JP2022007610A - 多能性幹細胞由来フィーダー細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
以下、本発明の一実施形態について、詳細に説明する。本発明の実施形態1は、多能性幹細胞由来フィーダー細胞に関する。
本発明の実施形態2は、上記の本発明の実施形態1の多能性幹細胞由来フィーダー細胞をフィーダー細胞として使用して目的の細胞を培養する工程を含む、細胞の培養方法に関する。説明の便宜上、実施形態1にて上記した事項と重複する事項については、その説明を省略する。
以下に本発明の実施形態をまとめる。
1-1.hESからの胚様体の形成
hES細胞であるSEES2を、ROCK阻害剤(Y-27632;10μM)に曝露した後、0.5mMEDTAを用いて単一細胞に解離させ、96ウェルプレートに1ウェルあたり5×103細胞の濃度で播種した。
1-1で形成された胚様体を、NMP collagen PS(Nippon Meat Packers Inc.)でコートしたT25フラスコに移し、XF32培地(85%KnockOut DMEM、15%35kGy照射XF-KSR、2mM GlutaMAX-I、0.1mM NEAA、Pen-Strep、50μg/ml L-アスコルビン酸2-ホスフェート、10ng/mlヘレグリン-1β(recombinant human NRG-beta 1/HRG-beta 1 EGF domain; Wako, Japan)、200ng/ml組換えヒトIGF-1(LONGR3-IGF-1; Sigma-Aldrich)、および20ng/mlヒトbFGF(Kaken Pharmaceutical Co. Ltd.))中で60~70日培養して、hES細胞由来細胞を得た。この細胞は間葉系細胞様の性質を有していることから、以後、hES細胞由来間葉系細胞と称する。hES細胞由来間葉系細胞の作製方法を図1に示す。
2-1.方法
良性婦人疾患を罹患した患者から摘出された子宮から子宮内膜検体を採取し、酵素処理に供して細胞を解離させた。次いで、解離した細胞をサイズによって間質細胞(40μm未満)と子宮内膜上皮細胞(40μm以上)とに分け、そのうち子宮内膜上皮細胞を以下の実験に使用した。
フィーダー細胞なしで培養した場合には、子宮内膜上皮細胞の生着はごく一部であり、継代培養は困難であった(図2)。
3-1.方法
(i)hES細胞からの軟骨細胞および間葉系細胞の同時発生
10cmディッシュに、30μlのiMatrix-511 silk(MATRIXOME)および9mlのPBSを添加し、1時間インキュベーター中でコートした。1時間後、アスピレーターで溶液を除去し、ディッシュを10mlのPBSで2回洗浄した。コート済みの10cmディッシュに9mlのStemFit(登録商標)AK02N培地(味の素株式会社)を入れた。
T25フラスコ(TPP)に3mlのコラーゲン塩酸混合液(コラーゲン:HCl=1:9または1:19)を入れ、インキュベーター中で1時間静置した。次いで、混合液を除去し、T25フラスコを10mlのPBSで2回洗浄し、そこに5mlの軟骨誘導培地を添加した。
(ii)で形成された細胞シートをHE染色した(図7、左)。図7中、間葉系細胞層(下の矢印で示す)に重なって、軟骨細胞(上の矢印で示す)が形成されていることが示された。
4-1.方法
多指症患者由来の表皮から樹立された細胞株であるYub2459keratinoを、表皮誘導培地(Defined keratinocyte SFM+ROCK阻害剤(Y-27632;10μM))中、37℃、5%CO2下で継代培養した。10cmディッシュに0.1%ゼラチンを入れ、15分以上静置して、コーティングした。次いで、フィーダー細胞としての照射(30Gy)hES細胞由来間葉系細胞を、表皮誘導培地中、ディッシュ当たり1×106細胞で播種した。翌日、表皮細胞をディッシュ当たり0.5×106細胞で播種した。
表皮細胞をPassage 5からPassage 22まで157日間培養した。hES細胞由来間葉系細胞またはMEFをフィーダー細胞として使用して培養した場合は、表皮細胞は増殖能を維持することができた。一方、フィーダー細胞なしの場合は、継代を重ねると徐々に細胞増殖能が低下し、細胞はほとんど増殖しなくなった(図8)。
5-1.方法
初代肝細胞であるHep2007(Passage 15)を、改変F培地中、37℃、5%CO2下で継代培養した。6cmディッシュに0.1%ゼラチンを入れ、15分以上静置して、コーティングした。次いで、フィーダー細胞としての照射(30Gy)hES細胞由来間葉系細胞を、改変F培地中、ディッシュ当たり0.5×106細胞で播種した。翌日、肝細胞Hep2007をディッシュ当たり1.0~2.0×106細胞で播種した。
結果を図11に示す。図11の2枚の写真は、いずれもhES細胞由来間葉系細胞をフィーダー細胞として使用した場合の肝細胞を示す。hES細胞由来間葉系細胞をフィーダー細胞として使用した場合、4回の継代培養を行うことができ、他の2条件(MEF、フィーダー細胞なし)よりも増殖能を維持できることが明らかになった。
