JP5172670B2 - 非アルコール性脂肪性肝炎モデル動物及び脂肪肝モデル動物 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎の症状を示す非ヒト動物、この動物からなるヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデル動物、この動物をヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデル動物として使用する方法、この動物を用いたヒト非アルコール性脂肪性肝炎の治療剤のスクリーニング方法、及びこの動物の作製方法に関する。
また本発明は、ヒト脂肪肝の症状を示す非ヒト動物、この動物からなるヒト脂肪肝モデル動物、この動物をヒト脂肪肝モデル動物として使用する方法、この動物を用いたヒト脂肪肝の治療剤のスクリーニング方法、及びこの動物の作製方法に関する。
脂肪肝は、肝細胞内に中性脂肪を中心とした脂質が蓄積した病態であり、肝小葉の1/3以上に肝細胞の脂肪化がみられる。脂肪肝の原因のうち重要と考えられるものは、栄養の摂り過ぎ、肥満、アルコールの過剰摂取、糖尿病、高カロリー輸液、一部の薬物、栄養障害、妊娠などである。原因を取り除けば可逆的で予後は良好であるが、中には炎症、繊維化を伴い肝硬変に進展する例もある。
また、非アルコール性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis: NASH）はアルコール非摂取者に見られる肝障害に対する疾患概念であって、肥満、糖尿病、高トリグリセリド血症、長期経静脈栄養などによる過剰栄養摂取、内分泌障害、低βリポ蛋白血症、飢餓・再補充症候群などが原因と考えられる疾患である。近年、NASH患者が増加しているため、注目を集めている。NASHは一般診療においても比較的頻繁に遭遇すると考えられる疾患で、アルコール性肝障害、ウイルス性肝炎、薬物性肝障害を否定できる肝炎の多くがこの病態であろうと推定される。アルコール性脂肪性肝炎とNASHとの間に組織学的類似性があるということにより両者に肝障害の発生機序における類似機構が存在することが示唆されるが、詳細は研究が進んでいる段階である。
NASHの発症メカニズム及び予防・治療の研究には、NASH症状を示すモデル動物が必要である。従来、脂肪肝のモデル動物として、レプチン遺伝子欠損により肥満・脂肪肝・および高インスリン血症を呈するob/obマウス、NASHのモデル動物としてコリン・メチオニン欠損食ラットなどが使用されているが、これらのモデル動物の肝臓は非ヒト動物の肝臓であるため、ヒトNASHを完全に再現したモデル動物ではない。
ここで、特許文献1は、肝臓で合成されるアルブミンのエンハンサー、及びプロモーターに連結したウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター (uPA) 遺伝子が全細胞に導入された遺伝的肝障害マウスであるuPAトランスジェニックマウス (uPA-Tgマウス) と、免疫不全マウスであるSCIDマウスとを交配させて免疫不全肝障害マウスであるuPA/SCIDマウスを作製し、このマウスにヒト肝細胞を移植することにより、マウス肝臓の一部がヒト肝細胞で置換されたヒト肝細胞キメラマウスが得られることを開示している。
また、特許文献２は、上記のuPA/SCIDマウスにヒト肝細胞を移植するとともに、補体抑制剤を投与することにより、マウス肝臓におけるヒト肝細胞の置換率が向上することを開示している。
特開2002-45087号公報
国際公開WO 03/080821号公報
本発明は、ヒト肝細胞で置換された肝臓を有しヒトNASH症状を示す非ヒト動物、このような動物の作製方法、このような動物をヒトNASHモデル動物として使用する方法、ヒト肝細胞で置換された肝臓を有するヒトNASHモデル動物、及びこのような非ヒト動物を用いてヒトNASH治療剤をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
また本発明は、ヒト肝細胞で置換された肝臓を有しヒト脂肪肝の症状を示す非ヒト動物、このような動物の作製方法、このような動物をヒト脂肪肝モデル動物として使用する方法、ヒト肝細胞で置換された肝臓を有するヒト脂肪肝モデル動物、及びこのような非ヒト動物を用いてヒト脂肪肝治療剤をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ね、以下の知見を得た。
(i) 肝障害免疫不全マウスであるuPA/SCIDマウスにヒト肝細胞を移植して初代キメラマウスを作製し、この初代キメラマウスの肝臓からヒト肝細胞をコラゲナーゼ灌流法により分離し、新たなuPA/SCIDマウスに移植して得たキメラマウスでは、ヒト肝細胞に大滴性の脂肪沈着およびヒト肝細胞の膨潤が観察され、ヒト肝細胞の周囲に好中球を中心とした炎症性細胞が集積し、繊維化像も観察された。この病態はNASHの病態の特徴であることから、このマウスはNASHモデルとして使用できると考えられる。
(ii) 上記初代キメラマウスでは、肝臓に大型の脂肪滴が観察され、肝臓の脂肪化がほとんどの肝細胞に認められるまで進行した。この症状はヒト脂肪肝と酷似していることから、このマウスは脂肪肝モデルとして使用できると考えられる。
(i) 肝障害免疫不全マウスであるuPA/SCIDマウスにヒト肝細胞を移植して初代キメラマウスを作製し、この初代キメラマウスの肝臓からヒト肝細胞をコラゲナーゼ灌流法により分離し、新たなuPA/SCIDマウスに移植して得たキメラマウスでは、ヒト肝細胞に大滴性の脂肪沈着およびヒト肝細胞の膨潤が観察され、ヒト肝細胞の周囲に好中球を中心とした炎症性細胞が集積し、繊維化像も観察された。この病態はNASHの病態の特徴であることから、このマウスはNASHモデルとして使用できると考えられる。
(ii) 上記初代キメラマウスでは、肝臓に大型の脂肪滴が観察され、肝臓の脂肪化がほとんどの肝細胞に認められるまで進行した。この症状はヒト脂肪肝と酷似していることから、このマウスは脂肪肝モデルとして使用できると考えられる。
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の非ヒト動物などを提供する。
項１． 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を上記の免疫不全肝障害非ヒト動物と同種の免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを含み、第２工程を１回又は複数回行う方法により得られ、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎の症状を示す非ヒト動物。
項２． 非ヒト動物が哺乳動物である項１に記載の非ヒト動物。
項３． 哺乳動物がげっ歯類である項２に記載の非ヒト動物。
項４． 第２工程を１回行う方法により得られる項１に記載の非ヒト動物。
項５． 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を上記の免疫不全肝障害非ヒト動物と同種の免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを含み、第２工程を１回又は複数回行う方法により得られる、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデル動物。
項６． 非ヒト動物が哺乳動物である項５に記載のモデル動物。
項７． 哺乳動物がげっ歯類である項６に記載のモデル動物。
項８． 第２工程を１回行う方法により得られる項５に記載のモデル動物。
項９． 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を上記の免疫不全肝障害非ヒト動物と同種の免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを含み、第２工程を１回又は複数回行う方法により得られる非ヒト動物を、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデル動物として使用する方法。
項１０． 非ヒト動物が哺乳動物である項９に記載の方法。
項１１． 哺乳動物がげっ歯類である項１０に記載の方法。
項１２． 第２工程を１回行う方法により得られる非ヒト動物を使用する項９に記載の方法。
