CN101735976B - 一种用于表皮黑素细胞体外培养的培养基 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于表皮黑素细胞体外培养的培养基，所述培养基以适用于表皮黑素细胞体外培养的基础培养基为基质，并添加：(1)生长因子、(2)cAMP促进剂和(3)血清。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了专门用于表皮黑素细胞的体外培养的培养基，可用于培养增殖能力、迁移能力和黑素合成能力强的表皮黑素细胞，可以使患者的黑素细胞在体外更好的生长及分化，可用于移植治疗色素减退或无色素性皮肤病患者。

Description

一种用于表皮黑素细胞体外培养的培养基

(一)技术领域

本发明涉及一种用于表皮黑素细胞体外培养的培养基。 

(二)背景技术

皮肤颜色主要由皮肤制造的色素和皮肤表层所含天然色素的组合所决定。皮肤上皮层表面的表皮中含有能制造皮肤色素(即黑色素)的表皮黑素细胞。色素减退或无色素性皮肤病患者的皮肤黑素细胞缺失、被破坏或无功能，从而在身体各部位出现白斑。 

黑色素不但具有保护作用，在皮肤美学上也至关重要。某些疾病可引起局部黑素细胞破坏、缺失或细胞功能受抑制，影响皮肤色素制造系统，从而导致皮肤色素减退或者色素缺失。此种异常会造成患者心理学和社会学的严重损害。 

白癜风是一种特殊的皮肤色素性疾病，以出现白斑和表皮黑素细胞缺失为主要特征。当前治疗包括光敏剂(如补骨脂素)联合UVA照射、窄波UVB照射或者局部使用(肾上腺)皮质类固醇，但疗效低，并伴随一定副作用(Shaffali and Gawkrodger，2000，Clin Exp Dermatol 25：575)。 

外科移植技术已经应用于白癜风治疗，如负压吸疱移植、刃厚皮片移植或微小皮片移植(Koga et al.，1988，Arch Dermatol 124：1656；Gupta etal.，1999，Dermatol Surg 25：955；Falabella，1984，J Dermatol Surg Oncol10：136；Suvanprakorn et al.，1985，J Am Acad Derm 13：968；Sarkar et al.，2001，J Dermatol 28：540；Pai et al.，2002，J.Eur Acad Dermatol Venereol16：604)。这些治疗在局限性和小面积病损的患者中有效。但对白斑面积大或者白斑数量多的患者，获得足够的移植皮片具有一定困难(Van Geel，N.et al.，2001，Dermatology 202：162)。 

要成功地进行大面积的自体表皮移植，需有大的移植皮片，内含大量细胞，特别是黑素细胞。或者，可通过细胞培养大量扩增自体黑素细胞用于移植。这种方法需要从病人健康皮肤取得黑素细胞，在体外将其培养在合适环境中(可促进细胞增殖、迁移和黑素制造)使之大量扩增，再在合适条件下将细胞移植至病人病变处皮肤，使之恢复正常颜色。 

Lerner等(1987，J Invest Derm 89：219)介绍了黑素细胞移植治疗斑驳病(一种遗传疾病，以先天性缺乏黑色素细胞导致皮肤白斑和白发为特点)。通过皮切活检术获得一小块皮肤，用含有TPA(12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate)，异丁基甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)，霍乱毒素及新生牛血清的培养基培养表皮黑素细胞。虽然细胞成功地移植到了色素减退区域，但由于培养基中含有TPA(一种肿瘤促进因子)，使这种培养基不适合用于人类移植。 

U.S.Pat.No.4,757,019介绍了一种人黑素细胞培养基的使用。此培养基包括MEM基础培养基，5％胎牛血清，phorbol 12-myristate13-acetate(PMA，即TPA，10ng/ml)和霍乱毒素(10-8M)。由于这种培养基含有TPA，也不适合用于人类移植。 

