CN113166722A - 羊水细胞来源的细胞外基质及其用途 - Google Patents
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Abstract
公开了一种在体外衍生于从羊水分离的细胞的细胞来源的细胞外基质(ECM)，及其使用方法以用于包括干细胞在内的粘附细胞的分离、维持和增殖，以及用于干细胞的分化。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年10月3日提交的美国临时专利申请号62/740,817的权益，其通过引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明一般性地涉及细胞来源的细胞外基质及其用途，包括哺乳动物细胞的分离、维持和增殖以及干细胞的分化。
背景技术
体外细胞培养可能是所有细胞生物学以及再生医学和组织工程学发展领域中最普遍、最重要和最缺乏了解的方面。首先，它允许观察细胞行为，以便可以详细研究细胞功能的各个方面。其次，它允许增加特定细胞组群的数量。对于基础研究以及许多临床应用而言，需要从小的生物样品中获得大量相对稀有的细胞。体外细胞培养可使少量的细胞在体外扩增，以获得相对较多的数量。最后，它允许储存细胞以备后用。通过体外扩大细胞数量，并冷冻活细胞以备后用，相对较小的生物样品可以在数天、数月甚至数年的时间内产生用于多次实验的细胞。
尽管细胞培养普遍存在，但体外培养对细胞天然特性的影响仍知之甚少。我们当前的许多实践并非来自经过深思熟虑的想法、计划和实验，而是来自偶然的观察。哺乳动物细胞培养始于1900年代初，1911年，Alexis Carrel和Montrose Burrows首次发表了有关体外培养哺乳动物组织的学术论文。当时他们正在通过切割哺乳动物组织的切片并将它们放在显微镜载玻片上来研究组织的生理学和解剖学。然后，他们注意到一些细胞从组织中迁移出来到了载玻片上。他们继续描述了永久性地培养细胞的技术。现在看来，他们的某些观察可能无效，但他们的工作为现代细胞培养铺平了道路。
发现造血干细胞(HSC)之后，世界各地的研究小组都在研究(HSC)。在培养过程中(悬浮状态)，观察到骨髓细胞亚群粘附在塑料瓶的底部并开始增殖。这些细胞后来被认为与HSC不同，最终被称为间充质干细胞(MSC)。由于这种偶然的观察导致了MSC的发现，塑料粘附仍然被广泛用作MSC和许多其他哺乳动物细胞类型的最典型的属性。
在塑料基底上培养细胞的做法是有问题的，因为有大量的、现已在文献中被广泛接受的证据证明了微环境在调节细胞功能中的关键作用。已经证明微环境有助于指导干细胞和祖细胞的分化，并调节成熟细胞类型的行为。
当将细胞从其天然环境中移出并进行体外扩增时，它们会失去来自其周围的细胞外基质或微环境的重要的线索，这些线索会将有关其周围环境的组成和状态的重要信息传递给细胞。细胞微环境的变化对这些细胞的行为产生了深远的影响。目前体外分离和扩增大多数粘附细胞的标准是将细胞放置在由聚苯乙烯(塑料)组成的培养容器中。可以以某种方式处理聚苯乙烯以促进细胞附着和生长，但是在大多数情况下，表面对于细胞而言完全是外来的。在其他情况下，表面可以涂有单独的基质蛋白(例如纤连蛋白或胶原蛋白)或蛋白的某种组合。这些简单的基底忽略了天然微环境的复杂性以及微环境在正常细胞功能中的关键作用。细胞会立即以与所述细胞在其天然环境中时大不相同的方式响应于该外来环境。
目前采用了五种主要方法来解决在塑料基底上培养细胞的这一问题：
1.忽略所述问题–代替试图实现与体内期望的功能相匹配的需要的功能，可以在多种培养基中测试多种细胞类型，以找到在没有合适的基质基底的情况下表现出特定所需功能的细胞。这种方法并不复杂，而且由于变量之间的复杂相互作用以及细胞与细胞外基质之间相互作用的广度，通常无法产生预期的结果。
2.确定关键组件。–许多学术实验室和几家公司已经采取了考虑从中分离出细胞的组织并寻找该组织中可能对细胞功能重要的独特成分的方法。然后将细胞在仅由一种或几种基质成分所组成的简单基底上培养。这种方法通常会失败，因为基质是天然非常复杂的环境，在某些情况下包括一百多种不同的蛋白质。细胞对它们需要但接收不到的信号的反应和对它们不需要但能够接收到的信号的反应一样强烈。
3.鸟枪法(shotgun approach)-如MATRIGELTM的蛋白质凝胶的使用采用了一种鸟枪法。产生了一种包含许多不同基质蛋白的凝胶，希望它会包含许多不同细胞类型的必要结合基序。这种方法可能无法提供将细胞推向特定方向的线索，或者无法提供细胞期望的所有线索。
4.组织来源的基质-这是一种生物模拟方法，其通常涉及从遗传相似的动物中分离目的组织，物理破坏或化学消化该组织以获得溶液或均匀的悬浮液，然后用解构的组织涂覆培养容器。例如，希望培养卫星细胞的人可能会收集肌肉，使组织均质化，然后在接种细胞之前在均质化的肌肉中涂覆培养容器。这种方法通常由于一些关键原因而失败。首先，即使在特定的组织类型内，干细胞/祖细胞的生态位也可能与组织的其余部分不同。仅仅使肌肉均质化并不能保证正在创建适当的生态位。其次，除了生化线索外，生态位还包括结构线索和物理线索。即使组织匀浆中存在许多/大多数生化线索，其结构已被破坏，并且细胞可能会感知到非常不同的机械线索。最后，组织来源的基质的可制造性取决于组织的可用性。这影响了可能的细胞培养总量，并导致批次间的差异。
