WO2021153673A1 - 免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤、遺伝子改変非ヒト動物、および免疫関連副作用モデル非ヒト動物 - Google Patents

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奈緒子 井川
亮多 田中
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Definitions

  • the present invention relates to agents that prevent and treat at least one of immune-related side effects, genetically modified non-human animals, and immune-related side effect model non-human animals.
  • Anti-PD-1 (Prommed cell death 1) antibody or anti-PD-L1 (Prommed cell death 1-Ligand 1) antibody which are immune checkpoint inhibitors, are various, including malignant melanoma and flat epithelial non-small cell lung cancer. It is effective in the treatment of cancer and is frequently used clinically as cancer immunotherapy. However, along with the anti-cancer effect, an autoimmune reaction is evoked by its mechanism of action, and various immune-related side effects (immune-related advanced events: irAEs, also referred to as immune-related adverse events) occur. Immune-related side effects occur in about 70% of cases treated with anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody.
  • Immune-related side effects can occur in systemic organs such as the lungs, intestines, and thyroid gland, but dermatitis accounts for about 40% of them, one of which is psoriasis-like dermatitis. It has been reported that patients who develop psoriasis-like dermatitis as an immune-related side effect have an increase in serum interleukin-6 (IL-6) compared to patients who do not develop immune-related side effects. (Non-Patent Document 1). However, since the pathophysiology and mechanism of onset of immune-related side effects are often unknown, non-specific immunosuppressive therapies such as steroids are currently selected as a coping method for immune-related side effects.
  • non-specific immunosuppressive therapies such as steroids are currently selected as a coping method for immune-related side effects.
  • the present inventors analyzed the pathophysiology and onset mechanism of immune-related side effects, especially psoriasis-like dermatitis, and considered that psoriasis-like dermatitis could be prevented and treated if a part of the mechanism could be inhibited. Therefore, the pathophysiology and onset mechanism of psoriasis-like dermatitis as an immune-related side effect are analyzed, and as the first aspect of the present invention, at least the prevention and treatment of the immune-related side effect by the anti-PD-1 antibody or the anti-PD-L1 antibody.
  • the challenge is to provide a drug that does one.
  • the state in which the anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody was administered can be reproduced in the model animal, it is considered that the pathophysiology and the onset mechanism of immune-related side effects can be analyzed. Therefore, as a second aspect of the present invention, it is an object of the present invention to provide a genetically modified non-human animal in which PD-1 / PD-L1 and L2 signals are inhibited in a tissue-specific and time-specific manner. Furthermore, if there is a model animal that develops immune-related side effects, we thought that it would be possible to search for and develop effective drugs for the prevention and treatment of immune-related side effects.
  • the present inventors have diligently studied to solve the above problems. As a result, they have found that the above problems can be solved by having the following configuration, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to, for example, the following [1] to [29].
  • a drug that comprises at least one of prevention and treatment of immune-related side effects caused by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, which comprises a substance that inhibits an IL-6 signal, and the immune-related side effects are skin disorders.
  • the psoriasis-like dermatitis is one in which the infiltration of CD8-positive cells into the epidermis is enhanced as compared with psoriasis vulgaris.
  • a genetically modified non-human whose expression of all or part of the PD-1 gene is suppressed or lost by introducing a mutation into the PD-1 gene or the expression regulatory region of the PD-1 gene in the genome.
  • the genetically modified non-human animal is a genetically modified non-human animal in which the expression of all or part of the PD-1 gene is suppressed or lost specifically in at least one of the tissue and the time period.
  • Immune-related side effects model non-human animals described in.
  • a drug that prevents and treats immune-related side effects caused by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody. It is possible to provide a genetically modified non-human animal in which PD-1 / PD-L1 and L2 signals are inhibited in a tissue-specific and time-specific manner. In addition, non-human animals can be provided that model immunity-related side effects with anti-PD-1 or anti-PD-L1 antibodies. It is possible to provide a method for screening a drug that performs at least one of prevention and treatment of immune-related side effects caused by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody. It is possible to provide a method for evaluating a drug that performs at least one of prevention and treatment of immune-related side effects caused by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.
  • FIG. 1 is a photograph of the skin of the back and lower legs of a patient with psoriasis vulgaris (left) and Anti-PD-1 antibody-induced psoriasis-like dermatitis (anti-PD-1 antibody-induced psoriasis-like dermatitis, right). be.
  • FIG. 2 shows tissue sections obtained from patients with psoriasis vulgaris (top) and Anti-PD-1 antibody-induced psoriasis-like dermatitis (anti-PD-1 antibody-induced psoriasis-like dermatitis, bottom) stained with hematoxyline eosin.
  • FIG. 3 shows CD8 / CD4 ratio (value obtained by dividing the number of CD8-positive T cells infiltrated into the epidermis by the number of CD4-positive T cells infiltrated into the epidermis) with psoriasis vulgaris and Anti-PD-1 antibody-induced. It is a graph which compared with the patient of psoriasis-like dermatitis (anti-PD-1 antibody-induced psoriasis-like dermatitis).
  • FIG. 4 shows changes in serum IL-6 concentration before and after administration of anti-PD-1 antibody-administered melanoma patients in patients with Psoriasis-like dermatitis (psoriasis-like dermatitis) and Other irAEs (psoriasis-like dermatitis). It is a graph comparing the patient with the onset of immune-related side effects other than) and the patient with No irAE (no immune-related side effects). Pre indicates before administration of anti-PD-1 antibody, and Post indicates after administration of anti-PD-1 antibody.
  • FIG. 5 shows the wild-type mice in the Vehicle group (left), the wild-type mice in the IMQ (imiquimod) group (center), and the PD-1 -/- mice (right) in the IMQ (imiquimod) group on the 7th day of application. It is a photograph of the back skin.
  • the left side of FIG. 6 is a graph showing changes in ear thickness between PD-1-/- mice (PD-1 -/- ) and wild-type mice (WT) coated with imiquimod.
  • the right side of FIG. 6 is a graph showing changes in the severity of inflammation in the back skin of PD-1-/- mice (PD-1 -/-) and wild-type mice (WT) coated with imiquimod.
  • FIG. 7 is a photograph of hematoxylin eosin-stained tissue sections of ear skin showing the appearance of imiquimod-induced psoriasis-like dermatitis in wild-type mice (WT) and PD-1 -/- mice (PD-1 -/-). Is.
  • the left side of FIG. 8 is a graph comparing the thickness of the ear epidermis of wild-type mice (WT) and PD-1 -/- mice (PD-1 -/-) between the imiquimod group and the vehicle group.
  • FIG. 8 is a graph showing the number of neutrophil microabscesses in the epidermis of the ears of wild-type mice (WT) and PD-1 -/- mice (PD-1 -/-).
  • FIG. 9 shows psoriasis-related cytokines (IL-6, IL-23a, IL-17a) in the ears of wild-type mice (WT) and PD-1 -/- mice (PD-1 -/-). It is a graph which analyzed the expression level of the mRNA of Ly6g which is a neutrophil surface marker by quantitative RT-PCR.
  • FIG. 9 shows psoriasis-related cytokines (IL-6, IL-23a, IL-17a) in the ears of wild-type mice (WT) and PD-1 -/- mice (PD-1 -/-). It is a graph which analyzed the expression level of the mRNA of Ly6g which is a neutrophil surface marker by quantitative RT-PCR.
  • FIG. 10 shows CD8-positive T cells stained by immunostaining tissue sections of ear skin of wild-type mice (WT) and PD-1 -/- mice (PD-1 -/-) on day 5 of imiquimod application. It is a photograph. CD8-positive T cells are indicated by arrowheads.
  • FIG. 11 shows the number of CD8-positive T cells infiltrated into the ear skin of wild-type mice (WT) and PD-1 -/- mice (PD-1 -/-) on the 5th day of imiquimod application in the epidermis and dermis. It is a comparison graph.
  • FIG. 12 is a conceptual diagram showing a procedure for separating Keratinocyte, Epidermal CD45 + cell and Dermal cell from the skin of the mouse ear.
  • FIG. 13 shows CD8a in Keratinocyte, Epidermal CD45 + cell and Dermal cell obtained from the skin of the ears of wild-type mice (WT) and PD-1 -/- mice (PD-1 -/-) on day 5 of imikimod application. , IFN- ⁇ and CXCL9 mRNA expression levels compared by quantitative RT-PCR.
  • FIG. 14 is a conceptual diagram of the genome of a floated mouse into which a 34 bp loxP sequence has been introduced upstream and downstream of the PD-1 gene region, respectively.
  • FIG. 15 shows the positions of exons of Pdcd1 (indicated by boxes, exons 1, 2, 3, 4, 5 from the right) in the genome of wild-type mice, left and right CRISPR and 3'arms (3'arm), central. It is a figure which shows the position of the arm (Carm), 5'arm (5'arm), and the left and right target arrangements (including PAM) of the CRISPR / Cas9 system.
  • FIG. 16-1 is a DNA sequence (part) of Pdcd1 in the genome of a wild-type mouse.
  • FIG. 16-2 is a continuation of FIG. 16-1.
  • FIG. 16-3 is a continuation of FIG. 16-2.
  • FIG. 16-4 is a continuation of FIG. 16-3.
  • FIG. 16-5 is a continuation of FIG. 16-4.
  • FIG. 16-6 is a continuation of FIG. 16-5.
  • FIG. 16-7 is a continuation of FIG. 16-6.
  • FIG. 16-8 is a continuation of FIG. 16-7.
  • FIG. 17-1 is a DNA sequence (part) of the pflop plateform.
  • FIG. 17-2 is a continuation of FIG. 17-1.
  • FIG. 18 is a conceptual diagram of Step 1 in the procedure for incorporating the genomic DNA of Pdcd1 into the pflop plateform.
  • FIG. 19 is a conceptual diagram of Step 2 in the procedure for incorporating the genomic DNA of Pdcd1 into the pflop plateform.
  • FIG. 20 is a conceptual diagram of Step 3 in the procedure for incorporating the genomic DNA of Pdcd1 into the pflop plateform.
  • FIG. 21 is a schematic diagram incorporating the target sequence of the CRISPR / Cas9 system into pX330.
  • FIG. 22 shows the position of the exon (indicated by box) of Pdcd1 in the genome of the PD-1 floated mouse, the position of the 3'arm (3'arm), the central arm (Carm), and the position of the 5'arm (5'arm). It is a figure which shows the cleavage site by a restriction enzyme, and the primer used for genotyping.
  • FIG. 23-1 is a DNA sequence (part) of Pdcd1 in the genome of PD-1 floated mouse.
  • FIG. 23-2 is a continuation of FIG. 23-1.
  • FIG. 23-3 is a continuation of FIG. 23-2.
  • FIG. 23-4 is a continuation of FIG. 23-3.
  • FIG. 23-5 is a continuation of FIG. 23-4.
  • FIG. 23-6 is a continuation of FIG. 23-5.
  • FIG. 23-7 is a continuation of FIG. 23-6.
  • FIG. 23-8 is a continuation of FIG. 23-7.
  • ORF open reading frame
  • It is an open reading frame (ORF) gene sequence and a corresponding amino acid sequence that are predicted after being dropped by the system (Mutation).
  • FIG. 25 shows a PD-1 conditional knockout in which a CD8-Cre mouse in which Cre was introduced downstream of the promoter of CD8 and a PD-1-floxed mouse were crossed and PD-1-deficient in a CD8-positive T cell-specific manner.
  • FIG. 26 is a photograph of the back skin of PD-1-cKO (CD8 Cre PD-1 fl / fl ) and its littermates (Littermate Ctrl (CD8 Cre PD-1 fl / + )) on the 7th day of imiquimod application. be.
  • FIG. 27 is a graph showing changes in ear thickness of PD-1-cKO (CD8 Cre PD-1 fl / fl) coated with imiquimod and its littermate Ctrl.
  • the right side of FIG. 27 is a graph showing changes in the severity of inflammation in the back skin of PD-1-cKO (CD8 Cre PD-1 fl / fl) coated with imiquimod and its littermate Ctrl.
  • the left side of FIG. 28 shows hematoxylin on the ear skin of PD-1-cKO (CD8 Cre PD-1 fl / fl ) and its littermates (Littermate Ctrl (CD8 Cre PD-1 fl / + )) on the 7th day of imiquimod application.
  • FIG. 28 shows the skin of the ear on the 7th day of imiquimod application of PD-1-cKO (CD8 Cre PD-1 fl / fl ) and its littermates (Littermate Ctrl (CD8 Cre PD-1 fl / +)). It is a graph comparing the thickness.
  • FIG. 29 shows PD-1-cKO (CD8 Cre PD-1 fl / fl ) and CD8a on the ear skin on the 7th day of imiquimod application of its littermate (Littermate Ctrl (CD8 Cre PD-1 fl / +)).
  • FIG. 30 shows the inflow region lymph nodes of PD-1-cKO (CD8 Cre PD-1 fl / fl ) and its litters (Littermate tll (CD8 Cre PD-1 fl / + )) on the 7th day of imikimod application. It is a graph which shows the number of infiltrated CD8 positive T cells.
  • FIG. 31 is a graph (right) showing a histogram of IFN- ⁇ (IFN ⁇ ) and GzmB produced by CD8-positive T cells in the influx region lymph node (left) and median fluorescence intensity (MFI).
  • MFI median fluorescence intensity
  • FIG. 32 shows the back skin of wild-type mice (WT) administered with IgG Ctrl and PD-1 -/- mice (PD-1 -/- ) administered with IgG Ctrl or MR16-1 on day 7 of imiquimod application. It is a photograph.
  • FIG. 33 Left shows the thickness of the ears of wild-type mice (WT) administered with IgG Ctrl and PD-1 -/- mice (PD-1 -/-) administered with IgG Ctrl or MR16-1 by imiquimod application. It is a graph which shows the change.
  • FIG. 33 Left shows the thickness of the ears of wild-type mice (WT) administered with IgG Ctrl and PD-1 -/- mice (PD-1 -/-) administered with IgG Ctrl or MR16-1 by imiquimod application. It is a graph which shows the change.
  • FIG. 33 shows inflammation in the back skin of wild-type mice (WT) administered with IgG Ctrl and PD-1 -/- mice (PD-1 -/-) administered with IgG Ctrl or MR16-1 due to imiquimod application. It is a graph which shows the change of severity.
  • FIG. 34 shows the ear skin of wild-type mice (WT) administered with IgG Ctrl and PD-1 -/- mice (PD-1 -/- ) administered with IgG Ctrl or MR16-1 on day 7 of imiquimod application. It is a photograph of a tissue section stained with hematoxylin eosin. The scale bar is 50 ⁇ m.
  • FIG. 34 shows the ear skin of wild-type mice (WT) administered with IgG Ctrl and PD-1 -/- mice (PD-1 -/- ) administered with IgG Ctrl or MR16-1 on day 7 of imiquimod application. It is a photograph of
  • FIG. 35 left shows the ears of wild-type mice (WT) administered with IgG Ctrl and PD-1 -/- mice (PD-1 -/- ) administered with IgG Ctrl or MR16-1 on day 7 of imiquimod application. It is the graph which compared the thickness of the epidermis.
  • FIG. 35 right shows neutrophils in the ear epidermis of wild-type mice (WT) administered with IgG Ctrl and PD-1-/-mice (PD-1-/-) administered with IgG Ctrl or MR16-1. It is a graph which shows the number of sex microabscess.
  • FIG. 36 shows the ear skin of wild-type mice (WT) administered with IgG Ctrl and PD-1 -/- mice (PD-1 -/- ) administered with IgG Ctrl or MR16-1 on day 7 of imiquimod application. It is a graph of the expression level of the mRNA of IL-6, IL-23a and IL-17a.
  • FIG. 37 shows IL-6 on day 7 of imiquimod application in wild-type mice (WT) administered with IgG Ctrl and PD-1 -/- mice (PD-1 -/-) administered with IgG Ctrl or MR16-1.
  • IL-23a and IL-17a are graphs of blood concentrations.
  • FIG. 39 left shows PD-1-cKO (CD8 Cre PD-1 fl / fl ) and its litter (Littermate Ctrl (CD8 Cre PD-1 fl / + )) to which IgG Ctrl or MR16-1 was administered. It is a graph which shows the change of the thickness of an ear by application of imiquimod.
  • FIG. 39 shows PD-1-cKO (CD8 Cre PD-1 fl / fl ) and its litter (Littermate Ctrl (CD8 Cre PD-1 fl / + )) to which IgG Ctrl or MR16-1 was administered. It is a graph which shows the change of the severity of inflammation by the application of imiquimod in the back skin.
  • FIG. 40 shows an imiquimod of PD-1-cKO (CD8 Cre PD-1 fl / fl ) and its litter (Littermate tll (CD8 Cre PD-1 fl / + )) to which IgG Ctrl or MR16-1 was administered.
  • FIG. 41 It is a photograph of a tissue section stained with hematoxylin eosin on the ear skin on the 7th day of application.
  • the scale bar is 50 ⁇ m.
  • the left side of FIG. 41 shows PD-1-cKO (CD8 Cre PD-1 fl / fl ) and its littermates (Littermate Ctrl (CD8 Cre PD-1 fl / + )) to which IgG Ctrl or MR16-1 was administered. It is a graph of the thickness of the epidermis of the ear on the 7th day of application of imiquimod.
  • FIG. 41 shows PD-1-cKO (CD8 Cre PD-1 fl / fl ) and its littermates (Littermate Ctrl (CD8 Cre PD-1 fl / + )) to which IgG Ctrl or MR16-1 was administered. It is a graph which shows the number of CD8 positive T cells which infiltrated the epidermis.
  • FIG. 42 shows the imikimod of PD-1-cKO (CD8 Cre PD-1 fl / fl ) and its littermates (Littermate tll (CD8 Cre PD-1 fl / + )) to which IgG Ctrl or MR16-1 was administered.
  • FIG. 43 shows the imikimod of PD-1-cKO (CD8 Cre PD-1 fl / fl ) and its litter (Littermate Ctrl (CD8 Cre PD-1 fl / + )) to which IgG Ctrl or MR16-1 was administered. It is a graph of the expression level of the mRNA of CD8a and IFN- ⁇ (IFN ⁇ ) in the ear skin on the 7th day of application.
  • IFN ⁇ IFN- ⁇
  • FIG. 44 is a conceptual diagram of the genome of a floated mouse in which a 34 bp loxP sequence is introduced upstream and downstream of the PD-L1 gene region, respectively.
  • FIG. 45 shows the positions of exons (indicated by boxes, exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7 from the right) of the PD-L1 gene (Cd274) in the genome of wild-type mice, and the left and right CRISPRs. It is a figure which shows the position of the 3'arm (3'arm), the central arm (Carm), and the 5'arm (5'arm), and the left and right target arrangements (including PAM) of a CRISPR / Cas9 system.
  • FIG. 45 shows the positions of exons (indicated by boxes, exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, and 7 from the right) of the PD-L1 gene (Cd274) in the genome of wild-type mice, and the left and right CRISPRs. It is a figure which shows the position of the 3'arm (3'
  • FIG. 46-1 is a DNA sequence (part) of Cd274 in the genome of a wild-type mouse.
  • FIG. 46-2 is a continuation of FIG. 46-1.
  • FIG. 46-3 is a continuation of FIG. 46-2.
  • FIG. 46-4 is a continuation of FIG. 46-3.
  • FIG. 46-5 is a continuation of FIG. 46-4.
  • FIG. 46-6 is a continuation of FIG. 46-5.
  • FIG. 46-7 is a continuation of FIG. 46-6.
  • FIG. 47 is a conceptual diagram of Step 1 in the procedure for incorporating the genomic DNA of Cd274 into the pflox plotform.
  • FIG. 48 is a conceptual diagram of Step 2 in the procedure for incorporating the genomic DNA of Cd274 into the pflox plotform.
  • FIG. 49 is a conceptual diagram of Step 3 in the procedure for incorporating the genomic DNA of Cd274 into the pflox plotform.
  • FIG. 50 is a schematic diagram incorporating the target sequence of the CRISPR / Cas9 system into pX330.
  • FIG. 51 shows the positions of exons (indicated by boxes) of Cd274 in the genome of PD-L1 frozen mice, 3'arms (3'arms), central arms (Carms), and 5'arms (5'arms). It is a figure which shows the cleavage site by a restriction enzyme, and the primer used for genotyping.
  • FIG. 52-1 is a DNA sequence (part) of Cd274 in the genome of PD-L1 floated mouse.
  • FIG. 52-2 is a continuation of FIG.
  • FIG. 52-3 is a continuation of FIG. 52-2.
  • FIG. 52-4 is a continuation of FIG. 52-3.
  • FIG. 52-5 is a continuation of FIG. 52-4.
  • FIG. 52-6 is a continuation of FIG. 52-5.
  • ORF open reading frame
  • FIG. 53 the gene sequence of the open reading frame (ORF) of the wild type (WT) PD-L1 and the corresponding amino acid sequence, and the second and third exons of PD-L1 were dropped by the Cre / loxP system. It is an open reading frame (ORF) gene sequence and a corresponding amino acid sequence, which are predicted later (Mutation).
  • FIG. 53 the gene sequence of the open reading frame (ORF) of the wild type (WT) PD-L1 and the corresponding amino acid sequence, and the second and third exons of PD-L1 were dropped by the Cre / loxP system. It is an open reading frame (ORF) gene sequence and a corresponding amino acid sequence, which are predicted later (M
  • FIG. 54 shows a PD-L1 conditional knockout mouse in which a Langerhans cell-specifically deficient PD-L1 is obtained by mating a Langerin-Cre mouse in which Cre is introduced downstream of the Langerhan promoter and a PD-L1-floxed mouse. It is a conceptual diagram of the method of making.
  • FIG. 55 is a histogram examining the expression of PD-L1 in Langerhans cells and dendritic cells.
  • FIG. 56 is a photograph of the back skin of PD-L1-cKO (PD-L1 fl / fl Language cre mouse) and its litter (Ctrl (PD-L1 fl / + Language cre mouse)) on the 5th day of imiquimod application.
  • FIG. 57 changes in ear thickness of PD-L1-cKO (PD-L1 fl / fl Language cre mouse) coated with imiquimod and its littermates (Ctrl (PD-L1 fl / + Language cre mouse)). It is a graph which shows. The lower part of FIG. 57 shows severe inflammation in the back skin of PD-L1-cKO (PD-L1 fl / fl Language cre mouse) coated with imiquimod and its littermates (Ctrl (PD-L1 fl / + Language cre mouse)). It is a graph which shows the change of degree.
  • FIG. 58 shows hematoxylin on the ear skin of PD-L1-cKO (PD-L1 fl / fl Language cre mouse) and its litter (Ctrl (PD-L1 fl / + Language cre mouse)) on day 5 of imiquimod application. It is a photograph of a tissue section stained with eodin. The scale bar is 50 ⁇ m.
  • FIG. 59 shows the epidermis of the ear of PD-L1-cKO (PD-L1 fl / fl Language cre mouse) and its litter (Ctrl (PD-L1 fl / + Language cre mouse)) on day 5 of imiquimod application. It is a graph comparing the thickness.
  • FIG. 60 shows IL in the ear skin of PD-L1-cKO (PD-L1 fl / fl Language cre mouse) and its litter (Ctrl (PD-L1 fl / + Language cre mouse)) on day 4 of imiquimod application. It is a graph of the expression level of mRNA of -6, IL-17A, and IL-23A.
  • FIG. 61 shows ⁇ T cells in the ear skin of PD-L1-cKO (PD-L1 fl / fl Language cre mouse) and its litter (Ctrl (PD-L1 fl / + Language cre mouse)) on day 4 of imiquimod application. It is a dot plot and a graph which show the result of the analysis of.
  • FIG. 62 shows PD-L1-cKO (PD-L1 fl / fl Language cre mouse) and its littermates (Ctrl (PD-L1 fl / + Language cre mouse)) in the inflow region lymph node on day 4 of imiquimod application. It is a graph which shows the result of having analyzed ⁇ T cells.
  • FIG. 63 is a diagram showing the positions of exons (indicated by box) of the PD-L2 gene (CD273) in the genome of wild-type mice, the target sequence of the CRISPR-Cas system, and the PAM sequence.
  • FIG. 64 is a table showing PCR conditions for determining a wild-type mouse (WT) or a PD-L2 frozen mouse (PD-L2 frozen).
  • FIG. 65-1 is a (partial) DNA sequence of Pdcd1lg2 (PD-L2) in the genome of a wild-type mouse (WT).
  • FIG. 65-2 is a continuation of FIG. 65-1.
  • FIG. 65-3 is a continuation of FIG.
  • FIG. 65-4 is a continuation of FIG. 65-3.
  • FIG. 65-5 is a continuation of FIG. 65-4.
  • FIG. 65-6 is a continuation of FIG. 65-5.
  • FIG. 66-1 is a DNA sequence (part) of Pdcd1lg2 (PD-L2) in the genome of PD-L2 frozen mouse).
  • FIG. 66-2 is a continuation of FIG. 66-1.
  • FIG. 66-3 is a continuation of FIG. 66-2.
  • FIG. 66-4 is a continuation of FIG. 66-3.
  • FIG. 66-5 is a continuation of FIG. 66-4.
  • FIG. 66-6 is a continuation of FIG. 66-5.
  • the present invention is roughly divided into five aspects.
  • the first aspect is a drug that comprises at least one of the prevention and treatment of immune-related side effects by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, which comprises a substance that inhibits an IL-6 signal, wherein the immune-related side effects.
  • the second aspect is a genetically modified non-human animal into which a recombinant target sequence that sandwiches a part or all of the PD-1 gene or the expression regulatory region of the PD-1 gene in the genome has been introduced.
  • a third aspect is the introduction of mutations into the PD-1 gene or the expression regulatory region of the PD-1 gene in the genome, thereby causing all or part of the PD-1 gene to be specific to at least one of tissue and time.
  • the fourth aspect is a gene in which the expression of all or part of the PD-1 gene is suppressed or lost by introducing a mutation into the expression-regulating region of the PD-1 gene or PD-1 gene in the genome.
  • the expression of all or part of the PD-L1 gene is suppressed or partially performed in a Langerhans cell-specific manner by introducing a mutation into the expression-regulating region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome. It is a genetically modified non-human animal that has been lost.
  • the expression of all or part of the PD-L1 gene is suppressed or partially suppressed in a Langerhans cell-specific manner by introducing a mutation into the expression-regulating region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome. It is an immune-related side effect model non-human animal by anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody, which is prepared by administering an antigenic enhancer to a genetically modified non-human animal that has been lost.
  • the seventh aspect is the genetically modified non-human animal according to the third aspect, the immune-related side effect model non-human animal according to the fourth aspect, the genetically modified non-human animal according to the fifth aspect, or the sixth aspect.
  • An immune-related side effect model A method of screening a drug for preventing and treating an immune-related side effect by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody using a non-human animal.
  • the eighth aspect is the genetically modified non-human animal of the third aspect, the immune-related side effect model non-human animal of the fourth aspect, the genetically modified non-human animal of the fifth aspect, or the sixth aspect.
  • An immune-related side effect model A method for evaluating a drug that uses a non-human animal to prevent or treat an immune-related side effect by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.
  • a ninth aspect is a genetically modified non-human animal into which a recombinant target sequence that sandwiches a part or all of the expression regulatory region of the PD-L2 gene or PD-L2 gene in the genome has been introduced. Next, the present invention will be specifically described.
  • antibody as used herein is used in the broadest sense, and includes a fragment of an antibody, an antibody-modified product, a modified antibody, and the like as long as it exhibits a desired antigen-binding activity.
  • the animal species from which the antibody is derived is not limited, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • a genetically modified antibody artificially modified for the purpose of reducing heterologous antigenicity for example, a chimeric antibody, a humanized antibody, or the like may be used. Further, it may be an antibody modified product bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • a recycling antibody may be a recycling antibody, a sweeping antibody, a bispecific antibody, a T cell redirecting antibody modified for the purpose of improving the blood retention of the antibody or antigen, or the like, enhancing or suppressing ADCC activity.
  • It may be an antibody that has undergone type Fc ⁇ receptor selective binding enhancement or the like. These modified antibodies can be produced using known methods.
  • a mammalian-derived monoclonal antibody is particularly preferable, and a mammalian-derived monoclonal antibody which is a chimeric antibody or a humanized antibody is more preferable.
  • a known antibody may be used, or a newly prepared antibody may be used.
  • the antibody can be prepared by a known method.
  • the antibody to be newly produced may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody obtained by immunizing an animal with an antigen, or may be produced by using a gene recombination technique known to those skilled in the art based on a known antibody sequence. It may be an antibody to be produced.
  • a recombinant antibody is produced by cloning the DNA encoding it from an antibody-producing cell such as a hybridoma or an antibody-producing sensitized lymphocyte, incorporating it into an appropriate vector, and introducing it into a host (host cell) to produce it. Can be obtained.
  • the substance that inhibits the interleukin-6 (IL-6) signal in the present invention is a substance that blocks the signal by IL-6 and inhibits the biological activity of IL-6.
  • the IL-6 receptor (IL-6R, also referred to as CD126) using IL-6 as a ligand includes the membrane-bound IL-6 receptor expressed on the cell membrane and the secretory soluble IL-6 receptor (IL-6 receptor).
  • IL-6 receptor There is a Solvel IL-6 Receptor (sIL-6R), and the secretory soluble IL-6 receptor is composed of a membrane-bound intracellular region and an extracellular region excluding the transmembrane region.
  • the IL-6 receptor binds to IL-6 to form a complex, and the complex associates with gp130 on the cell membrane to dimerize, thereby transmitting the IL-6 signal into the cell.
  • IL-6, IL-6R or gp130 in the present invention include those derived from primate mammals including mice, rats, hamsters, guinea pigs, dogs, pigs, monkeys or humans, respectively.
  • IL-6, IL-6R or gp130 is preferably human IL-6, human IL-6R or human gp130.
  • Substances that inhibit the IL-6 signal are selected from, for example, substances having an inhibitory effect on binding to at least one selected from IL-6, IL-6R and gp130, and IL-6, IL-6R and gp130. It is a substance that inhibits at least one expression.
  • a specific binding substance to at least one protein selected from IL-6, IL-6R and gp130 That is, a specific binding substance for IL-6, a specific binding substance for IL-6R, a specific binding substance for gp130, and the like can be mentioned.
  • Specific binding agents for IL-6R are preferred because they can effectively prevent or treat immune-related side effects.
  • the specific binding substance for at least one protein selected from IL-6, IL-6R and gp130 is not particularly limited, and is, for example, anti-IL-6 antibody, anti-IL-6R antibody, anti-gp130 antibody, and these.
  • the antibody fragment include F (ab') 2, Fab', Fab, Fv, scFv and the like.
  • an aptamer for example, a nucleic acid aptamer, a peptide aptamer and the like can be mentioned.
  • Anti-gp130 antibodies and fragments of these antibodies are preferred, with anti-IL-6R antibodies particularly preferred.
  • the anti-IL-6 antibody inhibits the binding of IL-6 to IL-6R and inhibits the IL-6 signal.
  • the anti-IL-6 antibody is not limited to these, but is limited to MH166 (Matsuda T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956) and SK2 antibody (Sato K. et.). Al., The 21st Annual Meeting of the Japan Society for Immunology, Academic Records (1991) 21, 166), Silkumab, which is a human anti-IL-6 monoclonal antibody, and the like.
  • one type of anti-IL-6 antibody may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the anti-gp130 antibody By binding to gp130, the anti-gp130 antibody inhibits the binding of the IL-6 / IL-6R complex to gp130 and inhibits the IL-6 signal.
  • the anti-gp130 antibody is not limited to these, but AM64 antibody (Japanese Patent Laid-Open No. 3-2198994), 4B11 antibody and 2H4 antibody (US5551513), B-S12 antibody and BP8 antibody (Japanese Patent Laid-Open No. 8-291199). ) And so on. Further, the anti-gp130 antibody may be used alone or in combination of two or more.
  • the anti-IL-6R antibody inhibits the binding of IL-6 to IL-6R and inhibits the IL-6 signal.
  • the anti-IL-6R antibody may be an antibody that binds to both the membrane-bound IL-6 receptor and the soluble IL-6 receptor, or it binds only to the membrane-bound IL-6 receptor and is soluble. It may be an antibody that does not bind to the IL-6 receptor, or an antibody that binds only to the soluble IL-6 receptor and does not bind to the membrane-bound IL-6 receptor. Further, the anti-IL-6R antibody may be used alone or in combination of two or more.
  • anti-IL-6R antibodies are, but are not limited to, MR16-1 antibodies (Tamura T, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 90 (24): 1124-1928, 1993),. PM-1 antibody (Hirata Y, et al. J Immunol, 143 (9): 2900-2906, 1989), AUK12-20 antibody, AUK64-7 antibody or AUK146-15 antibody (International Publication No. 92/19759), Examples thereof include tocilizumab, which is a humanized anti-IL-6 receptor monoclonal antibody, Sarilumab, which is an anti-human IL-6 receptor monoclonal antibody, and SA237.
  • a mammalian-derived monoclonal antibody is particularly preferable, and a mammalian-derived anti-IL-6R monoclonal antibody, which is a chimeric antibody or a humanized antibody, is more preferable.
  • Preferred monoclonal antibodies against human IL-6R include tocilizumab or sarilumab, and preferred monoclonal antibodies against mouse IL-6R include MR16-1 antibody. Further, a humanized antibody of MR16-1 antibody is also preferably used.
  • a substance that inhibits the expression of at least one selected from IL-6, IL-6R and gp130 a substance that can reduce the expression of IL-6, IL-6R or gp130 and, as a result, inhibit the IL-6 signal.
  • the present invention is not particularly limited, and examples thereof include siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, antisense nucleic acid, and low molecular weight compounds. SiRNA, shRNA, miRNA, ribozyme and antisense nucleic acids may contain various chemical modifications to improve stability and activity.
  • the phosphate residue may be replaced with a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate, methylphosphonate, or phosphorodithionate.
  • a chemically modified phosphate residue such as phosphorothioate, methylphosphonate, or phosphorodithionate.
  • at least a part thereof may be composed of nucleic acid analogs such as peptide nucleic acid (PNA).
  • PNA peptide nucleic acid
  • PD-1 Programmed cell death 1
  • PD-L1 Programmed cell death 1-Light 1
  • It is a protein present on the cell surface that has the function of activating.
  • PD-1 or PD-L1 in the present invention includes those derived from primate mammals including mice, rats, hamsters, guinea pigs, dogs, pigs, monkeys or humans, respectively.
  • PD-1 in the present invention is human PD-1 and PD-L1 is human PD-L1.
  • Anti-PD-1 antibody and anti-PD-L1 antibody inhibit the binding of PD-1 to PD-L1 and inhibit the PD-L1 / PD-1 signal.
  • Anti-PD-1 antibodies include, but are not limited to, nivolumab, pembrolizumab, cemiplimab, spartarizumab, pidilizumab, and the like.
  • One type of anti-PD-1 antibody may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • anti-PD-L1 antibody examples include, but are not limited to, atezolizumab, Avelumab, Durvalumab, BMS-936559 and the like.
  • One type of anti-PD-L1 antibody may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the immune-related side effects of the anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody in the present invention are anti-cancer effects caused by administration of anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody as an immune checkpoint inhibitor.
  • Other effects include skin disorders, myasthenia gravis, myositis, myositis, rhabdomyolysis, type I diabetes, neuropathy, nephropathy, arthritis, liver disorders, pneumonia, pancreatitis, thyroiditis, adnephritis. , At least one selected from hypothalamic dysfunction, and pan-pituitary dysfunction.
  • the immune-related side effects caused by the anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody are preferably at least one selected from skin disorders, liver disorders, pneumonia, and thyroiditis because they can be effectively prevented or treated according to the present invention. , More preferably a skin disorder.
  • the liver disorder is not particularly limited as long as it is a disorder caused in the liver by administration of anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody, and is not particularly limited, for example, AST (GOT), ALT (GPT), ⁇ -GTP, AST. , ALT and other liver enzymes and elevated total bilirubin can be used for diagnosis.
  • AST GAT
  • ALT GTP
  • ⁇ -GTP ⁇ -GTP
  • AST. ALT and other liver enzymes and elevated total bilirubin
  • the pneumonia is not particularly limited as long as it is pneumonia caused by administration of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody. Can be diagnosed.
  • the thyroiditis is not particularly limited as long as it is thyroiditis caused by administration of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, for example, hypothyroidism or hyperthyroidism, and TSH in blood. , Free T3, free T4 and thyroid ultrasound can be used for diagnosis.
  • Hypothalamic dysfunction, pan pituitary dysfunction, and adrenitis are not particularly limited as long as they are caused by administration of anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody. Diagnosis can be made by measuring ACTH, LH, FSH, GH, prolactin, cortisol, aldosterone, androgen, adrenaline, noradrenaline, estrogen, progesterone and the like.
  • the skin disorder is not particularly limited as long as it is a disorder caused on the skin by administration of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, for example, mucocutaneous ocular syndrome (Stevens-Johnson syndrome: SJS), addictive.
  • Epidermoid necrolysis Toxy Epidermal Necrolysis: TEN
  • psoriasis psoriasis psoriasis vulgaris, psoriasis arthropathy
  • the immune-related side effects of anti-PD-1 or anti-PD-L1 antibodies are preferably mucocutaneous ocular syndrome (Stevens-Johnson syndrome: SJS), toxic epidermal necrolysis, as can be effectively prevented or treated by the present invention.
  • SJS mucocutaneous ocular syndrome
  • toxic epidermal necrolysis As can be effectively prevented or treated by the present invention.
  • Toxic Epidermal Necrolysis: TEN Toxic Epidermal Necrolysis: TEN
  • psoriasis, psoriasis or psoriasis-like dermatitis more preferably psoriasis or psoriasis-like dermatitis, and even more preferably psoriasis-like dermatitis.
  • Psoriasis and psoriasis-like dermatitis usually have keratotic erythema with thick silvery white scales and pathologically psoriasis-like epidermal hyperplasia and granular layer. It can be diagnosed by the presence of parakeratosis and subepidermal neutrophil microabscess.
  • Mucocutaneous ocular syndrome toxic epidermal necrolysis
  • mucocutaneous ocular syndrome is characterized by erosive erythema of the mucous membrane and skin, mucocutaneous ocular syndrome is less than 10% of body surface area, and toxic epidermal necrolysis is more than 10%. You can see the erosion.
  • histopathologically it is diagnosed from the fact that lymphocytes infiltrate from the upper dermis into the epidermis with extensive epidermal keratinization cell death called keratinocyte reaction.
  • Lichen planus is a localized keratinized erythema and is diagnosed by histopathologically a lichen reaction. Vitiligo is diagnosed with well-defined depigmentation spots.
  • anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody causes mucocutaneous ocular syndrome (Stevens-Johnson syndrome: SJS), toxic epidermal necrolysis (TEN), erythema, psoriasis, psoriasis-like It has been reported that various types of inflammatory skin diseases other than diseases such as dermatitis and white spots are caused, and show erythema, psoriasis, rash and the like.
  • the immune-related side effects of the anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody are preferably psoriasis-like dermatitis in which the infiltration of CD8-positive cells into the epidermis is enhanced. More preferably, it is psoriasis-like dermatitis in which the infiltration of CD8-positive cells into the epidermis is higher than that of psoriasis vulgaris.
  • one of the preferred embodiments of the present invention is an agent that comprises at least one of prevention and treatment of immune-related side effects caused by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, which comprises a substance that inhibits an IL-6 signal.
  • the drug is a psoriasis-like dermatitis in which the immune-related side effects are characterized by increased infiltration of CD8-positive cells into the epidermis.
  • Another preferred embodiment of the present invention is an agent that inhibits the infiltration of CD8-positive cells into the epidermis, which comprises a substance that inhibits the IL-6 signal.
  • the method for confirming that the infiltration of CD8-positive cells into the epidermis is not particularly limited, but for example, immunostaining for CD8 using a sample collected from the affected area is performed, and the number of stained cells per unit area. Is to confirm.
  • the method for confirming that the infiltration of CD8-positive cells into the epidermis is higher than that of psoriasis vulgaris is not particularly limited. This can be confirmed by the fact that the number per unit area is higher than that of psoriasis vulgaris specimens.
  • both the anti-PD-1 antibody and the anti-PD-L1 antibody may be used in combination, and only one of the anti-PD-1 antibody and the anti-PD-L1 antibody is administered. You may.
