CN113621554A - 采用同一无血清培养基的表皮组织简易制备工艺及其保存 - Google Patents

Abstract

本发明公开采用同一无血清培养基的表皮组织简易制备工艺及其保存。本发明提出一种新配方的无血清培养基，成分明确，价格低廉；支持多种来源表皮细胞的提取及扩增；本发明在表皮组织制备过程中均可采用同一配方的无血清培养基，便可促进表皮细胞分化为具有同人体表皮类似的四层复层化结构，培养方式操作简便；表皮组织培养基仅在表皮细胞培养基的基础上增加VC和提高氯化钙的浓度，配制方法简单，可以迅速实现从细胞培养到组织制备的全过程。同时采用生物3D打印的制备方式，可以实现大规模批量化生产，减少人工制作导致的批间差异。

Description

采用同一无血清培养基的表皮组织简易制备工艺及其保存

技术领域

本发明属于细胞学及组织工程领域，尤其涉及一种采用同一无血清培养基的表皮组织简易制备工艺及其保存。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，具有保护体内组织、调节体温、感受刺激、排泄废物和参与免疫应答等重要的生物学功能。皮肤覆盖在人体表面，易于受到伤害，如发生大面积烧伤、皮肤溃疡和皮肤撕脱伤等。表皮细胞作为皮肤最外层表皮的主要组成细胞，其增殖速度与数量成为皮肤损伤修复的关键之一。此外，随着3R(减少、替代和优化)原则的推动和体外替代科学的发展，体外表皮组织因具有与人类皮肤相似的生理结构和代谢功能在化妆品/药品安全性评价，功效性测试和毒理学研究中获得了广泛的应用。其中表皮细胞是构建体外表皮组织的重要种子细胞。

目前表皮细胞来源包括从组织中分离提取的原代细胞或通过iPSC技术诱导而成的表皮细胞，其培养和扩增有两种体系，一是有饲养层支撑的有血清培养；二是无饲养层的无血清培养。其中，含血清的培养方式主要存在下列问题：1)血清易被病毒污染；2)血清中部分物质其含量和作用目前尚未完全确定；3)血清批次间差异大，无法保证培养基的稳定性及后期产品的一致性。无血清培养体系以其成分明确，批次间差异少，有利于后期生产标准化建立而受到使用者的欢迎。虽然无血清培养基有一定研究进展，但现有的无血清培养基中添加成分普遍较为复杂、价格高昂，且细胞一般难以达到有血清培养的生长速度。

而且，目前国际国内已有的可用于体外安全性评价的重组表皮模型，如申请号为CN 201610204148.6公布了一种体外表皮模型的制备方法，其中表皮模型每一层分化都需要特定的培养基，制作过程较为复杂。同时由于缺乏先进制造技术，无法进行大规模批量化地稳定生产。

发明内容

本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供一种表皮组织的制备方法，该方法包括以下步骤：

步骤(1)、将表皮细胞生物墨水加到生物3D打印喷头中，通过预先设置的速度和路径打印到底部放置有半透膜的培养皿内，制备得到表皮组织模型；其中，半透膜的材质为聚碳酸酯(PC)、聚酯(PE)或聚四氟乙烯(PTFE)；孔径为0.4-8μm。优选地，半透膜材质选择聚碳酸酯(PC)，孔径为0.4μm。

步骤(2)、待半透膜上细胞贴壁后，整个培养皿浸没在表皮组织培养基中培养1-2天；培养条件是37℃、5％CO₂、95％湿度。

步骤(3)、培养完成后，将培养皿内表皮组织培养基吸干，然后在培养皿外加入表皮组织培养基，进行气液临界培养10-14天，每隔两天更换一次；

在培养过程中，随机抽取表皮组织模型置于光学相干层析成像仪(OCT)下进行检测，观察模型表面是否干燥和平整。气液培养最后一天，随机抽取表皮模型置于光学相干层析成像仪(OCT)下进行检测，测量模型的三维结构形态和角质层分化情况。