Olsson等(1992，Lancet 340：981)报告的表皮黑色素细胞培养基配方，包含PC-1，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，丁酰环腺苷酸(dbcAMP)，青霉素-链霉素。该培养基用于在自体黑素细胞移植中扩增分离到的表皮黑色素细胞。此培养基不包含促进黑色素细胞生长和分化必需的血清。此外，bFGF的浓度(5ng/ml)太低，不能刺激表皮黑色素细胞作足够的生长。而dbcAMP不是一种天然物质，作用时间也很短。另外，对所培养细胞的数量和黑素含量均无量化指标报道，因此，很难评价这一培养基的效率。值得注意的是，Olsson等后来已使用非培养的表皮黑色素细胞移植治疗白癜风(Olsson and Juhlin，1998，Br J Dermatol 138：644)。 

另外的培养基，如HU16(FIC培养基)已被我们用于培养表皮黑素细胞。HU16培养基包括F12培养基(一种商品化的基础培养基)，补充有效浓度的bFGF、IBMX，霍乱毒素和胎牛血清。该培养基已经在台湾成功应用于120例白癜风患者黑素细胞移植治疗中的黑素细胞培养(Chen etal.，1999，Show Chwan Med J 1：85；Chen et al.，2000，J.Dermatol 27：434；Chen et al.；2001)。另一种表皮黑素细胞培养基(HU74)，含有bFGF、肝细胞生长因子(HGF)、肾上腺素和α-MSH，已经建立并在美国成功申报专利(US Patents 6943024and 7132279)。 

虽然培养表皮黑素细胞的培养基很多，但都不是最佳的。因此，一些患者因为细胞生长不佳，必须长时间等待；另一小部分患者细胞生长差，达不到移植需要。另外，一些移植成功的病人在移植区域的边缘缺乏色素形成，这可能与培养基不能有效刺激细胞的迁移有关(Chen et al.1999，Show Chwan Med J 19991：85；Chen et al.，2000，J.Dermatol 27：434)。 

因此，建立一种在体外培养表皮黑素细胞的新培养基是必要的，该培养基应是由非毒性和/或天然和/或生理学谐调的物质组成，能促进表皮黑素细胞增殖，并能表达正常表皮黑素细胞特性，(黑素合成和细胞迁移).最近发现有些生长因子能刺激不同种类细胞的生长。其中，成纤维细胞生长因子20(FGF20)是一种属于FGF家族的多功能生长因子，最早发现于2001年。FGF20与各种器官、组织和细胞的发育、生长和分化有关。FGF20可刺激不同细胞的生长和存活，特别是保护细胞对抗辐射和氧化应激的损伤。FGF20被研究用于减轻癌症化疗后的口腔粘膜炎，其作用在I期临床中获得肯定，且耐受良好(Schuster et al.，2008，Support CareCancer 16：477；Maclachlan et al.，2005，Int J Radiat Biol 81：567；Lavine Etal.，2005，Dev Cell 8：85；Ohmachi et al.，2003，J Neurosci Res 72：436)。FGF20在表皮黑素细胞生长和黑素合成上的作用尚未见报道。 

间羟异丙肾上腺素(Metaproterenol)是一种选择性的β2肾上腺素能的激动剂。间羟异丙肾上腺素通过cAMP第二信使系统激活β2肾上腺素能的受体，从而刺激黑素细胞生长与黑素合成。β2肾上腺素能的激动剂可刺激眼黑素细胞的生长和黑素合成；α-，β1和-β3-肾上腺素能的激动剂对生长和黑素合成没有作用(Hu et al.，2000，Exp.Eye Res.71：217)。间羟异丙肾上腺素(Metaprel，口服或者口腔吸入)已经在临床用作雾化吸入剂超过20年(Gilman et al，The Pharmacological Basis of Therapeutics，8th Ed，Pergamon Press，New York，1990)。间羟异丙肾上腺素在表皮黑素细胞生长和黑素合成上的作用尚未见报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种用于表皮黑素细胞体外培养的培养基新配方。 

