CN105132357A - 一种用于表皮细胞培养的无血清培养体系 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可用于表皮细胞培养的无血清培养体系，包括基础培养基，以及氨基酸1-5mM、霍乱毒素0.01-0.5μg/ml、促生长因子0.1-100μg/ml、腺嘌呤100-300μM、铁源1-10μg/ml、三碘甲状腺原氨酸1-5μM、以及钙盐。本发明提供的培养基成分中无血清添加，可以同时应用于有滋养层及无滋养层的培养，该方法提取的原代细胞数量大，活性高，在培养过程中表皮细胞贴壁率高、增殖快、分化率低，经过培养的细胞活性高，仍具备细胞原有的功能性。

Description

一种用于表皮细胞培养的无血清培养体系

技术领域

本发明涉及一种组织工程培养体系，尤其涉及一种用于表皮细胞培养的无血清培养体系。

背景技术

表皮细胞是位于皮肤最浅层的细胞，主要由表皮形成细胞和树突状细胞等种类的细胞组成。其中，表皮祖细胞存在于表皮基底层及毛囊中。表皮细胞在很多情况下有很重要的作用，如组织工程皮肤的构建中可将表皮祖细胞导入来培养组织工程皮肤的表皮部分，皮肤病的病理研究与治疗中可借用体外培养的表皮细胞来帮助进行皮肤相关疾病的发病机理的研究并通过表皮细胞对药物的反应，进行创伤修复、基因治疗，此外，创伤处愈合效果与伤处的表皮细胞的数量与增殖活性等密切相关。因此，体外快速培养表皮细胞以供移植等方式在医学领域具有重要意义。

表皮细胞的体外培养早有历史，在20世纪70年代开始就已经有学者致力于表皮细胞的分离和培养。表皮细胞培养体系根据有无滋养层及有无血清添加而分为不同类型，如中国专利CN104548209A公开的表皮细胞制备方法，蛋白酶消化分离后，将细胞置于含胎牛血清的DMEM培养基中进行传代和培养，中国专利CN1431299A公开了一种含牛血清蛋白、过氧化氢酶的无血清IMDM培养基，CN101333513B公开了一种无血清培养基，可用于单细胞或低密度水平下生长代谢和形成良好的细胞群落。

其中，因现今血清仍存在未知成分，且属于异源添加物，因而有血清的培养体系一直存在争议，无血清培养虽然获得了一定程度的研究成果，但是一般难以达到有血清培养的生长速度。

发明内容

针对目前有血清培养体系存在的问题，本发明提供了一种无血清培养体系，可以同时应用于有滋养层及无滋养层的培养。

本发明第一个方面是提供一种可用于表皮细胞培养的无血清培养体系，所述无血清培养基包括基础培养基，以及

氨基酸1-5mM，优选为1.5-4mM，更优选为2-3mM；

霍乱毒素0.01-0.5μg/ml，优选为0.05-0.4μg/ml，更优选为0.8-0.3μg/ml，更优选为0.1-0.2μg/ml；

促生长因子0.1-100μg/ml，优选为0.2-90μg/ml，更优选为0.3-80μg/ml，更优选为0.4-60μg/ml，更优选0.5-50μg/m；

腺嘌呤100-300μM，优选为130-250μM，更优选为150-220μM，更优选为180-200μM；

铁源1-10μg/ml，优选为2-8μg/ml，更优选为3-7μg/ml，更优选为5-6μg/ml；三碘甲状腺原氨酸1-5μM，优选为1.5-4μM，更优选为2-3μM；

以及钙盐0.05-2mM，更优选为0.08-1.5mM，更优选为0.1-1mM，更优选为0.4-0.8mM。

其中，所述基础培养基可以是已知的可用于表皮细胞培养的合成培养基或商品化培养基中的一种或几种的混合物，如DMEM培养基、DMEM与Ham’sF12混合培养基、RPI1640培养基，以及商品化的EX-302(JRH公司)、EX-620(JRH公司)、SFM4(hyclone公司)培养基。

在一种优选实施例中，所述DMEM与Ham’sF12混合培养基中，DMEM与Ham’sF12重量比例优选为(0.5-10)︰1，更优选为(1-8)︰1，更优选为(2-6)︰1，更优选为(3-5)︰1。

其中，所述氨基酸为细胞能量来源，可以是精氨酸、缬氨酸、络氨酸、组氨酸、色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、亮氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、L-谷氨酰胺中的任意一种或几种。

其中，促生长因子可以是肽激素、皮质醇、胰岛素、甲状腺素、氢化可的松中的任意一种或几种，更优选为表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松中的任意一种或其任意组合。