表皮组织培养14天后，即可成熟，从组织结构和生理功能上均与人真实表皮组织类似。此时，培养完成的表皮组织可用于体外物质安全和功效评价。

上述表皮组织培养基在表皮细胞无血清培养基的基础上，提高其中钙盐的浓度，同时增加维生素C，支持表皮细胞分化成典型的四层复层化结构，其中表皮组织培养基中钙离子浓度为1.0-1.8mM，优选为1.2mM，维生素C浓度为25-75μg/mL，优选为50μg/mL。

作为优选，所述表皮细胞无血清培养基包括基础培养基、表皮细胞生长成分；本发明的无血清培养基针对角质形成细胞的生长特性进行定制配制，可以使其生长状态达到最优。

所述的基础培养基为DMEM(无钙)与Ham’s F12按照体积比为3:1的混合培养基，或培养基MCDB153；

所述的表皮细胞生长成分包括磷酸乙醇胺、表皮生长因子、氢化可的松、胰岛素、垂体提取物或泌乳素、转铁蛋白和钙盐。

作为优选，表皮细胞生长成分中各物质在表皮细胞无血清培养基中的浓度如下：磷酸乙醇胺1×10^-5-5×10^-4M、表皮生长因子0.1-5ng/mL、氢化可的松0.1-1μg/mL、胰岛素0.01-10μg/mL、泌乳素或垂体提取物10-50μg/mL、转铁蛋白1-10μg/mL、钙离子浓度为0.03-1.5mM；

更为优选，表皮细胞生长成分中各物质在表皮细胞无血清培养基中的浓度如下：磷酸乙醇胺1×10^-5-1×10^-4M、表皮生长因子0.1-1ng/mL、氢化可的松0.2-0.8μg/mL、胰岛素0.1-5μg/mL、垂体提取物20-30μg/mL、转铁蛋白2-8μg/mL、钙离子浓度0.03-0.2mM；

最为优选，表皮细胞生长成分中各物质在表皮细胞无血清培养基中的浓度如下：磷酸乙醇胺1×10^-4M、表皮生长因子0.2ng/mL、氢化可的松0.4μg/mL、胰岛素5μg/mL、垂体提取物30μg/mL、转铁蛋白5μg/mL、钙离子浓度为0.08mM；

所述的表皮细胞生物墨水包括表皮细胞悬浮液、生物材料。

所述表皮细胞为采用表皮细胞无血清培养基提取分离的原代细胞或传代细胞，表皮细胞提取自人头发、乳房组织或包皮组织，其中供体不受年龄限制，包括新生儿、儿童或成人。优选地，选择儿童包皮组织。

所述生物材料用于模拟基底膜成分，同时为表皮组织提供营养；包括胶原、明胶、粘连蛋白、海藻酸钠等其中一种或多种，胶原包括Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和Ⅳ型胶原中的一种或多种。优选地，生物材料选择Ⅰ型胶原，Ⅰ型胶原来源包括不限于大鼠鼠尾Ⅰ型胶原、猪皮Ⅰ型胶原、牛尾Ⅰ型胶原等，更为优选大鼠鼠尾Ⅰ型胶原；

所述表皮细胞无血清培养基中添加物的作用：

磷酸乙醇胺作为脂类前体物，是细胞膜合成和细胞生长所必需的物质，同时对表皮生长因子有协同作用，促进表皮细胞增殖，推迟终末分化。

表皮生长因子可以通过抑制表皮细胞的分化来有效延长表皮细胞的生长周期、传代代数及克隆形成率。

氢化可的松属于糖皮质素类激素，可通过抑制纤溶酶原激活子的合成促进细胞的贴壁和增殖，以计量依赖的方式促进表皮生长因子和受体的结合效率。其中所述氢化可的松可用可溶性类似物如地塞米松代替。

