CN108130313B - 一种基于生物3d打印构建三维胶质瘤组织的方法 - Google Patents

一种基于生物3d打印构建三维胶质瘤组织的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法，步骤为：1）制备海绵支架材料，并检测其力学特性，利用生物3D打印技术将海绵加入到多孔板内，通过24h的冻干过程，再进行紫外灭菌2h以得到用于构建胶质瘤的三维组织支架；2）将人胶质瘤细胞用培养基混匀后3D打印到海绵支架材料上，然后在含有10%FBS培养液中培养7天，制备成三维胶质瘤组织工程化单元；3）检测三维胶质瘤组织的细胞活性和糖胺聚糖分泌量；4）采用生物等效性组化方法检测2D及3D第7天时的生长状态。其优点在于：本发明有效促进胶质瘤组织功能的形成，为脑组织工程的科学研究以及脑癌的临床治疗提供有益的参考，并且为生物打印技术的临床化提供有效的方法及技术支撑。

Description

一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法
技术领域
本发明属于生物学和组织工程学技术领域，具体涉及一种基于构建三维胶质瘤组织的方法。
背景技术
药物研发需要经过体外及体内实验，胶质瘤细胞在传统的2D培养中在药物筛选及组织工程已经具有广泛的研究和应用，但2D培养体系在长期的培养过程中存在细胞形态及功能上的缺失，许多指标无法客观评价，至今依然是需要攻克的难题。3D培养系统能更好的模拟细胞在人体的生长环境，具有比2D更加完善的培养体系，正广泛应用于各个领域。
3D培养体系需要借助不同的生物材料来实现，胶原、纳米材料等生物支架材料在组织工程中均具有广泛的应用。细胞生长需要一定的机械强度，海绵支架材料具有良好的吸水性和机械性能。组织工程得到的微型胶质瘤组织具有比2D更好的形态和功能上的优势，细胞与细胞间能形成紧密联系和彼此融合，形成具有一定肿瘤特性的胶质瘤组织。其更加完善的功能可用于体外药物筛选和评价以及3D打印方向的应用。
综上所述，脑癌组织工程领域迫切需要开发一种新的构建胶质瘤组织的方法，在能够有效达到培养胶质瘤组织目的的同时，还能成功取代市场上常用的基于免疫缺陷老鼠的PDX模型。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种可靠、操作简便、可重复性强，能够有效促进胶质瘤组织功能的形成的一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法，其创新点在于：包括以下步骤：
(1)制备海绵支架材料，并检测其力学特性，然后利用生物3D打印技术将海绵加入到多孔板内，通过24h的冻干过程，再进行紫外灭菌2h以得到用于构建胶质瘤的三维组织支架；
(2)将人胶质瘤细胞用培养基混匀后3D打印到步骤(1)中制备的海绵支架材料上，然后在含有10％FBS培养液中培养7天，即制备成三维胶质瘤组织工程化单元，保存备用；
(3)检测步骤(2)中制备的三维胶质瘤组织的细胞活性和糖胺聚糖GAG分泌量；
(4)采用生物等效性组化方法检测2D及3D第7天时的生长状态。
进一步的，所述步骤(1)中的海绵支架材料的制备具体方法为：首先称取20g鸡、鸭、牛、羊、猪、马等动物皮肤组织，尽量将组织剪成小块，以2％至8％的碳酸钠溶液超声脱脂，控制温度在30℃以下，用纯水洗涤去除残留的碳酸钠；将脱脂后的皮肤用破壁机打碎后再浸泡于500mL 1M醋酸中，加入1-5g胃蛋白酶消化2-3天，过滤，向粗提液中加入10％氯化钠盐析，充分搅拌后将得到白色胶原沉淀，将白色胶原沉淀复溶于0.5M醋酸溶液中，使用3500KDa的透析袋以纯水为外液透析2-3天，得到胶原液，将胶原液置于玻璃器皿中预冻过夜，然后冻干48h后即可得到海绵支架材料。
进一步的，所述步骤(1)中的胶质瘤的三维支架构建的具体方法为：称取2g海绵复溶于360mLpH＝3的稀盐酸中以得到均匀分散液，加入40mL 0.5％的纳米纤维素与分散液充分混匀后再利用3D打印技术精确打入孔板内，每孔容量100至600μL，预冻后冻干24h即可得到2-4mm左右厚度的海绵支架材料，紫外灭菌2h后即可得到构建胶质瘤的三维组织支架。
进一步的，所述步骤(1)中的力学特性检测的具体方法为：取70mL海绵支架材料溶液于长方形模具中预冻后冻干，沿同一方向裁取得到长宽10cm×1.6cm，厚度为3mm的长条形海绵；用力学测试仪器夹住长条形海绵的两端，标准距离为1cm，以5mm/min的速率进行薄膜和薄片拉伸性能的测定试验。
进一步的，所述步骤(2)的具体方法为：将人胶质瘤细胞浓度调整为1x107/mL，制成生物打印墨水，逐滴打印到海绵支架材料上，将海绵支架材料转移到培养箱中待细胞粘附1h后再补加适当的培养液以浸没支架，每2天更换新鲜培养液，观察支架内细胞生长状态。