項１３． 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を上記の免疫不全肝障害非ヒト動物と同種の免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを含み、第２工程を１回又は複数回行う方法により得られる非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、投与前後の非アルコール性脂肪性肝炎の症状の程度を比較する工程とを含む、ヒト非アルコール性肝炎治療剤のスクリーニング方法。
項１４． 非ヒト動物が哺乳動物である項１３に記載の方法。
項１５． 哺乳動物がげっ歯類である項１４に記載の方法。
項１６． 第２工程を１回行う方法により得られる非ヒト動物を使用する項１３に記載の方法。
項１７． ヒト非アルコール性脂肪性肝炎の症状を示す非ヒト動物の作製方法であり、免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を上記の免疫不全肝障害非ヒト動物と同種の免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを含み、第２工程を１回又は複数回行う方法。
項１８． 非ヒト動物が哺乳動物である項１７に記載の方法。
項１９． 哺乳動物がげっ歯類である項１８に記載の方法。
項２０． 第２工程を１回行う項１７に記載の方法。
項２１． 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する方法により得られ、ヒト脂肪肝の症状を示す非ヒト動物。
項２２． 非ヒト動物が哺乳動物である項２１に記載の非ヒト動物。
項２３． 哺乳動物がげっ歯類である項２２に記載の非ヒト動物。
項２４． 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して得られるキメラ非ヒト動物からなる、ヒト脂肪肝モデル動物。
項２５． 非ヒト動物が哺乳動物である項２４に記載のモデル動物。
項２６． 哺乳動物がげっ歯類である項２５に記載のモデル動物。
項２７． 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して得たキメラ非ヒト動物をヒト脂肪肝モデル動物として使用する方法。
項２８． 非ヒト動物が哺乳動物である項２７に記載の方法。
項２９． 哺乳動物がげっ歯類である項２８に記載の方法。
項３０． 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して得られるキメラ非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、投与前後の脂肪肝の症状の程度を比較する工程とを含む、ヒト脂肪肝治療剤のスクリーニング方法。
項３１． ヒト脂肪肝の症状を示す非ヒト動物の作製方法であり、
免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してヒト脂肪肝の症状を示すキメラ非ヒト動物を作製する方法。
項３２． 非ヒト動物が哺乳動物である項３１に記載の方法。
項３３． 哺乳動物がげっ歯類である項３２に記載の方法。
項１． 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を上記の免疫不全肝障害非ヒト動物と同種の免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを含み、第２工程を１回又は複数回行う方法により得られ、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎の症状を示す非ヒト動物。
項２． 非ヒト動物が哺乳動物である項１に記載の非ヒト動物。
項３． 哺乳動物がげっ歯類である項２に記載の非ヒト動物。
項４． 第２工程を１回行う方法により得られる項１に記載の非ヒト動物。
項５． 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を上記の免疫不全肝障害非ヒト動物と同種の免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを含み、第２工程を１回又は複数回行う方法により得られる、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデル動物。
項６． 非ヒト動物が哺乳動物である項５に記載のモデル動物。
項７． 哺乳動物がげっ歯類である項６に記載のモデル動物。
項８． 第２工程を１回行う方法により得られる項５に記載のモデル動物。
項９． 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を上記の免疫不全肝障害非ヒト動物と同種の免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを含み、第２工程を１回又は複数回行う方法により得られる非ヒト動物を、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデル動物として使用する方法。
項１０． 非ヒト動物が哺乳動物である項９に記載の方法。
項１１． 哺乳動物がげっ歯類である項１０に記載の方法。
項１２． 第２工程を１回行う方法により得られる非ヒト動物を使用する項９に記載の方法。
項１３． 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を上記の免疫不全肝障害非ヒト動物と同種の免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを含み、第２工程を１回又は複数回行う方法により得られる非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、投与前後の非アルコール性脂肪性肝炎の症状の程度を比較する工程とを含む、ヒト非アルコール性肝炎治療剤のスクリーニング方法。
項１４． 非ヒト動物が哺乳動物である項１３に記載の方法。
項１５． 哺乳動物がげっ歯類である項１４に記載の方法。
項１６． 第２工程を１回行う方法により得られる非ヒト動物を使用する項１３に記載の方法。
項１７． ヒト非アルコール性脂肪性肝炎の症状を示す非ヒト動物の作製方法であり、免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を上記の免疫不全肝障害非ヒト動物と同種の免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを含み、第２工程を１回又は複数回行う方法。
項１８． 非ヒト動物が哺乳動物である項１７に記載の方法。
項１９． 哺乳動物がげっ歯類である項１８に記載の方法。
項２０． 第２工程を１回行う項１７に記載の方法。
項２１． 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する方法により得られ、ヒト脂肪肝の症状を示す非ヒト動物。
項２２． 非ヒト動物が哺乳動物である項２１に記載の非ヒト動物。
項２３． 哺乳動物がげっ歯類である項２２に記載の非ヒト動物。
項２４． 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して得られるキメラ非ヒト動物からなる、ヒト脂肪肝モデル動物。
項２５． 非ヒト動物が哺乳動物である項２４に記載のモデル動物。
項２６． 哺乳動物がげっ歯類である項２５に記載のモデル動物。
項２７． 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して得たキメラ非ヒト動物をヒト脂肪肝モデル動物として使用する方法。
項２８． 非ヒト動物が哺乳動物である項２７に記載の方法。
項２９． 哺乳動物がげっ歯類である項２８に記載の方法。
項３０． 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して得られるキメラ非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、投与前後の脂肪肝の症状の程度を比較する工程とを含む、ヒト脂肪肝治療剤のスクリーニング方法。
項３１． ヒト脂肪肝の症状を示す非ヒト動物の作製方法であり、
免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してヒト脂肪肝の症状を示すキメラ非ヒト動物を作製する方法。
項３２． 非ヒト動物が哺乳動物である項３１に記載の方法。