胰岛素是重要的血清替代成分，能够促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，促进RNA，蛋白质和脂类合成，能够促进细胞黏附贴壁，同时促进细胞分裂抑制细胞凋亡，是重要的细胞存活因子。其中，所述胰岛素可以是重组胰岛素、人源胰岛素、动物源胰岛素(如牛源胰岛素)、以及类胰岛素生长因子。

泌乳素或垂体提取物包含表皮细胞生长所必须的生长因子和激素类物质，是无血清培养体系的重要添加成分，能够更显著提高表皮细胞的增殖和克隆。其中所述的垂体提取物可以是牛垂体提取物，泌乳素可以是重组人源泌乳素或动物源泌乳素，如绵羊泌乳素。

转铁蛋白在无血清培养体系中起着重要作用，大多数动物细胞上存在特定的转铁蛋白受体，受体与转铁蛋白/Fe³⁺复合物的结合是细胞获得必须微量元素铁的主要来源，能有效结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。其中，所述转铁蛋白可以是重组转铁蛋白、人源转铁蛋白、动物源转铁蛋白(如牛源转铁蛋白)、以及乳铁蛋白。

本发明提供的表皮细胞无血清培养基成分简单，用于培养原代和传代表皮细胞时，不用包被接种表面，培养的细胞具有数量多、活性好、增殖能力强和传代次数多等特点。此外表皮细胞无血清培养基作为生物墨水成分之一用于表皮组织的构建，支持表皮细胞的增殖。

上述表皮细胞生物墨水的制备方法，并将表皮细胞无血清培养基作为成分之一添加到生物墨水中，其包括如下步骤：

步骤1、原代表皮细胞提取及培养

1-1获取健康人皮肤组织；其中所述皮肤组织包括但不限于包皮组织、眼睑组织和乳房组织等。作为优选，健康人皮肤组织大小为1-3cm²。

1-2细胞分离及培养

a)皮肤组织在PBS缓冲液中冷藏运输到实验室，取面积约1cm²大小；

b)用PBS缓冲液反复清洗皮肤组织，直至PBS缓冲液澄清；

c)将清洗后皮肤组织在聚维酮碘溶液中孵育30min，以防止感染；作为优选，聚维酮碘溶液中碘的质量含量为10％；

d)用PBS缓冲液再次清洗皮肤组织多次(可以是3次)，去除皮下脂肪组织；

e)将去除皮下脂肪组织后的皮肤组织置于1.2U/mL中性蛋白酶37℃消化1-6小时；

f)轻轻将皮肤组织中表皮和真皮剥离开来，将表皮组织剪碎后用0.25％(m/v)胰蛋白酶37℃消化5-30min；然后用含体积含量为10％血清的DMEM培养基终止消化，网筛过滤后离心，收集表皮细胞接种；其中.25％(m/v)胰蛋白酶为0.25g胰蛋白酶粉末溶于100mLPBS缓冲液制备得到。

g)表皮细胞接种至表皮细胞无血清培养基，且隔天更换一次表皮细胞无血清培养基；

步骤2、表皮细胞的扩增

2-1采用步骤1分离及提取的原代表皮细胞。

2-2传代培养

a)待原代表皮细胞汇合度达到80％～90％，倒掉培养瓶内的表皮细胞无血清培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞表面多次(可以是2次)；

b)加入1-3mL0.25％(m/v)的胰蛋白酶，37℃消化3～6min后，显微镜下观察到细胞开始变圆，加入1-3mL体积含量为10％血清的DMEM培养基终止消化；

c)用移液管吹打细胞，使细胞完全脱落，将脱落的细胞悬液转移到离心管内，800～1200rpm，离心5min；将离心所得的沉淀用表皮细胞无血清培养基重悬，按1瓶传代2瓶的比例接种进行传代培养，此时细胞代次记作P1。