其中，所述胰岛素可以是重组胰岛素、人源胰岛素、动物源胰岛素(如牛源胰岛素)、以及类胰岛素生长因子。

在一种优选实施例中，所述无血清培养体系含有氢化可的松0.1-1μg/ml，优选为0.2-0.8μg/ml，更优选为0.3-0.6μg/ml，更优选为0.4-0.5μg/ml。

在一种优选实施例中，所述无血清培养体系含有胰岛素1-80μg/ml，优选为2-70μg/ml，更优选为4-60μg/ml，更优选为5-50μg/ml。

在一种优选实施例中，所述无血清培养体系含有人表皮生长因子1-50μg/ml，优选为2-40μg/ml，更优选为4-30μg/ml，更优选为5-20μg/ml，更优选为10-15μg/ml。

其中，所述铁源可以是能够被细胞转铁蛋白受体接受并获取铁元素的物质，如转铁蛋白、以及能够起到相同作用的转铁蛋白替代物中的任意一种或几种。

其中，转铁蛋白可以是重组转铁蛋白、人源转铁蛋白、动物源转铁蛋白(如牛源转铁蛋白)中的任意一种或几种。

其中，所述转铁蛋白替代物可以是柠檬酸铁、二甲胂酸铁、葡糖酸铁中的任意一种或几种。

其中，所述钙盐可以是氯化钙。

此外，本发明所述的无血清培养体系中，还可以包括乙醇胺、硒源(如亚硒酸盐)、维生素、贴壁因子中的任意一种或几种。

本发明第二个方面是提供一种表皮细胞培养方法，所述方法包括：

分离的表皮细胞接种于上述任意一种无血清培养体系中进行培养；

进行传代培养。

本发明第三个方面是提供一种制备人工表皮的方法，所述方法包括：

分离表皮细胞；

将表皮细胞接种于上述任意一种无血清培养体系中进行培养；

进行传代培养；

表皮细胞汇合；

收集人工表皮。

本发明提供的培养基成分中无血清添加，可以同时应用于有滋养层及无滋养层的培养，该方法提取的原代细胞数量大，活性高，在培养过程中表皮细胞贴壁率高、增殖快、分化率低，经过培养的细胞活性高，具备细胞原有的功能性。

附图说明

图1A-图1C分别为本发明实施例1中细胞接种后2、4、7天时的细胞状态图；

图2A-图2C分别为本发明实施例2中细胞接种后2、4、7天时的细胞状态图；

图3A-图3B分别为本发明实施例3中细胞接种后12天时的细胞状态图和多巴染色图。

具体实施方式

实施例1，健康男性包皮环切术后的包皮皮肤，体外扩增表皮细胞

(1)材料和方法

样本：医院手术后废弃的健康男性包皮环切术后的包皮皮肤取3cm²大小

细胞培养基：DMEM、Ham’sF12混合培养基，其中，DMEM、Ham’sF12重量比例3︰1

添加因子：L谷氨酰胺(2mM)、霍乱毒素(0.1ug/ml)、腺嘌呤(180uM)、氢化可的松(0.4ug/ml)、胰岛素(20ug/ml)、人表皮生长因子(10ug/ml)、转铁蛋白(5ug/ml)、三碘甲状腺原氨酸(2uM)、CaCl₂(1mM)。

(2)细胞分离及培养

a)皮肤样本在DMEM培养液中冷藏运输到实验室，测量面积，取3cm²大小。

b)用PBS清洗样本；碘酒、酒精消毒后再重复清洗样本，剪去部分的真皮层后切碎。

c)0.05％胰酶冷消化样本12-16小时；加胰酶抑制剂终止消化；

d)I型胶原酶继续热消化2-6小时，过滤后离心后收集表皮细胞接种至培养皿中培养。

e)隔天更换一次混合培养基

f)第4天传代，添加y27632后37℃，5％CO2下培养1小时，加胰酶继续消化；离心收集细胞，接种至新的培养皿中培养，隔天更换一次培养基至细胞，细胞第4天接近汇合。

结果：图1A为细胞接种后第2天时细胞状态图；图1B为第4天时细胞传代前的细胞状态图；图1C为第7天冻存前的细胞状态图。

实例2，取健康成年女性手术后的胸部皮肤，体外扩增表皮细胞

(1)材料和方法

样本：医院手术废弃的成年女性正常胸部皮肤约3cm²

细胞培养基：DMEM、Ham’sF12混合培养基，其中，DMEM、Ham’sF12重量比例3︰1

添加因子：L谷氨酰胺(2mM)、霍乱毒素(0.1ug/ml)、腺嘌呤(180uM)、氢化可的松(0.4ug/ml)、胰岛素(10ug/ml)、人表皮生长因子(10ug/ml)、转铁蛋白(5ug/ml)、三碘甲状腺原氨酸(2uM)、CaCl₂(1mM)。

