JP7021177B2 - 人工の腎臓組織、そのアレイ、およびその作製方法 - Google Patents
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Description
本願は、2014年10月6日に出願された米国特許出願第62/060,416号、および2015年3月30日に出願された米国特許出願第62/140,285号の恩典を主張する。これらの全開示は参照により本明細書に組み入れられる。
新薬を市場に出す、すなわち、臨床試験を通じた発見から認可までの総費用は、典型的には、数億米ドルまたは数十億米ドルである。これは、一つには、ヒトにおいて試験された実験薬の95%が有効でも安全でもないことが理由である。腎毒性は臨床試験段階での薬物減少の大きな原因であり、この毒性の主な部位は近位尿細管内にある。
[本発明1001]
a.腎臓線維芽細胞および内皮細胞を含む腎臓間質組織の層と、
b.尿細管上皮細胞を含む腎臓上皮組織の層であって、人工の三次元生体尿細管モデルを形成するように腎臓間質組織の層と接触している、腎臓上皮組織の層と
を含む、人工の三次元生体尿細管モデルであって、
但し、前記間質組織が間質バイオインクを含み、前記上皮組織が上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体尿細管モデルを形成する、
人工の三次元生体尿細管モデル。
[本発明1002]
腎臓間質組織の層が頂端面および側底面を有する、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1003]
腎臓上皮組織の層が腎臓間質組織の層の頂端面と接触している、本発明1002の尿細管モデル。
[本発明1004]
腎臓上皮組織の層が尿細管上皮細胞から本質的になる、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1005]
腎臓上皮組織の層が初代尿細管上皮細胞から本質的になる、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1006]
初代尿細管上皮細胞が、腎機能に影響を及ぼす疾患をもつ対象から単離されている、本発明1005の尿細管モデル。
[本発明1007]
初代尿細管上皮細胞が、多発性嚢胞腎をもつ対象から単離されている、本発明1005の尿細管モデル。
[本発明1008]
初代尿細管細胞が、II型糖尿病をもつ対象から単離されている、本発明1005の尿細管モデル。
[本発明1009]
腎臓上皮組織の層が腎細胞癌細胞を含む、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1010]
腎臓上皮組織の層が実質的に単層である、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1011]
腎臓間質組織の層が実質的に単層である、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1012]
腎臓上皮組織の層が腎臓間質組織の層と途切れることなく接触している、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1013]
腎臓上皮組織の層が、腎臓間質組織の層の頂端面と接触しており、かつそれを50%以上覆っている、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1014]
腎臓上皮組織の層が、腎臓間質組織の層の頂端面と接触しており、かつそれを70%以上覆っている、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1015]
腎臓上皮組織の層が、腎臓間質組織の層の頂端面と接触しており、かつそれを90%以上覆っている、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1016]
腎臓上皮組織の層にある細胞の少なくとも50%が、腎臓上皮組織の層の別の細胞と密着結合を形成している、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1017]
腎臓上皮組織の層にある細胞の少なくとも70%が、腎臓上皮組織の層の別の細胞と密着結合を形成している、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1018]
腎臓上皮組織の層にある細胞の少なくとも90%が、腎臓上皮組織の層の別の細胞と密着結合を形成している、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1019]
50~500μm厚である、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1020]
約100μm厚である、本発明1019の尿細管モデル。
[本発明1021]
腎臓上皮組織の層が押出材料をさらに含む、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1022]
線維芽細胞および内皮細胞が約95:5~約5:95の線維芽細胞:内皮細胞比で腎臓間質組織の層に存在する、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1023]
線維芽細胞および内皮細胞が約75:25~約25:75の線維芽細胞:内皮細胞比で腎臓間質組織の層に存在する、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1024]
線維芽細胞および内皮細胞が約60:40~約40:60の線維芽細胞:内皮細胞比で腎臓間質組織の層に存在する、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1025]
線維芽細胞および内皮細胞が約50:50の線維芽細胞:内皮細胞比で腎臓間質組織の層に存在する、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1026]
腎臓間質組織の層が分泌細胞をさらに含む、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1027]
腎臓間質組織の層が免疫細胞をさらに含む、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1028]
腎臓間質組織の層が押出材料をさらに含む、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1029]
腎臓間質組織の層が糸球体細胞を含む、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1030]
使用時に、前もって形成されたスキャフォールドを実質的に伴わない、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1031]
腎臓線維芽細胞、内皮細胞、および尿細管上皮細胞が哺乳動物細胞である、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1032]
腎臓間質組織の層または腎臓上皮組織の層のどちらかが少なくとも30体積%生細胞である、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1033]
腎臓間質組織の層または腎臓上皮組織の層のどちらかが少なくとも70体積%生細胞である、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1034]
腎臓間質組織の層または腎臓上皮組織の層のどちらかが少なくとも90体積%生細胞である、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1035]
実質的に平らである、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1036]
実質的に均一な厚さである、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1037]
バイオプリントされた少なくとも1種類の成分を含む、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1038]
押出しによってバイオプリントされた少なくとも1種類の成分を含む、本発明1037の尿細管モデル。
[本発明1039]
生体適合膜をさらに含む、本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1040]
孔径が約0.4μm超の生体適合膜をさらに含む、本発明1039の尿細管モデル。