項３３． 哺乳動物がげっ歯類である項３２に記載の方法。
本発明によれば、免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ動物を作製し、キメラ動物からヒト肝細胞を分離して、同種の新たな免疫不全肝障害非ヒト動物に移植して得た継代移植キメラ動物では、肝臓の組織像がNASHの特徴を示すことが見出された。NASH症状の程度は、初代キメラ動物の肝臓組織に比べて、格段に顕著である。
継代移植キメラ動物は、肝臓の全部又は一部がヒト肝細胞で置換されているため、ヒトNASHを正確に再現したものとなる。
これらのことから、この継代移植キメラ動物は、ヒトNASHの病態を正確に反映した病態モデル動物として、NASHの発症メカニズムの研究やその予防・治療剤のスクリーニング等に好適に使用できる。
また、本発明によれば、上記初代キメラ動物では、肝臓の組織像が脂肪肝の特徴を示すことが見出された。この初代キメラ動物は、ヒト脂肪肝の病態を正確に反映した病態モデル動物として、脂肪肝の発症メカニズムの研究やその予防・治療剤のスクリーニング等に好適に使用できる。
以下、本発明を詳細に説明する。まず、ヒトNASHの症状を示す非ヒト動物の作製方法について説明し、次いで、この非ヒト動物とその利用について説明する。さらに、ヒト脂肪肝の症状を示す非ヒト動物の作製方法について説明し、次いで、この非ヒト動物とその利用について説明する。
（Ｉ）NASHの症状を示す非ヒト動物の作製方法
本発明のヒトNASHの症状を示す非ヒト動物の作製方法は、免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を上記の免疫不全肝障害非ヒト動物と同種の免疫不全肝障害非ヒト動物に移植してNASHの症状を示す継代移植キメラ非ヒト動物を作製する第２工程とを含む方法である。また、第２工程を２回以上行う方法も本発明方法に含まれる。
本発明のヒトNASHの症状を示す非ヒト動物の作製方法は、免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を上記の免疫不全肝障害非ヒト動物と同種の免疫不全肝障害非ヒト動物に移植してNASHの症状を示す継代移植キメラ非ヒト動物を作製する第２工程とを含む方法である。また、第２工程を２回以上行う方法も本発明方法に含まれる。
ヒトNASHは、ヒトのアルコール性肝疾患以外の脂肪蓄積性の肝疾患の総称であり、肝臓において、少なくとも脂肪滴の沈着、炎症性細胞浸潤、および繊維化の症状を示す疾患をいう。通常、ウィルス性肝疾患は含まれないが、薬物性肝障害による肝疾患はNASHに含まれる。
本発明において、非ヒト動物（以下、「動物」と略称することもある）は、哺乳動物であることが好ましく、げっ歯類であることがより好ましい。げっ歯類動物としては、マウス、ラットのようなネズミ、モルモット、リス、ハムスターなどが挙げられるが、実験動物として汎用されているマウス、ラットのようなネズミが使用し易い。
免疫不全肝障害非ヒト動物
免疫不全肝障害非ヒト動物は、異種動物由来の細胞に対して拒絶反応を示さない免疫不全であるとともに、その非ヒト動物本来の肝臓の細胞が障害を受けている動物である。その動物本来の細胞が障害を受けていることにより、ヒト肝細胞を移植すれば、その肝機能は移植されたヒト肝細胞によって保たれ、ヒト肝細胞の個体内機能を正確に反映した動物となる。また、移植するヒト肝細胞が増殖し易くなる。
免疫不全肝障害非ヒト動物は、異種動物由来の細胞に対して拒絶反応を示さない免疫不全であるとともに、その非ヒト動物本来の肝臓の細胞が障害を受けている動物である。その動物本来の細胞が障害を受けていることにより、ヒト肝細胞を移植すれば、その肝機能は移植されたヒト肝細胞によって保たれ、ヒト肝細胞の個体内機能を正確に反映した動物となる。また、移植するヒト肝細胞が増殖し易くなる。
免疫不全肝障害動物は、同一個体に、肝障害誘発処理を施すとともに、免疫不全誘発処理を施すことにより作製することができる。肝障害誘発処理としては、四塩化炭素、黄リン、D-ガラクトサミン、2-アセチルアミノフルオレン、ピロロジンアルカロイドのような肝障害誘発物質の投与や、外科的な肝臓の部分切除などが挙げられる。免疫不全誘発処理としては、免疫抑制剤の投与や胸腺摘出などが挙げられる。
また、免疫不全肝障害動物は、遺伝的免疫不全症の動物に、肝障害誘発処理を施すことによっても作製できる。遺伝的免疫不全症動物としては、Ｔ細胞系不全を示す重症複合免疫不全症（SCID：severe combined immunodeficiency）の動物、遺伝的な胸腺の欠損によりT細胞機能を失った動物、RAG2遺伝子を公知のジーンターゲッティング法（Science,244:1288-1292,1989)によりノックアウトした動物などが挙げられる。具体的には、SCIDマウス、NUDEマウス、RAG2ノックアウトマウスなどが挙げられる。
また、免疫不全肝障害動物は、遺伝的肝障害動物に免疫不全誘発処理を施すことによっても作製できる。遺伝的肝障害動物としては、肝細胞特異的に発現するタンパク質のエンハンサー、及び／又はプロモーターの支配下に連結された肝障害誘発タンパク質遺伝子を用い、公知のトランスジェニック法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77;7380-7384,1980)により作製したトランスジェニック動物が挙げられる。このような動物では、肝障害誘発タンパク質が肝臓特異的に発現するため、肝障害を有するものとなる。肝臓特異的に発現するタンパク質としては、血清アルブミン、コリンエステラーゼ、ハーゲマン因子などが挙げられる。肝障害誘発タンパク質としては、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター(uPA)、ティッシュープラスミノーゲンアクチベーター(tPA)などが挙げられる。また、例えばフマリルアセト酢酸ヒドラーゼ遺伝子のような肝機能を担う遺伝子をノックアウトすることによっても遺伝的肝障害を有する動物を得ることができる。
さらに、免疫不全肝障害動物は、遺伝的免疫不全動物と、それと同種の遺伝的肝障害動物とを交配させることによっても作製することができる。
遺伝的免疫不全肝障害動物としては、肝障害遺伝子がホモ接合体である動物を用いることが好ましい。このようなホモ接合体動物は正常な肝細胞がほとんど増殖しないため、その動物の肝細胞がヒト肝細胞の増殖を妨げることがない。ただし、このようなホモ接合体動物は、ヘミ接合体同士を掛け合わせた場合、確率的に１／４の割合でしか得ることができない。
一方、肝障害遺伝子がヘミ接合体である遺伝的免疫不全肝障害動物（「ヘミ接合体免疫不全肝障害動物」）は、ヘミ接合体同士を掛け合わせた場合、またはヘミ接合体と遺伝的免疫不全動物とを掛け合わせた場合１／２の確立で得ることができるため、低コストで作製できる。しかし、ヘミ接合体免疫不全肝障害動物は、２倍体染色体の一方の遺伝子が正常であるため、肝障害遺伝子の欠失により正常肝細胞がコロニーを形成しながら増殖し、生後肝臓中の正常な肝細胞の比率が高くなってくる。このため、好ましくは、ヘミ接合体免疫不全肝障害動物にヒト肝細胞を移植する前に、肝細胞特異的に増殖を阻害する物質を投与し、正常化した肝細胞が増殖してコロニーを形成することを予防すればよい。肝細胞増殖阻害物質としては、たとえばピロロジンアルカロイドの一種であるレトロシン、ラシオカルピン、セネシフィリン、モノクロタリントリコデスミン等を例示することができる。
ヒト肝細胞
移植に用いるヒト肝細胞は、正常なヒト肝組織から、コラゲナーゼ灌流法のような常法によって単離したものを用いることができる。また、分離した肝細胞を一旦冷凍保存した後解凍して用いることもできる。
移植に用いるヒト肝細胞は、正常なヒト肝組織から、コラゲナーゼ灌流法のような常法によって単離したものを用いることができる。また、分離した肝細胞を一旦冷凍保存した後解凍して用いることもできる。
肝細胞を分離するヒトの年齢は特に制限されないが、例えば１４歳以下の小児のヒトの肝細胞を使用することにより、ヒト肝細胞による高置換率が達成される。
また、ｉｎ ｖｉｖｏで活発な増殖能を有する増殖性肝細胞を使用することが好ましい。本発明において、「増殖性ヒト肝細胞」とは、培養条件下（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、単一細胞種の集団としてのコロニーを形成し、そのコロニーを増大させるように増殖するヒト肝細胞を意味する。また、その増殖は、コロニー構成細胞が単一種であるという点において「クローン性増殖」という場合もある。さらに、このような細胞は、継代培養によって細胞数をさらに増加することができる細胞である。
