JP2002045087A - キメラ動物 - Google Patents
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- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトを含めた異種動物由来の肝細胞からなる
肝臓を有するキメラ動物と、このキメラ動物を用いた試
験方法を提供する。 【解決手段】 異種動物由来の肝細胞の集団を体内に有
し、この肝細胞集団が実質的に動物の肝機能を担ってい
ることを特徴とするキメラ動物と、このキメラ動物を用
いて、被験物質の毒性、肝臓における代謝、肝機能障害
に対する予防並びに治療効果を試験する方法。
肝臓を有するキメラ動物と、このキメラ動物を用いた試
験方法を提供する。 【解決手段】 異種動物由来の肝細胞の集団を体内に有
し、この肝細胞集団が実質的に動物の肝機能を担ってい
ることを特徴とするキメラ動物と、このキメラ動物を用
いて、被験物質の毒性、肝臓における代謝、肝機能障害
に対する予防並びに治療効果を試験する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、異種動物
由来の肝細胞集団を体内に有するキメラ動物と、このキ
メラ動物を用いた各種試験方法に関するものである。
由来の肝細胞集団を体内に有するキメラ動物と、このキ
メラ動物を用いた各種試験方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】肝臓は脊椎動物において消化管に付随す
る体中最大の腺性器官であり、(i)栄養に関係の深い中
間代謝、(ii)胆液の生産、(iii)血液成分の生成・変
換、(iv)解毒と異物除去、(v)発熱、など多種多様な機
能を有する重要な臓器である。
る体中最大の腺性器官であり、(i)栄養に関係の深い中
間代謝、(ii)胆液の生産、(iii)血液成分の生成・変
換、(iv)解毒と異物除去、(v)発熱、など多種多様な機
能を有する重要な臓器である。
【０００３】体内に取り込まれた物質の多くはまず肝臓
で代謝される。したがって医薬品開発の領域では、医薬
品候補物資が肝臓でどのような代謝を受け、あるいは肝
機能にどのような影響を与えるかは必須のデータであ
る。さらに、今日までに数多くの化学物質が合成されか
つ環境へも放出されているが、これらの物質の一つ一つ
がそれぞれに、あるいは複合してヒトにどのような障害
を及ぼすかを解明することは、社会的にも非常に重要な
問題となっている。このような化学物質の人体への影響
を評価する際にも、肝機能に対する毒性試験等が必要と
れている。
で代謝される。したがって医薬品開発の領域では、医薬
品候補物資が肝臓でどのような代謝を受け、あるいは肝
機能にどのような影響を与えるかは必須のデータであ
る。さらに、今日までに数多くの化学物質が合成されか
つ環境へも放出されているが、これらの物質の一つ一つ
がそれぞれに、あるいは複合してヒトにどのような障害
を及ぼすかを解明することは、社会的にも非常に重要な
問題となっている。このような化学物質の人体への影響
を評価する際にも、肝機能に対する毒性試験等が必要と
れている。
【０００４】医薬品候補物質をはじめとする化学物質や
自然界に存在する物質の毒性試験・安全性試験等には、
現在のところマウス、ウサギ、イヌ、チンパンジー等の
哺乳動物が使われている。特に医薬品開発ではヒトを対
象とする第一相試験へ入る前に、動物を用いた毒性試験
・安全性試験が義務づけられているが、これには多大の
時間と労力を必要とし、投資額も莫大なものとなってい
る。
自然界に存在する物質の毒性試験・安全性試験等には、
現在のところマウス、ウサギ、イヌ、チンパンジー等の
哺乳動物が使われている。特に医薬品開発ではヒトを対
象とする第一相試験へ入る前に、動物を用いた毒性試験
・安全性試験が義務づけられているが、これには多大の
時間と労力を必要とし、投資額も莫大なものとなってい
る。
【０００５】さらに、ヒトの肝炎ウイルスや肝臓疾患に
関わる研究を霊長類を除く他の動物で代替する事は不可
能である。
関わる研究を霊長類を除く他の動物で代替する事は不可
能である。
【０００６】また肝臓に遺伝的疾患を持つ病態モデルマ
ウスを作出する方法として、従来トランスジェニック法
やノックアウト法が用いられてきた。しかしながら、こ
れらの方法は大変に煩雑なステップを必要とし、しかも
目的の病態モデルマウスを確実に作製できる保証はな
い。
ウスを作出する方法として、従来トランスジェニック法
やノックアウト法が用いられてきた。しかしながら、こ
れらの方法は大変に煩雑なステップを必要とし、しかも
目的の病態モデルマウスを確実に作製できる保証はな
い。
【０００７】さらにまた、多くの分野で動物実験が行わ
れているが、これらの動物実験で得られる毒性試験や安
全性試験等に関するデータがそのままヒトに適用できる
保証は無い。事実、動物実験では毒性の認められなかっ
た物質がヒトに対して毒性を示す例は多い。当然なが
ら、その逆もありうる。すなわち動物実験で毒性が強い
ために、臨床試験にまで進められることなく開発中止と
なった医薬品候補物質もかなりあるものと予想される。
れているが、これらの動物実験で得られる毒性試験や安
全性試験等に関するデータがそのままヒトに適用できる
保証は無い。事実、動物実験では毒性の認められなかっ
た物質がヒトに対して毒性を示す例は多い。当然なが
ら、その逆もありうる。すなわち動物実験で毒性が強い
ために、臨床試験にまで進められることなく開発中止と
なった医薬品候補物質もかなりあるものと予想される。
【０００８】なお、比較的ヒトに近いとされているチン
パンジー等の類人猿が実験に供される場合もあるが、こ
れらは希少動物であると同時に非常に高価なために、大
量のサンプルを検査するには不適である。
パンジー等の類人猿が実験に供される場合もあるが、こ
れらは希少動物であると同時に非常に高価なために、大
量のサンプルを検査するには不適である。
【０００９】このような問題を解決することを目的とし
て、ヒトの培養肝細胞を用いたin vitroの実験系が考案
されており、一次スクリーニングとしては有用な手段に
なると考えられている。しかしながら培養細胞は、生体
内にある肝臓と全ての点において同等の機能を備えてい
る訳ではないことから、in vitro実験系からは信頼性の
高いデータは期待できないのが実状である。
て、ヒトの培養肝細胞を用いたin vitroの実験系が考案
されており、一次スクリーニングとしては有用な手段に
なると考えられている。しかしながら培養細胞は、生体
内にある肝臓と全ての点において同等の機能を備えてい
る訳ではないことから、in vitro実験系からは信頼性の
高いデータは期待できないのが実状である。
【００１０】一方、Rhimらは、アルブミンのプロモータ
およびエンハンサー領域とu-PA（urokinase-type plasm
inogen activator）の融合遺伝子を導入したトランスジ