  • the anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody may be administered in combination with other immune checkpoint inhibitors, and other immune checkpoint inhibitors include, for example, anti-CTLA-1 antibody and anti-LAG-. Examples thereof include 3 antibodies, anti-TIM-3 antibody, anti-TIGIT antibody, anti-KIR antibody, anti-B7 antibody, anti-C27 antibody, IDO inhibitor, anti-CD137 antibody and the like.
  • examples of the anti-CTLA-1 antibody include ipilimumab and tremelimumab.
  • the usage and dosage of the anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody are not particularly limited, and are usually determined according to the characteristics of the antibody and the expected anti-cancer effect.
  • 3 mg / kg (body weight) is intravenously infused at 2-week intervals, or 240 mg is intravenously infused at 2-week intervals.
  • 240 mg is intravenously infused at 2-week intervals.
  • pembrolizumab 2 mg / kg (body weight) is intravenously infused over 30 minutes at 3-week intervals, or 200 mg is intravenously infused over 30 minutes at 3-week intervals.
  • diseases to which anti-PD-1 or anti-PD-L1 antibodies are administered are not particularly limited, but usually various cancers such as malignant melanoma, non-small cell lung cancer, renal cell cancer, classical Hodgkin lymphoma, head and neck. Part cancer, gastric cancer, non-flat epithelial cancer, squamous epithelial cancer, solid cancer with high frequency microsatellite instability (MSI-High), bladder cancer, renal pelvis cancer, urinary tract cancer, urinary tract cancer, breast cancer, hepatocellular carcinoma, Multiple myeloma, esophageal cancer, renal cell cancer, colon cancer, ovarian cancer, prostate cancer, etc.
  • the disease to which the anti-PD-1 antibody or the anti-PD-L1 antibody is administered is preferably malignant melanoma because a sufficient anti-cancer effect can be expected.
  • the agent according to the first aspect of the present invention is an agent that comprises at least one of prevention and treatment of immune-related side effects caused by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, which comprises a substance that inhibits an IL-6 signal.
  • the immune-related side effects are skin disorder, myasthenia gravis, myositis, myositis, rhabdomyolysis, type I diabetes, neuropathy, nephropathy, arthritis, liver disorder, pneumonia, pancreatitis, thyroiditis, adrenitis. , At least one drug selected from hypothalamic dysfunction, and pan-pituitary dysfunction.
  • the dose of the drug is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the type and degree of symptom of immune-related side effects, the type of drug, the body weight of the administration target, and the like.
  • the substance that inhibits the IL-6 signal is an anti-IL-6R antibody
  • the amount of the anti-IL-6R antibody is intravenously infused at intervals of 1 to 8 weeks so that the amount of the anti-IL-6R antibody is 1 to 100 mg / kg at a time. be able to.
  • tocilizumab or sarilumab When tocilizumab or sarilumab is administered to humans, it is preferably administered by intravenous drip infusion at intervals of 1 to 8 weeks so as to be 2 to 12 mg / kg at a time, and 3 to 10 mg / kg at a time is more preferable.
  • the substance that inhibits the IL-6 signal may be administered to the living body as it is, but it is preferable to administer it as a drug in which an effective amount of the substance that inhibits the IL-6 signal is blended with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the administration method is not particularly limited and may be oral or parenteral, preferably parenteral, more preferably intravenous infusion, and even more preferably intravenous drip infusion.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is not particularly limited, but is, for example, a buffer solution such as phosphate, citrate, and other organic acids; an antioxidant containing ascorbic acid and methionine; octadecyldimethylbenzyl chloride.
  • Preservatives such as ammonium, hexamethonium chloride, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, benzyl alcohol, alkylparaben, catechol, resorcinol, cyclohexanol, 3-pentanol, m-cresol; low molecular weight polypeptides; serum albumin, gelatin , Or proteins such as immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, or lysine; sugars such as glucose, mannose, sucrose, mannitol, trehalose, sorbitol, dextrin; EDTA Chelating agents such as; salt-forming counterions such as sodium; metal complexes; polyhydric alcohols such as polyethylene glycol (PEG), nonionic surfactants such as polysorbate 20, polysorbate 80 and the like.
  • the administration target of the drug is not particularly limited, but mammals are preferable, and humans are more preferable.
  • the target of administration of the drug is preferably a patient with psoriasis-like dermatitis caused by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, and among them, a patient in which increased infiltration of CD8-positive cells into the epidermis is observed. More preferably, the patient is more preferably a patient in which the infiltration of CD8-positive cells into the epidermis is found to be higher than that of psoriasis vulgaris.
  • the genetically modified non-human animal in the present invention is not particularly limited as long as it is an animal other than human, but is preferably a mammal (for example, pig, dog, monkey, mouse, rat, guinea pig, rabbit), and more preferably. It is a rodent animal such as a mouse, a rat, a guinea pig, and a rabbit from the viewpoint of easiness of obtaining a next-generation animal by gene recombination and mating.
  • the genetically modified non-human animals include not only adults but also ES cells, fertilized eggs, embryos, eggs, sperms, tissue or organ cultures, chimeric animals, etc. from the 8-cell stage to blastocyst formation and just before birth. Includes aspects. These may be in a frozen state if necessary for storage.
  • a genetically modified non-human animal according to a third aspect of the present invention is specific to at least one of tissue and time by introducing a mutation into the expression regulatory region of the PD-1 gene or PD-1 gene in the genome.
  • the expression of all or part of the PD-1 gene is suppressed or lost. That is, it is characterized in that the expression of a part or all of the PD-1 gene is conditionally suppressed (knockdown) or lost (knockout).
  • the genetically modified non-human animal according to the third aspect of the present invention is also referred to as a conditional PD-1 genetically modified non-human animal, and is a conditional PD-1 knockout non-human animal and a conditional PD-1 knockdown non-human animal.
  • the conditional PD-1 genetically modified non-human animal is preferably a conditional PD-1 knockout non-human animal because it is easy to analyze the function of PD-1.
  • conditional PD-1 gene-modified non-human animal of the present invention is not particularly limited, but the same effect as when PD-L1 and L2 / PD-1 signals are inhibited can be obtained in a time-specific and tissue-specific manner. From, elucidation of the mechanism of PD-L1, L2 / PD-1 signal transduction system, analysis of pathological conditions caused by PD-L1, L2 / PD-1 signal inhibition, pathological conditions caused by PD-L1, L2 / PD-1 signal inhibition It can be used for the development of preventive and therapeutic agents.
  • analysis of pathological conditions caused by PD-L1, L2 / PD-1 signal inhibition, or prevention of pathological conditions caused by PD-L1, L2 / PD-1 signal inhibition It is preferably used for the development of therapeutic agents, analysis of pathological conditions caused by anti-PD-L1 antibody or anti-PD-1 antibody, prevention of pathological conditions caused by anti-PD-L1 antibody or anti-PD-1 antibody, development of therapeutic agents. It is more preferable to use it for analysis of immune-related side effects caused by anti-PD-L1 antibody or anti-PD-1 antibody, or prevention and therapeutic agents of immune-related side effects caused by anti-PD-L1 antibody or anti-PD-1 antibody. It is more preferable to use it for development and the like.
  • conditional PD-1 genetically modified non-human animal of the present invention may be bred without stimulation, but may be stimulated or loaded. Stimulation or loading makes it easier to observe the characteristics of conditional PD-1 genetically modified non-human animals more clearly.
  • the stimulus or load is not particularly limited, and may be, for example, a chemical, physical, or physiological stimulus or load, and may include a stimulus or load due to a drug, breeding density, exercise, radiation, ultraviolet rays, diet, or the like.
  • the stimulation or loading is preferably chemical stimulation or loading, more preferably stimulation or loading with an antigenic reinforcing agent.
  • Mutations in the PD-1 gene or the expression regulatory region of the PD-1 gene are such that the expression of all or part of the PD-1 gene is suppressed or abolished, thereby substantially inactivating PD-1.
  • the mutation introduced can be any of insertion, deletion, modification, or substitution, and the number of bases to be mutated is not limited.
  • the mutation is preferably introduced into the PD-1 gene rather than the expression regulatory region of the PD-1 gene.
  • the PD-1 genome When a mutation is introduced into the PD-1 gene, the PD-1 genome consists of exons 1 to 5, preferably in the range exons 1 to 4, more preferably in the range exons 2 to 4. Introduce mutations.
  • a conditional knockout mouse in which PD-1 was specifically inactivated in at least one of tissues and time by introducing mutations into exons 2, 3, and 4 of the mouse PD-1 genome was obtained. I succeeded in getting it.
  • the PD-1 gene whose expression is suppressed or lost in non-human animals may be all or part of the PD-1 gene, but is preferably a part of the PD-1 gene. Is.
  • the PD-1 gene whose expression is suppressed or lost is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, and particularly preferably 80% or more of the ORF.
  • the PD-1 genome whose expression is suppressed or lost is preferably part of the range of exons 1 to 4, more preferably part of the range of exons 2 to 4, and even more preferably. Exons 2, 3, and 4.
  • the method for introducing a mutation into the PD-1 gene or the expression regulation region of the PD-1 gene in the genome is not particularly limited, and a known method can be used.
  • a gene recombination-inducing method using a recombinant protein / recombinant target sequence system can be mentioned.
  • the recombinant protein / recombinant target sequence system utilizes the fact that a specific recombinant protein recognizes the recombinant target sequence and causes DNA recombination in that portion.
  • the recombination target sequence does not undergo recombination unless a specific recombination is present. Therefore, a genetically modified non-human animal in which the recombinant protein is specifically expressed in at least one of the tissues and the time period is crossed with a genetically modified non-human animal of the same species into which the recombinant target sequence has been introduced, and recombination by the recombinant is performed.
  • Recombinase protein / recombine target sequence system includes, for example, Cre / loxP sequence system using Cre recombinase protein derived from bacteriophage P1 and loxP sequence of 34 base pairs recognized by Cre protein, FLP protein derived from yeast. / FRT sequence system, pSR1 recombinase of Zygosaccharomyces rouxii / pSR1 recombine target sequence system, Gin protein / gif sequence system derived from bacteriophage Mu, and the like.
  • Cre / loxP sequences FLP protein / FRT sequences, or pSR1 recombinase / pSR1 recombinase target sequences are preferred and Cre / loxP systems are more preferred because of their simplicity of operation.
  • the conditional PD-1 gene-modified non-human animal of the present invention is preferably a gene into which a recombinant target sequence that sandwiches a part or all of the expression-regulating region of the PD-1 gene or PD-1 gene in the genome has been introduced. It is a conditional PD-1 gene-modified non-human animal produced by crossing a modified non-human animal with a recombinant non-human animal that specifically expresses a recombease protein that is CD8-positive T cell, and more preferably.
  • tissue and timing at which expression of the PD-1 gene is suppressed or lost can be selected according to the tissue specificity and timing specificity of the recombinant non-human animal recombinant protein expression to be crossed.
  • tissue specificity and timing specificity of the recombinant non-human animal recombinant protein expression to be crossed.
  • Various recombinant non-human animals that express the recombinant protein in a time-specific or tissue-specific manner have been reported and can be selected according to the purpose of the experiment, and the genetically modified non-human animal described later can be selected. It may be newly prepared according to the method for producing an animal.
  • the expression of the recombinant protein in non-human animals is not particularly limited as long as it is specific to at least one of the tissue and the time.
  • Tissue-specific and time-specific means that it is tissue-only, time-only, or tissue-specific and time-specific, and is preferably tissue-specific.
  • the tissue is a concept including cells and organs in addition to tissues such as epithelial tissue and connective tissue, but is preferably cells.
  • the cells are not particularly limited, and are various somatic cells and germ cells mainly derived from endoderm, ectoderm, or mesoderm.
  • the cells are preferably inflammatory cells, more preferably eosinophils, mast cells (mast cells), neutrophils, basophils, T cells, NK (natural killer), macrophages, or dendritic cells, even more preferably.
  • T cells especially CD8 positive T cells.
  • the organ is not particularly limited, and includes, for example, the eyeball, cornea, lung, heart, liver, kidney, spleen, pancreas, gallbladder, esophagus, stomach, small intestine, large intestine, bladder, prostate, testis, ovary, blood vessel, skin and the like. can give.
  • Time-specific means that it is specific to a particular time point or time period in the life of a non-human animal from development to death.
  • the recombinant target sequence is preferably a loxP sequence.
  • the position at which the recombinant target sequence is introduced is usually determined by the type and position of the mutation to be introduced into the expression regulatory region of the PD-1 gene or PD-1 gene.
  • the portion of the expression loss is usually sandwiched between a plurality of recombination target sequences in the same direction.
  • the plurality of recombinant target sequences is preferably two recombinant target sequences.
  • the presence of the recombinant protein causes a part or all of the expression regulatory region of the PD-1 gene or PD-1 gene sandwiched between multiple recombinant target sequences. Will be deleted.
  • the recombinant target sequence is introduced by sandwiching a part or all of the PD-1 gene or the expression regulation region of the PD-1 gene in the genome. Since the PD-1 genome consists of exons 1 to 5, the recombinant target sequence is preferably introduced with a portion of the range of exons 1 to 5, more preferably within the range of exons 1 to 4. It is introduced with a part sandwiched between them, and more preferably with exons 2, 3 and 4 sandwiched between them. In the examples described later, we succeeded in obtaining a genetically modified non-human animal in which a recombinant target sequence was introduced across exons 2, 3 and 4 of the mouse PD-1 genome.
  • the loxP sequence is not limited to 5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATATACGAAGTTATA-3'(SEQ ID NO: 1), which is the sequence used in the examples described later.
  • the sequence may be mutated as long as it is a sequence recognized by Cre. For example, it is a sequence represented by 5'-ATAACTTCGTATATANNNTANNNTATACGAAGTTATA-3'(SEQ ID NO: 2).
  • conditional PD-1 gene-modified non-human animals can be obtained by multiplying these. Can be produced. These conditional PD-1 genetically modified non-human animals are useful for analyzing the function of PD-1 gene, PD-1 protein, PD-L1, L2 / PD-1 signal.
  • the genetically modified non-human animal into which the recombinant target sequence has been introduced can be produced by the following method for producing a genetically modified non-human animal.
  • Method for producing genetically modified non-human animals The method for producing a genetically modified non-human animal is not particularly limited, and a known genetically modified technique can be used.
  • Known gene modification techniques include, for example, a method of injecting an artificial foreign gene into a fertilized egg and modifying the gene by homologous recombination, a method of injecting a targeting vector into an ES cell and modifying the gene by homologous recombination, and an arbitrary genomic DNA sequence.
  • a genome editing technique that induces a mutation at a specific location on the genome by using an artificial restriction enzyme that specifically cleaves the gene can be mentioned.
  • Examples of the genome editing technology include a method using a CRISPR / Cas system, a method using a Transcriction Activator-Like Effector Nuclease (TALEN), a method using a zinc finger nuclease, and the like.
  • TALEN Transcriction Activator-Like Effector Nuclease
  • the genome editing technique it is preferable to use the genome editing technique, and it is more preferable to use the CRISPR / Cas system because the genetically modified non-human animal can be efficiently produced in a short period of time.
  • CRISPR / Cas system The production of genetically modified non-human animals using the CRISPR / Cas system can be performed by a known method, but usually, when CRISPR enzyme, guide RNA, or knock-in is performed, donor DNA is used in addition to these.
  • CRISPR enzyme is one of the Cas protein families that make up the adaptive immune system that provides acquired resistance to invasive alien nucleic acids in bacteria and archaea, recognizing the PAM sequence in exogenous DNA and two upstream of it. An endonuclease that cleaves main-stranded DNA so that it has a blunt end.
  • a CRISPR enzyme is meant to form a complex with a guide RNA and have DNA-cleaving activity.
  • the family of CRISPR enzymes includes, for example, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (also known as Csn1 and Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1. , Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx1 , Csf2, Csf3, Csf4, their homologues, or their modifications.
  • Cas9, its homologue, or a modified version thereof is preferably used.
  • the CRISPR enzyme may be used as a CRISPR enzyme protein or as a nucleic acid encoding a CRISPR enzyme.
  • the nucleic acid encoding the CRISPR enzyme may be introduced into an expression vector.
  • the CRISPR enzyme protein can be expressed in a non-human animal fertilized egg or the like after the introduction.
  • the CRISPR enzyme is preferably used in the form in which the nucleic acid encoding the CRISPR enzyme is introduced into the expression vector.
  • the expression vector known ones can be used, and examples thereof include a viral vector, a bacterial vector, a protozoan vector, a DNA vector, and a recombinant vector obtained by recombining them.
  • the viral vector include a lentivirus vector, a baculovirus vector, an adenovirus / adeno-associated virus vector, and the like.
  • the expression vector may contain a nucleic acid encoding a guide RNA and a nucleic acid encoding a CRISPR enzyme.
  • Examples of such an expression vector include pX330, PrecisionX Cas9 SmartNuclease All-in-one Vectors (manufactured by System Bioscience), CRISPR / CAS9 Knockout plasmid (manufactured by Santa Cruz Biotechnology), and the like. Since the expression efficiency is good, pX330 is preferable as the expression vector.
  • Guide RNA is a small RNA fragment (CRISPR-RNA: crRNA) containing a foreign sequence (guide sequence) that constitutes an adaptive immune system that provides acquired resistance to invading foreign nucleic acids in bacteria and archaea, and is partially complementary to the crRNA. It mimics the hairpin structure of a tracrRNA-crRNA chimera fused with a typical RNA (trans-activating crRNA: tracrRNA).
  • the guide RNA may be a tracrRNA-crRNA chimera synthesized in a state in which the crRNA containing the target sequence and the tracrRNA are fused.
  • the crRNA containing the guide sequence and the tracrRNA may be prepared separately and annealed before introduction to obtain a tracrRNA-crRNA chimera.
  • it may be a single-strand RNA (sgRNA) produced by fusing the essential portion of the tracrRNA and the crRNA.
  • the guide RNA is preferably a tracrRNA-crRNA chimera synthesized in a state in which the crRNA containing the target sequence and the tracrRNA are fused.
  • the guide RNA is a polynucleotide consisting of a base sequence complementary to a base sequence of, for example, 10 bases or more and 25 bases or less from 1 base upstream of the PAM sequence in the target gene (gene to be cleaved by the CRISPR enzyme) 5'. It can be included in the terminal region.
  • the polynucleotide contained in the guide RNA is preferably 12 bases or more and 22 bases or less, more preferably 20 bases, from 1 base upstream of the PAM sequence in the target gene.
  • the PAM sequence is a sequence that can be recognized by the CRISPR enzyme, and the length and base sequence of the PAM sequence vary depending on the bacterial species from which the CRISPR enzyme is derived. For example, S. In pyogenes, 3 bases of "NGG” (N represents an arbitrary base) are recognized. Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) has two Cas9s, and recognizes 5 to 6 bases of "NGGNG” or "NNAGAA” (N represents an arbitrary base) as a PAM sequence, respectively.
  • the PAM sequence is preferably "NGG" because the PAM sequence to be recognized is short and the editable target gene is not easily restricted.
  • the guide RNA may be an isolated or synthesized RNA, or may be in the form of RNA incorporated into an expression vector. Further, it may be in the form of a nucleic acid encoding a guide RNA, or may be in a form in which a nucleic acid encoding a guide RNA is incorporated into an expression vector.
  • the guide RNA is preferably in the form in which the nucleic acid encoding the guide RNA is incorporated into the expression vector.
  • donor DNA When knocking in a specific gene into genomic DNA cleaved by the CRISPR / Cas system, donor DNA is used in addition to the guide RNA and CRISPR enzyme.
  • the donor DNA preferably contains DNA having a sequence homologous to the site of insertion on the target gene upstream and downstream of the gene to be knocked in.
  • the donor DNA may be a single-stranded oligo DNA or may be integrated into a plasmid, but is preferably integrated into a plasmid.
  • the method for introducing the CRISPR enzyme, guide RNA, or optionally donor DNA into a fertilized egg of a non-human animal is not particularly limited, and a known gene transfer method can be used.
  • a known gene transfer method can be used.
  • the calcium phosphate method, the electroporation method, the lipofection method, the aggregation method, the microinjection method, the particle gun method, the DEAE-dextran method and the like can be mentioned.
  • the microinjection method is preferable because of its high introduction efficiency.
  • the target of introduction is a fertilized egg
  • the fertilized egg is transplanted into the uterus or oviduct of the corresponding non-human animal and generated to generate a genetically modified non-human. Animals can be easily obtained.
  • a fourth aspect of the present invention is that the expression of all or part of the PD-1 gene is suppressed or lost by introducing a mutation into the expression-regulating region of the PD-1 gene or PD-1 gene in the genome.
  • This is a non-human animal model of immune-related side effects caused by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, which is prepared by administering an antigenic enhancer to a genetically modified non-human animal.
  • the expression of all or part of the PD-1 gene may be suppressed or lost, and constitutive suppression or loss, tissue and timing. Includes inhibition or loss specific to at least one.
  • the genetically modified non-human animal used for the immune-related side effect model non-human animal according to the fourth aspect of the present invention is a conventional PD-1 gene-modified non-human animal (conventional PD-1 knockout non-human animal, and conventional PD-. 1 knockdown non-human animal) and the conditional PD-1 gene-modified non-human animal (conditional PD-1 knockout non-human animal, and conditional PD-1 knockdown non-human animal) according to the third aspect of the present invention. )including.
  • the genetically modified non-human animal expresses all or part of PD-1 gene specifically in at least one of tissue and time.
  • the genetically modified non-human animal is preferably a conditional PD-1 gene-modified non-human animal, and more preferably, the expression of all or part of the PD-1 gene is suppressed or lost in a CD8-positive T cell-specific manner. It is a genetically modified non-human animal that has been genetically modified.
  • Mutation of the expression regulatory region of the PD-1 gene or PD-1 gene in conventional PD-1 gene-modified non-human animals results in suppression or loss of expression of all or part of the PD-1 gene, resulting in PD-1.
  • the mutation introduced may be any of insertion, deletion, modification, and substitution as long as it is substantially inactivated, and the number of bases to be mutated is not limited.
  • the mutation is preferably introduced into the PD-1 gene.
  • the PD-1 genome consists of exons 1 to 5, but mutations are preferably introduced within the range of exons 2 to 5, more preferably within the range of exons 3 to 5.
  • the PD-1 gene whose expression is suppressed or lost in non-human animals may be all or part of the PD-1 gene, but is preferably a part of the PD-1 gene. be.
  • the PD-1 gene whose expression is suppressed or lost is, for example, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more of the ORF.
  • the PD-1 genome whose expression is suppressed or lost is preferably part of the exon 2 to exon 5 range, more preferably part of the exon 3 to exon 5 range, and even more preferably part of the exon 3 to exon 5 range. Part of exon 3, part 4, and part of 5.
  • the conventional PD-1 genetically modified non-human animal can be produced according to the above-mentioned method for producing a genetically modified non-human animal, and is preferably a PD-1-deficient mouse described in the following literature. Tasuku Honjo, Immunological studies on PD-1-deficient meeting: conditional of PD-1 as a negative regulatory for B cell respons, International 1998. 10, NO. Pages 10,1563-1572
  • the use of the immune-related side effect model of the present invention in non-human animals is not particularly limited, and is used for mechanism analysis and prevention of immune-related side effects caused by anti-PD-L1 antibody or anti-PD-1 antibody, or development of therapeutic methods and drugs. be able to.
  • the immune-related side effect model of the present invention In non-human animals, the pathophysiology and symptoms of immune-related side effects caused by the anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody are enhanced. It is preferably used for screening, evaluation, or development of drugs that prevent and treat immune-related side effects.
  • the immune-related side effect is preferably psoriasis-like dermatitis as an immune-related side effect.
  • the immune-related side effect model non-human animal of the present invention has a longer-lasting immune-related side effect than the immune-related side effect model non-human animal prepared by administering an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody to a non-human animal.
  • the immune-related side effect model non-human animal is suitable for pathological analysis.
  • the expression of all or part of the PD-1 gene is suppressed or partially expressed by introducing a mutation into the expression regulatory region of the PD-1 gene or PD-1 gene in the genome.
  • an immune-related side effect model non-human animal by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody of a genetically modified non-human animal that has been lost and has been administered an antigenic enhancer Is the use of.
  • the expression of all or part of the PD-1 gene is suppressed or partially expressed by introducing a mutation into the expression regulatory region of the PD-1 gene or PD-1 gene in the genome.
  • a method for producing an immune-related side effect model non-human animal by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody which comprises a step of administering an antigenic enhancer to a genetically modified non-human animal that has been lost.
  • the antigenic enhancer in the present invention is a drug having an action of activating an immune response, and can be paraphrased as an immunostimulator or an adjuvant.
  • Antigenic enhancer is applied to genetically modified non-human animals in which mutations have been introduced into the PD-1 gene or the expression regulatory region of the PD-1 gene and the expression of all or part of the PD-1 gene is suppressed or lost.
  • the immune response of the genetically modified non-human animal is activated, and the pathophysiology and symptoms of immune-related side effects caused by the anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody can be enhanced. Since the immune response activated by the administration of the antigenic reinforcing agent is diverse, it is impossible or impractical to directly identify the non-human animal to which the antigenic reinforcing agent has been administered by its structure or characteristics.
  • the antigenic enhancer is not particularly limited as long as it has an effect of activating an immune response, but preferably promotes inflammatory cytokine production, and more preferably has an agonist activity against Toll-like receptor (TLR). , And more preferably, it has an agonist activity against Toll-like receptor 7 (TLR7).
  • TLR Toll-like receptor
  • the antigenic reinforcing agent include aluminum compounds, complete Freund's adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, imidazoquinoline, imidazoquinoline derivative and the like.
  • the imiquimod derivative include imiquimod, gardiquimod, and resiquimod. Aluminum compounds, complete Freund's adjuvant, or imidazoquinoline derivatives are preferred, imidazoquinoline derivatives are more preferred, and imiquimods are even more preferred, as they are easily available and have sufficient immunostimulatory activity.
  • the method of administering the antigenic reinforcing agent is not particularly limited, and may be selected depending on the type of the antigenic reinforcing agent.
  • Administration of the antigenic enhancer can be oral or parenteral.
  • the administration of the antigenic reinforcing agent is preferably parenteral, and since it can be administered only to a specific site, topical administration is more preferable, and external application to the skin is further preferable.
  • the antigenic reinforcing agent may be administered to a living body as it is, or may be administered as a preparation in which an effective amount thereof is blended with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the dose of the antigenic reinforcing agent is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the type of genetically modified non-human animal and the type and degree of immune-related side effects targeted by the model. For example, when imiquimod is applied externally to mice, 1 to 10% of imiquimod can be applied at 10 to 100 mg / dose / animal 1 to several times a day for 1 to 10 days.
  • the PD-L1 gene is specifically introduced into the Langerhans cell-specific by introducing a mutation into the expression-regulating region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome.
  • the expression of all or part of is suppressed or lost. That is, it is characterized in that the expression of a part or all of the PD-L1 gene is suppressed (knocked down) or lost (knocked out) specifically in Langerhans cells.
  • the genetically modified non-human animal according to the fifth aspect of the present invention is also referred to as a Langerhans cell-specific PD-L1 gene-modified non-human animal, and is a Langerhans cell-specific PD-L1 knockout non-human animal and a Langerhans cell-specific PD-. Includes L1 knockdown non-human animals.
  • the Langerhans cell-specific PD-L1 genetically modified non-human animal is preferably a Langerhans cell-specific PD-L1 knockout non-human animal because it is easy to analyze the function of PD-L1.
  • the use of the Langerhans cell-specific PD-L1 gene-modified non-human animal of the present invention is not particularly limited, but the same effect as when the PD-L1 / PD-1 signal is inhibited can be obtained specifically for Langerhans cells.
  • the Langerhans cell-specific PD-L1 gene-modified non-human animal of the present invention can be used for analysis of pathological conditions caused by PD-L1 / PD-1 signal inhibition, or for prevention and therapeutic agents for pathological conditions caused by PD-L1 / PD-1 signal inhibition.
  • pathological conditions caused by anti-PD-L1 antibody or anti-PD-1 antibody prevention of pathological conditions caused by anti-PD-L1 antibody or anti-PD-1 antibody, development of therapeutic agents, etc. It is more preferable to use, analysis of immune-related side effects caused by anti-PD-L1 antibody or anti-PD-1 antibody, prevention of immune-related side effects caused by anti-PD-L1 antibody or anti-PD-1 antibody, development of therapeutic agents, etc. It is more preferable to use it in.
  • the Langerhans cell-specific PD-L1 genetically modified non-human animal of the present invention may be bred without stimulation, but may be stimulated or loaded. Stimulation or loading makes it easier to more clearly observe the characteristics of Langerhans cell-specific PD-L1 genetically modified non-human animals.
  • the stimulus or load is not particularly limited, and may be, for example, a chemical, physical, or physiological stimulus or load, and may include a stimulus or load due to a drug, breeding density, exercise, radiation, ultraviolet rays, diet, or the like.
  • the stimulation or loading is preferably chemical stimulation or loading, more preferably stimulation or loading with an antigenic reinforcing agent.
  • Mutations in the expression control region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene are such that the expression of all or part of the PD-L1 gene is suppressed or lost, and PD-L1 is substantially inactivated.
  • the mutation introduced may be insertion, deletion, modification, or substitution, and the number of bases to be mutated is not limited.
  • the mutation is preferably introduced into the PD-L1 gene rather than the expression regulatory region of the PD-L1 gene.
  • the PD-L1 genome consists of exons 1 to 7, preferably in the range of exons 1 to 5, more preferably in the range of exons 2 and 3. Introduce mutations.
  • the PD-L1 genome consists of exons 1 to 7, preferably in the range of exons 1 to 5, more preferably in the range of exons 2 and 3. Introduce mutations.
  • by introducing mutations into exons 2 and 3 of the mouse PD-L1 genome we succeeded in obtaining a conditional knockout mouse in which PD-L1 was inactivated specifically in Langerhans cells.
  • the PD-L1 gene whose expression is suppressed or lost in non-human animals may be all or part of the PD-L1 gene, but is preferably the PD-L1 gene. It is a part.
  • the PD-L1 gene whose expression is suppressed or lost is preferably 30% or more, more preferably 40% or more, still more preferably 50% or more, and particularly preferably 60% or more of the ORF.
  • the PD-L1 genome whose expression is suppressed or lost is preferably part of the range of exons 1 to 7, more preferably part of the range of exons 1 to 5, and even more preferably. Exons 2 and 3.
  • the method for introducing a mutation into the expression-regulating region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome is not particularly limited, and a known method can be used.
  • a gene recombination-inducing method using a recombinant protein / recombinant target sequence system can be mentioned.
  • Recombinase protein / recombine target sequence system includes, for example, Cre / loxP sequence system using Cre recombinase protein derived from bacteriophage P1 and loxP sequence of 34 base pairs recognized by Cre protein, FLP protein derived from yeast.
  • Cre / loxP sequences, FLP protein / FRT sequences, or pSR1 recombinase / pSR1 recombinase target sequences are preferred and Cre / loxP systems are more preferred because of their simplicity of operation.
  • the Langerhans cell-specific PD-L1 gene-modified non-human animal of the present invention preferably has a recombinant target sequence that sandwiches a part or all of the expression regulatory region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome.
  • a Langerhans cell-specific PD-L1 gene-modified non-human animal prepared by crossing a genetically modified non-human animal with a recombinant non-human animal expressing a recombinase protein specifically expressing a Langerhans cell.
  • the Cre protein is expressed specifically in a Langerhans cell and a genetically modified non-human animal into which a loxP sequence sandwiching a part or all of the expression regulatory region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome has been introduced. It is a Langerhans cell-specific PD-L1 gene-modified non-human animal produced by crossing with a recombinant non-human animal.
  • a genetically modified non-human animal into which a recombinant target sequence sandwiching a part or all of the expression regulation region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome has been introduced is used.
  • the recombinant target sequence is preferably a loxP sequence.
  • the position at which the recombinant target sequence is introduced is usually determined by the type and position of the mutation to be introduced into the expression-regulating region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene.
  • the portion of the expression loss is usually sandwiched between a plurality of recombinant target sequences in the same direction.
  • the plurality of recombinant target sequences is preferably two recombinant target sequences.
  • the presence of the recombinant protein causes a part or all of the expression regulatory region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene sandwiched between the multiple recombinant target sequences. Will be deleted.
  • the recombinant target sequence is introduced by sandwiching a part or all of the expression regulation region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome. Since the PD-L1 genome consists of exons 1 to 7, the recombinant target sequence is preferably introduced with a portion of the range of exons 1 to 7, more preferably within the range of exons 1 to 5. It is introduced with a part sandwiched between them, and more preferably with exons 2 and 3 sandwiched between them. In the examples described later, we succeeded in obtaining a genetically modified non-human animal in which a recombinant target sequence was introduced across exons 2 and 3 of the mouse PD-L1 genome.
  • the loxP sequence is not limited to 5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATATACGAAGTTATA-3'(SEQ ID NO: 1), which is the sequence used in the examples described later.
  • the sequence may be mutated as long as it is a sequence recognized by Cre. For example, it is a sequence represented by 5'-ATAACTTCGTATATANNNTANNNTATACGAAGTTATA-3'(SEQ ID NO: 2).
  • a genetically modified non-human animal into which a recombinant target sequence that sandwiches a part or all of the expression regulatory region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome has been introduced has a specific recombination in at least one of the tissue and the time period.
  • mutations are introduced into the expression-regulating region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome, thereby being specific to at least one of tissue and time.
  • a PD-L1 gene-modified non-human animal in which the expression of all or part of the PD-L1 gene is suppressed or lost, that is, a conditional PD-L1 gene-modified non-human animal.
  • a genetically modified non-human animal into which a recombinant target sequence sandwiching a part or all of the expression regulatory region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome has been introduced, and a Langerhans cell-specific recombinant expression gene-modified non-human animal.
  • the expression of all or part of the PD-L1 gene is suppressed or lost in a Langerhans cell-specific manner by introducing a mutation into the expression-regulating region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome. Langerhans cell-specific PD-L1 gene-modified non-human animals can be produced.
  • the genetically modified non-human animal into which the recombinant target sequence has been introduced can be produced by the above-mentioned method for producing a genetically modified non-human animal.
  • a sixth aspect of the present invention is the expression of all or part of the PD-L1 gene specifically in Langerhans cells by introducing a mutation into the expression-regulating region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome.
  • This is a non-human animal model of immune-related side effects caused by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, which is prepared by administering an antigenic enhancer to a genetically modified non-human animal in which is suppressed or lost.
  • the genetically modified non-human animal used for the immune-related side effect model non-human animal is a Langerhans cell-specific PD-L1 gene-modified non-human animal (Langerhans cell-specific PD-L1 knockout non-human animal, which is the fifth aspect of the present invention. , And Langerhans cell-specific PD-L1 knockdown non-human animals).
  • the use of the immune-related side effect model of the present invention in non-human animals is not particularly limited, and is used for mechanism analysis and prevention of immune-related side effects caused by anti-PD-L1 antibody or anti-PD-1 antibody, or development of therapeutic methods and drugs. be able to.
  • the immune-related side effect model of the present invention In non-human animals, the pathophysiology and symptoms of immune-related side effects caused by the anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody are enhanced. It is preferably used for screening, evaluation, or development of drugs that prevent and treat immune-related side effects.
  • the immune-related side effect is preferably psoriasis-like dermatitis as an immune-related side effect.
  • One example of an embodiment of the present invention is a Langerhans cell-specific whole or part of the PD-L1 gene by introducing a mutation into the expression-regulating region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome.
  • Side effect model Use as a non-human animal.
  • One example of an embodiment of the present invention is a Langerhans cell-specific whole or part of the PD-L1 gene by introducing a mutation into the expression-regulating region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome.
  • a method for producing an immune-related side effect model non-human animal using an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody which comprises a step of administering an antigenic enhancer to a genetically modified non-human animal whose expression is suppressed or lost. Is.
  • ⁇ Antigenic reinforcement> A gene in which the expression of all or part of the PD-L1 gene is suppressed or lost in a Langerhans cell-specific manner by introducing a mutation into the expression-regulating region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome.
  • the method for screening a drug according to the seventh aspect of the present invention is a genetically modified non-human animal according to the third aspect, an immune-related side effect model non-human animal according to the fourth aspect, and a genetically modified non-human animal according to the fifth aspect.
  • a drug having an effect of inhibiting, suppressing, promoting, or enhancing immune-related side effects caused by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody can be screened.
  • the method for screening a drug of the present invention usually includes a step (A) of administering the drug to a non-human animal.
  • -A method for screening a drug for at least one of prevention and treatment of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody for immune-related side effects which comprises a step of evaluating immune-related side effects due to the L1 antibody.
  • the genetically modified non-human animal A is a genetically modified non-human animal according to the third aspect of the present invention.
  • Gene-modified non-human animal B By introducing a mutation into the expression-regulating region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome, the expression of all or part of the PD-L1 gene is suppressed in a Langerhans cell-specific manner. Or lost, genetically modified non-human animals.
  • the genetically modified non-human animal B is a genetically modified non-human animal according to the fifth aspect of the present invention.
  • Immune-related side effect model Non-human animal C Expression of all or part of the PD-1 gene is suppressed or lost by introducing a mutation into the expression regulatory region of the PD-1 gene or PD-1 gene in the genome.
  • the immune-related side effect model non-human animal C is an immune-related side effect model non-human animal according to the fourth aspect of the present invention.
  • Immune-related side effect model Non-human animal D Expression of all or part of the PD-L1 gene in a Langerhans cell-specific manner by introducing a mutation into the expression-regulating region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome.
  • the immune-related side effect model non-human animal D is an immune-related side effect model non-human animal according to the sixth aspect of the present invention.
  • the method of administering the drug to a genetically modified non-human animal or an immune-related side effect model non-human animal is not particularly limited and can be oral or parenteral.
  • the drug may be administered to a living body as it is, or may be administered as a preparation in which an effective amount thereof is blended with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the method for evaluating the immune-related side effects of the anti-PD-1 antibody or the anti-PD-L1 antibody is not particularly limited.
  • the evaluation of the immune-related side effects is preferably performed using an index indicating the severity.
  • the index indicating the severity of the immune-related side effects is not particularly limited.
  • the immune-related side effect is a skin disorder
  • the degree of vitiligo, erythema, pustule, rash, erosion and the like can be used as an index indicating the severity.
  • the indicators of severity include ear thickness, severity of inflammation, epidermis thickness, number of neutrophil microabscesses in the epidermis, and Cytokines, preferably IL-6, IL-17A, or IL-23A mRNA expression levels and the like can be used.
  • liver enzymes such as AST (GOT), ALT (GPT), ⁇ -GTP, AST, and ALT, or total bilirubin should be used as an index indicating the severity. Can be done.
  • the immune-related side effect is pneumonia
  • the degree of symptoms such as cough and dyspnea
  • the severity score obtained by examinations such as bronchoscopy and CT can be used as an index indicating the severity.
  • TSH thyroiditis
  • free T3, and free T4 in blood can be used as an index indicating the severity.
  • the indicators of severity include, for example, ADH, ACTH, LH, FSH, GH, prolactin, cortisol, aldosterone, and the like. Androgens, adrenaline, noradrenaline, estrogen, and progesterone can be used.
  • the immune-related side effects caused by the anti-PD-1 antibody or the anti-PD-L1 antibody in the presence of the drug can be caused by the drug.
  • the drug can be selected as a drug candidate for at least one of the prevention and treatment of the immune-related side effects when it is alleviated more than the immune-related side effects in the absence of.
  • the index indicating the severity of the immune-related side effect in the presence of the drug is 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, or When it is 80% or less, the drug can be selected as a candidate drug for at least one of the prevention and treatment of the immune-related side effects.
  • the drug is used. It is preferably selected as a drug candidate for at least one of the prevention and treatment of the immune-related side effects.
  • drugs examples include small molecule compounds, proteins, polypeptides, polysaccharides, nucleic acids, etc., but are not particularly limited.
  • the drug (candidate substance) may be a novel substance or a known substance.
  • the immune-related side effects of the anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody are preferably dermatitis, myasthenia gravis, myositis, myositis, thyroiditis, type I diabetes, neuropathy, nephropathy, arthritis. , Hepatic disorder, pneumonia, pancreatitis, thyroiditis, adrenitis, hypothalamic dysfunction, and panhypopituitarism, more preferably skin disorder, hepatic disorder, pneumonia, pancreatitis, and thyroid. At least one selected from inflammation, more preferably psoriasis-like dermatitis among skin disorders.
  • the method for screening the drug of the present invention preferably uses the immune-related side effect model non-human animal according to the fourth aspect or the immune-related side effect model non-human animal according to the sixth aspect, and more preferably the fourth aspect.