5.细胞来源的基质–培养中的细胞可被诱导在其培养容器中分泌基质。该基质是体内生态位的最佳近似，并且可以在体外制造。可以在体外诱导细胞形成基质，然后可以随后从基质中除去细胞，例如通过使用非离子型去污剂来保留基质的结构和化学性质。此方法具有几个关键优势。(1)基质结构可以重新创建并且不受干扰。(2)基质可以根据感兴趣的组织/细胞类型定制。(3)基质可能对干细胞和祖细胞生态位是特异性的。(4)基质可以大量生产。
对于细胞来源的基质，并非所有细胞类型都可以在任何给定的细胞来源的基质上高效分离和扩增。实际上，与其他类型的细胞相比，多能干细胞(pluripotent stem cell，PSC)对支持性生长基底的要求似乎有很大不同。众所周知，用于产生基质的特定细胞类型会影响基质的组成，因此会影响多种细胞类型对该基质的反应(参见Marinkovic,M.等人,One size does not fit all:developing a cell-specific niche for in vitro studyof cell behavior.Matrix Biol.54–55,426–441(2016))。在US 8,084,023中公开的先前工作已经描述了由骨髓基质或间充质干细胞产生的细胞外基质的产生和组成(还参见Chen,X.等人,Extracellular Matrix Made by Bone Marrow Cells FacilitatesExpansion of Marrow-Derived Mesenchymal Progenitor Cells and Prevents TheirDifferentiation into Osteoblasts.Journal of Bone and Mineral Research 22,1943–1956(2007)和Lai,Y.等人,Reconstitution of marrow-derived extracellularmatrix ex vivo:a robust culture system for expanding large-scale highlyfunctional human mesenchymal stem cells.Stem cells and development 19,1095–107(2010))。该骨髓细胞来源的基质已被证明支持其他MSC的扩增，但对其他类型的干细胞(尤其是诱导多能干细胞(iPSC))的附着和生长无效。与MSC相比，iPSC表现出形成更广泛类别的细胞和组织的更大的潜力。这代表了一个特别有趣的挑战，因为在标准培养条件下生长汇合的单层iPSC的困难使从iPSC产生细胞来源的基质变得不切实际。先前的细胞来源基质的主要局限性在于，为了制备组织特异性基质(例如，来自骨髓MSC的骨髓基质，来自脂肪MSC的脂肪基质或来自hUVEC的内皮基质)，需要使靶细胞群已经能够粘附至起始基底。使用iPSC、胚胎干细胞(ES)和许多其他细胞类型的困难在于它们不容易粘附于简单的基底。
发明内容
本发明提供了一种本领域中涉及细胞来源的细胞外基质(ECM)的至少一些上述局限性和不足的解决方案，以支持多能干细胞(PSC)的分离、扩增和增殖，所述多能干细胞包括但不限于诱导多能干细胞(iPSC)和胚胎干细胞(ES)。所述解决方案的前提是使用羊水细胞来源的细胞外基质。使用羊水中存在的未定型的、易粘附的且高度增殖性的围产期细胞，可以创建令人惊讶地支持这些PSC粘附、分离、扩增和增殖的细胞外基质(ECM)。该技术成就利用现有技术的细胞来源的ECM是不可能实现的。另外，本发明的羊水细胞来源的细胞外基质(AFC-ECM)对于粘附细胞类型的分离、扩增和增殖是有效的，所述粘附细胞类型包括但不限于其他干细胞，如间充质干细胞、体细胞、祖细胞、成熟细胞以及来自多个胚层的细胞。令人惊讶地，相对于骨髓细胞来源的ECM，本发明的AFC-ECM支持由骨髓产生的MSC的增殖增加。此外，本发明的AFC-ECM可以支持干细胞向分化的细胞类型的分化。
在本发明的一个方面，公开了一种细胞来源的细胞外基质(ECM)，其在体外衍生于从羊水分离的细胞。在一些实施方案中，所述ECM包含层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白(agrin)、波形蛋白(vimentin)和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。在一些实施方案中，所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2。在一些实施方案中，所述聚集蛋白的同工型是同工型6。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM不包含核心蛋白聚糖(decorin)、串珠蛋白聚糖(perlecan)和胶原(III)中的任意一种或全部。在一些实施方案中，所述从羊水分离的细胞包括干细胞。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM是脱细胞的。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM包括表2(参见实施例2)中列出的组分的任意一种、任意组合或全部，和/或表2中列出的其任何变体、衍生物或同工型，优选地，表2中列出的组分的全部和/或其任何衍生物或同工型。
