CN111315881B - 非人类动物及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种非人类动物，其中，血液系统的细胞具有第一遗传背景，血液系统以外细胞具有第二遗传背景，上述第一遗传背景和上述第二遗传背景互不相同，上述第二遗传背景是不形成造血干细胞的基因突变。

Description

非人类动物及其生产方法

技术领域

本发明涉及一种非人类动物及其生产方法。更具体地、涉及一种非人类动物、人类抗体的制备方法、大鼠(rat)抗体的制备方法、人类血细胞的制备方法、以及血液系统的细胞所具有的第一遗传背景和血液系统以外的细胞所具有的第二遗传背景互不相同的非人类动物的生产方法。本申请要求于2017年11月17日向日本专利局申请的特愿2017-222215号的优先权，且将其内容引用于此。

背景技术

已知有具有人类的血液系统细胞的小鼠(mouse)。就这些小鼠而言，例如，在破坏NSG小鼠、NOD小鼠等免疫缺陷小鼠的造血干细胞之后移植人类的造血干细胞而生产。通过射线照射、作为抗恶性肿瘤剂中一种的白消安的给药等来进行造血干细胞的破坏。

但是，通过现有的方法生产的具有人类的血液系统细胞的小鼠存在红细胞系统的细胞或淋巴细胞系统的细胞的移植存活率差的情况。

然而，例如，在非专利文献1中记载有具有不形成造血干细胞的基因突变的小鼠。

在先技术文献

非专利文献

非专利文献1：Yokomizo T.,et al.,Characterization of GATA-1+hemangioblastic cells in the mouse embryo,The EMBO Journal,26,184-196,2007.

发明内容

(发明所要解决的问题)

本发明的目的在于提供一种生产血液系统的细胞所具有的第一遗传背景和血液系统以外的细胞所具有的第二遗传背景互不相同的非人类动物的新技术。

(用于解决问题的方案)

本发明包括以下方面。

[1]一种非人类动物，其中，血液系统的细胞具有第一遗传背景，血液系统以外的细胞具有第二遗传背景，上述第一遗传背景和上述第二遗传背景互不相同，上述第二遗传背景是不形成造血干细胞的基因突变。

[2]根据[1]所述的非人类动物，其中，血液系统的所有细胞实质上具有上述第一遗传背景。

[3]根据[1]或[2]所述的非人类动物，其中，上述第二遗传背景包括Runx1基因或myb基因的敲除、造血干细胞特异性条件性敲除、或者参与造血干细胞的产生的组织特异性条件性敲除。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的非人类动物，其中，上述血液系统的细胞是人类细胞。

[5]根据[1]～[3]中任一项所述的非人类动物，其中，上述血液系统的细胞是大鼠细胞。

[6]包括用抗原免疫[4]所述的非人类动物的工序的上述抗原特异性人类抗体的制备方法。

[7]包括用抗原免疫[5]所述的非人类动物的工序的上述抗原特异性大鼠抗体的制备方法。

[8]一种人类血细胞的制备方法，包括从[4]所述的非人类动物采集血细胞的工序。

[9]一种非人类动物的生产方法，其用于生产血液系统的细胞所具有的第一遗传背景和血液系统以外的细胞所具有的第二遗传背景互不相同的非人类动物，上述非人类动物的生产方法包括：将具有第一遗传背景的造血干细胞以经胎盘的方式移植到具有第二遗传背景的非人类动物的早期胚胎的工序，其中，上述第二遗传背景是不形成造血干细胞的基因突变，上述第一遗传背景和上述第二遗传背景互不相同；以及使上述早期胚胎生长而得到具有造血干细胞的非人类动物的工序。

[10]根据[9]所述的非人类动物的生产方法，其中，上述第二遗传背景包括Runx1基因或myb基因的敲除、造血干细胞特异性条件性敲除、或者参与造血干细胞的产生的组织特异性条件性敲除。

[11]根据[9]或[10]所述的非人类动物的生产方法，其中，上述造血干细胞是人类细胞。

[12]根据[9]或[10]所述的非人类动物的生产方法，其中，上述造血干细胞是大鼠细胞。

(发明效果)

根据本发明，能够提供一种生产血液系统的细胞所具有的第一遗传背景和血液系统以外的细胞所具有的第二遗传背景互不相同的非人类动物的新技术。

附图说明

图1是说明涉及一个实施方式的非人类动物生产方法的示意图。

图2中，(a)～(c)是示出实验例2中的小鼠胎儿的照片和流式细胞术分析的代表性结果的图表。(d)是绘制了实验例2中的野生型小鼠和被拯救的(rescued)Runx1^-/-::Tg小鼠的嵌合(chimera)率的图表。

图3中，(a)和(b)是示出实验例2中的集落检测(colony assay)的结果的图表。(c)是示出在实验例2中测定了血细胞的集落的嵌合率的结果的图表。

图4是示出实验例2中的肝细胞的流式细胞术分析结果的图表。

图5是示出实验例2中的脾细胞的流式细胞术分析结果的图表。

图6中，(a)是野生型小鼠的胎儿的照片，(b)是在实验例3中通过大鼠的造血干细胞的移植来被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的胎儿的照片。

