CN111073845A - 一种表皮黑素细胞体外培养的培养基 - Google Patents

一种表皮黑素细胞体外培养的培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了细胞培养相关技术领域的一种表皮黑素细胞体外培养的培养基，包括基础培养基及以下浓度的组分：体积浓度5～30％的血清、3～10mg/L谷氨酰胺、5.5～6.5μg/L双丁酰环磷酸腺苷、0.1～25mg/L维生素E、0.1～12mg/L磷酸乙醇、5～45mg/L硝酸钙、0.2～1.3mg/L硫酸铁、0.2～0.8mg/L氯化锌、3～8μg/L硫酸铜、3～8μg/L亚硒酸钠、1～1000ng/mL的生长因子和促进剂；本发明配制得到的培养基中细胞量能够促进表皮黑素细胞数量的增值；表皮黑素细胞分泌黑色素有促进作用。

Description

一种表皮黑素细胞体外培养的培养基
技术领域
本发明涉及细胞培养相关技术领域，特别涉及一种表皮黑素细胞体外培养的培养基。
背景技术
黑色素细胞是皮肤里的一种特殊的细胞，它产生黑色素，传递给周围的角质形成细胞。黑色素停留在这些角质形成细胞的细胞核上起保护作用，防止染色体受到光线辐射受损。
在正常人体表皮中，一个黑色素细胞大约可以对40个角质形成细胞产生作用，称为表皮的黑色素形成单位。皮肤的颜色来自于角质形成细胞内存储的黑色素。一般来讲，存储黑色素多的人肤色更深，也更受到保护，远离阳光辐射。
医学研究发现，黑色素细胞损伤，会导致黑色素生成不足，并且，黑色素细胞损伤、脱失后，被损伤的黑色素细胞可再释放抗原，刺激机体产生更多的抗黑色素细胞抗体，使更多的黑色素细胞被破坏，因而形成恶性循环，导致大量的黑色素细胞失活，从而在皮肤表面形成形态各异，大小不一的斑点，最终形成白癜风。
目前，可通过细胞培养大量扩增自体表皮黑素细胞用于移植。这种方法需要从病人健康皮肤取得表皮黑素细胞，在体外将其培养在合适环境中，使之大量扩增，再在合适条件下将细胞移植至病人病变处皮肤，使之恢复正常颜色。但是，表皮细胞体外培养需要将细胞置于培养基中进行，因而一种行之有效的皮表皮黑素细胞体外培养的培养基研发，对现有技术，有着重要的作用。
发明内容
针对现有技术存在的需要一种行之有效的皮表皮黑素细胞体外培养的培养基的技术问题，本发明提供一种表皮黑素细胞体外培养的培养基。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种表皮黑素细胞体外培养的培养基，包括基础培养基及以下浓度的组分：体积浓度5～30％的血清、3～10mg/L谷氨酰胺、5.5～6.5μg/L双丁酰环磷酸腺苷、0.1～25mg/L维生素E、0.1～12mg/L磷酸乙醇、5～45mg/L硝酸钙、0.2～1.3mg/L硫酸铁、0.2～0.8mg/L氯化锌、3～8μg/L硫酸铜、3～8μg/L亚硒酸钠、1～1000ng/mL的生长因子和促进剂。
优选的，所述生长因子bFGF、HGF、FGF20、GM-CSF、转化生长因子-β中的一种或多种。
优选的，所述促进剂为1～1000ng/mLα-MSH、1～1000μg/mL的异甲基黄嘌呤、1～1000μM的间羟异丙肾上腺素或1～1000μM的L-肾上腺素之一。
优选的，所述基础培养基为Ham'sF12培养基、RPMI培养基或DMEM培养基之一。
进一步的，上述任一项所述的表皮黑素细胞体外培养的培养基，还包括1～100μg/mL青霉素和1～100μg/mL链霉素。
优选的，所述青霉素替换为庆大霉素。
进一步的，上述任一项所述的表皮黑素细胞体外培养的培养基，还包括1～10μg/mL的抗坏血酸钠。
本发明具有如下优点：
1.本发明配制得到的培养基中细胞量能够促进表皮黑素细胞数量的增值；
2.本发明配制的培养基对表皮黑素细胞分泌黑色素有促进作用。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例A1～10：表皮黑素细胞体外培养的培养基的配置