ェニックマウス（uPA-Tgマウス）を作製した。このマウ
スは肝細胞でのみu-PAが発現し、肝細胞が傷害を受ける
ため、２倍体染色体の両方に導入遺伝子を有するホモ接
合型のトランスジェニックマウスは、肝細胞の死滅によ
って、生後３〜６週で死に至る。このような肝障害マウ
スに正常なマウスの肝細胞を移植すると、ほとんどが正
常肝細胞に置き換わる（Rhim et.al., Replacement of
diseased mouseliver by hepatic cell transplantatio
n, Science, 263, 1149 (1994)）。ただし、uPA-Tgマウ
スの免疫機能は正常なため、ヒト肝細胞を含めた異種動
物由来の肝細胞は拒絶される。そこで、Petersenらは、
免疫不全マウスと肝障害マウスを掛け合わせて免疫不全
肝障害マウス（uPA(+/-)/RAG-2(+/+)）を作出し、この
マウスに成人の肝細胞を移植した。その結果、ヒト肝細
胞がuPA(+/-)/RAG-2(+/+)の肝臓に生着してマウス肝臓
の15％がヒト肝細胞に置き換わるとともに、このマウス
はヒトB型肝炎ウイルスを保持したと報告している（Hep
atology, Vol.30,No.4, Pt.2, 1050, 1999、Dandri M,B
urda M.R., Torok B, Pollok J.M., Iwanska A., Somme
r G., Rogiers X., RoglerC.E., Gupta S., Will H., G
reten H.,and Petersen J. Repopulation of mouselive
r with human hepatocytes and in vivo infection wit
h hepatitis B virus.Hepatology 33:981-988, 200
1）。しかしながらこの場合、uPA(+/-)/RAG-2(+/+)マウ
スにおけるヒト肝細胞への置換率は15%に過ぎず、移植
したヒト肝細胞がマウス個体内で正常な肝機能を発揮す
る細胞集団にまで増殖していない。
およびエンハンサー領域とu-PA（urokinase-type plasm
inogen activator）の融合遺伝子を導入したトランスジ
ェニックマウス（uPA-Tgマウス）を作製した。このマウ
スは肝細胞でのみu-PAが発現し、肝細胞が傷害を受ける
ため、２倍体染色体の両方に導入遺伝子を有するホモ接
合型のトランスジェニックマウスは、肝細胞の死滅によ
って、生後３〜６週で死に至る。このような肝障害マウ
スに正常なマウスの肝細胞を移植すると、ほとんどが正
常肝細胞に置き換わる（Rhim et.al., Replacement of
diseased mouseliver by hepatic cell transplantatio
n, Science, 263, 1149 (1994)）。ただし、uPA-Tgマウ
スの免疫機能は正常なため、ヒト肝細胞を含めた異種動
物由来の肝細胞は拒絶される。そこで、Petersenらは、
免疫不全マウスと肝障害マウスを掛け合わせて免疫不全
肝障害マウス（uPA(+/-)/RAG-2(+/+)）を作出し、この
マウスに成人の肝細胞を移植した。その結果、ヒト肝細
胞がuPA(+/-)/RAG-2(+/+)の肝臓に生着してマウス肝臓
の15％がヒト肝細胞に置き換わるとともに、このマウス
はヒトB型肝炎ウイルスを保持したと報告している（Hep
atology, Vol.30,No.4, Pt.2, 1050, 1999、Dandri M,B
urda M.R., Torok B, Pollok J.M., Iwanska A., Somme
r G., Rogiers X., RoglerC.E., Gupta S., Will H., G
reten H.,and Petersen J. Repopulation of mouselive
r with human hepatocytes and in vivo infection wit
h hepatitis B virus.Hepatology 33:981-988, 200
1）。しかしながらこの場合、uPA(+/-)/RAG-2(+/+)マウ
スにおけるヒト肝細胞への置換率は15%に過ぎず、移植
したヒト肝細胞がマウス個体内で正常な肝機能を発揮す
る細胞集団にまで増殖していない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】前記のとおり、医薬品
や化学物質の薬効、毒性試験等においては動物個体を用
いたin vivo評価系が不可欠であるが、医薬品や化学物
質の肝臓での代謝や肝機能の影響を調べるためには、動
物実験ではヒト肝細胞に対する医薬品や化学物質の効果
を正しく評価することはできない。また、培養ヒト肝細
胞を用いたin vitroの実験系の場合には、生体内の肝細
胞に対する医薬品や化学物質の効果を正確に評価するこ
とは困難である。
や化学物質の薬効、毒性試験等においては動物個体を用
いたin vivo評価系が不可欠であるが、医薬品や化学物
質の肝臓での代謝や肝機能の影響を調べるためには、動
物実験ではヒト肝細胞に対する医薬品や化学物質の効果
を正しく評価することはできない。また、培養ヒト肝細
胞を用いたin vitroの実験系の場合には、生体内の肝細
胞に対する医薬品や化学物質の効果を正確に評価するこ
とは困難である。
【００１２】そこで、前記のとおり、ヒト肝細胞を移植
したキメラマウス（前記Petersen文献）が知られている
が、このマウスの場合には、移植した肝細胞が正常な肝
機能を発揮する細胞集団にまで増殖しないため、ヒト肝
細胞に対する医薬品や化学物質の効果を評価するための
動物モデルとなり得ていない。
したキメラマウス（前記Petersen文献）が知られている
が、このマウスの場合には、移植した肝細胞が正常な肝
機能を発揮する細胞集団にまで増殖しないため、ヒト肝
細胞に対する医薬品や化学物質の効果を評価するための
動物モデルとなり得ていない。
【００１３】この出願の発明は、以上のとおりの事情に
鑑みてなされたものであって、異種動物由来の肝細胞か
らなる肝臓を有するキメラ動物を提供することを課題と
している。
鑑みてなされたものであって、異種動物由来の肝細胞か
らなる肝臓を有するキメラ動物を提供することを課題と
している。
【００１４】また、この出願の発明は、このキメラ動物
を用いた各種試験方法を提供することを課題としてもい
る。
を用いた各種試験方法を提供することを課題としてもい
る。
【００１５】
【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決するための発明として、異種動物由来の肝細胞の
集団を体内に有し、この肝細胞集団が実質的に動物の肝
機能を担っていることを特徴とするキメラ動物を提供す
る。
を解決するための発明として、異種動物由来の肝細胞の
集団を体内に有し、この肝細胞集団が実質的に動物の肝
機能を担っていることを特徴とするキメラ動物を提供す