[本発明1041]
孔径が約1μmの生体適合膜をさらに含む、本発明1039の尿細管モデル。
[本発明1042]
アレイを形成するように構成されている、複数の本発明1001の尿細管モデル。
[本発明1043]
それぞれの尿細管モデルの間に約20μm~約100μmのスペースをとるように構成されている、本発明1042の複数の尿細管モデル。
[本発明1044]
a.腎臓間質バイオインクを調製する工程であって、該間質バイオインクが複数の間質細胞タイプを含み、該間質細胞タイプが腎臓線維芽細胞および内皮細胞を含む、工程;腎臓上皮バイオインクを調製する工程であって、該上皮バイオインクが尿細管上皮細胞を含む、工程;
b.腎臓間質バイオインクの層の少なくとも1つの表面に腎臓上皮バイオインクが層を形成するように、前記腎臓間質バイオインクおよび前記腎臓上皮バイオインクを付着させる工程;ならびに
c.細胞を密着させて、人工の三次元生体尿細管モデルを形成するように、前記付着されたバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程
を含む、人工の三次元生体尿細管モデルを製作する方法。
[本発明1045]
腎臓間質組織バイオインクを付着させる工程が、頂端面および側底面を有する腎臓間質組織の層を形成する、本発明1044の方法。
[本発明1046]
腎臓上皮バイオインクが、腎臓間質組織の層の頂端面と接触して付着される、本発明1044の方法。
[本発明1047]
腎臓上皮バイオインクが尿細管上皮細胞から本質的になる、本発明1044の方法。
[本発明1048]
腎臓上皮バイオインクが初代尿細管上皮細胞から本質的になる、本発明1044の方法。
[本発明1049]
初代尿細管上皮細胞が、腎機能に影響を及ぼす疾患をもつ対象から単離されている、本発明1048の方法。
[本発明1050]
初代尿細管上皮細胞が、多発性嚢胞腎をもつ対象から単離されている、本発明1048の方法。
[本発明1051]
初代尿細管上皮細胞が、II型糖尿病をもつ対象から単離されている、本発明1048の方法。
[本発明1052]
腎臓上皮バイオインクが腎細胞癌細胞を含む、本発明1044の方法。
[本発明1053]
腎臓上皮バイオインクが単層で付着される、本発明1044の方法。
[本発明1054]
腎臓間質組織バイオインクが単層で付着される、本発明1044の方法。
[本発明1055]
腎臓上皮組織の層が腎臓間質組織の層と途切れることなく接触して付着される、本発明1044の方法。
[本発明1056]
腎臓上皮バイオインクが、腎臓間質組織の層の頂端面を50%以上覆う層を形成する、本発明1044の方法。
[本発明1057]
腎臓上皮バイオインクが、腎臓間質組織の層の頂端面を70%以上覆う層を形成する、本発明1044の方法。
[本発明1058]
腎臓上皮バイオインクが、腎臓間質組織の層の頂端面を90%以上覆う層を形成する、本発明1044の方法。
[本発明1059]
腎臓上皮層の腎臓上皮細胞の少なくとも50%が、他の腎臓上皮細胞と密着結合を形成する、本発明1044の方法。
[本発明1060]
腎臓上皮層の腎臓上皮細胞の少なくとも70%が、他の腎臓上皮細胞と密着結合を形成する、本発明1044の方法。
[本発明1061]
腎臓上皮層の腎臓上皮細胞の少なくとも90%が、他の腎臓上皮細胞と密着結合を形成する、本発明1044の方法。
[本発明1062]
尿細管モデルが50~500μm厚である、本発明1044の方法。
[本発明1063]
尿細管モデルが約100μm厚である、本発明1044の方法。
[本発明1064]
腎臓上皮バイオインクが押出材料をさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1065]
線維芽細胞および内皮細胞が約95:5~約5:95の線維芽細胞:内皮細胞比で腎臓間質バイオインクに存在する、本発明1044の方法。
[本発明1066]
線維芽細胞および内皮細胞が約75:25~約25:75の線維芽細胞:内皮細胞比で腎臓間質バイオインクに存在する、本発明1044の方法。
[本発明1067]
線維芽細胞および内皮細胞が約60:40~約40:60の線維芽細胞:内皮細胞比で腎臓間質バイオインクに存在する、本発明1044の方法。
[本発明1068]
線維芽細胞および内皮細胞が約50:50の線維芽細胞:内皮細胞比で腎臓間質バイオインクに存在する、本発明1044の方法。
[本発明1069]
腎臓間質バイオインクが分泌細胞をさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1070]
腎臓間質バイオインクが免疫細胞をさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1071]
腎臓間質バイオインクが押出材料をさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1072]
腎臓間質バイオインクが糸球体細胞を含む、本発明1044の方法。
[本発明1073]
前もって形成されたスキャフォールドを実質的に伴わずに前記モデルが製作される、本発明1044の方法。
[本発明1074]
腎臓線維芽細胞、内皮細胞、および尿細管上皮細胞が哺乳動物細胞である、本発明1044の方法。
[本発明1075]
腎臓間質バイオインクまたは腎臓上皮バイオインクのいずれかが、付着後に平らな層を形成する、本発明1044の方法。
[本発明1076]
尿細管モデルが、実質的に均一な厚さの尿細管モデルである、本発明1044の方法。
[本発明1077]
腎臓間質バイオインクを生体適合膜上に付着させる工程をさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1078]
腎臓間質バイオインクを、孔径が0.4μm超の生体適合膜上に付着させる工程をさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1079]
腎臓間質バイオインクを、孔径が約1μmの生体適合膜上に付着させる工程をさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1080]
人工の三次元生体尿細管モデルが、アレイを形成するように付着される、本発明1044の方法。
[本発明1081]
人工の三次元生体尿細管モデルが、それぞれの尿細管モデルの間に約20μm~約100μmのスペースをとるように構成されているアレイを形成するように付着される、本発明1044の方法。
[本発明1082]
腎臓間質バイオインクが少なくとも30体積%生細胞である、本発明1044の方法。
[本発明1083]
腎臓間質バイオインクが少なくとも70体積%生細胞である、本発明1044の方法。
[本発明1084]
腎臓間質バイオインクが少なくとも90体積%生細胞である、本発明1044の方法。
[本発明1085]
腎臓間質バイオインクが押出しバイオプリンティングによって付着される、本発明1044の方法。
[本発明1086]
腎臓上皮バイオインクがインクジェットバイオプリンティングによって付着される、本発明1044の方法。
[本発明1087]
尿細管モデルのどの層もインビトロ培養で3日後に生存可能である、本発明1044の方法。
[本発明1088]
尿細管モデルのどの層もインビトロ培養で10日後に生存可能である、本発明1044の方法。
[本発明1089]
a.腎臓間質バイオインクを調製する工程であって、該間質バイオインクが複数の間質細胞タイプを含み、該間質細胞タイプが腎臓線維芽細胞および内皮細胞を含む、工程;腎臓上皮バイオインクを調製する工程であって、該上皮バイオインクが尿細管上皮細胞を含む、工程;
b.間質バイオインクの少なくとも1つの表面に上皮バイオインクが層を形成するように、前記間質バイオインクおよび前記上皮バイオインクを付着させる工程;ならびに
c.細胞を密着させて、人工の三次元生体尿細管モデルを形成するように、前記付着されたバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程;
d.治療剤を構築物と接触させる工程;
e.尿細管上皮細胞の生存能力または機能を測定する工程;ならびに
f.尿細管上皮細胞の測定された生存能力または機能に基づいて治療剤の腎毒性を評価する工程
を含む、治療剤の腎毒性を評価する方法。
[本発明1090]
間質バイオインクが押出しバイオプリンティングによって付着される、本発明1089の方法。
[本発明1091]
上皮バイオインクがインクジェットバイオプリンティングによって付着される、本発明1089の方法。
[本発明1092]
間質バイオインクまたは上皮バイオインクのいずれかが治療用分子または治療用物質をさらに含む、本発明1089の方法。