实施例A1：
以Ham'sF12培养基作为基础培养基，在该基础培养基中加入以下组分，并使这些组分的浓度为：体积浓度5％的血清、3mg/L谷氨酰胺、5.5μg/L双丁酰环磷酸腺苷、0.1mg/L维生素E、0.1mg/L磷酸乙醇、5mg/L硝酸钙、0.2mg/L硫酸铁、0.2mg/L氯化锌、3μg/L硫酸铜、3μg/L亚硒酸钠、1ng/mL的bFGF作为生长因子和1ng/mLα-MSH作为促进剂。
具体实施时，bFGF和α-MSH的浓度均可以在1～1000ng/mL之间任意配置。
实施例A2：
以RPMI培养基作为基础培养基，在该基础培养基中加入以下组分，并使这些组分的浓度为：体积浓度15％的血清、7mg/L谷氨酰胺、6μg/L双丁酰环磷酸腺苷、12mg/L维生素E、6mg/L磷酸乙醇、25mg/L硝酸钙、0.7mg/L硫酸铁、0.5mg/L氯化锌、6μg/L硫酸铜、6μg/L亚硒酸钠、500ng/mL的HGF作为生长因子和500μg/mL的异甲基黄嘌呤作为促进剂。
具体实施时，HGF的浓度可以在1～1000ng/mL之间任意配置；异甲基黄嘌呤的浓度可以在1～1000μg/mL之间任意配置。
实施例A3：
以DMEM培养基作为基础培养基，在该基础培养基中加入以下组分，并使这些组分的浓度为：体积浓度30％的血清、10mg/L谷氨酰胺、6.5μg/L双丁酰环磷酸腺苷、25mg/L维生素E、12mg/L磷酸乙醇、45mg/L硝酸钙、1.3mg/L硫酸铁、0.8mg/L氯化锌、8μg/L硫酸铜、8μg/L亚硒酸钠、1000ng/mL的FGF20作为生长因子和1000μM的间羟异丙肾上腺素作为促进剂。
具体实施时，FGF20的浓度可以在1～1000ng/mL之间任意配置；间羟异丙肾上腺素的浓度可以在1～1000μM之间任意配置。
实施例A4：
以Ham'sF12培养基作为基础培养基，在该基础培养基中加入以下组分，并使这些组分的浓度为：体积浓度5％的血清、3mg/L谷氨酰胺、5.5μg/L双丁酰环磷酸腺苷、0.1mg/L维生素E、0.1mg/L磷酸乙醇、5mg/L硝酸钙、0.2mg/L硫酸铁、0.2mg/L氯化锌、3μg/L硫酸铜、3μg/L亚硒酸钠、1ng/mL的GM-CSF作为生长因子和1μM的L-肾上腺素作为促进剂，1μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
实施例A5：
以RPMI培养基作为基础培养基，在该基础培养基中加入以下组分，并使这些组分的浓度为：体积浓度15％的血清、7mg/L谷氨酰胺、6μg/L双丁酰环磷酸腺苷、12mg/L维生素E、6mg/L磷酸乙醇、25mg/L硝酸钙、0.7mg/L硫酸铁、0.5mg/L氯化锌、6μg/L硫酸铜、6μg/L亚硒酸钠、500ng/mL的GM-CSF作为生长因子和500μM的L-肾上腺素作为促进剂，50μg/mL青霉素和50μg/mL链霉素。
实施例A6：
以DMEM培养基作为基础培养基，在该基础培养基中加入以下组分，并使这些组分的浓度为：体积浓度30％的血清、10mg/L谷氨酰胺、6.5μg/L双丁酰环磷酸腺苷、25mg/L维生素E、12mg/L磷酸乙醇、45mg/L硝酸钙、1.3mg/L硫酸铁、0.8mg/L氯化锌、8μg/L硫酸铜、8μg/L亚硒酸钠、1000ng/mL的GM-CSF作为生长因子和1000μM的L-肾上腺素作为促进剂，100μg/mL青霉素和1μg/mL链霉素。
实施例A7：
以Ham'sF12培养基作为基础培养基，在该基础培养基中加入以下组分，并使这些组分的浓度为：体积浓度5％的血清、3mg/L谷氨酰胺、5.5μg/L双丁酰环磷酸腺苷、0.1mg/L维生素E、0.1mg/L磷酸乙醇、5mg/L硝酸钙、0.2mg/L硫酸铁、0.2mg/L氯化锌、3μg/L硫酸铜、3μg/L亚硒酸钠、1ng/mL的转化生长因子-β作为生长因子和1μM的L-肾上腺素作为促进剂，1μg/mL庆大霉素和100μg/mL链霉素。
