CN102391986A - 用动物生产人类成体多向干细胞 - Google Patents

Abstract

用动物生产人类成体多向干细胞，步骤包括：把人的体细胞诱导转化成iPS细胞，然后把进行抑制分化处理的iPS细胞与间充质干细胞和造血干细胞一起注入还没有建立起免疫耐受性的动物胚胎中，出生后再注射功能正常的iPS细胞，以后就可以在成年动物中源源不断提取人的干细胞。本发明具有生产出的人的成体干细胞年龄较低，多向分化潜能，增殖代数和分裂活性较高，而且可以为每个人进行量身定做。一般来说，年轻人身体比较健康，可一到老年期，就会变得体弱多病，什么癌症、糖尿病、心脑血管等等的疾病接踵而来。因此，逆转机体衰老可以让所有与增龄有关的疾病不攻自破。为此，制造遗传背景与患者一致、端粒较长的成体多向干细胞是逆转衰老和治愈顽疾的万能药物。

Description

用动物生产人类成体多向干细胞

技术领域

本发明属于生物医学领域，特别是涉及用动物生产人类成体多向干细胞。

背景技术

人类成体多向干细胞(adult multilineage stem cells)，是在个体组织中的一类可以自我更新和具有多向分化成多种组织细胞的干细胞，如造血干细胞、间充质干细胞及属于间充质干细胞的人类缪斯细胞(Muse cells)等。

一、个体是由干细胞与非干细胞组成的

个体中的器官组织是由干细胞和非干细胞组成的，非干细胞是器官组织中的一类功能细胞，通常不能自我更新，因端粒缩短、DNA突变等原因造成死亡而减少时可由干细胞通过分化来补充；干细胞因细胞分化、DNA突变等原因造成的死亡，也可以通过提高自我更新率来补充。

包括大脑神经元细胞在内的所有体细胞，每天平均大约有1％的细胞会因DNA突变、端粒缩短、细胞中的垃圾累积等等问题而发生死亡掉，但同时也有等量的细胞新生，靠的就是成体干细胞的自我更新和多向分化这两种功能。

二、骨髓是多向成体干细胞的中心

小鼠用致死量的放射线照射时，包括骨髓在内的全身所有的器官组织中的成体干细胞都会被射线杀死，但只要移植红骨髓就可以让小鼠活下来，这提示红骨髓中也许有一二种干细胞可以分化成个体所有器官组织中的成体干细胞。福建师大傅文庆教授认为，骨髓干细胞是成体干细胞中心(后来日本人也意识到这个问题)，可以支援或分化成机体其它所有器官组织的各种各样的成体干细胞，例如，骨髓间充质干细胞能够分化成胰腺干细胞、神经干细胞、内皮祖细胞等等。

幸运的是，在鼠类、人类骨髓中，美国和日本科学家分别发现两种接近于全能的多向成体干细胞，称迈阿密细胞(Miami细胞)和缪斯细胞(Muse细胞)，它们也能分化为具有内脏中胚层、神经外胚层和内胚层特征的细胞。

多向干细胞被誉为生命的种子，而红骨髓则是生命种子的仓库。红骨髓会随着年龄的增K而逐渐减少，当生命种子的源泉枯竭到一定程度时，油尽灯自熄，我们就是这样衰老死亡的！

如果骨髓是人体干细胞中心的理论是正确的话，因骨髓中含有造血干细胞、间充质干细胞和内皮祖细胞，由于内皮祖细胞是由间充质干细胞分化而来的，因此，只要补充遗传背景与宿主相同的年轻的造血干细胞和间充质干细胞这两种干细胞就可以使个体发生返老还童。

三、成体干细胞端粒缩短是造成个体衰老的首要原因

有不少学者认为，个体衰老是由个体组织中的成体干细胞数量减少造成的，而非成体干细胞本身发生增龄性的内在变化。据此认为，只要组织中的干细胞的自我更新率保持在0.5，即后代有50％左右仍然是干细胞，干细胞的数量就可以保持恒定不变，个体就可以青春永驻。实验室测定小鼠的造血干细胞的自我更新率高于0.5，一般在0.6至0.7之间。按理说小鼠不应该逐渐地发生衰老的，但实际上小鼠的个体还是发生了持续渐进性的增龄变化-衰老。这说明了什么？只能说明个体衰老是由组织中的成体干细胞本身发生了内在的增龄变化，而非干细胞数量的减少；蒋松柏用能够促进干细胞自我更新率的药物喂小鼠，小鼠的单核细胞数比对照组高167％(复旦大学生命科学院实验报告)，说明小鼠的细胞增殖活性非常旺盛，但是，小鼠最终还是摆脱不了自然的衰老与死亡。据此可以认为，采用分离出老年人体内的多向干细胞，在体外扩增后再注入老年人体内的疗法，不会使机体发生返老还童。