在本发明的另一方面，公开了在培养中增殖粘附细胞的方法，所述方法包括在培养基中在细胞来源的细胞外基质(ECM)存在下培养粘附细胞，从而增殖所述粘附细胞，其中所述细胞来源的ECM在体外衍生于从羊水分离的细胞。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM包含层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白、波形蛋白和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。在一些实施方案中，所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2。在一些实施方案中，所述聚集蛋白的同工型是同工型6。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM不包含核心蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖或胶原(III)。在一些实施方案中，所述从羊水分离的细胞包括干细胞。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM是脱细胞的。在一些实施方案中，所述粘附细胞包括哺乳动物粘附细胞。在多种实施方案中，所述粘附细胞包括干细胞、体细胞、祖细胞、成熟细胞或来自多个胚层的细胞。在一些实施方案中，所述粘附细胞包括干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞维持在未分化状态。在一些实施方案中，所述干细胞包括多能干细胞(PSC)。在一些实施方案中，所述PSC包括诱导型PSC(iPSC)和/或胚胎干细胞(ES)。在一些实施方案中，所述干细胞包括间充质干细胞(MSC)。在一些实施方案中，所述MSC获自骨髓。在一些实施方案中，所述粘附细胞包括祖细胞。在一些实施方案中，所述祖细胞包括内皮祖细胞。在一些实施方案中，所述粘附细胞包括成熟细胞。在一些实施方案中，所述成熟细胞包括软骨细胞。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM包括表2中列出的组分的任意一种、任意组合或全部，和/或表2中列出的其任何变体、衍生物或同工型，优选地，表2中列出的组分的全部和/或其任何衍生物或同工型。
在本发明的另一方面，公开了一种诱导干细胞分化为分化的细胞类型的方法，所述方法包括在分化培养基中在细胞来源的细胞外基质(ECM)存在下培养干细胞，其中所述细胞来源的ECM在体外衍生于从羊水分离的细胞。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM包含层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白、波形蛋白和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。在一些实施方案中，所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2。在一些实施方案中，所述聚集蛋白的同工型是同工型6。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM不包含核心蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖或胶原(III)。在一些实施方案中，所述从羊水分离的细胞包括干细胞。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM是脱细胞的。在一些实施方案中，所述干细胞包括多能干细胞(PSC)。在一些实施方案中，所述PSC包括诱导型PSC(iPSC)。在一些实施方案中，所述PSC包括胚胎干细胞(ES)。在一些实施方案中，所述干细胞包括间充质干细胞(MSC)。在一些实施方案中，所述MSC获自骨髓。在一些实施方案中，所述分化的细胞类型包括脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞或肌细胞。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM包括表2中列出的组分的任意一种、任意组合或全部，和/或表2中列出的其任何变体、衍生物或同工型，优选地，表2中列出的组分的全部和/或其任何衍生物或同工型。
在本发明的另一方面，公开了一种体外产生细胞来源的细胞外基质(ECM)的方法，所述方法包括：
(a)从羊水中分离细胞，
(b)将分离的细胞接种到细胞培养容器上或涂有基底的细胞培养容器上，