实施例A8：
以Ham'sF12培养基作为基础培养基，在该基础培养基中加入以下组分，并使这些组分的浓度为：体积浓度5％的血清、3mg/L谷氨酰胺、5.5μg/L双丁酰环磷酸腺苷、0.1mg/L维生素E、0.1mg/L磷酸乙醇、5mg/L硝酸钙、0.2mg/L硫酸铁、0.2mg/L氯化锌、3μg/L硫酸铜、3μg/L亚硒酸钠、1ng/mL的bFGF作为生长因子和1ng/mLα-MSH作为促进剂，1μg/mL的抗坏血酸钠。
实施例A9：
以RPMI培养基作为基础培养基，在该基础培养基中加入以下组分，并使这些组分的浓度为：体积浓度15％的血清、7mg/L谷氨酰胺、6μg/L双丁酰环磷酸腺苷、12mg/L维生素E、6mg/L磷酸乙醇、25mg/L硝酸钙、0.7mg/L硫酸铁、0.5mg/L氯化锌、6μg/L硫酸铜、6μg/L亚硒酸钠、500ng/mL的HGF作为生长因子和500μg/mL的异甲基黄嘌呤作为促进剂，5μg/mL的抗坏血酸钠。
实施例A10：
以DMEM培养基作为基础培养基，在该基础培养基中加入以下组分，并使这些组分的浓度为：体积浓度30％的血清、10mg/L谷氨酰胺、6.5μg/L双丁酰环磷酸腺苷、25mg/L维生素E、12mg/L磷酸乙醇、45mg/L硝酸钙、1.3mg/L硫酸铁、0.8mg/L氯化锌、8μg/L硫酸铜、8μg/L亚硒酸钠、1000ng/mL的FGF20作为生长因子和1000μM的间羟异丙肾上腺素作为促进剂，10μg/mL的抗坏血酸钠。
实施例a1、a2：对照实验用的培养基
实施例a1
以DMEM培养基作为基础培养基，在该基础培养基中加入以下组分，并使这些组分的浓度为：体积浓度30％的血清、10mg/L谷氨酰胺、6.5μg/L双丁酰环磷酸腺苷、25mg/L维生素E、12mg/L磷酸乙醇、45mg/L硝酸钙、1.3mg/L硫酸铁、0.8mg/L氯化锌、8μg/L硫酸铜、8μg/L亚硒酸钠、1000μM的间羟异丙肾上腺素作为促进剂，10μg/mL的抗坏血酸钠。
即在实施例A10的配方配置无生长因子培养基的基础上，该培养基中，除了没有添加生长因子以外，其他组分和浓度均与实施例A10中的相同。
实施例a2
以DMEM培养基作为基础培养基，在该基础培养基中加入以下组分，并使这些组分的浓度为：体积浓度30％的血清、10mg/L谷氨酰胺、6.5μg/L双丁酰环磷酸腺苷、25mg/L维生素E、12mg/L磷酸乙醇、45mg/L硝酸钙、1.3mg/L硫酸铁、0.8mg/L氯化锌、8μg/L硫酸铜、8μg/L亚硒酸钠、1000ng/mL的FGF20作为生长因子和10μg/mL的抗坏血酸钠。
即在实施例A10的配方配置无促进剂培养基的基础上，该培养基中，除了没有添加促进剂以外，其他组分和浓度均与实施例A10中的相同。
实施例B：表皮黑素细胞体外培养的效果试验
1、表皮黑素细胞的分离和培养
将白癜风患者含有表皮黑素细胞的未病变皮肤样本在0.3％体积浓度的胰酶中37℃条件下消化30min，然后在0.2％体积浓度的EDTA处理15min，形成含有表皮黑素细胞的悬液；将含有表皮黑素细胞的悬液离心后得到表皮黑素细胞；然后将表皮黑素细胞种植在装有F12培养基的T-25培养瓶中并将培养瓶放置在37℃的5％CO2培养箱中培养3天；然后用基因素去除角质形成细胞和成纤维细胞，以后隔天用F12培养基半量换液一次，待培养基本融合后，用胰酶-EDTA溶液脱下，离心，稀释，传代培养。
2、表皮黑素细胞培养生长检测
将表皮黑素细胞以2×104/孔的密度接种于24孔板。24h后，分别用A1～10或者a1或a2任一实施例配置的表皮黑素细胞体外培养的培养基替代原有培养基，并隔天用同样的培养基半量换液一次，6天后，用胰酶-EDTA脱下细胞，以含10％血清的培养基终止消化。