人工の三次元生体尿細管モデルであって、腎臓線維芽細胞および内皮細胞を含む腎臓間質組織の層と、尿細管上皮細胞を含む腎臓上皮組織の層であって、人工の三次元生体尿細管モデルを形成するように腎臓間質組織の層と接触している、腎臓上皮組織の層を含み、但し、間質組織が間質バイオインクを含み、上皮組織が上皮バイオインクを含み、人工の三次元生体尿細管モデルを形成する、人工の三次元生体尿細管モデルが本明細書において提供される。
特に定義のない限り、本明細書において用いられる技術用語は全て、本発明が属する当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈によってはっきりと規定されていない限り複数への言及を含む。本明細書における「または」についての、あらゆる言及は、特に定めのない限り、「および/または」を包含することが意図される。
一部の態様において、組織内の細胞は、尿細管間質組織境界面の層構造を再現するように空間的に組織化される。極性化した尿細管上皮は、内皮細胞をベースとする微小血管網を含む腎臓間質組織の層の上に存在する。任意で、EPO産生細胞などの専門化した細胞が管周囲空間内に含まれる。一部の態様において、上皮は刷子縁を有するか、または発生する。
一部の態様において、本明細書に記載の人工の組織、アレイ、および方法は複数の細胞タイプを含む。一部の態様において、尿細管モデルは、哺乳動物線維芽細胞および哺乳動物内皮細胞を含む間質組織の層を含む。様々な態様において、適切な内皮細胞はヒト臍帯静脈(HUVEC)、ヒト初代、ヒト腎臓に由来するか、または人工多能性幹細胞(iPS)もしくはヒト胚性幹細胞(hES)の方向付けられた分化に由来する。一部の態様において、線維芽細胞は腎臓間質線維芽細胞である。様々な態様において、適切な腎臓間質線維芽細胞は、ヒト腎臓から単離された初代細胞に由来する。一部の態様において、線維芽細胞は起源が真皮または血管である。一部の態様において、細胞成分の1つまたは複数は非ヒト哺乳動物に由来する。一部の態様において、間質組織は腫瘍細胞または癌細胞を含む。一部の態様において、間質組織の層は実質的に単層である。一部の態様において、間質組織の層は、その表面積の95%を覆う単層を含む。一部の態様において、間質組織の層は、その表面積の90%を覆う単層を含む。一部の態様において、間質組織の層は、その表面積の80%を覆う単層を含む。一部の態様において、間質組織の層は1個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は2個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は3個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は4個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は5個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は10個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は20個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は50個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は100個の細胞より厚い。一部の態様において、間質組織の層は20μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は30μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は40μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は50μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は100μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は200μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は500μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は600μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は1000μm厚より厚い。一部の態様において、間質組織の層は20μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は30μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は40μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は50μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は100μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は200μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は500μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は600μm厚未満である。一部の態様において、間質組織の層は1000μm厚未満である。
本開示の尿細管モデルは数多くの構成で構造的に配置することができる。ある特定の態様において、上皮組織層および間質組織層は、直接接触している別々の構造的に異なる層であるか、または1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm分だけ、もしくはそれより長く、この中の増加分を含めて分離されている別々の構造的に異なる層である。ある特定の態様において、この分離は、2つの層の間に細胞外マトリックスが分泌および付着されたことによるものであり、本開示の目的では接触しているとみなされる。正常な生理学的組織では、細胞および細胞層は頂端(内腔に面する)面と、他の細胞または組織マトリックスに面する側底面を有するように極性化している。本明細書において開示された尿細管モデルの目的では、側底面とは、別の細胞、細胞外マトリックス、または生体適合膜もしくは培養容器の表面に面している面を指す。本明細書において開示された尿細管モデルの目的では、頂端面とは、生体適合膜もしくは培養容器の表面から離れた所に面している面を指す。ある特定の態様において、間質組織層の側底面は、生体適合膜もしくは培養容器に取り付けられた面であり、間質組織層の頂端面は、生体適合膜にも培養容器にも取り付けられていない面である。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面に付着されるか、または間質組織層の頂端面に層を形成し、従って、2つの構造的に異なる層が形成される。ある特定の態様において、上皮組織層および間質組織層は途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の少なくとも99%は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の少なくとも95%は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の少なくとも90%は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の少なくとも80%は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の少なくとも70%は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の少なくとも60%は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の少なくとも50%は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の99%未満は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の98%未満は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の97%未満は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の95%未満は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の90%未満は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層の80%未満は間質組織層と途切れることなく接触している。