る。
【００１６】このキメラ動物は、異種動物由来の肝細胞
がヒト肝細胞であること、異種動物由来の肝細胞が増殖
能を有する小型肝細胞であること、およびレシピエント
がマウス由来であることをそれぞれ好ましい態様として
いる。
がヒト肝細胞であること、異種動物由来の肝細胞が増殖
能を有する小型肝細胞であること、およびレシピエント
がマウス由来であることをそれぞれ好ましい態様として
いる。
【００１７】この発明は、また、前記のキメラ動物に被
験物質を投与し、この投与物質の肝細胞に対する毒性を
評価することを特徴とする試験方法を提供する。
験物質を投与し、この投与物質の肝細胞に対する毒性を
評価することを特徴とする試験方法を提供する。
【００１８】さらにこの発明は、前記のキメラ動物に被
験物質を投与し、この投与物質に対する肝細胞の代謝能
を評価することを特徴とする試験方法を提供する。
験物質を投与し、この投与物質に対する肝細胞の代謝能
を評価することを特徴とする試験方法を提供する。
【００１９】またさらにこの発明は、前記のキメラ動物
に、人為的に肝機能障害を発症させた後、被験物質を投
与し、この投与物質の肝機能障害に対する治療効果を評
価することを特徴とする試験方法を提供する。
に、人為的に肝機能障害を発症させた後、被験物質を投
与し、この投与物質の肝機能障害に対する治療効果を評
価することを特徴とする試験方法を提供する。
【００２０】またこの発明は、さらに、前記のキメラ動
物に被験物質を投与した後、この動物に人為的に肝機能
障害を発症させ、投与物質の肝機能障害に対する予防効
果を評価することを特徴とする試験方法を提供する。
物に被験物質を投与した後、この動物に人為的に肝機能
障害を発症させ、投与物質の肝機能障害に対する予防効
果を評価することを特徴とする試験方法を提供する。
【００２１】
【発明の実施の形態】この発明のキメラ動物は、異種動
物由来の肝細胞の集団を体内に有し、この肝細胞集団が
実質的に異種動物の肝機能を担っていることを特徴とす
る。このキメラ動物において、レシピエントとなる動物
は、その動物本来の肝細胞が障害を受けている「肝障害
動物」であり、かつ、異種動物由来の肝細胞に対して拒
絶反応を示さない「免疫不全動物」である（以下、免疫
不全肝障害動物と記載することがある）。肝障害動物と
しては、公知の肝障害誘発物質（例えば、四塩化炭素、
D-ガラクトサミン、2-アセチルアミノフルオレン、ピロ
ロジンアルカロイドなど）によって処理された動物、あ
るいは外科的な肝切除によって肝再生を誘発した動物等
を用いることができる。また、前記Rhimら（Science, 2
63, 1149 (1994)）が作成したuPA-Tgマウスと同様のト
ランスジェニック動物を用いることもできる。また、免
疫不全動物は、例えば、免疫抑制剤の投与などの手段に
よって作製することができる。あるいは、遺伝的に免疫
不全である動物［例えば、免疫不全マウス（SCID：seve
re combined immunodeficiency disease；重症複合免疫
不全症マウス）］等を用いることもできる。
物由来の肝細胞の集団を体内に有し、この肝細胞集団が
実質的に異種動物の肝機能を担っていることを特徴とす
る。このキメラ動物において、レシピエントとなる動物
は、その動物本来の肝細胞が障害を受けている「肝障害
動物」であり、かつ、異種動物由来の肝細胞に対して拒
絶反応を示さない「免疫不全動物」である（以下、免疫
不全肝障害動物と記載することがある）。肝障害動物と
しては、公知の肝障害誘発物質（例えば、四塩化炭素、
D-ガラクトサミン、2-アセチルアミノフルオレン、ピロ
ロジンアルカロイドなど）によって処理された動物、あ
るいは外科的な肝切除によって肝再生を誘発した動物等
を用いることができる。また、前記Rhimら（Science, 2
63, 1149 (1994)）が作成したuPA-Tgマウスと同様のト
ランスジェニック動物を用いることもできる。また、免
疫不全動物は、例えば、免疫抑制剤の投与などの手段に
よって作製することができる。あるいは、遺伝的に免疫
不全である動物［例えば、免疫不全マウス（SCID：seve
re combined immunodeficiency disease；重症複合免疫
不全症マウス）］等を用いることもできる。
【００２２】従って、この発明のキメラ動物における免
疫不全肝障害動物は、前記の肝障害誘発処置と免疫不全
処置とを同一個体に施すことによって作製することがで
きる。あるいは、遺伝的に肝障害を有する動物（トラン
スジェニック動物）と遺伝的に免疫不全である動物とを
交配させて、その子孫動物を免疫不全肝障害動物として
用いることもできる。
疫不全肝障害動物は、前記の肝障害誘発処置と免疫不全
処置とを同一個体に施すことによって作製することがで
きる。あるいは、遺伝的に肝障害を有する動物（トラン
スジェニック動物）と遺伝的に免疫不全である動物とを
交配させて、その子孫動物を免疫不全肝障害動物として
用いることもできる。
【００２３】そして、この発明のキメラ動物は、レシピ
エントとしての免疫不全肝障害動物に、異種動物由来の
肝細胞を移植し、この移植肝細胞をレシピエントの体内
で増殖させることによって作出することができる。レシ
ピエントの本来の肝細胞は、肝障害によって死滅もしく
はその機能を喪失しているため、このキメラ動物の肝機
能は、移植された肝細胞の集団によって実質的に担われ
ていることになる。
エントとしての免疫不全肝障害動物に、異種動物由来の
肝細胞を移植し、この移植肝細胞をレシピエントの体内
で増殖させることによって作出することができる。レシ
ピエントの本来の肝細胞は、肝障害によって死滅もしく
はその機能を喪失しているため、このキメラ動物の肝機
能は、移植された肝細胞の集団によって実質的に担われ
ていることになる。
【００２４】異種動物由来の肝細胞をレシピエント動物
に移植するには、実施例に示したように、レシピエント
の脾臓を経由して肝臓へ移植することができる。また、
直接門脈から移植することも可能である。なお、移植し
た肝細胞が肝機能を保持していればよく、移植肝細胞が
生着する場所が肝臓である必要はない。
に移植するには、実施例に示したように、レシピエント
の脾臓を経由して肝臓へ移植することができる。また、
直接門脈から移植することも可能である。なお、移植し
た肝細胞が肝機能を保持していればよく、移植肝細胞が
生着する場所が肝臓である必要はない。
【００２５】移植に用いる肝細胞は、正常な動物の肝臓
から常法によって単離したものを用いることができる
が、特に、in vivoで活発な増殖能を有する「小型肝細
胞」を用いることが好ましい。すなわち、この出願の発
明者らは、ラットあるいはヒトの肝臓に増殖能の高い小
型の肝実質細胞が含まれることを見いだし、既に特許出
願している（特開平8-112092；クローン性増殖能を有す
る肝実質細胞とその取得法、並びに継代培養方法、特開
平8-112092；クローン性増殖能を有する肝実質細胞とそ
の取得法、並びに継代培養方法、特開平10-179148；ヒ