细胞悬液离心后，用200μl F12培养基重悬沉淀，用Pasteur移液管转移20μL的细胞悬液至血球计数器，在光学显微镜下观察。计数4个1mm3区域中的细胞；细胞数量计算公式为：细胞量(cells/mL)＝0.2×n×104c；其中，n＝细胞计数；四次计数，取平均值；所有实验样本都重复3次。
不同培养基中表皮黑素细胞量检测结果，如表下表所示：
Figure BDA0002320449530000041
Figure BDA0002320449530000051
由上表可知，在培养6天后，本发明配制得到的培养基中细胞量均高于对比例培养基中表皮黑素细胞量，并且各实施例中的组分随浓度增高，表皮黑素细胞的数量也明显增高。
3、培养的表皮黑素细胞的黑色素含量检测
将表皮黑素细胞以2×104/孔的密度接种于24孔板进行培养，24h后，转入用A1～10或者a1或a2任一实施例配置的表皮黑素细胞体外培养的培养基，并隔天用同样的培养基半量换液一次，6天后将表皮黑素细胞用胰酶-EDTA脱下并用血球计数器进行计数。再将细胞悬液离心，沉淀用1N的NaOH溶液溶解。通过分光光度计在475nm处检测溶液的光密度值，对照用合成的黑素(Sigma，St.Louis，Mo.)所做的标准曲线算出黑素含量。实验结果如下表所示：
所用培养基 黑素含量(pg/孔)
实施例A1 21
实施例A2 25
实施例A3 31
实施例A4 23
实施例A5 28
实施例A6 32
实施例A7 22
实施例A8 24
实施例A9 29
实施例A10 35
实施例a1 11
实施例a2 12
由上表可知，采用本发明配制得到的培养基中表皮黑素细胞分泌黑色素的量均高于对比实施例，并且各实施例中的组分随浓度增高，黑色素含量也明显增高；可见，本发明配制的培养基对表皮黑素细胞分泌黑色素有促进作用。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，在没有做出创造性劳动前提下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种表皮黑素细胞体外培养的培养基，其特征在于：包括基础培养基及以下浓度的组分：体积浓度5～30％的血清、3～10mg/L谷氨酰胺、5.5～6.5μg/L双丁酰环磷酸腺苷、0.1～25mg/L维生素E、0.1～12mg/L磷酸乙醇、5～45mg/L硝酸钙、0.2～1.3mg/L硫酸铁、0.2～0.8mg/L氯化锌、3～8μg/L硫酸铜、3～8μg/L亚硒酸钠、1～1000ng/mL的生长因子和促进剂。
2.根据权利要求1所述的表皮黑素细胞体外培养的培养基，其特征在于：所述生长因子bFGF、HGF、FGF20、GM-CSF、转化生长因子-β中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的表皮黑素细胞体外培养的培养基，其特征在于：所述促进剂为1～1000ng/mLα-MSH、1～1000μg/mL的异甲基黄嘌呤、1～1000μM的间羟异丙肾上腺素或1～1000μM的L-肾上腺素之一。
4.根据权利要求1所述的表皮黑素细胞体外培养的培养基，其特征在于：所述基础培养基为Ham'sF12培养基、RPMI培养基或DMEM培养基之一。
5.根据权利要求1～4任一项所述的表皮黑素细胞体外培养的培养基，其特征在于：还包括1～100μg/mL青霉素和1～100μg/mL链霉素。
6.根据权利要求5所述的表皮黑素细胞体外培养的培养基，其特征在于：所述青霉素替换为庆大霉素。
7.根据权利要求1～4任一项所述的表皮黑素细胞体外培养的培养基，其特征在于：还包括1～10μg/mL的抗坏血酸钠。
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