成体干细胞经过反复的对称性与非对称性分裂，染色体末端称为端粒的结构会越来越短。已经证明，端粒越短，基因的表达效率就越低，成体干细胞的自我更新潜能和多向分化潜能就越低，因此，成体干细胞端粒缩短是造成个体衰老的首要原因。

一般来说，年轻人身体比较健康，可一到老年期，就会变得体弱多病，什么癌症、糖尿病、心脑血管等等的疾病接踵而来。因此，逆转机体衰老可以让所有与增龄有关的疾病不攻自破。为此，制造遗传背景与患者一致、端粒较长的成体多向干细胞是逆转衰老和治愈顽疾的万能药物。

四、细胞衰老与细胞分化程序的逆转

把Oct3/4等四个基因转入体细胞，体细胞会经去分化过程，称“重编程”，变成诱导多能干细胞(induction ofpluripotent stem cells，iPS细胞)(山中伸弥等人，2006)。iPS细胞的性质与胚胎干细胞一样，具有全能性，可以分化成人体的200多种细胞。培养的iPS细胞能够分化成各种成体干细胞，如造血干细胞、间充质干细胞等。

重编程原理：不同分化类型的细胞，DNA有着不同的甲基化型式，即有着不同的表遗传，如果要全部回复到一致性，必须要先删除掉DNA上的所有甲基基团，以此消除不同类型细胞之间的表遗传差异。然后DNA再全部甲基化，以便以后用于重塑(分化)各种类型的细胞；为了让一种细胞能够按照先后顺序地塑造出各种不同类型的细胞(即塑造出不同的表遗传)，使基因能够按照发育程序的要求进行程序化表达。必须需要一种动力来推动基因程序运作，就像放电影时要由电动机提供动力推动胶带不断地向前位移，才能从头到尾顺序地播放节目、或计算机硬盘需要电动机推动硬盘旋转才能程序化地读取指令，因此，在细胞重编程过程中，相当于电影放映机或计算机硬盘驱动器中电动机的端粒也得到了有效地延伸，为以后的个体发育过程的基因程序化表达提供推动力，这就是作为生命种子的精子，其端粒为什么要延伸到15kb的原因。

总之，生物发育的表遗传程序的编制与指令读取和计算机、电影机的基本原理是一样的，只是方式不同而已。

发明内容

本发明的目的是用动物生产人类成体多向干细胞，其特征步骤包括：

1、把人的体细胞诱导转化成iPS细胞；

2、把iPS细胞植入无免疫力的裸鼠皮下，让iPS细胞发育成畸胎瘤，然后取出畸胎瘤并从瘤体中分离出间充质干细胞和造血干细胞；

3、把经过细胞抑制分化处理的iPS细胞与从畸胎瘤中分离的间充质干细胞和造血干细胞一起注入还没有建立起免疫耐受性的动物胚胎中。

4、动物胎儿出生后向动物胎儿注射一次功能正常的iPS细胞；

5、然后从动物血液或骨髓中分离出人的造血干细胞和间充质干细胞。

iPS细胞端粒长度可以保持一定水平，是一种可以保持永生化的和胚胎干细胞性质一样的干细胞，植入动物体内可以源源不断地分化出年轻的各种成体干细胞，使动物可以源源不断地为人类生产年轻的各种成体干细胞。因此，本发明具有生产出的人的成体干细胞年龄较低，多向分化潜能，增殖代数和分裂活性较高。而且可以为每个人进行量身定做，使成体干细胞的遗传背景和细胞接受者的人相同，不会被受者的免疫系统排斥掉，可以在受者体内长期生存和发挥作用。

具体实施方式

下面对本发明做进一步详细描述。

用动物生产人类成体多向干细胞，其特征步骤包括：

1、把人的体细胞诱导转化成iPS细胞；

2、把iPS细胞分成2份，一份iPS细胞暂时冻存备用，另一份iPS细胞植入无免疫力的裸鼠皮下，让iPS细胞发育成畸胎瘤，然后取出畸胎瘤并从瘤体中分离出间充质干细胞和造血干细胞，或把iPS细胞培养成胚状体(embryoidbodies，EBs)集落，然后从胚状体集落中分离出间充质干细胞和造血干细胞；