  • Immune-related side effect model Non-human animals are used.
  • the method for screening the drug of the present invention has persistent immune-related side effects as compared with the screening method using an immune-related side effect model prepared by administering an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody to a wild-type non-human animal.
  • an immune-related side effect model prepared by administering an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody to a wild-type non-human animal.
  • the experimental conditions are easy to stabilize and the sensitivity is high.
  • the method for evaluating a drug according to the eighth aspect of the present invention is the genetically modified non-human animal according to the third aspect, the immune-related side effect model non-human animal according to the fourth aspect, and the genetically modified non-human animal according to the fifth aspect.
  • the effect of the drug on inhibiting, suppressing, promoting, or enhancing the immune-related side effects of the anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody can be evaluated.
  • the method for evaluating a drug of the present invention usually includes a step (A) of administering the drug to a non-human animal. Therefore, one example of an embodiment of the present invention is Step ( ⁇ ): Administering the drug to the genetically modified non-human animal A or B below, or the immune-related side effect model non-human animal C or D below, and step ( ⁇ ): anti-PD-1 antibody or anti-PD.
  • -A method for evaluating a drug that comprises a step of evaluating an immune-related side effect of an L1 antibody and at least one of prevention and treatment of an immune-related side effect of an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.
  • Genetically modified non-human animal A By introducing a mutation into the PD-1 gene or the expression regulatory region of the PD-1 gene in the genome, all or one of the PD-1 genes is specifically directed to at least one of the tissues and the time period. Genetically modified non-human animals in which the expression of the part is suppressed or lost.
  • the genetically modified non-human animal A is a genetically modified non-human animal according to the third aspect of the present invention.
  • Gene-modified non-human animal B By introducing a mutation into the expression-regulating region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome, the expression of all or part of the PD-L1 gene is suppressed in a Langerhans cell-specific manner. Or lost, genetically modified non-human animals.
  • the genetically modified non-human animal B is a genetically modified non-human animal according to the fifth aspect of the present invention.
  • Immune-related side effect model Non-human animal C Expression of all or part of the PD-1 gene is suppressed or lost by introducing a mutation into the expression regulatory region of the PD-1 gene or PD-1 gene in the genome.
  • the immune-related side effect model non-human animal C is an immune-related side effect model non-human animal according to the fourth aspect of the present invention.
  • Immune-related side effect model Non-human animal D Expression of all or part of the PD-L1 gene in a Langerhans cell-specific manner by introducing a mutation into the expression-regulating region of the PD-L1 gene or PD-L1 gene in the genome.
  • the immune-related side effect model non-human animal D is an immune-related side effect model non-human animal according to the sixth aspect of the present invention.
  • the method for evaluating a drug (pharmaceutical candidate substance) of the present invention is carried out in the presence or absence of the drug, so that the anti-PD-1 antibody or the anti-PD-L1 antibody causes immune-related side effects of the drug in the presence of the drug.
  • the drug is effective for at least one of the prevention and treatment of immune-related side effects by anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody. Can be judged.
  • the immune-related side effects of the anti-PD-1 antibody or anti-PD-L1 antibody are preferably dermatitis, myasthenia gravis, myositis, myositis, thyroiditis, type I diabetes, neuropathy, nephropathy, arthritis. , Hepatic disorder, pneumonia, pancreatitis, thyroiditis, adrenitis, hypothalamic dysfunction, and panhypopituitarism, more preferably skin disorder, hepatic disorder, pneumonia, pancreatitis, and thyroid. At least one selected from inflammation, more preferably psoriasis-like dermatitis among skin disorders.
  • the method for evaluating the drug of the present invention preferably uses the immune-related side effect model non-human animal according to the fourth aspect or the immune-related side effect model non-human animal according to the sixth aspect, and more preferably the fourth aspect.
  • Immune-related side effect model Non-human animals are used.
  • the method for evaluating a drug of the present invention has an immune-related side effect as compared with a method for evaluating a drug using an immune-related side effect model prepared by administering an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody to a wild-type non-human animal.
  • an immune-related side effect model prepared by administering an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody to a wild-type non-human animal.
  • the experimental conditions are easy to stabilize and the sensitivity is high.
  • the recombinant target sequence is introduced in the vicinity of the expression regulatory region of the PD-L2 gene or PD-L2 gene in the genome, or in the PD-L2 gene or the expression regulatory region of the PD-L2 gene.
  • the recombinant target sequence is preferably a loxP sequence.
  • the position at which the recombinant target sequence is introduced is usually determined by the type and position of the mutation to be introduced into the expression-regulating region of the PD-L2 gene or PD-L2 gene.
  • the plurality of recombinant target sequences is preferably two recombinant target sequences.
  • the presence of the recombinant protein causes a part or all of the expression regulatory region of the PD-L2 gene or PD-L2 gene sandwiched between the multiple recombinant target sequences. Will be deleted.
  • the recombinant target sequence is introduced across a part or all of the expression regulatory region of the PD-L2 gene or PD-L2 gene in the genome. Since the PD-L2 genome consists of exons 1 to 6, the recombinant target sequence is preferably introduced with a portion of the range of exons 1 to 6, more preferably within the range of exons 1 to 4. It is introduced with a part sandwiched between them, and more preferably with exons 3 and 4 sandwiched between them. In the examples described later, we succeeded in obtaining a genetically modified non-human animal in which a recombinant target sequence was introduced across exons 3 and 4 of the mouse PD-L2 genome.
  • the loxP sequence is not limited to 5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATATACGAAGTTATA-3'(SEQ ID NO: 1), which is the sequence used in the examples described later.
  • the sequence may be mutated as long as it is a sequence recognized by Cre. For example, it is a sequence represented by 5'-ATAACTTCGTATATANNNTANNNTATACGAAGTTATA-3'(SEQ ID NO: 2).
  • the genetically modified non-human animal into which the recombinant target sequence has been introduced can be produced by the above-mentioned method for producing a genetically modified non-human animal.
  • mutations are introduced into the expression-regulating region of the PD-L2 gene or PD-L2 gene in the genome, thereby being specific to at least one of the tissue and time.
  • Conditional PD-L2 gene-modified non-human animals in which the expression of all or part of the PD-L2 gene is suppressed or lost can be produced.
  • conditional PD-L2 gene-modified non-human animal a mutation is introduced into the expression-regulating region of the PD-L2 gene or PD-L2 gene in the genome, whereby PD- The expression of all or part of the L2 gene is suppressed or lost. That is, it is characterized in that the expression of a part or all of the PD-L2 gene is conditionally suppressed (knockdown) or lost (knockout).
  • the conditional PD-L2 genetically modified non-human animal includes a conditional PD-L2 knockout non-human animal and a conditional PD-L2 knockdown non-human animal.
  • the conditional PD-L2 genetically modified non-human animal is preferably a conditional PD-L2 knockout non-human animal because it is easy to analyze the function of PD-L2.
  • conditional PD-L2 genetically modified non-human animal is not particularly limited, but since the same effect as when the PD-L2 / PD-1 signal is inhibited can be obtained in a time-specific and tissue-specific manner, PD- Used for elucidation of the mechanism of L2 / PD-1 signal transduction system, analysis of pathological conditions caused by PD-L2 / PD-1 signal inhibition, prevention of pathological conditions caused by PD-L2 / PD-1 signal inhibition, development of therapeutic agents, etc. Can be done.
  • conditional PD-L2 gene-modified non-human animal of the present invention can be used for analysis of pathological conditions caused by PD-L2 / PD-1 signal inhibition, or for prevention and therapeutic agents for pathological conditions caused by PD-L2 / PD-1 signal inhibition. It is preferably used for development, etc., and is used for analysis of pathological conditions caused by anti-PD-L2 antibody or anti-PD-1 antibody, prevention of pathological conditions caused by anti-PD-L2 antibody or anti-PD-1 antibody, development of therapeutic agents, etc.
  • it is used for analysis of immune-related side effects caused by anti-PD-L2 antibody or anti-PD-1 antibody, prevention of immune-related side effects caused by anti-PD-L2 antibody or anti-PD-1 antibody, development of therapeutic agents, etc. It is more preferable to use it.
  • the conditional PD-L2 genetically modified non-human animal may be bred without stimulation, but may be stimulated or loaded. Stimulation or loading makes it easier to more clearly observe the characteristics of the conditional PD-L2 genetically modified non-human animal.
  • the stimulus or load is not particularly limited, and may be, for example, a chemical, physical, or physiological stimulus or load, and may include a stimulus or load due to a drug, breeding density, exercise, radiation, ultraviolet rays, diet, or the like.
  • a mutation in the expression regulatory region of the PD-L2 gene or PD-L2 gene results in suppression or loss of expression of all or part of the PD-L2 gene, resulting in substantial inactivation of PD-L2.
  • the mutation introduced may be an insertion, deletion, modification, or substitution, and the number of bases to be mutated is not limited.
  • the mutation is preferably introduced into the PD-L2 gene rather than the expression regulatory region of the PD-L2 gene.
  • the PD-L2 genome consists of exons 1 to 6, preferably in the range exons 1 to 4, more preferably in the range exons 3 and 4. Introduce.
  • a genetically modified non-human animal in which a recombinant target sequence was introduced across exons 3 and 4 of the mouse PD-L2 genome.
  • Multiplying this genetically modified non-human animal with a recombinant non-human animal that specifically expresses recombinants in at least one of the tissues and times results in mutations in exons 3 and 4 of the mouse PD-L2 genome.
  • the PD-L2 gene whose expression is suppressed or lost in non-human animals may be all or part of the PD-L2 gene, but is preferably a part of the PD-L2 gene. Is.
  • the PD-L2 gene whose expression is suppressed or lost is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, and particularly preferably 80% or more of the ORF.
  • the PD-L2 genome whose expression is suppressed or lost is preferably part of the exon 1 to exon 4 range, more preferably part of the exon 1 to exon 5 range, and even more preferably part of the exon 1 to exon 5 range. Exons 3 and 4.
  • the method for introducing a mutation into the expression-regulating region of the PD-L2 gene or PD-L2 gene in the genome is not particularly limited, and a known method can be used.
  • a gene recombination-inducing method using a recombinant protein / recombinant target sequence system can be mentioned.
  • Recombinase protein / recombine target sequence system includes, for example, Cre / loxP sequence system using Cre recombinase protein derived from bacteriophage P1 and loxP sequence of 34 base pairs recognized by Cre protein, FLP protein derived from yeast. / FRT sequence system, pSR1 recombinase of Zygosaccharomyces rouxii / pSR1 recombine target sequence system, Gin protein / gif sequence system derived from bacteriophage Mu, and the like.
  • Cre / loxP sequences FLP protein / FRT sequences, or pSR1 recombinase / pSR1 recombinase target sequences are preferred and Cre / loxP systems are more preferred because of their simplicity of operation.
  • conditional PD-L2 gene-modified non-human animal is preferably a non-gene-modified non-gene-modified animal into which a recombinant target sequence sandwiching a part or all of the expression-regulating region of the PD-L2 gene or PD-L2 gene in the genome has been introduced.
  • a conditional PD-L2 gene-modified non-human animal prepared by crossing a human animal with a recombinant non-human animal that expresses a recombinant protein specifically in a myeloid lineage, more preferably a genome.
  • myeloid cells include monocytes, granulocytes (neutrophils, eosinophils, neutrophils), monocytes, macrophages, erythrocytes, dendritic cells, Langerhans cells and hematopoietic stem cells.
  • progenitor cells myeloid progenitor cells that differentiate into dendritic cells, monocytes, macrophages, neutrophils, or Langerhans cells.
  • the tissue and time when the expression of the PD-L2 gene is suppressed or lost is the tissue specificity and time-specificity of the recombinant protein expression of the genetically modified non-human animal to be crossed. It can be selected according to gender.
  • Various types of recombinant non-human animals that express the recombinant protein in a time-specific or tissue-specific manner have been reported and can be selected according to the purpose of the experiment, and the above-mentioned genetically modified non-human animals can be selected. It may be newly prepared according to the method for producing an animal.
  • Recombinase-expressing gene-modified non-human animals are preferably myeloid cell-specific, more preferably dendritic cell-specific, monocytes, macrophages, and neutrophil-specific, or Langerhans cell-specific.
  • mice Is introduced from the group consisting of genetically modified non-human animals; conditional PD-1 genetically modified non-human animals; conditional PD-L1 genetically modified non-human animals; and conditional PD-L2 genetically modified non-human animals.
  • PD-L1 and PD-L2 There are two ligands that accept PD-1 as receptors, PD-L1 and PD-L2, but the only antibodies that are widely used as immune checkpoint inhibitors are anti-PD-1 antibody and anti-PD-L1 antibody. Is. Since the functions of PD-1, PD-L1 and PD-L2 are often unknown, whether the side effects of anti-PD-1 antibody are due to inhibition of the PD-1 / PD-L1 signaling system, PD- It may not be known whether it is due to inhibition of the 1 / PD-L1 and L2 signaling systems or due to inhibition of PD-1 / PD-L2.
  • the phenotype of the conditional PD-1 gene-modified non-human animal is the same as the phenotype of the conditional PD-L1 gene-modified non-human animal, but the phenotype of the conditional PD-L2 gene-modified non-human animal.
  • the phenotype of the conditional PD-1 gene-modified non-human animal is the sum of the phenotype of the conditional PD-L1 gene-modified non-human animal and the phenotype of the conditional PD-L2 gene-modified non-human animal. If so, the side effects of the anti-PD-1 antibody can be determined to be due to inhibition of the PD-1 / PD-L1 and L2 signaling systems.
  • the functions of PD-1, PD-L1 and PD-L2 are elucidated in this way, it becomes easier to select an antibody having fewer side effects as an immune checkpoint inhibitor.
  • the number of cells infiltrating the epidermis in one section was counted and used as the number of CD8-positive cells infiltrating the epidermis.
  • the immunostained images with the anti-human CD4 monoclonal antibody were also counted in the same manner to determine the number of CD4 positive cells infiltrating the epidermis.
  • the value obtained by dividing the number of intraepidermal infiltrating CD8-positive cells by the number of intraepithelial infiltrating CD4 positive cells was defined as CD8 / CD4 lattice.
  • the significance test was a nonparametric two-sided test using the Mann-Whitney U test, and was shown by **: P ⁇ 0.01.
  • Fig. 2 The results are shown in Fig. 2.
  • the HE-stained image of psoriasis vulgaris showed thickening, parakeratosis and hyperkeratosis of the epidermis, and microabscesses due to neutrophils under the stratum corneum. Moreover, the granular layer had disappeared. The stratum spinosum was thickened, and the epidermal protrusions regularly extended toward the dermis in a club shape. Similar histopathological findings were observed in anti-PD-1 antibody-induced psoriasis-like dermatitis. In addition, in anti-PD-1 antibody-induced psoriasis-like dermatitis, more CD8-positive cells were observed in the epidermis than in psoriasis vulgaris.
  • CD8 / CD4 ratio in anti-PD-1 antibody-induced psoriasis-like dermatitis was significantly higher than that in psoriasis vulgaris.
  • anti-PD-1 antibody-induced psoriasis-like dermatitis it was revealed that the intraepidermal infiltration of CD8-positive cells was enhanced.
  • Fig. 4 Patients with psoriasis-like dermatitis tended to have higher serum IL-6 levels after administration of the anti-PD-1 antibody than before administration. Similarly, in patients with immune-related side effects other than psoriasis-like dermatitis, the serum IL-6 concentration tended to increase after administration of the anti-PD-1 antibody as compared with that before administration. On the other hand, in patients without immune-related side effects, changes in serum IL-6 concentration tended to decrease after administration of anti-PD-1 antibody as compared with before administration.
  • Example 1 Psoriasis-like dermatitis model using PD-1 conventional knockout mouse ⁇ Induction of dermatitis>
  • PD-1 conventional knockout mouse Provided by Professor Tasuku Honjo of Kyoto University, PD-1 -/- mouse, or PD-1-KO mouse
  • wild-type mouse C57BL / 6J, Charles River Japan
  • WT mice wild-type mouse
  • IMQ imikimod
  • mice were divided into two groups, an imikimod (IMQ) group and a wild group.
  • IMQ imikimod
  • the 3.5% imiquimod cream was prepared by diluting 5% imiquimod cream (Beselna cream, manufactured by Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.) with a control vehicle cream.
  • the application start date was set as the first day of application.
  • FIG. 5 shows photographs of the back of wild-type mice in the Vehicle group, WT mice in the imiquimod group, and PD-1 -/-mice in the imiquimod group on the 7th day of application. Mild erythema and scales were observed in WT mice in the imiquimod group. Severe erythema and scales were observed in PD-1 -/-mice in the imiquimod group.
  • ⁇ Severity of inflammation in the skin was assessed by an objective method that mimics PASI (Psoriasis Area and Severity Index), which is used in the diagnosis of human psoriasis. Specifically, the three items of erythema, scales, and thickening of the back were independently scored in five stages of 0: none, 1: mild, 2: moderate, 3: high, and 4: extremely high. The total score of the items (0 to 12) was calculated. The significance test for each group was performed by one-way ANOVA and indicated by **: P ⁇ 0.01, ***: P ⁇ 0.0001. Changes in the severity of inflammation (PASI Score) due to imiquimod application in WT and PD-1 -/-mice are shown on the right side of FIG. PD-1 -/- mice had significantly more severe skin inflammation than WT mice.
  • PASI Score Changes in the severity of inflammation due to imiquimod application in WT and PD-1 -/-mice are shown on the right side of FIG. PD-1
  • the skin tissue specimens of WT mice and PD-1-/- mice of the HE-stained Vehicle group and the imiquimod group are shown in FIG. No clear difference was observed between the WT mice in the Vehicle group and the PD-1 -/-mice.
  • the imiquimod group epidermal thickening, parakeratosis and hyperkeratosis were observed in both WT and PD-1 -/- mice, and microabscesses due to neutrophils were observed just below the stratum corneum.
  • the degree of epidermal thickening, parakeratosis and hyperkeratosis, and neutrophil microabscesses in PD-1 -/-mice was significantly worse than in WT.
  • the epidermis thickness was measured using the image of the above-mentioned HE-stained tissue specimen, and used as Epidermal sickness (thickness of epidermis, ⁇ m).
  • Epidermal sickness Thickness of epidermis, ⁇ m.
  • One sample was prepared from five mice in each group, and the thickness of five points per sample was measured and the average value was calculated.
  • the significance test was a nonparametric two-sided test using the Mann-Whitney U test, and was shown by **: P ⁇ 0.01. Independent experiments were performed three times and representative data were shown.
  • the thickness of the epidermis of WT mice and PD-1 -/- mice of the Vehicle group and the imiquimod group is shown on the left side of FIG.
  • the epidermis of the imiquimod group was significantly thicker than that of the vehicle group.
  • PD-1 -/- mice had a significantly thicker epidermis than WT mice.
  • ⁇ Micro abscess> The above-mentioned HE-stained tissue specimen was observed under a microscope and the number of microabscesses was counted. One sample was prepared from one ear of one mouse using five mice in each group, and the number of microabscesses was counted to obtain a Number of microabscess. The significance test was a nonparametric two-sided test using the Mann-Whitney U test, and was shown by **: P ⁇ 0.01. Independent experiments were performed three times and representative data were shown. The number of microabscesses in WT mice and PD-1 -/- mice in the imiquimod group is shown on the right side of FIG. PD-1 -/- mice had significantly more microabscesses than WT mice.
  • cDNA Complementary DNA
  • the mRNA expression level was determined by using Prime Time TM Gene Expression Master Mix and Prime Time TM qPCR Predesigned Primers (manufactured by Integrated DNA Technologies), and by QuantSTime Measured by PCR was performed by triplicate.
  • the amplified product was quantified by the comparative CT method and standardized by the expression level of GAPDH mRNA.
  • the significance test is a non-parametric two-sided test using the Mann-Whitney U test, and is indicated by *: P ⁇ 0.05, **: P ⁇ 0.01, ***: P ⁇ 0.001. rice field.
  • the Assay NO. Of the Prime Time TM qPCR pre-designated primers used is as follows.
  • IL-6 Mm. PT. 58.100005566 IL-23a: Mm. PT. 58.10594618.
  • g IL-17a Mm. PT. 58.6531092 Ly6g: Mm. PT. 58.30498043
  • GAPDH Mm. PT
  • FIG. 9 shows the quantification results of mRNAs of cytokines (IL-6, IL-23a, IL-17a) reported to be involved in psoriasis and Ly6g, which is a neutrophil surface marker.
  • the mRNA expression levels of IL-23a and IL-17a were significantly increased by imiquimod application in both WT and PD-1-/-mice.
  • the expression level of IL-6 mRNA was not changed by imiquimod application in WT mice, but was significantly increased by imiquimod application only in PD-1-/-mice.
  • IL-6 Since an increase in IL-6 was observed only in psoriasis-like dermatitis that developed in PD-1 -/- mice, PD-1 is strongly involved in the production of IL-6 in psoriasis-like dermatitis. It became clear.
  • the mRNA expression level of Ly6g was below the detection limit in the Vehicle group in both WT mice and PD-1-/- mice, but it was significantly increased by the application of imiquimod.
  • Alexa Fluor TM 488-labeled goat antibody-rabbit IgG (manufactured by Abcam) and Alexa Fluor TM 555-labeled goat antibody-rat IgG (manufactured by Abcam) as fluorescently labeled secondary antibodies, 4', 6- It was carried out by a conventional method using a diamidino-2-phenylindole (DAPI). Using a fluorescence microscope (BZ-X700, manufactured by Keyence), observe at a magnification of 400 times, CD8-positive and CD3-positive cells are designated as CD8-positive T cells, and the number of cells infiltrated into the skin is counted separately for the epidermis and dermis. did.
  • DAPI diamidino-2-phenylindole
  • the total number of CD8-positive T cells in the epidermis (Epidermis) and the number of CD8-positive T cells in the dermis (Dermis) was defined as Total.
  • the number of cells infiltrating the skin per section was counted and used as the number of CD8-positive T cells.
  • Two tissue sections were prepared from each of the five mice in each group. The significance test was a nonparametric two-sided test using the Mann-Whitney U test, and was shown by **: P ⁇ 0.01.
  • the number of CD8-positive T cells infiltrating the epidermis or dermis is shown in FIG.
  • the number of CD8-positive T cells infiltrating the epidermis of PD-1-/- mice was significantly higher than that of WT mice.
  • the number of CD8-positive T cells infiltrating the dermis was not different between WT mice and PD-1-/-mice.
  • PD-1 -/- mice had significantly more infiltrated CD8-positive T cells than WT mice.
  • the separated epidermis was washed twice with phosphate buffered saline containing no Ca 2+ and Mg 2+ , passed through a cell strainer having a mesh size of 70 ⁇ m, and then MACS using CD45 MicroBeads (manufactured by Miltenyi Biotec).
  • the cell populations were sorted by TM cell separation technology.
  • the obtained CD45-negative cell group was designated as "Keratinocyte”, and the CD45-negative cell group was designated as "Epidermal CD45 + cell”.
  • the CD45-positive cell content of keratinocyte was less than 1%, and the CD45-positive cell content of Epidermal CD45 + cell was higher than 95%.
  • the mRNA expression levels of CD8, IFN- ⁇ , and CXCL9 in the three cell groups of Keratinocyte, Epidermal CD45 + cell, and Dermal cell were quantified by quantitative RT-PCR. Quantitative RT-PCR was performed as described above, and the Assay NO. Of Prime Time TM qPCR predesigned primers used was as follows. IFN- ⁇ : Mm. PT. 58.41769240 CD8a: Mm. PT. 58.29971442 CXCL9: Mm. PT. 58.5726745
  • the results are shown in FIG.
  • the mRNA expression level of CD8a was not different between the WT mouse and the PD-1 -/- mouse in the dermal cell, but the PD-1 -/- mouse was more in the WT mouse in the Epidermal CD45 + cell. It was significantly more than.
  • the expression level of IFN- ⁇ mRNA was not different between WT mice and PD-1-/- mice in Dermal cell, but PD-1 -/- mouse was higher in Epidermal CD45 + cell. It was significantly more than WT mice.
  • the mRNA expression level of CXCL9 in keratinocyte was significantly higher in PD-1-/- mice than in WT mice. That is, it was revealed that in PD-1 -/- mice, the production of CD8a and IFN- ⁇ in Epidermal CD45 + cell and CXCL9 in Keratinocyte was enhanced.
  • FIG. 15 shows the search results of the exon (indicated by box) of the PD-1 gene (Pdcd1) in the genome of the wild-type mouse, the target sequence of the CRISPR-Cas system, and the PAM sequence.
  • Mouse Pdcd1 is located on chromosome 1 and is composed of 5 exons. Since the start codon of the PD-1 protein is present in the first exon, the complete PD-1 protein is removed by dropping the second, third, and fourth exons using the Cre / loxP system.
  • the loxP sequence was designed to be inserted at both ends of the region containing exons 2-4 using the CRISPR-Cas system to prevent the production of.
  • a pX330 vector CRISPR / Cas9 vector containing a guide RNA (gRNA) and a Cas9 expression cassette in one plasmid is introduced into a fertilized egg, and the target sgRNA and Cas9 mRNA are simultaneously expressed to mouse PD.
  • the genome was cleaved at a target position, and a pflop plasmid (donor vector) containing a loxP sequence was introduced into a fertilized egg together as a donor DNA so that the loxP sequence was inserted into the cleavage site.
  • the CRISPR target site on the 5'side of the region containing Exxon 2-4 is the Left CRISPR site
  • the CRISPR target site on the 3'side is the right CRISPR site
  • the area from the Left CRISPR prediction cleavage site to the upstream (5') side 1395 bp is 5 'Arm
  • 3'arm from the right CRISPR predictive cutting site to 1462bp downstream (3') is 5 'Arm
  • 2685bp between Left CRISPR predictive cutting site and light CRISPR predictive cutting site as the central arm.
  • the sequences of the Left CRISPR target site and the light CRISPR target site (L target sequence: SEQ ID NO: 3, R target sequence: SEQ ID NO: 4) are shown in FIG.
  • the left and right target sequences and PAMs were searched using CRISPR (https://crispr.dbcls.jp/) and a 20-base target sequence was found in the Pdcd-1 genome. I confirmed that there was only one place.
  • a donor vector containing the loxP sequence on the outside of the exon 2-4 and the sequence of the 5'arm, the central arm, and the 3'arm was prepared by the following procedure.
  • PCR was performed according to a conventional method using the genomic DNA of C57BL / 6J mice (FIG. 16, SEQ ID NO: 5) as a template and using the primers of Step1.
  • the 5'arm is the sequence of the B6J genome used as the template for the 5'arm
  • the Central arm coarse broken line
  • 3'arm ( Gothic) is the sequence of the B6J genome used as a template for the 3'arm.
  • Step 1 In-Fusion (Step 1, FIG. 18) of the obtained PCR product and a vector originally prepared based on pbluescrit (pflox primer (FIG. 17, SEQ ID NO: 6)).
  • pflox primer FOG. 17, SEQ ID NO: 6
  • the arrowhead pointing to the left indicates the loxP sequence.
  • PCR was performed using the primer of Step2, and the obtained PCR product and the product of Step1 were In-Fusioned (Step2, FIG. 19). Further, the primer of Step3 was used. PCR was performed, and the obtained PCR product and the product of Step 2 were in-fused (Step 3, FIG. 20). This product was designated as pflox-PD1.
  • the primers used are shown in Table 1.
  • FIG. 21 shows a schematic diagram.
  • pflox-PD1, pX330-PD-1-L and pX330-PD-1-R were microinjected into the pronucleus of C57BL / 6 fertilized eggs by a conventional method. Fertilized eggs were transplanted into the oviducts of pseudopregnant mice to give birth to founder mice. By mating this founder mouse with a C57BL6 mouse, a heterozygous PD-1 fl / + mouse was produced. Furthermore, homozygous PD-1 fl / fl mice were produced by mating these heterozygous PD-1 fl / + mice with each other.
  • Genotyping was performed on genomic DNA purified from a part of mouse tail tissue by PCR using the following primers (sequence is shown in FIG. 22) according to a conventional method.
  • PD1 Genotype RiF SEQ ID NO: 15
  • PD1 Genotype RiR SEQ ID NO: 16
  • PD1 Genotype LeF SEQ ID NO: 17
  • PD1 Genotype LeR SEQ ID NO: 18
  • the size of the PCR product obtained when the genomic DNA obtained from wild-type mice (WT) and PD-1 frozen mice (flox) was not treated with restriction enzymes (intact) and treated with restriction enzymes (EcoRV, AscI). It is shown in FIG. Based on the size of the obtained PCR product, it was judged to be a wild-type mouse (WT) or a PD-1 frozen mouse.
  • FIG. 23 The DNA sequence of Pdcd1 in the genome of PD-1 frozen mice is shown in FIG. 23 (SEQ ID NO: 19).
  • FIG. 24 shows the gene sequence (SEQ ID NO: 22) of the open reading frame (ORF) of the PD-1 frozen mouse predicted after the fourth exon is shed by the Cre / loxP system and the corresponding amino acid sequence (SEQ ID NO: 23). Shown in. The prepared PD-1 fl / fl mice developed normally, and it was shown that the regulation of the PD-1 gene was clearly not disturbed by the insertion of the loxP sequence.
  • PD-1 fl / + CD8 cre mice, PD-1 fl / fl mice, and CD8 cre mice were mated and conditional PD-1 homozygous mice (PD-1 fl / fl CD8 cre mice, PD-1 conditional). Knockout mice (also referred to as PD-1-cKO mice) were obtained. A conceptual diagram is shown in FIG. In addition, PD-1 heterozygous (PD-1 fl / + CD8 cre ) littermates were also obtained (Littermate Ctrl). Table 2 shows the primer sequences used for genotyping of CD8 cre , PD-1 -/- , and PD-1 fl.
  • Example 3 Psoriasis-like dermatitis model using CD8-positive T cell-specific PD-1 conditional knockout mouse ⁇ Induction of dermatitis>
  • imiquimod was applied to 5 PD-1 fl / fl CD8 cre mice (PD-1-cKO) and 5 PD-1 fl / + CD8 cre mice (Littermate Ctrl).
  • a photograph of the back on the 7th day of application is shown in FIG. Mild erythema and scales were observed on the Literate Ctrl coated with imiquimod. Severe erythema and scales were observed in PD-1-cKO coated with imiquimod.
  • HE-stained skin tissue specimens of Litermate Ctrl and PD-1-cKO are shown on the left side of FIG. 28.
  • ⁇ Thickness of epidermis> The evaluation was performed in the same manner as in Example 1. The thickness of the epidermis of Litermate Ctrl and PD-1-cKO is shown on the right side of FIG. 28. The epidermis of PD-1-cKO was significantly thicker than that of Literate Ctrl.
  • ⁇ CD8-positive cells in lymph nodes Inflow region lymph nodes collected from Litermate Ctrl and PD-1-cKO were ground on a mesh, individualized by pipetting, and filtered to prepare a single cell suspension. Staining was performed using a Zombie fixable viability kit (manufactured by BioLegend) to remove dead cells. Living cells were anti-CD45 antibody (30-F11, manufactured by BioLegend) diluted with FACS staining buffer (PBS containing 1% BSA, 5 mM EDTA), anti-CD8 antibody (53-6.7, manufactured by BioLegend), and Incubated with anti-CD3e antibody (145-2C11, manufactured by BioLegend).
  • ⁇ Expression level of IFN- ⁇ and GzmB in cells A suspension of lymph node cells prepared as described above from the influx region lymph nodes of Litermate Ctrl and PD-1-cKO was used. RPMI 1640 medium (10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, monensin) with a final concentration of 25 ng / ml PMA and a final concentration of 1 ⁇ g / ml ionomycin. The cells were stimulated with (addition).
  • Gallios manufactured by Beckman-Coulter was used as a flow cytometer, and data analysis was performed with FlowJo software (v7.6.5). Live CD45-positive, CD3e-positive and CD8-positive living cells were designated as CD8-positive T cells.
  • a histogram of cells expressing IFN- ⁇ or Gzm B is shown on the left side of FIG. 31.
  • IFN- ⁇ the peaks of CD8-positive T cells derived from PD-1-cKO are shifted to the right as compared with Litemate Ctrl and negative control, and cells with a large amount of IFN- ⁇ in the cells are PD-1-.
  • Gzm B the peaks of CD8-positive T cells derived from PD-1-cKO are shifted to the right as compared with Litermate Ctrl and negative control, and cells with a large amount of Gzm B in the cells are PD-1-.
  • FIG. 31 shows the median fluorescence intensity (MFI).
  • MFI median fluorescence intensity
  • Example 4 Administration of anti-IL-6R antibody to a psoriasis-like dermatitis model using conventional knockout mice ⁇ Induction of dermatitis and administration of anti-IL-6R antibody>
  • Ten PD-1 conventional knockout mice (PD-1 -/- ) and 10 wild-type mice (WT) were prepared. Imiquimod was applied to all mice in the same manner as in Example 1 to induce dermatitis.
  • 2 mg of anti-IL-6R antibody (MR16-1, manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) was intravenously injected per mouse, and analysis was performed on mice that were confirmed to have been injected reliably. carried out.
  • This antibody is a rat IgG1 monoclonal antibody against the ⁇ chain of mouse IL-6R.
  • Isotype IgG control manufactured by MP Biomedicals
  • Control (IgG Ctrl) WT mice treated with control PD-1 was administered (IgG Ctrl) - / - mice, and anti-IL-6R antibody (MR16-1) administration of the PD-1 - / - coating of mice
  • FIG. Mild erythema and scales were observed in control WT mice. Severe erythema and scales were observed in control PD-1 -/-mice. On the other hand, erythema and scales of PD-1-/- mice administered with anti-IL-6R antibody were mild. It was revealed that the exacerbation of PD-1-dependent dermatitis was alleviated by administration of anti-IL-6R antibody.
  • ⁇ Thickness of epidermis> This was done in the same manner as in Example 1.
  • the thickness of the epidermis of the control WT mouse, the control PD-1 -/- mouse, and the PD-1-/- mouse administered with the anti-IL-6R antibody is shown on the left of FIG. 35.
  • the epidermis of the control PD-1 -/- mice was significantly thicker than that of the WT mouse, but when the anti-IL-6R antibody was administered, the thickness was similar to that of the control WT mouse. It was revealed that PD-1-dependent epidermal thickening was alleviated by administration of anti-IL-6R antibody.
  • Example 2 This was done in the same manner as in Example 1.
  • the number of microabscesses in the control WT mouse, the control PD-1 -/- mouse, and the PD-1-/- mouse administered with the anti-IL-6R antibody is shown on the right side of FIG. 35.
  • the control PD-1 -/- mice had significantly more microabscesses than the control WT mice, but when the anti-IL-6R antibody was administered, the number was about the same as that of the control WT mice.
  • the increase in PD-1-dependent microabscesses was found to be alleviated by administration of anti-IL-6R antibody.
  • FIG. 36 shows the quantification results of mRNA of cytokines (IL-6, IL-23a, IL-17a) that have been reported to be involved in psoriasis.
  • the expression level of IL-6 mRNA was significantly higher in the control PD-1-/- mice than in the WT mice, but when the anti-IL-6R antibody was administered, the amount was similar to that in the control WT mice. there were. It was revealed that the PD-1-dependent increase in IL-6 production was alleviated by the administration of anti-IL-6R antibody. Further, IL-23a had the same tendency as described above.
  • IL-17a there was no significant difference between PD-1-/- mice and WT mice in the control, but it was revealed that when anti-IL-6R antibody was administered, it was significantly decreased as compared with the control. rice field.
  • the quantitative results are shown in FIG. 37.
  • the amount of IL-6 was significantly higher in control PD-1-/- mice than in WT mice, but was significantly reduced when anti-IL-6R antibody was administered. It was revealed that the PD-1-dependent increase in IL-6 production was alleviated by the administration of anti-IL-6R antibody. Further, IL-23A and IL-17A had the same tendency as described above.
  • Example 5 Administration of anti-IL-6R antibody to a psoriasis-like dermatitis model using a CD8-positive T cell-specific PD-1 conditional knockout mouse ⁇ Induction of dermatitis and administration of anti-IL-6R antibody> Twelve PD-1 fl / fl CD8 cre mice (PD-1-cKO) and 10 PD-1 fl / + CD8 cre mice (Littermate Ctrl) were prepared and assigned to two groups. All mice were coated with imiquimod in the same manner as in Example 4 and administered with anti-IL-6R antibody (MR16-1, manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) or control (Isotype IgG control).
  • MR16-1 manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.
  • FIG. 38 shows a photograph of the back of Littermate Ctrl mice and PD-1-cKO mice administered with control (IgG Ctrl) or anti-IL-6R antibody on the 7th day of application.
  • control IgG Ctrl
  • anti-IL-6R antibody a control that was administered with control or anti-IL-6R antibody.
  • severe erythema and scales were observed in control PD-1-cKO mice.
  • the erythema and scales of PD-1-cKO mice treated with anti-IL-6R antibody were mild. It was revealed that the exacerbation of PD-1-dependent dermatitis was alleviated by administration of anti-IL-6R antibody.
  • ⁇ Thickness of epidermis> This was done in the same manner as in Example 1.
  • the thickness of the epidermis of Littermate Ctrl and PD-1-cKO mice to which control (IgG Ctrl) or anti-IL-6R antibody was administered is shown on the left of FIG. 41.
  • the control PD-1-cKO mice had a significantly thicker epidermis than the Litermate Ctrl mice, but when the anti-IL-6R antibody was administered, the epidermis was as thick as the Litermate Ctrl mice. It was revealed that PD-1-dependent epidermal thickening was alleviated by administration of anti-IL-6R antibody.
  • ⁇ CD8-positive cells in lymph nodes> This was done in the same manner as in Example 3.
  • the number of CD8-positive cells in the lymph nodes of Litemate Ctrl and PD-1-cKO mice to which control (IgG Ctrl) or anti-IL-6R antibody was administered is shown in FIG. 42.
  • the control PD-1-cKO mice had significantly more CD8-positive cells in the lymph nodes than the Litermate Ctrl mice, but significantly decreased when anti-IL-6R antibody was administered. It was revealed that CD8-positive cell infiltration into PD-1-dependent lymph nodes was alleviated by administration of anti-IL-6R antibody.
  • Example 3 ⁇ Expression level of CD8a and IFN- ⁇ mRNA> This was done in the same manner as in Example 3.
  • the mRNA expression levels of CD8a and IFN- ⁇ in the ears of Litemate Ctrl and PD-1-cKO mice administered with control (IgG Ctrl) or anti-IL-6R antibody are shown in FIG. 43.
  • the mRNA expression level of CD8a was not different between the Littermate Ctrl mice and the administration of the control or anti-IL-6R antibody.
  • the control-administered PD-1-cKO mice had significantly higher levels of CD8a mRNA than the Litermate Ctrl mice, but significantly decreased when anti-IL-6R antibody was administered. It was revealed that PD-1 dependent increase in CD8a expression level was alleviated by administration of anti-IL-6R antibody.
  • the expression level of IFN- ⁇ mRNA was not different between the Littermate Ctrl mice and the administration of the control or anti-IL-6R antibody.
  • the control-administered PD-1-cKO mice had significantly higher IFN- ⁇ mRNA than the Litermate Ctrl mice, but tended to decrease when the anti-IL-6R antibody was administered.
  • FIG. 45 shows the search results of the exon (indicated by box) of the PD-L1 gene (CD274) in the genome of the wild-type mouse, the target sequence of the CRISPR-Cas system, and the PAM sequence.
  • Mouse CD274 is located on chromosome 19 and is composed of 7 exons. Since the start codon of PD-L1 protein is present in the first exon, dropping the second and third exons using the Cre / loxP system prevents the production of complete PD-L1 protein.
  • the loxP sequence was designed to be inserted at both ends of the region containing exons 2-3 using the CRISPR-Cas system.
  • a pX330 vector CRISPR / Cas9 vector containing a guide RNA (gRNA) and a Cas9 expression cassette in one plasmid is introduced into a fertilized egg, and the target sgRNA and Cas9 mRNA are simultaneously expressed to mouse PD.
  • the L1 genome was cleaved at the target position, and pflop-PD-L1 (donor vector) containing the loxP sequence was also introduced into the fertilized egg as donor DNA so that the loxP sequence was inserted into the cleavage site. ..