图7中，(a)是示出实验例4中的流式细胞术分析的代表性结果的图表。(b)是绘制了实验例4中的野生型小鼠和被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的嵌合率的图表。

图8是示出实验例4中的肝细胞的流式细胞术分析结果的图表。

图9的(a)和(b)是示出实验例5中的流式细胞术分析的代表性结果的图表。

图10是示出实验例6中的流式细胞术分析的代表性结果的图表。

图11的(a)和(b)是示出实验例7中的流式细胞术分析的代表性结果的图表。

图12的(a)～(c)是示出实验例8中的流式细胞术分析结果的图表。

图13是示出实验例9中的蛋白质印迹法检测结果的照片。

具体实施方式

[非人类动物]

在一个实施方式中，本发明提供一种非人类动物，其中，血液系统的细胞具有第一遗传背景，血液系统以外的细胞具有第二遗传背景，上述第一遗传背景和上述第二遗传背景互不相同，上述第二遗传背景是不形成造血干细胞的基因突变。

如在下面的实施例中叙述，就本实施方式的非人类动物而言，血液系统的细胞具有第一遗传背景，血液系统以外的细胞具有第二遗传背景，上述第一遗传背景和上述第二遗传背景互不相同。

即、就本实施方式的非人类动物而言，用具有第一遗传背景的细胞替换了本来具有第二遗传背景的非人类动物的血液系统的细胞。

在本说明书中，血液系统的细胞是指所有从造血干细胞分化的细胞。因此，在本说明书中，血液系统的细胞是指白细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞)、红细胞、血小板、肥大细胞、树突状细胞等。

在本实施方式的非人类动物中，具有第一遗传背景的红细胞系统的细胞和淋巴细胞系统的细胞的移植存活率高，且构建基于具有第一遗传背景的血液系统细胞的免疫系统。

作为非人类动物，并不特别限定，可举出小鼠、大鼠、兔、猪、绵羊、山羊、牛、猴等。

在本实施方式的非人类动物中，细胞的遗传背景互不相同是指细胞的种互不相同或细胞为同种异型(allo，近缘)，即、是指主要组织相容性基因复合体抗原互不相同、属于同类(congenic，类似基因型)系等。

在本实施方式的非人类动物中，第二遗传背景是不形成造血干细胞的基因突变。不形成造血干细胞的基因突变是指特定的基因因突变或缺失而导致的不形成造血干细胞的基因突变。具体地、可举出例如Runt相关转录因子1(Runt-related transcriptionfactor1，Runx1)^-/-、myb^-/-等。

在人类Runx1蛋白质中存在多种异形体(isoform)，NCBI登录号是NP_001116079.1、NP_001001890.1、NP_001745.2等。另外，小鼠Runx1蛋白质的NCBI登录号是NP_001104491.1等。

另外，在人类myb蛋白质中存在多种异形体，NCBI登录号是NP_001123645.1、NP_001155129.1、NP_001155130.1等。另外，小鼠myb蛋白质的NCBI登录号是NP_001185843.1等。

例如，已知Runx1^-/-小鼠由于胎儿肝中缺乏成体型造血功能而在胚胎发育12.5天左右就死亡。对此，例如，如在上述的非专利文献1中所记载，就将连接在GATA-1造血调节域(GATA-1 hematopoietic regulatory domain)的下游的Runx1 cDNA(G1-HRD-Runx1)作为转基因而导入的Runx1^-/-小鼠(Runx1^-/-::G1-HRD-Runx1)而言，虽然不形成造血干细胞，但一直生长到出生。这里，“::”是指具有转基因。例如，在上述非专利文献1的图4A等中记载有构建G1-HRD-Runx1的一个例子。

就本实施方式的非人类动物中的第二遗传背景而言，只要不形成造血干细胞，则可以是例如上述的Runx1^-/-::G1-HRD-Runx1等的基因突变或基因修饰。

另外，如上所述，Runx1^-/-::G1-HRD-Runx1小鼠一直生长到出生。但是，Runx1^-/-::G1-HRD-Runx1小鼠出生数小时后就死亡。可认为这是由于Runx1也参与神经系统和胸骨的产生之故。

于是，作为第二遗传背景，可以使用例如虽然不形成造血干细胞但其它方面成为更与正常接近的非人类动物的基因突变或基因修饰的诸如Runx1^f/f::Tie2-Cre::G1-HRD-Runx1、Runx1^f/-::Tie2-Cre::G1-HRD-Runx1等。通过移植功能性造血干细胞来能够使这种非人类动物正常地生长。这里，所谓功能性造血干细胞可以是正常的(野生型的)遗传背景，或者，可以是至少具有血液系统为正常的遗传背景的造血干细胞。此外，Tie2是在胎儿期的初期以血管内皮和血细胞的共通的前体细胞表达的受体酪氨酸激酶。例如，在KisanukiY.Y.,Tie2-Cre Transgenic Mice:A New Model for Endothelial Cell-LineageAnalysis in Vivo,Developmental Biology 230,230-242,2001.等中记载有构建Tie2-Cre的一个例子。