(c)向细胞培养容器中添加培养基，以及
(d)培养所述细胞，从而产生细胞来源的ECM，以及
(e)任选地，使所述细胞来源的ECM脱细胞。
在一些实施方案中，从羊水分离的细胞包括干细胞。在一些实施方案中，所述基底是纤连蛋白。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM包含层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白、波形蛋白和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。在一些实施方案中，所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2。在一些实施方案中，所述聚集蛋白的同工型是同工型6。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM不包含核心蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖或胶原(III)。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM包括表2中列出的组分的任意一种、任意组合或全部，和/或表2中列出的其任何变体、衍生物或同工型。
在本发明的另一方面，公开了一种通过如下所述方法体外产生的羊水细胞来源的细胞外基质(AFC-ECM)，所述方法包括：
(a)从羊水中分离细胞，
(b)将分离的细胞接种到细胞培养容器上或涂有基底的细胞培养容器上，
(c)向细胞培养容器中添加培养基，以及
(d)培养所述细胞，从而产生AFC-ECM，以及
(e)任选地，使所述AFC-ECM脱细胞。
在一些实施方案中，从羊水分离的细胞包括干细胞。在一些实施方案中，所述基底是纤连蛋白。在一些实施方案中，所述AFC-ECM包含层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白、波形蛋白和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。在一些实施方案中，所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2。在一些实施方案中，所述聚集蛋白的同工型是同工型6。在一些实施方案中，所述AFC-ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型。在一些实施方案中，所述AFC-ECM不包含核心蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖或胶原(III)。在一些实施方案中，所述AFC-ECM包括表2中列出的组分的任意一种、任意组合或全部，和/或表2中列出的其任何变体、衍生物或同工型。
在本发明的另一个方面，公开了一种细胞来源的细胞外基质(ECM)，其在体外衍生于从脐带分离的细胞。在一些实施方案中，所述从脐带分离的细胞来自脐带血和/或沃顿胶(Wharton’s jelly)。
在本发明的另一个方面，公开了一种细胞来源的细胞外基质(ECM)，其在体外衍生于从胎盘组织分离的细胞。在一些实施方案中，所述从胎盘组织分离的细胞来自膜片(羊膜和/或绒毛膜)、绒毛和/或血液。
在本发明的上下文中还公开了实施方案1至53。实施方案1是一种细胞来源的细胞外基质(ECM)，其在体外衍生于从羊水分离的细胞。实施方案2是实施方案1所述的细胞来源的ECM，其中所述ECM包含层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白、波形蛋白和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。实施方案3是实施方案2所述的细胞来源的ECM，其中所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2，和/或其中所述聚集蛋白的同工型是同工型6。实施方案4是实施方案2或3的任一项所述的细胞来源的ECM，其中所述细胞来源的ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型。实施方案5是实施方案1-4的任一项所述的细胞来源的ECM，其中所述细胞来源的ECM不包含核心蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖和/或胶原(III)。实施方案6是实施方案1-5的任一项所述的细胞来源的ECM，其中所述从羊水分离的细胞包括干细胞。实施方案7是实施方案1-6的任一项所述的细胞来源的ECM，其中所述细胞来源的ECM是脱细胞的。