  • the CRISPR target site on the 5'side of the region containing Exxon 2-3 is the Left CRISPR site
  • the CRISPR target site on the 3'side is the right CRISPR site
  • the area from the Left CRISPR prediction cut site to the upstream (5') side 1382 bp is 5 'Arm
  • from the right CRISPR predictive cutting site to 1085bp downstream (3') was the 3'arm
  • 3197bp between the Left CRISPR predictive cutting site and the light CRISPR predictive cutting site was the central arm.
  • the sequences of the Left CRISPR target site and the light CRISPR target site (L target sequence: SEQ ID NO: 31, R target sequence: SEQ ID NO: 32) are shown in FIG. 45.
  • the left and right target sequences and PAMs were searched using CRISPR (https://crispr.dbcls.jp/) and the 20-base target sequence was one in the CD274 genome. I confirmed that there was only one place.
  • a donor vector containing the loxP sequence on the outside of the exon 2-3 and containing the 5'arm, central arm, and 3'arm sequences was prepared by the following procedure.
  • PCR was performed according to a conventional method using the genomic DNA of C57BL / 6J mice (FIG. 46, SEQ ID NO: 33) as a template and using the primers of Step1.
  • the 5'arm is the sequence of the B6J genome used as the template for the 5'arm
  • the Central arm coarse broken line
  • 3'arm ( Gothic) is the sequence of the B6J genome used as a template for the 3'arm.
  • Step 1 In-Fusion (Step 1, FIG. 47) of the obtained PCR product and a vector originally prepared based on pbluescrit (pflox primer (FIG. 17, SEQ ID NO: 6)).
  • pflox primer FOG. 17, SEQ ID NO: 6
  • the arrowhead pointing to the left indicates the loxP sequence.
  • PCR was performed using the primer of Step2, and the obtained PCR product and the product of Step1 were In-Fusioned (Step2, FIG. 48). Further, the primer of Step3 was used. PCR was performed, and the obtained PCR product and the product of Step 2 were In-Fusion (Step 3, FIG. 49). This product was designated as pflox-PD-L1.
  • the primers used are shown in Table 3.
  • L target sequence SEQ ID NO: 40
  • R target sequence SEQ ID NO: 41
  • pX330-PD-PD pX330-PD-PD. It was designated as L1-L and pX330-PD-L1-R.
  • FIG. 50 shows a schematic diagram.
  • pflox-PD1, pX330-PD-L1-L and pX330-PD-L1-R were microinjected into the pronucleus of C57BL / 6 fertilized eggs by a conventional method. Fertilized eggs were transplanted into the oviducts of pseudopregnant mice to give birth to founder mice. By mating this founder mouse with a C57BL6 mouse, a heterozygous PD-L1 fl / + mouse was produced. Furthermore, homozygous PD-L1 fl / fl mice were produced by mating these heterozygous PD-L1 fl / + mice with each other.
  • Genotyping was performed on genomic DNA purified from a part of mouse tail tissue by PCR using the following primers (sequence is shown in FIG. 51) according to a conventional method.
  • PDL1 Genotype RiF SEQ ID NO: 42
  • PDL1 Genotype RiR SEQ ID NO: 43
  • PDL1 Genotype LeF SEQ ID NO: 44
  • PDL1 Genotype LeR SEQ ID NO: 45
  • FIG. 52 The DNA sequence of CD274 in the genome of PD-L1 frozen mouse is shown in FIG. 52 (SEQ ID NO: 46).
  • FIG. 53 shows the gene sequence (SEQ ID NO: 49) of the open reading frame (ORF) of PD-L1 frozen mice and the corresponding amino acid sequence (SEQ ID NO: 50) predicted after shedding by the Cre / loxP system.
  • the prepared PD-L1 fl / fl mice developed normally, and it was shown that the regulation of the PD-L1 gene was not clearly disturbed by the insertion of the loxP sequence.
  • Langerin cre mice are characterized by not expressing Cre in dendritic cells but expressing Cre specifically in Langerhans cells, PD-L1 fl / + Langerin cre mice, PD-L1 fl / fl mice, and Langerin.
  • the cre mice were mated to obtain conditional PD-L1 homozygous mice (also referred to as PD-L1 fl / fl Langerin cre mice, PD-L1 conditional knockout mice, and PD-L1-cKO mice).
  • a conceptual diagram is shown in FIG. 54.
  • PD-L1 heterozygous (PD-L1 fl / + Language cre ) litters were also obtained (Littermate Ctrl).
  • Table 4 shows the primer sequences used for genotyping of Langerin cre , PD-L1 -/- , and PD-L1 fl.
  • An anti-PD-L1 antibody (10F.9G2, manufactured by BioLegend) was used to indicate that PD-L1 gene expression was completely abolished in the lymph nodes of PD-L1 fl / fl Language cre mice in a Langerhans cell population-specific manner. It was confirmed by the flow cytometry.
  • Example 7 Psoriasis-like dermatitis model using Langerhans cell-specific PD-L1 conditional knockout mouse ⁇ Induction of dermatitis>
  • imiquimod was applied to 5 PD-L1 fl / fl Language cre mice (PD-L1-cKO) and 5 littermates PD-L1 fl / + Language cre mice (Ctrl).
  • PD-L1 was not expressed in Langerhans cells of PD-L1-cKO and Ctrl that had not been coated with imiquimod (IMQ (-)), but Langerin-positive dendritic cells and Langerin-negative dendritic cells had no expression.
  • PD-L1 was expressed.
  • imiquimod was applied (IMQ (+))
  • PD-L1 remained absent in Langerhans cells of PD-L1-cKO, but PD-L1 was expressed in Langerhans cells of Ctrl.
  • FIG. 56 shows a photograph of the back on the 5th day of application. There was no noticeable difference in skin condition between Ctrl without imiquimod and PD-L1-cKO. Mild erythema and scales were observed on imiquimod-coated (IMQ) Ctrl. Severe erythema and scales were observed in PD-L1-cKO coated with imiquimod.
  • IMQ imiquimod-coated
  • the HE-stained skin tissue specimens of Ctrl and PD-L1-cKO are shown in FIG. 58. There was no noticeable difference in the morphology of the skin tissue between Ctrl without imiquimod (Vehicle) and PD-L1-cKO. In PD-L1-cKO coated with imiquimod (IMQ), thickening of the epidermis, parakeratosis and hyperkeratosis, and microabscesses due to neutrophils just below the stratum corneum were significantly observed as compared with Ctrl.
  • IMQ imiquimod
  • ⁇ Thickness of epidermis> The evaluation was performed in the same manner as in Example 1. The thickness of the epidermis of Ctrl and PD-L1-cKO is shown in FIG. 59. There was no difference in epidermis thickness between Ctrl without imiquimod (Vehicle) and PD-L1-cKO, but PD-L1-cKO was more than Ctrl with imiquimod (IMQ). The epidermis was significantly thicker.
  • ⁇ Cytokine mRNA expression level> The mRNA expression levels of IL-6, IL-17a and IL-23a in imiquimod-coated Ctrl and PD-L1-cKO were examined in the same manner as in Example 1 "cytokine mRNA expression level". The results are shown in FIG. The mRNA expression levels of IL-6, IL-17a and IL-23 were higher in PD-L1-cKO than in Ctrl. In particular, the mRNA expression level of IL-17a in PD-L1-cKO was significantly higher than that in Ctrl. From this result, it was suggested that PD-L1 expressed in Langerhans cells regulates cytokine production in Th17 cells. Therefore, next, analysis was performed on ⁇ T cells, which are one of Th17 cells.
  • ⁇ Activation of ⁇ T cells On the 4th day of application, ears collected from mice were ground on a mesh, individualized by pipetting, and a single cell suspension was prepared through a filter.
  • RPMI 1640 medium (10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, monensin) with a final concentration of 25 ng / ml PMA and a final concentration of 1 ⁇ g / ml ionomycin.
  • the cells were stimulated with (addition).
  • anti-CD45 antibody (30-F11, manufactured by BioLegend), anti-TCR ⁇ antibody (H57-597, manufactured by BioLegend), anti-TCR ⁇ antibody (GL3, manufactured by BioLegend), anti-CD3e antibody (145-2C11).
  • BioLegend anti-CD69 antibody (H1.2F3, BioLegend)) to stain the cell surface with CD45, TCR ⁇ , TCR ⁇ and CD69, and then use Fix / Perm Kit (BD).
  • Intracellular cytokines were stained with an anti-IL-17A antibody (TC11-18H10.1, manufactured by BioLegend). Fluorescence-Minus-One Control was used as a negative control.
  • Gallios manufactured by Beckman-Coulter was used as a flow cytometer, and data analysis was performed with FlowJo software (v7.6.5).
  • a histogram of cells expressing TCR ⁇ and TCR ⁇ when gated with live CD45-positive cells is shown on the left side of FIG. 61.
  • the number of CD45-positive living cells expressing TCR ⁇ at a low level was 0.79% in Ctrl and 2.03% in PD-L1-cKO, and PD-L1-cKO was more common.
  • a graph of the ratio (%) of cells expressing TCR ⁇ at a low level ( ⁇ low T cell) to CD45-positive live cells (CD45 + live cell) is shown in the center of FIG. 61.
  • the ratio (%) of ⁇ low T cell to CD45 + live cell was significantly higher in PD-L1-cKO than in Ctrl.
  • a graph of the ratio (%) of cells expressing CD69 at a high level to ⁇ low T cell (CD69 hi ) is shown second from the right in FIG. 61.
  • “CD69 hi ⁇ low Tcell” on the vertical axis of the graph indicates the ratio of cells expressing CD69 at a high level (CD69 hi ⁇ low Tcell) to cells expressing TCR ⁇ at a low level ( ⁇ low Tcell) (CD69 hi ⁇ low Tcell). %).
  • the ratio (%) of cells expressing high levels of CD69 (CD69 hi ⁇ low T cells) to cells expressing TCR ⁇ at low levels was significantly higher in PD-L1-cKO than in Ctrl. There were many.
  • a graph of the intracellular IL-17A amount in ⁇ low T cell is shown on the right side of FIG. 61.
  • the vertical axis of the graph is the median fluorescence intensity (MFI).
  • MFI median fluorescence intensity
  • the intracellular IL-17A amount in ⁇ low Tcell was significantly higher in PD-L1-cKO than in Ctrl. From these results, it was clarified that PD-L1 expressed on Langerhans cells activates ⁇ T cells that produce IL-17A in the skin.
  • ⁇ Expression level of IFN- ⁇ and GzmB in cells> A suspension of lymph node cells prepared as in Example 3 from the influx region lymph nodes of mice was used.
  • RPMI 1640 medium (10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, monensin) with a final concentration of 25 ng / ml PMA and a final concentration of 1 ⁇ g / ml ionomycin.
  • the cells were stimulated with (addition). After incubation for 4 hours, anti-TCR ⁇ antibody (GL3, manufactured by BioLegend), anti-CD3e antibody (145-2C11, manufactured by BioLegend), anti-CD69 antibody (H1.2F3, manufactured by BioLegend), and anti-CCR6 (Chemokine receptor6).
  • Anti-IL-17A antibody (TC11-18H10.) After staining the cell surface with TCR ⁇ and CD69 using an antibody (29-2L17, manufactured by BioLegend), and then using a Fix / Perm Kit (manufactured by BD). 1. Intracellular staining was performed with BioLegend (manufactured by BioLegend). Fluorescence-Minus-One Control was used as a negative control. Gallios (manufactured by Beckman-Coulter) was used as a flow cytometer, and data analysis was performed with FlowJo software (v7.6.5).
  • CD69 hi ⁇ low T cells The number of CD69 hi ⁇ low T cells is shown on the left side of FIG. 62. (In the figure, CD69 hi ⁇ Tcell) CD69 hi ⁇ low Tcell number of, if not imiquimod applied was no difference between the Ctrl and PD-L1-cKO. The number of CD69 hi ⁇ low T cells increased when imiquimod was applied, and PD-L1-cKO increased significantly compared to Ctrl. In addition, the expression level of IL-17A in CCR6-negative CD69 hi ⁇ low T cell was not different between Ctrl and PD-L1-cKO with or without imiquimod application.
  • the IL-17A expression level in CCR6-positive CD69 hi ⁇ low T cell was not different between Ctrl and PD-L1-cKO when imiquimod was not applied, but when imiquimod was applied, CD69 hi ⁇ was not applied.
  • the number of low T cells was significantly higher in PD-L1-cKO than in Ctrl due to imiquimod application.
  • Example 8 Preparation of PD-L2 fl / fl mouse Wild-type mouse (WT) C57BL / 6J was purchased from Charles River Japan. (design) Using the CRISPR / Cas9 system at the University of Tsukuba Experimental Animal Resources Center, two loxP sequences (5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATATACGAAGTTATA-3') were inserted before and after the PD-L2 gene to produce transgenic mice (PD-L2 frozen). Mouse, or PD-L2 fl / fl mouse). FIG.
  • 63 shows the position of exons (indicated by box) of the PD-L2 gene (CD273) in the genome of wild-type mice, the target sequence of the CRISPR-Cas system, and the PAM sequence.
  • Mouse CD273 is located on chromosome 19 and consists of 6 exons. Since the start codon of the PD-L2 protein is present in the first exon, a part of the PD-L2 protein is deleted by dropping the third and fourth exons using the Cre / loxP system.
  • loxP sequences were designed to create a flox mouse by inserting loxP sequences at two locations so as to sandwich the region containing exons 3-4 (Left CRISPR on the 5'side and Light CRISPR on the 3'side. ). Genome editing by the electroporation method was adopted for the insertion of the left and right loxP sequences.
  • a single-stranded donor containing a fertilized egg obtained by artificially fertilizing a male sperm from a female mouse subjected to hyperovulation treatment, SpCas9 protein, guide RNA (gRNA), and loxP sequence.
  • the loxP sequence was inserted into the cleavage site by mixing with DNA (ssODN) and electroporation to introduce it into the fertilized egg.
  • the left and right target sequences and ssODN are shown in Table 5.
  • Fertilized eggs were transplanted into the oviducts of pseudopregnant mice to give birth to founder mice.
  • a heterozygous PD-L2 fl / + mouse was produced.
  • homozygous PD-L2 fl / fl mice were produced by mating these heterozygous PD-L2 fl / + mice with each other.
  • Genotyping was performed by performing PCR on genomic DNA purified from a part of the tail tissue of mice according to a conventional method using the following primers.
  • PD-L2 Genotype LF ACTTCCCTTCAGGCTTTGGT (SEQ ID NO: 63)
  • PD-L2 Genotype LR TGGTCCAGGATTTCTCAAGG
  • PD-L2 Genotype RF TCTGCCCCTCGTTTTCATAC (SEQ ID NO: 65)
  • PD-L2 Genotype RR CGCAGAGTGGTTGTGGTATG (SEQ ID NO: 66)
  • the size is shown in FIG. Based on the size of the obtained PCR product, it was judged to be a wild-type mouse (WT) or a PD-L2 frozen mouse.
  • the DNA sequence (SEQ ID NO: 71) in the genome of a wild-type mouse is shown in FIG.
  • the DNA sequence (SEQ ID NO: 72) in the genome of PD-L2 frozen mouse is shown in FIG.
  • a drug that prevents and treats immune-related side effects caused by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody. It is possible to provide a genetically modified non-human animal in which PD-1 / PD-L1 and L2 signals are inhibited in a tissue-specific and time-specific manner. In addition, non-human animals can be provided that model immunity-related side effects with anti-PD-1 or anti-PD-L1 antibodies. It is possible to provide a method for screening a drug that performs at least one of prevention and treatment of immune-related side effects caused by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody. It is possible to provide a method for evaluating a drug that performs at least one of prevention and treatment of immune-related side effects caused by an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.

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Abstract

抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤を提供することを課題とする。また、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナルが組織特異的、時期特異的に阻害される、遺伝子改変非ヒト動物を提供することを課題とする。抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物、およびそれを用いた薬剤のスクリーニング方法ならびに評価方法を提供することを課題とする。　ＩＬ－６シグナルを阻害する物質を含む、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤であって、前記免疫関連副作用が皮膚障害、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、横紋筋融解症、Ｉ型糖尿病、神経障害、腎障害、関節炎、肝障害、肺炎、膵炎、甲状腺炎、副腎炎、視床下部機能異常、および汎下垂体機能低下症から選ばれる少なくとも１つである、薬剤。ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、組織および時期の少なくとも一方に特異的にＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物。ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている遺伝子改変非ヒト動物に、抗原性補強剤を投与することにより作製する、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物。

Description

免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤、遺伝子改変非ヒト動物、および免疫関連副作用モデル非ヒト動物
　本発明は、免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤、遺伝子改変非ヒト動物、および免疫関連副作用モデル非ヒト動物に関する。
　免疫チェックポイント阻害薬である抗ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　１）抗体または抗ＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　１－Ｌｉｇａｎｄ　１）抗体は、悪性黒色腫および扁平上皮非小細胞肺癌を始めとする種々のガンの治療に有効であり、ガン免疫療法として臨床において頻繁に用いられている。しかし、抗ガン作用とともに、その作用機序より自己免疫反応が惹起され、様々な免疫関連副作用（ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｄｖｅｒｓｅ　ｅｖｅｎｔｓ：ｉｒＡＥｓ、免疫関連有害事象ともいう)が起きてしまう。免疫関連副作用は、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を投与した症例の約７割で発症している。免疫関連副作用は、肺、腸管、甲状腺などを始めとした全身の臓器で起こり得るが、皮膚炎はその約４割を占め、そのうちの一つが乾癬様皮膚炎である。免疫関連副作用としての乾癬様皮膚炎を発症した患者では、免疫関連副作用を発症しなかった患者に比べて、血清中のインターロイキン－６（ＩＬ－６）の上昇がみられることが報告されている（非特許文献１）。しかし、免疫関連副作用の病態や発症のメカニズムについては未知のことが多いため、免疫関連副作用の対処法としては現在のところステロイドなどの非特異的免疫抑制療法が選択されている。しかし、これは抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体によるガン免疫療法の抗ガン作用を打ち消すものであるので、抗ガン作用を打ち消さない特異的な治療法が求められていた。また、免疫関連副作用を発症するモデルが存在しないため、治療法や治療薬の開発が行えなかった。
Ｔａｎａｋａ　Ｒ、Ｓｅｒｕｍ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６　ｉｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｎｉｖｏｌｕｍａｂ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｓｏｒｉａｓｉｆｏｒｍ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ　ａｎｄ　ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－α　ｉｓ　ａ　ｂｉｏｍａｒｋｅｒ　ｏｆ　ｎｉｖｏｌｕｍａｂ　ｒｅｃａｔｉｖｉｔｙ．、Ｊ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ　Ｓｃｉ．、２０１７、８６（１）、７１－７３
　本発明者らは、免疫関連副作用、特に乾癬様皮膚炎の病態と発症メカニズムを解析し、そのメカニズムの一部を阻害できれば、乾癬様皮膚炎の予防および治療を行えると考えた。そこで、免疫関連副作用としての乾癬様皮膚炎の病態と発症メカニズムを解析し、本発明の第一の態様として、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤を提供することを課題とする。また、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体が投与された状態をモデル動物で再現できれば、免疫関連副作用の病態や発症メカニズムの解析が行えると考えた。そこで、本発明の第二の態様として、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１、Ｌ２シグナルが組織特異的、時期特異的に阻害される、遺伝子改変非ヒト動物を提供することを課題とする。さらに、免疫関連副作用を発症するモデル動物があれば、免疫関連副作用の予防や治療に有効な薬剤を探し、開発することができると考えた。そこで、本発明の第三の態様として、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物を提供することを課題とする。本発明の第四の態様として、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。本発明の第五の態様として、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤の評価方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した。その結果、以下の構成を有することにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、例えば以下の〔１〕～〔２９〕に関する。
〔１〕　ＩＬ－６シグナルを阻害する物質を含む、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤であって、前記免疫関連副作用が皮膚障害、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、横紋筋融解症、Ｉ型糖尿病、神経障害、腎障害、関節炎、肝障害、肺炎、膵炎、甲状腺炎、副腎炎、視床下部機能異常、および汎下垂体機能低下症から選ばれる少なくとも１つである、薬剤。
〔２〕　前記ＩＬ－６シグナルを阻害する物質が、ＩＬ－６とＩＬ－６Ｒとの結合を阻害する物質である、〔１〕に記載の薬剤。
〔３〕　前記ＩＬ－６とＩＬ－６Ｒとの結合を阻害する物質が、抗ＩＬ－６Ｒ抗体である、〔２〕に記載の薬剤。
〔４〕　前記免疫関連副作用が皮膚障害である、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の薬剤。
〔５〕　前記皮膚障害が乾癬様皮膚炎である、〔４〕に記載の薬剤。
〔６〕　前記乾癬様皮膚炎が、ＣＤ８陽性細胞の表皮への浸潤が尋常性乾癬よりも亢進しているものである、〔５〕に記載の薬剤。
〔７〕　ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物。
〔８〕　前記リコンビネース標的配列がｌｏｘＰ配列である、〔７〕に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
〔９〕　ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、組織および時期の少なくとも一方に特異的にＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物。
〔１０〕　Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ配列、ＦＬＰタンパク質／ＦＲＴ配列、およびｐＳＲ1リコンビネース／ｐＳＲ１リコンビネース標的配列からなる群から選ばれる、リコンビネース／リコンビネース標的配列システムの利用により、ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入される、〔９〕に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
〔１１〕　前記リコンビネース／リコンビネース標的配列システムがＣｒｅ／ｌｏｘＰ配列である、〔１０〕に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
〔１２〕　ＣＤ８陽性Ｔ細胞特異的にＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、〔９〕～〔１１〕のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
〔１３〕　ＰＤ－１遺伝子のエクソン２、３、および４の発現が抑制または喪失されている、〔９〕～〔１２〕のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
〔１４〕　ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている遺伝子改変非ヒト動物に、抗原性補強剤を投与することにより作製する、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物。
〔１５〕　前記遺伝子改変非ヒト動物が、組織および時期の少なくとも一方に特異的にＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている遺伝子改変非ヒト動物である、〔１４〕に記載の、免疫関連副作用モデル非ヒト動物。
〔１６〕　前記遺伝子改変非ヒト動物が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞特異的にＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている遺伝子改変非ヒト動物である、〔１５〕に記載の、免疫関連副作用モデル非ヒト動物。
〔１７〕　前記免疫関連副作用が、免疫関連副作用としての乾癬様皮膚炎である、〔１４〕～〔１６〕のいずれかに記載の免疫関連副作用モデル非ヒト動物。
〔１８〕　前記抗原性補強剤がイミキモドである、〔１４〕～〔１７〕のいずれかに記載の免疫関連副作用モデル非ヒト動物。
〔１９〕　ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物。
〔２０〕　Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ配列、ＦＬＰタンパク質／ＦＲＴ配列、およびｐＳＲ1リコンビネース／ｐＳＲ１リコンビネース標的配列からなる群から選ばれる、リコンビネース／リコンビネース標的配列システムの利用により、ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入される、〔１９〕に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
〔２１〕　前記リコンビネース／リコンビネース標的配列システムがＣｒｅ／ｌｏｘＰ配列である、〔２０〕に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
〔２２〕　ＰＤ－Ｌ１遺伝子のエクソン２および３の発現が抑制または喪失されている、〔１９〕～〔２１〕のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
〔２３〕　〔１９〕～〔２２〕のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物に、抗原性補強剤を投与することにより作製する、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物。
〔２４〕　前記免疫関連副作用が、免疫関連副作用としての乾癬様皮膚炎である、〔２３〕に記載の免疫関連副作用モデル非ヒト動物。
〔２５〕　前記抗原性補強剤がイミキモドである、〔２３〕または〔２４〕に記載の免疫関連副作用モデル非ヒト動物。
〔２６〕　〔９〕～〔１３〕、〔１９〕～〔２２〕のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物、または〔１４〕～〔１８〕、〔２３〕～〔２５〕のいずれかに記載の免疫関連副作用モデル非ヒト動物を用いる、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤のスクリーニング方法。
〔２７〕　〔９〕～〔１３〕、〔１９〕～〔２２〕２２のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物、または〔１４〕～〔１８〕、〔２３〕～〔２５〕のいずれかに記載の免疫関連副作用モデル非ヒト動物を用いる、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤の評価方法。
〔２８〕　ゲノム中のＰＤ－Ｌ２遺伝子またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物。
〔２９〕　前記リコンビネース標的配列がｌｏｘＰ配列である、〔２８〕に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
　本発明によれば、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤を提供することができる。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１、Ｌ２シグナルが組織特異的、時期特異的に阻害される、遺伝子改変非ヒト動物を提供することができる。さらに、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物を提供することができる。抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤のスクリーニング方法を提供することができる。抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤の評価方法を提供することができる。
図１は、尋常性乾癬（左）と、Ａｎｔｉ-ＰＤ－１　ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｓｏｒｉａｓｉｓ－ｌｉｋｅ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ（抗ＰＤ－１抗体誘導性乾癬様皮膚炎、右）の患者の背部と下腿の皮膚の写真である。 図２は、尋常性乾癬（上）と、Ａｎｔｉ-ＰＤ－１　ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｓｏｒｉａｓｉｓ－ｌｉｋｅ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ（抗ＰＤ－１抗体誘導性乾癬様皮膚炎、下）の患者から得た組織切片をヘマトキシリンエオジン染色した結果（ＨＥ）、抗ＣＤ８抗体により免疫染色した結果（ＣＤ８）および抗ＣＤ４抗体により免疫染色した結果（ＣＤ４）を示す写真である。写真中のスケールバーは５０μｍである。 図３は、ＣＤ８／ＣＤ４　ｒａｔｉｏ（表皮内に浸潤したＣＤ８陽性Ｔ細胞数を表皮内に浸潤したＣＤ４陽性Ｔ細胞数で除した値）を、尋常性乾癬と、Ａｎｔｉ-ＰＤ－１　ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｓｏｒｉａｓｉｓ－ｌｉｋｅ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ（抗ＰＤ－１抗体誘導性乾癬様皮膚炎）の患者とで比較したグラフである。 図４は、抗ＰＤ－１抗体投与を受けたメラノーマ患者の投与前後での血清中ＩＬ－６濃度の変化を、Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ－ｌｉｋｅ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ（乾癬様皮膚炎）発症患者、Ｏｔｈｅｒ　ｉｒＡＥｓ（乾癬様皮膚炎以外の免疫関連副作用）発症患者、およびＮｏ　ｉｒＡＥ（免疫関連副作用なし）の患者で比較したグラフである。Ｐｒｅは抗ＰＤ－１抗体投与前、Ｐｏｓｔは抗ＰＤ－１抗体投与後を示す。 図５は、Ｖｅｈｉｃｌｅ群の野生型マウス（左）、ＩＭＱ（イミキモド）群の野生型マウス（中央）、およびＩＭＱ（イミキモド）群のＰＤ－１-/-マウス（右）の塗布７日目の背部皮膚の写真である。 図６左は、イミキモドを塗布したＰＤ－１-/-マウス（ＰＤ－１-/-）と野生型マウス（ＷＴ）の耳の厚さの変化を示すグラフである。図６右は、イミキモドを塗布したＰＤ－１-/-マウス（ＰＤ－１-/-）と野生型マウス（ＷＴ）の背部皮膚における炎症の重症度の変化を示すグラフである。 図７は、野生型マウス（ＷＴ）とＰＤ－１-/-マウス（ＰＤ－１-/-）におけるイミキモド誘導性乾癬様皮膚炎の様子を示す、耳皮膚のヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の写真である。 図８左は、野生型マウス（ＷＴ）とＰＤ－１-/-マウス（ＰＤ－１-/-）の耳の表皮の厚さをイミキモド群とＶｅｈｉｃｌｅ群とで比較したグラフである。図８右は、野生型マウス（ＷＴ）とＰＤ－１-/-マウス（ＰＤ－１-/-）の耳の表皮中の好中球性微小膿瘍の数を示すグラフである。 図９は、野生型マウス（ＷＴ）とＰＤ－１-/-マウス（ＰＤ－１-/-）の耳における、乾癬に関連するサイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－２３ａ、ＩＬ－１７ａ）と好中球表面マーカーであるＬｙ６ｇのｍＲＮＡの発現量を定量ＲＴ－ＰＣＲにより解析したグラフである。 図１０は、イミキモド塗布５日目の野生型マウス（ＷＴ）とＰＤ－１-/-マウス（ＰＤ－１-/-）の耳皮膚の組織切片を免疫染色して、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を染色した写真である。ＣＤ８陽性Ｔ細胞を矢頭で示す。 図１１は、イミキモド塗布５日目の野生型マウス（ＷＴ）とＰＤ－１-/-マウス（ＰＤ－１-/-）の耳皮膚へ浸潤したＣＤ８陽性Ｔ細胞の数を、表皮と真皮で比較したグラフである。 図１２は、マウス耳の皮膚から、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ＣＤ４５＋ｃｅｌｌおよびＤｅｒｍａｌ　ｃｅｌｌを分離する手順を示す概念図である。 図１３は、イミキモド塗布５日目の野生型マウス（ＷＴ）とＰＤ－１-/-マウス（ＰＤ－１-/-）の耳の皮膚から得たＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ＣＤ４５+ｃｅｌｌおよびＤｅｒｍａｌ　ｃｅｌｌにおけるＣＤ８ａ、ＩＦＮ－γおよびＣＸＣＬ９のｍＲＮＡの発現量を定量ＲＴ-ＰＣＲにより比較したグラフである。 図１４は、ＰＤ－１遺伝子領域の上流と下流に３４ｂｐのｌｏｘＰ配列がそれぞれ導入されたｆｌｏｘｅｄマウスのゲノムの概念図である。 図１５は、野生型マウスのゲノムにおけるＰｄｃｄ１のエクソン（ｂｏｘで示す、右からエクソン１、２、３、４、５である）の位置、左右のＣＲＩＳＰＲと３'アーム（３'ａｒｍ）、セントラルアーム（Ｃ　ａｒｍ）、５'アーム（５'ａｒｍ）の位置、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの左右のターゲット配列（ＰＡＭを含む）を示す図である。 図１６－１は、野生型マウスのゲノムにおけるＰｄｃｄ１のＤＮＡ配列（一部）である。 図１６－２は、図１６－１の続きである。 図１６－３は、図１６－２の続きである。 図１６－４は、図１６－３の続きである。 図１６－５は、図１６－４の続きである。 図１６－６は、図１６－５の続きである。 図１６－７は、図１６－６の続きである。 図１６－８は、図１６－７の続きである。 図１７－１は、ｐｆｌｏｘ　ｐｌａｔｆｏｒｍのＤＮＡ配列（一部）である。 図１７－２は、図１７－１の続きである。 図１８は、Ｐｄｃｄ１のゲノムＤＮＡをｐｆｌｏｘ　ｐｌａｔｆｏｒｍに組み込む手順のうち、Ｓｔｅｐ１の概念図である。 図１９は、Ｐｄｃｄ１のゲノムＤＮＡをｐｆｌｏｘ　ｐｌａｔｆｏｒｍに組み込む手順のうち、Ｓｔｅｐ２の概念図である。 図２０は、Ｐｄｃｄ１のゲノムＤＮＡをｐｆｌｏｘ　ｐｌａｔｆｏｒｍに組み込む手順のうち、Ｓｔｅｐ３の概念図である。 図２１は、ｐＸ３３０にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのターゲット配列を組み込む模式図である。 図２２は、ＰＤ－１　ｆｌｏｘｅｄマウスのゲノムにおけるＰｄｃｄ１のエクソン（ｂｏｘで示す）の位置、３'アーム（３'ａｒｍ）、セントラルアーム（Ｃ　ａｒｍ）、５'アーム（５'ａｒｍ）の位置、制限酵素による切断部位、およびジェノタイピングに用いたプライマーを示す図である。 図２３－１は、ＰＤ－１　ｆｌｏｘｅｄマウスのゲノムにおけるＰｄｃｄ１のＤＮＡ配列（一部）である。 図２３－２は、図２３－１の続きである。 図２３－３は、図２３－２の続きである。 図２３－４は、図２３－３の続きである。 図２３－５は、図２３－４の続きである。 図２３－６は、図２３－５の続きである。 図２３－７は、図２３－６の続きである。 図２３－８は、図２３－７の続きである。 図２４は、野生型（ＷＴ）のＰＤ－１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の遺伝子配列とそれに対応するアミノ酸配列、およびＰＤ－１の２番目、３番目、および４番目のエクソンがＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムにより脱落した後（Ｍｕｔａｔｉｏｎ）に予測される、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の遺伝子配列とそれに対応するアミノ酸配列である。 図２５は、ＣＤ８のプロモーターの下流にＣｒｅが導入されたＣＤ８－Ｃｒｅマウスと、ＰＤ－１－ｆｌｏｘｅｄマウスを交配し、ＣＤ８陽性Ｔ細胞特異的にＰＤ－１が欠損するＰＤ－１コンディショナルノックアウトマウスを作製する方法の概念図である。 図２６は、ＰＤ－１－ｃＫＯ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/fl）と、その同腹子（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/+））のイミキモド塗布７日目の背部皮膚の写真である。 図２７左は、イミキモドを塗布したＰＤ－１－ｃＫＯ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/fl）とその同腹子（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ）の耳の厚さの変化を示すグラフである。図２７右は、イミキモドを塗布したＰＤ－１－ｃＫＯ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/fl）とその同腹子（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ）の背部皮膚における炎症の重症度の変化を示すグラフである。 図２８左は、ＰＤ－１－ｃＫＯ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/fl）と、その同腹子（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/+））のイミキモド塗布７日目の耳皮膚をヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の写真である。スケールバーは１００μｍである。図２８右は、ＰＤ－１－ｃＫＯ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/fl）と、その同腹子（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/+））のイミキモド塗布７日目の耳の表皮の厚さを比較したグラフである。 図２９は、ＰＤ－１－ｃＫＯ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/fl）と、その同腹子（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/+））のイミキモド塗布７日目の耳皮膚におけるＣＤ８ａとＩＦＮ－γ（ＩＦＮγ）のｍＲＮＡの発現量のグラフである。 