ト小型肝細胞の取得方法と、この細胞の初代培養法）。
また、関連の論文も発表している（C. Tateno and K. Y
oshizato. Growth and Differentiation of Clonogenic
Hepatocytes Which Express Both Phenotypes of Hepa
tocytes and Biliary Epithelial Cells. Am J Pathol
1996, 149:1593-1605, C. Tateno, K. Takai-Kajihara,
C.Yamasaki, H. Sato and K. Yoshizato. Heterogenei
ty of Growth Potential ofAdult Rat Hepatocytes in
vitro. Hepatology 2000, 31:65-74, H. Hino, C.Taten
o, H. Sato, C. Yamasaki, S. Katayama, T. Kohashi,
A. Aratani, T. Asahara, K. Dohi, and K. Yoshizato.
A Long-Term Culture of Human Hepatocytes Which Sh
ow a High Growth Potential and Express Their Diffe
rentiated Phenotypes. Biochem Biophys Res Com 199
9, 256:184-191, S. Katayam, C. Tateno, T. Asahara
and K. Yoshizato. Size-Dependent in Vivo Growth Po
tential of Adult Rat Hepatocytes, American Journal
of Pathology, 158: 97-105,2001）。すなわち、この
小型肝細胞は、その優れた増殖能によって、レシピエン
トの体内で急速に増殖し、肝機能を発揮しうる細胞集団
を短時間で形成することができる。特に、増殖活性が低
いヒト肝細胞を移植する場合には、ヒト由来の小型肝細
胞の使用が特に好ましい。また、最終的に分化した肝細
胞はいわば老いた細胞であるのに対し、活発な増殖能を
持つ小型肝細胞は若い細胞であること、未分化な細胞の
ため様々な肝機能を持つ肝細胞に分化する能力を持つこ
となど、肝機能の観点からみても移植に小型肝細胞を用
いる意義は大きい。特に、この小型肝細胞が様々な肝機
能を持つ肝細胞に分化する能力を持つことは重要であ
る。すなわち、肝臓は多くの機能を持つが、一つ一つの
肝細胞が全ての機能を備えているとは断定できない。つ
まり分化した肝細胞は肝機能を役割分担している可能性
があり、分化した肝細胞を移植すれば、肝機能は限定さ
れたものになるからである。
から常法によって単離したものを用いることができる
が、特に、in vivoで活発な増殖能を有する「小型肝細
胞」を用いることが好ましい。すなわち、この出願の発
明者らは、ラットあるいはヒトの肝臓に増殖能の高い小
型の肝実質細胞が含まれることを見いだし、既に特許出
願している（特開平8-112092；クローン性増殖能を有す
る肝実質細胞とその取得法、並びに継代培養方法、特開
平8-112092；クローン性増殖能を有する肝実質細胞とそ
の取得法、並びに継代培養方法、特開平10-179148；ヒ
ト小型肝細胞の取得方法と、この細胞の初代培養法）。
また、関連の論文も発表している（C. Tateno and K. Y
oshizato. Growth and Differentiation of Clonogenic
Hepatocytes Which Express Both Phenotypes of Hepa
tocytes and Biliary Epithelial Cells. Am J Pathol
1996, 149:1593-1605, C. Tateno, K. Takai-Kajihara,
C.Yamasaki, H. Sato and K. Yoshizato. Heterogenei
ty of Growth Potential ofAdult Rat Hepatocytes in
vitro. Hepatology 2000, 31:65-74, H. Hino, C.Taten
o, H. Sato, C. Yamasaki, S. Katayama, T. Kohashi,
A. Aratani, T. Asahara, K. Dohi, and K. Yoshizato.
A Long-Term Culture of Human Hepatocytes Which Sh
ow a High Growth Potential and Express Their Diffe
rentiated Phenotypes. Biochem Biophys Res Com 199
9, 256:184-191, S. Katayam, C. Tateno, T. Asahara
and K. Yoshizato. Size-Dependent in Vivo Growth Po
tential of Adult Rat Hepatocytes, American Journal
of Pathology, 158: 97-105,2001）。すなわち、この
小型肝細胞は、その優れた増殖能によって、レシピエン
トの体内で急速に増殖し、肝機能を発揮しうる細胞集団
を短時間で形成することができる。特に、増殖活性が低
いヒト肝細胞を移植する場合には、ヒト由来の小型肝細
胞の使用が特に好ましい。また、最終的に分化した肝細
胞はいわば老いた細胞であるのに対し、活発な増殖能を
持つ小型肝細胞は若い細胞であること、未分化な細胞の
ため様々な肝機能を持つ肝細胞に分化する能力を持つこ
となど、肝機能の観点からみても移植に小型肝細胞を用
いる意義は大きい。特に、この小型肝細胞が様々な肝機
能を持つ肝細胞に分化する能力を持つことは重要であ
る。すなわち、肝臓は多くの機能を持つが、一つ一つの
肝細胞が全ての機能を備えているとは断定できない。つ
まり分化した肝細胞は肝機能を役割分担している可能性
があり、分化した肝細胞を移植すれば、肝機能は限定さ
れたものになるからである。
【００２６】このような小型肝細胞の採取は、前記の先
願発明に記載されているような遠心分離を用いた方法の
他、エルトリエーターやFACS等の細胞分画装置によって
も採取することができる。小型肝細胞に特異的な抗原あ
るいはレセプターを利用して分取する事もできる。さら
に、primary肝細胞、継代肝細胞、テロメラーゼ遺伝子
等の導入により不死化させた肝細胞、凍結保存肝細胞、
これらの肝細胞と非実質細胞を混合させたものでも可能
である。
願発明に記載されているような遠心分離を用いた方法の
他、エルトリエーターやFACS等の細胞分画装置によって
も採取することができる。小型肝細胞に特異的な抗原あ
るいはレセプターを利用して分取する事もできる。さら