このような増殖性ヒト肝細胞は、一例として、本発明者らが発明したヒト小型肝細胞（特開平０８−１１２０９２号公報；日本特許第３２６６７６６号；米国特許第６，００４，８１０号、特開平１０−１７９１４８号公報：日本特許第３２１１９４１号、特開平７−２７４９５１公報；日本特許第３１５７９８４号、特開平９−３１３１７２号公報；日本特許第３０１４３２２号）を用いることができる。このヒト小型肝細胞は、その優れた増殖能によって、レシピエントの体内で急速に増殖し、正常な肝機能を発揮しうるヒト肝細胞集団を短時間で形成することができる。
このような小型肝細胞の採取は、前記公報に記載されているような遠心分離を用いた方法の他、エルトリエーターやＦＡＣＳ等の細胞分画装置によっても採取することができる。さらには、コロニーを形成しながら増殖する肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体によって採取することもできる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させたヒト肝細胞、凍結保存肝細胞、テロメラーゼ遺伝子等の導入により不死化させた肝細胞、これらの肝細胞と非実質細胞を混合させたものも使用できる。
初代キメラ動物の作製
このようなヒト肝細胞は、免疫不全肝障害動物の脾臓を経由して肝臓へ移植することができる。また、直接門脈から移植することもできる。移植するヒト肝細胞の数は、１〜２００万個程度、好ましくは５０万〜１００万個程度とすることができる。
このようなヒト肝細胞は、免疫不全肝障害動物の脾臓を経由して肝臓へ移植することができる。また、直接門脈から移植することもできる。移植するヒト肝細胞の数は、１〜２００万個程度、好ましくは５０万〜１００万個程度とすることができる。
免疫不全肝障害動物の性別は特に限定されない。また、移植時の免疫不全肝障害動物の日齢は、特に限定されないが、マウスが低週齢のときにヒト肝細胞を移植すると、マウスの成長とともにヒト肝細胞がより活発に増殖することができる点で、生後０〜４０日程度、中でも生後８〜４０日程度の動物を使用するのが好ましい。
移植後の動物を、常法により、飼育すればよい。例えば移植後４０〜２００日間程度飼育することにより、肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換された初代キメラ動物が得られる。キメラ動物の血中ヒトアルブミン濃度が６ mg/ml以上になるまで飼育することが好ましい。この濃度であれば、キメラ動物の肝臓が十分にヒト肝細胞により置換されており、後工程で、このキメラ動物から分離した肝細胞中にヒト肝細胞が高率で含まれ、ヒト肝細胞の継代移植を効率的に行うことができる。マウスの場合は、ヒト肝細胞を７．５×１０５個程度移植した場合、４０〜１２０日間程度飼育することにより、上記の血中ヒトアルブミン濃度（これは、ヒト肝細胞置換率を示す。）が得られる。
継代移植キメラ動物の作製
キメラ動物体内で増殖したヒト肝細胞は、例えば、キメラ動物の肝臓組織をコラゲナーゼ処理することにより回収することができる。コラゲナーゼの細胞毒性は、非ヒト動物肝細胞に対する方が、ヒト肝細胞に対するより高いため、コラゲナーゼ処理時間を調節することにより、キメラ動物の肝細胞に障害を与え、実質的にヒト肝細胞だけを分離することができる。コラゲナーゼ処理時間は、ヒト肝細胞と非ヒト肝細胞との存在割合によって異なるが、例えば、血中アルブミン濃度が１〜１４ｍｇ／ｍｌ程度の場合は、濃度０．０１〜０．１重量％程度のコラゲナーゼ溶液で１０〜３０分間程度処理を行えばよい。回収された肝細胞の中には、キメラ動物体内で増殖したヒト肝細胞の他、肝非実質細胞が少量含まれる。さらに、動物自身の肝細胞も少量含まれる。
キメラ動物体内で増殖したヒト肝細胞は、例えば、キメラ動物の肝臓組織をコラゲナーゼ処理することにより回収することができる。コラゲナーゼの細胞毒性は、非ヒト動物肝細胞に対する方が、ヒト肝細胞に対するより高いため、コラゲナーゼ処理時間を調節することにより、キメラ動物の肝細胞に障害を与え、実質的にヒト肝細胞だけを分離することができる。コラゲナーゼ処理時間は、ヒト肝細胞と非ヒト肝細胞との存在割合によって異なるが、例えば、血中アルブミン濃度が１〜１４ｍｇ／ｍｌ程度の場合は、濃度０．０１〜０．１重量％程度のコラゲナーゼ溶液で１０〜３０分間程度処理を行えばよい。回収された肝細胞の中には、キメラ動物体内で増殖したヒト肝細胞の他、肝非実質細胞が少量含まれる。さらに、動物自身の肝細胞も少量含まれる。
回収した肝細胞をそのまま移植に使用してもよいが、ヒト肝細胞あるいはマウス肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いてヒト肝細胞の純度を上げることもできる。分離した肝細胞をヒト肝細胞特異抗体と反応させる場合は、反応した細胞をフローサイトメーター（FACS）や磁気細胞分離装置（MACS）で回収すればよい。また、分離した肝細胞をマウス肝細胞特異的抗体と反応させる場合は、反応しなかった細胞をFACSやMACSを用いて回収すればよい。
ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体としては、本発明者らが作製したハイブリドーマK8216株（2002年3月6日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1-1-1 つくばセンター 中央第６）にFERM P-18751として寄託済み。また、2003年3月20日に、同センターにFERM BP-8333として国際寄託済み。）細胞を培養することによって得たもの、又はこのハイブリドーマ細胞をマウス腹腔内に注射し、腹水から採取したものが挙げられる。特に、ヒト増殖性肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体としては、本発明者らが作製したハイブリドーマK8223株（2002年3月6日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P-18752として寄託済み。また、2003年3月20日に、FERM BP-8334として国際寄託済み。）細胞を培養することによって得たもの、又はこのハイブリドーマ細胞をマウス腹腔内に注射し、腹水から採取したものが挙げられる。
第２工程では、初代キメラ動物の体内で増殖したヒト肝細胞を、第１工程で使用した非ヒト動物と同種の免疫不全肝障害動物に移植して、継代移植したキメラ動物を作製する。同種の動物とは、第１工程で使用した動物がマウスであればマウスを指し、第１工程で使用した動物がラットであればラットを指す。
第２工程（継代移植）は1回行ってもよく、２回以上行っても良い。例えば、３回行う場合は、初代キメラ動物体内で増殖したヒト肝細胞を、新たな免疫不全肝障害動物に移植して継代移植キメラ動物を作製し、この継代移植キメラ動物の体内で増殖したヒト肝細胞を、新たな免疫不全肝障害動物に移植して継代移植キメラ動物を作製すればよい。
初代キメラ動物から分離したヒト肝細胞の非ヒト動物の肝臓への移植経路、細胞数は、第１工程と同様である。また、移植を受ける非ヒト動物の日齢、性別についても、第１工程と同様である。
移植後の動物を、常法により、例えば移植後４０〜１２０日間程度飼育すればよい。これにより、肝細胞の一部又は全部がヒト肝細胞で置換された継代移植キメラ動物が得られる。血中アルブミン濃度が0.1 mg/ml以上、好ましくは1.0 mg/ml以上になるまで飼育することにより、病態モデル動物として使用できるだけの十分なヒト肝細胞置換率が得られ、また十分にヒトNASH症状が現われる。例えば、マウスでは、7.5ｘ105個程度の肝細胞を移植した場合、移植後、70日程度、好ましくは80日程度で十分にNASH症状が現われる。移植後の飼育期間の上限は特にないが、通常400日程度とすればよい。
このようにして得られた継代移植キメラ動物は、十分にヒトNASH症状を示すが、この継代移植キメラ動物の体内で増殖したヒト肝細胞を、さらに同種の免疫不全肝障害動物に移植して継代移植キメラ動物を得ることもできる。このように複数回継代移植したキメラ動物も、ヒトNASH症状を示す。このように複数回継代移植したキメラ動物も、ヒトNASH症状を示す。
（ＩＩ）ヒトNASHの症状を示す非ヒト動物
