software (UMAX Copr, Fremont, CA))을 사용하여 정량하였다. HA 피크의 정량은 NIH Image 1.60/fat 소프트웨어(National Institute of Health)를 사용하여 수행되었고, 각 블롯상에 존재하는 50ng HA 표준에 대하여 정상화하였다.
이번에도, 초기 이식편 증식은 트랜스유전자를 운반하는 오직 4마리의 동물에서만 보였다. 이들 동물에서, HA 신호는 제 8 주까지 거의 최대값으로 유지되었고 이때 이식편 기능의 두가지 패턴이 나타났다 (도 3; 마우스 3, 흰 사각형; 마우스 4, 검은 삼각형; 마우스 5, 흰 원; 마우스 6, 검은 원).
세 마리 동물에서 이식편 기능은 10, 15 또는 16주 시점에서 HA 신호가 사라짐과 동시에 서서히 줄어들기 시작하였다. 반면, 네번째 트랜스제닉 동물(마우스 6)은 모든 측정된 시점에서 최고의 HA 생산을 보였는데(도 3과 4), 이는 인간 간세포의 안정된 이식을 나타낸다. 지속되는 이식편 기능은 트랜스 유전자를 운반하는 동물의 약 25 %에서 반복적으로 일어났다. 이식된 간세포에 대한 증식 신호는 트랜 스 유전자의 전체 발현양에 의존하는 것 같았고, 숙주-유래 간세포가 자연적으로 트랜스 유전자를 제거함에 따라 줄어들었다.
이식된 마우스가 HBV-감염, 이식 세포의 HBV 감염을 지지하는지를 평가하기 위하여, 모든 이식 마우스로부터의 혈청 샘플을 B형 간염 표면 항원(HBsAg) 생산에 대하여 샌드위치 ELISA에 의하여 스크리닝하였다. 샌드위치 ELISA 키트(Heprofile HbsAg ; ADI Diagnostics)를 사용하여 혈청 알리쿼트(20 ㎕)를 HBsAg의 존재에 대하여 시험하였고 Dynatech MRX microplate spectrophotometer (Dynex)를 사용하여 플레이트 분석을 수행하였다. 포지티브 및 네거티브 모두의 인간 혈청 대조표준 뿐 아니라 네거티브 마우스 혈청 대조표준도 분석에 포함되었다.
결과가 표 1에 요약된다. 네거티브 인간 및 마우스 혈청 대조표준은 0.04-0.05 흡광 유니트 범위이고; 포지티브 인간 대조표준은 0.30-0.40 흡광 유니트 범위이다.
Figure 112002030390203-pct00002
예상되는 바와 같이, 대조표준 (Alb-uPA 네거티브, 일련번호. 1-2)마우스는 검출불가능한 HBsAg 수준을 가졌고 일시적 이식편 기능을 가지는 세마리 동물은 제 6-12 주 동안 간헐적인 소량의 증가만을 나타내었다. 그러나, 지속적 이식편 기능의 패턴을 가지는 트랜스제닉 마우스(마우스 제 6 번)는 모든 측정 시점에서 명백히 증가되는 수준을 나타내었고, 제 8 주 후 급격히 증가하여 활동성으로 감염된 인간 대조표준에서의 HBsAg 수준의 범위내에서 우수하게 지속되었다. 급격한 증가는 활발한 바이러스 복제의 회복을 시사하였다.
활발한 복제를 확인하기 위하여, 제 8, 10, 12 및 16 주에서 이 동물로부터 취하여진 혈청의 샘플을 HBV DNA의 존재에 대하여 PCR로 분석하였다. 12.5 ㎕의 마우스 혈청으로부터 분리된 DNA에 대하여 상기된 (Tipples et al. Hepatology 24 : 714 (1996)) HBV-특이적 프라이머와 증폭조건을 사용하여 PCR을 수행하였다. 모든 분석은 블라인디드 방식으로 수행되었다. 모든 네가지 혈청 샘플은 바이러스 DNA의 존재에 대하여 강한 포지티브를 나타내었다(데이터 나타내지 않음). 이 결과는, 인간 공여자 내에서 활발하게 복제되지 않았음에도 불구하고 바이러스가 면역결핍 마우스 숙주에서는 재활성화되었다는 점에서 특히 흥미로왔다. 이 재활성화는, 기관 이식 후 약학적 면역억제가 주어지는 만성 HBV 보균자에서 관찰되는 것과 유사한, 불충분한 항바이러스 면역성의 결과였다 (Terrault et al. Gut 40 : 568 (1997)).
그러므로, 이 실시예는 키메라, 트랜스제닉 마우스내로 이식된 인간 간세포가 HBV 바이러스 복제를 지지할 수 있음을 나타낸다.
실시예 3. 1차 HCV 감염의 확립
키메라 동물 내에서 HBV 복제를 지지하는 키메라 동물의 제작의 상기 성공은 동물의 HBV 모델로서의 용도를 지지한다. 그러나, (배경기술에) 상기된 HBV와 HCV 사이의 막대한 차이점은, 특히 다른사람들의 HCV 동물모델 개발의 실패와 HCV에 대한 세포시스템의 드묾을 고려하면, 동물모델이 정상적 감염경로를 통한 HCV 감염을 일으킬 것이라는 것 또는 키메라 간이 활발한 HCV 감염을 지지할 것이라는 논리적 예상을 할 수 없다는 것을 의미하였다. HBV 동물 모델의 상대적 성공과 반복되는 다른 사람들의 HCV 동물 모델의 실패는 HBV로부터 단순히 HCV를 추론할 수는 없다는 것을 나타낸다. 그러므로, 바이러스-감염 인간 혈청을 사용하여 키메라 간을 가진 마우스에서 1차 HCV 감염을 확립하기 위한 시도가 행하여졌다.
7 마리의 한배새끼를 7일령에서 HCV와 HBV 모두에 대하여 혈청학적으로 네거티브인 환자로부터 분리된 인간 간세포로 이식시켰다. 5/7 동물에서 이식후 제 6 주에 초기 이식편 기능을 확인한 후, 모든 마우스를 관련없는 HCV 포지티브 공여자로부터 얻은 0.25 ml 인간 혈청으로 정맥내 접종하였다. 인간 혈청 공여자의 HCV-포지티브 상태는 PCR에 의하여 HCV RNA에 대한 포지티브로 확인되었고, 바이러스 적정값은 ml 혈청당 1 x 107 복제수였다. 그러므로, 각 마우스는 약 2.5 x 106 바이러스 입자로 접종되었다. 모든 일곱마리 마우스로부터 이식후 제 11, 12 및 13 주(감염후 제 5, 6 및 7 주)에 취하여진 혈청 샘플을 Cobas Amplicor system (Roche Diagnostics)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 HBV RNA의 존재에 대하여 PCR로 분석하였다. 두 마리의 비이식 마우스를 비감염 대조표준으로서 사용하였다.
양호한 초기 이식을 가진 다섯 마리의 동물 중에서 4 마리는 일시적 이식편 기능을 나타내었고 다시 한마리의 동물은 모든 측정 시점을 통하여 최대 강도로 HA 수준을 나타냈다. 혈청내 인간 알부민의 지속성으로써 반영된 바와 같은, 지속적 인간 키메라성을 가진 동물로부터 취하여진 모든 세 가지 샘플은 HCV RNA에 대하여 강한 포지티브였고 제 36주까지 매주 간격의 시점에서 지속적으로 포지티브였다. Alb-uPA 트랜스유전자에 대하여 네거티브인 동물 또는 트랜스유전자에 대하여 단지 일시적으로 HA 마커를 발현하였던 동물에 대하여 RT-PCR 분석은 균일하게 네거티브였다. 6 마리 동물은 HCV RNA에 대하여 네거티브였으므로, 제 7의 동물에서의 포지티브 RT-PCR 신호가 접종물로부터의 잔여 바이러스로부터 유래하였을 가능성은 배제된다. 이 예는, 이 동물은 발생시켰고 이식후 23주 및 감염 후 20주에 활동적 HCV를 1. 2 x 105-1. 8 x 105 비리온/ml 혈청으로 번식시킨다는 결론을 지지한다.
이들 일련의 실험은 SCID-beige/Alb-uPA 트랜스제닉 마우스의 키메라 인간 간을 인간 간세포 이식후 장기간 및 아마도 무한 기간동안 생성시키고 유지시킬 수 있는 능력을 달성시킨다. 이들 키메라 장기는 HCV-포지티브 인간 혈청으로 신규로 감염될 수 있고, 인간-특이적 향간성 바이러스의 인간에서 임상적 수준과 균등할 수 있는 수준으로의 장기간 (예를 들어, 수일에 대비하여 수주 또는 수개월 동안) 복제를 지지할 수 있다. HCV 바이러스 입자는 자동화되어 더 신속한 스크리닝을 용이하게 할 수 있는 표준기술에 따라 혈청, 혈, 또는 다른 혈유래 분획에서 검출될 수 있다. 예를 들어, HCV-감염 숙주는 기지 비감염 혈청으로 희석(예를 들어, 2 내지 4 배 희석)하여 자동화 기기에서 사용되기 적당한 샘플 부피를 제공하고, 무작 위 인간 샘플과 구별될 수 없는 분석에서의 신호 세기를 제공할 수 있다.
본 발명의 모델에서의 HCV 장기간 (예를 들어, 4주 초과의 기간, 일반적으로 약 12 주 초과의 기간, 예를 들어 약 3 개월 내지 6 개월이상 동안) 복제는 이 모델의 적당한 약물 개발에 필수적인, 장기간에 걸친 약물 시험에서의 용도를 허용한다. 예를 들어, 항 HCV 치료제의 하나인 인터페론-α(특히 인터페론-α2b)의 투여 효과는 일반적으로 인간에서 치료후 약 12 주에서만 검출될 수 있다. 바이러스 복제를 겨우 수일 또는 수주 유지하고/또는 일정하지 않은 바이러스 생산을 나타내는 동물 모델에서는, 바이러스 적정값이 후보 치료법 때문인지 아니면 동물 모델에서 본래의 정상적 적정값 변동 때문인지 결정하기 어렵거나 불가능할 것이다. 본 발명은 이런 문제점을 피한 모델을 제공한다.