に、primary肝細胞、継代肝細胞、テロメラーゼ遺伝子
等の導入により不死化させた肝細胞、凍結保存肝細胞、
これらの肝細胞と非実質細胞を混合させたものでも可能
である。
【００２７】また、移植する肝細胞は、肝炎ウイルス感
染細胞、遺伝的疾患を有する患者由来の肝細胞、あるい
は外来遺伝子を導入した形質転換細胞であってもよい。
このような肝細胞を移植したキメラ動物は、肝炎やその
他の疾患に関する「病態モデル動物」として利用するこ
とができる。例えば、OCT欠損症（ornitine carbamoylt
ransferase deficiency）の患者は、先天性尿素サイク
ル代謝異常による高アンモニア血症のため、痙攣や意識
障害を呈して死亡する例が多く、有効な治療法は開発さ
れていない。このOCT欠損症の患者から単離した肝細胞
を移植したキメラ動物はOCT欠損症患者と同様の症状を
呈するため、その治療薬や治療法の開発のためのモデル
動物として有用である。
染細胞、遺伝的疾患を有する患者由来の肝細胞、あるい
は外来遺伝子を導入した形質転換細胞であってもよい。
このような肝細胞を移植したキメラ動物は、肝炎やその
他の疾患に関する「病態モデル動物」として利用するこ
とができる。例えば、OCT欠損症（ornitine carbamoylt
ransferase deficiency）の患者は、先天性尿素サイク
ル代謝異常による高アンモニア血症のため、痙攣や意識
障害を呈して死亡する例が多く、有効な治療法は開発さ
れていない。このOCT欠損症の患者から単離した肝細胞
を移植したキメラ動物はOCT欠損症患者と同様の症状を
呈するため、その治療薬や治療法の開発のためのモデル
動物として有用である。
【００２８】この発明の試験方法は、前記のキメラ動物
を用いた方法である。すなわち、第１の試験方法は、キ
メラ動物に被験物質を投与し、この投与物質の肝細胞に
対する毒性を評価することを特徴とする方法である。被
験物質は医薬品や化学物質であり、通常の動物試験と同
様に、被験物質を全身投与し、キメラ動物の肝細胞の状
態を、常法に従って診断すればよい。例えば、キメラ動
物から肝臓（肝細胞集団）を採取し、個々の細胞の状態
を顕微鏡観察することによって投与物質の毒性を判定す
ることができる。また、血液学的検査や血液生化学的検
査による診断も可能である。すなわち、血液中に存在す
る血小板数の減少や、肝細胞の機能障害を反映して生じ
るアルブミン、コリンエステラーゼおよびコレステロー
ル等の減少、血漿遊離アミノ酸異常およびγ-グロブリ
ン、IV型コラーゲンやヒアルロン酸等の上昇等を診断の
指標として用いることができる。
を用いた方法である。すなわち、第１の試験方法は、キ
メラ動物に被験物質を投与し、この投与物質の肝細胞に
対する毒性を評価することを特徴とする方法である。被
験物質は医薬品や化学物質であり、通常の動物試験と同
様に、被験物質を全身投与し、キメラ動物の肝細胞の状
態を、常法に従って診断すればよい。例えば、キメラ動
物から肝臓（肝細胞集団）を採取し、個々の細胞の状態
を顕微鏡観察することによって投与物質の毒性を判定す
ることができる。また、血液学的検査や血液生化学的検
査による診断も可能である。すなわち、血液中に存在す
る血小板数の減少や、肝細胞の機能障害を反映して生じ
るアルブミン、コリンエステラーゼおよびコレステロー
ル等の減少、血漿遊離アミノ酸異常およびγ-グロブリ
ン、IV型コラーゲンやヒアルロン酸等の上昇等を診断の
指標として用いることができる。
【００２９】また、第２の試験方法の場合には、投与物
質に対する肝細胞の代謝能を常法により測定すればよ
い。例えば、リドカインをキメラ動物に投与し、その代
謝物であるmonoethyl glycinexylidine hydrochloride
（MEGX）を血清または尿中より回収し、HPLC等によって
測定すればよい。
質に対する肝細胞の代謝能を常法により測定すればよ
い。例えば、リドカインをキメラ動物に投与し、その代
謝物であるmonoethyl glycinexylidine hydrochloride
（MEGX）を血清または尿中より回収し、HPLC等によって
測定すればよい。
【００３０】さらに、第３および第４の試験方法は、キ
メラ動物に人為的に肝機能障害を生じさせ、この肝機能
障害に対する被験物質の治療効果または予防効果を試験
する方法である。人為的に肝機能障害を生じさせる方法
としては、前記の肝障害誘発処置（例えば、四塩化炭
素、D-ガラクトサミン、2-アセチルアミノフルオレンな
どによる処置）を採用することができる。あるいは、肝
炎ウイルス等を感染させるなどの方法を採用することも
できる。また、第３の方法においては、肝炎ウイルス感
染細胞や外来遺伝子（特に、肝疾患原因遺伝子）によっ
て形質転換した肝細胞を移植したキメラ動物を用いる場
合には、人為的に肝障害を生じさせることなく、この試
験方法を実施することもできる。
メラ動物に人為的に肝機能障害を生じさせ、この肝機能
障害に対する被験物質の治療効果または予防効果を試験
する方法である。人為的に肝機能障害を生じさせる方法
としては、前記の肝障害誘発処置（例えば、四塩化炭
素、D-ガラクトサミン、2-アセチルアミノフルオレンな
どによる処置）を採用することができる。あるいは、肝
炎ウイルス等を感染させるなどの方法を採用することも
できる。また、第３の方法においては、肝炎ウイルス感
染細胞や外来遺伝子（特に、肝疾患原因遺伝子）によっ
て形質転換した肝細胞を移植したキメラ動物を用いる場
合には、人為的に肝障害を生じさせることなく、この試
験方法を実施することもできる。
【００３１】以上のとおりの第１〜第４の試験方法にお
いては、使用するキメラ動物の肝機能が、異種動物（ド
ナー）由来の肝細胞集団によって担われているため、被
験物質がドナー動物の肝臓で受ける代謝過程や、その物
質が肝臓に与える影響を正確に評価することが可能であ
る。
いては、使用するキメラ動物の肝機能が、異種動物（ド
ナー）由来の肝細胞集団によって担われているため、被
験物質がドナー動物の肝臓で受ける代謝過程や、その物
質が肝臓に与える影響を正確に評価することが可能であ
る。
【００３２】
【実施例】以下、実施例を示してこの出願の発明につい
てさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明
は以下の例によって限定されるものではない。 1.材料 (a)アルブミンウロキナーゼアクティベータートランス
ジェニックマウス(uPA-Tg):B6SJL-TgN (Alb1Plau) 144B
ri (b)スキッドマウス (Scid): C. B-17/Icr Scidjcl (c)ラット肝細胞 (d)ヒト肝細胞 (e)ヒトまたはラット非実質細胞 なお、マウス(a)はThe Jackson Laboratory、マウス(b)
は日本クレアよりそれぞれ購入した。また、細胞(c)−
(e)は文献（Hepatplogy 31:65-47, 2000およびBiochem.