进一步的，所述步骤(3)的具体方法为：待三维胶质瘤组织材料培养24h后进行live/dead荧光检测；将培养1天的三维胶质瘤组织材料和浸泡在培养液内1天的无细胞海绵支架材料收集冷冻，并于第7天一起检测第1天和第7天三维胶质瘤组织材料以及无细胞的海绵支架材料的GAG含量，最后通过三维胶质瘤组织材料的GAG含量减去对应的无细胞海绵支架材料的GAG含量，即可得到三维胶质瘤组织在培养第1天和第7天时GAG的分泌量。
本发明的有益效果如下：本发明可靠、操作简便、可重复性强，能够有效促进胶质瘤组织功能的形成，能够为脑组织工程的科学研究以及脑癌的临床治疗提供有益的参考，并且为生物打印技术的临床化提供有效的方法及技术支撑。
附图说明
图1为48孔板内的海绵支架材料材料形态图；
图2为海绵支架材料力学测试的结果图；
图3为24h后2D和3D的live/dead荧光染色图；
图4为三维胶质瘤材料在培养第1天和第7天的GAG分泌量对比图；
图5为本发明2D及3D培养体系下第7天时的HE染色图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法，包括以下步骤：
(1)制备海绵支架材料，并检测其力学特性，然后利用生物3D打印技术将海绵加入到多孔板内，通过24h的冻干过程，再进行紫外灭菌2h以得到用于构建胶质瘤的三维组织支架；
(2)将人胶质瘤细胞用培养基混匀后3D打印到步骤(1)中制备的海绵支架材料上，然后在含有10％FBS培养液中培养7天，即制备成三维胶质瘤组织工程化单元，保存备用；
(3)检测步骤(2)中制备的三维胶质瘤组织的细胞活性和糖胺聚糖GAG分泌量；
(4)采用生物等效性组化方法检测2D及3D第7天时的生长状态。
海绵支架材料的制备具体方法为：首先称取20g鸡、鸭、牛、羊、猪、马等动物皮肤组织，尽量将组织剪成小块，以2％至8％的碳酸钠溶液超声脱脂，控制温度在30℃以下，用纯水洗涤去除残留的碳酸钠；将脱脂后的皮肤用破壁机打碎后再浸泡于500mL 1M醋酸中，加入1-5g胃蛋白酶消化2-3天，过滤，向粗提液中加入10％氯化钠盐析，充分搅拌后将得到白色胶原沉淀，将白色胶原沉淀复溶于0.5M醋酸溶液中，使用3500KDa的透析袋以纯水为外液透析2-3天，得到胶原液，将胶原液置于玻璃器皿中预冻过夜，然后冻干48h后即可得到海绵支架材料，如图1所示。
为了进一步了解本发明方法的效果，对海绵支架材料材料和培养出来的微型胶质瘤组织进行了相应的检测及鉴定。
(1)支架材料力学特性测定
取70mL海绵支架材料溶液于长方形模具中预冻后冻干，沿同一方向裁取得到长宽10cm×1.6cm，厚度为3mm的长条形海绵。用力学测试仪器夹住长条形海绵的两端，标准距离为1cm，最后以5mm/min的速率进行薄膜和薄片拉伸性能的测定试验，如图2所示。
由图2可知，纳米纤维素增加了ECM的强度，在一定程度可以维持海绵支架材料在48孔板内的形状。
(2)细胞活性检测
根据标准的染色方案，对培养24h后的三维胶质瘤组织材料进行live/dead荧光检测，如图3所示。
由图3可知，该组织材料具有较高的细胞活性，该海绵支架材料适合细胞生长。
(3)GAG分泌量测定
将培养1天的三维胶质瘤组织材料和浸泡在培养液内1天的无细胞海绵支架材料收集冷冻，并于第7天一起检测第1天和第7天三维胶质瘤组织材料以及无细胞的海绵支架材料的GAG含量，最后通过有三维胶质瘤组织材料的GAG含量减去对应的无细胞海绵支架材料的GAG含量，即可得到三维胶质瘤组织在培养第1天和第7天时GAG的分泌量，如图4所示。
由图4可知，第7天时GAG的分泌量高于第1天，因GAG是胶质瘤生长所处的微环境的主要成分之一，故说明该海绵支架材料是很好的用于培养和促进胶质瘤生成的支架材料。
(4)组织学分析
根据标准组织学检测方法，收集海绵和三维胶质瘤组织置于10％(v/v)福尔马林中固定过夜，脱水完全后转移至氯仿透明直至包埋入石蜡中，然后进行石蜡切片，切片厚度为8μm，最后用H/E对上述制备的切片进行染色，观察样品中的细胞核及细胞外基质，如图5所示。
由图5可知，结果表明第7天时3D体系内细胞生长良好，细胞之间形成相互联系，且细胞分泌了一定量的ECM，但海绵支架材料降解的速率快于ECM的生成速率。2D培养体系细胞整体生长较好，出现大量细胞聚集生长。
本发明可靠、操作简便、可重复性强，能够有效促进胶质瘤组织功能的形成，能够为脑组织工程的科学研究以及脑癌的临床治疗提供有益的参考，并且为生物打印技术的临床化提供有效的方法及技术支撑。
上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。