요약하면, 본 발명자가 아는 한, 이것은 정상정 감염 경로에 의한 HCV 감염이 가능한 비-영장류 동물모델의 최초의 보고이다. 본 모델은 임상적으로 적당하고(예를 들어, 정상 감염경로에 의하여 감염될수 있고 인간에서 관찰되는 것과 유사한 지속적 HCV 감염을 지지하고), 실질적 수로 정규적으로 및 신뢰성있게 제작될 수 있고, 관찰자가 바이러스 복제를 생체내 억제하는 전략을 직접적으로 연구하도록 허용할 것이다.
실시예 4: Alb-uPA 마우스의 HCV 감염
이 실시예에서, 상기 연구는 본 발명의 동물 모델이 HCV의 복제를 지지할 수 있는 것을 설명하기 위하여 더 확장되었다.
방법과 재료
다음 방법 및 재료가 본 실시예에서 사용되었다.
scid/Alb-uPA 계통의 개발. 동물은 무-바이러스/항원 조건에서 수용되고 Canadian Council on Animal Care (1993)에 의하여 확립된 지침서에 따라 사육되었다. 여기에서 기재된 모든 동물 실험은 University of Alberta Animal Welfare Committee로부터의 승인에 따라서 수행되었다.
트랜스유전자에 대한 이형접합성 Alb-uPA 마우스(계통 TgN (AlblPlau) 144Bri (The Jackson Laboratory))를 동형접합성 scid-bg 마우스(계통 C. b-17/GbmsTac- scid-bgN7 (Taconic Farms)와 교배시키고, Alb-uPA 트랜스유전자를 운반하는 자손을 꼬리 생검(Jackson Laboratories technical support)으로부터 추출한 게놈 DNA의 PCR 분석에 의하여 식별하였다. 역교배를 통하여, 샌드위치 ELISA 기술을 사용하여 전체 혈청 IgG의 정량에 의하여 확인된 바와 같이, scid 형질이 교배로 동형접합성으로 얻어졌다. > 정상 혈청 IgG의 1%인 동물을 안락사시켰다.
인간 간세포의 분리와 정제. 인간 조직의 사용에 대한 윤리적 승인은 University of Alberta Faculty of Medicine Research Ethics Board로부터 얻었고; 정보제공후 동의를 간세포 기증자로부터 얻었다. 인간 간조직의 절편(15-20 cm3)을 병리학적 시험 후 일반적으로 버려지는 간 절제 시료 부위로부터 얻었고; 수술의 대부분은 간내 악성에 대하여 수행되었다.
절제된 시료의 신속한 냉각 후, 간세포를 콜라겐아제 관류물 내의 0.38 mg/mL Liberase CI (Boehringer-Mannheim)를 사용하여 표준 2단계 콜라겐아제-기초 관류(Seglen Methods Cell Biol. 13 : 29-83 (1976) ; Ryan et al. Surgery 113 : 48-54 (1993))에 의하여 분리하고 정제하였다. 정제 후, 세포를 세척하고, 이식전 단기간 저장을 위하여 0 ℃에서 Belzer-UW 용액 (DuPont)에 현탁시켰다. 세포 수와 생존률은 세포계수기 및 트립판 블루 배제에 의하여 확인하였고; 최종 생존률은 통상 > 80 %였다.
인간 간세포의 이식. (5-14일령의) 자손을 할로탄/02 마취시키고, 작은 좌측복부절개를 수행하였다. 수술 확대경 하에서, 1 x 106 개의 생존가능한 간세포를 하부 비장극 내로 27g 나비 주사 세트(Abbott)로 주사하였고, 지혈을 위하여 단일 멸균 티타늄 클립을 주사부위에 걸쳐 배치하였다. 비장을 복부로 되돌리고 복부절개부위는 두겹으로 봉합하였다.
면역침강과 웨스턴 블롯에 의한 마우스 혈청의 HA 검출. 마우스 혈청의 알리쿼트(20 ㎕)를 항-인간 알부민 단일클론 항체 (Clone HSA-9 ; Sigma)와 함께 항온처리하였고, 항원-항체 복합체를 단백질 G-한천 비드(Boehringer-Mannheim)로 침강시켰다. 환원조건하에서, 면역침강물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 분리시키고 니트로셀룰로스로 전달시켰다. 신호검출을 위하여 스트랩트아비딘-HRP 융합체(Pierce)와 화학발광제(Pierce)를 사용하고, 비오틴화 항-인간 알부민 단일클론 항체(Clone HSA-11 ; Sigma)를 사용하여, 웨스턴 블롯이 제작되었다.
Alb-uPA 트랜스유전자의 접합체 유형의 결정. 마우스 DNA (3 ㎍)을 PvuII로 절단하고, 0.7 % 한천겔 상에서 크기 분획하고, Hybond-N+ 막 (Amersham Life Science)으로 전달시키고 uPA 유전자의 마지막 인트론 (위치 7312-7920, GenBank 접근번호 M17922)의로부터의 [32P]-표지 프로브와 혼성화시켰다.
2.88 kb 밴드는 uPA 트랜스 유전자(T)로부터 유래하고 2.53 kb 밴드는 내인성 uPA 유전자(E)로부터 유래하며; 혼성화는 Fuji 포스포이미저와 Image Gauge Software로 정량하였다.
면역조직화학. 마우스 간 생검은 10 % 포르말린에서 고정하고 파라핀에서 충전하였다. 5 μ 두께의 절편을 표준방법으로 헤마톡실린과 에오신(H & E)으로 염색하였다. 선택된 절편을 내인성 아비딘/비오틴 차단 키트(Zymed Laboratories, Inc.)로 처리하였고 항-인간 간세포 단일클론항체(DAKO, 1 : 20 희석)로 염색하였다; 결합된 항체를 Super Sensitive Immunodetection System (BioGenex)을 사용하여 검출하였다.
HA 생산의 정량을 위한 단백질 도트블롯 분석. 마우스 혈청의 샘플(2 ㎕)을 40 ㎕의 환원 완충액에서 5분간 100 ℃에서 항온처리하였고, 2 ㎕ 알리쿼트를 세 벌로 니트로셀룰로스 상에 블로팅하였다. 건조된 막을 전달 완충액에 적시고 3 % PB-Tween으로 차단하고, 웨스턴 블롯으로 제조하였다. 각 블롯 상에서 제조된 표준 곡선으로부터 STORM 포스포이미저를 사용하여 화학발광을 정량하였다.
마우스 혈청내 포지티브 가닥 HCV RNA의 정량 분석. 정량적 HCV 분석을 Alberta Provincial Laboratory of Public Health (Edmonton, Alberta, Canada), 또는 the Canadian Center for Disease Control (Winnipeg, Manitoba, Canada)에 의하여 블라인디드 방식으로 수행하였다. 분석은 제조자의 지시에 따라 Cobas Amplicor HCV Monitor system (Roche Diagnostics)를 사용하여 혈청 샘플에 대하여 수행하였다.
열안정성 rTth 역전사효소 RNA PCR에 의한 네거티브-가닥 HCV RNA의 검출. TRIZOL (Gibco BRL)를 사용하여 전체 RNA를 마우스 간 생검 또는 감염된 인간 혈청으로부터 분리하였다. RT-PCR은 열안정성 rTth 역전사효소 RNA PCR 키트 (Perkin Elmer)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 역전사 14에 대하여, 포지티브-가닥 RNA는 안티센스(5'-CTCGCAAGCCCCTATCAGG-3'(SEQ ID NO : 1))프라이머로 검출하였고 네거티브-가닥은 센스(5'-GAAAGCGTCTAGCCATGGCGT-3'(SEQ ID NO : 2)) 프라이머로 검출하였다. 5'-비코드화 영역(NCR)의 240-염기쌍(bp) 영역에 표적화하기 위하여, 가닥-특이적 cDNA를 다른 프라이머를 첨가하고 95 ℃에서 30 초, 66 ℃에서 45 초 및 70 ℃에서 90초의 35 차례 순환 후에 70 ℃에서 5분간 처리함으로써 증폭시켰다. 반응 산물은 2% 한천겔 상에 로딩시키고 Hybond-N+ 나일론 막(Amersham Pharmacia Biotech) 상으로 전달시키고, HCV 5'NCR에 대한 α- 32P-표지 DNA 프로브로 42 ℃에서 하룻밤 혼성화시켰다.
RANase 보호 분석에 의한 네거티브-가닥 HCV RNA의 검출. 각각의 제조자의 지시에 따라 Trizol Reagent (GIBCO/BRL)을 사용하여 총 RNA를 마우스 간으로부터 분리하였고 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen)을 사용하여 HCV 감염 인간 혈청으로부터 총 RNA를 분리하였다. 추출된 RNA를 32P-표지, 겔-정제 안티센스 리보프로브((+) 사슬의 검출), 센스 리보프로브((-) 사슬의 검출), 및/또는 β-엑틴 안티센스 리보프로브로 프로빙하였다.
