JP7136509B2 - 肝細胞培養膜、それを備えた薬物輸送能評価キット、及び薬物輸送能評価方法 - Google Patents
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Description
第一被検液を収めるインサート容器筒の底に設けられた多孔質プラスチックフィルム上で、肝癌細胞と、胆管癌細胞と、遊離肝細胞と、動物由来ヒト化新鮮肝細胞との少なくとも何れかの細胞を、播種し、隙間なく並んだ単層の膜状に培養して、膜状細胞層にすることにより、前記膜状細胞層が、前記膜状細胞層の下側で血管側となり、前記膜状細胞層の上側で胆管側となる配向性を有している肝細胞培養膜を形成して、肝細胞培養膜担持インサート容器を調製する工程と、
前記肝細胞培養膜担持インサート容器を挿入するウェルを有しており前記肝細胞培養膜が浸漬される第二被検液を収めるウェルプレートを調製する工程と、
前記肝細胞培養膜担持インサート容器に、薬物輸送能の測定対象薬物を含有させた前記第一被検液を収め、前記ウェルプレートの前記ウェルに、前記測定対象薬物を含有しない前記第二被検液を収め、前記肝細胞培養膜を前記第二被検液に浸漬した後、前記胆管側から前記血液側への前記測定対象薬物の輸送量を測定する血液側輸送量測定工程と、
前記肝細胞培養膜担持インサート容器に、前記測定対象薬物を含有しない前記第一被検液を収め、前記ウェルプレートの前記ウェルに、前記測定対象薬物を含有させた前記第二被検液を収め、前記肝細胞培養膜を前記第二被検液に浸漬した後、前記血液側から前記胆管側への前記測定対象薬物の輸送量を測定する胆管側輸送量測定工程と、
それぞれの輸送量を経時的に測定することで輸送速度を算出する工程と、
それら血液側輸送速度及び胆管側輸送速度の比を算出して、前記測定対象薬の薬物輸送能を求める薬物輸送能算出工程とを、有しているというものである。
胆管癌細胞としては、市販の肝癌細胞株、例えば、胆管癌細胞株TFK-1(国立大学法人東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター)、ヒト不死化胆管由来細胞株MMNK-1(JCRB)、不死化ヒト肝内皮細胞株(JCRB)、類洞内皮癌細胞が挙げられる。
遊離肝細胞としては、初代遊離肝細胞(プライマリー肝細胞)、例えばヒト肝細胞株Chang-Liver(コスモ・バイオ株式会社など)が挙げられる。
動物由来ヒト化新鮮肝細胞としては、例えばPXB-cell(PhoenixBio社)、免疫不全動物にヒト細胞が生着した動物由来肝細胞(公益財団法人実験動物中央研究所)が挙げられる。
また、肝細胞に誘導される前駆体培養細胞である場合、人工多能性幹細胞:iPS細胞としては、例えばiCell肝細胞(富士フイルム株式会社)、Cellartis(タカラバイオ株式会社)が挙げられる。
図2に示すようにして、HepG2細胞(JCRB)を用いた例について、肝細胞培養膜14、薬物輸送能評価キット1、薬物輸送能評価方法の具体的な実施例を以下に示す。
[材料]
試薬として、DMEM(high glucose)(富士フィルム和光純薬株式会社製)、FBS(biosera社製)、デオキシコール酸(富士フィルム和光純薬株式会社製)、BSP(MP Biochemicals社製)を用いた。
[細胞培養]
HepG2は、DMEMに10%のFBSを添加した培地で培養した。12ウェルインサートにおよそ2×105個/cm2で播種をし、播種後1日と4日目に胆管側のみ胆汁酸100μMを添加した培地に交換、血管側は培地を交換した。培養7日目に以下の実験に使用した。
[輸送実験]
トランスポートバッファーはHBSS-HEPES(pH7.4)を使用した。
基質薬物は、24μMBSPとした。
培養したプレートを膜上細胞層形成の確認のため、Millicell ERM2(Merck Millipore社製)を用いて膜抵抗値を測定した。
ウェルインサートを0.9%NaClで洗浄した。
トランスポーターの基質薬物(BSP)を輸送物質とし、A側からB側の輸送の場合は基質薬物を第一被検液とし、トランスポートバッファーを第二被検液とした。B側からA側の輸送の場合はトランスポートバッファーを第一被検液とし、基質薬物を第二被検液とした。作業は37℃水浴上で行った。