这里，“Runx1^f/f”是指具有外显子的至少一部分夹在两个loxP序列之间的同源(homo)Runx1基因。另外，“Runx1^f/-”是指在一侧基因组具有外显子的至少一部分夹在两个loxP序列之间的Runx1基因而在另一侧基因组不具有Runx1基因。另外，Tie2-Cre是指具有在Tie2基因的启动子的下游连接有Cre重组酶基因的转基因。Tie2基因是以造血干细胞或参与造血干细胞的产生的血管内皮细胞等表达的基因。因此，在具有Runx1^f/f::Tie2-Cre、Runx1^f/-::Tie2-Cre等的基因修饰的非人类动物中，Runx1基因在造血干细胞或参与造血干细胞的产生的血管内皮细胞中条件性地(conditionally，附带条件地)缺失。其结果，成为不形成造血干细胞的表型。

即、本实施方式的非人类动物中的第二遗传背景可以包括Runx1基因或myb基因的敲除(knockout)、Runx1基因或myb基因的造血干细胞特异性条件性敲除、Runx1基因或myb基因的参与造血干细胞的产生的组织特异性条件性敲除。

这里，所谓“包括”是指本实施方式的非人类动物中的第二遗传背景除了具有上述的不形成造血干细胞的基因突变之外还可以进一步具有“::G1-HRD-Runx1”等的基因修饰。

在本实施方式的非人类动物中，第二遗传背景优选不是导致免疫缺陷的基因突变。作为导致免疫缺陷的遗传背景可举出例如NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ(与NSG小鼠相同的遗传背景)、NOD/Shi-scid-IL2Rγ^null(与NOG小鼠相同的遗传背景)等。另外，本实施方式的非人类动物优选未受到通过射线照射、白消安的给药等来进行的造血干细胞的破坏。

本实施方式的非人类动物中的第一遗传背景可以是正常的(野生型的)遗传背景，或者，可以是至少血液系统为正常的遗传背景。具有第一遗传背景的血液系统的细胞可以是例如与本实施方式的非人类动物不同种的血液系统的细胞，也可以是与本实施方式的非人类动物同种异型(allo，近缘)的血液系统的细胞，还可以是与本实施方式的非人类动物同种且同类(congenic，类似基因型)系的血液系统的细胞。更具体地、例如，非人类动物是小鼠，具有第一遗传背景的血液系统的细胞可以是人类的血液系统的细胞、大鼠的血液系统的细胞、同类(congenic，类似基因型)系的小鼠的血液系统的细胞等。

优选地，本实施方式的非人类动物中血液系统的所有细胞实质上具有上述第一遗传背景。由此，本实施方式的非人类动物用具有第一遗传背景的细胞完全替换了本来具有第二遗传背景的非人类动物的血液系统的细胞。

这里，所谓血液系统的所有细胞实质上具有上述第一遗传背景是指血液系统的细胞的80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、尤其优选100％具有第一遗传背景。

在本实施方式的非人类动物中，具有第一遗传背景的血液系统的细胞可以是人类细胞，也可以是大鼠细胞。例如，本实施方式的非人类动物可以是血液系统的细胞为人类细胞或大鼠细胞的小鼠、兔、猪、绵羊、山羊、牛等。

在本实施方式的非人类动物具有人类的血液系统的情况下，能够将该非人类动物用作人类疾病模型等。或者，能够将该非人类动物使用于药品开发中的药效评价和药物筛选等。

[人类抗体的制备方法]

在一个实施方式中，本发明提供一种上述抗原特异性人类抗体的制备方法，其包括用抗原免疫上述的非人类动物即血液系统的细胞为人类细胞的非人类动物的工序。

作为非人类动物，例如，以小鼠为宜。即、根据本实施方式的制备方法，通过用抗原免疫血液系统的细胞为人类细胞的小鼠就能够容易地制备抗原特异性人类单克隆抗体。

作为用抗原免疫小鼠的手法，能够使用现有的方法。另外，作为抗体的制备方法，能够使用现有的杂交瘤的制备方法。

通过本实施方式的方法而得到的人类单克隆抗体，由于完全是人类抗体，因此，即使对人类给药，引起过敏性休克等副作用的可能性也低，因而能够用作抗体药物。

另外，作为非人类动物，在使用例如兔等更大型动物的情况下，还能够制备多克隆抗体。即、通过用抗原免疫血液系统的细胞为人类细胞的兔就能够制备抗原特异性人类多克隆抗体。

[大鼠抗体的制备方法]

在一个实施方式中，本发明提供一种上述抗原特异性大鼠抗体的制备方法，其包括用抗原免疫上述的非人类动物即血液系统的细胞为大鼠细胞的非人类动物的工序。

作为非人类动物，例如，以小鼠为宜。即、根据本实施方式的制备方法，通过用抗原免疫血液系统的细胞为大鼠细胞的小鼠就能够容易地制备抗原特异性大鼠单克隆抗体。

过去，一直是通过用抗原免疫大鼠而制备了大鼠单克隆抗体。但是，存在小鼠比大鼠更容易处理的情况。因此，若能够使用小鼠制备大鼠单克隆抗体，则有时能够更简便地制备大鼠单克隆抗体且便利。