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面を完全に覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の少なくとも99%を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の少なくとも95%を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の少なくとも90%を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の少なくとも80%を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の少なくとも70%を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の少なくとも60%を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の少なくとも50%を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の99%未満を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の98%未満を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の97%未満を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の95%未満を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の90%未満を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の80%未満を覆う。ある特定の態様において、上皮組織層は間質組織層の頂端面の70%未満を覆う。
通常、上皮組織細胞は、隣接する細胞と密着結合を形成する。密着結合は、膜貫通タンパク質ファミリーであるカドヘリンを特徴とする。これらの1つであるE-カドヘリンは腎臓組織にある密着結合において特に顕著であり、密着結合の形成を特徴とする。ある特定の態様において、上皮組織層は、密着結合を形成する細胞からなる。ある特定の態様において、上皮組織層にある実質的に全ての細胞が、少なくとも1つの隣接する細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、上皮組織層にある細胞の少なくとも99%が、少なくとも1つの他の細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、上皮組織層にある細胞の少なくとも95%が、少なくとも1つの他の細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、上皮組織層にある細胞の少なくとも90%が、少なくとも1つの他の細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、上皮組織層にある細胞の少なくとも80%が、少なくとも1つの他の細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、上皮組織層にある細胞の少なくとも70%が、少なくとも1つの他の細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、上皮組織層にある細胞の少なくとも60%が、少なくとも1つの他の細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、上皮組織層にある細胞の少なくとも50%が、少なくとも1つの他の細胞と密着結合を形成する。
本開示の方法によるバイオプリンティングの利点は高い密度および高い生存率で細胞をプリントできることである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は少なくとも1x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は少なくとも5x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は少なくとも10x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は少なくとも20x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は少なくとも50x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は少なくとも100x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は少なくとも200x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は少なくとも500x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は約100x106細胞/mL~約900x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は約100x106細胞/mL~約700x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は約100x106細胞/mL~約600x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は約100x106細胞/mL~約500x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は約100x106細胞/mL~約300x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質細胞層の密度は約100x106細胞/mL~約200x106細胞/mLである。ある特定の態様において、間質組織層の生存率は99体積%生細胞より大きい。ある特定の態様において、間質組織層の生存率は95体積%生細胞より大きい。ある特定の態様において、間質組織層の生存率は90体積%生細胞より大きい。ある特定の態様において、間質組織層の生存率は80体積%生細胞より大きい。ある特定の態様において、間質組織層の生存率は70体積%生細胞より大きい。ある特定の態様において、間質組織層の生存率は60体積%生細胞より大きい。ある特定の態様において、間質組織層の生存率は50体積%生細胞より大きい。ある特定の態様において、この生存率は、プリンティング後、少なくとも8時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、またはそれより長く維持される。ある特定の態様において、この生存率は、プリンティング後、少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、21日、またはそれより長く維持される。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも1x105細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも2x105細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも5x105/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも1x106細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも5x106細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも10x106細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも20x106細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも50x106細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも100x106細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも200x106細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は少なくとも500x106細胞/mLである。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は1x105/mL未満である。