本发明采用的技术方案是： 

一种用于表皮黑素细胞体外培养的培养基，所述培养基以适用于表皮黑素细胞体外培养的基础培养基为基质，所述基质中添加有：(1)体积浓度5％～30％的血清、(2)3～1000ng/mL的生长因子和(3)cAMP促进剂，所述生长因子为下列之一或其中两种以上的混合：FGF20、bFGF、HGF、EGF、转录生长因子β；所述cAMP促进剂为下列之一或其中两种以上的混合：1～1000μg/mL的异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)、1～1000μM的间羟异丙肾上腺素(Metaproterenol)、1～1000μM的L-肾上腺素。 

本发明中的培养基包括基础培养基，血清、生长因子和cAMP激活剂为补充成份。基础培养基可以是任何一种本领域常规的适用于细胞培养的稳定的培养基，满足细胞生长的最低需要。这样的基础培养基包括但不仅限于基础氨基酸/盐混合液如Ham′s F 12、RPMI或者DMEM。培养基中的其他添加物可包括葡萄糖、谷氨酰胺、维生素以及所属领域技术人员所熟知的一些添加剂。任何一种动物血清都可使用，包括但不仅限于胎牛、牛或人血清。 

所述基础培养基优选为下列之一：Ham′s F12培养基、RPMI培养基、 DMEM培养基。 

本发明的基础是发现FGF20可以刺激表皮黑素细胞生长和迁移。这种作用可以诱导移植的表皮黑素细胞生长，并向移植区域边缘迁移，这对减少病人移植区域边缘的低色素现象非常重要。 

此外，同时添加FGF20和bFGF的培养基可增强表皮黑素细胞的增殖，提示FGF20在与bFGF联合应用是对细胞具有额外的生长刺激作用。因此，培养基中添加FGF20可进一步刺激表皮黑素细胞在体外的生长，从而缩短病人等待移植的时间。进一步来说，表皮黑素细胞生长不佳的病人和体外扩增细胞数不能满足移植需要的，可通过添加FGF20以促进细胞生长，从而协助移植的实施。 

本发明中的培养基还含有一种或多种无毒性，可通过提高细胞内cAMP水平，促进表皮黑素细胞生长及黑素合成的物质。IBMX和间羟异丙肾上腺素在cAMP缺乏的培养基中可刺激表皮黑素细胞的生长和黑素合成。 

本发明提供的含有天然或者生理学成分的培养基为表皮黑素细胞的孵育提供了更符合生理状态的微环境。除了为移植提供细胞来源，发明中的培养体系还为各种生物学物质(如药品、中药和化妆品等)对表皮黑素细胞生长、黑素合成、迁移能力和其他功能影响的检测提供了体外模型。 

优选的，所述基质中添加有下列组分： 

(1)体积浓度10％～20％的血清； 

(2)1～100ng/mL的bFGF和/或10～300ng/mL的FGF20；优选为两者的混合，在含有bFGF的培养基中加入FGF20对体外培养的黑素细胞生长具有额外的刺激作用。 

(3)3～300μg/mL的IBMX和3～100μM的间羟异丙肾上腺素。 

更为优选的，所述基质中添加有下列组分： 

(1)体积浓度10％的血清； 

(2)25ng/mL的bFGF和30ng/mL的FGF20； 

(3)20μg/mL的IBMX和30μM的间羟异丙肾上腺素。 

由于间羟异丙肾上腺素不稳定，容易被氧化，因此基质中还添加有抗氧化物质，如1～10μg/mL的抗坏血酸钠来使间羟异丙肾上腺素保持稳定。 

所述培养基中还添加有细胞生长及存活所需的0.1～5mM谷氨酰胺和防止细菌污染的1～100μg/mL庆大霉素。 

优选的，所述培养基终浓度组成如下： 

溶剂为Ham′s F12培养基。 

本发明中的培养基与以往报道过的培养基不同，它含有一种新的生长和迁移刺激因子FGF20，一种新的可刺激细胞生长和分化的cAMP激动剂Metaproterenol。FGF20和Metaproterenol都是无毒性的生理性物质，在临床其他方面已有应用，但目前尚未用于黑素细胞培养。本发明的基础是分离和培养在本发明培养基中的表皮黑素细胞具有强的增殖、迁移和黑素合成能力。 