d)从P1开始，当表皮细胞汇合度达到60％～80％时，重复上述步骤b)和c)。细胞每传代一次，细胞代次依次记作P2、P3...依此类推。

步骤3、表皮细胞生物墨水的制备

3-1从皮肤组织中提取原代表皮细胞或经iPSC诱导的表皮细胞；

3-2利用表皮细胞无血清培养基培养原代表皮细胞，消化原代表皮细胞并用表皮细胞无血清培养基进行传代培养，得到表皮细胞悬浮液，记作组分A；或消化传代培养的表皮细胞，并用表皮细胞无血清培养基制备表皮细胞悬浮液，记作组分A；其中传代培养的表皮细胞采用P1-P10，优选地，表皮细胞为P2-P6。

上述表皮细胞悬液密度为4×10⁴-1×10⁷cells/mL，优选地，表皮细胞悬液密度为3×10⁶cells/mL；

3-3低浓度中性生物材料溶液制备：利用表皮细胞无血清培养基稀释生物材料，加入10×PBS和1mol/LNaOH溶液，调节pH至7.4，记作组分B。

其中，生物材料浓度为0.1mg/mL-2mg/mL，优选生物材料浓度为0.1mg/mL。

3-4将组分A、B按照体积比为1:10-1:60混合均匀，即可制备成表皮细胞生物墨水。

作为优选，组分A和B的混合体积比为1:30。

本发明的另一个目的是提供表皮组织的保存方法：

利用由固定载体材料和营养支持培养基组成的处理材料保存上述表皮组织；

所述固体载体材料为具有一定力学性能的水凝胶材料，可以为明胶、甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠、琼脂糖、壳聚糖等其中的一种或多种组成，用于固定支撑成熟的表皮组织；优选地，固定载体材料为明胶。

所述营养支持培养基用于运输过程为表皮组织提供营养，采用表皮组织培养基。

作为优选，处理材料中明胶浓度为1％-15％(w/v，单位为g/mL)，优选地明胶浓度为2％-10％(w/v，单位为g/mL)。

上述处理材料的制备方法如下:

步骤(1)、在固体载体材料中加入去离子水，得到固体载体材料溶液，灭菌后备用；

步骤(2)、将固体载体材料溶液与营养支持培养基按照体积比1:1-5(优选1:2)混合均匀，即可用于表皮组织的短期保存。

本发明的有益效果：

本发明提出一种新配方的无血清培养基，成分明确，价格低廉；支持多种来源表皮细胞的提取及扩增；

本发明在表皮组织制备过程中均可采用同一配方的无血清培养基，便可促进表皮细胞分化为具有同人体表皮类似的四层复层化结构，培养方式操作简便；表皮组织培养基仅在表皮细胞无血清培养基的基础上增加VC和提高氯化钙的浓度，配制方法简单，可以迅速实现从细胞培养到组织制备的全过程。同时采用生物3D打印的制备方式，可以实现大规模批量化生产，减少人工制作导致的批间差异。

附图说明

图1A-1B分别是本发明实施例1中健康男性包皮提取的原代表皮细胞、健康女性眼睑提取的原代表皮细胞接种4天时的细胞状态图；

图2A-2B分别是本发明实施例2中健康男性P7表皮细胞、健康女性P7表皮细胞传代消化第2天的细胞状态图；

图3A-3B分别是本发明实施例3中利用健康男性包皮提取的表皮细胞和健康女性眼睑提取的表皮细胞构建的表皮组织模型在培养完成时的H&E组织切片图；

图4A-4B分别是本发明实施例3中利用健康男性包皮提取的表皮细胞和健康女性眼睑提取表皮细胞构建的表皮组织模型在培养完成时OCT扫描的三维图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。

实施例1：原代表皮细胞分离

(1)材料和方法

样本：健康男性包皮环切术后的包皮皮肤，健康女性眼睑组织，取1-3cm²大小。

细胞培养基：基础培养基为MCDB153；添加因子分别为：磷酸乙醇胺1×10^-4M、表皮生长因子0.5ng/mL、氢化可的松0.2μg/mL、胰岛素0.5μg/mL、牛垂体提取物20μg/mL、转铁蛋白5μg/mL、钙离子浓度为0.06mM。