6-1.hiPS細胞のhES細胞由来間葉系細胞またはMEFとの共培養
照射(30Gy)hES細胞由来間質細胞を10cmディッシュに1ディッシュ当たり2.0×106細胞で播種し、翌日に月経血由来のhiPS細胞であるEdom22iPS #s31を、10cmディッシュに1ディッシュ当たり8×104細胞で播種した。使用した培地はXF32培地であった(Nishiwaki, M. et al., bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/729525)。
MEFまたはhES細胞由来間葉系細胞上で培養したhiPS細胞における未分化マーカーであるNANOGおよびOCT3/4、ならびに自己複製能を評価するためのマーカーであるTERTの遺伝子発現量をqRT-PCR法を用いて比較した。NANOG増幅用のフォワードおよびリバースプライマー、OCT3/4増幅用のフォワードおよびリバースプライマー、ならびにおよびTERT増幅用のフォワードおよびリバースプライマーのヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号1~6に示す。
hiPS細胞がhES細胞由来間葉系細胞上で多分化能を維持するかどうかを免疫組織化学染色で検討した。詳細には、多能性細胞の特異的マーカーであるNANOG、OCT3/4、SSEA4、TRA1-60、およびSOX2の発現をMEFとの共培養の場合と比較した。MEFまたはhES細胞由来間葉系細胞の存在下での培養の結果をそれぞれ図14および図15に示す。図14および図15において、左から右に、NANOG、OCT3/4、SSEA4、TRA1-60、およびSOX2についての結果を示す。使用した抗体は以下のとおりである:NANOG:Repro CELL #RCAB0003P;OCT3/4:Santa Cruz #sc-5279;SSEA4:MILLIPORE #MAB4304;TRA1-60:MILLIPORE #MAB4360;SOX2:MILLIPORE #AB5603。
iPS細胞(cell#O)から分化キット(cellartis、タカラバイオ)を用いて分化誘導されたiPS細胞由来肝細胞(cellartis-Hep#O)を、分化誘導を終えてコンフルエントになった時点で、細胞シートとして継代培養に供した。継代培養において、培地として改変F培地を使用し、フィーダー細胞として、MEFまたはヒトES細胞由来間葉系細胞を、1ウェル当たり1×105細胞の濃度で播種して使用した。
Claims (11)
- 多能性幹細胞由来フィーダー細胞。
- 前記多能性幹細胞が霊長類に由来する、請求項1に記載の多能性幹細胞由来フィーダー細胞。
- 前記多能性幹細胞がヒトに由来する、請求項2に記載の多能性幹細胞由来フィーダー細胞。
- 多能性幹細胞から形成された胚様体を培養することによって得られる、請求項1~3のいずれか1項に記載の多能性幹細胞由来フィーダー細胞。
- 間葉系細胞である、請求項1~4のいずれか1項に記載の多能性幹細胞由来フィーダー細胞。
- CD24、CD320、CD63、CD70、CD99L2、HMMR、ICAM1、IGF2R、ITGA3、MCAM、PDGFRA、PDGFRB、CD29、CD44、CD54、CD59、CD73、CD90、CD105およびHLA-ABCからなる群より選択される少なくとも1つが陽性であるか、または、HLA-DRが陰性である、請求項1~5のいずれか1項に記載の多能性幹細胞由来フィーダー細胞。
- Wnt/βカテニンシグナル伝達系遺伝子の発現が増強されている、請求項1~6のいずれか1項に記載の多能性幹細胞由来フィーダー細胞。
- 不死化されている、請求項1~7のいずれか1項に記載の多能性幹細胞由来フィーダー細胞。
- 子宮内膜上皮細胞、軟骨細胞、表皮細胞、肝細胞、多能性幹細胞および多能性幹細胞由来の分化細胞からなる群より選択される細胞の培養に際してフィーダー細胞として使用するための、請求項1~8のいずれか1項に記載の多能性幹細胞由来フィーダー細胞。
- 請求項1~9のいずれか1項に記載の多能性幹細胞由来フィーダー細胞をフィーダー細胞として使用して目的の細胞を培養する工程を含む、細胞の培養方法。
- 前記目的の細胞が、子宮内膜上皮細胞、軟骨細胞、表皮細胞、肝細胞、多能性幹細胞および多能性幹細胞由来の分化細胞からなる群より選択される、請求項10に記載の細胞の培養方法。
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WO2024053684A1 (ja) * | 2022-09-06 | 2024-03-14 | 大日本印刷株式会社 | フィーダー細胞、細胞シートおよびそれらの製造方法、ならびにフィーダー細胞を用いた細胞の維持または増殖方法 |
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