本领域所有技术人员均知添加剂或者替代品加入培养基中可以维持表皮黑素细胞的生长。可以通过一些不同的方法进行监测。比如，细胞生长可以通过用血球计数器或者流式细胞仪计数细胞数量来监测；细胞迁移可以通过细胞趋化分析，如使用Boyden小室进行监测；黑素产生可以应用分光光度计测量。 

采用本发明培养基培养的表皮黑素细胞可应用于需要皮肤色素形成的个体。培养的表皮黑素细胞可以直接移植至受体，形成具有正常颜色的新的皮肤组织。 

培养的表皮黑素细胞移植前，皮肤无色素或者色素减退区域的表皮需通过浅表的磨削术去除，直至到达表真皮结合部位。表皮去除可通过(1)机械方法，如用装有钻石磨轮的外科磨皮机以25000转/分钟的速度磨擦(Loentz et al.，1994，J Am Acad Dermatol 30：5917)；(2)用皮肤移植小刀或者激光去除，如用装备Sharplan 1030CO₂激光的SilktouchFlashscanner，功率4.5～7W，0.2秒一个脉冲(Chen et al.，2000，J.Dermatol27：434)；(3)应用YAG激光(Pai et al.，2002，J Eur Acad DermatolVenereol 16：604)；(4)应用液氮(Gauthier et al.，1992，J Am AcadDermatol.26：191)。 

用本发明培养的表皮黑素细胞还可用于基因工程，使它们能够产生一系列具有生物学功能的蛋白，包括但不仅限于生长因子、细胞因子、激素、细胞因子抑制剂、多肽生长和分化因子以及细胞外基质蛋白。本领域常用技术是构建包含目的蛋白编码核苷酸，并连接正确转录和翻译控制信号的表达载体。实施方式可见以下报道，Sambrook，et al.，1992，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，andAusebel et al.，1989，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates&Wiley Interscience，N.Y.。 

此外，培养的表皮黑素细胞在移植前、移植中或移植后，还可粘附在天然或人工合成的基质上。该基质生物相容性好，用于受体时不会产生不良或过敏反应。也可与刺激组织生长的生长因子合用。这些基质通过设计 可在长时间内持续释放生长因子。此类基质也可以是能自行降解的，可为机体吸收。 

为了促进表皮黑素细胞对基质的粘附，以及黑素细胞的存活，功能和/或迁移，基质外部可选择性的包被本领域技术人员熟知的可促进细胞粘附、生长、存活或迁移的因子。这些因子可包括细胞粘附分子、细胞外基质分子或生长因子。 

以足量表皮黑素细胞移植于受体，可达到预期治疗目的。具体地说，足量是指足以使皮肤色素和功能恢复正常的细胞数量，从而缓解因基因异常或者组织受损引起的病症。可通过肉眼观察，评估细胞覆盖和皮肤色素形成以判断移植受体的情况。达到本发明目的所需的细胞数量取决于皮肤受损程度和范围。判断细胞数量是否足够，是本领域技术人员应具有的能力。 

供移植用的培养的表皮黑素细胞可用各种分离剂(例如胰酶-EDTA)从培养瓶脱下.将细胞悬液离心后用不含血清的F12培养基重悬。然后移植至己除去表皮层的皮肤表面. 

也可将表皮黑素细胞置于其他生理性溶液中作移植.生理性溶液指(但不限于)磷酸盐缓冲液，Hanks溶液或各种细胞培养基(含或不含血清).此外，细胞也可先粘附于基质上再作移植. 

可在接受移植的区域加用生长因子或激素(移植前或移植后)，从而形成一个合适的微环境，可支持细胞生长和(或)细胞分化和(或)细胞迁移和(或)黑素形成。 

移植部位可用保护性的覆盖物覆盖，如硅树脂(Chen et al.，2000，J.Dermatol 27：434)，胶原敷料(Olson et al.，1995，Br.J.Dermatol 132：58791)，纱布或者凡士林纱布。纱布可用Tegaderm固定(3M，St.Paul，Minn.)(Chen et al.，2000，J.Dermatol 27：434；Olsson et al.，1995，Br J.Dermatol132：587)。病人在移植后需要平躺一段时间，使移植的细胞能粘附在移 植部位。 