实施方案8是在培养中增殖粘附细胞的方法，所述方法包括在培养基中在细胞来源的细胞外基质(ECM)存在下培养粘附细胞，从而增殖所述粘附细胞，其中所述细胞来源的ECM在体外衍生于从羊水分离的细胞。实施方案9是实施方案8所述的方法，其中所述细胞来源的ECM包含层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白、波形蛋白和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。实施方案10是实施方案9所述的方法，其中所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2，和/或其中所述聚集蛋白的同工型是同工型6。实施方案11是实施方案9或10的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型。实施方案12是实施方案8-11的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM不包含核心蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖和/或胶原(III)。实施方案13是实施方案8-12的任一项所述的方法，其中所述从羊水分离的细胞包括干细胞。实施方案14是实施方案8-13的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM在与所述粘附干细胞接触之前被脱细胞。实施方案15是实施方案8-14的任一项所述的方法，其中所述粘附细胞包括哺乳动物粘附细胞。实施方案16是实施方案8-15的任一项所述的方法，其中所述粘附细胞包括干细胞、体细胞、祖细胞、成熟细胞或来自多个胚层的细胞。实施方案17是实施方案16所述的方法，其中所述粘附细胞包括干细胞。实施方案18是实施方案17所述的方法，其中所述干细胞保持未分化状态。实施方案19是实施方案17或18的任一项所述的方法，其中所述干细胞包括多能干细胞(PSC)。实施方案20是实施方案19所述的方法，其中所述PSC包括诱导型PSC(iPSC)。实施方案21是实施方案19所述的方法，其中所述PSC包括胚胎干细胞(ES)。实施方案22是实施方案17或18的任一项所述的方法，其中所述干细胞包括间充质干细胞(MSC)。实施方案23是实施方案22所述的方法，其中所述MSC获自骨髓。实施方案24是实施方案16所述的方法，其中所述粘附细胞包括祖细胞。实施方案25是实施方案24所述的方法，其中所述祖细胞包括内皮祖细胞。实施方案26是实施方案16所述的方法，其中所述粘附细胞包括成熟细胞。实施方案27是实施方案26所述的方法，其中所述成熟细胞包括软骨细胞。
实施方案28是一种诱导干细胞分化为分化的细胞类型的方法，所述方法包括在分化培养基中在细胞来源的细胞外基质(ECM)存在下培养干细胞，其中所述细胞来源的ECM在体外衍生于从羊水分离的细胞。实施方案29是实施方案28所述的方法，其中所述细胞来源的ECM包含层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白、波形蛋白和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。实施方案30是实施方案29所述的方法，其中所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2，和/或其中所述聚集蛋白的同工型是同工型6。实施方案31是实施方案29或30的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型。实施方案32是实施方案28-31的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM不包含核心蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖和/或胶原(III)。实施方案33是实施方案28-32的任一项所述的方法，其中所述从羊水分离的细胞包括干细胞。实施方案34是实施方案28-33的任一项所述的方法，其中所述干细胞包括多能干细胞(PSC)。实施方案35是实施方案34所述的方法，其中所述PSC包括诱导型PSC(iPSC)。实施方案36是实施方案34所述的方法，其中所述PSC包括胚胎干细胞(ES)。实施方案37是实施方案28-33的任一项所述的方法，其中所述干细胞包括间充质干细胞(MSC)。实施方案38是实施方案22所述的方法，其中所述MSC获自骨髓。实施方案39是实施方案37或38的任一项所述的方法，其中所述分化的细胞类型包括脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞或肌细胞。