このようにして得られた１回又は２回以上の継代移植キメラ動物は、ヒトNASHの症状を示す。具体的には、肝臓組織において、少なくとも脂肪滴の沈着、炎症性細胞浸潤、および繊維化が観察される。継代移植キメラ動物の肝臓組織では、初代キメラ動物の肝臓組織に比べて、ヒトNASH様症状が格段に顕著に現われる。従って、この非ヒト動物は、ヒトNASHモデル動物として使用するのに適している。即ち、本発明は、上記説明したヒトNASH症状を示す非ヒト動物をヒトNASHモデル動物として使用する方法も提供する。
このようにして得られた１回又は２回以上の継代移植キメラ動物は、ヒトNASHの症状を示す。具体的には、肝臓組織において、少なくとも脂肪滴の沈着、炎症性細胞浸潤、および繊維化が観察される。継代移植キメラ動物の肝臓組織では、初代キメラ動物の肝臓組織に比べて、ヒトNASH様症状が格段に顕著に現われる。従って、この非ヒト動物は、ヒトNASHモデル動物として使用するのに適している。即ち、本発明は、上記説明したヒトNASH症状を示す非ヒト動物をヒトNASHモデル動物として使用する方法も提供する。
（ＩＩＩ）ヒトNASHの治療剤のスクリーニング方法
本発明のヒトNASHの治療剤のスクリーニング方法は、上記説明した本発明のヒトNASH症状を示す非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、投与前後のNASH症状の程度を比較する工程とを含む方法である。
本発明のヒトNASHの治療剤のスクリーニング方法は、上記説明した本発明のヒトNASH症状を示す非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、投与前後のNASH症状の程度を比較する工程とを含む方法である。
投与前後のNASH症状の程度の比較は、肝臓組織における脂肪滴の沈着、炎症性細胞浸潤、および繊維化の各項目について行えばよい。これらの症状が緩和されていれば、その被験物質はヒトNASHの治療又は改善に有効であると判定することができる。これらは、通常、組織染色により判定することができる。その他、アポトーシス、酸化ストレスマーカー、肝臓組織における鉄の沈着についても比較するのが好ましい。これらの項目についても比較することにより、一層正確なスクリーニングが行える。被験物質の投与によりこれらの項目の改善が観察されれば、その被験物質にNASHの治療又は改善効果があることが一層確実になる。
（ＩＶ）脂肪肝の症状を示す非ヒト動物の作製方法
本発明のヒト脂肪肝の症状を示す非ヒト動物の作製方法は、免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する方法である。
ヒト脂肪肝は、肝細胞内に中性脂肪が過剰に沈着した状態をいう。
本発明のヒト脂肪肝の症状を示す非ヒト動物の作製方法は、免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する方法である。
ヒト脂肪肝は、肝細胞内に中性脂肪が過剰に沈着した状態をいう。
免疫不全肝障害非ヒト動物
免疫不全肝障害非ヒト動物については、前述した通りである。
免疫不全肝障害非ヒト動物については、前述した通りである。
ヒト肝細胞
移植に用いるヒト肝細胞については、前述した通りである。
移植に用いるヒト肝細胞については、前述した通りである。
初代キメラ動物の作製
免疫不全肝障害動物へのヒト肝細胞の移植は前述した通りである。
免疫不全肝障害動物へのヒト肝細胞の移植は前述した通りである。
移植後の動物を、常法により、飼育すればよい。例えば40〜200日間程度飼育することにより、移植したヒト肝細胞が増殖し、脂肪肝の症状を示す初代キメラ動物が得られる。マウスの場合は、ヒト肝細胞を7.5×105個程度移植した場合、70〜120日間程度飼育することにより、脂肪肝の症状を示す初代キメラマウスが得られる。
また、キメラ動物の血中ヒトアルブミン濃度が6mg/ml以上になるまで飼育することが好ましい。この程度飼育することにより、肝細胞におけるヒト肝細胞置換率が十分に高くなり、ヒト脂肪肝のモデル動物として実用できるようになる。マウスの場合は、ヒト肝細胞を7.5×105個程度移植した場合、60〜120日間程度飼育することにより、上記の血中ヒトアルブミン濃度（ヒト肝細胞置換率）が得られる。飼育期間の上限は特に限定されないが、通常400日間程度とすればよい。
（Ｖ）ヒト脂肪肝の症状を示す非ヒト動物
このようにして得られた初代キメラ動物は、ヒト脂肪肝の症状を示す。具体的には、少なくとも肝臓組織に中性脂肪が沈着している。肝小葉の約1/3以上にわたって肝細胞の脂肪化が認められる場合もある。従って、この非ヒト動物は、ヒト脂肪肝モデル動物として使用するのに適している。即ち、本発明は、上記説明したヒト脂肪肝の症状を示す非ヒト動物をヒト脂肪肝モデル動物として使用する方法も提供する。
このようにして得られた初代キメラ動物は、ヒト脂肪肝の症状を示す。具体的には、少なくとも肝臓組織に中性脂肪が沈着している。肝小葉の約1/3以上にわたって肝細胞の脂肪化が認められる場合もある。従って、この非ヒト動物は、ヒト脂肪肝モデル動物として使用するのに適している。即ち、本発明は、上記説明したヒト脂肪肝の症状を示す非ヒト動物をヒト脂肪肝モデル動物として使用する方法も提供する。
（ＶＩ）ヒト脂肪肝の治療剤のスクリーニング方法
本発明のヒト脂肪肝の治療剤のスクリーニング方法は、上記説明した本発明のヒト脂肪肝症状を示す非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、投与前後の脂肪肝症状の程度を比較する工程とを含む方法である。
本発明のヒト脂肪肝の治療剤のスクリーニング方法は、上記説明した本発明のヒト脂肪肝症状を示す非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、投与前後の脂肪肝症状の程度を比較する工程とを含む方法である。
投与前後の脂肪肝症状の程度の比較は、例えば、肝臓の組織切片について脂肪化の程度が小さくなるかを確認することにより行えばよい。肝臓の組織切片について脂肪化の程度が小さくなっていれば、その被験物質はヒト脂肪肝の治療又は改善に有効であると判定することができる。
実施例
以下、本発明を実施例を挙げて、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下、本発明を実施例を挙げて、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（１）NASHモデルマウスの作製
(1-1)免疫不全肝障害マウス
レシピエント動物として使用したuPA-Tg(+/+)/SCID(+/+)マウスは、広島県産業科学技術研究所あるいは株式会社フェニックスバイオにて繁殖させたものを用いた。
(1-1)免疫不全肝障害マウス
レシピエント動物として使用したuPA-Tg(+/+)/SCID(+/+)マウスは、広島県産業科学技術研究所あるいは株式会社フェニックスバイオにて繁殖させたものを用いた。
このマウスは、次のようにして作製したものである。uPA-Tgマウス（hemizygote, +/-）とSCIDc.b.-17マウス（homozygote, +/+）とを掛け合せ、両方の形質を持つマウスuPA-Tg(+/-)/SCID (+/-)を35.2％の確率で得た。uPA-Tg(+/-)とuPA-Tg(-/-)の識別は、uPA遺伝子に特異的な配列をプライマーに用い、ゲノムPCR法により行った。また、SCID (+/-)とSCID(-/-)の識別は、PCR-RFLP法により行った。
次に、得られたuPA-Tg(+/-)/SCID (+/-)をSCID (+/+)と戻し交配させ、uPA-Tg(+/-)/SCID (+/+)を得た。その結果、uPA-Tg(+/-)は37.9％出現し、SCID (+/+)は52.8％出現した。uPA-Tg(+/-)/SCID (+/+)同士を交配させ、uPA-Tg(+/-)/SCID (+/+)、及び目的のuPA-Tg(+/+)/SCID (+/+)を得た。