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了专门用于病人表皮黑素细胞的体外培养的培养基，可用于培养增殖能力、迁移能力和黑素合成能力增强的表皮黑素细胞，以更好的应用于移植治疗色素减退或无色素性皮肤病患者。 

(四)附图说明

图1为bFGF(ng/ml)对表皮黑素细胞的影响。A为细胞生长，B为黑素含量。 

图2为FGF20(ng/ml)对表皮黑素细胞的影响。A为细胞生长，B为黑素含量。C为表皮黑素细胞的迁移。 

图3为单独含bFGF(25ng/ml)培养基和含bFGF、FGF20(100ng/ml)培养基培养黑素细胞的比较。 

图4为IBMX(μg/ml)对表皮黑素细胞的影响。A为细胞生长，B为黑素含量。 

图5为Metaproterenol(μM)对表皮黑素细胞的影响。A为细胞生长，B为黑素含量。 

图6为单独含IBMX(20μg/ml)培养基和含IBMX、Metaproterenol(30μM)培养基培养黑素细胞的比较。A为细胞生长，B为黑素含量。 

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此： 

实施例1： 

1.1材料和方法 

1.1.1培养基的配制 

谷胺酰胺加入Ham’s F12(GIBCO，Carlsbad，Calif.)至终浓度为2 mM；庆大霉素终浓度为50μg/ml；胎牛血清(FBS，GIBCO，Carlsbad，Calif.)加至终浓度10％(体积/体积)，得到含有FBS和庆大霉素的培养基A，4度保存，每两周新鲜配制一次。 

bFGF(PeproTech，Rocky Hill，N.J.)在F12培养基中溶解，浓度为2500ng/ml，分装后-70度保存。每周一次，将bFGF存储液加入培养基A中至终浓度25ng/ml。 

FGF20(PeproTech，Rocky Hill，N.J.)在F12培养基中溶解，浓度为3000ng/ml，分装后-70度保存。每周一次，将FGF20存储液加入培养基A中至终浓度30ng/ml。 

IBMX粉剂(Sigma，St.Louis，Mo.)用细胞培养用水溶解至浓度1000μg/ml，室温保存。每周一次，将IBMX存储液加入培养基A中至终浓度20μg/ml。 

间羟异丙肾上腺素(Sigma，St.Louis，Mo.)用PBS溶解至1mM，加入抗坏血酸钠(Sigma，St.Louis，Mo.)后-70度保存。间羟异丙肾上腺素和抗坏血酸(0.165mg/ml)每周一次加入培养基A中，间羟异丙肾上腺素终浓度为30μM，抗坏血酸钠终浓度为5μg/ml。 

因子缺失的培养基： 

(1)无生长因子培养基；(培养基A+20μg/ml IBMX) 

(2)无cAMP激动剂培养基；(培养基A+25ng/ml bFGF) 

将不同检测物质加入上述因子缺失培养基中，包括bFGF，FGF20，IBMX和间羟异丙肾上腺素。不含测试物质的因子缺失培养基为对照。 

实施例中涉及的培养基如下： 

(1)无生长因子培养基中添加bFGF至终浓度为1，3，10，30，100，300ng/ml(图1)；以无生长因子培养基为对照； 

(2)无生长因子培养基中添加FGF20至终浓度为1，3，10，30，100，300ng/ml(图2)；以无生长因子培养基为对照； 

(3)无生长因子培养基中添加终浓度25ng/ml的bFGF、30ng/ml的FGF20、或者25ng/ml的bFGF+30ng/ml的FGF20(图3)；以无生长因子培养基为对照； 

(4)无cAMP激动剂培养基中添加IBMX至终浓度为3，10，30，100，300ng/ml(图4)；以无cAMP激动剂培养基为对照； 

(5)无cAMP激动剂培养基中添加Metaproterenol至终浓度为1，3，10，30，100μM(图5)；以无cAMP激动剂培养基为对照； 

(6)无cAMP激动剂培养基中添加终浓度20ng/ml的IBMX、30μM的Metaproterenol、或者20ng/ml的IBMX+30μM的Metaproterenol(图6)；以无cAMP激动剂培养基为对照； 