Biophys.Res.Com. 256:184-191, 1999）記載の方法に従
って調製した。 ２．方法と結果 ２．１． 免疫不全アルブミンウロキナーゼトランスジ
ェニックマウスの作製uPA-Tg(ヘミ接合型：+/-)とScid
マウス（ホモ接合型：+/+）を交配させ、両方の形質を
持つマウスuPA-Tg(+/-)Scid(+/-)を35.2％の確立で得
た。uPA-Tg(+/-)とuPA-Tg(-/-)の識別は、uPA遺伝子に
特異的な配列をプライマーに用い、ゲノムPCR法により
行った。また、Scid(+/-)とScid(-/-)の識別は、PCR-RF
LP法により行った。
てさらに詳細かつ具体的に説明するが、この出願の発明
は以下の例によって限定されるものではない。 1.材料 (a)アルブミンウロキナーゼアクティベータートランス
ジェニックマウス(uPA-Tg):B6SJL-TgN (Alb1Plau) 144B
ri (b)スキッドマウス (Scid): C. B-17/Icr Scidjcl (c)ラット肝細胞 (d)ヒト肝細胞 (e)ヒトまたはラット非実質細胞 なお、マウス(a)はThe Jackson Laboratory、マウス(b)
は日本クレアよりそれぞれ購入した。また、細胞(c)−
(e)は文献（Hepatplogy 31:65-47, 2000およびBiochem.
Biophys.Res.Com. 256:184-191, 1999）記載の方法に従
って調製した。 ２．方法と結果 ２．１． 免疫不全アルブミンウロキナーゼトランスジ
ェニックマウスの作製uPA-Tg(ヘミ接合型：+/-)とScid
マウス（ホモ接合型：+/+）を交配させ、両方の形質を
持つマウスuPA-Tg(+/-)Scid(+/-)を35.2％の確立で得
た。uPA-Tg(+/-)とuPA-Tg(-/-)の識別は、uPA遺伝子に
特異的な配列をプライマーに用い、ゲノムPCR法により
行った。また、Scid(+/-)とScid(-/-)の識別は、PCR-RF
LP法により行った。
【００３３】次に、得られたuPA-Tg(+/-)Scid (+/-)をS
cid（+/+）と戻し交配させ、uPA-Tg(+/-)Scid(+/+)を得
た。その結果、出現率はuPA-Tg(+/-)は37.9%、Scid(+/
+)は52.8％であった。
cid（+/+）と戻し交配させ、uPA-Tg(+/-)Scid(+/+)を得
た。その結果、出現率はuPA-Tg(+/-)は37.9%、Scid(+/
+)は52.8％であった。
【００３４】出生直後のuPA-Tg(+/-)Scid(+/+)マウスの
肝臓はアルブミンウロキナーゼの影響により白いが、生
後４週にはuPA遺伝子の欠失により生じた正常肝細胞の
コロニーが観察され、７週にはコロニーは成長し、２８
週ではすべて正常肝細胞で占められていた。
肝臓はアルブミンウロキナーゼの影響により白いが、生
後４週にはuPA遺伝子の欠失により生じた正常肝細胞の
コロニーが観察され、７週にはコロニーは成長し、２８
週ではすべて正常肝細胞で占められていた。
【００３５】ラットまたはヒト肝細胞で置き換わったキ
メラマウスを作製するためには、uPA-Tg(+/＋)Scid(+/
+)に肝細胞を移植する必要がある。しかしながら、uPA-
Tg(+/-)Scid(+/+)同士の掛け合わせでは、uPA-Tg(+/＋)
Scid (+/+)が得られる確率は計算上25%であり、さらにu
PA-Tg(+/＋)の生存できるのは20%と報告されている。し
たがって、このままでは必要な匹数を確保することは困
難である。そこでまず、uPA-Tg(+/-)Scid(+/+)同士の掛
け合わせを行い、uPA-Tg(+/＋)Scid(+/+)を得た。つい
で、生後10〜13日目のuPA-Tg(+/＋)Scid(+/+)のマウス
に脾臓経由でラット肝細胞を移植して生殖年齢まで延命
させ、得られたラット肝細胞を持つuPA-Tg(+/＋)Scid(+
/+)のマウスを交配させて、必要とする匹数のuPA-Tg(+/
＋)Scid(+/+)マウスを作出することに成功した。
メラマウスを作製するためには、uPA-Tg(+/＋)Scid(+/
+)に肝細胞を移植する必要がある。しかしながら、uPA-
Tg(+/-)Scid(+/+)同士の掛け合わせでは、uPA-Tg(+/＋)
Scid (+/+)が得られる確率は計算上25%であり、さらにu
PA-Tg(+/＋)の生存できるのは20%と報告されている。し
たがって、このままでは必要な匹数を確保することは困
難である。そこでまず、uPA-Tg(+/-)Scid(+/+)同士の掛
け合わせを行い、uPA-Tg(+/＋)Scid(+/+)を得た。つい
で、生後10〜13日目のuPA-Tg(+/＋)Scid(+/+)のマウス
に脾臓経由でラット肝細胞を移植して生殖年齢まで延命
させ、得られたラット肝細胞を持つuPA-Tg(+/＋)Scid(+
/+)のマウスを交配させて、必要とする匹数のuPA-Tg(+/
＋)Scid(+/+)マウスを作出することに成功した。
【００３６】なお、導入したアルブミンウロキナーゼ遺
伝子のホモ接合体（uPA-Tg(+/+)）とヘテロ接合体（uPA
-Tg(+/-)）の識別は、以下の方法により行った。
伝子のホモ接合体（uPA-Tg(+/+)）とヘテロ接合体（uPA
-Tg(+/-)）の識別は、以下の方法により行った。
【００３７】生後8〜10日目のマウスの尾を約5 mm切断
し、Qiagen Dneasy Tissue Kitを用いてゲノムDNAを抽
出した。抽出したDNAの濃度および純度を吸光度計を用
いて測定した。master mix 25 μl, primer F 1μl, pr
imer R 1 μl, Taqman probe 1μlにDNAと蒸留水を加
え、全量を50 μlに調整し、定量性PCRを行った（ABI77
00, Sequencer Detector, PE Applied Biosystems）。
プライマーおよびTaqman probeはuPA遺伝子導入のため
のベクターに含まれるヒト生長ホルモンのコード配列を
対象として以下のとおりに設計した。
し、Qiagen Dneasy Tissue Kitを用いてゲノムDNAを抽
出した。抽出したDNAの濃度および純度を吸光度計を用
いて測定した。master mix 25 μl, primer F 1μl, pr
imer R 1 μl, Taqman probe 1μlにDNAと蒸留水を加
え、全量を50 μlに調整し、定量性PCRを行った（ABI77
00, Sequencer Detector, PE Applied Biosystems）。
プライマーおよびTaqman probeはuPA遺伝子導入のため
のベクターに含まれるヒト生長ホルモンのコード配列を
対象として以下のとおりに設計した。
【００３８】 primer F：gtcttggctcgctgcaatc（SEQ ID No: 1） primer R：cgggagactgaggcaggag（SEQ ID No: 2） Taqman probe：ccgcctcctgggttcaagcga（SEQ ID No:
3） またとコントロールとして、マウス G3PDHを対象とする
以下のプライマーおよびTaqman probeを用いた。
3） またとコントロールとして、マウス G3PDHを対象とする
以下のプライマーおよびTaqman probeを用いた。