플라스미드 구성체. 잘린 HCV RNA의 시험관내 전사를 위하여 세 가지 플라스미드 구성체를 제조하였다. HCVPfix/KS+는 HCV 세린 프로틴아제의 발현 연구를 위하여 우리 실험실에서 원래 개발한 구성체이다. HCV 감염 환자로부터 얻은 신선한 혈청으로부터 제조된 총 RNA(Chomczynski et al. Anal Biochem 162, 156-159 (1987))를 95 ℃에서 5 분간 변성시켰다. cDNA 합성은 20 ㎕의 반응 부피에서 AMV 수퍼 역전사효소 (Molecular Genetic Resources)로 42 ℃에서 90 분간 수행하였다. 사용된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5'-TCTCTGTCGACTCACTGGGGCACTGCTGGTGG-3' (SEQ ID NO : 3) (3'primer)이다. PCR은 총 부피 100 ㎕에서 수행하였고, 반응물은 2 ㎕의 최종 cDNA 반응 혼합물, 20mM Tris-HCl(pH 8.4), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 μM의 각 디옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트, 0.5 μM의 3' 프라이머 및 5' 프라이머 (5'GGAATTCGCGACGACGATGACAAGGCACCCATTACGGCGTATGCCCAGCAGACAAGGGGCCTCTT-3' (SEQ ID NO : 4)), 및 2. 5 U Taq DNA 중합효소 (GIBCO/BRL)를 함유하였다. 5' 프라이머는 엔테로키나제 절단 부위를 추가시켰고, 전체 623 bp 단편을 pBluescript KS+ (Stratagene, PDI)의 Eco RI 및 Sal 1 부위 내로 클로닝 하였다.
pCV-H77C (Masayuki etal. J. ProcNatAcad Sci USA 94, 8738-8743 (1994))로부터 HCV RNA의 고도로 보존적인 5' 비코드화 영역(NCR)을 얻기 위하여 PCR 전략을 사용하여 잔여 두가지 플라스미드를 제작하였다. 사용된 주형이 100 ng pCV-H77C이고 프라이머가 5'-GAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAG-3' (SEQ ID NO : 5) (5'프라이머) 및 5'-GGCACTCGCAAGCACCCTATCAGGC-3' (SEQ ID NO : 6) (3' 프라이머)라는 점을 제외하고는 PCR 성분은 상기와 동일하였다. 시중구입 가능한 TOPO TA 클로닝 키트 (Invitrogen)을 사용하여 양방향의 245 bp 산물을 pCR2. 1 TOPO내로 TA-클로닝시켜 pCR 2. 1/NCR센스 및 pCR 2. 1/ NCR안티센스 플라스미드를 제작하였다. 모든 클론은 DNA 서열결정에 의하여 확인하였다 (University of Alberta DNA Core Facility).
리보프로브와 잘린 HCV RNA 전사체의 제작. T7 RNA 중합효소 (Promega)를 사용한 시험관내 전사에 의하여 [32P] UTP 존재하에서 리보프로브를 제조자의 지시에 따라 제작하였다. (+) 사슬 HCV RNA의 검출을 위하여, Kpn I 절단 pCR 2. 1/NCR안티센스로부터 383-nt 안티센스 리보프로브를 전사시켰고, (-) 사슬 HCV RNA의 검출을 위하여, Sall 절단 HCVPfix/KS+로부터 636-nt 센스 리보프로브를 전사시켰다. β-엑틴의 검출을 위하여, 선형화된 pTRI-Actin-Mouse (AMBION)를 사용하여 304 nt 리보프로브를 제작하였다. HCV RNA의 가닥-특이적 검출의 특이성을 설명하기 위하여, 방사성불활성의 센스 및 안티센스 리보프로브 또한 제작하였다. 요약하면, T7 RNA 중합효소를 사용한 시험관내 전사 전에 pCR2.1/NCR 센스/안티센스를 Kpn I로 절단하였고 HCVPfix/KS+를 Sal I으로 절단하였다. 또한, HCVPfix/KS+를 Eco R1을 사용하여 선형화하였고 T3 RNA 중합효소(Promega)를 사용하여 전사시켰다. 모든 신 험관내 전사 반응은 37 ℃에서 1시간동안 처리에 이어 무-RNase DNaseI (RQ1 DNase, Promega)로 37 ℃에서 30 분동안 처리하였다. 표지된 리보프로브는 겔정제하였고 방사성불활성 HCV RNA 리보프로브는 0.5 부피의 7.5 M 아세트산암모늄을 첨가한 후 2.5 부피의 순수알콜로 침전반응시켰다. 1 % 한천겔을 통한 전기영동에 의하여 방사성불활성, 시험관내전사 RNA의 무결성을 평가하였다. RNA 샘플을 변성시키고 42 ℃에서 하룻밤 혼성화시켰고, RNase 보호 분석 키트(AMBION RPA III Kit)를 사용하여 RNase 가수분해를 수행하였다. 산물을 8 M 요소를 함유한 5 % 폴리아크릴아미드 겔 상에서 용해시키고 Kodak X-Omat AR 필름에 노출시켰다.
트랜스제닉 마우스의 제작 및 인간 간세포의 이식
Alb-uPA를 운반하는 마우스를 C. b-17/scid-bg계로부터의 동물과 교배시켜, 선택적 역교배를 통하여 scid 형질을 교배로 동형접합체로 얻었다. 최초 실험에서, 반접합성 방식으로 Alb-uPA 트랜스유전자를 운반하는 동형접합성 scid 동물을 교배시키고, 4-12일령의 자손을 비장내로 0.5-1 x 106의 신선한 분리된 생존가능한 인간 간세포로 이식시켰다. 인간 간세포에서만 고유하게 생산되는 인간 알부민을 이식편 기능의 지표로 채용하였다.
36 건의 이식의 소규모 연구에서, 이식 후 제 4-5 주에서 19 마리의 수여자의 혈청에서 강한 HA 신호가 나타났다. 이식후 제 2 주부터 HA 밴드는 검출되기 시작하였고 4-6주에 걸쳐서 강도가 증가하였고, 이는 이식편 확장을 시사하는 것이다 (도 5). 블라인디드 유전자형 분석은 모든 강한 HA 포지티브 동물이 Alb-uPA를 운 반하지만 나머지는 그렇지 않음을 나타내었다.
최초의 강한 HA 신호에도 불구하고, 몇몇 이식편 수여자는 약 14 주에서 신호의 소멸을 나타낸 반면, 제 2의 서브세트는 강한 신호를 30 주 이후에도 유지하였고; 대표적인 결과가 도 7에 나타난다. 이들 이식편 수여자는 이형접합성 교배의 자손이므로 Alb-uPA 트랜스 유전자의 접합성유형의 결과에 따른 이식편 생존의 상이를 시험하였다. uPA 유전자의 마지막 인트론으로부터 유래한 [32P]-표지 프로브를 사용하였으므로, 트랜스제닉 및 내인성 uPA는 서던블롯에 의하여 구별될 수 있었고, 신호비율은 트랜스 유전자 배열의 접합성유형을 결정하는데 사용될 수 있었다(도 6). 게놈 DNA 분석으로 지속적 인간 이식을 나타내는 동물은 Alb-uPA에 대하여 동형접합성이었으나 이식편 기능이 실패한 서브세트는 이형접합성이었음을 확인하였다.
이식된 동형접합체 간으로부터의 절편의 시험은 전형적 골-유사 구조로 배열된 간세포 큰 결절을 나타내었다. 결절 내에, 간세포 세포질과 핵은, 세포가 명백히 더 작고 공포화된 세포질과 농축핵을 가진 주위 주직과는 반대로 조직학적으로 정상인 것으로 나타났다. 인간 세포를 시각적으로 나타내기 위하여, 우리는, 대조표준 인간 간을 강하게 염색시키지만 비-이식된 동형접합성 마우스 간과 실질적인 교차-반응은 갖지 않는 단일클론 항-인간 간세포 항체로 절편을 면역염색하였다. 이는 결절이 명백히 인간 기원의 것이며, 바깥쪽으로 확장하고 있으며 주위 마우스-유래 조직을 압박함을 나타내었다. 큰 인간 결절은 건강한 간세포를 함유하 였고 모든 담즙관과 입구 구조는 숙주유래의 것으로 보였다.
HCV 감염
장기간의 인간 이식상태의 증거가 나타날 때, 마우스를 HCV-감염 인간 기증가로부터의 혈청으로 감염시켰다. 비-감염 인간 간세포를 이형접합성 교배로부터의 자손 27 마리내로 이식시켰고, 이식후 제 6 주에서 모든 마우스를 정맥내 ± 복강내로 하나 이상의 비연관 HCV-포지티브 기증자(바이러스 유전자형 1a 및 6a)로부터 얻은 0.25 ml 인간 혈청으로 접종시켰다. 접종 후 제 3 내지 40 주의 선택된 혈청 샘플을 포지티브-가닥 HCV RNA의 존재에 대하여 RT-PCR로 분석하였고; 실험의 결과는 표 2에 요약된다. 이식편 내구성은 면역침강/웨스턴 블롯 방법에 의한 HA 검출성의 기간으로 정의되었다.
Figure 112002030390203-pct00003
모든 8 야생주 대조표준은 최초 이식편 기능의 증거를 가지지 않았고, HCV RNA에 대하여 지속적으로 네거티브였다. 반접합성 동물은 최초에는 강한 HA 신호를 가졌으나, 중앙값 이식편 내구성 15.5 주로 점차적으로 시간경과에 따라 신호의 세기를 잃었고; (+) 사슬 HCV RNA는 복수 시점에 걸쳐 이들 동물에서 검출되지 않았 다. 아주 대조적으로, Alb-uPA 트랜스 유전자에 대한 동형접합성인 모든 네마리 동물은 지속적인(중앙값 30.5 주) 인간 키메라성을 나타내었고 혈청 RT-PCR 분석에 따르면 HCV RNA에 대하여 포지티브였다. 정량적 HCV RNA 분석은 바이러스 수준이 1. 4 x 103 내지 1. 4 x 106 RAN 복제수/ml 범위이고 바로 감염된 인간의 수준 이내임을 나타내었다. 이 최초 무리의 네 마리 동물에서 바이러스 접종의 유전자형과 10-21 주 범위인 감염 내구성 모두에서 성공적 감염이 확립되었다.