バッファー量は12wellインサートの場合は第一被検液0.5mL、第二被検液1.5mLとした。
輸送薬物を添加した反対側から、15、30、45、60分後、液量の10%を採取した。その都度採取した等量のバッファーを添加した。
採取したサンプルについて、HPLC(株式会社島津製作所製、商品名:DIODE ARRAY DETECTOR SPD-M20Aを検出器とするシステム一式)を用いて濃度を測定した。
[計算法]
得られた濃度より、それぞれの輸送方向(A to B,B to A)の輸送速度(P(cm/sec))を算出し、Efflux ratio(B to AのP/A to BのP)を算出した。計算法は以下の通りである。
HuH-7細胞(JCRB)を用いた例について、実施例1に準じて行った実施例について、以下に詳細に示す。
[材料]
試薬として、DMEM(low glucose)(SIGMA社製)、Rho123(SIGMA社製)、ベラパミル(富士フィルム和光純薬株式会社製)、その他の材料は、実施例1に準じた。
[細胞培養]
HuH-7は、DMEM(low glucose)に10%のFBSを添加した培地で培養した。
24ウェルインサートにおよそ2×105個/cm2で播種をし、播種後1日と4日目に培地交換を行った。培養7日目に以下の実験に使用した。
[輸送実験]
基質薬物は10μMRho123とし、阻害物質は100μMベラパミルとした。
培養したプレートを膜上細胞層形成の確認のため、Millicell ERM2(Merck Millipore社製)を用いて膜抵抗値を測定した。
ウェルインサートを0.9%NaClで洗浄した。
阻害剤無添加の場合にはトランスポートバッファーを第一被検液、第二被検液として、37℃水浴上で10分間インキュベートした。
その後、トランスポーターの基質薬物(Rho123)を輸送物質とし、A側からB側の輸送の場合は基質薬物を第一被検液とし、トランスポートバッファーを第二被検液とした。B側からA側の輸送の場合はトランスポートバッファーを第一被検液とし、基質薬物を第二被検液とした。
阻害剤を添加する場合は、阻害物質を含む溶液を第一被検液、第二被検液として、37℃水浴上で10分間インキュベートした。
その後、A側からB側の輸送の場合は基質薬物と阻害物質を含む溶液を第一被検液とし、阻害物質を含むトランスポートバッファーを第二被検液とした。B側からA側の輸送の場合は阻害物質を含むトランスポートバッファーを第一被検液とし、基質薬物と阻害物質を含む溶液を第二被検液とした。
すべての作業は37℃水浴上で行った。
採取したサンプルについて蛍光プレートリーダー(Perkin Elmer社製、製品名:ARVO MX)励起波長485nm/蛍光波長535nmで測定した。
その他の条件は実施例1に準じた。
[計算法]
得られた濃度より、それぞれの輸送方向(A to B、B to A)の輸送速度(P(cm/sec))を算出し、Efflux ratio(B to AのP/A to BのP)を算出した。さらに基質薬物のみのときのEfflux ratio(ERn)を阻害物質存在下でのEfflux ratio(ERi)で割った値を算出した。計算法は、以下の通りである。
その結果を表1に示す。
Claims (10)
- 肝癌細胞と、胆管癌細胞と、遊離肝細胞と、動物由来ヒト化新鮮肝細胞との少なくとも何れかの細胞が、多孔質プラスチックフィルム上で隙間なく並んで単層の膜状に培養された膜状細胞層を形成しており、前記細胞が、前記膜状細胞層の下側で血管側となり、前記膜状細胞層の上側で胆管側となる配向性を有していることを特徴とする単層の膜状細胞層と多孔質プラスチックフィルムとからなる肝細胞培養膜。
- 請求項1に記載の肝細胞培養膜が底に設けられており第一被検液を収める肝細胞培養膜担持インサート容器と、前記肝細胞培養膜担持インサート容器が挿入されているウェルを有しており前記肝細胞培養膜が浸漬される第二被検液を収めるウェルプレートとを、備えていることを特徴とする薬物輸送能評価キット。