作为用抗原免疫小鼠的手法，能够使用现有的方法。另外，作为抗体的制备方法，能够使用现有的杂交瘤的制备方法。

另外，作为非人类动物，在使用例如兔等更大型动物的情况下，还能够制备多克隆抗体。即、通过用抗原免疫血液系统的细胞为大鼠细胞的兔就能够制备抗原特异性大鼠多克隆抗体。

[人类血细胞的制备方法]

在一个实施方式中，本发明提供一种人类血细胞的制备方法，其包括从上述的非人类动物即血液系统的细胞为人类细胞的非人类动物采集血细胞的工序。

目前，就输血用血液而言，不能人工制造，另外，难以长期保存，因而通过献血来确保。但是，由于献血者伴随出生率下降和人口老龄化等而在减少，因此，被指出其稳定供给将变得困难的可能性。

对此，根据本实施方式的制备方法，能够工业化地生产红细胞、血小板等血细胞，且能够利用于制备输血用血液制剂。

在本实施方式的制备方法中，作为非人类动物，能够适当地利用例如猪、绵羊、山羊、牛等。即、根据本实施方式的制备方法，能够从血液系统的细胞为人类细胞的非人类动物采集血细胞并稳定地制备人类血细胞。

[非人类动物的生产方法]

在一个实施方式中，本发明提供一种非人类动物的生产方法，用于生产血液系统的细胞所具有的第一遗传背景和血液系统以外的细胞所具有的第二遗传背景互不相同的非人类动物，所述非人类动物的生产方法包括：将具有第一遗传背景的造血干细胞以经胎盘的方式移植到具有第二遗传背景的非人类动物的早期胚胎的工序，其中，上述第二遗传背景是不形成造血干细胞的基因突变，上述第一遗传背景和上述第二遗传背景互不相同；以及使上述早期胚胎生长并得到具有造血干细胞的非人类动物的工序。

通过本实施方式的生产方法就能够生产上述的非人类动物。在本实施方式的生产方法中，非人类动物、第一遗传背景、第二遗传背景与上述的非人类动物、第一遗传背景、第二遗传背景相同。

图1是说明本实施方式的生产方法的一个例子的示意图。在图1所示的例子中，非人类动物是小鼠。

首先，麻醉怀了具有不形成造血干细胞的基因突变的早期胚胎(胎儿)的母小鼠并切开腹部以暴露子宫。这里，根据所使用的母小鼠的遗传背景，有在胎儿中并存具有形成造血干细胞的遗传背景的胎儿和具有不形成造血干细胞的遗传背景的胎儿的情况。

作为不形成造血干细胞的基因突变，其与上述的相同，可举出包括Runx1基因或myb基因的敲除、Runx1基因或myb基因的造血干细胞特异性条件性敲除、Runx1基因或myb基因的参与造血干细胞的产生的组织特异性条件性敲除的基因突变等。

更具体地、可举出例如Runx1^-/-::G1-HRD-Runx1、Runx1^f/f::Tie2-Cre::G1-HRD-Runx1、Runx1^f/-::Tie2-Cre::G1-HRD-Runx1等的基因突变，但不限定于这些基因突变。

胎儿优选是与在野生型的胎儿中产生造血干细胞的时期相对应的发生阶段的胎儿，例如，在小鼠的情况下，优选胚胎发育10～11天的胎儿。

接着，将针头从暴露的子宫的外部刺入到胎盘中而注入所希望的造血干细胞，将造血干细胞以经胎盘的方式移植到胎儿中。只要所移植的造血干细胞的数量为1个以上即可。另外，可以将造血干细胞精制而移植，还可以移植包含造血干细胞的细胞群。作为包含造血干细胞的细胞群，可举出例如源自胎儿肝脏的细胞、源自活体的骨髓细胞等，但不限定于这些细胞。

这里，作为针头，可举出注射针、玻璃针等。其中，优选使用玻璃针，尤其优选使用研磨了尖端的玻璃针。能够使用例如研磨机(型号为“EG-4”，株式会社成茂)等而研磨玻璃针的尖端。另外，玻璃针的尖端的粗细优选为50～62.5μm左右。发明人等发现，通过研磨玻璃针的尖端即可空前提高移植的成功率。

另外，所移植的造血干细胞可以是与发生初期的造血干细胞相对应的发生阶段的造血干细胞，也可以是发生后期的造血干细胞，还可以是源自成体的造血干细胞。例如，可以是从多能干细胞分化诱导而发生的造血干细胞。作为多能干细胞并不特别限定，可举出胚胎干细胞(ES细胞)、iPS细胞等。

发明人等成功地得到了血液系统的细胞为源自所移植的造血干细胞且与所移植的造血干细胞的发生阶段无关的小鼠。

另外，所移植的造血干细胞例如可以是人类细胞，还可以是大鼠细胞。

在移植了造血干细胞之后，将子宫返回至母小鼠，缝合皮肤，并使胎儿生长。其结果，造血干细胞的缺失导致了在造血干细胞的移植上失败的胎儿死亡。另一方面，成功移植了造血干细胞的胎儿和具有形成造血干细胞的遗传背景的胎儿胚胎发育19天就出生。所生长的胎儿可以通过剖腹产而摘取。