Alb-uPA 트랜스유전자에 대한 동형접합성 또는 반접합성 동물의 HCV 감염
포지티브-가닥 HCV RNA는 동형접합성 동물에서 지속적으로 나타나는 반면, 반접합체에서는 HCV RNA가 검출불가능하였다. 우리는 반접합체는 최초 이식성 감소와 이식편의 조기 손실의 결과로 검출성 수준에서의 HCV 복제를 지지하는 것에 실패함을 가정하였다. 이 가설을 시험하기 위하여, 화학발광을 사용하고 HA 생산을 더욱 정확하게 정량하기 위한 포스포이미징을 수행하여 단백질 도트-블롯 분석을 현상하였다. 단일 인간 기증자로부터의 냉동보존된 인간 간세포 1 x 106 개를 21 마리(15 마리는 동형접합체, 6 마리는 반접합체)의 수여자에게 이식한 후, 정량적 HA 분석을 위하여 무작위로 선택된 동물로부터 샘플채취하였고/또는 면역조직화학적 분석을 위하여 희생시켰다. 이 실험의 결과는 도 8에 나타난다.
반접합성 및 동형접합성 동물은 최초에 유사한 강도의 HA 신호 가지지만, 제 5-6 주까지 명백한 양분이 분명해지고, 제 10-12 주까지는 동형접합성 마우스에서의 HA 신호는 반접합체보다 한차수 이상 더 높았다 (도 8). 이식후 선택된 시점에 희생된 동형접합성 및 이형접합성 수여자로부터의 무작위적 간 절편은, 마우스간의 인간 조직으로의 교체 백분율을 추산하기 위하여, 단일클론 항-인간 간세포 항체로 면역염색시켰다. 이들 면역조직화학적 데이터는 인간 세포가 동형접합성 동물의 간 단면면적의 실질적인 부분을 차지하는 ( > 50 %) 단백질 도트-블롯에서의 발견을 확인시켰다. 아주 대조적으로, 이형접합성 수여자로부터의 조직의 다중 절편의 실험은 인간 이식성의 오직 미세한 증거만을 나타내었다. 종합적으로, 이들 연구는 동형접합성 Alb-uPA 수여자에 대한 인간 간세포 이식의, 이형접합성 대응체와 비교한 양 및 내구성 모두에서의 실질적인 이점을 시사한다.
이형접합성 교배의 자손 내로 이식함으로써, 4/27 마우스에서 성공적인 감염을 달성하였고, 모두 동형접합성이었다. 이 성공률은 모델을 일상적으로 사용하기에 너무 부담되도록 할 수 있다. 이식편 크기 정량적인 이점의 결과는 동형접합성 마우스 덕이기 때문에, 교배 콜로니를 동형접합성 Alb-uPA 마우스의 배타적 생산방향으로 발전시켰다. 고-수준 간세포 이식성에 대하여 조기에 스크리닝하기 위하여 상기된 도트-블롯 분석을 사용하여, 약 75 %의 HCV-접종 동물이 지속적 바이러스 적정값 > 3 x 104 복제수/ml, 많은 경우 > 106 복제수/ml를 발전시켰다. 나머지 바이러스 연구는 동형접합성 수여자에서 수행되었다.
HCV의 장기간 지속의 확인
인간에서 바이러스 적정값의 장기간 지속은 진행되는 활발한 증식의 결과이다. 그러나, 면역기능저하된 키메라 동물에서는 HCV 지속성의 원인을 진정한 감염 과 복제라기보다 더딘 바이러스 제거 탓으로 돌릴 수도 있다. 다섯 마리의 동형접합성 이식편 수여자를 250 ㎕의 감염된 인간 혈청(유전자형 3a ; 2.95 x 106 바이러스 RNA 복제수/ml)으로 접종시켰고; 각각 동물은 따라서 7.38 x 105 RNA 복제수의 접종을 받았다. 이 실험의 결과는 도 9에 나타난다. 3/5 수여자에서, 바이러스 적정값은 제 5 주까지 초기 접종량의 16, 27 및 36 배 증가하였고; 나머지 두 마리의 수여자에서 적정값은 5 주 경과후에 온화하게 (1.6배와 4.3배) 증가하였다.
포지티브-가닥 HCV RNA의 진행중 검출은 네 마리(한마리는 혈 샘플채취 후 죽음)의 동물에서 접종 후 15 주 이후에도 확인하였다. 15 주에서 지속적인 높은 바이러스 수준과 연관된 정정값의 초기 증가는 이월된 인공물이라기 보다는 바이러스 복제와 일치한다. 더 나아간 실험에서, 여섯 키메라 마우스를 더 소량의 바이러스 접종물(1.35 x 103 RNA 복제수)로 감염시켰다. 총 혈청 바이러스 부하가 감염후 10 주에 1000배 증가인 1.33 x 106로 측정되었다. 비생산적 "상호작용"은 논리적으로 바이러스 부하의 3-로그 증가를 달성시킬 수 없을 것이고, 이는 바이러스 복제가 일어났음을 강하게 지지한다.
HCV는 네거티브-가닥 중간체를 통하여 복제되는 포지티브-가닥 RNA 바이러스이고; 간내의 (-) 가닥 HCV RNA의 검출은 복제의 증거를 구성한다. 가짜 포지티브 결과의 위험을 줄이기 위하여(Lanford et al. Virology 202 : 60-6614 (1994)), 두개의 별개이지만 상보적인 기술을 사용하여 (-) 가닥 분석을 수행하였다.
신선하게 얻어진 인간 혈청으로부터의 5 x 105 복제수의 바이러스 RNA로 접종된 여덟 마리의 동형접합성 이식편 수여자는 접종후 제 3-4주에 (+) 가닥 HCV RNA를 가지는 것으로 확인되었다. 50 % 부분 간절제에 의하여 간조직의 샘플을 여섯 동물에서는 접종후 제 2-5 주에, 나머지 두 마리에서는 제 12-13 주에 얻었다.
rTth 역전사효소 RNA PCR 프로토콜 및 사슬-특이적 프라이머를 사용하여, 블라인디드 방식에 의하여 독립적 연구실(A. R.)에서 (-) 사슬 HCV RNA에 대한 분석을 수행하였다. 도 10A-lOC에서 나타난 바와 같이 결과는 이식되고 감염된 동형접합성 Alb-uPA 마우스의 간내에서의 HCV 복제성 중간체(네거티브-사슬 바이러스 RNA)의 생산을 확인시켰다. 도 10A-10C에서의 문자 표시(하기된 A 내지 J)는 대조군 샘플이고; 수자 표시(1 내지 10)는 이식된 후 HCV-감염 인간 혈청에 의하여 접종된 10 마리의 동형접합성 마우스의 간으로부터 분리된 샘플 각각의 RNA 샘플을 나타낸다.
도 10 A는 열안정성 rTth 역전사효소 RNA PCR 프로토콜 및 사슬-특이적 프라이머에 의한 (+) 가닥 RNA (상부 패널) 또는 (-) 가닥 RNA (하부 패널)의 검출을 나타낸다. A는 비이식, 비감염의 야생종 대조표준 마우스이고; B는 HCV로 접종된 이형접합성 이식된 마우스이고; C는 HCV로 접종되지 않은, 동형접합성 이식된 마우스이고 ; D는 감염된 인간으로부터 채취된 혈청이고; E는 표준 DNA 사다리 마커이고; F는 (+) 가닥 (상부 패널) 또는 (-) 가닥 (하부 패널) 바이러스 RNA로부터 제조된 표적 DNA 서열에 대한 표지된 프로브의 결합을 나타내고; G는 HCV-포지티브 인간으로부터의 혈청 RNA로 도프된 마우스 간 RNA (10 ㎍)이고; H는 106 복제수의 방사성불활성 안티센스(상부) 또는 센스(하부) 리보프로브로 도프된 마우스 간 RNA (10 ㎍)이고; I는 106 복제수의 방사성불활성 센스(상부 패널) 또는 안티센스(하부 패널) 리보프로브로 도프된 마우스 간 RNA (10 ㎍)이고; J는 10 ㎍ 마우스 간 RNA로 혼성화된 리보프로브이고, 다음의 모든 단계는 RNase를 첨가한 것을 제외하고는 동일하다. 이 레인에서의 단편은 비절단 리보프로브(화살표)를 나타내고, 예상되는 길이는 표적에 혼성화에 의하여 보호되는 대응 단편의 길이보다 길다. HCV 게놈의 복제는 이 방법에 의하여 분석된 5/9 동물에서 명백하게 나타난다.
도 10B는 열안정성 rTth 역전사효소 RNA PCR 프로토콜을 사용한 선택된 동물의 일련 희석의 분석의 결과를 나타낸다. (+) 및 (-) 사슬 둘 모두의 RNA가 2-3로그 희석 이상에서도 검출가능하다. 이 실험에서만, 이전에 나타났고 다중 RPA 분석에서 이후에 확인되었지만, (-) 사슬 바이러스 RNA는 마우스 5에서 검출되지 않았다. RNase 보호 분석에 의한 (+) 사슬 HCV RNA (상부 패널), (-) 사슬 HCV RNA (중간부 패널), 또는 β-액틴 RNA(하부 패널)의 검출의 결과가 도 10C에서 나타난다. 대조표준 레인은 상기 표시된 바와 같고; 마우스 10을 RPA 방법에 의하여만 분석하였다. 이 분석은 상기 데이터 5/6 동물과 일치하고, 이는 3/4에서 (-) 가닥의 존재를 확인시킨다. 마우스 6에서 (-) 가닥 RNA를 검출하는 것의 실패는 RPA 분석의 감도가 줄었기 때문으로 보인다.
면역조직화학적 분석.