3、解冻一部分冻存的iPS细胞，然后进行细胞抑制分化处理，然后把经过细胞抑制分化处理的iPS细胞与从畸胎瘤或胚状体集落中分离的间充质干细胞和造血干细胞一起注入还没有建立起免疫耐受性的动物胚胎中，所述的动物胚胎可以是猪、羊、或鸡等。

4、解冻一部分冻存的iPS细胞，在动物胎儿出生后向动物胎儿注射一次功能正常的iPS细胞，饲养长大利用；

5、利用，是在动物生存期，每隔一段时间用干细胞动员剂把人的造血干细胞和间充质干细胞从动物骨髓中动员到血液中，或抽取动物的骨髓，然后从血液或骨髓中分离出人的造血干细胞和间充质干细胞，剩下的动物细胞要回输动物体内。

绵羊胚胎大约在45天至75天之间产建立起免疫耐受性的诱导，因此，iPS细胞、间充质干细胞和造血干细胞在绵羊的胎龄为45天至60天之间进行宫内移植为佳。其它品种的动物可根据实际情况确定时期。从胚状体集落中分离出的间充质干细胞和造血干细胞的细胞生物学年龄比较幼稚，注入动物胚胎后会归巢到胎肝部位，并逐渐发育成熟，使动物能够对各种生物学年龄的人间充质干细胞和造血干细胞产生耐受性，因为不同生物学年龄的细胞会有不同的基因发生表达。

绵羊体内的微环境比较适于人细胞生存，因此，人的细胞比例较大，据报道，绵羊-人细胞嵌合体的绵羊，含有15％的人细胞。

畸胎瘤中不但含有各种干细胞，而且还含有各种瘤体起源的非干细胞，干细胞是被各种非干细胞包裹在瘤体中的，很少能释放到血液循环中。本发明的动物，在胚胎产生免疫耐受期时没有接触过除了人的iPS细胞、间充质干细胞和造血干细胞以外的人体细胞，当人的iPS细胞、间充质干细胞和造血干细胞分化出各种人的体细胞时，这些人的体细胞就会很快被动物的免疫系统删除掉，只留下人的iPS细胞、间充质干细胞和造血干细胞，因此，干细胞不会被非干细胞包裹住，干细胞就可以不受约束地释放到血液循环中，并随着血液循环达到骨髓组织中定居。而所述的iPS细胞进行细胞抑制分化处理就是防止iPS细胞在胚胎中分化出其它类型的细胞，以此避免胚胎对除了iPS细胞、造血干细胞和间充质干细胞以外的由iPS细胞分化的其它类型的细胞产生免疫耐受。细胞抑制分化处理的方法可以把iPS细胞用大剂量辐射照射，或进行细胞脱核处理，目的就是使细胞不会进行分化，但细胞还活着。当然，也可能会有一部分动物，iPS细胞在动物体内会产生畸胎瘤，由于畸胎瘤是一种良性肿瘤，一般不会要动物的命，而且畸胎瘤中的造血干细胞和间充质干细胞也有一部分会释放到血液循环中。

畸胎瘤中含有各种成体干细胞和iPS细胞，因此，从畸胎瘤中可以分离出多种成体干细胞用于干细胞移植疗法，但是，科学家担心残余的少量iPS细胞有致瘤性，于是，今年美国斯坦福大学的科学家采用一种抗体成功地删除掉其中残余的iPS细胞。我认为这种做法是多余的，因为iPS细胞是胚胎产生免疫耐受期之前的细胞，有一些抗原没有经过免疫识别耐受，因此，即使遗传背景与宿主相同，宿主体内的免疫系统也会把它当做异物排斥掉。《参考消息》报2011.5.16日第七版题为“人工干细胞动物实验失败”，说：英国科学家把iPS移植到小鼠体内遭到排斥，造成这种后果我曾经(燕京医学通讯，1998；66：1058、1060，本文是内部刊物，要索取本文请到燕京函授医学院，地址：北京市海淀区复兴路21号(公主坟西北侧卫国中学内))说过，转化(年轻化)的干细胞可能会表达胚胎免疫系统没有识别和耐受的胚性抗原，会引发免疫排斥，如iPS细胞会表达Oct3/4基因，而该基因在成体细胞中则没有表达；今年5月13日在《自然》杂志的一篇文章报道：“重编程细胞同源移植也会排斥”，美国加州大学圣地亚哥分校的研究者把小鼠体细胞重编程的iPS细胞分化的成体细胞移植到细胞来源的小鼠体内，本来以为遗传背景相同不会发生排斥，可小鼠却快速排斥移植来的细胞。研究者发现由iPS细胞分化的成体细胞高表达两种基因，而这两种基因在正常小鼠体细胞内没有表达。因此，虽然从动物的血液和骨髓中分离的人成体干细胞中可能会污染少量的iPS细胞，但无需净化也可以放心使用。