(2)细胞分离及培养步骤

a)皮肤样本在DMEM培养液中冷藏运输到实验室，测量面积为3cm²。

b)用PBS清洗样本；碘酒、酒精消毒后再重复清洗样本，剪去部分的真皮层后切碎

c)0.05％胰酶冷消化样本12-16小时；加胰酶抑制剂终止消化；

d)I型胶原酶继续热消化2-6小时，过滤后离心后收集表皮细胞接种至培养皿中培养。

e)隔天更换一次混合培养基。

f)第7天时细胞接近汇合

结果：图2A、2B、2C分别为接种第2天、第4天与第7天的结果图。

实例3健康男性包皮环切术后的包皮皮肤，用体外扩增表皮细胞并形成表皮，进行苏木素染色和多巴染色。

(1)材料和方法

样本：医院手术后废弃的健康男性包皮环切术后的包皮皮肤取3cm²大小

皮肤培养基：DMEM、Ham’sF12混合培养基，其中，DMEM、Ham’sF12重量比例3︰1

添加因子：L谷氨酰胺(2mM)、霍乱毒素(0.1ug/ml)、腺嘌呤(180uM)、氢化可的松(0.4ug/ml)、胰岛素(20ug/ml)、人表皮生长因子(10ug/ml)、转铁蛋白(5ug/ml)、三碘甲状腺原氨酸(2uM)、CaCl₂(1mM)。

(2)细胞分离及表皮培养

a)表皮细胞扩增：具体步骤参照实例1所述

b)表皮膜片的分离及染色:8天后细胞汇合，汇合后继续培养4天后进行皮片剥离；用dispase分散酶消化表皮膜片后覆盖油纱布将皮片轻轻从培养皿剥离，对剥离下的皮片做苏木素染色和多巴染色，观察黑色素在表皮膜片上的分布。

(3)结果：图片3A显示体外形成的表皮膜片上细胞状态良好；苏木素染色与多巴染色(图片3B)结果显示表皮膜片上存在分布较均匀的黑色素，说明黑色素细胞存在并分泌黑色素，证明该体系下培养的黑色素细胞仍然具备其在体内时原有的功能性。

可以看出：

1)本发明使用的培养体系是采用无血清培养体系，避免了血清在培养过程中的使用所带来的争议和应用上的限制。

2)本发明所用的培养基可以在无滋养层的体系中直接贴附培养皿底部生长，操作简单，且可以避免滋养层细胞的代谢活动可能给细胞带来的不利影响

3)本发明培养体系下的表皮细胞增殖旺盛，在4-7天内即可获得大量的增值能力高的表皮细胞。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种可用于表皮细胞培养的无血清培养体系，其特征在于，所述无血清培养体系包括基础培养基，以及

氨基酸1-5mM；

霍乱毒素0.01-0.5μg/ml；

促生长因子0.1-100μg/ml；

腺嘌呤100-300μM；

铁源1-10μg/ml；

三碘甲状腺原氨酸1-5μM；

以及钙盐0.05-2mM。

2.根据权利要求1所述的无血清培养体系，其特征在于，所述基础培养基选自DMEM培养基、DMEM与Ham’sF12混合培养基、RPI1640培养基中的任意一种或几种。

3.根据权利要求1所述的无血清培养体系，其特征在于，所述DMEM与Ham’sF12混合培养基中，DMEM与Ham’sF12重量比例优选为(0.5-10)︰1。

4.根据权利要求1所述的无血清培养体系，其特征在于，所述促生长因子选自肽激素、皮质醇、胰岛素、甲状腺素、氢化可的松中的任意一种或几种。

5.根据权利要求4所述的无血清培养体系，其特征在于，所述无血清培养体系含有氢化可的松0.1-1μg/ml，含有胰岛素1-80μg/ml，优选为2-70μg/ml，含有人表皮生长因子1-50μg/ml。

6.根据权利要求1所述的无血清培养体系，其特征在于，所述氨基酸选自精氨酸、缬氨酸、络氨酸、组氨酸、色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、亮氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、L-谷氨酰胺中的任意一种或几种。

7.根据权利要求1所述的无血清培养体系，其特征在于，所述铁源选自转铁蛋白、柠檬酸铁、二甲胂酸铁、葡糖酸铁中的任意一种或几种。

8.根据权利要求1所述的无血清培养体系，其特征在于，所述钙盐是氯化钙。

9.一种表皮细胞培养方法，其特征在于，所述方法包括：

分离的表皮细胞接种于权利要求1所述无血清培养体系中进行培养；

进行传代培养。

10.一种制备人工表皮的方法，其特征在于，所述方法包括：

分离表皮细胞；

将表皮细胞接种于权利要求1所述无血清培养体系中进行培养；

进行传代培养；

表皮细胞汇合；

收集人工表皮。