1.1.2表皮黑素细胞的分离和培养 

含表皮的人类皮肤样本取自供者。样本在0.25％(w/v)胰酶(GIBCO，Carlsbad，Calif.)中37度孵育15分钟，0.2％(w/v)EDTA(Sigma，St.Louis，Mo.)继续孵育10分钟。用镊子小心的将皮片上的表皮细胞分离下来，形成表皮细胞悬液。表皮细胞离心后，种植在25cm²的培养瓶中。培养瓶放置在37度的CO₂培养箱中(95％空气，5％CO₂)。3天后，加入100μg/ml基因素(Sigma，St.Louis，Mo.)以去除角质形成细胞和成纤维细胞。每3天换液一次。黑素细胞一般在2周后基本融合。细胞融合后，用胰酶-EDTA溶液脱下，离心，稀释，传代培养。在移植时，黑素细胞用胰酶-EDTA溶液脱下，离心后用F12培养基重悬。 

1.1.3培养的表皮黑素细胞的细胞生长检测 

测试物质对表皮黑素细胞生长的影响通过细胞计数进行评估。表皮黑素细胞以2×10⁴/孔的密度接种于24孔板。24h后，用测试培养基替代原有培养基。每3天换液一次。6天后，用胰酶-EDTA脱下细胞，以含10％血清的培养基终止消化。细胞悬液离心后，用200μl F12培养基重悬沉淀，用Pasteur移液管转移20μl的细胞悬液至血球计数器，在光学显微镜下观 察。计数4个1mm³区域中的细胞。细胞数量用下面的公式1计算(Freshney，1987，Culture of Animal Cells.Wiley-Liss，Inc.，New York，2nd edition)。四次计数，取平均值。所有实验样本都三重复。公式1：c＝0.2×n×10⁴c＝细胞量(cells/ml)；n＝细胞计数； 

6.1.4培养的表皮黑素细胞的黑素含量检测 

黑素细胞用胰酶-EDTA脱下并用血球计数器进行计数。再将细胞悬液离心，沉淀用1N的NaOH溶液溶解。通过分光光度计在475nm处检测溶液的光密度值，对照用合成的黑色素(Sigma，St.Louis，Mo.)所做的标准曲线算出黑素含量。黑素含量用ng/孔或者pg/细胞表示(Hu et al.，1995，Invest.Ophthalmol Vis Sci 36：931)。 

6.1.5培养的表皮黑素细胞的迁移能力检测 

细胞迁移实验用黑素细胞在48孔Boyden小室中进行(Neuroprobe，Bethesda，Md.)。培养的表皮黑素细胞用0.05％胰酶-EDTA在37度处理2～3分钟，含用10％FBS的培养基终止消化。细胞离心后用培养基重悬。Boyden小室的下层是含或不含检测物质的培养基。由8μm孔径的微孔滤膜将小室隔为上下两层。将50μl表皮黑素细胞悬液(3×10⁴)加入小室的上层。小室放置在37度的CO₂培养箱中(95％空气，5％CO₂)。6h后，滤膜从小室中取出，用95％酒精固定5分钟，苏木素染色1分钟。穿过滤膜迁移并粘附在滤膜下层的细胞在10个高度放大视野(×600)下计数(Doerr et al.，1996，J Biol Chem 271：2443；Verdoorn et al.，1986，ArchOphtalmol 104：1216)。所有实验样本都三重复。 

1.1.6HX1培养基对细胞生长的短期作用 

在三个不同细胞株中进行HX1培养基对细胞生长的短期作用研究。每株黑素细胞在首次传代时用HX1培养基接种于培养瓶，每3天换液一次。6天后，用胰酶-EDTA脱下细胞，用含10％血清的培养基终止消化。 细胞数和黑素含量用上述方法检测。细胞的倍增时间(DOT)用公式2加以计算。 