図３０は、ＰＤ－１－ｃＫＯ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/fl）と、その同腹子（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/+））のイミキモド塗布７日目における流入領域リンパ節に浸潤したＣＤ８陽性Ｔ細胞の数を示すグラフである。 図３１は、流入領域リンパ節のＣＤ８陽性Ｔ細胞により産生されたＩＦＮ－γ（ＩＦＮγ）とＧｚｍＢのヒストグラム（左）と蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を示すグラフ（右）である。 図３２は、ＩｇＧ　Ｃｔｒｌを投与した野生型マウス（ＷＴ）およびＩｇＧ　ＣｔｒｌまたはＭＲ１６－１を投与したＰＤ－１-/-マウス（ＰＤ－１-/-）のイミキモド塗布７日目の背部皮膚の写真である。 図３３左は、ＩｇＧ　Ｃｔｒｌを投与した野生型マウス（ＷＴ）およびＩｇＧ　ＣｔｒｌまたはＭＲ１６－１を投与したＰＤ－１-/-マウス（ＰＤ－１-/-）のイミキモド塗布による耳の厚さの変化を示すグラフである。図３３右は、ＩｇＧ　Ｃｔｒｌを投与した野生型マウス（ＷＴ）およびＩｇＧ　ＣｔｒｌまたはＭＲ１６－１を投与したＰＤ－１-/-マウス（ＰＤ－１-/-）のイミキモド塗布による背部皮膚における炎症の重症度の変化を示すグラフである。 図３４は、ＩｇＧ　Ｃｔｒｌを投与した野生型マウス（ＷＴ）およびＩｇＧ　ＣｔｒｌまたはＭＲ１６－１を投与したＰＤ－１-/-マウス（ＰＤ－１-/-）のイミキモド塗布７日目の耳皮膚のヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の写真である。スケールバーは５０μｍである。 図３５左は、ＩｇＧ　Ｃｔｒｌを投与した野生型マウス（ＷＴ）およびＩｇＧ　ＣｔｒｌまたはＭＲ１６－１を投与したＰＤ－１-/-マウス（ＰＤ－１-/-）のイミキモド塗布７日目の耳の表皮の厚さを比較したグラフである。図３５右は、ＩｇＧ　Ｃｔｒｌを投与した野生型マウス（ＷＴ）およびＩｇＧ　ＣｔｒｌまたはＭＲ１６－１を投与したＰＤ－１－／－マウス（ＰＤ－１－／－）の耳の表皮中の好中球性微小膿瘍の数を示すグラフである。 図３６は、ＩｇＧ　Ｃｔｒｌを投与した野生型マウス（ＷＴ）およびＩｇＧ　ＣｔｒｌまたはＭＲ１６－１を投与したＰＤ－１-/-マウス（ＰＤ－１-/-）のイミキモド塗布７日目の耳皮膚におけるＩＬ－６、ＩＬ－２３ａおよびＩＬ－１７ａのｍＲＮＡの発現量のグラフである。 図３７は、ＩｇＧ　Ｃｔｒｌを投与した野生型マウス（ＷＴ）およびＩｇＧ　ＣｔｒｌまたはＭＲ１６－１を投与したＰＤ－１-/-マウス（ＰＤ－１-/-）のイミキモド塗布７日目のＩＬ－６、ＩＬ－２３ａおよびＩＬ－１７ａの血中濃度のグラフである。 図３８は、ＩｇＧ　ＣｔｒｌまたはＭＲ１６－１を投与した、ＰＤ－１－ｃＫＯ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/fl）と、その同腹子（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/+））のイミキモド塗布７日目の背部皮膚の写真である。 図３９左は、ＩｇＧ　ＣｔｒｌまたはＭＲ１６－１を投与した、ＰＤ－１－ｃＫＯ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/fl）と、その同腹子（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/+））のイミキモド塗布による耳の厚さの変化を示すグラフである。図３９右は、ＩｇＧ　ＣｔｒｌまたはＭＲ１６－１を投与した、ＰＤ－１－ｃＫＯ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/fl）と、その同腹子（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/+））の背部皮膚におけるイミキモド塗布による炎症の重症度の変化を示すグラフである。 図４０は、ＩｇＧ　ＣｔｒｌまたはＭＲ１６－１を投与した、ＰＤ－１－ｃＫＯ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/fl）と、その同腹子（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/+））のイミキモド塗布７日目の耳皮膚のヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の写真である。スケールバーは５０μｍである。 図４１左は、ＩｇＧ　ＣｔｒｌまたはＭＲ１６－１を投与した、ＰＤ－１－ｃＫＯ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/fl）と、その同腹子（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/+））のイミキモド塗布７日目の耳の表皮の厚さのグラフである。図４１右は、ＩｇＧ　ＣｔｒｌまたはＭＲ１６－１を投与した、ＰＤ－１－ｃＫＯ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/fl）と、その同腹子（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/+））の表皮に浸潤したＣＤ８陽性Ｔ細胞の数を示すグラフである。 図４２は、ＩｇＧ　ＣｔｒｌまたはＭＲ１６－１を投与した、ＰＤ－１－ｃＫＯ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/fl）と、その同腹子（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/+））のイミキモド塗布７日目における流入領域リンパ節に浸潤したＣＤ８陽性Ｔ細胞の数を示すグラフである。 図４３は、ＩｇＧ　ＣｔｒｌまたはＭＲ１６－１を投与した、ＰＤ－１－ｃＫＯ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/fl）と、その同腹子（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ（ＣＤ８CreＰＤ－１fl/+））のイミキモド塗布７日目の耳皮膚におけるＣＤ８ａおよびＩＦＮ－γ（ＩＦＮγ）のｍＲＮＡの発現量のグラフである。 図４４は、ＰＤ－Ｌ１遺伝子領域の上流と下流に３４ｂｐのｌｏｘＰ配列がそれぞれ導入されたｆｌｏｘｅｄマウスのゲノムの概念図である。 図４５は、野生型マウスのゲノムにおけるＰＤ－Ｌ１遺伝子（Ｃｄ２７４）のエクソン（ｂｏｘで示す、右からエクソン１、２、３、４、５、６、７である）の位置、左右のＣＲＩＳＰＲと３'アーム（３'ａｒｍ）、セントラルアーム（Ｃ　ａｒｍ）、５'アーム（５'ａｒｍ）の位置、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの左右のターゲット配列（ＰＡＭを含む）を示す図である。 図４６－１は、野生型マウスのゲノムにおけるＣｄ２７４のＤＮＡ配列（一部）である。 図４６－２は、図４６－１の続きである。 図４６－３は、図４６－２の続きである。 図４６－４は、図４６－３の続きである。 図４６－５は、図４６－４の続きである。 図４６－６は、図４６－５の続きである。 図４６－７は、図４６－６の続きである。 図４７は、Ｃｄ２７４のゲノムＤＮＡをｐｆｌｏｘ　ｐｌａｔｆｏｒｍに組み込む手順のうち、Ｓｔｅｐ１の概念図である。 図４８は、Ｃｄ２７４のゲノムＤＮＡをｐｆｌｏｘ　ｐｌａｔｆｏｒｍに組み込む手順のうち、Ｓｔｅｐ２の概念図である。 図４９は、Ｃｄ２７４のゲノムＤＮＡをｐｆｌｏｘ　ｐｌａｔｆｏｒｍに組み込む手順のうち、Ｓｔｅｐ３の概念図である。 図５０は、ｐＸ３３０にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのターゲット配列を組み込む模式図である。 図５１は、ＰＤ－Ｌ１　ｆｌｏｘｅｄマウスのゲノムにおけるＣｄ２７４のエクソン（ｂｏｘで示す）の位置、３'アーム（３'ａｒｍ）、セントラルアーム（Ｃ　ａｒｍ）、５'アーム（５'ａｒｍ）の位置、制限酵素による切断部位、およびジェノタイピングに用いたプライマーを示す図である。 図５２－１は、ＰＤ－Ｌ１　ｆｌｏｘｅｄマウスのゲノムにおけるＣｄ２７４のＤＮＡ配列（一部）である。 図５２－２は、図５２－１の続きである。 図５２－３は、図５２－２の続きである。 図５２－４は、図５２－３の続きである。 図５２－５は、図５２－４の続きである。 図５２－６は、図５２－５の続きである。 図５３は、野生型（ＷＴ）のＰＤ－Ｌ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の遺伝子配列とそれに対応するアミノ酸配列、およびＰＤ－Ｌ１の２番目および３番目のエクソンがＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムにより脱落した後（Ｍｕｔａｔｉｏｎ）に予測される、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の遺伝子配列とそれに対応するアミノ酸配列である。 図５４は、Ｌａｎｇｅｒｉｎのプロモーターの下流にＣｒｅが導入されたＬａｎｇｅｒｉｎ－Ｃｒｅマウスと、ＰＤ－Ｌ１－ｆｌｏｘｅｄマウスを交配し、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１が欠損するＰＤ－Ｌ１コンディショナルノックアウトマウスを作成する方法の概念図である。 図５５は、ランゲルハンス細胞および樹状細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現を調べたヒストグラムである。 図５６は、ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯ（ＰＤ－Ｌ１fl/flＬａｎｇｅｒｉｎcreマウス）と、その同腹子（Ｃｔｒｌ（ＰＤ－Ｌ１fl/+Ｌａｎｇｅｒｉｎcreマウス））のイミキモド塗布５日目の背部皮膚の写真である。 図５７上は、イミキモドを塗布したＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯ（ＰＤ－Ｌ１fl/flＬａｎｇｅｒｉｎcreマウス）とその同腹子（Ｃｔｒｌ（ＰＤ－Ｌ１fl/+Ｌａｎｇｅｒｉｎcreマウス））の耳の厚さの変化を示すグラフである。図５７下は、イミキモドを塗布したＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯ（ＰＤ－Ｌ１fl/flＬａｎｇｅｒｉｎcreマウス）とその同腹子（Ｃｔｒｌ（ＰＤ－Ｌ１fl/+Ｌａｎｇｅｒｉｎcreマウス））の背部皮膚における炎症の重症度の変化を示すグラフである。イミキモドを塗布した場合を実線で、Ｖｅｈｉｃｌｅを塗布した場合を点線で示す。 図５８は、ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯ（ＰＤ－Ｌ１fl/flＬａｎｇｅｒｉｎcreマウス）と、その同腹子（Ｃｔｒｌ（ＰＤ－Ｌ１fl/+Ｌａｎｇｅｒｉｎcreマウス））のイミキモド塗布５日目の耳皮膚をヘマトキシリンエオジン染色した組織切片の写真である。スケールバーは５０μｍである。 図５９は、ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯ（ＰＤ－Ｌ１fl/flＬａｎｇｅｒｉｎcreマウス）と、その同腹子（Ｃｔｒｌ（ＰＤ－Ｌ１fl/+Ｌａｎｇｅｒｉｎcreマウス））のイミキモド塗布５日目の耳の表皮の厚さを比較したグラフである。 図６０は、ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯ（ＰＤ－Ｌ１fl/flＬａｎｇｅｒｉｎcreマウス）と、その同腹子（Ｃｔｒｌ（ＰＤ－Ｌ１fl/+Ｌａｎｇｅｒｉｎcreマウス））のイミキモド塗布４日目の耳皮膚におけるＩＬ－６、ＩＬ－１７Ａ、およびＩＬ－２３ＡのｍＲＮＡの発現量のグラフである。 図６１は、ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯ（ＰＤ－Ｌ１fl/flＬａｎｇｅｒｉｎcreマウス）、その同腹子（Ｃｔｒｌ（ＰＤ－Ｌ１fl/+Ｌａｎｇｅｒｉｎcreマウス））のイミキモド塗布４日目の耳皮膚におけるγδＴ細胞を解析した結果を示すドットプロットとグラフである。 図６２は、ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯ（ＰＤ－Ｌ１fl/flＬａｎｇｅｒｉｎcreマウス）、その同腹子（Ｃｔｒｌ（ＰＤ－Ｌ１fl/+Ｌａｎｇｅｒｉｎcreマウス））のイミキモド塗布４日目の流入領域リンパ節におけるγδＴ細胞を解析した結果を示すグラフである。右のグラフの縦軸は、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）である。 図６３は、野生型マウスのゲノムにおけるＰＤ－Ｌ２遺伝子（ＣＤ２７３）のエクソン（ｂｏｘで示す）の位置とＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのターゲット配列、ＰＡＭ配列を示す図である。 図６４は、野生型マウス（ＷＴ）またはＰＤ－Ｌ２　ｆｌｏｘｅｄマウス（ＰＤ－Ｌ２ｆｌｏｘｅｄ）と判断するためのＰＣＲ条件を示す表である。 図６５－１は、野生型マウス（ＷＴ）のゲノムにおけるＰｄｃｄ１ｌｇ２（ＰＤ－Ｌ２）のＤＮＡ配列（一部）である。 図６５－２は、図６５－１の続きである。 図６５－３は、図６５－２の続きである。 図６５－４は、図６５－３の続きである。 図６５－５は、図６５－４の続きである。 図６５－６は、図６５－５の続きである。 図６６－１は、ＰＤ－Ｌ２　ｆｌｏｘｅｄマウス）のゲノムにおけるＰｄｃｄ１ｌｇ２（ＰＤ－Ｌ２）のＤＮＡ配列（一部）である。 図６６－２は、図６６－１の続きである。 図６６－３は、図６６－２の続きである。 図６６－４は、図６６－３の続きである。 図６６－５は、図６６－４の続きである。 図６６－６は、図６６－５の続きである。
　本発明は、大きく分けて五つの態様がある。
　第一の態様は、ＩＬ－６シグナルを阻害する物質を含む、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤であって、前記免疫関連副作用が皮膚障害、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、横紋筋融解症、Ｉ型糖尿病、神経障害、腎障害、関節炎、肝障害、肺炎、膵炎、甲状腺炎、副腎炎、視床下部機能異常、および汎下垂体機能低下症から選ばれる少なくとも１つである、薬剤である。
　第二の態様は、ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物である。
　第三の態様は、ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、組織および時期の少なくとも一方に特異的にＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物である。
　第四の態様は、ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている遺伝子改変非ヒト動物に、抗原性補強剤を投与することにより作製する、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物である。
　第五の態様は、ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物である。
　第六の態様は、ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物に、抗原性補強剤を投与することにより作製する、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物である。
　第七の態様は、第三の態様である遺伝子改変非ヒト動物、第四の態様である免疫関連副作用モデル非ヒト動物、第五の態様である遺伝子改変非ヒト動物、または第六の態様である免疫関連副作用モデル非ヒト動物を用いる、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤のスクリーニング方法である。
　第八の態様は、第三の態様である遺伝子改変非ヒト動物、第四の態様である免疫関連副作用モデル非ヒト動物、第五の態様である遺伝子改変非ヒト動物、または第六の態様である免疫関連副作用モデル非ヒト動物を用いる、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤の評価方法である。
　第九の態様は、ゲノム中のＰＤ－Ｌ２遺伝子またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物である。
　次に本発明について具体的に説明する。
〈抗体〉
　本明細書における抗体とは、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、抗体の断片や抗体修飾物、改変した抗体等も含む。抗体が由来する動物種は制限されず、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また、異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組み換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体等であってもよい。また、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体修飾物であってもよい。また、抗体や抗原の血中滞留性等を改良すること等を目的として改変した、リサイクリング抗体、スイーピング抗体、バイスペシフィック抗体、Ｔ細胞リダイレクティング抗体であってもよいし、ＡＤＣＣ活性増強、抑制型Ｆｃγ受容体選択的結合増強等を行った抗体であってもよい。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。本発明における抗体とは、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましく、キメラ抗体またはヒト化抗体である哺乳動物由来のモノクローナル抗体がより好ましい。
　本発明における抗体は、既知の抗体を用いてもよいし、新たに作製した抗体を用いてもよい。抗体の作製は、公知の方法により行うことができる。新たに作製する抗体は、抗原を動物に免疫することにより得られるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体であってもよいし、既知の抗体の配列を基に、当業者に公知の遺伝子組み換え技術を用いて作製される抗体であってもよい。組み換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマ、または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主（宿主細胞）に導入し産生させて得ることができる。
〈ＩＬ－６シグナルを阻害する物質〉
　本発明中におけるインターロイキン－６（ＩＬ－６）シグナルを阻害する物質は、ＩＬ－６によるシグナルを遮断し、ＩＬ－６の生物学的活性を阻害する物質である。ＩＬ－６をリガンドとするＩＬ－６受容体（ＩＬ－６Ｒ、ＣＤ１２６ともいう）には、細胞膜上に発現している膜結合型ＩＬ－６受容体および分泌型の可溶性ＩＬ－６受容体（Ｓｏｌｕｂｌｅ　ＩＬ－６　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｓＩＬ－６Ｒ）があり、分泌型の可溶性ＩＬ－６受容体は、膜結合型の細胞内領域および膜貫通領域を除く細胞外領域から構成されている。ＩＬ－６受容体がＩＬ－６と結合して複合体を形成し、複合体が細胞膜上のｇｐ１３０と会合して二量体化することで、細胞内にＩＬ－６シグナルが伝達される。
　本発明におけるＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒまたはｇｐ１３０は、それぞれマウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、ブタ、サルまたはヒトを含む霊長類の哺乳動物を由来とするものを含む。ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒまたはｇｐ１３０は、好ましくは、ヒトＩＬ－６、ヒトＩＬ－６Ｒまたはヒトｇｐ１３０である。
　ＩＬ－６シグナルを阻害する物質は、例えばＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒおよびｇｐ１３０から選択される少なくとも1つとの結合に対する阻害作用を有する物質、ならびにＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒおよびｇｐ１３０から選択される少なくとも1つの発現を阻害する物質である。
　ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒおよびｇｐ１３０から選択される少なくとも1つとの結合に対する阻害作用を有する物質としては、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒおよびｇｐ１３０から選択される少なくとも1つのタンパク質に対する特異的結合物質、すなわちＩＬ－６に対する特異的結合物質、ＩＬ－６Ｒに対する特異的結合物質、ｇｐ１３０に対する特異的結合物質等が挙げられる。免疫関連副作用を効果的に予防または治療できることから、ＩＬ－６Ｒに対する特異的結合物質が好ましい。
　ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒおよびｇｐ１３０から選択される少なくとも1つのタンパク質に対する特異的結合物質としては、特に制限されないが、例えば抗ＩＬ－６抗体、抗ＩＬ－６Ｒ抗体、抗ｇｐ１３０抗体、およびこれらの抗体断片、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、またはｇｐ１３０の改変体、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、またはｇｐ１３０の部分ペプチド、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、またはｇｐ１３０に対するアプタマー、およびこれらと同様の活性を示す低分子物質が挙げられる。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。また、アプタマーとしては、例えば、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。
　ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒおよびｇｐ１３０から選択される少なくとも1つのタンパク質に対する特異的結合物質としては、免疫関連副作用を効果的に予防または治療できることから、抗ＩＬ－６抗体、抗ＩＬ－６Ｒ抗体、抗ｇｐ１３０抗体、およびこれらの抗体断片が好ましく、抗ＩＬ－６Ｒ抗体が特に好ましい。
　抗ＩＬ－６抗体は、ＩＬ－６と結合することにより、ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒへの結合を阻害して、ＩＬ－６シグナルを阻害する。抗ＩＬ－６抗体としては、これらに限定されるものではないが、ＭＨ１６６（Ｍａｔｓｕｄａ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１８、９５１－９５６）やＳＫ２抗体（Ｓａｔｏ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．、第２１回日本免疫学会総会、学術記録（１９９１）２１、１６６）、ヒト型抗ＩＬ－６モノクローナル抗体であるシルクマブ等が挙げられる。また、抗ＩＬ－６抗体は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　抗ｇｐ１３０抗体は、ｇｐ１３０と結合することにより、ＩＬ－６／ＩＬ－６Ｒ複合体のｇｐ１３０への結合を阻害してＩＬ－６シグナルを阻害する。抗ｇｐ１３０抗体としては、これらに限定されるものではないが、ＡＭ６４抗体（特開平３－２１９８９４）、４Ｂ１１抗体および２Ｈ４抗体（ＵＳ５５７１５１３）、Ｂ－Ｓ１２抗体およびＢ－Ｐ８抗体（特開平８－２９１１９９）などが挙げられる。また、抗ｇｐ１３０抗体は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　抗ＩＬ－６Ｒ抗体は、ＩＬ－６Ｒと結合することにより、ＩＬ－６のＩＬ－６Ｒへの結合を阻害してＩＬ－６シグナルを阻害する。抗ＩＬ－６Ｒ抗体は、膜結合型ＩＬ－６受容体および可溶性ＩＬ－６受容体のどちらにも結合する抗体であってもよいし、膜結合型ＩＬ－６受容体にのみ結合し、可溶性ＩＬ－６受容体には結合しない抗体、あるいは可溶性ＩＬ－６受容体にのみ結合し、膜結合型ＩＬ－６受容体には結合しない抗体であってもよい。また、抗ＩＬ－６Ｒ抗体は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。抗ＩＬ－６Ｒ抗体の例としては、これらに限定されるものではないが、ＭＲ１６－１抗体（Ｔａｍｕｒａ　Ｔ、ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、９０（２４）：１１９２４－１１９２８、１９９３）、ＰＭ－１抗体（Ｈｉｒａｔａ　Ｙ、ｅｔ　ａｌ．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４３（９）：２９００－２９０６、１９８９）、ＡＵＫ１２－２０抗体、ＡＵＫ６４－７抗体またはＡＵＫ１４６－１５抗体（国際公開第９２／１９７５９号）、ヒト化抗ＩＬ－６受容体モノクローナル抗体であるトシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、抗ヒトＩＬ－６受容体モノクローナル抗体であるサリルマブ（Ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、ＳＡ２３７などが挙げられる。抗ＩＬ－６Ｒ抗体は、免疫関連副作用を効果的に予防または治療できることから、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましく、キメラ抗体またはヒト化抗体である哺乳動物由来の抗ＩＬ－６Ｒモノクローナル抗体がより好ましい。ヒトＩＬ－６Ｒに対する好ましいモノクローナル抗体としては、トシリズマブまたはサリルマブが挙げられ、マウスＩＬ－６Ｒに対する好ましいモノクローナル抗体としては、ＭＲ１６－１抗体が挙げられる。また、ＭＲ１６－１抗体のヒト化抗体も好適に用いられる。
　ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒおよびｇｐ１３０から選択される少なくとも1つの発現を阻害する物質としては、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒまたはｇｐ１３０の発現を低減させ、結果としてＩＬ－６シグナルを阻害できる物質であれば特に限定されず、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸、低分子化合物等が挙げられる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイムおよびアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部をペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成してもよい。
〈抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体〉
　ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　１）は、活性化Ｔ細胞の表面に発現する受容体であり、ＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　１－Ｌｉｇａｎｄ　１）は、ＰＤ－１と結合し、ＰＤ－１を活性化させる働きを持つ、細胞表面に存在するタンパク質である。
　本発明におけるＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１は、それぞれマウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、ブタ、サルまたはヒトを含む霊長類の哺乳動物を由来とするものを含む。好ましくは、本発明におけるＰＤ－１はヒトＰＤ－１であり、ＰＤ－Ｌ１はヒトＰＤ－Ｌ１である。
　抗ＰＤ－１抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合を阻害し、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１のシグナルを阻害する。
　抗ＰＤ－１抗体としては、これに限定されるものではないが、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、セミプリマブ（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）、スパリタリズマブ（ｓｐａｒｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ピディリズマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）等が挙げられる。抗ＰＤ－１抗体は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　抗ＰＤ－Ｌ１抗体としては、これに限定されるものではないが、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、ＢＭＳ－９３６５５９等が挙げられる。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
〈抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用〉
　本発明における抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用とは、免疫チェックポイント阻害薬として抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体が投与されることにより引き起こされる、抗ガン作用以外の作用であって、皮膚障害、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、横紋筋融解症、Ｉ型糖尿病、神経障害、腎障害、関節炎、肝障害、肺炎、膵炎、甲状腺炎、副腎炎、視床下部機能異常、および汎下垂体機能低下症から選ばれる少なくとも１つであるものをいう。
　抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用は、本発明により効果的に予防または治療できることから、好ましくは皮膚障害、肝障害、肺炎、および甲状腺炎から選ばれる少なくとも１つであり、より好ましくは皮膚障害である。
　前記肝障害とは、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与により肝臓に生じた障害であれば、特に制限されず、例えばＡＳＴ（ＧＯＴ）、ＡＬＴ（ＧＰＴ）、γ－ＧＴＰ、ＡＳＴ、ＡＬＴ等の肝酵素や総ビリルビンの上昇により診断することができる。
　前記肺炎とは、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与により生じた肺炎であれば、特に制限されず、例えば咳嗽や呼吸困難等の症状、気管支内視鏡、ＣＴ等の検査により診断することができる。
　前記甲状腺炎とは、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与により生じた甲状腺炎であれば、特に制限されず、例えば甲状腺機能低下症または甲状腺機能亢進症であり、血中のＴＳＨ、ｆｒｅｅ　Ｔ３、ｆｒｅｅ　Ｔ４の測定や甲状腺超音波検査により診断することが出来る。
　視床下部機能異常、汎下垂体機能低下症、副腎炎は、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与により生じたものであれば特に制限されず、例えばホルモン分泌異常を生じ、ＡＤＨ、ＡＣＴＨ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＧＨ、プロラクチン、コルチゾール、アルドステロン、アンドロゲン、アドレナリン、ノルアドレナリン、エストロゲン、プロゲステロン等の測定により診断することができる。
　前記皮膚障害とは、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与により皮膚に生じた障害であれば、特に制限されず、例えば皮膚粘膜眼症候群（Ｓｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群：ＳＪＳ）、中毒性表皮壊死融解症（Ｔｏｘｉｃ　Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｎｅｃｒｏｌｙｓｉｓ：ＴＥＮ）、扁平苔癬、尋常性乾癬（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、関節症性乾癬（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ　ａｒｔｈｒｏｐｉｃａ）、膿疱性乾癬（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ　ｐｕｓｔｕｌｏｓａ）等の乾癬、乾癬様皮膚炎等の疾患、白斑、紅斑、膿疱、皮疹等の症候を示すその他の炎症性皮膚疾患である。本発明により効果的に予防または治療できることから、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用は、好ましくは皮膚粘膜眼症候群（Ｓｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群：ＳＪＳ）、中毒性表皮壊死融解症（Ｔｏｘｉｃ　Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｎｅｃｒｏｌｙｓｉｓ：ＴＥＮ）、扁平苔癬、乾癬または乾癬様皮膚炎であり、より好ましくは乾癬または乾癬様皮膚炎であり、さらに好ましくは乾癬様皮膚炎である。
　乾癬および乾癬様皮膚炎（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ－ｌｉｋｅ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）は、通常、厚い銀白色の鱗屑を伴った角化性紅斑が認められ、病理学的にも乾癬様の表皮突起が延長した表皮肥厚と顆粒層を欠失した錯角化、角層下好中球性微小膿瘍が認められることにより診断することができる。
　皮膚粘膜眼症候群、中毒性表皮壊死融解症は、粘膜と皮膚のびらん化した紅斑で特徴づけられ、皮膚粘膜眼症候群は体表面積の１０％未満のびらん、中毒性表皮壊死融解症は１０％以上のびらんが見られる。また、病理組織学的には苔癬反応と呼ばれる、広範な表皮角化細胞死を伴い、リンパ球が真皮上層から表皮内へ浸潤する像が認められることから診断する。
　扁平苔癬は、限局した角化性紅斑であり、病理組織学的にはやはり苔癬反応が認められることから診断される。
　白斑は、境界明瞭な色素脱失斑にて診断される。
　抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体の投与により、皮膚粘膜眼症候群（Ｓｔｅｖｅｎｓ－Ｊｏｈｎｓｏｎ症候群：ＳＪＳ）、中毒性表皮壊死融解症（Ｔｏｘｉｃ　Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｎｅｃｒｏｌｙｓｉｓ：ＴＥＮ）、扁平苔癬、乾癬、乾癬様皮膚炎等の疾患、白斑以外にもその他の様々なタイプの炎症性皮膚疾患が惹起されることが報告されており、紅斑、膿疱、皮疹等を示す。
　抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用としての乾癬様皮膚炎では、ＣＤ８陽性細胞の表皮への浸潤が尋常性乾癬よりも亢進していることが特徴である。したがって、本発明により効果的に予防または治療できることから、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用は、好ましくはＣＤ８陽性細胞の表皮への浸潤が亢進している乾癬様皮膚炎であり、より好ましくは、ＣＤ８陽性細胞の表皮への浸潤が尋常性乾癬よりも亢進している乾癬様皮膚炎である。すなわち、本発明の好ましい態様の一つは、ＩＬ－６シグナルを阻害する物質を含む、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤であって、前記免疫関連副作用がＣＤ８陽性細胞の表皮への浸潤亢進によって特徴づけられる乾癬様皮膚炎である、薬剤である。本発明の好ましい態様のもう一つは、ＩＬ－６シグナルを阻害する物質を含む、ＣＤ８陽性細胞の表皮への浸潤抑制剤である。
　ＣＤ８陽性細胞の表皮への浸潤が亢進していることを確認する方法は、特に制限されないが、例えば患部から採取した標本を用いてＣＤ８に対する免疫染色を行い、染まった細胞の単位面積あたりの数を確認することである。ＣＤ８陽性細胞の表皮への浸潤が尋常性乾癬よりも亢進していることを確認する方法は、特に制限されないが、例えば患部から採取した標本を用いてＣＤ８に対する免疫染色を行い、染まった細胞の単位面積あたりの数が尋常性乾癬の標本よりも多いことで確認することができる。
　抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、抗ＰＤ－１抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の両方を併用してもよく、抗ＰＤ－１抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体の一方のみを投与してもよい。抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、他の免疫チェックポイント阻害薬と併用して投与されてもよく、他の免疫チェックポイント阻害薬としては、例えば抗ＣＴＬＡ－１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｂ７抗体、抗Ｃ２７抗体、ＩＤＯ阻害薬、抗ＣＤ１３７抗体等をあげることができる。抗ＣＴＬＡ－１抗体としてはイピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）等が挙げられる。
　抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体の用法、用量は、特に制限されず、通常、その抗体の特性や期待する抗ガン作用に応じて決定する。例えば、ニボルマブであれば、１回３ｍｇ／ｋｇ（体重）を２週間間隔で点滴静注、あるいは１回２４０ｍｇを２週間間隔で点滴静注する。例えば、ペムブロリズマブであれば、１回２ｍｇ／ｋｇ（体重）を３週間間隔で３０分間かけて点滴静注、あるいは１回２００ｍｇを３週間間隔で３０分間かけて点滴静注する。
　抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体が投与される疾患は、特に制限されないが、通常、種々のガン、例えば悪性黒色腫、非小細胞肺ガン、腎細胞癌、古典的ホジキンリンパ腫、頭頸部ガン、胃ガン、非扁平上皮ガン、扁平上皮ガン、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈｉｇｈ）を有する固形ガン、膀胱ガン、腎盂ガン、尿管ガン、尿道ガン、乳ガン、肝細胞ガン、多発性骨髄腫、食道ガン、腎細胞ガン、大腸ガン、卵巣ガン、前立腺ガン等である。抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体が投与される疾患は、充分な抗ガン作用が期待できることから、好ましくは悪性黒色腫である。
〈本発明の第一の態様である薬剤〉
　本発明の第一の態様である薬剤は、ＩＬ－６シグナルを阻害する物質を含む、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤であって、前記免疫関連副作用が皮膚障害、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、横紋筋融解症、Ｉ型糖尿病、神経障害、腎障害、関節炎、肝障害、肺炎、膵炎、甲状腺炎、副腎炎、視床下部機能異常、および汎下垂体機能低下症から選ばれる少なくとも１つである、薬剤である。
　前記薬剤の投与量は特に制限されず、免疫関連副作用の種類や症状の程度、薬剤の種類、投与対象の体重等によって適宜選択すればよい。例えば、ＩＬ－６シグナルを阻害する物質が、抗ＩＬ－６Ｒ抗体である場合、抗ＩＬ－６Ｒ抗体の量が１回１～１００ｍｇ／ｋｇとなるように１～８週間隔で点滴静注することができる。ヒトに対して、トシリズマブまたはサリルマブを投与する場合、１回２～１２ｍｇ／ｋｇとなるように１～８週間隔で点滴静注することが好ましく、１回３～１０ｍｇ／ｋｇがより好ましい。
　ＩＬ－６シグナルを阻害する物質は、そのまま生体に投与してもよいが、前記ＩＬ－６シグナルを阻害する物質の有効量を薬学的に許容する担体と共に配合した医薬品として投与することが好ましい。投与方法は特に制限されず、経口、または非経口とすることができ、好ましくは非経口であり、より好ましくは静注、さらに好ましくは点滴静注である。
　前記薬学的に許容される担体は、特に制限されないが、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む、抗酸化剤；オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、アルキルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、ｍ－クレゾールなどの保存料；低分子ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、デキストリンなどの糖類；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；金属錯体；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの多価アルコール、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などの非イオン系表面活性剤等があげられる。
　前記薬剤の投与対象は特に制限されないが、哺乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。また、前記薬剤の投与対象は、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による乾癬様皮膚炎の患者であることが好ましく、その中でもＣＤ８陽性細胞の表皮への浸潤亢進が認められる患者であることがより好ましく、ＣＤ８陽性細胞の表皮への浸潤が尋常性乾癬よりも亢進していることが認められる患者であることがさらに好ましい。
〈遺伝子改変非ヒト動物〉
　本発明における遺伝子改変非ヒト動物は、ヒト以外の動物であれば特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ブタ、イヌ、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ）であり、より好ましくは、遺伝子組み換えおよび交配による次世代動物取得の容易性の観点からマウス、ラット、モルモット、ウサギ等のげっ歯類動物である。前記遺伝子改変非ヒト動物は成体のみならず、ＥＳ細胞、受精卵、８細胞期から胚盤胞形成そして出生直前までの胚、卵、精子、組織または器官の培養物、キメラ動物等の全ての態様を含む。これらは、保存のため、必要に応じ冷凍されている状態であってもよい。
〈本発明の第三の態様である遺伝子改変非ヒト動物〉
　本発明の第三の態様である遺伝子改変非ヒト動物は、ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、組織および時期の少なくとも一方に特異的にＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されているものである。すなわち、コンディショナルにＰＤ－１遺伝子の一部または全部の発現が抑制(ノックダウン)または喪失（ノックアウト）されていることを特徴とする。本発明の第三の態様である遺伝子改変非ヒト動物は、コンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物とも称し、コンディショナルＰＤ－１ノックアウト非ヒト動物、およびコンディショナルＰＤ－１ノックダウン非ヒト動物を含む。ＰＤ－１の働きを解析しやすいことから、コンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物は、好ましくはコンディショナルＰＤ－１ノックアウト非ヒト動物である。
　本発明のコンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物の用途は特に制限されないが、ＰＤ－Ｌ１、Ｌ２／ＰＤ－１シグナルを阻害した場合と同じ効果を時期特異的、組織特異的に得られることから、ＰＤ－Ｌ１、Ｌ２／ＰＤ－１シグナル伝達系のメカニズム解明、ＰＤ－Ｌ１、Ｌ２／ＰＤ－１シグナル阻害により生じる病態の解析、ＰＤ－Ｌ１、Ｌ２／ＰＤ－１シグナル阻害により生じる病態の予防、治療剤の開発等に用いることができる。本発明のコンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物は、ＰＤ－Ｌ１、Ｌ２／ＰＤ－１シグナル阻害により生じる病態の解析、またはＰＤ－Ｌ１、Ｌ２／ＰＤ－１シグナル阻害により生じる病態の予防、治療剤の開発等に用いることが好ましく、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－１抗体により生じる病態の解析、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－１抗体により生じる病態の予防、治療剤の開発等に用いることがより好ましく、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－１抗体により生じる免疫関連副作用の解析、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－１抗体により生じる免疫関連副作用の予防、治療剤の開発等に用いることがさらに好ましい。
　本発明のコンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物は、無刺激下で飼育してもよいが、刺激または負荷を与えてもよい。刺激または負荷を与えることにより、コンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物の特徴をより明確に観察しやすくなる。刺激または負荷は、特に制限されないが、例えば化学的、物理的、または生理学的な刺激もしくは負荷であり、薬剤、飼育密度、運動、放射線、紫外線、食餌等による刺激または負荷を挙げることができる。刺激または負荷は、化学的な刺激または負荷が好ましく、抗原性補強剤による刺激または負荷がより好ましい。
　ＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域の変異は、それによりＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失され、ＰＤ－１が実質的に不活化するものであればよく、導入される変異は挿入、欠失、変更、置換のいずれであってもよく、変異する塩基数も制限されない。変異は、ＰＤ－１遺伝子の発現調節領域よりもＰＤ－１遺伝子に導入されることが好ましい。
　ＰＤ－１遺伝子に変異が導入される場合、ＰＤ－１ゲノムはエクソン１～エクソン５からなるが、好ましくはエクソン１～エクソン４の範囲内において、より好ましくはエクソン２～エクソン４の範囲内において変異を導入する。後述する実施例においてはマウスＰＤ－１ゲノムのエクソン２、３、および４に変異を導入することによって、組織および時期の少なくとも一方に特異的にＰＤ－１を不活化した、コンディショナルノックアウトマウスを得ることに成功した。
　コンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物において発現が抑制または喪失されているＰＤ－１遺伝子は、ＰＤ－１遺伝子の全部または一部であってもよいが、好ましくはＰＤ－１遺伝子の一部である。発現が抑制または喪失されているＰＤ－１遺伝子は、ＯＲＦのうち、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上である。発現が抑制または喪失されているＰＤ－１ゲノムは、好ましくはエクソン１～エクソン４の範囲内の一部であり、より好ましくはエクソン２～エクソン４の範囲内の一部であり、さらに好ましくはエクソン２、３、および４である。
　ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異を導入するための方法は、特に制限されず、公知の方法を用いることができる。例えば、リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用した遺伝子組み換え誘導型の方法などが挙げられる。
　リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムは、特定のリコンビネースタンパク質がリコンビネース標的配列を認識し、その部分でＤＮＡの組み換えを起こすことを利用するものである。リコンビネース標的配列は特定のリコンビネースが存在しない限り組み換えを起こさない。よって、リコンビネースタンパク質を組織および時期の少なくとも一方に特異的に発現させた遺伝子改変非ヒト動物と、リコンビネース標的配列が導入された同種の遺伝子改変非ヒト動物とを掛け合わせ、リコンビネースによる組み換えを組織および時期の少なくとも一方に特異的に生じさせ、所望の遺伝子を組織および時期の少なくとも一方に特異的に制御することを可能にする。リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムとしては、例えばバクテリオファージＰ１由来のＣｒｅリコンビネースタンパク質とＣｒｅタンパク質によって認識される３４塩基対のｌｏｘＰ配列を利用したＣｒｅ／ｌｏｘＰ配列システム、酵母由来のＦＬＰタンパク質／ＦＲＴ配列システム、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉのｐＳＲ１リコンビネース／ｐＳＲ１リコンビネース標的配列システム、バクテリオファージＭｕ由来のＧｉｎタンパク質／ｇｉｘ配列システム等が挙げられる。操作が簡便であることから、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ配列、ＦＬＰタンパク質／ＦＲＴ配列、またはｐＳＲ１リコンビネース／ｐＳＲ１リコンビネース標的配列が好ましく、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムがより好ましい。
　本発明のコンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物は、好ましくは、ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物と、ＣＤ８陽性Ｔ細胞特異的にリコンビースタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物とを掛け合わせて作製した、コンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物であり、より好ましくは、ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むｌｏｘＰ配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物と、ＣＤ８陽性Ｔ細胞特異的にＣｒｅタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物とを掛け合わせて作製した、コンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物である。
（リコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物）
　リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用して、ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入される場合、コンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物において、ＰＤ－１遺伝子の発現が抑制または喪失される組織および時期は、掛け合わせる遺伝子改変非ヒト動物のリコンビネースタンパク質発現の組織特異性および時期特異性により選択することができる。時期特異的または組織特異的にリコンビネースタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物は、種々のものが報告され、実験の目的に応じて選択することができるし、後述する遺伝子改変非ヒト動物の作製方法により新たに作製してもよい。
　リコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物におけるリコンビネースタンパク質の発現は、組織および時期の少なくとも一方に特異的であれば、その特異性は特に制限されない。
　組織および時期の少なくとも一方に特異的であるとは、組織のみに特異的、時期のみに特異的、または組織特異的かつ時期特異的であることをいい、組織特異的であることが好ましい。
　前記組織とは上皮組織、結合組織等の組織に加えて、細胞、および臓器を含む概念であるが、好ましくは細胞である。
　前記細胞とは、特に制限されず、主に内胚葉、外胚葉、または中胚葉に由来する種々の体細胞や生殖細胞である。前記細胞は、好ましくは炎症細胞、より好ましくは好酸球、肥満細胞（マスト細胞）、好中球、好塩基球、Ｔ細胞、ＮＫ（ナチュラルキラー）、マクロファージ、または樹状細胞、さらに好ましくはＴ細胞、特に好ましくはＣＤ８陽性Ｔ細胞である。
　前記臓器は、特に制限されず、例えば、眼球、角膜、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、胆嚢、食道、胃、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、卵巣、血管、皮膚等があげられる。
　時期特異的とは、非ヒト動物の発生から死までの一生における特定の時点または特定の期間に特異的であるとの意味である。
（リコンビネース標的配列が導入された遺伝子改変非ヒト動物）
　リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用して、ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入される場合、ゲノム中のＰＤ－１遺伝子もしくはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域の近傍、またはＰＤ－１遺伝子中またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域中にリコンビネース標的配列が導入された遺伝子改変非ヒト動物を用いる。ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物が本発明の第二の態様である。前記リコンビネース標的配列は、ｌｏｘＰ配列であることが好ましい。
　リコンビネース標的配列を導入する位置は、通常、ＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に導入を予定する変異の種類や位置によって決定する。ＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域の一部または全部の発現を喪失させる場合は、通常、発現を喪失させる部分を、同一方向の複数のリコンビネース標的配列で挟む。複数のリコンビネース標的配列とは、好ましくは２個のリコンビネース標的配列である。相同組み換えによって前記リコンビネース標的配列がゲノムに組み込まれると、リコンビネースタンパク質の存在により、複数のリコンビネース標的配列で挟まれたＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域の一部または全部が削除される。
　リコンビネース標的配列は、ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟んで導入される。ＰＤ－１ゲノムはエクソン１～エクソン５からなるので、リコンビネース標的配列は、好ましくはエクソン１～エクソン５の範囲内の一部を挟んで導入され、より好ましくはエクソン１～エクソン４の範囲内の一部を挟んで導入され、さらに好ましくはエクソン２、３および４を挟んで導入される。後述する実施例においては、リコンビネース標的配列をマウスＰＤ－１ゲノムのエクソン２、３および４を挟んで導入した、遺伝子改変非ヒト動物を得ることに成功した。
　Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ配列システムを用いる場合、ｌｏｘＰ配列は後述する実施例で用いた配列である５'－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ－３'（配列番号１）に限定されない。Ｃｒｅに認識される配列であれば配列に変異があってもよく、例えば、５'－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＮＮＮＴＡＮＮＮＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ－３'（配列番号２）等で示される配列である。
　ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物と、リコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物とを掛け合わせると、ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、組織および時期の少なくとも一方に特異的にＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、コンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物を作製することができる。リコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物は、リコンビネースタンパク質発現の組織特異性および時期特異性が異なるものが多数存在するので、これらと掛け合わせることにより、種々のコンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物を作製できる。これらのコンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物は、ＰＤ－１遺伝子、ＰＤ－１タンパク質、ＰＤ－Ｌ１、Ｌ２／ＰＤ－１シグナルの機能を解析するために有用である。
