JPWO2019098362A1 - 非ヒト動物及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]血液系の細胞が第1の遺伝的背景を有しており、血液系以外の細胞が第2の遺伝的背景を有しており、前記第1の遺伝的背景と前記第2の遺伝的背景が異なっており、前記第2の遺伝的背景が造血幹細胞を形成しない遺伝子変異である、非ヒト動物。
[2]血液系の細胞の実質的に全てが前記第1の遺伝的背景を有している、[1]に記載の非ヒト動物。
[3]前記第2の遺伝的背景が、Runx1遺伝子又はmyb遺伝子の、ノックアウト、造血幹細胞特異的なコンディショナルノックアウト、又は造血幹細胞の発生に関与する組織特異的なコンディショナルノックアウトを含む、[1]又は[2]に記載の非ヒト動物。
[4]前記血液系の細胞がヒト細胞である、[1]〜[3]のいずれかに記載の非ヒト動物。
[5]前記血液系の細胞がラット細胞である、[1]〜[3]のいずれかに記載の非ヒト動物。
[6][4]に記載の非ヒト動物を抗原で免疫する工程を含む、前記抗原特異的ヒト抗体の製造方法。
[7][5]に記載の非ヒト動物を抗原で免疫する工程を含む、前記抗原特異的ラット抗体の製造方法。
[8][4]に記載の非ヒト動物から血液細胞を採取する工程を含む、ヒト血液細胞の製造方法。
[9]第2の遺伝的背景を有する非ヒト動物の初期胚に、第1の遺伝的背景を有する造血幹細胞を経胎盤的に移植する工程であって、前記第2の遺伝的背景が造血幹細胞を形成しない遺伝子変異であり、前記第1の遺伝的背景と前記第2の遺伝的背景が異なっている工程と、前記初期胚を成長させ、造血幹細胞を有する非ヒト動物を得る工程と、を含む、血液系の細胞が有する第1の遺伝的背景と血液系以外の細胞が有する第2の遺伝的背景が異なる非ヒト動物の製造方法。
[10]前記第2の遺伝的背景が、Runx1遺伝子又はmyb遺伝子の、ノックアウト、造血幹細胞特異的なコンディショナルノックアウト、又は造血幹細胞の発生に関与する組織特異的なコンディショナルノックアウトを含む、[9]に記載の製造方法。
[11]前記造血幹細胞がヒト細胞である、[9]又は[10]に記載の製造方法。
[12]前記造血幹細胞がラット細胞である、[9]又は[10]に記載の製造方法。
1実施形態において、本発明は、血液系の細胞が第1の遺伝的背景を有しており、血液系以外の細胞が第2の遺伝的背景を有しており、前記第1の遺伝的背景と前記第2の遺伝的背景が異なっており、前記第2の遺伝的背景が造血幹細胞を形成しない遺伝子変異である、非ヒト動物を提供する。
1実施形態において、本発明は、上述した非ヒト動物であって、血液系の細胞がヒト細胞である非ヒト動物を、抗原で免疫する工程を含む、前記抗原特異的ヒト抗体の製造方法を提供する。
1実施形態において、本発明は、上述した非ヒト動物であって、血液系の細胞がラット細胞である非ヒト動物を、抗原で免疫する工程を含む、前記抗原特異的ラット抗体の製造方法を提供する。
1実施形態において、本発明は、上述した非ヒト動物であって、血液系の細胞がヒト細胞である非ヒト動物から血液細胞を採取する工程を含む、ヒト血液細胞の製造方法を提供する。
1実施形態において、本発明は、第2の遺伝的背景を有する非ヒト動物の初期胚に、第1の遺伝的背景を有する造血幹細胞を経胎盤的に移植する工程であって、前記第2の遺伝的背景が造血幹細胞を形成しない遺伝子変異であり、前記第1の遺伝的背景と前記第2の遺伝的背景が異なっている工程と、前記初期胚を成長させ、造血幹細胞を有する非ヒト動物を得る工程と、を含む、血液系の細胞が有する第1の遺伝的背景と血液系以外の細胞が有する第2の遺伝的背景が異なる非ヒト動物の製造方法を提供する。
(マウス造血幹細胞の移植1)
《経肝臓的な移植の検討》
Runx1+/−::G1−HRD−Runx1の遺伝子型を有するLy5.2マウス(以下、「Runx1+/−::Tgマウス」という場合がある。)である母親マウスの胎仔に、コンジェニック系統であるC57BL/6−Ly5.1マウス(以下、「ドナーマウス」という場合がある。)の造血幹細胞を移植した。