이식된 마우스 간 내에서의 HCV의 편재를 확인하기 위하여, 인간 간세포로 이식된후 HCV-감염 인간 혈청으로 접종된 동형접합성 마우스로부터 채취된 간의 절편을 바이러스 폴리단백질의 NS3-NS4 영역에 대한 단일클론 항체로 면역염색하였다. 인간 간의 대조표준 절편은 핵으로부터의 염색의 배재와 함께 과립성 세포질 외형을 나타내었다 (도 11A). 섬유증의 지대와 입구 삼각 구조는 NS3-NS4에 대하여 포지티브로 염색되지 않았다. 대부분의 간세포는 포지티브 염색되었으나, 남은 지대가 있었다. 비이식 마우스 간으로부터의 대조표준 절편은 염색의 어떤 증거도 전혀 나타내지 않았다(데이터 표시하지 않음). 이식되고 감염된 마우스로부터 채취된 시험 절편(도 11B)은 염색 강도는 약간 더 줄었으나 세포성 과립 외형면에서 대조표준 인간 절편과 유사한 간세포 염색지대를 나타내었다. 이 면역조직화학적 발견은 HCV는 이식된 Alb-uPA 마우스의 키메라 간 내에서 인간 간세포를 진실로 감염시킨다는 증거를 제공한다.
결론.
이들 별개의 독립적으로 수행된 분석은 접종 후 2-5주에서 채취된 키메라 간내의 네거티브-가닥 HCV RNA의 존재를 분명하게 나타낸다. 정량적 RT-PCR에 의한 순차적 매주 분석(도 9)은 접종후 2-4 주에서 HCV 바이러스 적정값의 신속한 증가가 나타났고, 이는 간 내의 바이러스 복제의 최대속도와 대응하고; 이는 (-) 사슬 바이러스 RNA의 최대양과 일치할 것으로 예상되었다. 이는 (-) 사슬이 감염 후기(12-13 주에서 채취된 0/2 동물)보다는 감염 조기(2-5주에 채취된 5/6 동물)에 검출가능한 이유를 설명한다. 조합하여 보면, 이들 데이터는 이 동물 모델에서의 활발한 바이러스 복제를 결론적으로 지지한다. 더욱이, HCV 감염은 만성적이다. 가장 최근에, 발명자는 (이식후 35주에서 (도트 블롯으로 약 800 유니트보다 큰) 높은 알부민 혈청 수준의 검출에 의하여 측정된 바와 같이) 기능하는 인간 간세포 조직편을 갖는 키메라, Alb/uPA 트랜스제닉 마우스 및 이식후 35주에서 혈청내 높은 적정값(1.7 x 105 복제수/ml)의 HCV에 기초한 본 발명의 동물 모델을 설명하였다.
HCV 감염의 일련의 계대
복제를 확인한 후, 마우스로부터 마우스로 HCV 감염의 계대를 시도하였다. 인간 기증자로부터의 신선한 혈청(250 ㎕; 4.75 x 105 바이러스 RNA 복제수)을 피실험경력없는 키메라 마우스 내로 복강내 접종시켰고; 접종 후 제 4주에서 바이러스 적정값은 1.76 x 106 복제수/ml이었다. 이 마우스로부터 채취된 혈청(125 ㎕; 약 2.19 x 105 RNA 복제수)을 접종후 제 4 주에서 1.75 x 104 복제수/ml의 적정값을 발전시킨 제 2의 피실험경력 없는 키메라 마우스 내로 복강내 접종시켰다. 이 제 1 계대 수여자로 부터의 혈청(100 ㎕; 약 1.75 x 103 RNA 복제수)을 그 후 제 3의 피실험경력 없는 마우스 내로 접종시켰다. 접종 후 제 5주에서, 이 제 2의 계대 수여자는 3.42 x 106 복제수/ml의 바이러스 적정값을 가졌다. 만약 초기 인간 접종물이 지속하여 존재하고 복제는 일어나지 않는다는 무가치한 가설을 가정한다고 하면, 이 제 2의 계대 수여자는 초기 접종물로부터의 바이러스의 (마우스 혈청 부피를 약 1000 ㎕로 가정할 때, 4.75 x 105 바이러스 복제수 x 1:8 희석 x 1:10 희석) 약 6000 복제수를 받았을 것이고; 제 2의 계대 수여자는 원래의 인간 접종물로부터 받은 것보다 576 배 더 많이 측정되는 바이러스 RNA를 가졌다. 이 제 2 계대 수여자로 부터의 혈청(30 ㎕)을 두 마리의 피시험경력이 없는 추가적 마우스에 접종시켰고, 이들 둘 모두 그 후 HCV 감염을 발전시켰다(제 3 계대 수여자; 정량중). 세 세대의 계대 후 2 마리의 동물을 포함하여 모두 7 마리에서 일련의 전이가 지금까지 이루어졌다. 인간 → 마우스 → 마우스 → 마우스 → 마우스로의 이 전이는 HCV 게놈의 복제와 완전 감염성 입자의 생산 모두를 나타낸다.
이들 실험은 키메라 인간 간을 갖는 동형접합성 scid/Alb-uPA 마우스는 신규로 HCV 포지티브 인간 혈청으로 감염될 수 있고, 임상적으로 충분한 적정량으로 HCV 복제를 지지할 수 있고 이 감염을 다른 키메라 마우스에 전이시킬 수 있음을 나타낸다. 표준 상업적 분석에 의하여 용이하게 검출가능한 수준으로 바이러스 RNA 적정값의 신속한 증가를 나타내며, 바이러스 유전자형 1a, lb, 3a 및 6a으로 성공적인 감염이 달성되었다. Alb-uPA의 동형접합성은 바이러스 감염의 성공적 성취에 매우 중요하고, 도트 블롯 분석에 의한 이식편 기능의 조기 스크리닝과 연계하여 동형접합성을 수여자로 사용함으로써, HCV 감염은 일상적으로 모든 동물중에 약 75 %로 달성된다.
이식 방법은 기초적 마이크로수술 장비와 기술의 숙련을 요구한다. 우리의 손에서는 마취 유도 및 회복시간을 포함하여 이식은 동물당 5-6 분이 소요된다. 인 간 간세포에 대한 접근은 몇몇 연구자에 대하여는 제한적일 수 있지만, 우리 실험실에서 간 분리로부터의 수득은 평균 2-3 x 108 개의 생존가능한 인간세포이다. 과잉의 세포를 냉동보존할 수 있는 능력은 효율적 이용 뿐 아니라 인간 조직 접근이 없는 센터로의 수송을 허용한다. 냉동보존된 간세포를 이식한 후의 성공률은 감소되지만, 접종시 도트블롯 > 250 유니트인 동물의 약 50 %의 성공을 나타내며, 도트-블롯 혼성화로 이들 수여자를 사전스크리닝하는 것은 HCV 연구에서의 이들 의 효율적 이용을 허용한다.
실시예 5: 이식을 위한 세포 공급원으로서의 인간 탯줄 재대혈 세포
현재 논문에서, 인간 근간세포(stem cell)는 다중잠재성인 것으로 증명된다. 그것은 조건과 자극의 적절한 조합만 주어지면 조혈세포 뿐아니라 간세포로 재생성될 수 있는 능력을 가진다. 인간 근간세포는 NOD/SCID 마우스에서 조혈세포를 재구성시킬 수 있는 능력을 가지는 것으로 나타났다 (예를 들어, Bhatia et al. J Exp Med 186 (4) : 619-24 (1997) ; Bhatia et al Proc Natl Acad Sci U S A 94 (10) : 5320-5 (1997) ; Larochelle et al. Nat Med 2 (12) : 1329-37 (1996)참조). 그러나, 간 재구성에 대하여, 임상적 연구는 간을 재생시키기 위하여 소아 간모세포종에서 근간세포 이식을 사용하였다.
인간 재대혈은 근간세포의 풍부한 공급원이다. 또한, 그것은 신뢰성있게 냉동보존되어 왔고 세포 성질은 해동후에도 보존되었다. 인간 재대혈은 또한 훨씬 더 이용가능하다. 신선한 간 조직의 제한적 이용가능성 때문에 인간 간세포의 대안적 공급원은 본 발명의 동물 모델의 개발에 유용할 것이다. 우리의 SCID. bg/Alb-uPa 마우스 내로 이식된 세포는 생존가능한 인간 간세포로 재생성될 수 있다. 그 다음에, 그것은 이식되어 키메라 마우스/인간 간으로 발생될 수 있는 잠재성을 갖는다. 또한 세포는 우리의 SCID. bg/Alb-uPa의 면역 시스템을 재구성할 수 있다.
재료와 방법
여기에 기재된 프로토콜을 따라, SCID. bg/Alb-uPa 마우스가 인간 간세포로 10-14 일령에 이식된다. 인간 간세포 대신, 5백만 인간 재대혈 단핵세포(근간세포의 공급원)를 비장내 주사를 통하여 이식되었다. 이식후 4 주에서 도트 블롯을 통한, 인간 알부민의 존재에 대한 마우스 혈청 검사의 프로토콜이 여기에 기재된 바와 같이 이어진다.
또한, 면역 시스템 또한 재구성되었는지 결정하기 위하여, 림프구의 존재에 대하여 관찰하기 위하여 4 주령에서 말초혈 도말이 수행되었다. 제 8 주에서, 혈청을 ELISA를 통하여 인간 IgG의 존재여부에 대하여 시험하였고, FACS 분석으로 CD4+ 및 CD8+ 존재 여부에 대하여 시험한다. 만약 이들 세포가 존재하면, 이들 세포의 기능을 측정하기 위하여, PHA 자극을 수행할 것이다.
실시예 6. HCV로 감염된 Scid/uPA 마우스에서의 인터페론 α-2b의 처리
본 발명의 HCV 동물 모델은 후보 화학요법제의 항-HCV 활성에 대하여 스크리닝하기 위하여 사용될 수 있다. 인터페론 α-2b는 항-HCV 활성을 가지는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 본원발명의 HCV-감염 마우스를 재조합 인터페론 α-2b로 치료하는 것은 HCV RNA의 수준의 유의한 감소를 결과할 것이다.