　リコンビネース標的配列が導入された遺伝子改変非ヒト動物は、以下の遺伝子改変非ヒト動物の作製方法により作製することができる。
（遺伝子改変非ヒト動物の作製方法）
　遺伝子改変非ヒト動物の作製方法は特に制限されず、公知の遺伝子改変技術を用いることができる。公知の遺伝子改変技術としては、例えば、人工外来遺伝子を受精卵にインジェクションし、相同組み換えにより遺伝子改変させる方法、ターゲティングベクターをＥＳ細胞にインジェクションし、相同組み換えにより遺伝子改変させる方法、任意のゲノムＤＮＡ配列を特異的に切断する人工制限酵素を使用することで、ゲノム上の特定の場所に変異を誘導するゲノム編集技術等が挙げられる。
　ゲノム編集技術としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）を用いた方法、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた方法等が挙げられる。
　本発明における遺伝子改変非ヒト動物の作製は、効率よく短期間で遺伝子改変非ヒト動物を作製できることから、ゲノム編集技術を用いることが好ましく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いることがより好ましい。
［ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム］
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた遺伝子改変非ヒト動物の製造は、公知の方法で行うことができるが、通常、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイドＲＮＡ、ノックインを行う場合は、これらに加えてドナーＤＮＡを用いる。
［ＣＲＩＳＰＲ酵素］
　ＣＲＩＳＰＲ酵素は、細菌および古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成するＣａｓタンパク質ファミリーの一つであり、外来侵入性ＤＮＡ中のＰＡＭ配列を認識して、その上流で二本鎖ＤＮＡを平滑末端になるように切断するエンドヌクレアーゼである。本明細書において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ガイドＲＮＡと複合体を形成し、ＤＮＡ切断活性を有するものを意味する。
　ＣＲＩＳＰＲ酵素のファミリーとしては、例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知)、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、またはそれらの改変されたもの等が挙げられる。本発明における遺伝子改変非ヒト動物の製造においては、好ましくはＣａｓ９、そのホモログ、またはそれらの改変されたものを用いる。
　ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素タンパク質として用いても、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸として用いてもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸を用いる場合、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸が発現ベクターに導入されている形であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素タンパク質をコードする核酸が発現ベクターに導入されている形で非ヒト動物の受精卵等に導入すると、導入後、非ヒト動物の受精卵等においてＣＲＩＳＰＲ酵素タンパク質を発現させることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸が発現ベクターに導入されている形で用いることが好ましい。
　発現ベクターは、公知のものを用いることができるが、例えば、ウイルスベクター、細菌ベクター、原生動物ベクター、ＤＮＡベクターおよびそれらを組み換え体である組み換えベクター等が挙げられる。ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、アデノウイルス／アデノ随伴ウイルスベクター等が挙げられる。
　発現ベクターは、ガイドＲＮＡをコードする核酸と、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸とを含んでもよい。このような発現ベクターとしては、ｐＸ３３０、ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＸ　Ｃａｓ９　ＳｍａｒｔＮｕｃｌｅａｓｅ　Ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ　Ｖｅｃｔｏｒｓ（システムバイオサイエンス社製）、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９　Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｐｌａｓｍｉｄ（サンタクルーズバイオテクノロジー社製）等が挙げられる。発現効率が良いことから、発現ベクターとしては、ｐＸ３３０が好ましい。
［ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）］
　ガイドＲＮＡとは細菌および古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成する、外来配列（ガイド配列）を含む小さなＲＮＡ断片（ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ）と該ｃｒＲＮＡと一部相補的なＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを融合させたｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡキメラのヘアピン構造を模倣したものである。
　ガイドＲＮＡは、ターゲット配列を含むｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが融合した状態で合成されたｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡキメラであってもよい。または、ガイド配列を含むｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを別々に作製し、導入前にアニーリングしてｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡキメラとしたものであってもよい。または、ｔｒａｃｒＲＮＡの必須部分およびｃｒＲＮＡの融合によって作製される一本鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。ガイドＲＮＡは、ターゲット配列を含むｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが融合した状態で合成されたｔｒａｃｒＲＮＡ－ｃｒＲＮＡキメラとすることが好ましい。
　ガイドＲＮＡは、標的遺伝子（ＣＲＩＳＰＲ酵素により切断しようとする遺伝子）中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、例えば１０塩基以上２５塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５'末端領域に含むものとすることができる。オフターゲットでの切断を避けるために、ガイドＲＮＡが含む前記ポリヌクレオチドは、好ましくは標的遺伝子中のＰＡＭ配列の１塩基上流から１２塩基以上２２塩基以下であり、より好ましくは２０塩基である。
　ＰＡＭ配列とはＣＲＩＳＰＲ酵素により認識され得る配列であって、ＰＡＭ配列の長さや塩基配列はＣＲＩＳＰＲ酵素の由来となる細菌種によってさまざまである。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓでは「ＮＧＧ」(Ｎは任意の塩基を表す)の３塩基を認識する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は２つのＣａｓ９を持っており、それぞれ「ＮＧＧＮＧ」または「ＮＮＡＧＡＡ」(Ｎは任意の塩基を表す)の５～６塩基をＰＡＭ配列として認識する。認識するＰＡＭ配列が短く編集可能な標的遺伝子が制限されにくいことから、ＰＡＭ配列は「ＮＧＧ」であることが好ましい。
　ガイドＲＮＡは、単離または合成されたＲＮＡであってもよく、発現ベクター内に組み込まれたＲＮＡの形であってもよい。また、ガイドＲＮＡをコードする核酸の形であってもよく、ガイドＲＮＡをコードする核酸が発現ベクターに組み込まれている形であってもよい。ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードする核酸が発現ベクターに組み込まれている形であることが好ましい。
［ドナーＤＮＡ］
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにより切断されたゲノムＤＮＡに、特定の遺伝子をノックインする場合は、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素に加えてドナーＤＮＡを用いる。ドナーＤＮＡは、ノックインする遺伝子の上流および下流に、標的遺伝子上の挿入を行う部位と相同な配列からなるＤＮＡを含むことが好ましい。ドナーＤＮＡは、一本鎖オリゴＤＮＡであってもよいし、プラスミドに組み込んでもよいが、プラスミドに組み込むことが好ましい。
［受精卵等への導入］
　非ヒト動物の受精卵等にＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイドＲＮＡ、任意でドナーＤＮＡを導入する方法は、特に制限されず、公知の遺伝子導入の手法を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ－デキストラン法等が挙げられる。導入効率が高いことから、マイクロインジェクション法が好ましい。
　導入対象が受精卵である場合、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイドＲＮＡ、任意でのドナーＤＮＡの導入後、受精卵を対応する非ヒト動物の子宮または卵管へ移植し、発生させることで、遺伝子改変非ヒト動物を簡便に得ることができる。
〈抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物（ＰＤ－１遺伝子改変）〉
　本発明の第四の態様は、ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている遺伝子改変非ヒト動物に、抗原性補強剤を投与することにより作製する、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物である。
　前記免疫関連副作用モデル非ヒト動物に用いる遺伝子改変非ヒト動物は、ＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されていればよく、恒常的な抑制または喪失と、組織および時期の少なくとも一方に特異的な抑制または喪失を含む。すなわち、本発明の第四の態様である免疫関連副作用モデル非ヒト動物に用いる遺伝子改変非ヒト動物は、コンベンショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物（コンベンショナルＰＤ－１ノックアウト非ヒト動物、およびコンベンショナルＰＤ－１ノックダウン非ヒト動物）と、本発明の第三の態様であるコンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物（コンディショナルＰＤ－１ノックアウト非ヒト動物、およびコンディショナルＰＤ－１ノックダウン非ヒト動物）を含む。
　ＰＤ－１遺伝子の発現を組織および時期の少なくとも一方に特異的にコントロールできることから、前記遺伝子改変非ヒト動物は、組織および時期の少なくとも一方に特異的にＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている遺伝子改変非ヒト動物であることが好ましい。すなわち、前記遺伝子改変非ヒト動物は、好ましくはコンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物であり、より好ましくはＣＤ８陽性Ｔ細胞特異的にＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている遺伝子改変非ヒト動物である。
　コンベンショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物におけるＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域の変異は、それによりＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失され、ＰＤ－１が実質的に不活化するものであればよく、導入される変異は挿入、欠失、変更、置換のいずれであってもよく、変異する塩基数も制限されない。変異は、ＰＤ－１遺伝子に導入されることが好ましい。
　ＰＤ－１ゲノムはエクソン１～エクソン５からなるが、好ましくはエクソン２～エクソン５の範囲内において、より好ましくはエクソン３～エクソン５の範囲内において変異を導入する。
　コンベンショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物において発現が抑制または喪失されているＰＤ－１遺伝子は、ＰＤ－１遺伝子の全部または一部であってもよいが、好ましくはＰＤ－１遺伝子の一部である。発現が抑制または喪失されているＰＤ－１遺伝子は、例えばＯＲＦのうち、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上である。発現が抑制または喪失されているＰＤ－１ゲノムは、好ましくはエクソン２～エクソン５の範囲内の一部であり、より好ましくはエクソン３～エクソン５の範囲内の一部であり、さらに好ましくはエクソン３の一部、４、および５の一部である。
　コンベンショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物は、前述の遺伝子改変非ヒト動物の作製方法に従って作製することができるが、好ましくは以下の文献に記載のＰＤ－１欠損マウスである。
　Ｔａｓｕｋｕ　Ｈｏｎｊｏ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ＰＤ－１－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｉｃｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＤ－１　ａｓ　ａ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ｆｏｒ　Ｂ　ｃｅｌｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９８年、ｖｏｌ．１０、ＮＯ．１０、１５６３－１５７２ページ
　本発明の免疫関連副作用モデル非ヒト動物の用途は特に制限されず、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－１抗体による免疫関連副作用のメカニズム解析や予防、または治療の方法および薬剤の開発等に用いることができる。本発明の免疫関連副作用モデル非ヒト動物は、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の病態や症状が増強されているので、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤のスクリーニング、評価、または開発に用いることが好ましい。
　前記免疫関連副作用は、免疫関連副作用としての乾癬様皮膚炎であることが好ましい。
　本発明の免疫関連副作用モデル非ヒト動物は、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を非ヒト動物に投与して作製する免疫関連副作用モデル非ヒト動物に比べて、免疫関連副作用が持続し、また、モデル作製に際して抗体投与等のブレを生じやすい工程がないことから、実験条件が安定しやすい。そのため、前記免疫関連副作用モデル非ヒト動物は、病態解析に好適である。
　本発明の実施形態の１つの例は、ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている遺伝子改変非ヒト動物であって、抗原性補強剤が投与された、前記遺伝子改変非ヒト動物の、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物としての使用である。
　本発明の実施形態の１つの例は、ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている遺伝子改変非ヒト動物に、抗原性補強剤を投与する工程を含む、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物の作製方法である。
〈抗原性補強剤〉
　本発明における抗原性補強剤は、免疫応答を賦活化する作用をもつ薬剤であり、免疫賦活剤、またはアジュバントと言い換えることができる。ＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されており、ＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている遺伝子改変非ヒト動物に抗原性補強剤を投与することにより、前記遺伝子改変非ヒト動物の免疫応答が賦活化され、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の病態、症状を増強させることができる。抗原性補強剤の投与により賦活化される免疫応答は多種多様であるから、抗原性補強剤を投与された非ヒト動物を構造又は特性により直接特定することは不可能又は非実際的である。
　抗原性補強剤は、免疫応答を賦活する効果を有すれば特に制限されないが、好ましくは炎症性サイトカイン産生を促進するものであり、より好ましくはＴｏｌｌ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）に対するアゴニスト活性を持つものであり、さらに好ましくはＴｏｌｌ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　７（ＴＬＲ７）に対するアゴニスト活性を持つものである。抗原性補強剤としては、例えばアルミニウム化合物、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、イミダゾキノリン、イミダゾキノリン誘導体等が挙げられる。イミダゾキノリン誘導体としては、例えばイミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、ガーディキモド（ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）、レシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）が挙げられる。入手が容易であり、免疫賦活作用が充分であることから、アルミニウム化合物、完全フロイントアジュバント、またはイミダゾキノリン誘導体が好ましく、イミダゾキノリン誘導体がより好ましく、イミキモドがさらに好ましい。
　抗原性補強剤の投与方法は特に制限されず、抗原性補強剤の種類によって選択すればよい。抗原性補強剤の投与は、経口、または非経口とすることができる。抗原性補強剤の投与は、非経口が好ましく、特定の部位にのみ投与することが可能であることから、局所投与がより好ましく、皮膚への外用がさらに好ましい。抗原性補強剤は、そのまま生体に投与してもよいし、その有効量を薬学的に許容する担体とともに配合した製剤として投与してもよい。
　抗原性補強剤の投与量は特に制限されず、遺伝子改変非ヒト動物の種類やモデルの対象とする免疫関連副作用の種類や程度によって適宜選択すればよい。例えばイミキモドをマウスに外用する場合、１～１０％のイミキモドを１０～１００ｍｇ／回／匹で１日１～数回、１～１０日間塗布することができる。
〈本発明の第五の態様である遺伝子改変非ヒト動物〉
　本発明の第五の態様である遺伝子改変非ヒト動物は、ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されているものである。すなわち、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１遺伝子の一部または全部の発現が抑制(ノックダウン)または喪失（ノックアウト）されていることを特徴とする。本発明の第五の態様である遺伝子改変非ヒト動物は、ランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物とも称し、ランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１ノックアウト非ヒト動物、およびランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１ノックダウン非ヒト動物を含む。ＰＤ－Ｌ１の働きを解析しやすいことから、ランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物は、好ましくはランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１ノックアウト非ヒト動物である。
　本発明のランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物の用途は特に制限されないが、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１シグナルを阻害した場合と同じ効果をランゲルハンス細胞特異的に得られることから、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１シグナル伝達系のメカニズム解明、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１シグナル阻害により生じる病態の解析、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１シグナル阻害により生じる病態の予防、治療剤の開発等に用いることができる。本発明のランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１シグナル阻害により生じる病態の解析、またはＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１シグナル阻害により生じる病態の予防、治療剤の開発等に用いることが好ましく、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－１抗体により生じる病態の解析、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－１抗体により生じる病態の予防、治療剤の開発等に用いることがより好ましく、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－１抗体により生じる免疫関連副作用の解析、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－１抗体により生じる免疫関連副作用の予防、治療剤の開発等に用いることがさらに好ましい。
　本発明のランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物は、無刺激下で飼育してもよいが、刺激または負荷を与えてもよい。刺激または負荷を与えることにより、ランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物の特徴をより明確に観察しやすくなる。刺激または負荷は、特に制限されないが、例えば化学的、物理的、または生理学的な刺激もしくは負荷であり、薬剤、飼育密度、運動、放射線、紫外線、食餌等による刺激または負荷を挙げることができる。刺激または負荷は、化学的な刺激または負荷が好ましく、抗原性補強剤による刺激または負荷がより好ましい。
　ＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域の変異は、それによりＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失され、ＰＤ－Ｌ１が実質的に不活化するものであればよく、導入される変異は挿入、欠失、変更、置換のいずれであってもよく、変異する塩基数も制限されない。変異は、ＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域よりもＰＤ－Ｌ１遺伝子に導入されることが好ましい。
　ＰＤ－Ｌ１遺伝子に変異が導入される場合、ＰＤ－Ｌ１ゲノムはエクソン１～エクソン７からなるが、好ましくはエクソン１～エクソン５の範囲内において、より好ましくはエクソン２およびエクソン３の範囲内において変異を導入する。後述する実施例においてはマウスＰＤ－Ｌ１ゲノムのエクソン２および３に変異を導入することによって、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１を不活化した、コンディショナルノックアウトマウスを得ることに成功した。
　ランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物において発現が抑制または喪失されているＰＤ－Ｌ１遺伝子は、ＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部であってもよいが、好ましくはＰＤ－Ｌ１遺伝子の一部である。発現が抑制または喪失されているＰＤ－Ｌ１遺伝子は、ＯＲＦのうち、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは６０％以上である。発現が抑制または喪失されているＰＤ－Ｌ１ゲノムは、好ましくはエクソン１～エクソン７の範囲内の一部であり、より好ましくはエクソン１～エクソン５の範囲内の一部であり、さらに好ましくはエクソン２および３である。
　ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異を導入するための方法は、特に制限されず、公知の方法を用いることができる。例えば、リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用した遺伝子組み換え誘導型の方法などが挙げられる。
　リコンビネースタンパク質をランゲルハンス細胞特異的に発現させた遺伝子改変非ヒト動物と、リコンビネース標的配列が導入された同種の遺伝子改変非ヒト動物とを掛け合わせ、リコンビネースによる組み換えをランゲルハンス細胞特異的に生じさせ、所望の遺伝子をランゲルハンス細胞特異的に制御することを可能にする。リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムとしては、例えばバクテリオファージＰ１由来のＣｒｅリコンビネースタンパク質とＣｒｅタンパク質によって認識される３４塩基対のｌｏｘＰ配列を利用したＣｒｅ／ｌｏｘＰ配列システム、酵母由来のＦＬＰタンパク質／ＦＲＴ配列システム、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉのｐＳＲ１リコンビネース／ｐＳＲ１リコンビネース標的配列システム、バクテリオファージＭｕ由来のＧｉｎタンパク質／ｇｉｘ配列システム等が挙げられる。操作が簡便であることから、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ配列、ＦＬＰタンパク質／ＦＲＴ配列、またはｐＳＲ１リコンビネース／ｐＳＲ１リコンビネース標的配列が好ましく、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムがより好ましい。
　本発明のランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物は、好ましくは、ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物と、ランゲルハンス細胞特異的にリコンビースタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物とを掛け合わせて作製した、ランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物であり、より好ましくは、ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むｌｏｘＰ配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物と、ランゲルハンス細胞特異的にＣｒｅタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物とを掛け合わせて作製した、ランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物である。
（リコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物）
　ランゲルハンス細胞特異的にリコンビネースタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物は、種々のものが報告されているので、実験の目的に応じて選択することができるし、前述した遺伝子改変非ヒト動物の作製方法により新たに作製してもよい。
　既知のランゲルハンス細胞特異的にリコンビネースタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物としては、例えばLaura S. Bursch et. al. "Identification of a novel population of Langerin+ dendritic cells" J Exp Med. 2007 Dec 24; 204(13): 3147？3156に記載のＬａｎｇｅｒｉｎcreマウスが挙げられる。このＬａｎｇｅｒｉｎcreマウスは、樹状細胞にはＣｒｅが発現せず、ランゲルハンス細胞特異的にＣｒｅが発現する。
（リコンビネース標的配列が導入された遺伝子改変非ヒト動物）
　リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用して、ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入される場合、ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子もしくはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域の近傍、またはＰＤ－Ｌ１遺伝子中またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域中にリコンビネース標的配列が導入された遺伝子改変非ヒト動物を用いる。すなわち、ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物を用いる。前記リコンビネース標的配列は、ｌｏｘＰ配列であることが好ましい。
　リコンビネース標的配列を導入する位置は、通常、ＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に導入を予定する変異の種類や位置によって決定する。ＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域の一部または全部の発現を喪失させる場合は、通常、発現を喪失させる部分を、同一方向の複数のリコンビネース標的配列で挟む。複数のリコンビネース標的配列とは、好ましくは２個のリコンビネース標的配列である。相同組み換えによって前記リコンビネース標的配列がゲノムに組み込まれると、リコンビネースタンパク質の存在により、複数のリコンビネース標的配列で挟まれたＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域の一部または全部が削除される。
　リコンビネース標的配列は、ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟んで導入される。ＰＤ－Ｌ１ゲノムはエクソン１～エクソン７からなるので、リコンビネース標的配列は、好ましくはエクソン１～エクソン７の範囲内の一部を挟んで導入され、より好ましくはエクソン１～エクソン５の範囲内の一部を挟んで導入され、さらに好ましくはエクソン２および３を挟んで導入される。後述する実施例においては、リコンビネース標的配列をマウスＰＤ－Ｌ１ゲノムのエクソン２および３を挟んで導入した、遺伝子改変非ヒト動物を得ることに成功した。
　Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ配列システムを用いる場合、ｌｏｘＰ配列は後述する実施例で用いた配列である５'－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ－３'（配列番号１）に限定されない。Ｃｒｅに認識される配列であれば配列に変異があってもよく、例えば、５'－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＮＮＮＴＡＮＮＮＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ－３'（配列番号２）等で示される配列である。
　ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物は、組織および時期の少なくとも一方に特異的にリコンビネースが発現しているリコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物と掛け合わせると、ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、組織および時期の少なくとも一方に特異的にＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、ＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物、すなわち、コンディショナルＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物を作製することができる。
　ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物と、ランゲルハンス細胞特異的リコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物とを掛け合わせると、ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、ランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物を作製することができる。
　リコンビネース標的配列が導入された遺伝子改変非ヒト動物は、上述の遺伝子改変非ヒト動物の作製方法により作製することができる。
〈抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物（ＰＤ－Ｌ１遺伝子改変）〉
　本発明の第六の態様は、ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物に、抗原性補強剤を投与することにより作製する、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物である。
　前記免疫関連副作用モデル非ヒト動物に用いる遺伝子改変非ヒト動物は、本発明の第五の態様であるランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物（ランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１ノックアウト非ヒト動物、およびランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１ノックダウン非ヒト動物）である。
　本発明の免疫関連副作用モデル非ヒト動物の用途は特に制限されず、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－１抗体による免疫関連副作用のメカニズム解析や予防、または治療の方法および薬剤の開発等に用いることができる。本発明の免疫関連副作用モデル非ヒト動物は、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の病態や症状が増強されているので、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＰＤ－１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤のスクリーニング、評価、または開発に用いることが好ましい。
　前記免疫関連副作用は、免疫関連副作用としての乾癬様皮膚炎であることが好ましい。
　本発明の実施形態の１つの例は、ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物であって、抗原性補強剤が投与された、前記遺伝子改変非ヒト動物の、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物としての使用である。
　本発明の実施形態の１つの例は、ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物に、抗原性補強剤を投与する工程を含む、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物の作製方法である。
〈抗原性補強剤〉
　ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物に抗原性補強剤を投与することにより、前記遺伝子改変非ヒト動物の免疫応答が賦活化され、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の病態、症状を増強させることができる。
〈薬剤のスクリーニング方法〉
　本発明の第七の態様である薬剤のスクリーニング方法は、第三の態様である遺伝子改変非ヒト動物、第四の態様である免疫関連副作用モデル非ヒト動物、第五の態様である遺伝子改変非ヒト動物、または第六の態様である免疫関連副作用モデル非ヒト動物を用いる、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤のスクリーニング方法である。　
　本発明の薬剤のスクリーニング方法により、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用を阻害、抑制、促進、または増強する効果を有する薬剤をスクリーニングすることができる。
　本発明の薬剤のスクリーニング方法は、通常、非ヒト動物に薬剤を投与する工程（Ａ）を有する。
　したがって、本発明の実施形態の１つの例は、
工程（α）：下記の遺伝子改変非ヒト動物ＡもしくはＢ、または下記の免疫関連副作用モデル非ヒト動物ＣもしくはＤに薬剤を投与する工程、および
工程（β）：抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の評価を行う工程
を有する、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤のスクリーニング方法である。
遺伝子改変非ヒト動物Ａ：ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、組織および時期の少なくとも一方に特異的にＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物。遺伝子改変非ヒト動物Ａは、本発明の第三の態様の遺伝子改変非ヒト動物である。
遺伝子改変非ヒト動物Ｂ：ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物。遺伝子改変非ヒト動物Ｂは、本発明の第五の態様の遺伝子改変非ヒト動物である。
免疫関連副作用モデル非ヒト動物Ｃ：ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている遺伝子改変非ヒト動物に、抗原性補強剤を投与することにより作製する、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物。免疫関連副作用モデル非ヒト動物Ｃは、本発明の第四の態様の免疫関連副作用モデル非ヒト動物である。
免疫関連副作用モデル非ヒト動物Ｄ：ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物に、抗原性補強剤を投与することにより作製する、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物。免疫関連副作用モデル非ヒト動物Ｄは、本発明の第六の態様の免疫関連副作用モデル非ヒト動物である。
　遺伝子改変非ヒト動物、または免疫関連副作用モデル非ヒト動物に薬剤を投与する方法は、特に制限されず、経口、または非経口とすることができる。薬剤は、そのまま生体に投与してもよいし、その有効量を薬学的に許容する担体とともに配合した製剤として投与してもよい。
　抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の評価を行う方法は、特に制限されない。前記免疫関連副作用の評価は、重症度を示す指標を用いて行うことが好ましい。前記免疫関連副作用の重症度を示す指標は、特に制限されない。
　前記免疫関連副作用が皮膚障害である場合は、重症度を示す指標としては、例えば、白斑、紅斑、膿疱、皮疹、びらん等の程度を用いることができる。前記免疫関連副作用が乾癬様皮膚炎である場合は、重症度を示す指標としては、耳の厚さ、炎症の重症度、表皮の厚さ、表皮中の好中球性微小膿瘍の数、およびサイトカイン、好ましくはＩＬ－６、ＩＬ－１７Ａ、またはＩＬ－２３ＡのｍＲＮＡの発現量等を用いることができる。
　前記免疫関連副作用が肝障害である場合は、重症度を示す指標としては、例えば、ＡＳＴ（ＧＯＴ）、ＡＬＴ（ＧＰＴ）、γ－ＧＴＰ、ＡＳＴ、ＡＬＴ等の肝酵素、または総ビリルビンを用いることができる。
　前記免疫関連副作用が肺炎である場合は、重症度を示す指標としては、例えば、咳嗽や呼吸困難等の症状の程度、気管支内視鏡、ＣＴ等の検査による重症スコアを用いることができる。
　前記免疫関連副作用が甲状腺炎である場合は、重症度を示す指標としては、例えば、血中のＴＳＨ、ｆｒｅｅ　Ｔ３、ｆｒｅｅ　Ｔ４を用いることができる。
　前記免疫関連副作用が視床下部機能異常、汎下垂体機能低下症、副腎炎である場合は、重症度を示す指標としては、例えば、ＡＤＨ、ＡＣＴＨ、ＬＨ、ＦＳＨ、ＧＨ、プロラクチン、コルチゾール、アルドステロン、アンドロゲン、アドレナリン、ノルアドレナリン、エストロゲン、プロゲステロンを用いることができる。
　本発明の薬剤（医薬品候補物質）のスクリーニング方法は、薬剤の存在下および非存在下において行うことにより、薬剤の存在下における抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用が、薬剤の非存在下における該免疫関連副作用よりも軽減されている場合に、該薬剤を該免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行うための薬剤の候補として選択することができる。例えば、薬剤の存在下における前記免疫関連副作用の重症度を示す指標が、薬剤の非存在下における前記指標の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％以下である場合に、該薬剤を前記免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行うための薬剤の候補として選択することができる。薬剤の存在下における前記免疫関連副作用の重症度を示す指標が、薬剤の非存在下における前記指標の１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％以下である場合に、該薬剤を該免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行うための医薬品の候補として選択することが好ましい。
　薬剤（医薬品候補物質）としては、低分子化合物、タンパク質、ポリペプチド、多糖類、核酸等があげられるが、特に制限されない。医薬品（候補物質）は、新規な物質でも公知の物質でもよい。
　前記抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用は、好ましくは皮膚障害、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、横紋筋融解症、Ｉ型糖尿病、神経障害、腎障害、関節炎、肝障害、肺炎、膵炎、甲状腺炎、副腎炎、視床下部機能異常、および汎下垂体機能低下症から選ばれる少なくとも１つであり、より好ましくは皮膚障害、肝障害、肺炎、膵炎、および甲状腺炎から選ばれる少なくとも１つであり、さらに好ましくは皮膚障害の中でも乾癬様皮膚炎である。
　本発明の薬剤のスクリーニング方法は、好ましくは第四の態様である免疫関連副作用モデル非ヒト動物または第六の態様である免疫関連副作用モデル非ヒト動物を用い、より好ましくは第四の態様である免疫関連副作用モデル非ヒト動物を用いる。
　本発明の薬剤のスクリーニング方法は、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を野生型の非ヒト動物に投与して作製する免疫関連副作用モデルを用いるスクリーニング方法に比べて、免疫関連副作用が持続し、また、モデル作製に際して抗体投与等のブレを生じやすい工程がないことから、実験条件が安定しやすく、感度が高い。
〈薬剤の評価方法〉
　本発明の第八の態様である薬剤の評価方法は、第三の態様である遺伝子改変非ヒト動物、第四の態様である免疫関連副作用モデル非ヒト動物、第五の態様である遺伝子改変非ヒト動物、または第六の態様である免疫関連副作用モデル非ヒト動物を用いる、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤の評価方法である。
　本発明の薬剤の評価方法により、薬剤が有する、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用を阻害、抑制、促進、または増強する効果を評価することができる。
　本発明の薬剤の評価方法は、通常、非ヒト動物に薬剤を投与する工程（Ａ）を有する。
　したがって、本発明の実施形態の１つの例は、
工程（α）：下記の遺伝子改変非ヒト動物ＡもしくはＢ、または下記の免疫関連副作用モデル非ヒト動物ＣもしくはＤに薬剤を投与する工程、および
工程（β）：抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の評価を行う工程
を有する、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤の評価方法である。
遺伝子改変非ヒト動物Ａ：ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、組織および時期の少なくとも一方に特異的にＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物。遺伝子改変非ヒト動物Ａは、本発明の第三の態様の遺伝子改変非ヒト動物である。
遺伝子改変非ヒト動物Ｂ：ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物。遺伝子改変非ヒト動物Ｂは、本発明の第五の態様の遺伝子改変非ヒト動物である。
免疫関連副作用モデル非ヒト動物Ｃ：ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている遺伝子改変非ヒト動物に、抗原性補強剤を投与することにより作製する、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物。免疫関連副作用モデル非ヒト動物Ｃは、本発明の第四の態様の免疫関連副作用モデル非ヒト動物である。
免疫関連副作用モデル非ヒト動物Ｄ：ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物に、抗原性補強剤を投与することにより作製する、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物。免疫関連副作用モデル非ヒト動物Ｄは、本発明の第六の態様の免疫関連副作用モデル非ヒト動物である。
　本発明の薬剤（医薬品候補物質）の評価方法は、薬剤の存在下および非存在下において行うことにより、薬剤の存在下における抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用が薬剤の非存在下における該免疫関連副作用よりも軽減されている場合に、該候薬剤を抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行うために有効であると判断することができる。
　前記抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用は、好ましくは皮膚障害、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、横紋筋融解症、Ｉ型糖尿病、神経障害、腎障害、関節炎、肝障害、肺炎、膵炎、甲状腺炎、副腎炎、視床下部機能異常、および汎下垂体機能低下症から選ばれる少なくとも１つであり、より好ましくは皮膚障害、肝障害、肺炎、膵炎、および甲状腺炎から選ばれる少なくとも１つであり、さらに好ましくは皮膚障害の中でも乾癬様皮膚炎である。
　本発明の薬剤の評価方法は、好ましくは第四の態様である免疫関連副作用モデル非ヒト動物または第六の態様である免疫関連副作用モデル非ヒト動物を用い、より好ましくは第四の態様である免疫関連副作用モデル非ヒト動物を用いる。
　本発明の薬剤の評価方法は、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体を野生型の非ヒト動物に投与して作製する免疫関連副作用モデルを用いる薬剤の評価方法に比べて、免疫関連副作用が持続し、また、モデル作製に際して抗体投与等のブレを生じやすい工程がないことから、実験条件が安定しやすく、感度が高い。
〈本発明の第九の態様である遺伝子改変非ヒト動物〉
　本発明の第九の態様である遺伝子改変非ヒト動物は、ゲノム中のＰＤ－Ｌ２遺伝子またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入されている。
　リコンビネース標的配列は、ゲノム中のＰＤ－Ｌ２遺伝子もしくはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域の近傍、またはＰＤ－Ｌ２遺伝子中またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域中に導入される。前記リコンビネース標的配列は、ｌｏｘＰ配列であることが好ましい。
　リコンビネース標的配列を導入する位置は、通常、ＰＤ－Ｌ２遺伝子またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域に導入を予定する変異の種類や位置によって決定する。ＰＤ－Ｌ２遺伝子またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域の一部または全部の発現を喪失させる場合は、通常、発現を喪失させる部分を、同一方向の複数のリコンビネース標的配列で挟む。複数のリコンビネース標的配列とは、好ましくは２個のリコンビネース標的配列である。相同組み換えによって前記リコンビネース標的配列がゲノムに組み込まれると、リコンビネースタンパク質の存在により、複数のリコンビネース標的配列で挟まれたＰＤ－Ｌ２遺伝子またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域の一部または全部が削除される。
　リコンビネース標的配列は、ゲノム中のＰＤ－Ｌ２遺伝子またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟んで導入される。ＰＤ－Ｌ２ゲノムはエクソン１～エクソン６からなるので、リコンビネース標的配列は、好ましくはエクソン１～エクソン６の範囲内の一部を挟んで導入され、より好ましくはエクソン１～エクソン４の範囲内の一部を挟んで導入され、さらに好ましくはエクソン３および４を挟んで導入される。後述する実施例においては、リコンビネース標的配列をマウスＰＤ－Ｌ２ゲノムのエクソン３および４を挟んで導入した、遺伝子改変非ヒト動物を得ることに成功した。
　Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ配列システムを用いる場合、ｌｏｘＰ配列は後述する実施例で用いた配列である５'－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ－３'（配列番号１）に限定されない。Ｃｒｅに認識される配列であれば配列に変異があってもよく、例えば、５'－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＮＮＮＴＡＮＮＮＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ－３'（配列番号２）等で示される配列である。
　リコンビネース標的配列が導入された遺伝子改変非ヒト動物は、上述の遺伝子改変非ヒト動物の作製方法により作製することができる。
　ゲノム中のＰＤ－Ｌ２遺伝子またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物と、組織および時期の少なくとも一方に特異的にリコンビネースが発現しているリコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物とを掛け合わせると、ゲノム中のＰＤ－Ｌ２遺伝子またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、組織および時期の少なくとも一方に特異的にＰＤ－Ｌ２遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、コンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物を作製することができる。
　前記コンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物は、ゲノム中のＰＤ－Ｌ２遺伝子またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、組織および時期の少なくとも一方に特異的にＰＤ－Ｌ２遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されているものである。すなわち、コンディショナルにＰＤ－Ｌ２遺伝子の一部または全部の発現が抑制(ノックダウン)または喪失（ノックアウト）されていることを特徴とする。前記コンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物は、コンディショナルＰＤ－Ｌ２ノックアウト非ヒト動物、およびコンディショナルＰＤ－Ｌ２ノックダウン非ヒト動物を含む。ＰＤ－Ｌ２の働きを解析しやすいことから、コンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物は、好ましくはコンディショナルＰＤ－Ｌ２ノックアウト非ヒト動物である。
　前記コンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物の用途は特に制限されないが、ＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１シグナルを阻害した場合と同じ効果を時期特異的、組織特異的に得られることから、ＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１シグナル伝達系のメカニズム解明、ＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１シグナル阻害により生じる病態の解析、ＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１シグナル阻害により生じる病態の予防、治療剤の開発等に用いることができる。本発明の前記コンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物は、ＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１シグナル阻害により生じる病態の解析、またはＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１シグナル阻害により生じる病態の予防、治療剤の開発等に用いることが好ましく、抗ＰＤ－Ｌ２抗体または抗ＰＤ－１抗体により生じる病態の解析、または抗ＰＤ－Ｌ２抗体または抗ＰＤ－１抗体により生じる病態の予防、治療剤の開発等に用いることがより好ましく、抗ＰＤ－Ｌ２抗体または抗ＰＤ－１抗体により生じる免疫関連副作用の解析、または抗ＰＤ－Ｌ２抗体または抗ＰＤ－１抗体により生じる免疫関連副作用の予防、治療剤の開発等に用いることがさらに好ましい。
　前記コンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物は、無刺激下で飼育してもよいが、刺激または負荷を与えてもよい。刺激または負荷を与えることにより、前記コンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物の特徴をより明確に観察しやすくなる。刺激または負荷は、特に制限されないが、例えば化学的、物理的、または生理学的な刺激もしくは負荷であり、薬剤、飼育密度、運動、放射線、紫外線、食餌等による刺激または負荷を挙げることができる。
　ＰＤ－Ｌ２遺伝子またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域の変異は、それによりＰＤ－Ｌ２遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失され、ＰＤ－Ｌ２が実質的に不活化するものであればよく、導入される変異は挿入、欠失、変更、置換のいずれであってもよく、変異する塩基数も制限されない。変異は、ＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域よりもＰＤ－Ｌ２遺伝子に導入されることが好ましい。