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は2x105/mL未満である。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は5x105/mL未満である。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は1x106細胞/mL未満である。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は5x106細胞/mL未満である。ある特定の態様において、上皮細胞層の密度は10x106細胞/mL未満である。ある特定の態様において、上皮組織層の生存率は99体積%生細胞より大きい。ある特定の態様において、上皮組織層の生存率は95体積%生細胞より大きい。ある特定の態様において、上皮組織層の生存率は90体積%生細胞より大きい。ある特定の態様において、上皮組織層の生存率は80体積%生細胞より大きい。ある特定の態様において、上皮組織層の生存率は70体積%生細胞より大きい。ある特定の態様において、上皮組織層の生存率は60体積%生細胞より大きい。ある特定の態様において、上皮組織層の生存率は50体積%生細胞より大きい。ある特定の態様において、この生存率は、プリンティング後、少なくとも8時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間にわたって維持される。ある特定の態様において、この生存率は、プリンティング後、少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日にわたって維持される。
本開示の方法を用いたバイオプリンティングの利点の1つは、対応する組織において反映される、このプロセスによって成し遂げられる高度の均一性である。ある特定の態様において、尿細管モデルの厚さは実質的に均一である。ある特定の態様において、尿細管モデルの99%超が、尿細管モデルの全平均厚さの10%プラスまたはマイナス以内である。ある特定の態様において、尿細管モデルの95%超が、尿細管モデルの全体平均厚さの10%プラスまたはマイナス以内である。ある特定の態様において、尿細管モデルの90%超が、尿細管モデルの全体平均厚さの10%プラスまたはマイナス以内である。ある特定の態様において、尿細管モデルの80%超が、尿細管モデルの全体平均厚さの10%プラスまたはマイナス以内である。ある特定の態様において、尿細管モデルの70%超が、尿細管モデルの全体平均厚さの10%プラスまたはマイナス以内である。ある特定の態様において、尿細管モデルの99%超が、尿細管モデルの全体平均厚さの20%プラスまたはマイナス以内である。ある特定の態様において、尿細管モデルの95%超が、尿細管モデルの全体平均厚さの20%プラスまたはマイナス以内である。ある特定の態様において、尿細管モデルの90%超が、尿細管モデルの全体平均厚さの20%プラスまたはマイナス以内である。ある特定の態様において、尿細管モデルの80%超が、尿細管モデルの全体平均厚さの20%プラスまたはマイナス以内である。ある特定の態様において、尿細管モデルの70%超が、尿細管モデルの全体平均厚さの20%プラスまたはマイナス以内である。
多くの場合、バイオプリントされる細胞またはバイオインクは、バイオプリンティングに対する適性を改善する賦形剤または押出材料を含有する。押出材料の例には、ゲル、ヒドロゲル、ペプチドヒドロゲル、アミノ酸ベースのゲル、界面活性剤ポリオール(例えば、Pluronic F-127またはPF-127)、温度応答性ポリマー、ヒアルロン酸塩、アルギン酸塩、細胞外マトリックス成分(およびその誘導体)、コラーゲン、ゼラチン、他の生体適合性の天然ポリマーまたは合成ポリマー、ナノファイバー、ならびに自己組織化ナノファイバーが含まれるが、これに限定されない。一部の態様において、押出材料は合成ポリマーを含有する。一部の態様において、押出材料は、哺乳動物組織に通常、関連しない非合成ポリマーを含有する。一部の態様において、押出材料は、バイオプリンティング後に、物理的手段、化学的手段、または酵素的手段によって除去される。一部の態様において、本開示のバイオインクは1重量%超の押出材料を含有する。一部の態様において、本開示の尿細管モデルは1重量%超の押出材料を含有する。一部の態様において、本開示のバイオインクは5重量%未満の押出材料を含有する。一部の態様において、本開示のバイオインクは2重量%未満の押出材料を含有する。一部の態様において、本開示のバイオインクは1重量%未満の押出材料を含有する。一部の態様において、本開示の尿細管モデルは5重量%未満の押出材料を含有する。一部の態様において、本開示の尿細管モデルは2重量%未満の押出材料を含有する。一部の態様において、本開示の尿細管モデルは1重量%未満の押出材料を含有する。一部の態様において、上皮バイオインクはヒドロゲルを伴わない。一部の態様において、上皮バイオインクは押出材料を伴わない。一部の態様において、上皮バイオインクは、賦形剤または押出材料として用いられる合成ポリマーを伴わない。一部の態様において、尿細管モデルは、賦形剤または押出材料として用いられる合成ポリマーを伴わない。一部の態様において、上皮細胞層は、賦形剤または押出材料として用いられる合成ポリマーを伴わない。一部の態様において、間質細胞層は、賦形剤または押出材料として用いられる合成ポリマーを伴わない。
生体適合面に取り付けられた尿細管モデルが本明細書において提供される。ある特定の態様において、間質組織層は生体適合面にプリントされる。ある特定の態様において、生体適合面は、孔径が0.4μm超の膜である。ある特定の態様において、生体適合面の孔径は約1μmである。ある特定の態様において、生体適合面は、細胞付着または生存能力を改善する組成物でコーティングされる。ある特定の態様において、尿細管モジュールは6ウェルプレート、12ウェルプレート、24ウェルプレート、48ウェルプレート、96ウェルプレート、または384ウェルプレートの中にプリントされる。ある特定の態様において、尿細管モジュールは、直径が60mm、100mm、もしくは150mm、またはそれより大きい組織培養プレートの中にプリントされる。ある特定の態様において、尿細管モジュールは組織培養フラスコの中に、またはマイクロ流体チップ上にプリントされる。ある特定の態様において、尿細管モジュールはトランズウェルインサート(transwell insert)の中/上にプリントされる。
本開示は、尿細管モデルを製作するための方法およびプロセスを助ける。ある特定の態様において、人工の三次元生体尿細管モデルの製品はバイオプリンティングのプロセスによって作製される。ある特定の態様において、人工の三次元生体尿細管モデルの製品の少なくとも1つの構成要素はバイオプリンティングのプロセスによって作製される。ある特定の態様において、人工の三次元生体尿細管モデルを製作するプロセスは、腎臓間質バイオインクを調製する工程であって、間質バイオインクが複数の間質細胞タイプを含み、間質細胞タイプが腎臓線維芽細胞および内皮細胞を含む、工程;腎臓上皮バイオインクを調製する工程であって、上皮バイオインクが尿細管上皮細胞を含む、工程;腎臓間質バイオインクの層の少なくとも1つの表面に腎臓上皮バイオインクが層を形成するように腎臓間質バイオインクおよび腎臓上皮バイオインクを付着させる工程;ならびに、細胞を密着させて、人工の三次元生体尿細管モデルを形成するように、付着されたバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程を含む。ある特定の態様において、腎臓間質組織バイオインクは頂端面および側底面を有する腎臓間質組織の層を形成する。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは腎臓間質組織の層の頂端面と接触して付着される。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは尿細管上皮細胞から本質的になる。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは初代尿細管上皮細胞から本質的になる。ある特定の態様において、初代尿細管上皮細胞は、腎機能に影響を及ぼす疾患をもつ対象から単離されている。ある特定の態様において、初代尿細管上皮細胞は、多発性嚢胞腎をもつ対象から単離されている。ある特定の態様において、初代尿細管上皮細胞は、II型糖尿病をもつ対象から単離されている。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは腎細胞癌細胞を含む。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは単層で付着される。ある特定の態様において、腎臓間質組織バイオインクは単層で付着される。