방법과 재료:
동물: 콜라겐아제(Liberase HI, Boehringer Mannheim)에 의한 연속적 관류를 사용하여, 수술장으로부터 얻은 인간 간조직의 조각으로부터 인간 간세포를 분리하였다. 비장내 주사를 통하여 동형접합체 SCID/uPA 마우스를 10-15일령에서 0. 5 X 106 내지 1. 0 X 106 개의 신선한 인간 간세포로 이식시켰다. 이식 후 4주에서 채혈하고 정량적 도트 블롯을 사용하여 인간 알부민(HA) 농도에 대하여 분석하였다. > 200 ㎍/ml 의 HA를 나타내는 마우스는 성공적 이식편을 가진 것으로 간주되어 이 실험에 사용되었다.
HCV 감염: 이식후 제 8주에, 마우스에 유전자형 3의 HCV 포지티브 간 이식 환자로부터의 혈청 50 ㎕를 복강내 주사하였다. 혈청을 -70 ℃에서 저장하고 접종시에 해동시켰다. 환자혈청은 HCV RNA 수준 2.56 X 105 IU/ml을 나타내었다. 모든 HCV 정량은 Provincial Laboratory at the University of Alberta Hospital에서 Cobas Amplicor HCV Monitor version 2.0 (Roche Diagnostics)을 사용하여 수행하였다.
인터페론 투여: 마우스를 3 개의 처리군: 군 1 = 대조표준 (n=5), 군 2 = IFN 135 IU/g/d (n=1), 군 3 = 1350 IU/g/d (n=2)으로 나누었다. 처리는 HCV 접종 후 제 2 주에서 개시되었다. IFN(또는 일반적 식염수의 동등 부피)을 15 일간의 연속되는 날 동안 주사하였다. 처리의 개시시, 처리 종료시, 및 처리가 종결된 후 2 주 및 4주 후의 HCV RNA 수준 및 조직편 기능에 대하여 분석하기 위하여 채혈하였 다.
인간 간세포 이식을 받은 동물은, > 250 유니트의 인간 알부민 혈청에 대한 도트-블롯 분석에 의한 만족할만한 이식의 확인 후에, 유전자형 3의 HCV 인간 보균자로부터의 혈청 100 ㎕로 IP 주사시켰다. 이전의 연구가 HCV 복제수의 최대 절대상승을 나타낸 경우, 베이스라인 값은 바이러스 복제수/HCV 주사후 2주로부터의 ml 마우스 혈청이다. 인터페론 치료법은 135(n=1) 또는 1350(n=2) IU/그램 체중/일 의 투여량으로 세 마리의 동물에서 베이스라인에서 개시되었다. 제 2주에 인터페론 치료법의 종료시 RT-PCR로 HCV 적정이 있었고, 제 4주는 치료 2 주 후이다; 분석은 Roche Amplicor 키트를 사용하여 the Provincial Laboratory of Public Health of Alberta에서 수행하였다. 샘플을 블라인디드시키고 임상 분석으로부터의 인간 혈청 샘플과 혼합배치시켰다. 분석 감도는 600 IU/ml 또는 약 1.2 x 103 바이러스 복제수/ml이다. 결과는 하기 표 3에 나타낸다 (E는 지수값임을 나타냄).
Figure 112005025030346-pct00019
다섯 마리의 대조표준 미처리 마우스는 이 시간 기간동안에 걸쳐 HCV의 적정값의 증가를 나타내지만, 한마리는 안정된 수준을 보인다. 더 높은 투여량의 두마리는 바이러스 제거(ND = 검출되지 않음)를 나타내는 것 비롯하여, 모든 3 마리의 처리 동물은 바이러스 적정값이 감소하였다.
실시예 7: HBIg 투여에 의한 B형 간염 감염에 대한 수동 면역
여기에 기재된 HCV 모델은 구체적 예로서 SCID. bg/Alb-uPa 마우스인 면역기능저하 마우스의 키메라 마우스/인간 간의 존재에 기초한다. 이 모델은 C형 간염 바이러스의 복제를 지지할 뿐 아니라 B형 간염 감염 또한 지지한다. C형 간염에 대한 검증된 백신이 현재 없기 때문에, 백신화 시험에서 동물모델의 유효성을 시험하기 위하여 HBV-감염 마우스를 사용한다. HBV 바이러스에 대하여는 현재 수동 및 능동 면역 모두 존재한다.
B형 간염 면역글로불린(HBIg)은 B형 간염 표면 항원에 대하여 개발된 수동 백신이다. 그것은 포지티브 항-HBs 기증자로부터의 혈장을 수집하고 풀링함으로써 개발된다. 최종 결과는 높은 적정값의 항-HBs 제조이다. 임상적 조건에서, 이것은 적용성이 제한되는데 이는 1) 부분적으로 효능이 있고 2) 반감기가 짧고 3) 장기간 지속되는 면역에 의한 방해 때문이다. 그러나, 어떤 상황에서는, 유용한 것으로 확인되었다.
간 이식에서, HBIg 면역학적예방은 널리 사용되고 허용된다. B형 간염 포지티브 환자에서 HBV 이식후 재발률은 유의하게 감소함이 밝혀졌다. 결론적으로, 그것은 이식편과 환자 모두에서 이환률을 감소시킨다. 이식편의 간세포화 단계 동안 환자는 큰 볼루스 투약으로 치료된다. 치료는 1 년간 계속되고 투여량은 항HBs 항체 적정값에 의하여 결정된다. 바늘-막대 노출 후, HBIg의 투여는 HBV의 전이를 80 %의 경우에 방지하였다.
본 발명의 동물 모델은 백신 개발에서 사용될 수 있다. 백신 개발에서의 동물 모델의 유용성을 나타내는 대조표준으로서, HBV에 대한 이용가능한 검증된 면역학적예방 백신이 사용된다. B형 간염의 면역클로불린(HBIg)의 주사를 통하여, SCID. bg/Alb-uPa 마우스는 B형 간염의 후속되는 접종에 대한 수동면역을 얻을 것이고, 따라서 활발한 바이러스 감염을 막는다.
상기 강조된 바와 같이, HBV와 HCV는 유사한 바이러스가 아니다. 그러나, 현재 HCV에 대한 이용가능한 수동 면역요법이 없기 때문에, HBV와 HBIg의 사용은 HBV 감염에 대항한 효과적으로 알려진 면역요법제가 본원발명의 동물 모델에서 효과적임을 나타내주는 초기 스트리닝을 제공하며, 동물 모델이 실제로 수동 면역에 대한 가치있는 스크리닝 도구를 제공한다는 더 나아간 증거를 제공한다.
재료와 방법
상기 실시예에 기재된 프로토콜을 따라, SCID. bg/ALB-uPa 마우스를 10-14일령에 인간 간세포로 이식시킨다. 이식 후 제 4 주에, 마우스를 인간 알부민에 대한 도트 블롯에 의하여 시험한다. 그 후, 강한 신호를 가지는 동물을 실험에서 사용을 위하여 선택한다.
제 0 일: 8 주령에서, 실험군으로 분배된 마우스를 HBIg (lcc/kg)의 고투여량 근육내 주사를 받게하고 대조군은 일반 식염수의 주사를 받게 한다.
제 1 일: 모든 마우스를 100 ㎕의 고적정값 HBV 혈청으로 접종시킨다(복강내 주사).
제 1-14 일: 실험 마우스를 (간이식 환자에서의 것과 유사한 양인) 유지투여량인 0. 12cc/kg의 HBIg로 하루에 한번 처리한다. 대조표준 마우스는 일반 식염수 주사를 계속한다.
HBIg의 효과를 분석하기 위하여, HBV 적정값을 위하여 HBV 감염후 제 2, 4, 6, 8, 10 및 12 주에서 혈청 샘플을 얻는다. B형 감염 표면항원은 HBV 접종전에 제 1 일에 분석되고 감염 후 제 8 주에서 반복한다.
실시예 8: HCV 감염에서 면역반응을 분석하기 위한 면역 재구성 HCV 동물 모델의 사용
본 발명의 동물 모델은 HBV나 HCV로 감염된 자가 간세포의 문맥에서 인간 면역반응을 연구하기 위한 가치있는 도구를 제공한다. 인간 간세포를 운반하는 마우스는 자가 말초혈 단핵세포(PBMCs, 2-3 x 107 세포/마우스)로 면역-재구성될 수 있어, HBV와 HCV 감염의 모델 시스템을 제공하여 다음의 연구를 수행할 수 있다. 그 후 이 모델은 다음 예시적 방법을 따라 사용될 수 있다.
하기된 실험은 면역체계의 다양한 성분, 예를 들어 항원제시세포, 특정 사이토카인 및 T 세포의 핵심적 역할, 및 만성 간염 감염에서의 면역변형의 기초가 되는 기작에 대한 통찰을 제공할 수 있다. 이들 연구는 만성 간염 바이러스 감염의 면역요법에 대한 신규 전략과 신규 백신 후보의 고안과 관찰에 대한 기반을 제공할 수 있다. 이들 연구는 만성 간염 감염의 미래의 화학요법제적 및/또는 면역요법적 치료의 평가에 대한 임상전 모델로서의 마우스 모델 시스템 또한 확립할 것이다.
만성 HCV 감염에서 면역반응 및 변형의 평가
인간 간세포로 이식되고 자가 PBMCs로 재구성된 HCV 감염 마우스는 진행적 HCV 감염의 문맥에서 종합적 면역세포 역량 및/또는 면역억제를 평가하기 위하여 사용된다. 비장 또는 림프절 T 세포를 마우스로부터 얻어 시험관내 배양물로 확립시켜 분열촉진인자, 동종이형 APCs, 복합 Th 에피토프(예를 들어, 파상풍 독소, PADRE 펩티드 등)에 대한 반응을 시험하고 T 세포 증식 분석에 의하여 평가하는 경시적 연구가 수행된다. 동일한 배양물에서, 배양물 상청액의 사이토카인 분비 또는 세포내 생산이 시험된다. 또한, 이들 배양 세포에서, T 세포 활성화 마커를 유동세포계측에 의하여 시험한다. 이들 실험은 경시적 방식으로 수행되므로, T 세포는 마우스로부터 다양한 시점(감염후 및 PBMCs 재구성 후 제 1, 4, 8, 12, 16 주)에서 회수되고 상기한 바와 같이 그것의 폴리클론 자극에 대하여 시험된다. 각 시점에 HCV 바이러스 부하 또한 평가되어, 종합적 면역 반응이 바이러스 부하와 연관될 수 있다.