　ＰＤ－Ｌ２遺伝子に変異が導入される場合、ＰＤ－Ｌ２ゲノムはエクソン１～エクソン６からなるが、好ましくはエクソン１～エクソン４の範囲内において、より好ましくはエクソン３および４の範囲内において変異を導入する。後述する実施例においては、リコンビネース標的配列をマウスＰＤ－Ｌ２ゲノムのエクソン３および４を挟んで導入した、遺伝子改変非ヒト動物を得ることに成功した。この遺伝子改変非ヒト動物と、組織および時期の少なくとも一方に特異的にリコンビネースが発現しているリコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物とを掛け合わせると、マウスＰＤ－Ｌ２ゲノムのエクソン３および４に変異を導入することによって、組織および時期の少なくとも一方に特異的にＰＤ－Ｌ２を不活化した、コンディショナルノックアウトマウスを得ることができる。
　コンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物において発現が抑制または喪失されているＰＤ－Ｌ２遺伝子は、ＰＤ－Ｌ２遺伝子の全部または一部であってもよいが、好ましくはＰＤ－Ｌ２遺伝子の一部である。発現が抑制または喪失されているＰＤ－Ｌ２遺伝子は、ＯＲＦのうち、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上である。発現が抑制または喪失されているＰＤ－Ｌ２ゲノムは、好ましくはエクソン１～エクソン４の範囲内の一部であり、より好ましくはエクソン１～エクソン５の範囲内の一部であり、さらに好ましくはエクソン３および４である。
　ゲノム中のＰＤ－Ｌ２遺伝子またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域に変異を導入するための方法は、特に制限されず、公知の方法を用いることができる。例えば、リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムを利用した遺伝子組み換え誘導型の方法などが挙げられる。
　リコンビネースタンパク質／リコンビネース標的配列システムとしては、例えばバクテリオファージＰ１由来のＣｒｅリコンビネースタンパク質とＣｒｅタンパク質によって認識される３４塩基対のｌｏｘＰ配列を利用したＣｒｅ／ｌｏｘＰ配列システム、酵母由来のＦＬＰタンパク質／ＦＲＴ配列システム、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｕｘｉｉのｐＳＲ１リコンビネース／ｐＳＲ１リコンビネース標的配列システム、バクテリオファージＭｕ由来のＧｉｎタンパク質／ｇｉｘ配列システム等が挙げられる。操作が簡便であることから、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ配列、ＦＬＰタンパク質／ＦＲＴ配列、またはｐＳＲ１リコンビネース／ｐＳＲ１リコンビネース標的配列が好ましく、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰシステムがより好ましい。
　前記コンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物は、好ましくは、ゲノム中のＰＤ－Ｌ２遺伝子またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物と、骨髄系細胞特異的にリコンビネースタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物とを掛け合わせて作製した、コンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物であり、より好ましくは、ゲノム中のＰＤ－Ｌ２遺伝子またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むｌｏｘＰ配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物と、骨髄系細胞特異的にＣｒｅタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物とを掛け合わせて作製した、コンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物である。
　前記骨髄系細胞としては、例えば、巨核球、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、単球、マクロファージ、赤血球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞および造血幹細胞から生まれてこれらの細胞に分化する前駆細胞（骨髄系前駆細胞）が挙げられるが、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、またはランゲルハンス細胞が好ましい。
（リコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物）
　前記コンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物において、ＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現が抑制または喪失される組織および時期は、掛け合わせる遺伝子改変非ヒト動物のリコンビネースタンパク質発現の組織特異性および時期特異性により選択することができる。時期特異的または組織特異的にリコンビネースタンパク質を発現するリコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物は、種々のものが報告され、実験の目的に応じて選択することができるし、前述した遺伝子改変非ヒト動物の作製方法により新たに作製してもよい。
　リコンビネース発現遺伝子改変非ヒト動物は、好ましくは骨髄系細胞特異的であり、より好ましくは、樹状細胞特異的、単球、マクロファージ、および好中球特異的、またはランゲルハンス細胞特異的である。
（遺伝子改変非ヒト動物の掛け合わせ）
　ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物；ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物；ゲノム中のＰＤ－Ｌ２遺伝子またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物；コンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物；コンディショナルＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物；およびコンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物からなる群から選ばれる少なくとも２つを掛け合わせることにより、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２およびＰＤ－１の発現を、組織特異的、時期特異的に抑制または喪失させたマウスを作製することができる。これらのマウスはＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２／ＰＤ－１シグナル伝達系の解析に非常に有用である。
　ＰＤ－１を受容体とするリガンドは、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の２つであるが、免疫チェックポイント阻害薬として汎用されている抗体は、抗ＰＤ－１抗体と抗ＰＤ－Ｌ１抗体のみである。ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＰＤ－Ｌ２の機能は不明なことも多いため、抗ＰＤ－１抗体による副作用がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達系の阻害によるものであるのか、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１およびＬ２シグナル伝達系の阻害によるものであるのか、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２の阻害によるものであるのかはわからない場合がある。
　本明細書に開示されたコンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物、コンディショナルＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物、およびコンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物からなる群から選ばれる少なくとも２つの表現型を比較すると、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＰＤ－Ｌ２の機能解明に有用である。例えば、コンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物の表現型が、コンディショナルＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物の表現型と同じであるが、コンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物の表現型とは異なる場合、抗ＰＤ－１抗体による副作用は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達系の阻害によるものであると判断することができる。また、コンディショナルＰＤ－１遺伝子改変非ヒト動物の表現型が、コンディショナルＰＤ－Ｌ１遺伝子改変非ヒト動物の表現型と、コンディショナルＰＤ－Ｌ２遺伝子改変非ヒト動物の表現型とを合計したものである場合、抗ＰＤ－１抗体による副作用は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１およびＬ２シグナル伝達系の阻害によるものであると判断することができる。このようにＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＰＤ－Ｌ２の機能が解明されると、副作用がより少ない抗体を免疫チェックポイント阻害薬として選択しやすくなる。
　次に本発明について実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
　ヒトに関する試験は、筑波大学付属病院内倫理委員会の承認に従い、全ての患者から書面によるインフォームドコンセントを得た上で行われた。患者の臨床データは、病歴を後ろ向きにレビューした。また、動物実験は、筑波大学動物実験委員会によって承認され、筑波大学の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って実施した。マウスは、特定病原体不在下で飼育した。
〔参考例〕尋常性乾癬と抗ＰＤ－１抗体誘導性乾癬様皮膚炎の比較
　２０１２年から２０１８年の間に筑波大学病院および水戸済生会総合病院を受診した患者のうち、抗ＰＤ－１抗体誘導性乾癬様皮膚炎（Ａｎｔｉ－ＰＤ－１　ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｓｏｒｉａｓｉｓ－ｌｉｋｅ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）を発症したメラノーマ患者７名と尋常性乾癬（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）の患者６名を対象とした。
＜外観による所見＞
　代表的な患者の背部と下腿の写真を撮影した。結果を図１に示す。抗ＰＤ－１抗体誘導性乾癬様皮膚炎（Ａｎｔｉ－ＰＤ－１　ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｓｏｒｉａｓｉｓ－ｌｉｋｅ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、および尋常性乾癬（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ
　ｖｕｌｇａｒｉｓ）のどちらの患者にも、厚い銀白色の鱗屑を伴った角化性紅斑が認められる。
＜病理組織学的所見＞
　患者の紅斑から皮膚生検を行い、ホルマリン固定したパラフィン切片を作製した。２μｍ厚の組織切片を作製し、ＨＥ（ヘマトキシリン、エオジン）染色を行なった。また、免疫組織染色は、抗ヒトＣＤ８モノクローナル抗体（Ｃ８／１４４Ｂ、ニチレイバイオサイエンス社製）、または抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体（４Ｂ１２、ニチレイバイオサイエンス社製）を用い、自動免疫染色装置（ニチレイバイオサイエンス社製）により、製品プロトコルに従って行った。染色した標本は顕微鏡（オリンパス社製）を用いて観察、および写真撮影を行った。抗ヒトＣＤ８モノクローナル抗体による免疫染色画像において、一切片中の表皮に浸潤している細胞の数をカウントし、表皮内浸潤ＣＤ８陽性細胞数とした。抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体による免疫染色画像においても同様にカウントし、表皮内浸潤ＣＤ４陽性細胞数とした。表皮内浸潤ＣＤ８陽性細胞数を表皮内浸潤ＣＤ４陽性細胞数で除した値をＣＤ８／ＣＤ４　ｒａｔｉｏとした。有意差検定は、マン・ホイットニーのＵ検定を用いてノンパラメトリックな両側検定を行い、＊＊：Ｐ＜０．０１で示した。
　結果を図２に示す。尋常性乾癬のＨＥ染色像には、表皮の肥厚、錯角化および過角化が認められ、角層下には好中球による微小膿瘍が認められた。また、顆粒層は消失していた。有棘層は肥厚し、表皮突起は真皮に向かって規則的に棍棒状に延長していた。抗ＰＤ－１抗体誘導性乾癬様皮膚炎でも同様の病理組織学的所見が認められた。また、抗ＰＤ－１抗体誘導性乾癬様皮膚炎においては、尋常性乾癬に比べて、ＣＤ８陽性細胞が表皮内に多く観察された。
　図３より、抗ＰＤ－１抗体誘導性乾癬様皮膚炎でのＣＤ８／ＣＤ４　ｒａｔｉｏは尋常性乾癬に比べて有意に多かった。抗ＰＤ－１抗体誘導性乾癬様皮膚炎では、ＣＤ８陽性細胞の表皮内浸潤が亢進していることが明らかになった。
＜血清中のＩＬ－６濃度＞
　２０１２年から２０１９年の間に筑波大学病院において、抗ＰＤ－１抗体投与の治療を受けたメラノーマ患者１９名から、抗ＰＤ－１抗体投与前後において血清を採取し、測定まで－２０℃にて保存した。血清中ＩＬ－６濃度は、製品プロトコルに従い、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ　ＭＡＰ　Ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用い、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ　Ｌｕｍｉｎｅｘ　２００　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で測定した。抗ＰＤ－１抗体投与１２ヶ月後または抗ＰＤ－１抗体投与中止時までに発症した免疫関連副作用の有無によって、患者を３群に分類した。すなわち、乾癬様皮膚炎を発症した患者５名をＰｓｏｒｉａｓｉｓ－ｌｉｋｅ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ、乾癬様皮膚炎以外の免疫関連副作用を発症した患者７名をＯｔｈｅｒ　ｉｒＡＥｓ、免疫関連副作用が観察されなかった患者７名をＮｏ　ｉｒＡＥとした。乾癬様皮膚炎以外の免疫関連副作用を発症した患者７名の内訳は、白斑２例、神経障害１例、肝障害１例、甲状腺炎１例、下垂体機能低下症１例、腸炎１例であった。
　結果を図４に示す。乾癬様皮膚炎発症患者は、抗ＰＤ－１抗体投与後に投与前よりも血清中ＩＬ－６濃度が上昇する傾向にあった。乾癬様皮膚炎以外の免疫関連副作用発症患者でも同様に、抗ＰＤ－１抗体投与後に投与前よりも血清中ＩＬ－６濃度が上昇する傾向にあった。一方、免疫関連副作用なしの患者では、抗ＰＤ－１抗体投与後に投与前よりも血清中ＩＬ－６濃度変化が減少する傾向にあった。
〔実施例１〕ＰＤ－１コンベンショナルノックアウトマウスを用いた乾癬様皮膚炎モデル
＜皮膚炎の惹起＞
　ＰＤ－１コンベンショナルノックアウトマウス（京都大学の本庶佑教授より供与、ＰＤ－１-/-マウス、またはＰＤ－１－ＫＯマウスともいう）と、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｊａｐａｎ社より購入、ＷＴマウスともいう）とを１０匹ずつ用意し、それぞれ５匹ずつイミキモド（ＩＭＱ）群とＶｅｈｉｃｌｅ群の２群に分けた。マウスの背部を剃毛し、イミキモド群のマウスにはイミキモド６２．５ｍｇ相当量の３．５％イミキモドクリーム、Ｖｅｈｉｃｌｅ群のマウスにはコントロールＶｅｈｉｃｌｅクリーム（Ｖａｎｉｃｒｅａｍ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ社製）を１日１回連続５日間または７日間背部および両耳に塗布した。３．５％イミキモドクリームは、５％イミキモドクリーム（ベセルナクリーム、持田製薬株式会社製）をコントロールＶｅｈｉｃｌｅクリームで希釈して調製した。塗布開始日を塗布１日目とした。
　Ｖｅｈｉｃｌｅ群の野生型マウス、イミキモド群のＷＴマウス、イミキモド群のＰＤ－１-/-マウスの塗布７日目の背部の写真を図５に示す。イミキモド群のＷＴマウスでは、軽度の紅斑および鱗屑が観察された。イミキモド群のＰＤ－１-/-マウスでは高度の紅斑および鱗屑が観察された。
＜Ｅａｒ　Ｓｗｅｌｌｉｎｇ＞
　塗布開始７日目にマイクロメーター（株式会社ミツトヨ製）を用いてマウス耳の厚さを測定し、Ｅａｒ　Ｓｗｅｌｌｉｎｇ（μｍ）とした。各群の有意差検定は、２元配置分散分析で行い、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１で示した。
　ＷＴマウスとＰＤ－１-/-マウスのイミキモド塗布による耳の厚さの変化を図６左に示した。ＰＤ－１-/-マウスの方がＷＴマウスよりも有意に耳が厚くなった。
＜皮膚における炎症の重症度＞
　背部皮膚における炎症の重症度は、ヒト乾癬の診断に利用されているＰＡＳＩ（Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ　Ａｒｅａ　ａｎｄ　Ｓｅｖｅｒｉｔｙ　Ｉｎｄｅｘ）を模した客観的な方法で評価した。具体的には、背部の紅斑、鱗屑および肥厚の３項目をそれぞれ独立して、０：なし、１：軽度、２：中等度、３：高度、４：きわめて高度の５段階でスコア化し、３項目の合計スコア（０～１２まで）を算出した。各群の有意差検定は、２元配置分散分析で行い、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１で示した。
　ＷＴマウスとＰＤ－１-/-マウスのイミキモド塗布による炎症の重症度（ＰＡＳＩ　Ｓｃｏｒｅ）の変化を図６右に示した。ＰＤ－１-/-マウスの方がＷＴマウスよりも有意に皮膚における炎症が重症であった。
＜病理組織学的所見＞
　塗布開始７日目にマウス耳の皮膚を採取し、ホルマリン固定後、パラフィン包埋した。４μｍ厚の組織切片を作製し、ＨＥ（ヘマトキシリン、エオジン）染色を行なって、組織標本を作製した。染色した組織標本は顕微鏡（ニコン社製）を用いて観察、および写真撮影を行った。
　ＨＥ染色したＶｅｈｉｃｌｅ群およびイミキモド群のＷＴマウスとＰＤ－１-/-マウスの皮膚組織標本を図７に示す。Ｖｅｈｉｃｌｅ群のＷＴマウスとＰＤ－１-/-マウスとでは、明確な差は見られなかった。イミキモド群では、ＷＴマウス、ＰＤ－１-/-マウス共に表皮の肥厚、不全角化および過角化が認められ、角層直下には好中球による微小膿瘍が認められた。ＰＤ－１-/-マウスにおける表皮の肥厚、不全角化および過角化、好中球による微小膿瘍の程度は、ＷＴに比べて顕著に悪かった。
＜表皮の厚さ＞
　上述のＨＥ染色した組織標本の画像を用いて表皮厚を測定し、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ（表皮の厚さ、μｍ）とした。各群５匹ずつのマウスから、１匹あたり１標本作製し、１標本あたり５点の厚さを測定し平均値を算出した。有意差検定は、マン・ホイットニーのＵ検定を用いてノンパラメトリックな両側検定を行い、＊＊：Ｐ＜０．０１で示した。独立した実験を３度行い、代表的なデータを示した。
　Ｖｅｈｉｃｌｅ群およびイミキモド群のＷＴマウスとＰＤ－１-/-マウスの表皮の厚さを図８左に示す。ＷＴマウス、ＰＤ－１-/-マウス共に、イミキモド群の方がＶｅｈｉｃｌｅ群よりも表皮が有意に厚かった。また、イミキモド群においては、ＰＤ－１-/-マウスの方がＷＴマウスよりも表皮が有意に厚かった。
＜微小膿瘍＞
　上述のＨＥ染色した組織標本を顕微鏡で観察して、微小膿瘍の数をカウントした。各群５匹ずつのマウスを用いてマウス１匹の片耳から１標本作製して微小膿瘍の数をカウントし、Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏａｂｓｃｅｓｓとした。有意差検定は、マン・ホイットニーのＵ検定を用いてノンパラメトリックな両側検定を行い、＊＊：Ｐ＜０．０１で示した。独立した実験を３度行い、代表的なデータを示した。
　イミキモド群のＷＴマウスとＰＤ－１-/-マウスの微小膿瘍の数を図８右に示す。ＰＤ－１-/-マウスの方がＷＴマウスよりも有意に微小膿瘍の数が多かった。
＜サイトカインのｍＲＮＡ発現量＞
　サイトカインのｍＲＮＡの発現量を定量ＲＴ－ＰＣＲにより定量した。Ｖｅｈｉｃｌｅ群およびイミキモド群のＷＴマウスとＰＤ－１-/-マウス（各８匹ずつ）から耳を採取し、Ｔｒｉｚｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ　ＮＤ－１０００（ｐｅｑＬａｂ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ　ＧｍｂＨ社製）を用いて、ＲＮＡサンプルを定量し、またＯＤ２６０／２３０とＯＤ２６０／２８０がそれぞれ１．８、１．６を超えていることを確認した。Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて合成した。ｍＲＮＡ発現量は、ＰｒｉｍｅＴｉｍｅTM　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘと、Ｐｒｉｍｅ　ＴｉｍｅTM　ｑＰＣＲ　ｐｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ　５　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により、ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅することにより測定した。ＰＣＲは、ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅで行った。増幅産物は、比較ＣＴ法により定量し、ＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡの発現量で標準化した。有意差検定は、マン・ホイットニーのＵ検定を用いてノンパラメトリックな両側検定を行い、＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１で示した。用いたＰｒｉｍｅ　ＴｉｍｅTM　ｑＰＣＲ　ｐｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｐｒｉｍｅｒｓのＡｓｓａｙ　ＮＯ.は、以下の通りである。
ＩＬ－６：Ｍｍ．ＰＴ．５８．１０００５５６６
ＩＬ－２３ａ：Ｍｍ．ＰＴ．５８．１０５９４６１８．ｇ
ＩＬ－１７ａ：Ｍｍ．ＰＴ．５８．６５３１０９２
Ｌｙ６ｇ：Ｍｍ．ＰＴ．５８．３０４９８０４３
ＧＡＰＤＨ：Ｍｍ．ＰＴ．３９ａ．１
　乾癬への関与が報告されているサイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－２３ａ、ＩＬ－１７ａ）および好中球表面マーカーであるＬｙ６ｇのｍＲＮＡの定量結果を図９に示す。ＩＬ－２３ａおよびＩＬ－１７ａのｍＲＮＡ発現量は、ＷＴマウス、ＰＤ－１-/-マウスのどちらでもイミキモド塗布によって顕著に増加した。一方、ＩＬ－６のｍＲＮＡ発現量は、ＷＴマウスではイミキモド塗布によっては変化せず、ＰＤ－１-/-マウスにおいてのみイミキモド塗布によって顕著に増加していた。ＰＤ－１-/-マウスにおいて発症した乾癬様皮膚炎においてのみ、ＩＬ－６の上昇が観察されたことから、乾癬様皮膚炎におけるＩＬ－６の産生にはＰＤ－１が強く関与していることが明らかになった。Ｌｙ６ｇのｍＲＮＡ発現量はＷＴマウス、ＰＤ－１-/-マウスのどちらでもＶｅｈｉｃｌｅ群では検出限界以下であったが、イミキモド塗布により有意に増加した。
＜免疫染色＞
　塗布開始７日目にマウス耳の皮膚を採取し、ホルマリン固定後、パラフィン包埋し、４μｍ厚の組織切片を作製した。免疫組織染色は、一次抗体として抗ＣＤ８ａ　ｒａｔモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ：４ＳＭ１５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、１：４００で希釈）、蛍光標識二次抗体としてＡｌｅｘａ　ＦｌｕｏｒTM　５５５－ｌａｂｅｌｅｄ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｒａｔ　ＩｇＧ（Ａｂｃａｍ社製）、核の検出は４'，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）を用いて常法により行った。蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７００、Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を用い、倍率４００倍にて観察した。
　イミキモド群のＷＴマウスおよびＰＤ－１-/-マウスでの免疫染色結果を図１０に示す。ＣＤ８陽性Ｔ細胞を矢頭で示す。ＷＴマウスに比べ、ＰＤ－１-/-マウスではＣＤ８陽性Ｔ細胞が表皮内に多く観察された。
＜皮膚に浸潤したＣＤ８陽性Ｔ細胞数＞
　塗布開始７日目にマウス耳の皮膚を採取し、ホルマリン固定後、パラフィン包埋し、４μｍ厚の組織切片を作製した。免疫組織染色は、一次抗体として、抗ＣＤ３　ｒａｂｂｉｔモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ：ＳＰ７、Ａｂｃａｍ社製、１：１００で希釈）および抗ＣＤ８ａ　ｒａｔモノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ：４ＳＭ１５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、１：４００で希釈）、蛍光標識二次抗体としてＡｌｅｘａ　ＦｌｕｏｒTM　４８８－ｌａｂｅｌｅｄ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（Ａｂｃａｍ社製）およびＡｌｅｘａ　ＦｌｕｏｒTM　５５５－ｌａｂｅｌｅｄ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ｒａｔ　ＩｇＧ（Ａｂｃａｍ社製）、核の検出は４'，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）を用いて常法により行った。蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７００、Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を用い、倍率４００倍にて観察し、ＣＤ８陽性かつＣＤ３陽性である細胞をＣＤ８陽性Ｔ細胞とし、皮膚に浸潤した数を表皮、真皮にわけてカウントした。表皮（Ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）中のＣＤ８陽性Ｔ細胞数と真皮（Ｄｅｒｍｉｓ）中のＣＤ８陽性Ｔ細胞数を合計した数をＴｏｔａｌとした。免疫染色画像において、一切片あたりの、皮膚に浸潤している細胞の数をカウントし、ＣＤ８陽性Ｔ細胞数とした。各群５匹のマウスから、一匹あたり２枚の組織切片を作製した。有意差検定は、マン・ホイットニーのＵ検定を用いてノンパラメトリックな両側検定を行い、＊＊：Ｐ＜０．０１で示した。
　表皮または真皮に浸潤したＣＤ８陽性Ｔ細胞の数を図１１に示す。ＰＤ－１-/-マウスの表皮に浸潤したＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＷＴマウスよりも有意に多かった。一方、真皮に浸潤したＣＤ８陽性Ｔ細胞数は、ＷＴマウスとＰＤ－１-/-マウスとで差がなかった。Ｔｏｔａｌでは、ＰＤ－１-/-マウスの浸潤ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＷＴマウスよりも有意に多かった。
＜表皮と真皮におけるＣＤ８、ＩＦＮ－γ、ＣＸＣＬ９のｍＲＮＡ発現量＞
　塗布５日目のマウス(各群５匹ずつ)の耳の皮膚を０．２５％トリプシン溶液（富士フイルム和光純薬株式会社製）で３７℃にて４０分間処理し、表皮と真皮とに分離した。分離した真皮は、コラジェナーゼ（Ｌｉｂｅｒａｓｅ ＴＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒａｄｅ、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）で３７℃にて３０分間処理し、得られた細胞群をＤｅｒｍａｌ　ｃｅｌｌとした。分離した表皮は、Ｃａ2+およびＭｇ2+を含まないリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、メッシュサイズ７０μｍのセルストレイナーを通した後、ＣＤ４５　ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）を用いたＭＡＣＳTM ｃｅｌｌ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより細胞群をソートした。得られたＣＤ４５陰性の細胞群を「Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ」とし、ＣＤ４５陰性の細胞群を「Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ＣＤ４５+ｃｅｌｌ」とした。フローサイトメトリーで解析した結果、ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅのＣＤ４５陽性細胞含有率は１％未満であり、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ＣＤ４５+ｃｅｌｌのＣＤ４５陽性細胞含有率は９５％より多かった。上記の手順の概念図を図１２に示す。
　Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ＣＤ４５+ｃｅｌｌ、Ｄｅｒｍａｌ　ｃｅｌｌの３つの細胞群におけるＣＤ８、ＩＦＮ－γ、ＣＸＣＬ９のｍＲＮＡ発現量を定量ＲＴ－ＰＣＲにより定量した。定量ＲＴ－ＰＣＲは前述のように行い、用いたＰｒｉｍｅ　ＴｉｍｅTM　ｑＰＣＲ　ｐｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｐｒｉｍｅｒｓのＡｓｓａｙ　ＮＯ.は、以下の通りである。
ＩＦＮ－γ：Ｍｍ．ＰＴ．５８．４１７６９２４０
ＣＤ８ａ：Ｍｍ．ＰＴ．５８．２９９７１４４２
ＣＸＣＬ９：Ｍｍ．ＰＴ．５８．５７２６７４５
　結果を図１３に示した。ＣＤ８ａのｍＲＮＡ発現量は、Ｄｅｒｍａｌ　ｃｅｌｌにおいては、ＷＴマウスとＰＤ－１-/-マウスとの間で差はなかったが、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ＣＤ４５+ｃｅｌｌにおいてはＰＤ－１-/-マウスの方がＷＴマウスよりも有意に多かった。ＩＦＮ－γのｍＲＮＡ発現量は、Ｄｅｒｍａｌ　ｃｅｌｌにおいては、ＷＴマウスとＰＤ－１-/-マウスとの間で差はなかったが、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ＣＤ４５+ｃｅｌｌにおいてはＰＤ－１-/-マウスの方がＷＴマウスよりも有意に多かった。ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅにおけるＣＸＣＬ９のｍＲＮＡ発現量は、ＰＤ－１-/-マウスの方がＷＴマウスよりも有意に多かった。すなわち、ＰＤ－１-/-マウスでは、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ＣＤ４５+ｃｅｌｌにおけるＣＤ８ａおよびＩＦＮ－γ、ＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅにおけるＣＸＣＬ９の産生が亢進していることが明らかになった。
　〔実施例２〕ＣＤ８陽性Ｔ細胞特異的ＰＤ－１コンディショナルノックアウトマウスの作製
＜ＰＤ－１fl/flマウスの作製＞
　野生型マウス（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊは、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｊａｐａｎより購入した。
（デザイン）
　筑波大学実験動物資源センターのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、ＰＤ－１遺伝子の前後に二つのｌｏｘＰ配列（５'－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ－３'：配列番号１）を挿入し、遺伝子組み換えマウスを作製した（ＰＤ－１　ｆｌｏｘｅｄマウス、またはＰＤ－１fl/flマウスという）。概念図を図１４に示す。
　図１５に野生型マウスのゲノムにおけるＰＤ－１遺伝子（Ｐｄｃｄ１）のエクソン（ｂｏｘで示す）の位置とＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのターゲット配列、ＰＡＭ配列の検索結果を示す。マウスＰｄｃｄ１は１番染色体上にあり、５個のエクソンから構成される。１番目のエクソンにＰＤ－１タンパク質の開始コドンが存在しているので、２番目、３番目、および４番目のエクソンをＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを利用して脱落させることにより、完全なＰＤ－１タンパク質が産生されないようにするため、エクソン２－４を含む領域の両端にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いてｌｏｘＰ配列を挿入するように設計した。具体的には、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とＣａｓ９発現カセットを１つのプラスミド内に含むｐＸ３３０ベクター（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター）を受精卵に導入して、目的のｓｇＲＮＡとＣａｓ９　ｍＲＮＡを同時に発現させてマウスＰＤ－１ゲノムを目的の位置で切断し、さらにｌｏｘＰ配列を含むｐｆｌｏｘ　ｐｌａｔｆｏｒｍ（ドナーベクター）をドナーＤＮＡとして併せて受精卵に導入することで切断部位にｌｏｘＰ配列が挿入されるようにした。
（ドナーベクターの作製）
　エクソン２－４を含む領域の５'側のＣＲＩＳＰＲ標的サイトをＬｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲサイト、３'側のＣＲＩＳＰＲ標的サイトをｒｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲサイトとし、Ｌｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲ予測切断部位からその上流（５’）側１３９５ｂｐまでを５'アーム、ｒｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲ予測切断部位からその下流（３’）側１４６２ｂｐまでを３'アーム、Ｌｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲ予測切断部位とｒｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲ予測切断部位の間２６８５ｂｐをセントラルアームとした。Ｌｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲ標的サイトとｒｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲ標的サイトの配列（Ｌ　ｔａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ：配列番号３、Ｒ　ｔａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ：配列番号４）を図１５に示す。オフターゲットを切断するリスクを低減するため、左右のターゲット配列およびＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ／）を用いて検索し、２０塩基のターゲット配列がＰｄｃｄ－１ゲノム内に一か所しかないことを確認した。
　まず、以下の手順により、エクソン２－４の外側にｌｏｘＰ配列を含み、５'アーム、セントラルアーム、３'アームの配列を含むドナーベクターを作製した。まず、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのゲノムＤＮＡ（図１６、配列番号５）をテンプレートとし、Ｓｔｅｐ１のプライマーを用いて常法に従いＰＣＲを行った。図１６中の５'ａｒｍ（細破線）が５'アームのテンプレートとして使用されたＢ６Ｊゲノムの配列、Ｃｅｎｔｒａｌ　ａｒｍ（粗破線）がセントラルアームのテンプレートとしてＢ６Ｊゲノムの使用された配列、３'ａｒｍ（ゴシック体）が３'アームのテンプレートとして使用されたＢ６Ｊゲノムの配列である。
　得られたＰＣＲ産物とｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔを基盤に独自に作製したベクター（ｐｆｌｏｘ　ｐｌａｔｆｏｒｍ（図１７、配列番号６）とをＩｎ-Ｆｕｓｉｏｎした（Ｓｔｅｐ１、図１８）。なお、図１８、図１９、図２０における左向きの矢頭はｌｏｘＰ配列を示す。次に、Ｓｔｅｐ２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物とＳｔｅｐ１の産物とをＩｎ-Ｆｕｓｉｏｎした（Ｓｔｅｐ２、図１９）。さらにＳｔｅｐ３のプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物とＳｔｅｐ２の産物とをＩｎ-Ｆｕｓｉｏｎした（Ｓｔｅｐ３、図２０）。この産物をｐｆｌｏｘ－ＰＤ１とする。用いたプライマーを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの作製）
　ｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ-ＣＢｈ-ｈＳｐＣａｓ９ベクター（ｐＸ３３０ともいう。Ａｄｄｇｅｎｅ社製）に、左右のターゲット配列（ＰＡＭを含まない２０ｍｅｒ、図１５、Ｌ　ｔａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ：配列番号１３、Ｒ　ｔａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ：配列番号１４）をそれぞれ組み込み、ｐＸ３３０－ＰＤ－１-ＬとｐＸ３３０－ＰＤ－１-Ｒとした。
　具体的には、ターゲット配列にＢｂｓＩで切断される配列を付加したオリゴＤＮＡとそれに相補的なオリゴＤＮＡを合成した。この２種のオリゴＤＮＡをアニーリングさせた後、二本鎖ＤＮＡとしてＢｂｓＩを用いてｐＸ３３０に挿入した。図２１に模式図を示す。
（マウス受精卵へのプラスミドの導入）
　ｐｆｌｏｘ－ＰＤ１、ｐＸ３３０－ＰＤ－１－ＬおよびｐＸ３３０－ＰＤ－１－ＲをＣ５７ＢＬ／６受精卵前核に常法によりマイクロインジェクションした。受精卵を偽妊娠マウスの卵管内へ移植し、ファウンダーマウスを誕生させた。このファウンダーマウスをＣ５７ＢＬ６マウスと交配することにより、ヘテロ接合型ＰＤ－１fl/+マウスを作製した。さらにこのヘテロ接合型ＰＤ－１fl/+マウス同士の交配により、ホモ接合型ＰＤ－１fl/flマウスを作製した。
　マウスの尾部組織の一部より精製したゲノムＤＮＡに対して以下のプライマー（配列は図２２に記載）を用いて常法に従いＰＣＲを行うことにより、ジェノタイピングを行った。
ＰＤ１　Ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ＲｉＦ：配列番号１５
ＰＤ１　Ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ＲｉＲ：配列番号１６
ＰＤ１　Ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ＬｅＦ：配列番号１７
ＰＤ１　Ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ＬｅＲ：配列番号１８
　野生型マウス（ＷＴ）およびＰＤ－１　ｆｌｏｘｅｄマウス（ｆｌｏｘ）から得られたゲノムＤＮＡを制限酵素処理なしの場合（ｉｎｔａｃｔ）および制限酵素処理した場合（ＥｃｏＲＶ、ＡｓｃＩ）に得られるＰＣＲ産物のサイズを図２２に示す。得られたＰＣＲ産物のサイズによって、野生型マウス（ＷＴ）またはＰＤ－１　ｆｌｏｘｅｄマウスと判断した。
　ＰＤ－１　ｆｌｏｘｅｄマウスのゲノムにおけるＰｄｃｄ１のＤＮＡ配列を図２３に示す（配列番号１９）。また、野生型（ＷＴ）のＰＤ－１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の遺伝子配列（配列番号２０）とそれに対応するアミノ酸配列（配列番号２１）、およびＰＤ－１の２番目、３番目、および４番目のエクソンがＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムにより脱落した後に予測されるＰＤ－１　ｆｌｏｘｅｄマウスのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の遺伝子配列（配列番号２２）とそれに対応するアミノ酸配列（配列番号２３）を図２４に示す。
　作製したＰＤ－１fl/flマウスは正常に発育し、ｌｏｘＰ配列の挿入によりＰＤ－１遺伝子の調節は明らかに妨害されないことが示された。
＜ＰＤ－１fl/flＣＤ８creマウスの作製＞
　野生型マウスと戻し交配させたヘテロ接合型ＰＤ－１fl/+マウスおよびヘテロ接合型ＣＤ８creマウス（Ｃ５７ＢＬ／６－Ｔｇ（Ｃｄ８ａ－ｃｒｅ）１ｔａｎ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入手）を交配して、二重ヘテロ接合型ＰＤ－１fl/+ＣＤ８creマウスを作製した。ＣＤ８creマウスは、遺伝子改変により、ＣＤ８のプロモーターの下流にＣｒｅが導入されている。ＰＤ－１fl/+ＣＤ８creマウスとＰＤ－１fl/flマウス、およびＣＤ８creマウスを交配し、コンディショナルＰＤ－１ホモ接合マウス（ＰＤ－１fl/flＣＤ８creマウス、ＰＤ－１コンディショナルノックアウトマウス、ＰＤ－１－ｃＫＯマウスとも言う）を得た。概念図を図２５に示す。また、ＰＤ－１ヘテロ接合型（ＰＤ－１fl/+ＣＤ８cre）同腹子も得た（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ）。
　ＣＤ８cre、ＰＤ－１-/-、およびＰＤ－１flのジェノタイピングに使用したプライマー配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＰＤ－１fl/flＣＤ８creマウスのリンパ節において、ＰＤ－１遺伝子発現がＣＤ８陽性Ｔ細胞集団（ＣＤ４５+ＣＤ３+ＣＤ８+細胞）特異的に完全に消失していることを抗ＰＤ－１抗体（２９Ｆ．１Ａ１２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いたフローサイトメトリーにより確認した。
〔実施例３〕ＣＤ８陽性Ｔ細胞特異的ＰＤ－１コンディショナルノックアウトマウスを用いた乾癬様皮膚炎モデル
＜皮膚炎の惹起＞
　実施例１と同様にして、ＰＤ－１fl/flＣＤ８creマウス（ＰＤ－１－ｃＫＯ）５匹およびＰＤ－１fl/+ＣＤ８creマウス（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ）５匹にイミキモドを塗布した。
　塗布７日目の背部の写真を図２６に示す。イミキモドを塗布したＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌでは、軽度の紅斑および鱗屑が観察された。イミキモドを塗布したＰＤ－１－ｃＫＯでは高度の紅斑および鱗屑が観察された。
＜Ｅａｒ　Ｓｗｅｌｌｉｎｇ＞
　実施例１と同様にして評価を行った。
　Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ＣｔｒｌとのＰＤ－１－ｃＫＯのイミキモド塗布による耳の厚さの変化を図２７左に示した。ＰＤ－１－ｃＫＯの方がＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌよりも有意に耳が厚くなった。
＜皮膚における炎症の重症度＞
　実施例１と同様にして評価を行った。
　Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ＣｔｒｌとＰＤ－１－ｃＫＯのイミキモド塗布による炎症の重症度（ＰＡＳＩ　Ｓｃｏｒｅ）の変化を図２７右に示した。ＰＤ－１－ｃＫＯの方がＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌよりも有意に皮膚における炎症が重症であった。
＜病理組織学的所見＞
　実施例１と同様にして評価を行った。
　Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ＣｔｒｌとＰＤ－１－ｃＫＯのＨＥ染色した皮膚組織標本を図２８左に示す。ＰＤ－１－ｃＫＯで認められた表皮の肥厚、不全角化および過角化、角層直下の好中球による微小膿瘍は、Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌに比べて顕著であった。
＜表皮の厚さ＞
　実施例１と同様にして評価を行った。
　Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ＣｔｒｌとＰＤ－１－ｃＫＯの表皮の厚さを図２８右に示す。ＰＤ－１－ｃＫＯの方がＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌよりも表皮が有意に厚かった
＜ＣＤ８ａおよびＩＦＮ－γのｍＲＮＡ発現量＞
　Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ＣｔｒｌとＰＤ－１－ｃＫＯの耳を用い、実施例１の「サイトカインのｍＲＮＡ発現量」と同様にしてＣＤ８ａおよびＩＦＮ－γのｍＲＮＡ発現量を調べた。用いたＰｒｉｍｅ　ＴｉｍｅTM　ｑＰＣＲ　ｐｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｐｒｉｍｅｒｓのＡｓｓａｙ　ＮＯ.は、実施例１の「表皮と真皮におけるＣＤ８、ＩＦＮ－γ、ＣＸＣＬ９のｍＲＮＡ発現量」の項に記載した通りである。
　結果を図２９に示す。ＣＤ８ａおよびＩＦＮ－γのｍＲＮＡ発現量は、ＰＤ－１－ｃＫＯの方がＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌよりも有意に多かった。
＜リンパ節中のＣＤ８陽性細胞＞
　Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ＣｔｒｌとＰＤ－１－ｃＫＯから採取した流入領域リンパ節をメッシュ上ですり潰し、ピペッティングで個細胞化し、フィルターを通して単一細胞の懸濁液を調製した。Ｚｏｍｂｉｅ　ｆｉｘａｂｌｅ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｋｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いて染色を行い、死細胞を除いた。生細胞は、ＦＡＣＳ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（１％　ＢＳＡ、５ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で希釈した抗ＣＤ４５抗体（３０－Ｆ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ８抗体（５３－６．７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、および抗ＣＤ３ｅ抗体（１４５－２Ｃ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）と共にインキュベーションした。フローサイトメーターとしてＧａｌｌｉｏｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用い、データ解析はＦｌｏｗＪｏ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ７．６．５）で行い、ＣＤ４５陽性、ＣＤ３陽性、かつＣＤ８陽性の細胞集団をＣＤ８陽性Ｔ細胞として細胞数をカウントし、分離した。なお、抗ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ抗体（ＢＤ社製）、抗ＣＤ４抗体（Ｇｋ１．５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｂ２２０抗体（ＲＡ３－６Ｂ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて同様にインキュベーションし、ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ陽性、ＣＤ４陽性、またはＢ２２０陽性である細胞は除外した。また、抗ＰＤ－１抗体（２９Ｆ．１Ａ１２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いてＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ＣｔｒｌのＣＤ８陽性Ｔ細胞上におけるＰＤ－１発現を確認した。
　リンパ節中のＣＤ８陽性細胞数を図３０に示す。リンパ節中のＣＤ８陽性細胞数は、ＰＤ－１－ｃＫＯの方がＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌよりも有意に多かった。
＜細胞内のＩＦＮ－γとＧｚｍＢの発現量＞
　Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ＣｔｒｌとＰＤ－１－ｃＫＯの流入領域リンパ節から前述の通りに調製したリンパ節細胞の懸濁液を用いた。終濃度２５ｎｇ／ｍｌＰＭＡ、終濃度１μｇ／ｍｌ　Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎを加えたＲＰＭＩ　１６４０培地（１０％ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ、２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１００Ｕ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｍｏｎｅｎｓｉｎ（Ｇｏｌｇｉ　Ｓｔｏｐ、ＢＤ社製）を添加）で細胞を刺激した。５時間インキュベーションした後、抗ＣＤ８抗体（５３－６．７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ３ｅ抗体（１４５－２Ｃ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ４５抗体（３０－Ｆ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いて細胞表面のＣＤ８、ＣＤ３ｅ、およびＣＤ４５の染色を行った後、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ　Ｋｉｔ（ＢＤ社製）を用いて抗ＩＦＮ－γ抗体（ＸＭＧ１．２、ＢＤ社製）、抗Ｇｚｍ　Ｂ抗体（ＮＧＺＢ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）により、細胞内サイトカインの染色を行った。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ｍｉｎｕｓ－Ｏｎｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌをネガティブコントロールとして用いた。フローサイトメーターとしてＧａｌｌｉｏｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用い、データ解析はＦｌｏｗＪｏ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ７．６．５）で行った。ＣＤ４５陽性、ＣＤ３ｅ陽性かつＣＤ８陽性の生細胞をＣＤ８陽性Ｔ細胞とした。
　ＣＤ８陽性Ｔ細胞のうち、ＩＦＮ－γまたはＧｚｍ　Ｂを発現している細胞のヒストグラムを図３１左に示す。ＩＦＮ－γの場合、ＰＤ－１－ｃＫＯ由来のＣＤ８陽性Ｔ細胞は、Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌおよびネガティブコントロールに比べてピークが右にずれており、細胞内のＩＦＮ－γ量が多い細胞がＰＤ－１－ｃＫＯに多いことが明らかになった。また、Ｇｚｍ　Ｂについても、ＰＤ－１－ｃＫＯ由来のＣＤ８陽性Ｔ細胞は、Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌおよびネガティブコントロールに比べてピークが右にずれており、細胞内のＧｚｍ　Ｂ量の多い細胞がＰＤ－１－ｃＫＯに多いことが明らかになった。図３１右は、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を示す。ＩＦＮ－γについて、ＭＦＩはＰＤ－１－ｃＫＯの方がＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌよりも有意に大きかった。すなわち、細胞内のＩＦＮ－γ量は、ＰＤ－１－ｃＫＯの方がＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌよりも有意に多いことが明らかになった。また、Ｇｚｍ　Ｂについても、ＭＦＩはＰＤ－１－ｃＫＯの方がＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌよりも有意に大きく、細胞内のＧｚｍ　Ｂは、ＰＤ－１－ｃＫＯの方がＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌよりも有意に多いことが明らかになった。
　〔実施例４〕コンベンショナルノックアウトマウスを用いた乾癬様皮膚炎モデルへの抗ＩＬ－６Ｒ抗体の投与
＜皮膚炎の惹起と抗ＩＬ－６Ｒ抗体の投与＞
　ＰＤ－１コンベンショナルノックアウトマウス（ＰＤ－１-/-）と、野生型マウス（ＷＴ）を１０匹ずつ準備した。実施例１と同様にして全てのマウスにイミキモドを塗布し、皮膚炎を惹起した。イミキモド塗布開始の前日である塗布０日目に抗ＩＬ－６Ｒ抗体（ＭＲ１６－１、中外製薬株式会社製）をマウス一匹あたり２ｍｇ静脈注射し、確実に注射されたと確認できたマウスで解析を実施した。この抗体は、マウスＩＬ－６Ｒのα鎖に対するラットＩｇＧ１モノクローナル抗体である。コントロールとしてはＩｓｏｔｙｐｅ　ＩｇＧ　ｃｏｎｔｒｏｌ（ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を投与した。
　コントロール（ＩｇＧ　Ｃｔｒｌ）を投与したＷＴマウス、コントロール（ＩｇＧ　Ｃｔｒｌ）を投与したＰＤ－１-/-マウス、および抗ＩＬ－６Ｒ抗体（ＭＲ１６－１）を投与したＰＤ－１-/-マウスの塗布７日目の背部の写真を図３２に示す。コントロールのＷＴマウスでは、軽度の紅斑および鱗屑が観察された。コントロールのＰＤ－１-/-マウスでは高度の紅斑および鱗屑が観察された。一方、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与のＰＤ－１-/-マウスの紅斑および鱗屑は軽度なものであった。ＰＤ－１依存的な皮膚炎の悪化は抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与により軽減されることが明らかになった。
＜Ｅａｒ　Ｓｗｅｌｌｉｎｇ＞
　実施例１と同様にして、測定した。
　コントロールのＷＴマウス、コントロールのＰＤ－１-/-マウス、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与のＰＤ－１-/-マウスのイミキモド塗布による耳の厚さの変化を図３３左に示す。コントロールのＰＤ－１-/-マウスでは有意に耳が厚くなったが、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与した場合は、コントロールのＷＴマウスと同程度の耳の厚さであった。ＰＤ－１依存的な耳の肥厚は、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与により軽減されることが明らかになった。
＜皮膚における炎症の重症度＞
　実施例１と同様にして、測定した。
　コントロールのＷＴマウス、コントロールのＰＤ－１-/-マウス、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与のＰＤ－１-/-マウスのイミキモド塗布による炎症の重症度（ＰＡＳＩ　Ｓｃｏｒｅ）の変化を図３３右に示した。コントロールのＰＤ－１-/-マウスでは有意に炎症が重症であったが、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与した場合は、コントロールのＷＴマウスと同程度の重症度であった。ＰＤ－１依存的な皮膚の炎症の悪化は、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与により軽減されることが明らかになった。
＜病理組織学的所見＞
　実施例１と同様にして行った。