ある特定の態様において、腎臓上皮組織の層は腎臓間質組織の層と途切れることなく接触して付着される。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは、腎臓間質組織の層の頂端面を50%以上覆う層を形成する。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは、腎臓間質組織の層の頂端面を70%以上覆う層を形成する。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは、腎臓間質組織の層の頂端面を90%以上覆う層を形成する。ある特定の態様において、腎臓上皮層の腎臓上皮細胞の少なくとも50%は他の腎臓上皮細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、腎臓上皮層の腎臓上皮細胞の少なくとも70%は他の腎臓上皮細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、腎臓上皮層の腎臓上皮細胞の少なくとも90%は他の腎臓上皮細胞と密着結合を形成する。ある特定の態様において、尿細管モデルは50~500μm厚である。ある特定の態様において、尿細管モデルは約100μm厚である。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクは押出材料をさらに含む。ある特定の態様において、線維芽細胞および内皮細胞は約95:5~約5:95の線維芽細胞:内皮細胞比で腎臓間質バイオインクに存在する。ある特定の態様において、線維芽細胞および内皮細胞は約75:25~約25:75の線維芽細胞:内皮細胞比で腎臓間質バイオインクに存在する。ある特定の態様において、線維芽細胞および内皮細胞は約60:40~約40:60の線維芽細胞:内皮細胞比で腎臓間質バイオインクに存在する。ある特定の態様において、線維芽細胞および内皮細胞は、約50:50の線維芽細胞:内皮細胞比で腎臓間質バイオインクに存在する。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは分泌細胞をさらに含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは免疫細胞をさらに含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは押出材料をさらに含む。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは糸球体細胞を含む。ある特定の態様において、前記モデルは、前もって形成されたスキャフォールドを実質的に伴わずに製作される。ある特定の態様において、腎臓線維芽細胞、内皮細胞、および尿細管上皮細胞は哺乳動物細胞である。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクまたは腎臓上皮バイオインクのいずれかが、付着後に平らな層を形成する。ある特定の態様において、尿細管モデルは均一な厚さの尿細管モデルである。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは生体適合膜上に付着される。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは、孔径が0.4μm超の生体適合膜上に付着される。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは、孔径が約1μmの生体適合膜上に付着される。ある特定の態様において、人工の三次元生体尿細管モデルはアレイを形成するように付着される。ある特定の態様において、人工の三次元生体尿細管モデルは、それぞれの尿細管モデルの間に約20μm~約100μmのスペースをとるように構成されているアレイを形成するように付着される。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは少なくとも30体積%生細胞である。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは少なくとも70体積%生細胞である。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは少なくとも90体積%生細胞である。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクは押出しバイオプリンティングによって付着される。ある特定の態様において、腎臓上皮バイオインクはインクジェットバイオプリンティングによって付着される。ある特定の態様において、腎臓間質バイオインクはインクジェットバイオプリンティングによって付着されない。ある特定の態様において、尿細管モデルのどの層もインビトロ培養で培養状態で3日後に生存可能である。ある特定の態様において、尿細管モデルのどの層もインビトロ培養で10日後に生存可能である。
ある特定の態様において、本開示の尿細管モデルは、バイオプリンティング後に、ある一定の時間にわたって成熟される。ある特定の態様において、前記モデルは、使用前に少なくとも1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、16時間、18時間、24時間、またはそれより長く成熟される。ある特定の態様において、前記モデルは、使用前に少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、30日間、またはそれより長く成熟される。一部の態様において、組織の出荷または移送は、一つの用途である。ある特定の態様において、本開示の尿細管モデルの間質層は、バイオプリンティング後に、上皮層が加えられる前に、ある一定の時間にわたって成熟される。ある特定の態様において、間質層は、使用前に少なくとも1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、16時間、18時間、24時間、またはそれより長く成熟される。ある特定の態様において、間質層は、使用前に少なくとも1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、22日、23日、24日、25日、26日、27日、28日、29日、30日間、またはそれより長く成熟される。一部の態様において、組織の出荷または移送は、一つの用途である。一部の態様において、上皮層は、間質層のバイオプリンティング後、1時間以内、2時間以内、3時間以内、4時間以内、5時間以内、6時間以内、7時間以内、8時間以内、9時間以内、10時間以内、11時間以内、12時間以内、16時間以内、18時間以内、24時間以内に間質層上にバイオプリントされる。一部の態様において、組織の出荷または移送は、一つの用途である。一部の態様において、上皮層は、間質層のバイオプリンティング後、1日以内、2日以内、3日以内、4日以内、5日以内、6日以内、7日以内、8日以内、9日以内、10日以内、11日以内、12日以内、13日以内、14日以内、15日以内、16日以内、17日以内、18日以内、19日以内、20日以内、21日以内、22日以内、23日以内、24日以内、25日以内、26日以内、27日以内、28日以内、29日以内、30日以内に間質層上にバイオプリントされる。
一部の態様において、本明細書において開示された尿細管およびアレイはインビトロアッセイにおいて使用するためのものである。一部の態様において、「アッセイ」とは、有機試料または生物試料(例えば、細胞凝集物、組織、臓器、生物など)の中の物質(例えば、化学物質、分子、生化学物質、薬物など)の存在または活性を試験または測定するための手順である。さらなる態様において、アッセイには定性アッセイおよび定量アッセイが含まれる。なおさらなる態様において、定量アッセイは、試料中の物質、例えば、化学物質または生体分子の量を測定する。