Claims (5)

1.一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）制备海绵支架材料，并检测其力学特性，然后利用生物3D打印技术将海绵加入到多孔板内，通过24h的冻干过程，再进行紫外灭菌2h以得到用于构建胶质瘤的三维组织支架；所述的海绵支架材料的制备具体方法为：首先称取20g鸡、鸭、牛、羊、猪、马等动物皮肤组织，尽量将组织剪成小块，以2%至8%的碳酸钠溶液超声脱脂，控制温度在30℃以下，用纯水洗涤去除残留的碳酸钠；将脱脂后的皮肤用破壁机打碎后再浸泡于500 mL 1M醋酸中，加入1-5g胃蛋白酶消化2-3天，过滤，向粗提液中加入10%氯化钠盐析，充分搅拌后将得到白色胶原沉淀，将白色胶原沉淀复溶于0.5M醋酸溶液中，使用3500KDa的透析袋以纯水为外液透析2-3天，得到胶原液，将胶原液置于玻璃器皿中预冻过夜，然后冻干48h后即可得到海绵支架材料；
（2）将人胶质瘤细胞用培养基混匀后3D打印到步骤（1）中制备的海绵支架材料上，然后在含有10% FBS培养液中培养7天，即制备成三维胶质瘤组织工程化单元，保存备用；其中，所述步骤的具体方法为：将人胶质瘤细胞浓度调整为1x107/mL，制成生物打印墨水，逐滴打印到海绵支架材料上，将海绵支架材料转移到培养箱中待细胞粘附1h后再补加适当的培养液以浸没支架；
（3）检测步骤（2）中制备的三维胶质瘤组织的细胞活性和糖胺聚糖GAG分泌量；
（4）采用生物等效性组化方法检测第7天时的生长状态。
2.根据权利要求1一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的胶质瘤的三维支架构建的具体方法为：称取2g海绵复溶于360 mL pH=3的稀盐酸中以得到均匀分散液，加入40 mL 0.5%的纳米纤维素与分散液充分混匀后再利用3D打印技术精确打入孔板内，每孔容量100至600µL，预冻后冻干24 h即可得到2-4mm厚度的海绵支架材料，紫外灭菌2h后即可得到构建胶质瘤的三维组织支架。
3.根据权利要求1所述的一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的力学特性检测的具体方法为：取70mL海绵支架材料溶液于长方形模具中预冻后冻干，沿同一方向裁取得到长宽10cm×1.6cm，厚度为3mm的长条形海绵；用力学测试仪器夹住长条形海绵的两端，标准距离为1cm，以5 mm/min的速率进行薄膜和薄片拉伸性能的测定试验。
4.根据权利要求1所述的一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法，其特征在于：步骤（2）中还包括每2天更换新鲜培养液，观察支架内细胞生长状态。
5.根据权利要求1所述的一种基于生物3D打印构建三维胶质瘤组织的方法，其特征在于：所述步骤（3）的具体方法为：待三维胶质瘤组织材料培养24h后进行live/dead荧光检测；将培养1天的三维胶质瘤组织材料和浸泡在培养液内1天的无细胞海绵支架材料收集冷冻，并于第7天一起检测第1天和第7天三维胶质瘤组织材料以及无细胞的海绵支架材料的GAG含量，最后通过三维胶质瘤组织材料的GAG含量减去对应的无细胞海绵支架材料的GAG含量，即可得到三维胶质瘤组织在培养第1天和第7天时GAG的分泌量。
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