而且，在生长的胎儿中包括非人类动物，就该非人类动物而言，血液系统的细胞所具有的第一遗传背景和血液系统以外的细胞所具有的第二遗传背景互不相同，第二遗传背景是不形成造血干细胞的基因突变。

例如，在分析胎儿体细胞中的血液系统以外的细胞的基因组DNA并确认出具有第二遗传背景的情况下，该胎儿是目标非人类动物也就是血液系统的细胞所具有的第一遗传背景和血液系统以外的细胞所具有的第二遗传背景互不相同的非人类动物。

[实施例]

接下来，示出实施例而更详细地说明本发明，但本发明并不限定于以下实施例。

[实验例1]

(小鼠造血干细胞的移植1)

《以经肝脏的方式的移植的研讨》

在作为具有Runx1^+/-::G1-HRD-Runx1的基因型的Ly5.2小鼠(以下，有时称为“Runx1^+/-::Tg小鼠”)的母鼠的胎儿中移植了作为同类(congenic，类似基因型)系的C57BL/6-Ly5.1小鼠(以下，有时称为“供体(donor)小鼠”)的造血干细胞。

作为移植方法，使用注射针(型号为30G，日本TERUMO株式会社)而将供体小鼠的造血干细胞以经肝脏的方式移植到胚胎发育13.5天或胚胎发育14.5天的胎儿中。具体地、将细胞密度调制成2×10⁵个/1μL的、胚胎发育14.5天的供体小鼠的胎儿的肝细胞在每一个胎儿中各移植了1μL。

但是，尽管在232个胎儿中进行了移植，但通过供体小鼠的造血干细胞被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠连一只也未得到。

从该结果可认为存在胎儿被以经肝脏的方式的移植操作所损坏的可能性。

《以经胎盘的方式的移植的研讨》

接着，研讨了以经胎盘的方式的移植。具体地、在胚胎发育11.5天的作为Runx1^+/-::Tg小鼠的母鼠的胎儿中以经胎盘的方式移植了供体小鼠的造血干细胞。

首先，用异氟烷麻醉作为Runx1^+/-::Tg小鼠的母鼠并切开腹部以使子宫暴露。接着，在胎盘所存在的部位刺入玻璃针并移植了供体小鼠的造血干细胞。

作为玻璃针，使用了以研磨机(型号为“EG-4”，株式会社成茂)研磨了尖端的玻璃针。尖端的粗细大致为50μm。

作为造血干细胞，将细胞密度调制成2×10⁵个/1μL的、胚胎发育14.5天的供体小鼠的胎儿的肝细胞在每一个胎儿中各移植了1μL。

在移植了造血干细胞之后，将子宫返回至母鼠，缝合皮肤，并使胎儿生长。移植造血干细胞7天之后，将胚胎发育18.5天的胎儿通过剖腹产摘取并进行了分析。

对401个胎儿进行了造血干细胞的移植，其结果，267只小鼠存活到胚胎发育18.5天。存活率大致为66.6％。通过供体小鼠的造血干细胞被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的外观正常，可认为造血系统的重建成功。

[实验例2]

(移植小鼠的分析)

进一步详细地分析了实验例1中的通过供体小鼠的造血干细胞的以经胎盘的方式的移植来被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠。

《嵌合率的研讨》

首先，通过使用了抗CD45.1抗体和抗CD45.2抗体的流式细胞术分析来研讨了被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的肝细胞中的源自供体小鼠的细胞的嵌合率。通过下式(1)算出了源自供体小鼠的细胞的嵌合率。

嵌合率(％)＝(CD45.1阳性细胞数量/(CD45.1阳性细胞数量+CD45.2阳性细胞数量))×100……(1)

图2(a)～(c)是示出胎儿的照片和流式细胞术分析的代表性结果的图表。图2(a)是示出Runx1^+/+::Tg小鼠的代表性照片和分析结果的图表，图2(b)是示出未被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的代表性照片和分析结果的图表，图2(c)是示出被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的代表性照片和分析结果的图表。另外，图2(d)是绘制了野生型小鼠(WT)和被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的嵌合率的图表。在图2(d)中，“供体：小鼠”表示造血干细胞的供体是小鼠。

其结果，移植了造血干细胞的32只Runx1^-/-::Tg小鼠中的23只Runx1^-/-::Tg小鼠示出了0.4％以上的嵌合率。对此，已清楚，移植了供体小鼠的造血干细胞的野生型小鼠仅示出低嵌合率。

此外，可认为之所以嵌合率未达到100％是由于胚胎发育18.5天的分析之故，若生长更长时间则嵌合率趋近100％。但是，Runx1^-/-::Tg小鼠出生后不久就死亡，因此，为了使其更长时间生长，有必要进行使用具有Runx1^f/f::Tie2-Cre::G1-HRD-Runx1、Runx1^f/-::Tie2-Cre::G1-HRD-Runx1等的基因型的小鼠的分析。