【００３９】 primer F：ggatgcagggatgatgttc（SEQ ID No: 4） primer R：tgcaccaccaactgcttag（SEQ ID No: 5） Taqman probe：cagaagactgtggatggccctc（SEQ ID No:
6） PCR条件は、95℃で10分変性の後、95℃で15秒変性と60
℃℃で１分伸長を50サイクル行った。ヒト生長ホルモン
のコード配列の増幅断片の量を、内部コントロールのマ
ウス G3PDHコード配列の増幅断片量で割った相対値によ
り、ホモ接合体とヘテロ接合体を識別した。解剖時の肉
眼的所見から、この方法による正答率は約90％であっ
た。 2．２．ラットまたはヒト肝細胞の移植 レシピエントにはuPA-Tg(+/+)/SCID(+/+)、uPA-Tg(+/-)
/SCID(+/+)、uPA-Tg(-/-) /SCID(+/+)を用いた。ドナー
細胞には、増殖性の高い小型肝細胞を含むラット細胞画
分およびヒト肝細胞画分を用い、1-10 x 105個の細胞を
脾臓からエーテル痲酔下で移植した。なお、uPAマウス
は腸管や腹腔内で出血をおこしやすい。そこで手術時の
出血による死亡を避けるため、止血作用を有するe-amin
ocaproicacid (SIGMA)を0.02g/mlの濃度で40 μlを、開
腹時に腹腔内に投与した。
6） PCR条件は、95℃で10分変性の後、95℃で15秒変性と60
℃℃で１分伸長を50サイクル行った。ヒト生長ホルモン
のコード配列の増幅断片の量を、内部コントロールのマ
ウス G3PDHコード配列の増幅断片量で割った相対値によ
り、ホモ接合体とヘテロ接合体を識別した。解剖時の肉
眼的所見から、この方法による正答率は約90％であっ
た。 2．２．ラットまたはヒト肝細胞の移植 レシピエントにはuPA-Tg(+/+)/SCID(+/+)、uPA-Tg(+/-)
/SCID(+/+)、uPA-Tg(-/-) /SCID(+/+)を用いた。ドナー
細胞には、増殖性の高い小型肝細胞を含むラット細胞画
分およびヒト肝細胞画分を用い、1-10 x 105個の細胞を
脾臓からエーテル痲酔下で移植した。なお、uPAマウス
は腸管や腹腔内で出血をおこしやすい。そこで手術時の
出血による死亡を避けるため、止血作用を有するe-amin
ocaproicacid (SIGMA)を0.02g/mlの濃度で40 μlを、開
腹時に腹腔内に投与した。
【００４０】また、ヒト肝細胞はvitamin Cを合成でき
ない。そこで飼育に際し、L-ascorbic 2-acid phosphat
eを1 mg/mlの濃度で溶かした飲料水を与えた。 2．3．ELISA ヒト肝細胞移植後１週間目より、週１回または２回ずつ
尾より採血し、ヒトアルブミン濃度をQuantitative ELI
SA immunoassay (Bethyl laboratories Inc.)を用いて
測定した。 2．4．キメラマウスの確認 ラット肝細胞を移植したuPA-Tg(+/-)SCID(+/+)マウスの
肝臓についてH4抗体の免疫染色を行ったところ、ラット
肝細胞と思われるH4抗体陽性肝細胞のコロニーが多数観
察された（図１）。ヒト肝細胞を移植した場合は、ヒト
サイトケラチン8、18対する抗体を用いた免疫染色（図
２）、またはヒト特異的DNAプローブを用いたin situ h
ybridization（図３）により検出を行い、いずれの方法
においても陽性コロニーが観察された。一方、uPA-Tg(-
/-)/SCID(+/+)ではラットおよびヒト肝細胞の生着は確
認されなかった。
ない。そこで飼育に際し、L-ascorbic 2-acid phosphat
eを1 mg/mlの濃度で溶かした飲料水を与えた。 2．3．ELISA ヒト肝細胞移植後１週間目より、週１回または２回ずつ
尾より採血し、ヒトアルブミン濃度をQuantitative ELI
SA immunoassay (Bethyl laboratories Inc.)を用いて
測定した。 2．4．キメラマウスの確認 ラット肝細胞を移植したuPA-Tg(+/-)SCID(+/+)マウスの
肝臓についてH4抗体の免疫染色を行ったところ、ラット
肝細胞と思われるH4抗体陽性肝細胞のコロニーが多数観
察された（図１）。ヒト肝細胞を移植した場合は、ヒト
サイトケラチン8、18対する抗体を用いた免疫染色（図
２）、またはヒト特異的DNAプローブを用いたin situ h
ybridization（図３）により検出を行い、いずれの方法
においても陽性コロニーが観察された。一方、uPA-Tg(-
/-)/SCID(+/+)ではラットおよびヒト肝細胞の生着は確
認されなかった。
【００４１】12才ヒト由来の凍結融解肝細胞をuPA-Tg(+
/-)/SCID(+/+)マウスへ移植したところ、血中ヒトアル
ブミン量は0.4 〜0.7 mg/mlまで上昇したが、移植30日
目頃から頭打ちとなった。移植53日目で、血中総アルブ
ミンに占めるヒトアルブミンの割合は4〜7％であった。
移植54日目で屠殺し、肝臓を観察したところ、大部分が
uPA遺伝子が欠損したことを示す、またはヒト肝細胞に
置き換わったことを示す赤色の肝臓に置き換わっていた
が、uPAが発現していることを示す白色の領域も確認さ
れた（図4）。肝臓切片をヒトサイトケラチン8,18の抗
体で免疫染色したところ、陽性領域は約25％と計算され
た（図5）。
/-)/SCID(+/+)マウスへ移植したところ、血中ヒトアル
ブミン量は0.4 〜0.7 mg/mlまで上昇したが、移植30日
目頃から頭打ちとなった。移植53日目で、血中総アルブ
ミンに占めるヒトアルブミンの割合は4〜7％であった。
移植54日目で屠殺し、肝臓を観察したところ、大部分が
uPA遺伝子が欠損したことを示す、またはヒト肝細胞に
置き換わったことを示す赤色の肝臓に置き換わっていた
が、uPAが発現していることを示す白色の領域も確認さ
れた（図4）。肝臓切片をヒトサイトケラチン8,18の抗
体で免疫染色したところ、陽性領域は約25％と計算され
た（図5）。
【００４２】これに対し、１２才ヒト由来の凍結融解肝
細胞をuPA-Tg(+/+)/SCID(+/+)マウスへ移植した場合、
移植42日でヒトアルブミン量は3.7 mg/ml、血中総アル
ブミンに占めるヒトアルブミンの割合は37％にまで上昇
した。
細胞をuPA-Tg(+/+)/SCID(+/+)マウスへ移植した場合、
移植42日でヒトアルブミン量は3.7 mg/ml、血中総アル
ブミンに占めるヒトアルブミンの割合は37％にまで上昇
した。
【００４３】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、ヒトを含めた異種動物由来の肝細胞から
なる肝臓を有するキメラ動物が提供される。また、この
キメラ動物を用いた動物実験によって、ヒトの肝機能に
対する各種物質の毒性、各種物質のヒト肝臓における代
謝状態、あるいはヒト肝機能障害に対する治療薬や予防
薬の正確なスクリーニングが可能となる。
発明によって、ヒトを含めた異種動物由来の肝細胞から
なる肝臓を有するキメラ動物が提供される。また、この
キメラ動物を用いた動物実験によって、ヒトの肝機能に
対する各種物質の毒性、各種物質のヒト肝臓における代
謝状態、あるいはヒト肝機能障害に対する治療薬や予防
薬の正確なスクリーニングが可能となる。