公式2：D＝(t×log 2)/(log Nt-log No)D＝DOT.；Nt＝传代时细胞数；No＝接种的细胞数；t＝培养天数。 

黑素制造量(MPC)用公式3加以计算。 

公式3：MPC＝MCt P-MCo/1.3D(P-1)MPC＝每个黑素细胞每天的黑素制造量(pg/cell/24hr)；MCo＝接种时细胞黑素含量(ng/cell)；MCt＝传代时细胞黑素含量(ng/cell)；P＝细胞增长倍数；D＝细胞倍增时间(DOT，日)(Hu et al.，1995，Invest.Ophthalmol Vis Sci 36：931)。 

1.1.7HX1培养基对细胞生长的长期作用 

在三个不同细胞株中进行HX1培养基对细胞生长的长期作用研究。每株黑素细胞在首次传代时用HX1培养基接种于培养瓶，细胞连续培养，直至衰老。细胞的每一代的扩增数(E)用公式4加以计算。 

公式4：E＝NT/No。NT＝培养结束时细胞数；No＝开始培养时细胞数。 

累积细胞扩增数(CE)＝第一代E×第二代E×......最后一代E。 

细胞株在所用培养基中的累积倍增数(CPD)可以用公式5进行计算。 

公式5：CPD＝logCE/log2CE为累积细胞扩增数。 

(Hu et al.，1992，Invest Ophthalmol Vis Sci 33：2443；Hu，2008，Photochem Photobiol.84：645) 

1.2结果 

1.2.1bFGF对培养的表皮黑素细胞生长和黑素形成的作用 

细胞在无生长因子培养基中(对照)或含不同浓度bFGF(ng/ml)培养基中培养6天。作细胞计数和黑素量/孔检测，并与对照组比较。结果 以实验组和对照组的百分比表示(每组3重复，Mean±SD)。结果显示：表皮黑素细胞在无生长因子的培养基中生长缓慢。加入1～300ng/ml bFGF可剂量依赖性的刺激细胞生长(图1A)。在含有bFGF的培养基中培养的黑素细胞在数量上远多于对照组(P＜0.05，1～300ng/ml)。但是bFGF对黑素细胞的黑素含量没有明显影响(P＞0.05)(图1B)。 

1.2.2FGF20对培养的表皮黑素细胞生长和黑素形成的作用 

细胞在无生长因子培养基中(对照)或者含不同浓度FGF20(ng/ml)培养基中培养6天。作细胞计数和黑素量/孔检测，并与对照组比较。结果以实验组和对照组的百分比表示(每组3重复，Mean±SD)。结果显示：表皮黑素细胞在无生长因子的培养基中生长缓慢。加入1～300ng/mlFGF20可剂量依赖性的刺激细胞生长(图2A)。在含有FGF20的培养基中培养的黑素细胞在数量上远多于对照组(P＜0.05，3～300ng/ml)。但是FGF20对黑素细胞的黑素含量没有明显影响(P＞0.05)(图2B)。 

用含FGF20培养基培养的黑素细胞较对照组有更好的迁移能力。加入1～300ng/ml FGF20可剂量依赖性的刺激细胞迁移(图2C)。在含有FGF20的培养基中培养的黑素细胞迁移的细胞远多于对照组(P＜0.05，10～300ng/ml)。 

在同时含有bFGF和FGF20的培养基中，细胞的生长有进一步的增加，细胞在数量上显著多于仅含bFGF培养基培养的细胞(P＜0.05)(图3)。 

1.2.3IBMX对培养的表皮黑素细胞生长和黑素形成的作用 

细胞在无cAMP激动剂培养基中(对照)或者含不同浓度IBMX(1～300μg/ml)培养基中培养6天。细胞计数和黑素量/孔检测，并与对照组比较。结果以实验组和对照组的百分比表示(每组3重复，Mean±SD)。结果显示：表皮黑素细胞在无cAMP激动剂的培养基中生长缓慢，黑素含量较低。加入3～300μg/ml IBMX可剂量依赖性的刺激细胞生长(图 4A)。在含有IBMX的培养基中培养的黑素细胞在数量上远多于对照组(P＜0.05，10～300μg/ml)。IBMX同时刺激黑素的合成。用含IBMX培养基培养的黑素细胞，其黑素含量显著高于对照组(P＜0.05，3～300μg/ml)(图4B)。 