폴리클론 자극과 함께 기지의 보존적 HCV 복합 헬퍼 에피토프에 대한 T 세포 반응이 시험관내 시험되고, 그 자극은 경시적 실험에서의 바이러스 부하와 연관시킨다. 유사하게 B 세포가 동일한 시점에서 분리되고 폴리클론 B 세포 자극, 예를 들어, LPS, α-CD40 등과 함께 배양되며, 폴리클론 자극에 대하여 배양물 내에서의 사이토카인 분비 뿐 아니라 종합적 Ig 생산에 대하여 시험된다. 비감염, PBMC 재구 성 마우스는 대조표준으로 사용된다. 진행중인 HCV 감염에서 종합적 T 및 B 세포 능력 또한 평가될 수 있다.
대안으로, 감염 및 PBMCs 재구성 후 다양한 시점에서 복합 HCV 및 비-HCV Th 에피토프로 마우스를 생체내 항원자극시킨 후, 사이토카인 생산, 활성화 마커 발현 및 증식에 의하여 펩티드 반응성 T 세포의 시험이 이어진다. 다시, 이들 생체내 항원자극 실험에서, 종합적 T 세포 반응은 바이러스 부하, 감염으로부터 경과시간 등과 연관된다. 비면역화지만 면역-재구성되고 HCV 감염된 마우스로부터 얻어진 T 세포는 종합적 CD4/CD8 비, MHC 분자 및 다른 T 세포/활성화 분자에 대하여 평가되고 비감염, 면역재구성 마우스와 비교된다. 대안적 실험에서, 정상 인간 PBMCs를 HCV 감염 마우스로부터의 혈청의 존재하에서 폴리클론적으로 자극시키고 T 세포 반응의 어떤 변형에 대하여 시험된다. 이 실험에 이어, 어떤 관찰된 T 세포 반응 결핍의 생화학적 기초를 결정하기 위하여 다양한 TCR 분자의 포스포릴레이션, Ca2+ 운동성 등을 시험한다. 또한, 우리는 자극에 대하여 T 세포가 아폽토시스를 수행하는지 실험할 것이다.
만성 간염 바이러스 감염에서 사이토카인 및 면역조절 분자.
HCV 감염에 대한 다양한 사이토카인(유형 1 대 2)의 역할을 시험하기 위하여, HCV로 감염된 마우스로부터 혈청을 채취하고 PBMCs로 재구성하고, 유형 1 대 2 사이토카인 우세에 대하여 시험한다. 이들 실험은 사이토카인 생산과 HCV 바이러스 부하를 연관시키기 위하여 경시적 방식으로 수행되었고, 대조군인 비-감염 면역재 구성 마우스와 비교된다. 다른 한편, 주요 1 또는 2 유형 사이토카인, 예를들어, IL-2, γ-IFN, IL-4, IL-10 및 IL-12를 이들 마우스에 주사하거나 (항-사이토카인 항체를 주사함으로써) 제거하고, 바이러스 부하, 복합 HCV 및 비 HCV 펩티드에 대한 T 세포 반응 뿐 아니라 폴리클론 자극에 대한 그 효과가 평가되었다. 또한, 사이토카인 스위치의 진행, 사이토카인 생산 또는 변형의 결핍이 감염 직후 또는 장시간 후(즉, 마우스에서 2-3 개월)에 평가된다. 시험관내 실험에서, 특정 사이토카인의 첨가의 역할이 T 세포 반응에 대하여 시험관내 평가된다.
만성 HCV 감염에서 항원제시세포(수지상 세포, DCs) 및 보호적 면역반응을 제공하기 위한 DC 기능의 변형.
인간 만성 HCV 감염에서 수지상 세포 기능이 손상된다는 것을 시사하는 몇몇 증거가 있다. 수지상 세포(DCs)는 효과적 면역을 유도하는 CD4+ T 세포의 가장 유력한 자극원이다. 그러므로, HCV 감염의 문맥에서 DC 기능의 시험은 HCV 감염에 대한 면역반응을 이해하는데 필수적이다.
HCV 감염 PBL 재구성 마우스로부터, 비장 또는 혈로부터 단핵구를 분리하여 GM-CSF 및 IL-4와 함께 배양하여 비성숙 DCs를 제조한다. 이들 비성숙 DCs는 γ-IFN, α-IFN, LPS 또는 α-CD40의 존재하에서 성숙되고, 유동세포계측에 의하여 DC 활성화 마커의 발현에 대하여, 상청액에서의 IL-12 생산에 대하여 및 자가 T 세포에 대한 동종이형 T 세포 및 HCV 복합 Th 에피토프 제시를 자극하는 능력에 대하여 시험된다. 이들 실험은 경시적 방식으로 수행되고, DC 기능의 변화의 진행은 시간과 HCV 바이러스 부하라는 인자로서 시험된다.
추가적 실험에서, HCV 감염을 운반하고 인간 PBMCs로 재구성된 마우스를 시험관내 활성화 성숙 DCs로 주사하고, T 세포 반응과 바이러스 부하에 대하여 시험한다.
HCV 감염에서 복합 인간 헬퍼 및 CTL 에피토프의 면역화
Th 및 세포장해 T 세포(CTL) 반응을 보고하는 다수의 연구에서, HCV 보존적 영역으로부터 다수의 복합 Th 및 CTL 에피토프가 시험관내 동정되었고, 이는 Th 및 CTL 초회(初回)항원자극이 HCV 감염된 개체에서 발생함을 시사한다. 그러나, 명백하게 이 진행중인 자연적 T 세포 반응은 그 자체만으로 바이러스 감염 및/또는 복제를 제거시키기에 충분하지 않다. 본 발명의 동물 모델은 강한 면역 반응을 일으키기 위한 기지의 복합 Th 및 CTL 에피토프를 사용하여 (하기 열거된) 다양한 면역 전략을 평가하는데 사용될 수 있다. 면역화 후에 마우스는 Th 및 CTL 세포 반응의 생성에 대하여 평가된다. 동시에, 바이러스 부하가 평가된다. 그러므로, 동물 모델은 HCV 감염에 대항한 면역성을 제공하기 위하여 Th 및 CTL 반응의 적당한 변형을 결정하는데 사용될 수 있다.
항원으로의 면역화는 미립분자 제제, 예를 들어, 리포솜; 변형된 항원 펩티드, 예를 들어, 지질화된 펩티드; 특정 아주반트 또는 첨가제로서 아주반트 및 사이토카인 제제; 항원으로 부하된 수지상 세포; DNA 매개 면역화; 시험관내에서 확장된 항원 특이적 T 세포로의 T 세포 채용 치료법 등의 문맥에서 시험될 수 있다.
HBV 및 HCV의 구조 및 비-구조 단백질로부터 유래한 합성 펩티드(또는 변형된 리포펩티드)의 면역원성
HCV 만성 보균자에서 진행중인 HCV 감염을 해소하는 것의 실패에 대한 대안적 가설은 이들 에피토프에 대한 Th 및 CTL 반응이 실제로 바이러스 복제를 억제시키거나 바이러스 감염 세포를 제거할 수 없고, 방어적 면역을 생성시키기 위하여는 다른 에피토프 결정인자가 필수적이라는 증거에 촛점을 맞춘다. HCV 폴리단백질에 대한 신규의 T세포 에피토프를 결정하기 위하여, 보존적인 구조적 및 기능적 바이러스 단백질로부터의 잠재적 Th 및 CTL 에피토프를 동정하기 위하여 최초의 인터넷이용(in silico) 연구가 수행되었다. 이들 동정된 에피토프는 그 후, 면역요법 백신 후보라는 것을 나타내는 강한 T 세포 반응을 생성시킬 수 있는 능력에 대하여, 본 발명의 재구성 동물 모델에서 변형되고 평가된다.
조합 치료적 접근(항원-기초 백신 및 바이러스 복제를 억제하고/또는 면역변형을 유도하는 소분자)의 시험
이 접근법은 만성 HCV 감염에서 면역반응을 고려하고, 소분자는 바이러스 복제의 억제 및/또는 면역변형의 활성을 가지는, 항원-기초 치료와 소분자-기초 치료의 조합의 이점을 취한 항-바이러스 치료제를 동정하기 위하여 본 발명의 재구성된 동물 모델을 사용한다. 바이러스 복제의 억제 또는 바이러스 제거에 효과적인 억제를 제공하는 조합이, 상기된 바와 같이 HCV 감염, 면역 재구성 동물을 사용하여 동정된다. HCV 감염을 억제하고/또는 제거하기 위한 효과적 면역을 제공하기 위하여 (IL-2 또는 리포솜 IL-2 같은) 사이토카인과 조합에서 백신 후보를 평가한다.