なお、uPA遺伝子の(-/-), (+/-), (+/+)の識別は以下の方法で行った。生後8〜10日目のマウスの尾を約5 mm切断し、30 μlのDNA lysis buffer ｛50 mM Tris (pH 8), 50 mM EDTA (pH 8), 1% SDS, 2 mg/ml Proteinase K｝を添加後55℃で2〜3時間インキュベートした。インキュベート後、15秒間激しく懸濁し、蒸留水170 μlを添加し、95℃で10分間インキュベートすることによってProteniase Kを不活性化させた。これをPCRのテンプレートとして用いた。テンプレート 1μl、10 x Buffer (Mg+) 2μl、dNTP Mix (2.5 mM) 1.6μl、蒸留水 11.4 μl、uPA-del-Fプライマー (10 pmol/μl) 0.4μl、uPA-del-Rプライマー (10 pmol/μl) 0.4 μl、Tg-Fプライマー (10 pmol/μl) 0.4μl、uPA-high-R1 (10 pmol/μl) 0.4 μl、MgCl2 (25mM) 2 μl、Tween20 (50%) 0.2 μl、rTaq 0.2 μlを混合し、94℃・5分、次いで（94℃・30秒、62℃・30秒、72℃・30秒）x 35〜40サイクルの条件でPCRを行った。2％アガロースゲルを用いて電気泳動を行い、300 bp付近にバンドが検出された場合uPA (-/-)、150 bpに検出された場合はuPA (+/+)、300 bpと150 bp両方に検出された場合uPA (+/-)として判定した。用いたプライマーの配列は以下の通りである。
uPA-del-F
5’-TTCTCTTCTCTTGCCCTCTCACA-3’（配列番号１）
uPA-del-R
5’-TTGAGACCCTCAAGACAGCCA-3’ （配列番号２）
Tg-F
5’-ATCCCTGTGACCCCTCCC-3’ （配列番号３）
uPA-high-R1
5’-CTCCATACCACCCCCCTC-3’ （配列番号４）
uPA-del-F
5’-TTCTCTTCTCTTGCCCTCTCACA-3’（配列番号１）
uPA-del-R
5’-TTGAGACCCTCAAGACAGCCA-3’ （配列番号２）
Tg-F
5’-ATCCCTGTGACCCCTCCC-3’ （配列番号３）
uPA-high-R1
5’-CTCCATACCACCCCCCTC-3’ （配列番号４）
(1-2)ヒト肝細胞移植
ヒト肝細胞としては、BD Gentest社より購入した肝細胞（Lot No.BD51、女児、４才）を使用した。この凍結肝細胞はChise Tateno, Yasumi Yoshizane, Naomi Saito, Miho Kataoka, Rie Utoh, Chihiro Yamasaki, Asato Tachibana, Yoshinori Soeno, Kinji Asahina, Hiroshi Hino, Toshimasa Asahara, Tsuyoshi Yokoi, Toshinori Furukawa, Katsutoshi Yoshizato: Near-completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol 165:901-912, 2004に記載の方法に従って融解して用いた。
ヒト肝細胞としては、BD Gentest社より購入した肝細胞（Lot No.BD51、女児、４才）を使用した。この凍結肝細胞はChise Tateno, Yasumi Yoshizane, Naomi Saito, Miho Kataoka, Rie Utoh, Chihiro Yamasaki, Asato Tachibana, Yoshinori Soeno, Kinji Asahina, Hiroshi Hino, Toshimasa Asahara, Tsuyoshi Yokoi, Toshinori Furukawa, Katsutoshi Yoshizato: Near-completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol 165:901-912, 2004に記載の方法に従って融解して用いた。
生後3〜5週齢のuPA-Tg(+/+) /SCID(+/+)マウスをエーテルで麻酔し、わき腹を約5 mm切開し、脾頭より7.5x105個のヒト肝細胞を注入した後、腹腔に止血剤ε-aminocaproic acid (SIGMA)を0.02 g/mlの濃度で40 μlづつ投与し、脾臓を腹腔に戻し縫合した。
ε-aminocaproic acidを投与したのは以下の理由による。トランスジェニックマウスの肝細胞で作られたuPAは細胞外へ分泌されるため、血中のuPA濃度が高い。uPAは、蛋白質分解やプラスミノーゲンからプラスミンへの活性化を触媒したり、フィブリンクロットを分解する働きがある。手術時の出血による死亡を避けるため、プラスミノーゲンアクチベーターおよびプラスミンの作用を阻止し止血作用の効果を有するε-aminocaproic acidを投与した。
掛け合わせに用いたSCID/c.b-17マウスは、T細胞、B細胞は持たないが、NK細胞を持つことが知られている。そこで、移植したヒト肝細胞がマウスのNK細胞に攻撃されないように、NK活性を阻害するasialo GM1抗体を移植前日と移植翌週に腹腔内に投与した。
(1-3)初代キメラマウスからのヒト肝細胞の分離
移植後、ビタミンC 0.3%含有CRF-1（オリエンタル酵母株式会社）、次亜塩素酸ナトリウム溶液0.0125％添加水道水の自由摂取により飼育した。
移植後、ビタミンC 0.3%含有CRF-1（オリエンタル酵母株式会社）、次亜塩素酸ナトリウム溶液0.0125％添加水道水の自由摂取により飼育した。
週に１回マウス尾静脈より採血し、マウス血中のヒトアルブミン濃度を栄研化学株式会社のラテックス試薬‘栄研’ALB-IIを用い、免疫比濁法により測定した。測定条件は同試薬の添付マニュアルに従った。
初代キメラマウスの血中アルブミン濃度が10 mg/mlを超えた高置換マウス(生後63〜77日)６匹を用い、二段階コラゲナーゼ灌流法により肝細胞を分離した。コラゲナーゼ濃度は0.05％、処理時間は18〜25分間とした。肝細胞にはヒト肝細胞とマウス肝細胞が混在しているが、コラゲナーゼによる毒性はヒト肝細胞に対するよりマウス肝細胞に対する方が高いため、ヒト肝細胞の比率の高い肝細胞が得られる。
(1-4)継代移植キメラマウスの作製
生後３〜５週齢のuPA/SCIDマウス39匹に、初代キメラマウスから分離した肝細胞7.5×105個を脾臓から移植した。移植方法は初代キメラマウスへのヒト肝細胞移植と同様である。肝細胞は6匹の初代キメラマウスから分離したものを用いた。６匹の初代キメラマウスから分離した細胞を、それぞれ６、８、１０、５、５、５匹のuPA-Tg(+/+) /SCID(+/+)マウスに移植した。
生後３〜５週齢のuPA/SCIDマウス39匹に、初代キメラマウスから分離した肝細胞7.5×105個を脾臓から移植した。移植方法は初代キメラマウスへのヒト肝細胞移植と同様である。肝細胞は6匹の初代キメラマウスから分離したものを用いた。６匹の初代キメラマウスから分離した細胞を、それぞれ６、８、１０、５、５、５匹のuPA-Tg(+/+) /SCID(+/+)マウスに移植した。
移植後ビタミンC 0.3%含有CRF-1（オリエンタル酵母株式会社）、次亜塩素酸ナトリウム溶液0.0125％添加水道水の自由摂取により飼育した。
週に１回マウス尾静脈より採血し、マウス血中のヒトアルブミン濃度を栄研化学株式会社のラテックス試薬‘栄研’ALB-IIを用い、免疫比濁法により測定した。
移植後死亡した継代移植マウスは10匹であり、血中ヒトアルブミン濃度が1 mg/mlを超えたマウスは16匹であった。
週に１回マウス尾静脈より採血し、マウス血中のヒトアルブミン濃度を栄研化学株式会社のラテックス試薬‘栄研’ALB-IIを用い、免疫比濁法により測定した。
移植後死亡した継代移植マウスは10匹であり、血中ヒトアルブミン濃度が1 mg/mlを超えたマウスは16匹であった。
(1-5)組織染色
初代キメラマウス（移植後86日）の肝臓切片について、ヘマトキシリン・エオジン染色、シリウスレッド染色を行った。また、継代移植キメラマウス（移植後61, 89, 124日）の肝臓切片を用いて、キメラマウス肝細胞への脂肪沈着をOil Red O染色で確認し、繊維化をシリウスレッド染色で確認した。また、継代移植キメラマウス肝臓におけるヒト肝細胞領域を特定するためにヒト肝細胞特異的なサイトケラチン8/18抗体（ICN Pharmaceuticals, Inc.）を用いて免疫染色を行った。
初代キメラマウス（移植後86日）の肝臓切片について、ヘマトキシリン・エオジン染色、シリウスレッド染色を行った。また、継代移植キメラマウス（移植後61, 89, 124日）の肝臓切片を用いて、キメラマウス肝細胞への脂肪沈着をOil Red O染色で確認し、繊維化をシリウスレッド染色で確認した。また、継代移植キメラマウス肝臓におけるヒト肝細胞領域を特定するためにヒト肝細胞特異的なサイトケラチン8/18抗体（ICN Pharmaceuticals, Inc.）を用いて免疫染色を行った。