(2)细胞分离及培养

a)皮肤组织在含PBS缓冲液中冷藏运输到实验室，取面积约1cm²大小；

b)用PBS缓冲液反复清洗组织直至冲洗液澄清；

c)将皮肤组织在聚维酮碘溶液(10％碘)中孵育30min，以防止感染；

d)用PBS缓冲液再次清洗皮肤组织3次，用手术剪刀去除皮下脂肪组织；

e)1.2U/mL中性蛋白酶37℃消化样本1-6小时；

f)轻轻将表皮和真皮剥离开来，将表皮组织剪碎后用0.025％(m/v)胰蛋白酶37℃消化5-30min；

g)用含10％血清的DMEM培养基终止消化，过滤后离心后收集表皮细胞接种；

h)隔天更换一次表皮细胞无血清培养基；

i)表皮细胞在第4天时汇合度接近80％，显微镜下拍照后进行传代；

结果：图1A为包皮组织提取的表皮细胞接种后第4天细胞状态图；图1B为眼睑组织提取的表皮细胞接种后第4天细胞状态图。

实施例2：表皮细胞传代扩增培养

(1)材料和方法

样本：按照实施例1分离及提取的原代表皮细胞

细胞培养基：基础培养基为MCDB153；添加因子分别为：磷酸乙醇胺1×10^-4M、表皮生长因子0.5ng/mL、氢化可的松0.2μg/mL、胰岛素0.5μg/mL、泌乳素20μg/mL、转铁蛋白5μg/mL、钙离子浓度为0.06mM。

(2)传代培养

a)待原代表皮细胞汇合度达到80％～90％，倒掉培养瓶内的培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞表面两次；

b)加入1-3mL0.025％(m/v)的胰蛋白酶，37℃消化3～6min后，显微镜下观察到细胞开始变圆，加入1-3mL含10％血清的DMEM培养液终止消化；

c)用移液管吹打细胞，使细胞完全脱落，将脱落的细胞和培养液转移到离心管内，800～1200rpm，离心5min，将离心所得的沉淀用表皮细胞无血清培养基重悬，按1：2的比例接种进行传代培养，此时细胞代次记作P1。

从P1开始，当表皮细胞汇合度达到60％～80％时，重复上述步骤b)和c)。细胞每传代一次，细胞代次依次记作P2、P3...依此类推。

结果：图2A为包皮组织P7表皮细胞传代消化第2天的细胞状态图；图2B为眼睑组织P7表皮细胞传代消化第2天的细胞状态图。

实施例3：生物3D打印表皮模型-1

(1)材料和方法

样本：按照实施例2培养的P2包皮及眼睑来源的表皮细胞

培养基：基础培养基为MCDB153；添加因子分别为：磷酸乙醇胺1×10^-4M、表皮生长因子0.5ng/mL、氢化可的松0.2μg/mL、胰岛素0.5μg/mL、泌乳素20μg/mL、转铁蛋白5μg/mL、钙离子浓度为1.2mM。

低浓度中性胶原溶液：鼠尾Ⅰ型胶原溶液、10×PBS、1mol/LNaOH溶液、表皮细胞无血清培养基，混合均匀，胶原溶液终浓度为0.1mg/mL。

(2)三维重组表皮模型构建

a)待P2表皮细胞汇合度达到60％～80％，倒掉培养瓶内的培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞表面两次；

b)加入1-3mL0.025％(m/v)的胰蛋白酶，37℃消化3～6min后，显微镜下观察到细胞开始变圆，加入1-3mL含10％血清的DMEM培养液终止消化；

c)用移液管吹打细胞，使细胞完全脱落，将脱落的细胞和培养液转移到离心管内，800～1200rpm，离心5min后倒去上清，加入表皮细胞无血清培养基，使表皮细胞悬液密度为3×10⁶cells/mL，记作组分A；上述表皮组织培养基在培养基MCDB153的基础上，提高其中钙盐的浓度，同时增加维生素C，支持表皮细胞分化成典型的四层复层化结构，其中表皮组织培养基中钙离子浓度为1.2mM，维生素C浓度为50μg/mL。