《CFU的研讨》

接着，使用作为胚胎发育18.5天的Runx1^+/+::Tg小鼠、未被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠、被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的各小鼠而进行了胎儿肝细胞的集落检测(colony assay)。

图3(a)和(b)是示出集落检测的结果的图表。图3(a)示出每1×10⁵个胎儿肝细胞的成红细胞集落形成单位(CFU-E)的数量，图3(b)示出每1×10⁵个胎儿肝细胞的成红细胞爆式集落形成单位(BFU-E)、粒细胞巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)、包含髓样细胞、红细胞、巨核细胞的混合集落形成单位(CFU-Mix)的数量。

在图3(a)和(b)中，“Runx1^-/-::Tg”表示未被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的结果，“被拯救(Rescued)”表示被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的结果。另外，在图3(b)中，“ND”表示未进行检测。

其结果，在被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的胎儿肝细胞中检测到CFU-E、BFU-E、CFU-GM、CFU-Mix，然而，已清楚，在未被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的胎儿肝细胞中并未检测到这些集落形成单位。

另外，图3(c)是示出通过使用了抗CD45.1抗体和抗CD45.2抗体的流式细胞术分析来测定了Runx1^+/+::Tg小鼠和源自被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的上述集落的嵌合率的结果的图表。在图3(c)中，“被拯救”表示被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的结果。

其结果，已清楚，源自被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的上述集落由源自高嵌合率且CD45.1阳性的供体小鼠的细胞组成。

《肝细胞和脾细胞的研讨》

接着，通过流式细胞术分析了被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的肝脏和脾脏中的源自供体小鼠的细胞是否分化为巨噬细胞、B淋巴细胞以及T淋巴细胞。

检测了CD11b抗原而作为巨噬细胞的标志物(marker)。另外，检测了B220抗原而作为B淋巴细胞标志物。另外，检测了CD3抗原而作为T淋巴细胞标志物。图4是示出肝细胞的流式细胞术分析结果的图表。

其结果，已清楚，被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的肝脏中的源自供体小鼠的细胞分化为巨噬细胞、B淋巴细胞以及T淋巴细胞。

另外，图5是示出脾细胞的流式细胞术分析结果的图表。其结果，已清楚，在脾脏中虽然源自供体小鼠的细胞少但至少存在巨噬细胞和B淋巴细胞。

[实验例3]

(大鼠造血干细胞的移植)

研讨了是否能够用异种造血干细胞拯救Runx1^-/-::Tg小鼠。

具体地、作为移植的细胞，使用了胚胎发育15.5天的大鼠的胎儿的肝细胞，除了这一点之外，以与实验例1相同的方式在作为Runx1^+/-::Tg小鼠的母鼠的胎儿中以经胎盘的方式移植了大鼠的造血干细胞。

对53个胎儿进行了造血干细胞的移植，其结果，得到了36个活着的胎儿。在36个活着的胎儿中5个胎儿是Runx1^-/-::Tg小鼠。其中，4个胎儿的外观正常，可认为利用大鼠的造血干细胞成功地重建了造血系统。

图6(a)是野生型小鼠的胎儿的照片，图6(b)是通过大鼠的造血干细胞的移植而被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的胎儿的照片。

[实验例4]

(移植小鼠的分析)

进一步详细地分析了实验例3中的通过大鼠的造血干细胞的以经胎盘方式的移植而被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠。

《嵌合率的研讨》

首先，通过使用了抗小鼠抗CD45.2抗体和抗大鼠CD45抗体的流式细胞术分析来研讨了胚胎发育18.5天的被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的肝细胞中的源自大鼠的细胞的嵌合率。通过下式(2)算出了源自大鼠的细胞的嵌合率。

嵌合率(％)＝(大鼠CD45阳性细胞数量/(大鼠CD45阳性细胞数量+小鼠CD45.2阳性细胞数量))×100……(2)

图7(a)是示出流式细胞术分析的代表性结果的图表。另外，图7(b)是绘制了野生型小鼠(WT)和被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的嵌合率的图表。在图7(b)中，“供体：大鼠”表示造血干细胞的供体是大鼠。

其结果，已清楚，移植了大鼠的造血干细胞的Runx1^-/-::Tg小鼠示出了最大为96％的嵌合率。然而，已清楚，移植了大鼠的造血干细胞的野生型小鼠仅示出低嵌合率。

《肝细胞的研讨》

接着，通过流式细胞术分析了示出96％的嵌合率的被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的肝脏中的源自大鼠的细胞是否分化为巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞以及红细胞。

检测了大鼠CD11b抗原而作为巨噬细胞的标志物。另外，检测了大鼠B220抗原而作为B淋巴细胞标志物。另外，检测了大鼠CD3抗原而作为T淋巴细胞标志物。另外，检测了大鼠Ter119抗原和小鼠Ter119抗原而作为红细胞标志物。图8是示出流式细胞术分析结果的图表。