　コントロールのＷＴマウス、コントロールのＰＤ－１-/-マウス、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与のＰＤ－１-/-マウスのＨＥ染色した皮膚組織標本を図３４に示す。コントロールのＰＤ－１-/-マウスでは表皮の肥厚、不全角化および過角化が認められ、角層直下には好中球による微小膿瘍が認められたが、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与した場合のこれらの所見は、コントロールのＷＴマウスと同程度に軽減していた。ＰＤ－１依存的な表皮の肥厚、不全角化および過角化、好中球による微小膿瘍等は、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与により軽減されることが明らかになった。
＜表皮の厚さ＞
　実施例１と同様にして行った。コントロールのＷＴマウス、コントロールのＰＤ－１-/-マウス、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与のＰＤ－１-/-マウスの表皮の厚さを図３５左に示す。コントロールのＰＤ－１-/-マウスではＷＴマウスに比べて有意に表皮が厚かったが、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与した場合は、コントロールのＷＴマウスと同程度の厚さであった。ＰＤ－１依存的な表皮の肥厚は、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与により軽減されることが明らかになった。
＜微小膿瘍＞
　実施例１と同様にして行った。
　コントロールのＷＴマウス、コントロールのＰＤ－１-/-マウス、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与のＰＤ－１-/-マウスの微小膿瘍の数を図３５右に示す。コントロールのＰＤ－１-/-マウスではＷＴマウスに比べて有意に微小膿瘍が多かったが、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与した場合は、コントロールのＷＴマウスと同程度の数であった。ＰＤ－１依存的な微小膿瘍の増加は、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与により軽減されることがわかった。
＜サイトカインのｍＲＮＡ発現量＞
　実施例１と同様にして行った。
　乾癬への関与が報告されているサイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－２３ａ、ＩＬ－１７ａ）のｍＲＮＡの定量結果を図３６に示す。ＩＬ－６のｍＲＮＡ発現量は、コントロールのＰＤ－１-/-マウスではＷＴマウスに比べて有意に多かったが、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与した場合は、コントロールのＷＴマウスと同程度の量であった。ＰＤ－１依存的なＩＬ－６産生量の増加は、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与により軽減されることが明らかになった。また、ＩＬ－２３ａについても上述と同様の傾向であった。ＩＬ－１７ａについては、コントロールのＰＤ－１-/-マウスとＷＴマウスとに有意差は見られないが、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与した場合は、コントロールよりも有意に減少することが明らかになった。
＜血清中サイトカイン量＞
　マウスの顎下静脈から出血させて血液を採取し、血清を分離し、使用するまで－２０℃で保存した。血清中サイトカイン（ＩＬ－６、ＩＬ－２３Ａ、ＩＬ－１７Ａ）量の測定は、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸTM　ＭＡＰ　Ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｂｉｏ－ＰｌｅｘTM　Ｌｕｍｉｎｅｘ　２００　ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いて、製品プロトコルに従って行った。
　定量結果を図３７に示す。ＩＬ－６量は、コントロールのＰＤ－１-/-マウスではＷＴマウスに比べて有意に多かったが、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与した場合は、顕著に減少した。ＰＤ－１依存的なＩＬ－６産生量の増加は、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与により軽減されることが明らかになった。また、ＩＬ－２３Ａ、ＩＬ－１７Ａについても上述と同様の傾向であった。
　〔実施例５〕ＣＤ８陽性Ｔ細胞特異的ＰＤ－１コンディショナルノックアウトマウスを用いた乾癬様皮膚炎モデルへの抗ＩＬ－６Ｒ抗体の投与
＜皮膚炎の惹起と抗ＩＬ－６Ｒ抗体の投与＞
　ＰＤ－１fl/flＣＤ８creマウス（ＰＤ－１－ｃＫＯ）１２匹とＰＤ－１fl/+ＣＤ８creマウス（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ）１０匹を準備し、それぞれを２群に割付した。実施例４と同様にして全てのマウスにイミキモドを塗布し、抗ＩＬ－６Ｒ抗体（ＭＲ１６－１、中外製薬株式会社製）またはコントロール（Ｉｓｏｔｙｐｅ　ＩｇＧ　ｃｏｎｔｒｏｌ）を投与した。
　コントロール（ＩｇＧ　Ｃｔｒｌ）または抗ＩＬ－６Ｒ抗体を投与した、Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ＣｔｒｌマウスとＰＤ－１－ｃＫＯマウスの塗布７日目の背部の写真を図３８に示す。Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスでは、軽度の紅斑および鱗屑が観察され、コントロールまたは抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与による差は見られなかった。一方、コントロールのＰＤ－１－ｃＫＯマウスでは高度の紅斑および鱗屑が観察された。抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与のＰＤ－１－ｃＫＯマウスの紅斑および鱗屑は軽度なものであった。ＰＤ－１依存的な皮膚炎の悪化は抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与により軽減されることが明らかになった。
＜Ｅａｒ　Ｓｗｅｌｌｉｎｇ＞
　実施例１と同様にして、測定した。
　コントロール（ＩｇＧ　Ｃｔｒｌ）または抗ＩＬ－６Ｒ抗体を投与した、Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ＣｔｒｌマウスとＰＤ－１－ｃＫＯマウスのイミキモド塗布による耳の厚さの変化を図３９左に示す。Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスでは、コントロールまたは抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与による差は見られなかった。コントロールのＰＤ－１－ｃＫＯマウスでは有意に耳が厚くなったが、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与した場合は、Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスと同程度の耳の厚さであった。ＰＤ－１依存的な耳の肥厚は、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与により軽減されることが明らかになった。
＜皮膚における炎症の重症度＞
　実施例１と同様にして、測定した。
　コントロール（ＩｇＧ　Ｃｔｒｌ）または抗ＩＬ－６Ｒ抗体を投与した、Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ＣｔｒｌマウスとＰＤ－１－ｃＫＯマウスのイミキモド塗布による炎症の重症度（ＰＡＳＩ　Ｓｃｏｒｅ）の変化を図３９右に示した。Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスでは、コントロールまたは抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与による差は見られなかった。コントロールのＰＤ－１－ｃＫＯマウスでは有意に炎症が重症であったが、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与した場合は、Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスと同程度の重症度であった。ＰＤ－１依存的な皮膚の炎症の悪化は、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与により軽減されることが明らかになった
＜病理組織学的所見＞
　実施例１と同様にして行った。
　コントロール（ＩｇＧ　Ｃｔｒｌ）または抗ＩＬ－６Ｒ抗体を投与した、Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ＣｔｒｌマウスとＰＤ－１－ｃＫＯマウスのＨＥ染色した皮膚組織標本を図４０に示す。Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスでは、コントロールまたは抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与による差は見られなかった。コントロールのＰＤ－１－ｃＫＯマウスでは表皮の肥厚、不全角化および過角化が認められ、角層直下には好中球による微小膿瘍が認められたが、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与した場合のこれらの所見は、Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスと同程度に軽減していた。ＰＤ－１依存的な表皮の肥厚、不全角化および過角化、好中球による微小膿瘍等は、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与により軽減されることが明らかになった。
＜表皮の厚さ＞
　実施例１と同様にして行った。
　コントロール（ＩｇＧ　Ｃｔｒｌ）または抗ＩＬ－６Ｒ抗体を投与した、Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ＣｔｒｌマウスとＰＤ－１－ｃＫＯマウスの表皮の厚さを図４１左に示す。Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスでは、コントロールまたは抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与による差は見られなかった。コントロールのＰＤ－１－ｃＫＯマウスではＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスに比べて有意に表皮が厚かったが、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与した場合は、Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスと同程度の厚さであった。ＰＤ－１依存的な表皮の肥厚は、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与により軽減されることが明らかになった。
＜免疫染色＞
　実施例１と同様にして行った。
　コントロール（ＩｇＧ　Ｃｔｒｌ）または抗ＩＬ－６Ｒ抗体を投与した、Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ＣｔｒｌマウスとＰＤ－１－ｃＫＯマウスの表皮中のＣＤ８陽性Ｔ細胞の数を図４１右に示す。Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスでは、コントロールまたは抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与による差は見られなかった。コントロールのＰＤ－１－ｃＫＯマウスではＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスに比べて有意に表皮中にＣＤ８陽性Ｔ細胞が多かったが、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与した場合は、有意に減少した。ＰＤ－１依存的な表皮へＣＤ８陽性Ｔ細胞浸潤は、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与により軽減されることが明らかになった。
　＜リンパ節中のＣＤ８陽性細胞＞
　実施例３と同様にして行った。
　コントロール（ＩｇＧ　Ｃｔｒｌ）または抗ＩＬ－６Ｒ抗体を投与した、Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ＣｔｒｌマウスとＰＤ－１－ｃＫＯマウスのリンパ節中のＣＤ８陽性細胞数を図４２に示す。Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスでは、コントロールまたは抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与による差は見られなかった。コントロールのＰＤ－１－ｃＫＯマウスではＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスに比べて有意にリンパ節中のＣＤ８陽性細胞が多かったが、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与した場合は、有意に減少した。ＰＤ－１依存的なリンパ節へのＣＤ８陽性細胞浸潤は、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与により軽減されることが明らかになった。
＜ＣＤ８ａおよびＩＦＮ－γのｍＲＮＡ発現量＞
　実施例３と同様にして行った。
　コントロール（ＩｇＧ　Ｃｔｒｌ）または抗ＩＬ－６Ｒ抗体を投与した、Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　ＣｔｒｌマウスとＰＤ－１－ｃＫＯマウスの耳におけるＣＤ８ａおよびＩＦＮ－γのｍＲＮＡ発現量を図４３に示す。ＣＤ８ａのｍＲＮＡ発現量はＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスでは、コントロールまたは抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与による差は見られなかった。コントロール投与のＰＤ－１－ｃＫＯマウスではＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスに比べて有意にＣＤ８ａのｍＲＮＡが多かったが、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与した場合は有意に減少した。ＰＤ－１依存的なＣＤ８ａ発現量増加は、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与により軽減されることが明らかになった
　ＩＦＮ－γのｍＲＮＡ発現量は、Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスでは、コントロールまたは抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与による差は見られなかった。コントロール投与のＰＤ－１－ｃＫＯマウスではＬｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌマウスに比べて有意にＩＦＮ－γのｍＲＮＡが多かったが、抗ＩＬ－６Ｒ抗体投与した場合は減少する傾向にあった。
　〔実施例６〕ランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１コンディショナルノックアウトマウスの作製
＜ＰＤ－Ｌ１fl/flマウスの作製＞
　野生型マウス（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊは、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｊａｐａｎより購入した。
（デザイン）
　筑波大学実験動物資源センターのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、ＰＤ－Ｌ１遺伝子の前後に二つのｌｏｘＰ配列（５’－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ－３'：配列番号１）を挿入し、遺伝子組み換えマウスを作製した（ＰＤ－Ｌ１　ｆｌｏｘｅｄマウス、またはＰＤ－Ｌ１fl/flマウスという）。概念図を図４４に示す。
　図４５に野生型マウスのゲノムにおけるＰＤ－Ｌ１遺伝子（ＣＤ２７４）のエクソン（ｂｏｘで示す）の位置とＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのターゲット配列、ＰＡＭ配列の検索結果を示す。マウスＣＤ２７４は１９番染色体上にあり、７個のエクソンから構成される。１番目のエクソンにＰＤ－Ｌ１タンパク質の開始コドンが存在しているので、２番目および３番目のエクソンをＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを利用して脱落させることにより、完全なＰＤ－Ｌ１タンパク質が産出されないようにするため、エクソン２－３を含む領域の両端にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いてｌｏｘＰ配列を挿入するように設計した。具体的には、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とＣａｓ９発現カセットを１つのプラスミド内に含むｐＸ３３０ベクター（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクター）を受精卵に導入して、目的のｓｇＲＮＡとＣａｓ９　ｍＲＮＡを同時に発現させてマウスＰＤ－Ｌ１ゲノムを目的の位置で切断し、さらにｌｏｘＰ配列を含むｐｆｌｏｘ－ＰＤ－Ｌ１（ドナーベクター）をドナーＤＮＡとして併せて受精卵に導入することで切断部位にｌｏｘＰ配列が挿入されるようにした。
（ドナーベクターの作製）
　エクソン２－３を含む領域の５’側のＣＲＩＳＰＲ標的サイトをＬｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲサイト、３’側のＣＲＩＳＰＲ標的サイトをｒｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲサイトとし、Ｌｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲ予測切断部位からその上流（５’）側１３８２ｂｐまでを５’アーム、ｒｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲ予測切断部位からその下流（３’）側１０８５ｂｐまでを３'アーム、Ｌｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲ予測切断部位とｒｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲ予測切断部位の間３１９７ｂｐをセントラルアームとした。Ｌｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲ標的サイトとｒｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲ標的サイトの配列（Ｌ　ｔａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ：配列番号３１、Ｒ　ｔａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ：配列番号３２）を図４５に示す。オフターゲットを切断するリスクを低減するため、左右のターゲット配列およびＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ／）を用いて検索し、２０塩基のターゲット配列がＣＤ２７４ゲノム内に一か所しかないことを確認した。
　まず、以下の手順により、エクソン２－３の外側にｌｏｘＰ配列を含み、５’アーム、セントラルアーム、３’アームの配列を含むドナーベクターを作製した。まず、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスのゲノムＤＮＡ（図４６、配列番号３３）をテンプレートとし、Ｓｔｅｐ１のプライマーを用いて常法に従いＰＣＲを行った。図Ｃ中の５’ａｒｍ（細破線）が５’アームのテンプレートとして使用されたＢ６Ｊゲノムの配列、Ｃｅｎｔｒａｌ　ａｒｍ（粗破線）がセントラルアームのテンプレートとしてＢ６Ｊゲノムの使用された配列、３’ａｒｍ（ゴシック体）が３’アームのテンプレートとして使用されたＢ６Ｊゲノムの配列である。
　得られたＰＣＲ産物とｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔを基盤に独自に作製したベクター（ｐｆｌｏｘ　ｐｌａｔｆｏｒｍ（図１７、配列番号６）とをＩｎ-Ｆｕｓｉｏｎした（Ｓｔｅｐ１、図４７）。なお、図４７、図４８、図４９における左向きの矢頭はｌｏｘＰ配列を示す。次に、Ｓｔｅｐ２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物とＳｔｅｐ１の産物とをＩｎ-Ｆｕｓｉｏｎした（Ｓｔｅｐ２、図４８）。さらにＳｔｅｐ３のプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物とＳｔｅｐ２の産物とをＩｎ-Ｆｕｓｉｏｎした（Ｓｔｅｐ３、図４９）。この産物をｐｆｌｏｘ－ＰＤ－Ｌ１とする。用いたプライマーを表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターの作製）
　ｐＸ３３０－Ｕ６－Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ-ＣＢｈ-ｈＳｐＣａｓ９ベクター（ｐＸ３３０ともいう。Ａｄｄｇｅｎｅ社製）に、左右のターゲット配列（Ｌ　ｔａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ：配列番号４０、Ｒ　ｔａｒｇｅｔ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ：配列番号４１）をそれぞれ組み込み、ｐＸ３３０－ＰＤ－Ｌ１-ＬとｐＸ３３０－ＰＤ－Ｌ１-Ｒとした。
　具体的には、ターゲット配列にＢｂｓＩで切断される配列を付加したオリゴＤＮＡとそれに相補的なオリゴＤＮＡを合成した。この２種のオリゴＤＮＡをアニーリングさせた後、二本鎖ＤＮＡとしてＢｂｓＩを用いてｐＸ３３０に挿入した。図５０に模式図を示す。
（マウス受精卵へのプラスミドの導入）
　ｐｆｌｏｘ－ＰＤ１、ｐＸ３３０－ＰＤ－Ｌ１－ＬおよびｐＸ３３０－ＰＤ－Ｌ１－ＲをＣ５７ＢＬ／６受精卵前核に常法によりマイクロインジェクションした。受精卵を偽妊娠マウスの卵管内へ移植し、ファウンダーマウスを誕生させた。このファウンダーマウスをＣ５７ＢＬ６マウスと交配することにより、ヘテロ接合型ＰＤ－Ｌ１fl/+マウスを作製した。さらにこのヘテロ接合型ＰＤ－Ｌ１fl/+マウス同士の交配により、ホモ接合型ＰＤ－Ｌ１fl/flマウスを作製した。
　マウスの尾部組織の一部より精製したゲノムＤＮＡに対して以下のプライマー（配列は図５１に記載）を用いて常法に従いＰＣＲを行うことにより、ジェノタイピングを行った。
ＰＤＬ１　Ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ＲｉＦ：配列番号４２
ＰＤＬ１　Ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ＲｉＲ：配列番号４３
ＰＤＬ１　Ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ＬｅＦ：配列番号４４
ＰＤＬ１　Ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ＬｅＲ：配列番号４５
　野生型マウス（ＷＴ）およびＰＤ－Ｌ１　ｆｌｏｘｅｄマウス（ＰＤ－Ｌ１　ｆｌｏｘｅｄ）から得られたゲノムＤＮＡを制限酵素処理なしの場合（ｉｎｔａｃｔ）および制限酵素処理した場合（ＥｃｏＲＶ、ＡｓｃＩ）に得られるＰＣＲ産物のサイズを図５１に示す。得られたＰＣＲ産物のサイズによって、野生型マウス（ＷＴ）またはＰＤ－Ｌ１　ｆｌｏｘｅｄマウスと判断した。
　ＰＤ－Ｌ１　ｆｌｏｘｅｄマウスのゲノムにおけるＣＤ２７４のＤＮＡ配列を図５２に示す（配列番号４６）。また、野生型（ＷＴ）のＰＤ－Ｌ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の遺伝子配列（配列番号４７）とそれに対応するアミノ酸配列（配列番号４８）、およびＰＤ－Ｌ１の２番目および３番目のエクソンがＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムにより脱落した後に予測される、ＰＤ－Ｌ１　ｆｌｏｘｅｄマウスのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の遺伝子配列（配列番号４９）とそれに対応するアミノ酸配列（配列番号５０）を図５３に示す。
　作製したＰＤ－Ｌ１fl/flマウスは正常に発育し、ｌｏｘＰ配列の挿入によりＰＤ－Ｌ１遺伝子の調節は明らかに妨害されないことが示された。
＜ＰＤ－Ｌ１fl/flＬａｎｇｅｒｉｎcreマウスの作製＞
　野生型マウスと戻し交配させたヘテロ接合型ＰＤ－Ｌ１fl/+マウスおよびヘテロ接合型Ｌａｎｇｅｒｉｎcreマウス（Ｄａｎｉｅｌ　Ｈ　Ｋａｐｌａｎ，ｅｔ．　ａｌ．　”Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ／ｐａｒａｃｒｉｎｅ　ＴＧＦｂｅｔａ１　ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ　ｃｅｌｌｓ“　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ．　２００７　Ｏｃｔ　２７；２０４（１１）：２５４５－２５５２記載。Ｋａｐｌａｎ博士より入手）を交配して、二重ヘテロ接合型ＰＤ－Ｌ１fl/+Ｌａｎｇｅｒｉｎcreマウスを作製した。Ｌａｎｇｅｒｉｎcreマウスは、遺伝子改変により、Ｌａｎｇｅｒｉｎのプロモーターの下流にＣｒｅが導入されている。Ｌａｎｇｅｒｉｎcreマウスは、樹状細胞にはＣｒｅが発現せず、ランゲルハンス細胞特異的にＣｒｅが発現することが特徴であるＰＤ－Ｌ１fl/+ＬａｎｇｅｒｉｎcreマウスとＰＤ－Ｌ１fl/flマウス、およびＬａｎｇｅｒｉｎcreマウスを交配し、コンディショナルＰＤ－Ｌ１ホモ接合マウス（ＰＤ－Ｌ１fl/flＬａｎｇｅｒｉｎcreマウス、ＰＤ－Ｌ１コンディショナルノックアウトマウス、ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯマウスとも言う）を得た。概念図を図５４に示す。また、ＰＤ－Ｌ１ヘテロ接合型（ＰＤ－Ｌ１fl/+Ｌａｎｇｅｒｉｎcre）同腹子も得た（Ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ　Ｃｔｒｌ）。
　Ｌａｎｇｅｒｉｎcre、ＰＤ－Ｌ１-/-、およびＰＤ－Ｌ１flのジェノタイピングに使用したプライマー配列を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＰＤ－Ｌ１fl/flＬａｎｇｅｒｉｎcreマウスのリンパ節において、ＰＤ－Ｌ１遺伝子発現がランゲルハンス細胞集団特異的に完全に消失していることを抗ＰＤ－Ｌ１抗体（１０Ｆ．９Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いたフローサイトメトリーにより確認した。
〔実施例７〕ランゲルハンス細胞特異的ＰＤ－Ｌ１コンディショナルノックアウトマウスを用いた乾癬様皮膚炎モデル
＜皮膚炎の惹起＞
　実施例１と同様にして、ＰＤ－Ｌ１fl/flＬａｎｇｅｒｉｎcreマウス（ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯ）５匹およびその同腹子ＰＤ－Ｌ１fl/+Ｌａｎｇｅｒｉｎcreマウス（Ｃｔｒｌ）５匹にイミキモドを塗布した。
＜ランゲルハンス細胞および樹状細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現＞
　塗布５日目に、マウスから採取した耳をメッシュ上ですり潰し、ピペッティングで個細胞化し、フィルターを通して単一細胞の懸濁液を調製した。Ｚｏｍｂｉｅ　ｆｉｘａｂｌｅ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ｋｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いて染色を行い、死細胞を除いた。生細胞は、ＦＡＣＳ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（１％　ＢＳＡ、５ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で希釈した抗ＰＤ－Ｌ１抗体（１０Ｆ．９Ｇ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ抗体（Ｍ５／１１４．１５．２、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、抗Ｌａｎｇｅｒｉｎ抗体（４Ｃ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、ＣＤ１１ｂ抗体（Ｍ１／７０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、ＣＤ１１ｃ抗体（Ｎ４１８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）と共にインキュベーションした。フローサイトメーターとしてＧａｌｌｉｏｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用い、データ解析はＦｌｏｗＪｏ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ７．６．５）で行い、ＣＤ４５陽性、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ陽性、ＣＤ１１ｃ陽性生細胞のうち、Ｌａｎｇｅｒｉｎ陽性、ＣＤ１１ｂ陽性の細胞集団をランゲルハンス細胞（ＬＣｓ）として、Ｌａｎｇｅｒｉｎ陽性、ＣＤ１０３陽性の細胞集団をＬａｎｇｅｒｉｎ陽性樹状細胞（Ｌａｎｇｅｒｉｎ+ｄＤＣｓ）として、また、Ｌａｎｇｅｒｉｎ陰性の細胞集団をＬａｎｇｅｒｉｎ陰性樹状細胞（Ｌａｎｇｅｒｉｎ-ｄＤＣｓ）として、細胞数をカウントした。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ｍｉｎｕｓ－Ｏｎｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＦＭＯ　Ｃｔｒｌ）をネガティブコントロールとした。
　結果を図５５に示す。イミキモドを塗布していない（ＩＭＱ（－））ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯおよびＣｔｒｌのランゲルハンス細胞には、ＰＤ－Ｌ１は発現していなかったが、Ｌａｎｇｅｒｉｎ陽性樹状細胞およびＬａｎｇｅｒｉｎ陰性樹状細胞には、ＰＤ－Ｌ１が発現していた。イミキモドを塗布すると（ＩＭＱ（＋））、ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯのランゲルハンス細胞にはＰＤ－Ｌ１は発現しないままであったが、Ｃｔｒｌのランゲルハンス細胞にはＰＤ－Ｌ１が発現していた。ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯおよびＣｔｒｌのＬａｎｇｅｒｉｎ陽性樹状細胞およびＬａｎｇｅｒｉｎ陰性樹状細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現は、イミキモドを塗布してもほとんど変化しなかった。Ｃｔｒｌにおいては、イミキモド塗布により、ランゲルハンス細胞のＰＤ－Ｌ１の発現が誘導されることが明らかになった。
　塗布５日目の背部の写真を図５６に示す。イミキモドを塗布していない（Ｖｅｈｉｃｌｅ）ＣｔｒｌとＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯとでは、皮膚の状態に目立った差はなかった。イミキモドを塗布した（ＩＭＱ）Ｃｔｒｌでは、軽度の紅斑および鱗屑が観察された。イミキモドを塗布したＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯでは高度の紅斑および鱗屑が観察された。
＜Ｅａｒ　Ｓｗｅｌｌｉｎｇ＞
　実施例１と同様にして評価を行った。
　ＣｔｒｌとＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯのイミキモド塗布による耳の厚さの変化を図５７上に示した。イミキモドを塗布していない（Ｖｅｈｉｃｌｅ）ＣｔｒｌとＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯとでは、耳の厚さに目立った差はなかった。イミキモドを塗布した場合、ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯの方がＣｔｒｌよりも耳が厚くなった。
＜皮膚における炎症の重症度＞
　実施例１と同様にして評価を行った。
　ＣｔｒｌとＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯのイミキモド塗布による炎症の重症度（ＰＡＳＩ　Ｓｃｏｒｅ）の変化を図５７下に示した。イミキモドを塗布していない（Ｖｅｈｉｃｌｅ）ＣｔｒｌとＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯとでは、炎症の重症度に目立った差はなかった。イミキモドを塗布した場合、ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯの方がＣｔｒｌよりも皮膚における炎症が有意に重症であった。
＜病理組織学的所見＞
　実施例１と同様にして評価を行った。
　ＣｔｒｌとＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯのＨＥ染色した皮膚組織標本を図５８に示す。イミキモドを塗布していない（Ｖｅｈｉｃｌｅ）ＣｔｒｌとＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯとでは、皮膚組織の形態に目立った差はなかった。イミキモドを塗布した（ＩＭＱ）ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯでは、Ｃｔｒｌに比べて、表皮の肥厚、不全角化および過角化、角層直下の好中球による微小膿瘍が顕著に認められた。
＜表皮の厚さ＞
　実施例１と同様にして評価を行った。
　ＣｔｒｌとＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯの表皮の厚さを図５９に示す。イミキモドを塗布していない（Ｖｅｈｉｃｌｅ）ＣｔｒｌとＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯとでは、表皮の厚さに差はなかったが、イミキモドを塗布した（ＩＭＱ）場合、ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯの方がＣｔｒｌよりも表皮が有意に厚かった。
＜サイトカインのｍＲＮＡ発現量＞
　実施例１の「サイトカインのｍＲＮＡ発現量」と同様にして、イミキモドを塗布したＣｔｒｌとＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯにおける、ＩＬ－６、ＩＬ－１７ａおよびＩＬ－２３ａのｍＲＮＡ発現量を調べた。
　結果を図６０に示す。ＩＬ－６、ＩＬ－１７ａおよびＩＬ－２３のｍＲＮＡ発現量は、ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯの方がＣｔｒｌよりも多かった。特に、ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯにおけるＩＬ－１７ａのｍＲＮＡ発現量は、Ｃｔｒｌに比べて有意に多かった。この結果から、ランゲルハンス細胞に発現しているＰＤ－Ｌ１が、Ｔｈ１７細胞のサイトカイン産生を制御していることが示唆された。そこで、次に、Ｔｈ１７細胞の１つであるγδＴ細胞について解析を行った。
＜γδＴ細胞の活性化＞
　塗布４日目に、マウスから採取した耳をメッシュ上ですり潰し、ピペッティングで個細胞化し、フィルターを通して単一細胞の懸濁液を調製した。終濃度２５ｎｇ／ｍｌＰＭＡ、終濃度１μｇ／ｍｌ　Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎを加えたＲＰＭＩ　１６４０培地（１０％ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ、２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１００Ｕ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｍｏｎｅｎｓｉｎ（Ｇｏｌｇｉ　Ｓｔｏｐ、ＢＤ社製）を添加）で細胞を刺激した。５時間インキュベーションした後、抗ＣＤ４５抗体（３０－Ｆ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗ＴＣＲβ抗体（Ｈ５７－５９７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗ＴＣＲγδ抗体（ＧＬ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ３ｅ抗体（１４５－２Ｃ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ６９抗体（Ｈ１．２Ｆ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製））を用いて細胞表面のＣＤ４５、ＴＣＲβ、ＴＣＲγδおよびＣＤ６９の染色を行った後、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ　Ｋｉｔ（ＢＤ社製）を用いて抗ＩＬ－１７Ａ抗体（ＴＣ１１－１８Ｈ１０．１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）により、細胞内サイトカインの染色を行った。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ｍｉｎｕｓ－Ｏｎｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌをネガティブコントロールとして用いた。フローサイトメーターとしてＧａｌｌｉｏｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用い、データ解析はＦｌｏｗＪｏ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ７．６．５）で行った。
　ＣＤ４５陽性生細胞でゲートをかけた場合の（Ｇａｔｅｄ　ＣＤ４５+　ｌｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ）、ＴＣＲβとＴＣＲγδを発現している細胞のヒストグラムを図６１左に示す。ＴＣＲγδを低いレベルで発現しているＣＤ４５陽性生細胞は、Ｃｔｒｌでは０．７９％、ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯでは２．０３％であり、ＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯの方が多かった。また、ＣＤ４５陽性生細胞（ＣＤ４５+　ｌｉｖｅ　ｃｅｌｌ）に対する、ＴＣＲγδを低いレベルで発現している細胞（γδlowＴｃｅｌｌ）の割合（％）のグラフを図６１中央に示す。ＣＤ４５+　ｌｉｖｅ　ｃｅｌｌに対する、γδlowＴｃｅｌｌの割合（％）は、Ｃｔｒｌに比べてＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯの方が有意に多かった。さらに、γδlowＴｃｅｌｌに対する、ＣＤ６９を高いレベルで発現している細胞（ＣＤ６９hi）の割合（％）のグラフを図６１右から２番目に示す。グラフ縦軸の「ＣＤ６９hiγδlowＴｃｅｌｌ」は、ＴＣＲγδを低いレベルで発現している細胞（γδlowＴｃｅｌｌ）に対する、ＣＤ６９を高いレベルで発現している細胞（ＣＤ６９hiγδlowＴｃｅｌｌ）の割合（％）である。ＴＣＲγδを低いレベルで発現している細胞に対する、ＣＤ６９を高いレベルで発現している細胞（ＣＤ６９hiγδlowＴｃｅｌｌ）の割合（％）は、Ｃｔｒｌに比べてＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯの方が有意に多かった。また、γδlowＴｃｅｌｌにおける細胞内のＩＬ－１７Ａ量のグラフを図６１右に示す。グラフの縦軸は、蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）である。γδlowＴｃｅｌｌにおける細胞内のＩＬ－１７Ａ量は、Ｃｔｒｌに比べてＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯの方が有意に多かった。
　これらの結果から、ランゲルハンス細胞上に発現しているＰＤ－Ｌ１が、皮膚におけるＩＬ－１７Ａを産生するγδＴ細胞を活性化していることが明らかになった。
＜細胞内のＩＦＮ－γとＧｚｍＢの発現量＞
　マウスの流入領域リンパ節から実施例３の通りに調製したリンパ節細胞の懸濁液を用いた。終濃度２５ｎｇ／ｍｌＰＭＡ、終濃度１μｇ／ｍｌ　Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎを加えたＲＰＭＩ　１６４０培地（１０％ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ、２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１００Ｕ／ｍｌ　ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｍｏｎｅｎｓｉｎ（Ｇｏｌｇｉ　Ｓｔｏｐ、ＢＤ社製）を添加）で細胞を刺激した。４時間インキュベーションした後、抗ＴＣＲγδ抗体（ＧＬ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ３ｅ抗体（１４５－２Ｃ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、抗ＣＤ６９抗体（Ｈ１．２Ｆ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、および抗ＣＣＲ６（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　６）抗体（２９－２Ｌ１７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）を用いて細胞表面のＴＣＲγδ、およびＣＤ６９の染色を行った後、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ　Ｋｉｔ（ＢＤ社製）を用いて抗ＩＬ－１７Ａ抗体（ＴＣ１１－１８Ｈ１０．１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）により、細胞内の染色を行った。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ｍｉｎｕｓ－Ｏｎｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌをネガティブコントロールとして用いた。フローサイトメーターとしてＧａｌｌｉｏｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用い、データ解析はＦｌｏｗＪｏ　ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ７．６．５）で行った。
　ＣＤ６９hiγδlowＴｃｅｌｌの数を図６２左に示す。ＣＤ６９hiγδlowＴｃｅｌｌ（図中では、ＣＤ６９hiγδＴｃｅｌｌ）の数は、イミキモド塗布していない場合はＣｔｒｌとＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯとの間に差はなかった。ＣＤ６９hiγδlowＴｃｅｌｌの数はイミキモドを塗布すると増加し、Ｃｔｒｌに比べてＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯの方が顕著に増加した。また、ＣＣＲ６陰性のＣＤ６９hiγδlowＴｃｅｌｌにおけるＩＬ－１７Ａ発現量は、イミキモド塗布してもしていなくてもＣｔｒｌとＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯとの間に差はなかった。ＣＣＲ６陽性のＣＤ６９hiγδlowＴｃｅｌｌにおけるＩＬ－１７Ａ発現量は、イミキモド塗布していない場合は、ＣｔｒｌとＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯとの間に差はなかったが、イミキモド塗布した場合は、ＣＤ６９hiγδlowＴｃｅｌｌの数はイミキモド塗布により、Ｃｔｒｌに比べてＰＤ－Ｌ１－ｃＫＯの方が有意に多かった。
〔実施例８〕ＰＤーＬ２fl/flマウスの作製
　野生型マウス（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊは、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｊａｐａｎより購入した。
（デザイン）
　筑波大学実験動物資源センターでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、ＰＤ－Ｌ２遺伝子の前後に二つのｌｏｘＰ配列（５’－ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ －３’）を挿入し、遺伝子組み換えマウスを作製した（ＰＤ－Ｌ２　ｆｌｏｘｅｄマウス、またはＰＤ－Ｌ２fl/flマウスという）。
　図６３に野生型マウスのゲノムにおけるＰＤ－Ｌ２遺伝子（ＣＤ２７３）のエクソン（ｂｏｘで示す）の位置とＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのターゲット配列、ＰＡＭ配列を示す。マウスＣＤ２７３は１９番染色体上にあり、６個のエクソンから構成される。１番目のエクソンにＰＤ－Ｌ２タンパク質の開始コドンが存在しているので、３番目および４番目のエクソンをＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムを利用して脱落させることにより、ＰＤ－Ｌ２タンパク質の一部が欠損するようにするため、エクソン３－４を含む領域をはさむようにｌｏｘＰ配列を２箇所に挿入してｆｌｏｘマウスを作成するように設計した（５’側をＬｅｆｔ　ＣＲＩＳＰＲ、３’側をＲｉｇｈｔ　ＣＲＩＳＰＲとした）。左右それぞれのｌｏｘＰ配列の挿入には、エレクトロポレーション法によるゲノム編集を採用した。具体的には、過排卵処置をしたメスのマウスから採卵し、オスの精子と人工受精をすることによって得た受精卵と、ＳｐＣａｓ９タンパク、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ｌｏｘＰ配列を含む一本鎖ドナーＤＮＡ（ｓｓＯＤＮ）とを併せて混合し、エレクトロポレーションを実施し受精卵に導入することで切断部位にｌｏｘＰ配列が挿入されるようにした。左右のターゲット配列およびｓｓＯＤＮを表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　受精卵を偽妊娠マウスの卵管内へ移植し、ファウンダーマウスを誕生させた。このファウンダーマウスをＣ５７ＢＬ６マウスと交配することにより、ヘテロ接合型ＰＤ－Ｌ２fl/+マウスを作製した。さらにこのヘテロ接合型ＰＤ－Ｌ２fl/+マウス同士の交配により、ホモ接合型ＰＤ－Ｌ２fl/flマウスを作製した。
　マウスの尾部組織の一部より精製したゲノムＤＮＡに対して以下のプライマーを用いて常法に従いＰＣＲを行うことにより、ジェノタイピングを行った。
ＰＤ－Ｌ２　Ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ＬＦ：ACTTCCCTTCAGGCTTTGGT（配列番号６３）
ＰＤ－Ｌ２　Ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ＬＲ：TGGTCCAGGATTTCTCAAGG（配列番号６４）
ＰＤ－Ｌ２　Ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ＲＦ：TCTGCCCCTCGTTTTCATAC（配列番号６５）
ＰＤ－Ｌ２　Ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ＲＲ：CGCAGAGTGGTTGTGGTATG（配列番号６６）
　野生型マウス（ＷＴ）およびＰＤ－Ｌ２　ｆｌｏｘｅｄマウス（ＰＤ－Ｌ２ｆｌｏｘｅｄ）から得られたゲノムＤＮＡを制限酵素処理なしの場合（ｉｎｔａｃｔ）および制限酵素処理した場合（Ｘｈｏｌ、ＥｃｏＲＶ）に得られるＰＣＲ産物のサイズを図６４に示す。得られたＰＣＲ産物のサイズによって、野生型マウス（ＷＴ）またはＰＤ－Ｌ２　ｆｌｏｘｅｄマウスと判断した。
野生型マウスのゲノムにおけるＤＮＡ配列（配列番号７１）を図６５に示す。
ＰＤ－Ｌ２　ｆｌｏｘｅｄマウスのゲノムにおけるＤＮＡ配列（配列番号７２）を図６６に示す。
産業上の利用の可能性
　本発明によれば、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤を提供することができる。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１、Ｌ２シグナルが組織特異的、時期特異的に阻害される、遺伝子改変非ヒト動物を提供することができる。さらに、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物を提供することができる。抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤のスクリーニング方法を提供することができる。抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤の評価方法を提供することができる。

Claims (29)

  1. 　ＩＬ－６シグナルを阻害する物質を含む、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤であって、前記免疫関連副作用が皮膚障害、重症筋無力症、心筋炎、筋炎、横紋筋融解症、Ｉ型糖尿病、神経障害、腎障害、関節炎、肝障害、肺炎、膵炎、甲状腺炎、副腎炎、視床下部機能異常、および汎下垂体機能低下症から選ばれる少なくとも１つである、薬剤。
  2. 　前記ＩＬ－６シグナルを阻害する物質が、ＩＬ－６とＩＬ－６Ｒとの結合を阻害する物質である、請求項１に記載の薬剤。
  3. 　前記ＩＬ－６とＩＬ－６Ｒとの結合を阻害する物質が、抗ＩＬ－６Ｒ抗体である、請求項２に記載の薬剤。
  4. 　前記免疫関連副作用が皮膚障害である、請求項１～３のいずれか１項に記載の薬剤。
  5. 　前記皮膚障害が乾癬様皮膚炎である、請求項４に記載の薬剤。
  6. 　前記乾癬様皮膚炎が、ＣＤ８陽性細胞の表皮への浸潤が尋常性乾癬よりも亢進しているものである、請求項５に記載の薬剤。
  7. 　ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物。
  8. 　前記リコンビネース標的配列がｌｏｘＰ配列である、請求項７に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
  9. 　ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、組織および時期の少なくとも一方に特異的にＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物。
  10. 　Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ配列、ＦＬＰタンパク質／ＦＲＴ配列、およびｐＳＲ1リコンビネース／ｐＳＲ１リコンビネース標的配列からなる群から選ばれる、リコンビネース／リコンビネース標的配列システムの利用により、ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入される、請求項９に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
  11. 　前記リコンビネース／リコンビネース標的配列システムがＣｒｅ／ｌｏｘＰ配列である、請求項１０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
  12. 　ＣＤ８陽性Ｔ細胞特異的にＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、請求項９～１１のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
  13. 　ＰＤ－１遺伝子のエクソン２、３、および４の発現が抑制または喪失されている、請求項９～１２のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
  14. 　ゲノム中のＰＤ－１遺伝子またはＰＤ－１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている遺伝子改変非ヒト動物に、抗原性補強剤を投与することにより作製する、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物。
  15. 　前記遺伝子改変非ヒト動物が、組織および時期の少なくとも一方に特異的にＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている遺伝子改変非ヒト動物である、請求項１４に記載の、免疫関連副作用モデル非ヒト動物。
  16. 　前記遺伝子改変非ヒト動物が、ＣＤ８陽性Ｔ細胞特異的にＰＤ－１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている遺伝子改変非ヒト動物である、請求項１５に記載の、免疫関連副作用モデル非ヒト動物。
  17. 　前記免疫関連副作用が、免疫関連副作用としての乾癬様皮膚炎である、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の免疫関連副作用モデル非ヒト動物。
  18. 　前記抗原性補強剤がイミキモドである、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の免疫関連副作用モデル非ヒト動物。
  19. 　ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されることにより、ランゲルハンス細胞特異的にＰＤ－Ｌ１遺伝子の全部または一部の発現が抑制または喪失されている、遺伝子改変非ヒト動物。
  20. 　Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ配列、ＦＬＰタンパク質／ＦＲＴ配列、およびｐＳＲ1リコンビネース／ｐＳＲ１リコンビネース標的配列からなる群から選ばれる、リコンビネース／リコンビネース標的配列システムの利用により、ゲノム中のＰＤ－Ｌ１遺伝子またはＰＤ－Ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入される、請求項１９に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
  21. 　前記リコンビネース／リコンビネース標的配列システムがＣｒｅ／ｌｏｘＰ配列である、請求項２０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
  22. 　ＰＤ－Ｌ１遺伝子のエクソン２および３の発現が抑制または喪失されている、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
  23. 　請求項１９～２２のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物に、抗原性補強剤を投与することにより作製する、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用モデル非ヒト動物。
  24. 　前記免疫関連副作用が、免疫関連副作用としての乾癬様皮膚炎である、請求項２３に記載の免疫関連副作用モデル非ヒト動物。
  25. 　前記抗原性補強剤がイミキモドである、請求項２３または２４に記載の免疫関連副作用モデル非ヒト動物。
  26. 　請求項９～１３、１９～２２のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物、または請求項１４～１８、２３～２５のいずれか１項に記載の免疫関連副作用モデル非ヒト動物を用いる、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤のスクリーニング方法。
  27. 　請求項９～１３、１９～２２のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物、または請求項１４～１８、２３～２５のいずれか１項に記載の免疫関連副作用モデル非ヒト動物を用いる、抗ＰＤ－１抗体または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による免疫関連副作用の予防および治療の少なくとも一方を行う薬剤の評価方法。
  28. 　ゲノム中のＰＤ－Ｌ２遺伝子またはＰＤ－Ｌ２遺伝子の発現調節領域の一部または全部を挟むリコンビネース標的配列が導入された、遺伝子改変非ヒト動物。
  29. 　前記リコンビネース標的配列がｌｏｘＰ配列である、請求項２８に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
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