实施方案40是一种体外产生细胞来源的细胞外基质(ECM)的方法，所述方法包括：(a)从羊水中分离细胞；(b)将分离的细胞接种到细胞培养容器上或涂有基底的细胞培养容器上；(c)向细胞培养容器中添加培养基；以及(d)培养细胞，从而产生细胞来源的ECM；以及(e)任选地，使所述细胞来源的ECM脱细胞。实施方案41是实施方案40所述的方法，其中从羊水中分离的细胞包括干细胞。实施方案42是实施方案40或41所述的方法，其中所述基底是纤连蛋白。实施方案43是实施方案40-42的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM包含层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白、波形蛋白和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。实施方案44是实施方案43所述的方法，其中所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2，和/或其中所述聚集蛋白的同工型是同工型6。实施方案45是实施方案43或44的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型。实施方案46是实施方案40-45的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM不包含核心蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖和/或胶原(III)。
实施方案47是一种通过如下所述方法体外产生的羊水细胞来源的细胞外基质(AFC-ECM)，所述方法包括：(a)从羊水中分离细胞，(b)将分离的细胞接种到细胞培养容器上或涂有基底的细胞培养容器上，(c)向细胞培养容器中添加培养基，以及(d)培养所述细胞，从而产生AFC-ECM，以及(e)任选地，使所述AFC-ECM脱细胞。实施方案48是实施方案47所述的方法，其中从羊水中分离的细胞包括干细胞。实施方案49是实施方案47或48所述的方法，其中所述基底是纤连蛋白。实施方案50是实施方案47-49的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM包含层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白、波形蛋白和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。实施方案51是实施方案50所述的方法，其中所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2，和/或其中所述聚集蛋白的同工型是同工型6。实施方案52是实施方案50或51的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型。实施方案53是实施方案47-52的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM不包含核心蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖和/或胶原(III)。
术语“干样特征(stem-like characteristic)”或“干性(stemness)”是指可以在干细胞中观察到或与干细胞相关的特征。例如，所述干样特征之一可以选自分化为不同细胞类型的能力、自我更新的能力、在某些条件下(包括缺氧条件)的存活能力、抵抗化疗剂的能力以及多种标志物的表达。
术语“同工型”是指生物分子或蛋白质的不同形式。所述生物分子或蛋白质的不同形式可以通过多种过程或机制来产生。在所述生物分子是蛋白质的实施方案中，所述同工型可以是序列中一个或多个氨基酸不同的蛋白质。例如，所述蛋白质同工型可以是遗传等位基因。或者，所述蛋白质同工型可以是可变剪接、RNA编辑、翻译后加工等的产物。
术语“大约”或“近似”被定义为接近本领域普通技术人员所理解的，并且在一个非限制性实施方案中，所述术语被定义为在10％以内，优选地在5％以内，更优选地在1％以内，并且最优选地在0.5％以内。
术语“基本上”及其变型被定义为包括在10％以内、5％以内、1％以内或0.5％以内的范围。
术语“重量％”、“体积％”或“摩尔％”分别是指组分的重量百分比、组分的体积百分比或组分的摩尔百分比，以上百分比基于包含所述组分的总重量、材料的总体积或总摩尔数。在非限制性实例中，在100克材料中的10克组分为10重量％的组分。
术语“抑制”或“减少”或“防止”或“避免”或这些术语的任何变型，当在权利要求和/或说明书中使用时，包括任何可测量的减少或完全抑制以实现期望的结果。
如在说明书和/或权利要求书中所用的，术语“有效”是指足以实现期望的、预料的或预期的结果。
词语“包含(comprising)”(和包含(comprising)的任何形式，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和具有的任何形式，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和包括的任何形式，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和含有的任何形式，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或开放式的，并且不排除额外的、未引用的元素或方法步骤。