其结果，已清楚，被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的肝脏中的源自大鼠的细胞分化为巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞以及红细胞。

另外，已清楚，在被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的肝脏中大量存在大鼠的红细胞。具体地、大鼠的红细胞的百分比为67.4％，小鼠的红细胞的百分比为23.2％。

以上的结果表明，通过以经胎盘的方式的移植来能够用异种造血干细胞拯救Runx1^-/-::Tg小鼠。

[实验例5]

(人类造血干细胞的移植1)

研讨了是否能够用人类造血干细胞拯救Runx1^-/-::Tg小鼠。

《人类造血干细胞的培养》

参考在先文献培养了源自人类脐带血的造血干细胞(参照Boitano,A.E.et al.,Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of humanhematopoietic stem cells,Science,329(5997),1345-1348,2010.；Wagner,J.E.,Jr.etal.,Phase I/II Trial of StemRegenin-1Expanded Umbilical Cord BloodHematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft,Stem Cell,18(1),144-155,2016.)。从筑波大学血液内科千叶茂教授分发得到源自人类脐带血的造血干细胞。

具体地、在源自人类脐带血的造血干细胞增殖用无血清培养基(商品名称为“StemSpan SFEM”，干细胞技术公司)中分别添加了100ng/mL的人类血小板生成素、人类白介素(IL)-6、人类Fms样酪氨酸激酶3配体(Fms-related tyrosine kinase 3ligand，Flt3-L)、人类干细胞因子(均由R&D系统公司制造)以及750nM的StemRegenin1(干细胞技术公司)，并使用该培养基在6孔板中培养了5×10⁴个/mL的源自CD34阳性人类脐带血的造血干细胞。在5％的CO₂、37℃的条件下进行了培养。回收了培养1周以上的源自脐带血的造血干细胞并将其使用于移植实验。

《以经胎盘方式的移植》

对于每一个胎儿，以与实验例1相同的方式在胚胎发育11.5天的作为Runx1^+/-::Tg小鼠的母鼠的胎儿中以经胎盘的方式移植了各自为20ng的人类细胞因子(血小板生成素、IL-6、Flt3-L、干细胞因子)和1×10⁴个源自人类脐带血的造血干细胞。接着，回收胚胎发育18.5天的胎儿的肝脏，并通过流式细胞术进行了分析。

图9(a)和(b)是示出流式细胞术分析的代表性结果的图表。图9(a)是未移植人类造血干细胞的胎儿的结果，图9(b)是通过移植人类造血干细胞而被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的胎儿的结果。在图9(b)中，箭头指示人类CD45阳性细胞。

其结果，在被拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠中检测到人类CD45阳性细胞，并确认出源自人类的细胞在小鼠胎儿体内移植存活。

[实验例6]

(人类造血干细胞的移植2)

研讨了是否能够用人类造血干细胞拯救野生型小鼠。首先，以与实验例5相同的方式调制了源自人类脐带血的造血干细胞。接着，对于野生型小鼠的胚胎发育11.5天的48个胎儿，以与实验例1相同的方式在每一个胎儿中以经胎盘的方式移植了各自为20ng的人类细胞因子(血小板生成素、IL-6、Flt3-L、干细胞因子)和0.2×10⁴个～5×10⁴个源自人类脐带血的造血干细胞。其后，在48只小鼠中有34只小鼠通过自然分娩而出生，并生长到4周龄。

接着，使用这些小鼠的外周血进行流式细胞术分析，并测定了源自人类造血干细胞的细胞的嵌合率。通过下式(3)算出了嵌合率。

嵌合率(％)＝(人类CD45阳性细胞数量/(人类CD45阳性细胞数量+小鼠CD45.2阳性细胞数量))×100……(3)

图10是示出流式细胞术分析的代表性结果的图表。在图10中，箭头指示人类CD45阳性细胞。其结果，确认出在出生的34只小鼠中的3只小鼠中有0.3％以上的源自人类的细胞移植存活。

[实验例7]

(小鼠造血干细胞的移植2)

在作为具有Runx1^f/-::Tie2-Cre::G1-HRD-Runx1的基因型的Ly5.2小鼠(以下，有时称为“Runx1 cKO小鼠”)的母鼠的胎儿中以与实验例1相同的方式且以经胎盘的方式移植了作为同类(congenic，类似基因型)系的C57BL/6-Ly5.1小鼠(以下，有时称为“供体小鼠”)的造血干细胞。接着，回收胚胎发育18.5天的胎儿的肝脏并对肝细胞进行了流式细胞术分析。

图11(a)和(b)是示出流式细胞术分析的代表性结果的图表。图11(a)是将源自供体小鼠的造血干细胞移植到野生型小鼠的胎儿中而作为对照的结果。另外，图11(b)是被拯救的Runx1 cKO小鼠的结果。在图11(b)中，箭头指示源自供体小鼠的CD45.1阳性细胞。

其结果，已清楚，被拯救的Runx1 cKO小鼠示出高嵌合率。具体地、在基于图11(b)的结果并通过上述式(1)计算嵌合率时，嵌合率(％)＝(67.53/(67.53+1.61))×100＝97.7％。