続いて、経胎盤的な移植を検討した。具体的には、胎生11.5日のRunx1+/−::Tgマウスである母親マウスの胎仔に、経胎盤的にドナーマウスの造血幹細胞を移植した。
(移植マウスの解析)
実験例1における、ドナーマウスの造血幹細胞の経胎盤移植によりレスキューされた、Runx1−/−::Tgマウスを更に詳細に解析した。
まず、抗CD45.1抗体及び抗CD45.2抗体を用いたフローサイトメトリー解析により、レスキューされたRunx1−/−::Tgマウスの肝臓細胞における、ドナーマウス由来の細胞のキメラ率を検討した。ドナーマウス由来の細胞のキメラ率は、下記式(1)により算出した。
続いて、胎生18.5日の、Runx1+/+::Tgマウス、レスキューされなかったRunx1−/−::Tgマウス、レスキューされたRunx1−/−::Tgマウスの各マウスを用いて、胎仔肝臓細胞のコロニーアッセイを行った。
続いて、レスキューされたRunx1−/−::Tgマウスの肝臓及び脾臓におけるドナーマウス由来の細胞が、マクロファージ、Bリンパ球及びTリンパ球に分化しているか否かをフローサイトメトリーにより解析した。
(ラット造血幹細胞の移植)
Runx1−/−::Tgマウスを異種の造血幹細胞でレスキューできるか否かを検討した。
(移植マウスの解析)
実験例3における、ラットの造血幹細胞の経胎盤移植によりレスキューされた、Runx1−/−::Tgマウスを更に詳細に解析した。
まず、抗マウス抗CD45.2抗体及び抗ラットCD45抗体を用いたフローサイトメトリー解析により、胎生18.5日のレスキューされたRunx1−/−::Tgマウスの肝臓細胞における、ラット由来の細胞のキメラ率を検討した。ラット由来の細胞のキメラ率は、下記式(2)により算出した。
続いて、96%のキメラ率を示した、レスキューされたRunx1−/−::Tgマウスの肝臓におけるラット由来の細胞が、マクロファージ、Bリンパ球、Tリンパ球及び赤血球に分化しているか否かをフローサイトメトリーにより解析した。
(ヒト造血幹細胞の移植1)
Runx1−/−::Tgマウスをヒト造血幹細胞でレスキューできるか否かを検討した。
先行文献を参考にして、ヒト臍帯血由来造血幹細胞を培養した(Boitano, A.E. et al., Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells, Science, 329 (5997), 1345-1348, 2010.; Wagner, J.E., Jr. et al., Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft, Stem Cell, 18 (1), 144-155, 2016. を参照。)。ヒト臍帯血由来造血幹細胞は、筑波大学血液内科千葉茂教授より分与された。
1胎仔あたり、それぞれ20ngのヒトサイトカイン(トロンボボエチン、IL−6、Flt3−L、stem cell factor)及び1×104個のヒト臍帯血由来造血幹細胞を、実験例1と同様にして、Runx1+/−::Tgマウスである母親マウスの胎生11.5日胎仔に経胎盤的に移植した。続いて、胎生18.5日の胎仔の肝臓を回収し、フローサイトメトリーにより解析した。
(ヒト造血幹細胞の移植2)
野生型マウスをヒト造血幹細胞でレスキューできるか否かを検討した。まず、ヒト臍帯血由来造血幹細胞を実験例5と同様にして調製した。続いて、野生型マウスの胎生11.5日胎仔48匹に、1胎仔あたり、それぞれ20ngのヒトサイトカイン(トロンボボエチン、IL−6、Flt3−L、stem cell factor)及び0.2×104個〜5×104個のヒト臍帯血由来造血幹細胞を、実験例1と同様にして経胎盤的に移植した。その後、48匹中34匹のマウスが自然分娩により産まれ、4週齢まで成長した。
(マウス造血幹細胞の移植2)