酸化ストレスは脂肪肝障害 (NAFLD) からNASHへ症状が進行する原因の一つであるとされている。酸化ストレスをもたらすタンパク質として、CYP2E1及び4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE)が知られている。CYP2E1はフリーラジカルを発生させる酵素の一つであり、4-HNEは脂質過酸化酵素である。ここでは、初代キメラマウス及び継代移植キメラマウスの肝臓切片について、ヒトCYP2E1抗体（AFFINITY）とヒト4-HNE抗体（OXIS）を用いて免疫染色を行った。初代キメラマウスの肝臓切片はコントロールとして用いた。
また、NASH肝臓組織には、鉄沈着やアポトーシスが観察されることが知られているため、継代移植キメラマウスの肝臓切片について鉄染色（武藤化学）および TUNEL染色 (Serological Corporation)を行った。
（２）試験結果
(2-1)血中ヒトアルブミン濃度
初代キメラマウス、及び継代移植キメラマウスの血中ヒトアルブミン濃度の推移を図１に示す。継代移植キメラマウス39匹のうち10匹が移植後死亡した。生存していた29匹のうち、血中ヒトアルブミン濃度が１ mg/mlを超えたのは16匹であった。これらのマウスでは、移植後40〜60日程度で血中ヒトアルブミン濃度が１ mg/mlを超えた。
(2-1)血中ヒトアルブミン濃度
初代キメラマウス、及び継代移植キメラマウスの血中ヒトアルブミン濃度の推移を図１に示す。継代移植キメラマウス39匹のうち10匹が移植後死亡した。生存していた29匹のうち、血中ヒトアルブミン濃度が１ mg/mlを超えたのは16匹であった。これらのマウスでは、移植後40〜60日程度で血中ヒトアルブミン濃度が１ mg/mlを超えた。
(2-2)ヒト肝細胞による置換率
移植後84日の継代移植キメラマウスの肝臓の外観を図２Aに写真で示す。このときのマウス血中ヒトアルブミン濃度は4.0 mg/mlである。肝臓の白い部分は主に移植・増殖したヒト肝細胞で、初代キメラマウスに比べて脂肪変化により白っぽく観察される。濃い部分にはuPA欠損により増殖したマウス肝細胞が存在する。
移植後84日の継代移植キメラマウスの肝臓の外観を図２Aに写真で示す。このときのマウス血中ヒトアルブミン濃度は4.0 mg/mlである。肝臓の白い部分は主に移植・増殖したヒト肝細胞で、初代キメラマウスに比べて脂肪変化により白っぽく観察される。濃い部分にはuPA欠損により増殖したマウス肝細胞が存在する。
図2Bは、図2Aに示す継代移植キメラマウス肝臓の外側右葉の部分から切片を採取し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色した結果を模式的に示す図である。枠で囲った領域がマウス肝細胞領域である。面積比から求めたヒト肝細胞置換率は70％であった。外側右葉は全体肝臓重量の約40％を占める。全ての７つの葉から求めた置換率と外側右葉で求めた置換率を比較すると、高い相関がみられる。従って、外側右葉で調べた置換率はほぼ全体の置換率を反映している。
＜参考例＞
キメラマウス肝臓の全ての７つの葉から求めた置換率と外側右葉で求めた置換率を比較すると、高い相関がみられることは以下の実験から明らかである。In Vitro Technology社より購入した凍結ヒト肝細胞Lot. NLR（12才、男児）を移植したキメラマウス14匹（移植後46-102日）について、肝臓組織全7葉から組織切片を作製し、抗ヒトサイトケラチン8/18抗体陽性面積比から置換率を求めた。
肝臓組織全7葉から求めた肝臓全体の置換率と外側右葉の置換率との相関を調べたところ、相関係数R2=0.9357の相関を示した。図１０に相関図を示す。
キメラマウス肝臓の全ての７つの葉から求めた置換率と外側右葉で求めた置換率を比較すると、高い相関がみられることは以下の実験から明らかである。In Vitro Technology社より購入した凍結ヒト肝細胞Lot. NLR（12才、男児）を移植したキメラマウス14匹（移植後46-102日）について、肝臓組織全7葉から組織切片を作製し、抗ヒトサイトケラチン8/18抗体陽性面積比から置換率を求めた。
肝臓組織全7葉から求めた肝臓全体の置換率と外側右葉の置換率との相関を調べたところ、相関係数R2=0.9357の相関を示した。図１０に相関図を示す。
(2-3)肝臓の組織像
初代キメラマウス(移植後86日)と継代移植キメラマウス(移植後84日)の双方について、肝臓の内側左葉または外側右葉の部分から切片を採取し、HE染色、及びシリウスレッド染色を行った。
初代キメラマウス(移植後86日)と継代移植キメラマウス(移植後84日)の双方について、肝臓の内側左葉または外側右葉の部分から切片を採取し、HE染色、及びシリウスレッド染色を行った。
染色像を図３に示す。HE染色像から明らかなように、継代移植キメラマウスでは好中球の浸潤が認められたが、初代キメラマウスでは認められなかった。また、シリウスレッド染色像から明らかなように、軽度の繊維化が観察されたが、初代キメラマウスでは認められなかった。
継代移植キメラマウス(移植後61日，89日，124日)の肝臓の内側左葉または外側右葉の部分から切片を採取し、HE染色、及びOil Red O染色を行った。また、ヒト肝細胞特異的なサイトケラチン8/18を用いて免疫染色を行うとともに、ヘキスト染色を行った。これらの染色像を、それぞれ図４、図５、及び図６に示す。図４〜６において、サイトケラチン8/18免疫染色及びヘキスト染色で濃染された領域はヒト肝細胞領域である。
図４〜６から明らかなように、移植後61日目の継代移植キメラマウスでは、HE染色の結果、正常な肝細胞形態であることが分かり、Oil Red O染色の結果、脂肪沈着の程度が低いことが分かる。また、移植後89日目、124日目の継代移植キメラマウスでは、HE染色の結果、膨潤しているヒト肝細胞が多く観察された。また、Oil Red O染色の結果、脂肪滴が沈着しているのが観察された。
初代キメラマウス(移植後82日)と継代移植キメラマウス(移植後61日、84日)の双方について、肝臓のヒト肝細胞に置換されている部分から切片を採取し、CYP2E1の免疫染色および4-HNEの免疫染色を行った。結果を図７に示す。継代移植キメラマウス肝臓において、CYP2E1及び4-HNEの強い発現が観察された。初代キメラマウス肝臓においては、CYP2E1は弱く染色され、4-HNEはほとんど染まらなかった。
また、継代移植キメラマウス (移植後84日) について、肝臓のヒト肝細胞に置換されている部分から切片を採取し、鉄染色、及びTUNEL染色を行った。結果を図８に示す。初代キメラマウス肝臓では、肝細胞に鉄沈着やアポトーシス（apoptosis）は認められないが、継代移植キメラマウス肝臓においては、軽度な鉄沈着やTUNEL陽性の肝細胞が観察され、この変化はNASH組織にみられる変化と一致した。
以上より、継代移植キメラマウスは、移植後60日を経過した後に、好中球の浸潤、繊維化、脂肪滴の沈着、細胞の膨潤、酸化ストレス、鉄沈着、及びアポトーシスが生じることが分かる。この組織像は、NASHのヒトの肝臓組織像に酷似していることから、継代移植キメラマウスは、ヒトNASHのモデル動物として好適に使用できることが分かる。
（１）脂肪肝モデルマウスの作製
(1-1)免疫不全肝障害マウス
実施例１と同様の免疫不全肝障害マウスを使用した。
(1-1)免疫不全肝障害マウス
実施例１と同様の免疫不全肝障害マウスを使用した。
(1-2)ヒト肝細胞移植
ドナー肝細胞として、6才女児(BD Gentest社製)、または、9ヶ月男児（In Vitro Technology社）の凍結保存肝細胞を、Chise Tateno, Yasumi Yoshizane, Naomi Saito, Miho Kataoka, Rie Utoh, Chihiro Yamasaki, Asato Tachibana, Yoshinori Soeno, Kinji Asahina, Hiroshi Hino, Toshimasa Asahara, Tsuyoshi Yokoi, Toshinori Furukawa, Katsutoshi Yoshizato: Near-completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol 165:901-912, 2004に記載の方法に従って融解し用いた。