[实验例8]

(造血再构建能力的研讨)

进行源自实验例7中被拯救的Runx1 cKO胎儿的造血干细胞的2次移植，研讨了自我复制能力。具体地、将胚胎发育18.5天的被拯救的Runx1 cKO胎儿的肝细胞调整为1×10⁷个/100μL，并对于进行了全身射线照射(7Gy)的6周龄的雌性小鼠，每一只中尾静脉注射100μL而移植了上述肝细胞。其后，对于接受了2次移植的受体小鼠的外周血经时地进行了流式细胞术分析。

图12(a)～(c)是示出流式细胞术分析结果的图表。图12(a)是自2次移植经过3周后的结果，图12(b)是自2次移植经过2个月后的结果，图12(c)是自2次移植经过6个月后的结果。

其结果，接受了2次移植的受体小鼠自移植经过6个月之后示出了97.3％的高嵌合率。该结果示出源自被拯救的Runx1 cKO胎儿的造血干细胞具有造血构建能力。

[实验例9]

(移植小鼠的血清中的人类IgG的检测)

对移植了人类造血干细胞的小鼠的血清中的人类IgG进行了检测。具体地，就在实验例5中用人类造血干细胞拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的、胚胎发育18.5天胎儿的血清中的人类IgG的检测而言，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移到PVDF膜上，并通过蛋白质印迹法进行了检测。另外，为了进行比较，对于在实验例6中移植了人类造血干细胞的野生型小鼠的、胚胎发育18.5天胎儿的血清中的人类IgG和人类血清中的人类IgG也相同地进行了检测。

在人类IgG的检测中，作为1次抗体使用了抗人类IgG抗体(目录号为“#62-8411”，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))。另外，作为2次抗体使用了HRP标记兔抗山羊抗体。

图13是示出蛋白质印迹法检测结果的照片。在图13中，泳道1是仅施加了缓冲剂的阴性对照的结果，泳道2是施加了(apply)稀释10倍的人类血清的结果，泳道3是施加了稀释50倍的人类血清的结果，泳道4是施加了用人类造血干细胞拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的血清的结果，泳道5是施加了已移植人类造血干细胞的野生型小鼠的血清的结果。另外，箭头指示大致为50kDa的人类IgG的条带的出现位置。

其结果，在泳道4中检测到人类IgG的条带。对此，在泳道5中未检测到人类IgG的条带。此外，在泳道2和泳道3的施加了人类血清的结果中，由于50kDa的信号过强，因而检测到的是亮白的状态。

从以上的结果确认出在用人类造血干细胞拯救的Runx1^-/-::Tg小鼠的血清中存在人类IgG。

(工业上的可利用性)

根据本发明，能够提供一种生产血液系统的细胞所具有的第一遗传背景和血液系统以外的细胞所具有的第二遗传背景互不相同的非人类动物的新技术。

Claims (6)

1.一种抗原特异性人类抗体的制备方法，其包括用抗原来免疫小鼠的工序，

在上述小鼠中，

血液系统的细胞为具有第一遗传背景的人类细胞，

血液系统以外的细胞具有第二遗传背景，上述第二遗传背景包括Runx1基因的敲除、Runx1基因的造血干细胞特异性条件性敲除、或者Runx1基因的参与造血干细胞产生的组织特异性条件性敲除，

上述第一遗传背景和上述第二遗传背景互不相同，

上述第二遗传背景是不形成造血干细胞的基因突变。

2.一种抗原特异性大鼠抗体的制备方法，其包括用抗原来免疫小鼠的工序，

在上述小鼠中，

血液系统的细胞为具有第一遗传背景的大鼠细胞，

血液系统以外的细胞具有第二遗传背景，上述第二遗传背景包括Runx1基因的敲除、Runx1基因的造血干细胞特异性条件性敲除、或者Runx1基因的参与造血干细胞产生的组织特异性条件性敲除，

上述第一遗传背景和上述第二遗传背景互不相同，

上述第二遗传背景是不形成造血干细胞的基因突变。

3.一种人类血细胞的制备方法，其中，

包括从权利要求1所述的小鼠采集血细胞的工序。

4.一种小鼠的生产方法，其用于生产血液系统的细胞所具有的第一遗传背景和血液系统以外的细胞所具有的第二遗传背景互不相同的小鼠，上述小鼠的生产方法包括：

将具有第一遗传背景的造血干细胞以经胎盘的方式移植到具有第二遗传背景的小鼠的早期胚胎的工序，其中，上述第二遗传背景包括Runx1基因的敲除、Runx1基因的造血干细胞特异性条件性敲除、或者Runx1基因的参与造血干细胞产生的组织特异性条件性敲除，上述第二遗传背景是不形成造血干细胞的基因突变，上述第一遗传背景和上述第二遗传背景互不相同；以及，

使上述早期胚胎生长而得到具有造血干细胞的小鼠的工序。

5.根据权利要求4所述的小鼠的生产方法，其中，

上述造血干细胞是人类细胞。

6.根据权利要求4所述的小鼠的生产方法，其中，

上述造血干细胞是大鼠细胞。