Runx1f/−::Tie2−Cre::G1−HRD−Runx1の遺伝子型を有するLy5.2マウス(以下、「Runx1 cKOマウス」という場合がある。)である母親マウスの胎仔に、コンジェニック系統であるC57BL/6−Ly5.1マウス(以下、「ドナーマウス」という場合がある。)の造血幹細胞を、実験例1と同様にして経胎盤的に移植した。続いて、胎生18.5日の胎仔の肝臓を回収し、肝臓細胞のフローサイトメトリー解析を行った。
(造血再構築能の検討)
実験例7でレスキューされたRunx1 cKO胎仔由来の造血幹細胞の2次移植を行い、自己複製能を検討した。具体的には、胎生18.5日のレスキューされたRunx1 cKO胎仔の肝臓細胞を1×107個/100μLに調整し、全身放射線照射(7Gy)した6週齢のメスマウスに、1頭あたり100μLずつ尾静脈注射により移植した。その後、2次移植を受けたレシピエントマウスの末梢血を、経時的にフローサイトメトリー解析した。
(移植マウスの血清中のヒトIgGの検出)
ヒト造血幹細胞を移植したマウスの血清中のヒトIgGを検出した。具体的には、実験例5において、ヒト造血幹細胞でレスキューしたRunx1−/−::Tgマウスの、胎生18.5日胎仔の血清中のヒトIgGをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、PVDF膜に転写して、ウエスタンブロッティングにより検出した。また、比較のために、実験例6においてヒト造血幹細胞を移植した野生型マウスの、胎生18.5日胎仔の血清中のヒトIgG、及び、ヒト血清中のヒトIgGについても同様に検出した。
Claims (12)
- 血液系の細胞が第1の遺伝的背景を有しており、血液系以外の細胞が第2の遺伝的背景を有しており、前記第1の遺伝的背景と前記第2の遺伝的背景が異なっており、前記第2の遺伝的背景が造血幹細胞を形成しない遺伝子変異である、非ヒト動物。
- 血液系の細胞の実質的に全てが前記第1の遺伝的背景を有している、請求項1に記載の非ヒト動物。
- 前記第2の遺伝的背景が、Runx1遺伝子又はmyb遺伝子の、ノックアウト、造血幹細胞特異的なコンディショナルノックアウト、又は造血幹細胞の発生に関与する組織特異的なコンディショナルノックアウトを含む、請求項1又は2に記載の非ヒト動物。
- 前記血液系の細胞がヒト細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
- 前記血液系の細胞がラット細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
- 請求項4に記載の非ヒト動物を抗原で免疫する工程を含む、前記抗原特異的ヒト抗体の製造方法。
- 請求項5に記載の非ヒト動物を抗原で免疫する工程を含む、前記抗原特異的ラット抗体の製造方法。
- 請求項4に記載の非ヒト動物から血液細胞を採取する工程を含む、ヒト血液細胞の製造方法。
- 第2の遺伝的背景を有する非ヒト動物の初期胚に、第1の遺伝的背景を有する造血幹細胞を経胎盤的に移植する工程であって、前記第2の遺伝的背景が造血幹細胞を形成しない遺伝子変異であり、前記第1の遺伝的背景と前記第2の遺伝的背景が異なっている工程と、
前記初期胚を成長させ、造血幹細胞を有する非ヒト動物を得る工程と、
を含む、血液系の細胞が有する第1の遺伝的背景と血液系以外の細胞が有する第2の遺伝的背景が異なる非ヒト動物の製造方法。 - 前記第2の遺伝的背景が、Runx1遺伝子又はmyb遺伝子の、ノックアウト、造血幹細胞特異的なコンディショナルノックアウト、又は造血幹細胞の発生に関与する組織特異的なコンディショナルノックアウトを含む、請求項9に記載の製造方法。
- 前記造血幹細胞がヒト細胞である、請求項9又は10に記載の製造方法。
- 前記造血幹細胞がラット細胞である、請求項9又は10に記載の製造方法。
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