ドナー肝細胞として、6才女児(BD Gentest社製)、または、9ヶ月男児（In Vitro Technology社）の凍結保存肝細胞を、Chise Tateno, Yasumi Yoshizane, Naomi Saito, Miho Kataoka, Rie Utoh, Chihiro Yamasaki, Asato Tachibana, Yoshinori Soeno, Kinji Asahina, Hiroshi Hino, Toshimasa Asahara, Tsuyoshi Yokoi, Toshinori Furukawa, Katsutoshi Yoshizato: Near-completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol 165:901-912, 2004に記載の方法に従って融解し用いた。
生後3〜5週齢のuPA-Tg(+/+) /SCID(+/+)マウスをエーテルで麻酔し、わき腹を約5 mm切開し、脾頭より7.5×105個のヒト肝細胞を注入した後、腹腔に止血剤ε-aminocaproic acid (SIGMA)を0.02 g/mlの濃度で40μlづつ投与し、脾臓を腹腔に戻し縫合した。マウス41匹には 6才女児のドナー肝細胞を移植し、6匹には９ヶ月男児のドナー肝細胞を移植した。
移植したヒト肝細胞がマウスのNK細胞に攻撃されないように、NK活性を阻害するasialo GM1抗体を移植前日と移植翌日に腹腔内に投与した。
移植後、ビタミンC 0.3%含有CRF-1（オリエンタル酵母株式会社製）、次亜塩素酸ナトリウム溶液0.0125%添加水道水の自由摂取により飼育した。
(1-3)組織染色・脂肪化グレード
6才女児移植キメラマウスを、移植後48日から111日の間に屠殺し、肝臓を採取した。肝臓の凍結切片を作製し、Oil Red O脂肪染色を行った。染色標本の写真を撮影し、Oil Red O陽性脂肪滴の程度によって、脂肪化のグレードを0-3まで4段階に設定し、各マウスの肝臓を評価した。肝細胞にほとんど脂肪沈着が認められないものをグレード０、33％以下の肝細胞に脂肪沈着が見られるものをグレード１（軽微）、33〜66%以上の肝細胞に脂肪沈着が認められるものをグレード２（中等度）、66%以上の肝細胞に脂肪沈着が認められるのをグレード３（高度）とした（Matteoni, C.A. et al.:Nonalcohlic fatty liver disease: a spectrum of clinical and pathological severity. Gastroenterology, 116:1413-1419, 1999）。
6才女児移植キメラマウスを、移植後48日から111日の間に屠殺し、肝臓を採取した。肝臓の凍結切片を作製し、Oil Red O脂肪染色を行った。染色標本の写真を撮影し、Oil Red O陽性脂肪滴の程度によって、脂肪化のグレードを0-3まで4段階に設定し、各マウスの肝臓を評価した。肝細胞にほとんど脂肪沈着が認められないものをグレード０、33％以下の肝細胞に脂肪沈着が見られるものをグレード１（軽微）、33〜66%以上の肝細胞に脂肪沈着が認められるものをグレード２（中等度）、66%以上の肝細胞に脂肪沈着が認められるのをグレード３（高度）とした（Matteoni, C.A. et al.:Nonalcohlic fatty liver disease: a spectrum of clinical and pathological severity. Gastroenterology, 116:1413-1419, 1999）。
（２）試験結果
結果を図９に示す。図９Bは、移植後経過日数と脂肪化グレードとの関係を示すグラフであり、図９Aは、グレード0、1，2，3と判定した凍結切片のOil Red O染色像である。
結果を図９に示す。図９Bは、移植後経過日数と脂肪化グレードとの関係を示すグラフであり、図９Aは、グレード0、1，2，3と判定した凍結切片のOil Red O染色像である。
移植後60日までは、脂肪化グレードは0または1と低く脂肪滴は少なかった。移植後70日以降脂肪化グレードは増加し、大型の脂肪滴が観察され、肝細胞領域全体にみられるものもあった。キメラマウスの肝臓においては、移植後60日頃までは脂肪変化はあまりみられないが、移植後70日以降脂肪変化が見られるマウスが増加し、移植後日数の経過に伴い脂肪変化の程度が強くなると考えられた。
移植後70日以降の肝臓組織像は、ヒト脂肪肝の組織像に酷似していた。このことから、ヒト肝細胞を移植した初代キメラマウスは、ヒト脂肪肝のモデル動物として好適に使用できることが分かる。
本発明の非ヒト動物は、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎のモデル動物、又はヒト脂肪肝のモデル動物として、これらの疾患の治療剤のスクリーニング等に好適に使用できる。
Claims (12)
- 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を上記の免疫不全肝障害非ヒト動物と同種の免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを含み、第２工程を１回又は複数回行う方法により得られる非ヒト動物を、ヒト非アルコール性脂肪性肝炎モデル動物として使用する方法。
- 非ヒト動物が哺乳動物である請求項１に記載の方法。
- 哺乳動物がげっ歯類である請求項２に記載の方法。
- 第２工程を１回行う方法により得られる非ヒト動物を使用する請求項１に記載の方法。
- 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植してキメラ非ヒト動物を作製する第１工程と、キメラ非ヒト動物体内で増殖したヒト肝細胞を上記の免疫不全肝障害非ヒト動物と同種の免疫不全肝障害非ヒト動物に移植する第２工程とを含み、第２工程を１回又は複数回行う方法により得られる非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、投与前後の非アルコール性脂肪性肝炎の症状の程度を比較する工程とを含む、ヒト非アルコール性肝炎治療剤のスクリーニング方法。
- 非ヒト動物が哺乳動物である請求項５に記載の方法。
- 哺乳動物がげっ歯類である請求項６に記載の方法。
- 第２工程を１回行う方法により得られる非ヒト動物を使用する請求項５に記載の方法。
- 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して得たキメラ非ヒト動物をヒト脂肪肝モデル動物として使用する方法。
- 非ヒト動物が哺乳動物である請求項９に記載の方法。
- 哺乳動物がげっ歯類である請求項１０に記載の方法。
- 免疫不全肝障害非ヒト動物にヒト肝細胞を移植して得られるキメラ非ヒト動物に被験物質を投与する工程と、投与前後の脂肪肝の症状の程度を比較する工程とを含む、ヒト脂肪肝治療剤のスクリーニング方法。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| RU2598351C1 (ru) * | 2015-05-25 | 2016-09-20 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный областной университет | Способ моделирования неалкогольного стеатогепатита у крыс |
| RU2600476C1 (ru) * | 2015-07-24 | 2016-10-20 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Тверской государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ моделирования неалкогольной жировой болезни печени у крыс |
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| US20090313710A1 (en) | 2009-12-17 |
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