【００４４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science and Technology Corporation and Hiroshima Industrial Technology Organization <120> Chimera animal <130> <150> JP2000-149079 <151> 2000-05-19 <160> 6 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized oligonucleotide <400> 1 gtcttggctc gctgcaatc 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized oligonucleotide <400> 2 cgggagactg aggcaggag 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized oligonucleotide <400> 3 ccgcctcctg ggttcaagcg a 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized oligonucleotide <400> 4 ggatgcaggg atgatgttc 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized oligonucleotide <400> 5 tgcaccacca actgcttag 19 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthesized oligonucleotide <400> 6 cagaagactg tggatggccc tc 22
【図１】ラット肝細胞を移植したuPa-Tg(+/-)/ADID(+/
+)マウスの肝臓を、H4抗体を用いて免疫染色を行った結
果である。スケールは100μm。
+)マウスの肝臓を、H4抗体を用いて免疫染色を行った結
果である。スケールは100μm。
【図２】ヒト肝細胞を移植したuPa-Tg(+/-)/ADID(+/+)
マウスの肝臓を、ヒトサイトケラチン8、18抗体を用い
て免疫染色を行った結果である。スケールは100μm。
マウスの肝臓を、ヒトサイトケラチン8、18抗体を用い
て免疫染色を行った結果である。スケールは100μm。
【図３】ヒト肝細胞を移植したuPa-Tg(+/-)/ADID(+/+)
マウスの肝臓に対して、ヒト特異的DNAプローブを用い
たin situ hybridizationを行った結果である。スケー
ルは100μm。
マウスの肝臓に対して、ヒト特異的DNAプローブを用い
たin situ hybridizationを行った結果である。スケー
ルは100μm。
【図４】12才ヒト由来の凍結融解肝細胞を移植したuPa-
Tg(+/-)/ADID(+/+)マウスの肝臓である。
Tg(+/-)/ADID(+/+)マウスの肝臓である。
【図５】12才ヒト由来の凍結融解肝細胞を移植したuPa-
Tg(+/-)/ADID(+/+)マウスの肝臓を、ヒトサイトケラチ
ン8、18抗体を用いて免疫染色を行った結果である。ス
ケールは100μm。
Tg(+/-)/ADID(+/+)マウスの肝臓を、ヒトサイトケラチ
ン8、18抗体を用いて免疫染色を行った結果である。ス
ケールは100μm。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 古川 敏紀 広島県広島市東区牛田本町６−１−９− 506 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 CB01 4B024 AA11 BA16 CA01 CA03 GA11 GA18 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QQ20 QQ36 QR62 QR72 QR80 QS24 QS28 QX01
Claims (8)
- 【請求項１】 異種動物由来の肝細胞の集団を体内に有
し、この肝細胞集団が実質的に動物の肝機能を担ってい
ることを特徴とするキメラ動物。 - 【請求項２】 異種動物由来の肝細胞が、ヒト肝細胞で
ある請求項１のキメラ動物。 - 【請求項３】 異種動物由来の肝細胞が、増殖能を有す
る小型肝細胞である請求項１または２のキメラ動物。 - 【請求項４】 キメラ動物が、マウス由来である請求項
１から３のいずれかののキメラ動物。 - 【請求項５】 請求項１から４のいずれかのキメラ動物
に被験物質を投与し、この投与物質の肝細胞に対する毒
性を評価することを特徴とする試験方法。 - 【請求項６】 請求項１から４のいずれかのキメラ動物
に被験物質を投与し、この投与物質に対する肝細胞の代
謝能を評価することを特徴とする試験方法。 - 【請求項７】 請求項１から４のいずれかのキメラ動物
に、人為的に肝機能障害を発症させた後、被験物質を投
与し、この投与物質の肝機能障害に対する治療効果を評
価することを特徴とする試験方法。 - 【請求項８】 請求項１から４のいずれかのキメラ動物
に被験物質を投与した後、この動物に人為的に肝機能障
害を発症させ、投与物質の肝機能障害に対する予防効果
を評価することを特徴とする試験方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001150098A JP2002045087A (ja) | 2000-05-19 | 2001-05-18 | キメラ動物 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000-149079 | 2000-05-19 | ||
| JP2000149079 | 2000-05-19 | ||
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002045087A true JP2002045087A (ja) | 2002-02-12 |
Family
ID=26592273
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|---|---|---|---|
| JP2001150098A Pending JP2002045087A (ja) | 2000-05-19 | 2001-05-18 | キメラ動物 |
Country Status (1)
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|---|---|
| JP (1) | JP2002045087A (ja) |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003080821A1 (fr) | 2002-03-25 | 2003-10-02 | Japan Science And Technology Agency | Procede assurant la proliferation des hepatocytes humains et procede d'obtention d'hepatocytes humains |
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