- 前記多孔質プラスチックフィルムが、含フッ素樹脂、ポリカーボネート、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアミド、ポリイミド、セルロース、及び再生セルロースから選ばれる何れかのプラスチックで形成されていることを特徴とする請求項2に記載の薬物輸送能評価キット。
- 前記多孔質プラスチックフィルムが前記肝細胞の大きさよりも小さな多孔を有し、又はその多孔の開口部がパターン状に配列されていることを特徴とする請求項2に記載の薬物輸送能評価キット。
- 前記多孔質プラスチックフィルムが、コラーゲン、及び/又はフィブロネクチンでコーティングされていることを特徴とする請求項2に記載の薬物輸送能評価キット。
- 前記第一被検液と、前記第二被検液との少なくとも何れかに胆汁酸が含有されていることを特徴とする請求項2に記載の薬物輸送能評価キット。
- 請求項2~6の何れかに記載の薬物輸送能評価キットを用い、前記肝細胞培養膜担持インサート容器の内部の前記第一被検液と、前記肝細胞培養膜担持インサート容器の外部にあって前記ウェルプレートの前記ウェルの内部の前記第二被検液との何れかに、測定対象薬物を加え、前記膜状細胞層と前記多孔質プラスチックフィルムとの前記肝細胞培養膜を介して、前記測定対象薬物の輸送量を経時的に測定し、輸送速度を算出することにより、薬物輸送能を評価することを特徴とする薬物輸送能評価方法。
- 第一被検液を収めるインサート容器筒の底に設けられた多孔質プラスチックフィルム上で、肝癌細胞と、胆管癌細胞と、遊離肝細胞と、動物由来ヒト化新鮮肝細胞との少なくとも何れかの細胞を、播種し、隙間なく並んだ単層の膜状に培養して、膜状細胞層にすることにより、前記膜状細胞層が、前記膜状細胞層の下側で血管側となり、前記膜状細胞層の上側で胆管側となる配向性を有している肝細胞培養膜を形成して、肝細胞培養膜担持インサート容器を調製する工程と、
前記肝細胞培養膜担持インサート容器を挿入するウェルを有しており前記肝細胞培養膜が浸漬される第二被検液を収めるウェルプレートを調製する工程と、
前記肝細胞培養膜担持インサート容器に、薬物輸送能の測定対象薬物を含有させた前記第一被検液を収め、前記ウェルプレートの前記ウェルに、前記測定対象薬物を含有しない前記第二被検液を収め、前記肝細胞培養膜を前記第二被検液に浸漬した後、前記胆管側から前記血液側への前記測定対象薬物の輸送量を測定する血液側輸送量測定工程と、
前記肝細胞培養膜担持インサート容器に、前記測定対象薬物を含有しない前記第一被検液を収め、前記ウェルプレートの前記ウェルに、前記測定対象薬物を含有させた前記第二被検液を収め、前記肝細胞培養膜を前記第二被検液に浸漬した後、前記血液側から前記胆管側への前記測定対象薬物の輸送量を測定する胆管側輸送量測定工程と、
それぞれの輸送量を経時的に測定することで輸送速度を算出する工程と、
それら血液側輸送速度及び胆管側輸送速度の比を算出して、前記測定対象薬の薬物輸送能を求める薬物輸送能算出工程とを、有していることを特徴とする薬物輸送能評価方法。 - 前記血液側輸送量測定工程中、さらに前記第一被検液と前記第二被検液とにトランスポーターのインヒビターを添加して行い、前記胆管側輸送量測定工程中、さらに前記第一被検液と前記第二被検液とにトランスポーターのインヒビターを添加して行い、それらについても胆管側輸送量測定工程を行い、前記薬物輸送能算出工程で、インヒビター未添加でのそれら血液側輸送速度及び胆管側輸送速度の比と、インヒビター添加でのそれら血液側輸送速度及び胆管側輸送速度の比との比を算出して、前記測定対象薬の薬物輸送能を求めることを特徴とする請求項8に記載の薬物輸送評価方法。
- 肝癌細胞と、胆管癌細胞と、遊離肝細胞と、動物由来ヒト化新鮮肝細胞との少なくとも何れかの細胞を、多孔質プラスチックフィルム上で培養して膜状細胞層を形成し、前記膜状細胞層の下側で血管側となり前記膜状細胞層の上側で胆管側となる配向性を発現させるための肝細胞培地であって、培養成分と、胆汁酸とを有していることを特徴とする、配向性増強肝細胞培地。
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