1.2.4间羟异丙肾上腺素对培养的表皮黑素细胞生长和黑素形成的作用 

细胞在无cAMP激动剂培养基中(对照)或者含不同浓度Metaproterenol(1-100μM)培养基中培养6天。细胞计数和黑素量/孔检测，并与对照组比较。结果以实验组和对照组的百分比表示(每组3重复，Mean±SD)。结果显示：表皮黑素细胞在无cAMP激动剂的培养基中生长缓慢，黑素含量较低。加入1～100μM间羟异丙肾上腺素可剂量依赖性的刺激细胞生长(图5A)。在含有间羟异丙肾上腺素的培养基中培养的黑素细胞在数量上显著多于对照组(P＜0.05，3～100μM)。间羟异丙肾上腺素同时刺激黑素的合成。用含间羟异丙肾上腺素培养基培养的黑素细胞黑素含量显著高于对照组(P＜0.05，1～100μM)(图5B)。 

在含有20μg/ml IBMX的培养基中，再加入30μM间羟异丙肾上腺素可进一步刺激细胞生长和黑素合成。在同时含有IBMX和间羟异丙肾上腺素的培养基中培养的细胞在数量上显著多于仅含IBMX培养基培养的细胞(P＜0.05)，在同时含有IBMX和间羟异丙肾上腺素的培养基中培养的细胞黑素含量也显著高于仅含IBMX培养基培养的细胞(P＜0.05)(图6)。 

1.2.5HX1培养基对表皮黑素细胞的短期作用 

3株黑素细胞用HX1培养基培养6天。HX1培养基中黑素细胞生长良好。经过6天培养，细胞数从开始培养到培养结束，增加5.68±0.35(mean±SD)倍，DOT＝2.38±0.09天(即一个细胞分裂成两个细胞需要 2.4天)。黑素含量在培养过程中基本保持不变，开始培养时为181±23pg/cell，培养结束时为180±27pg/cell。培养期间黑素制造量为49.5±5.8pg/cell/24h。 

1.2.6HX1培养基对表皮黑素细胞的长期作用 

3株黑素细胞用HX1培养基培养2月。黑素细胞在培养的49～53天内生长良好，然后才逐渐老化。在整个过程中，细胞总共扩增311，159±339,562倍(即一个细胞分裂成311，159个细胞)，DOT＝3.09±0.98天。细胞总体倍增次数为17.43±2.27(即细胞分裂17次)。老化前，黑素含量基本保持不变，为208±60pg/cell；黑素制造量为45.8±12pg/cell/24h。 

以上列举的仅是本发明的具体实施例，显然本发明不限于以上实施例，还可有许多改动。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有改动，均应认为是本发明的保护范围。 

Claims (6)

1.一种用于表皮黑素细胞体外培养的培养基，所述培养基以适用于表皮黑素细胞体外培养的基础培养基为基质，所述基质中添加有下列组分：

（1）体积浓度10%~20%的血清；

（2）1~100 ng/mL的bFGF和10~300 ng/mL的FGF20；

（3）3~300 μg/mL的异丁基甲基黄嘌呤和3~100 μM的间羟异丙肾上腺素。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于所述基础培养基为下列之一：Ham's F12培养基、RPMI培养基、DMEM培养基。

3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于所述基质中添加有下列组分：

（1）体积浓度10%的血清；

（2）25ng/mL的bFGF和30ng/mL的FGF20；

（3）20 μg/mL的异丁基甲基黄嘌呤和30 μM的间羟异丙肾上腺素。

4.如权利要求1~3之一所述的培养基，其特征在于所述基质中还添加有1~10 μg/mL的抗坏血酸钠。

5.如权利要求1~3之一所述的培养基，其特征在于所述用于表皮黑素细胞体外培养的培养基中还添加有0.1~5mM的谷氨酰胺和1~100 μg/mL的庆大霉素。

6.如权利要求1所述的培养基，其特征在于所述用于表皮黑素细胞体外培养的培养基终浓度组成如下：

溶剂为Ham's F12培养基。

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