실시예 9 고지혈증에 대한 치료법의 평가를 위한 모델의 사용
상기한 바와 같이, Apo B 100은 고지혈증으로부터의 결과인 죽상경화증의 위 험에 대한 당업계-수용 마커이다. 고지혈증에 대항하는 활성을 가진 약제에 대한 스크리닝에서의 본 발명의 마우스 모델의 용도를 평가하기 위하여, 인간 Apo B100에 특이적인 마우스 단일클론 항체를 사용하여, 이식된 인간 세포에 의한 인간 Apo B100 생산을 검출하였다. 혈청 샘플은 키메라 Alb/uPA 이식 동물 및 Alb/uPA 비이식 동물(네거티브 대조표준)로부터 수집되었다. 인간 혈청은 포지티브 대조표준 역할을 하였다. 혈청은 당업계 주지의 방법에 따라 항-Apo B100 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, Apo B100에 결합하는 항체 비-이식 대조표준 동물(레인 3)에서는 검출되지 않았지만, 인간 혈청 포지티브 대조표준(레인 1) 및 키메라 Alb/uPA 이식 동물(레인 2)에서는 항원결합이 검출되었다. 이들 데이터는 지속적 인간 키메라성을 갖는 Alb/uPA 마우스 간은 인간 apo B100을 분비한다는 것을 나타낸다. 이 관찰결과는 Alb/uPA 마우스 모델이 간으로부터의 apo B100의 양을 감소시키는 선택적 치료의 개발에 대한 기초를 제공할 수 있고, 결과적으로 심혈관 질환 및 죽상경화증에 의한 뇌졸증의 위험을 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명은 그것의 구체적 구체예에 대한 참고문헌과 함께 기재되었지만, 본 발명의 요지와 범위에서 벗어나지 않고 당업계 숙련자에 의하여 다양한 변화가 이루어질 수 있고 균등물이 대체될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 특수 조건, 재료, 조성물, 방법, 방법의 단계를 본 발명의 목적, 요지 및 범위에 적용하기 위하여 다수의 변형이 이루어질 수 있다. 모든 이와 같은 변형은 여기에 첨부된 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
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Claims (26)

  1. 인간 C형 간염 바이러스(HCV)로 감염된 키메라 트랜스제닉 마우스 숙주로서,
    우로키나제형 플라스미노겐 활성제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈을 갖으며, 폴리뉴클레오티드는 숙주 마우스 간세포에서 폴리펩티드가 발현되도록 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 면역결핍, 트랜스제닉 마우스; 및
    마우스 숙주 간에 이식된 인간 간세포를 포함하는 키메라 간을 포함하며,
    키메라 마우스 숙주에의 인간 HCV의 접종은 마우스 숙주의 HCV 감염을 초래하며, 숙주는 폴리뉴클레오티드에 대하여 동형접합성인 것을 특징으로 하는 키메라 트랜스제닉 마우스 숙주.
  2. 제 1 항에 있어서, 인간의 간세포는 키메라 간의 적어도 20 %의 간세포를 구성하는 것을 특징으로 하는 키메라 마우스 숙주.
  3. 제 1 항에 있어서, 인간의 간세포는 적어도 15 주 동안 기능하는 것을 특징으로 하는 키메라 마우스 숙주.
  4. 제 1 항에 있어서, 숙주는 간세포 이식 후에 인간의 C형 간염 바이러스로 감염되는 것을 특징으로 하는 키메라 마우스 숙주.
  5. 제 4 항에 있어서, 감염된 숙주는 적어도 103 바이러스 입자/mL 혈청을 생산하는 것을 특징으로 하는 키메라 마우스 숙주.
  6. 제 4 항에 있어서, 감염된 숙주는 적어도 15주의 기간 동안 일정하게 검출가능한 HCV 감염을 유지하는 것을 특징으로 하는 키메라 마우스 숙주.
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서, 프로모터는 마우스 알부민 프로모터인 것을 특징으로 하는 키메라 마우스 숙주.
  9. 제 1 항에 있어서, B 및 T 림프구의 결핍은 면역글로불린 및 T 세포 리셉터 유전자 재배열에서의 유전적 결함에 의해 초래되는 것을 특징으로 하는 키메라 마우스 숙주.
  10. 제 1 항에 있어서, 숙주 면역결핍은 scid 돌연변이에 의해 야기되는 것을 특징으로 하는 키메라 마우스 숙주.
  11. 인간의 간세포를 우로키나제형 플라스미노겐 활성제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈을 갖으며, 폴리뉴클레오티드는 숙주 마우스 간세포에서 폴리펩티드가 발현되도록 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 면역기능저하, 트랜스제닉 마우스 숙주 내로 이식시키는 단계; 및
    숙주에 인간의 HCV를 접종하는 단계를 포함하는
    인간의 C형 간염 바이러스(HCV)로 감염된 키메라 트랜스제닉 마우스 숙주를 생산하는 방법에 있어서,
    인간-마우스 키메라 간을 포함하고, 인간의 HCV 감염을 가지는 키메라 트랜스제닉 마우스 숙주가 생산되며, 숙주는 폴리뉴클레오티드에 대하여 동형접합성인 것을 특징으로 하는, 키메라 트랜스제닉 마우스 숙주를 생산하는 방법.
  12. 제 11 항의 방법으로 생산된 키메라 트랜스제닉 마우스 숙주.
  13. 제 1 항 또는 제 11 항의 키메라 트랜스제닉 마우스 숙주에 인간의 HCV를 투여하는 단계; 및
    숙주에서 인간의 HCV 복제 후에 감염된 숙주로부터 인간의 HCV를 분리하는 단계를 포함하는, 인간의 C형 간염 바이러스(HCV)를 배양하는 방법.
  14. 제 1 항 또는 제 11 항의 키메라 트랜스제닉 마우스 숙주에 후보 약제를 투여하는 단계; 및
    HCV 감염에 대한 후보 약제의 효과를 분석하는 단계를 포함하는, 향간성 병원체에 대항한 활성에 대하여 후보 약제를 스크리닝하는 방법에 있어서,
    비치료 키메라 트랜스제닉 마우스 숙주 또는 후보 약제투여 전의 키메라 트랜스제닉 마우스 숙주에서의 감염성 부하에 비하여, 인간 HCV의 감염성 부하가 감소하는 것이 약제의 항-HCV 활성의 지표가 되는 것을 특징으로 하는, 후보 약제를 스크리닝하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 후보 약제는 인간의 HCV로 감염되기 전에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 후보 약제는 활성 면역요법용 후보 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 14 항에 있어서, 후보 약제는 치료용 예방접종을 위한 후보 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 14 항에 있어서, 후보약제는 면역치료제인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 면역치료제는 항-HCV 항체 또는 그것의 HCV-결합 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항 또는 제 11 항의 키메라 트랜스제닉 마우스 숙주에 후보 약제를 투여하는 단계; 및
    혈청 apoB100 지방단백질에 대한 후보 약제의 효과를 분석하는 단계로 이루어지는, 혈지질 감소 획득에 활성이 있는 후보 약제를 스크리닝하는 방법에 있어서;
    후보 약제 투여전의 apoB 100 수준에 비하여 후보 약제 투여 후에 감소된 apoB 100 수준이 검출되는 것이 후보 약제가 혈지질 감소 활성을 가진다는 것의 지표가 되는 것을 특징으로 하는, 후보 약제를 스크리닝하는 방법.
  21. 키메라 면역결핍 트랜스제닉 마우스 숙주에 후보 약제를 투여하는 단계로서, 여기서 숙주는 a) 기능하는 동종 B 및 T 림프구가 결핍되고, b) 우로키나제형 플라스미노겐 활성제 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 통합 폴리뉴클레오티드를 갖으며, 폴리뉴클레오티드는 숙주 마우스 간세포에서 폴리펩티드가 발현되도록 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있으며, 숙주는 폴리뉴클레오티드에 대하여 동형접합성이고, 그리고 c) 숙주의 간에 이식된 인간의 간세포를 가지는 것을 특징으로 하는 단계; 및
    간 기능 또는 간 조직에 대한 후보 약제의 효과를 분석하는 단계를 포함하는, 약제의 간 독성을 평가하는 방법에 있어서;
    비치료 키메라 마우스 숙주 또는 후보 약제 투여전의 간 기능 또는 조직학에 비하여, 치료된 숙주에서의 간 기능의 감소 또는 조직병리학에서의 불리한 변형이, 약제가 간세포에 대하여 독성임의 지표가 되는 것을 특징으로 하는, 간 독성을 평가하는 방법.
  22. 인간 C형 간염 바이러스(HCV) 감염을 받을 수 있는 키메라 트랜스제닉 마우스로서,
    우로키나제형 플라스미노겐 활성제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈을 갖으며, 폴리뉴클레오티드는 마우스 간세포에서 폴리펩티드가 발현되도록 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 면역결핍 마우스; 및
    마우스 간에 이식된 인간 간세포를 포함하는 키메라 간을 포함하며,
    키메라 마우스에의 인간 HCV의 접종은 마우스의 HCV 감염을 초래하며, 마우스는 폴리뉴클레오티드에 대하여 동형접합성인 것을 특징으로 하는 키메라 트랜스제닉 마우스.
  23. 제 22 항에 있어서, 프로모터는 알부민 프로모터인 것을 특징으로 하는 키메라 트랜스제닉 마우스.
  24. 제 22 항에 있어서, 사람 간세포는 마우스 간으로 이식되기 전에는 검출가능한 HCV를 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 키메라 트랜스제닉 마우스.
  25. 인간 C형 간염 바이러스(HCV)로 감염된 키메라 트랜스제닉 마우스로서,
    우로키나제형 플라스미노겐 활성제 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈을 갖으며, 폴리뉴클레오티드는 마우스 간세포에서 폴리펩티드가 발현되도록 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 면역결핍 마우스; 및
    마우스 간에 이식된 인간 간세포를 포함하는 키메라 간을 포함하며,
    키메라 마우스에의 인간 HCV의 접종은 마우스의 HCV 감염을 초래하여 감염된 마우스는 적어도 104 바이러스 복제수/mL 혈청을 생산하고, 마우스는 폴리뉴클레오티드에 대하여 동형접합성인 것을 특징으로 하는 키메라 트랜스제닉 마우스.
  26. 제 25 항에 있어서, 감염된 마우스는 적어도 105 바이러스 복제수/mL 혈청을 생산하는 것을 특징으로 하는 키메라 트랜스제닉 마우스.
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