d)低浓度中性胶原溶液制备：利用表皮细胞无血清培养基稀释大鼠鼠尾Ⅰ型胶原，加入10×PBS和1mol/L NaOH溶液，调节pH为7.4，记作组分B。其中，Ⅰ型胶原浓度为0.1mg/mL；

e)将组分A、B按照体积比1:10-60混合均匀，即可制备成表皮细胞生物墨水。

f)利用生物3D打印机将生物墨水打印在培养皿的半透膜上，每孔100μL。培养皿内外均加表皮组织培养基，浸没培养1-2天；

g)将培养皿内半透膜上表面培养基吸出，培养皿外置于表皮组织培养基内进行气-液临界培养，每天换液，培养10-14天。

结果：图3A是包皮组织来源表皮细胞构建的表皮组织模型在培养完成时的H&E组织切片图；图3B是眼睑组织来源表皮细胞构建的表皮组织模型在培养完成时的H&E组织切片图。图4A是包皮组织来源表皮细胞构建的表皮组织模型在培养完成时利用OCT扫描后的三维重建图；图4B是眼睑组织来源表皮细胞构建的表皮组织模型在培养完成时利用OCT扫描后的三维重建图。

上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.采用同一无血清培养基的表皮组织简易制备工艺，包括以下步骤：

步骤(1)、将表皮细胞生物墨水加到生物3D打印喷头中，通过预先设置的速度和路径打印到底部放置有半透膜的培养皿内；

步骤(2)、待半透膜上细胞贴壁后，整个培养皿浸没在表皮组织培养基中培养1-2天；培养条件是37℃、5％CO₂、95％湿度；

步骤(3)、培养完成后，将培养皿内表皮组织培养基吸干，然后在培养皿外加入表皮组织培养基，进行气液临界培养10-14天，每隔两天更换一次；

所述表皮组织培养基为在表皮细胞无血清培养基的基础上，额外添加钙盐、维生素C，使得表皮组织培养基中钙离子浓度为1.0-1.8mM，维生素C浓度为25-75μg/mL；

所述的表皮细胞生物墨水包括表皮细胞悬浮液、生物材料；

所述表皮细胞为采用表皮细胞无血清培养基提取分离的原代细胞或传代细胞；

所述生物材料包括胶原、明胶、粘连蛋白、海藻酸钠中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的制备工艺，其特征在于半透膜的材质为聚碳酸酯、聚酯或聚四氟乙烯；孔径为0.4-8μm。

3.如权利要求1所述的制备工艺，其特征在于所述表皮细胞无血清培养基包括基础培养基、表皮细胞生长成分；

所述的基础培养基为DMEM与Ham’s F12按照体积比为3:1的混合培养基，或培养基MCDB153；

所述的表皮细胞生长成分包括磷酸乙醇胺、表皮生长因子、氢化可的松、胰岛素、垂体提取物或泌乳素、转铁蛋白和钙盐。

4.如权利要求3所述的制备工艺，其特征在于所述表皮细胞生长成分中各物质在表皮细胞无血清培养基中的浓度如下：磷酸乙醇胺1×10^-5-5×10^-4M、表皮生长因子0.1-5ng/ml、氢化可的松0.1-1μg/ml、胰岛素0.01-10μg/ml、泌乳素或垂体提取物10-50μg/ml、转铁蛋白1-10μg/ml、钙离子浓度为0.03-1.5mM。