理想的な人工の腎臓組織は完全にヒトであり、かつ尿細管上皮細胞、腎臓間質線維芽細胞、および内皮細胞を含む多細胞である。さらに、理想的な人工の腎臓組織は、CYP1A2、CYP2C9、およびCYP3A4活性、アルブミン輸送、ならびにビタミンDヒドロキシル化、γ-グルタミル-トランスフェラーゼ活性を含むが、これに限定されない特定の機能を示す。さらに、理想的な人工の腎臓組織は密着結合、カドヘリン、輸送体の極性、およびCD31発現でも特徴付けられ、アルブミン輸送、CYP450活性、組織学、および生存能力を含む特定のアッセイによって検証される。一部の態様において、本開示の尿細管モデルは、1日より長く、2日より長く、3日より長く、4日より長く、5日より長く、6日より長く、7日より長く、8日より長く、9日より長く、10日より長く、またはそれより長く培養状態で維持されている2D共培養または組織外植片と比較して増加した特定の機能を示す。一部の態様において、本開示の尿細管モデルは、1日より長く、2日より長く、3日より長く、4日より長く、5日より長く、6日より長く、7日より長く、8日より長く、9日より長く、10日より長く、またはそれより長く培養状態で維持されている2D共培養または組織外植片と比較して2倍増加した特定の機能を示す。一部の態様において、本開示の尿細管モデルは、1日より長く、2日より長く、3日より長く、4日より長く、5日より長く、6日より長く、7日より長く、8日より長く、9日より長く、10日より長く、またはそれより長く培養状態で維持されている2D共培養または組織外植片と比較して5倍以上増加した特定の機能を示す。一部の態様において、本開示の尿細管モデルは、21日より長く、またはそれより長く培養状態で維持されている2D共培養または組織外植片と比較して2倍以上増加した特定の機能を示す。一部の態様において、本開示の尿細管モデルは、27日より長く、またはそれより長く培養状態で維持されている2D共培養または組織外植片と比較して5倍以上増加した特定の機能を示す。一部の態様において、本開示の尿細管モデルは、27日より長く、またはそれより長く培養状態で維持されている2D共培養または組織外植片と比較して2倍以上増加した特定の機能を示す。一部の態様において、本開示の尿細管モデルは、21日より長く、またはそれより長く培養状態で維持されている2D共培養または組織外植片と比較して5倍以上増加した特定の機能を示す。ある特定の態様において、特定の機能はγ-グルタミル-トランスフェラーゼ活性である。ある特定の態様において、特定の機能はビタミンDヒドロキシル化である。
●尿細管上皮細胞wの極性化/細胞内密着結合(E-Cad、ZO-1、およびクローディン)の形成、ならびに輸送体(頂端:OAT4、URAT1)およびインテグリン(側底)の正しい細胞内局在化
●尿細管細胞層と、その下にある間質との間での基底膜の発達
●組織様尿細管細胞の発達を含む広範囲にわたる間質内微小血管網:微小血管空間関係の確立
●尿細管上皮輸送体(キュビリン、メガリン、アクアポリン)、OAT、URAT)、血管マーカー(CD31、vWF)を含む区画(compartment)特異的マーカーの発現、EPOタンパク質産生の証明(該当する場合)
●25-(OH)1ヒドロキシラーゼ(1OHアーゼ)を介したビタミンD合成
●アンジオテンシンIIの産生
●キュビリンを介した尿細管内腔からのアルブミン能動輸送
●側底面からのシメチジン輸送/蓄積
●代謝に関与するCYP450発現およびUGT発現(それぞれ、例えば、CYP2B6、3A5、4A11と、UGT1A9、2B7)
を含むが、これに限定されない組織学的特徴および尿細管特異的機能を含む、インビボヒト腎臓組織に関連する重要な構造的特性および機能的特性を有する。
寸法が3mmx3mmx0.75mmの3層カップ形状を、12ウェル組織培養プレートの中あるTranswell膜上にバイオプリントした(図2Aおよび図2B)。底面シートと二層の壁は75%成人腎臓線維芽細胞(aRF)と25%ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)で構成された。細胞を1億5000万細胞/mlでNovogel(登録商標)2.0に再懸濁した。カップを、2%ゼラチンに溶解した100万~500万細胞/mlの100%上皮細胞(MDCK)希釈懸濁液で満たした(「構造1」)。バイオプリントした直後に、構造を、溶けたNovogel(登録商標)1.0で取り囲み、次いで、腎臓線維芽細胞培地、HUVEC培地、およびMDCK培地の混合物中で培養した。
寸法が3mmx3mmx250μmのシートを、12ウェルプレートの中あるTranswell膜上にバイオプリントした。組織シートは、1億5000万細胞/mlでNovogel(登録商標)2.0に再懸濁した75%成人腎臓線維芽細胞と25%HUVECで構成された。シートの端は、Novogel(登録商標)3.0で構成される、500μm厚のバイオプリントヒドロゲルしかない壁で縁取られた。バイオプリントした直後に、50mM塩化カルシウムを用いて境界の壁を2分間、架橋した。次いで、この溶液を吸引し、構築物を、溶けたNovogel(登録商標)1.0で取り囲んだ。次いで、100msの弁開口時間でインクジェットスプレーモジュールセットを用いて付着させることによって、100万細胞/mlの上皮細胞(MDCKまたはhTERT-RPTEC)希釈懸濁液を構造の上面に添加した(「構造2」)。構造2の模式図を図6Aおよび図6Bに示した。インクジェットスプレーモジュールを用いることによって、プリントした直後に上皮細胞を付着させることが可能になる。または、間質組織をプリントし、数日間成熟させた後に、上皮細胞を付着させることができる。これにより、上皮細胞の正しい形態の支持を助ける可能性がある微小血管系および細胞外マトリックスの形成が容易になる。
間質層の厚さおよび細胞充実性を小さくするために、細胞比を50%線維芽細胞/50%HUVECに変えた。これらの細胞の濃度は1.25x108細胞/mLであった。腎臓近位尿細管モデルの間質層は、Novogel(登録商標)2.0に溶解した腎臓線維芽細胞とHUVECで構成される。本実施例において作製された構築物は、3D腎臓組織内に、極性化の特徴を示す近位尿細管上皮細胞(RPTEC)を示す。RPTECの間の外側膜にあるE-カドヘリン(明るい染色および940)が密着結合に対応する(図9A、図9B、および図9C)。さらに、間質層に対応する基底膜はコラーゲンを産生する(図9Aおよび図9B; 920)。H&E染色を示し(図10A)、刷子縁を示した(図11A、矢印)。トリクローム染色はコラーゲン分泌を示し(図10B、および図11B、矢印)、CD31(図12、明るい染色)染色はHUVEC網の存在を示す(図12、星印)。バイオプリントされた組織は、培養状態で経時増加するγ-グルタミル-トランスフェラーゼ(GGT)活性を示した。これは、機能している上皮層を示している(図13)。3Dバイオプリント尿細管モデルの上皮成分の成熟度および機能を評価するために、組織をホモジナイズし、γグルタミル-トランスフェラーゼ(GGT)活性についてアッセイした。GGTは、上皮細胞の頂端面で発現している酵素であり、グルタチオンホメオスタシスおよび生体異物代謝に関与する。正の対照として、2Dの単層として培養したhTERT-RPTEC細胞を評価した。負の対照として、検出されたGGT活性が上皮特異的であることを検証するために、上皮を伴わないバイオプリント腎臓間質組織もアッセイした。培養3日目、10日目、14日目、21日目、または28日目に、2D hTERT-RPTEC、3D間質組織、または3Dバイオプリント尿細管組織をホモジナイズし、Sigma-Aldrichから入手可能な比色アッセイを用いて機能的GGT酵素活性について評価した。バイオプリント尿細管組織は培養10~28日目から安定したGGT活性を示し、バイオプリントされた間質しかない組織では、ごくわずかなGGT活性が検出された。2D hTERT-RPTEC単層培養は、3Dバイオプリント尿細管組織において観察されるものと比較的等しいGGT活性を示したが、2D単層は21日目に機能低下を示し、28日目には生存不可能であった。
組織形態に及ぼす線維芽細胞:内皮細胞比の影響を確かめる実験を試みた。90:10、75:25、および50:50(線維芽細胞:内皮細胞)の比の腎臓線維芽細胞およびHUVEC細胞を含むバイオインクを用いて尿細管モデルをバイオプリントした。図14および図15は、この実験の結果を示す。図14は、プリントした尿細管モデルを肉眼で見たものを示す。これに対して、図15は、マッソントリクロームで染色した対応する組織構造を示す。プリントして6日後に、50:50比を含む尿細管モデルは実質的に平ら、または平らであった。図14Cおよび図15C。90:10(図14Aおよび図15A)ならびに72:25(図14Bおよび図15B)でプリントした尿細管モデルは、プリントして6日後に反りを示した。
尿細管モデルの厚さおよび表面トポロジーの均一性を確かめる実験を試みた。尿細管モデルを12ウェルプレートのウェルの中にバイオプリントし(図16A)、Keyence技術を用いて分析した(図16B)。バイオプリント尿細管モデルを14日間、培養し、Keyence VHX-700デジタル顕微鏡を用いて表面積および厚さについて分析した。Novogel3.0縁端部(実施例3を参照されたい)の内部にある面積は0.068cm2であると見積もられた。縁端部の内部にある組織全体にわたって、厚さの平均は約106.8umであることが分かり、示されたヒートマップによって立証されたように厚さは比較的均一であった(極めて薄い領域が1650である)。色の対比を強め、組織表面のマッピングを楽にするために、組織をメチルブルーで染色した。2つ別々の領域がヒートマップの青色の範囲1650の中にある。これは、これらの領域が、約20um厚のかなり薄い小さな「くぼみ」であることを示している。構築物の厚さの平均は100μmである。データから、表面形態が極めて均一で、平らで、滑らかであり、小さなくぼみの証拠があることが分かる。