导致上述“重编程细胞同源移植也会排斥”的原因有：(1)iPS细胞刚分化的细胞还没有成熟，即过于幼稚，还在表达胚胎免疫耐受前的基因，只要让细胞培养增殖几次，细胞就会成熟到不会表达胚性基因，成体的免疫系统就不会排斥它了。就像胎肝细胞会表达甲胎蛋白，成熟的肝细胞不会表达甲胎蛋白一样；(2)用于重编程的体细胞本身已经发生了突变，诱导转化成的iPS细胞同样携带突变的基因，再分化成的成体细胞还是携带突变的基因，个体的免疫系统当然会把它当做异物排斥掉，这和通常个体的免疫系统删除突变的体细胞的动机是一样的。

已有的生产干细胞的方法：(1)iPS细胞在适当的培养液下也可以分化成各种成体干细胞，但是，在体外培养的条件下每3个细胞分裂一次就有1次突变发生，并且其突变具有累积效应，因此，经过若干代增殖后，一群细胞中的大部分细胞都是突变的，不但没有实用价值，而且还有副作用；(2)今年日本科学家把人的iPS细胞注入无免疫力的裸鼠皮下，待畸胎瘤长到直径2厘米时取出，从瘤体中提取间充质干细胞获得成功，但是，无免疫力的裸鼠不会把突变的细胞删除掉，因此，时间长了，同样存在着突变累积效应，而且生产量又比较小；(3)把成体干细胞注入还没有建立起免疫耐受性的早期动物胚胎中，待动物出生后就可以生产人的成体干细胞，现在已经在绵羊体内成功地扩增了人的造血干细胞。但是，由于扩增的造血干细胞是取自成年人或老年人的，有着成年人或老年人的年龄烙印，又在动物体内分裂增殖，端粒会进一步地缩短，还是没有实用价值。

高等动物的免疫系统除了能够消灭外来病原体外，还能删除掉自身突变的细胞株。因此，在本发明的动物体内的人iPS细胞、间充质干细胞和造血干细胞如果有发生突变的细胞株，就会被动物的免疫系统删除掉，以此可以防止突变细胞的累积。

本发明的各种技术是现成的，这里无需详细赘述，请查看相关文献。

Claims (2)

1.用动物生产人类成体多向干细胞，其特征步骤包括：1、把人的体细胞诱导转化成iPS细胞；2、把iPS细胞分成2份，一份iPS细胞暂时冻存备用，另一份iPS细胞植入无免疫力的裸鼠皮下，让iPS细胞发育成畸胎瘤，然后取出畸胎瘤并从瘤体中分离出间充质干细胞和造血干细胞，或把iPS细胞培养成胚状体集落，然后从胚状体集落中分离出间充质干细胞和造血干细胞；3解冻一部分冻存的iPS细胞，然后进行细胞抑制分化处理，然后把经过细胞抑制分化处理的iPS细胞与从畸胎瘤或胚状体集落中分离的间充质干细胞和造血干细胞一起注入还没有建立起免疫耐受性的动物胚胎中；4、解冻一部分冻存的iPS细胞，在动物胎儿出生后向动物胎儿注射一次功能正常的iPS细胞，饲养长大利用；5、利用，是在动物生存期，每隔一段时间用干细胞动员剂把人的造血干细胞和间充质干细胞从动物骨髓中动员到血液中，或抽取动物的骨髓，然后从血液或骨髓中分离出人的造血干细胞和间充质干细胞，剩下的动物细胞要回输动物体内。

2.根据权利要求1所述的用动物生产人类成体多向干细胞，其特征是所述的动物胚胎是猪、羊、或鸡。