5.如权利要求4所述的制备工艺，其特征在于所述表皮细胞生长成分中各物质在表皮细胞无血清培养基中的浓度如下：磷酸乙醇胺1×10^-4M、表皮生长因子0.2ng/mL、氢化可的松0.4μg/mL、胰岛素5μg/mL、垂体提取物30μg/mL、转铁蛋白5μg/mL、钙离子浓度为0.08mM。

6.如权利要求1所述的制备工艺，其特征在于所述表皮细胞生物墨水的制备方法包括如下步骤：

步骤1、原代表皮细胞提取及培养

1-1获取健康人皮肤组织；

1-2细胞分离及培养

a)皮肤组织在PBS缓冲液中冷藏运输；

b)用PBS缓冲液反复清洗皮肤组织，直至PBS缓冲液澄清；

c)将清洗后皮肤组织在聚维酮碘溶液中孵育一定时间；

d)用PBS缓冲液再次清洗皮肤组织多次，去除皮下脂肪组织；

e)将去除皮下脂肪组织后的皮肤组织置于1.2U/ml中性蛋白酶37℃消化1-6小时；

f)轻轻将皮肤组织中表皮和真皮剥离开来，将表皮组织剪碎后用0.25％胰蛋白酶37℃消化5-30min；然后用含体积含量为10％血清的DMEM培养基终止消化，网筛过滤后离心，收集表皮细胞接种；

g)表皮细胞接种至表皮细胞无血清培养基，且隔天更换一次表皮细胞无血清培养基；

步骤2、表皮细胞的扩增

2-1采用步骤1分离及提取的原代表皮细胞；

2-2传代培养

a)待原代表皮细胞汇合度达到80％～90％，倒掉培养瓶内的表皮细胞无血清培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞表面多次；

b)加入1-3mL0.25％胰蛋白酶，37℃消化3～6min后，显微镜下观察到细胞开始变圆，加入1-3mL体积含量为10％血清的DMEM培养基终止消化；

c)用移液管吹打细胞，使细胞完全脱落，将脱落的细胞悬液转移到离心管内，800～1200rpm，离心5min；将离心所得的沉淀用表皮细胞无血清培养基重悬，然后进行传代培养；

d)当表皮细胞汇合度达到60％～80％时，重复上述步骤b)和c)，最终得到第一至十代的传代培养的表皮细胞；

步骤3、表皮细胞生物墨水的制备

3-1从皮肤组织中提取原代表皮细胞或经iPSC诱导的表皮细胞；

3-2利用表皮细胞无血清培养基培养原代表皮细胞，消化原代表皮细胞并用表皮细胞无血清培养基进行传代培养，得到表皮细胞悬浮液，记作组分A；或消化传代培养的表皮细胞，并用表皮细胞无血清培养基制备表皮细胞悬浮液，记作组分A；

上述表皮细胞悬液密度为4×10⁴-1×10⁷cells/mL；

3-3低浓度中性生物材料溶液制备：利用表皮细胞无血清培养基稀释生物材料，加入10×PBS和1mol/LNaOH溶液，调节pH至7.4，记作组分B；

其中生物材料浓度为0.1mg/mL-2mg/mL；

3-4将组分A和B按照体积比为1:10-1:60混合均匀，再加入表皮细胞无血清培养基混匀后制备得到表皮细胞生物墨水。

7.权利要求1-6任一所述的制备工艺得到的表皮组织的保存方法，其特征在于利用由固定载体材料和表皮组织培养基组成的处理材料保存上述表皮组织。

8.如权利要求7所述的保存方法，其特征在于所述固体载体材料为明胶、甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠、琼脂糖、壳聚糖中的一种或多种。

9.如权利要求8所述的保存方法，其特征在于所述固体载体材料为明胶。

10.如权利要求7所述的保存方法，其特征在于所述处理材料的制备方法如下：

步骤(1)、在固体载体材料中加入去离子水，得到固体载体材料溶液，灭菌后备用；

步骤(2)、将固体载体材料溶液与表皮组织培养基按照体积比1:1-5混合均匀即可。

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