50:50の線維芽細胞:内皮細胞比を含む間質層を24ウェルプレートの各ウェルにバイオプリントした。構築物を、2%FBSを含有する培地の存在下(図17B、図17C、および図17D)または非存在下(図17A)で、1.25x105個(図17Aおよび図17B)、2.5x105個(図17C)、または5.0x105個(図17D)のRPTEC細胞のいずれかとインキュベートした。組織構造を11日目に採取し、H&E染色した。
インビトロ毒性アッセイ実験に対する尿細管モデルの適性を確かめるために、一般的な細胞傷害剤であるアンホテリシンB、シスプラチン、およびTGFβを用いてインビトロ毒性アッセイ実験を行った(図18~図23)。前の実施例の方法に従って尿細管モデルをプリントした。
実施例8は、ヒドロゲルしかないNovogel3.0の縁端部を用いて作製されたバイオプリント尿細管組織について説明する。この縁端部またはNovogel1.0の堀(moat)は、0.4μm孔径のトランズウェルインサートが培養表面として用いられた時に、トランズウェル膜に組織を付着させるのを容易にするのに必要である。尿細管モデル50:50腎臓線維芽細胞:HUVECのバイオプリント腎臓間質部分を様々な表面上で製作し、トランズウェル膜への付着について評価した。図24Aは、バイオプリント組織が縁端部または堀の非存在下では培養して3日後に浮遊することを示す。無傷の障壁および輸送体機能を評価するために、培養表面全体を覆う組織が必要である。バイオプリント尿細管組織の付着および成長を容易にするために、ならびにバイオプリント尿細管モデルの表面積被覆度を改善するために、縁端部または堀の非存在下で組織付着を促進する培養表面を使用することが望ましい。図24Bに示した、好ましい態様のバイオプリント腎臓間質組織(50:50腎臓線維芽細胞:HUVEC)は付着し、堀もヒドロゲル縁端部も伴わない状態で1μm孔径膜上に広がる。
本開示の3D尿細管モデルの利点の1つは培養状態で持続的な生存能力があることである。多くの場合、この生存能力は通常の2D培養または組織外植片の生存能力より長く続く。図25は、培養状態で6日目(図25A)、10日目(図25B)、および27日目(図25C)の3D尿細管モデルを示す。
Claims (11)
- a.腎臓線維芽細胞および内皮細胞を含む腎臓間質組織の層であって、腎臓間質組織の層に存在する細胞が腎臓線維芽細胞および内皮細胞からなり、かつ腎臓間質組織の層が頂端面および側底面を有する、腎臓間質組織の層と、
b.尿細管上皮細胞を含む腎臓上皮組織の層であって、人工の三次元生体尿細管モデルを形成するように、腎臓上皮組織が、腎臓間質組織の層の頂端面と直接接触している、腎臓上皮組織の層と
を含む、人工の三次元生体尿細管モデルであって、
腎臓上皮組織の層が、腎臓間質組織の層の頂端面を50%以上覆っている、
95:5~5:95の線維芽細胞:内皮細胞比、75:25~25:75の線維芽細胞:内皮細胞比、60:40~40:60の線維芽細胞:内皮細胞比、もしくは50:50の線維芽細胞:内皮細胞比で、線維芽細胞および内皮細胞が腎臓間質組織の層に存在する、および
腎臓間質組織の層もしくは腎臓上皮組織の層のどちらかが、少なくとも30体積%生細胞である、
但し、前記間質組織が間質バイオインクを含み、前記上皮組織が上皮バイオインクを含む、
人工の三次元生体尿細管モデル。 - (a)腎臓上皮組織の層に存在する細胞が尿細管上皮細胞からなる、
(b)腎臓上皮組織の層が単層である、
(c)腎臓上皮組織の層が腎臓間質組織の層と途切れることなく接触している、
(d)腎臓上皮組織の層が、腎臓間質組織の層の頂端面と接触しており、かつそれを70%、もしくは90%以上覆っている、
(e)腎臓上皮組織の層にある細胞の少なくとも50%、少なくとも70%、もしくは少なくとも90%が、腎臓上皮組織の層の別の細胞と密着結合を形成している、
(f)50~500μm厚である、
(g)腎臓間質組織の層もしくは腎臓上皮組織の層のどちらかが、少なくとも70体積%生細胞、もしくは少なくとも90体積%生細胞である、または
(h)(a)~(g)のいずれか2つ以上の組み合わせである、
請求項1記載の尿細管モデル。 - 平らである、均一な厚さである、またはその両方である、請求項1または2記載の尿細管モデル。
- 生体適合膜、または孔径が0.4μm超の生体適合膜をさらに含む、請求項1~3のいずれか一項記載の尿細管モデル。
- アレイを形成するように構成されている、複数の請求項1~4のいずれか一項記載の尿細管モデル。
- a.腎臓間質バイオインクを調製する工程であって、該間質バイオインクが複数の間質細胞タイプを含み、腎臓間質バイオインクに存在する該細胞タイプが腎臓線維芽細胞および内皮細胞からなる、工程;
b.腎臓上皮バイオインクを調製する工程であって、該上皮バイオインクが尿細管上皮細胞を含む、工程;
c.腎臓間質バイオインクが、頂端面および側底面を有する腎臓間質組織層を形成し、かつ腎臓上皮バイオインクが、腎臓間質組織層の頂端面と直接接触して付着されるように、前記腎臓間質バイオインクおよび前記腎臓上皮バイオインクを付着させる工程;ならびに
d.細胞を密着させて、人工の三次元生体尿細管モデルを形成するように、前記付着されたバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程
を含む、人工の三次元生体尿細管モデルを製作する方法であって、
腎臓上皮バイオインクが、腎臓間質組織層の頂端面を50%以上覆う腎臓上皮組織の層を形成する、
95:5~5:95の線維芽細胞:内皮細胞比、75:25~25:75の線維芽細胞:内皮細胞比、60:40~40:60の線維芽細胞:内皮細胞比、もしくは50:50の線維芽細胞:内皮細胞比で、線維芽細胞および内皮細胞が腎臓間質バイオインクに存在する、および
腎臓間質バイオインクが、少なくとも30体積%生細胞である、
前記方法。 - (a)腎臓上皮バイオインクに存在する細胞が尿細管上皮細胞からなる、
(b)腎臓上皮バイオインクが単層で付着される、
(c)腎臓上皮組織の層が腎臓間質組織の層と途切れることなく接触して付着される、
(d)腎臓上皮バイオインクが、腎臓間質組織の層の頂端面を70%、もしくは90%以上覆う腎臓上皮組織の層を形成する、
(e)腎臓上皮層の腎臓上皮細胞の少なくとも50%、70%、もしくは90%が、他の腎臓上皮細胞と密着結合を形成する、
(f)尿細管モデルが50~500μm厚である、
(g)腎臓間質バイオインクが、少なくとも70体積%生細胞、もしくは少なくとも90体積%生細胞である、
(h)腎臓間質バイオインクもしくは腎臓上皮バイオインクのいずれかが、付着後に平らな層を形成する、または
(i)(a)~(h)のいずれか2つ以上の組み合わせである、
請求項6記載の方法。 - 尿細管モデルが、均一な厚さの尿細管モデルである、請求項6または7記載の方法。
- 腎臓間質バイオインクを生体適合膜上に付着させる工程、または腎臓間質バイオインクを孔径が0.4μm超の生体適合膜上に付着させる工程をさらに含む、請求項6~8のいずれか一項記載の方法。
- 人工の三次元生体尿細管モデルが、アレイを形成するように付着される、請求項6~9のいずれか一項記載の方法。
- a.腎臓間質バイオインクを調製する工程であって、該間質バイオインクが複数の間質細胞タイプを含み、腎臓間質バイオインクに存在する該細胞タイプが腎臓線維芽細胞および内皮細胞からなる、工程;
b.腎臓上皮バイオインクを調製する工程であって、該上皮バイオインクが尿細管上皮細胞を含む、工程;
c.腎臓間質バイオインクが頂端面および側底面を有する腎臓間質組織層を形成し、かつ腎臓上皮バイオインクが、腎臓間質組織層の頂端面と直接接触して付着されるように、前記間質バイオインクおよび前記上皮バイオインクを付着させる工程;ならびに
d.細胞を密着させて、人工の三次元生体尿細管モデルを形成するように、前記付着されたバイオインクを細胞培養培地中で成熟させる工程;
e.治療剤を該尿細管モデルと接触させる工程;
f.尿細管上皮細胞の生存能力または機能を測定する工程;ならびに
g.尿細管上皮細胞の測定された生存能力または機能に基づいて治療剤の腎毒性を評価する工程
を含む、治療剤の腎毒性を評価する方法であって、
腎臓上皮バイオインクが、腎臓間質組織の層の頂端面を50%以上覆う腎臓上皮組織の層を形成する、
95:5~5:95の線維芽細胞:内皮細胞比、75:25~25:75の線維芽細胞:内皮細胞比、60:40~40:60の線維芽細胞:内皮細胞比、もしくは50:50の線維芽細胞:内皮細胞比で、線維芽細胞および内皮細胞が腎臓間質バイオインクに存在する、および
腎臓間質バイオインクが、少なくとも30体積%生細胞である、
前記方法。
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