当与术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”或“含有(containing)”(或这些词的任何变体)结合使用时，单词“一(a)”或“一个(an)”的使用可以表示“一个(one)”，但是它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或一个以上”的含义一致。
所述组合物及其使用方法可以“包含”整个说明书中公开的任何成分或步骤、“基本上由其组成”或“由其组成”。关于过渡性短语“基本上由...组成”，在一个非限制性方面，本发明的细胞来源的细胞外基质的基本和新颖特征是，它(1)在体外来源于从羊水分离的细胞，和(2)提供了支持PSC粘附、分离、扩增和/或增殖的环境。
可以设想，本说明书中讨论的任何实施方案可以相对于本发明的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
从下面的详细描述中，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应该理解的是，详细描述和具体实施例虽然指示了本发明的具体实施方案，但是仅仅是以说明的方式给出的，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图说明
图1：使用10倍物镜以100倍放大率拍摄的羊水细胞来源的细胞外基质明视野图像的显微照片
图2：羊水细胞来源的ECM和骨髓细胞来源的ECM的3个代表性的40x40um切片的原子力显微照片，其显示了形貌、粘附性和刚度。
图3a：散点图，其示出了骨髓细胞来源的ECM和羊水细胞来源的ECM的粘附性的量化。每个点代表一个独立的测量点。
图3b：散点图，其示出了骨髓细胞来源的ECM和羊水细胞来源的ECM的刚度(弹性模量)的量化。每个点代表一个独立的测量点。
图4：显微照片，显示了iPSC在羊水细胞来源的ECM和骨髓细胞来源的ECM上的第0天和第2天的培养。
图5：在羊水细胞来源的ECM和骨髓细胞来源的ECM的存在下培养的iPSC的生长曲线图。
图6：在羊水细胞来源的ECM上培养的iPSC中多能转录因子表达的柱状图。
图7：在羊水细胞来源的ECM和骨髓细胞来源的ECM和组织培养上的培养中的MSC、EPC和软骨细胞的明视野图像的显微照片。
图8a：在羊水细胞来源的ECM上4天后，对培养中的MSC的增殖进行定量的柱状图。
图8b：在羊水细胞来源的ECM上4天后，对培养中的EPC的增殖进行定量的柱状图。
图8c：在羊水细胞来源的ECM上4天后，对培养中的软骨细胞的增殖进行定量的柱状图。
图9：在羊水细胞来源的ECM和骨髓细胞来源的ECM和组织培养塑料上培养四天后，通过流式细胞仪测量的表达SSEA-4的MSC的百分比的柱状图
图10：在羊水细胞来源的基质上培养4天的MSC的成脂分化的显微照片。
图11：在羊水细胞来源的基质上培养4天的MSC的成骨分化的显微照片。
具体实施方式
本发明公开了一种细胞来源的细胞外基质(ECM)以及制备所述ECM的方法，所述ECM在体外衍生于从羊水分离的细胞。还公开了使用所述ECM来分离、维持和扩增/增殖粘附细胞的方法，所述粘附细胞可以是哺乳动物细胞。
哺乳动物细胞的功能很大程度上取决于它们所处的环境，例如细胞外基质。它们对它们的环境中存在的信号(阳性信号)以及需要但不存在的信号(阴性信号)做出反应。非定向干细胞(uncommitted stem cell)可能会产生包含维持干细胞活力和干性所必需的生态位基序的基质，但是缺乏更成熟细胞可能分泌的许多谱系特异性信号，所述信号会将干细胞推向特定的命运。不受理论的束缚，有人提议，不太成熟的细胞(例如围产期细胞或围产期干细胞)可能会产生与本领域先前公开的ECM不同的ECM，如骨髓基质细胞来源的ECM，并可能允许更好地分离和扩展/增殖比间充质干细胞(MSC)具有更高潜能的干细胞，如多能干细胞(PSC)。质谱证明，与先前已知的细胞来源的ECM相比，本发明的羊水细胞来源的ECM包含在所有3个胚层中发现的基质蛋白，并且缺乏与成骨谱系强烈相关的特异性蛋白。此外，本发明的ECM包含特定的基序，例如层粘连蛋白，已知这些基序有助于多能细胞的粘附和扩增。
A.羊水细胞来源的细胞外基质(AFC-ECM)
围产期细胞可分为三类：来自羊水的细胞；来自胎盘的细胞；和来自脐带的细胞。羊水有几种细胞来源，包括来源于发育中的胎儿、从胎儿羊膜、皮肤以及消化道、呼吸道和泌尿生殖道脱落的细胞。胎盘也有几种细胞来源，包括膜片(羊膜和绒毛膜)、绒毛和血液。脐带细胞通常来自两种来源，即脐带血和沃顿胶。来自这三种围产期来源的细胞可以包括干细胞。用于产生本发明的羊水细胞来源的ECM的细胞获自哺乳动物的羊水，所述哺乳动物包括但不限于人类(智人)、鼠、兔、猫、狗、猪、马或灵长类动物。在优选的实施方案中，所述细胞来自人类的羊水。羊水可以来自足月分娩(大于约37周胎龄)或早产(小于约37周胎龄)的人类。早产包括晚期早产(约33周至约37周胎龄)、中度早产(约29周至约33周胎龄)以及极度早产(约23至约29周胎龄)。所述羊水可以源自羊水存在的、任何胎龄的、分娩前的人类，并且可以与分娩时的羊水来源结合使用。通常，在分娩前，通过羊膜穿刺术手术采集羊水。在某些实施方案中，羊水源自足月分娩、早产、晚期早产、中度早产、极度早产、或分娩前，或其组合的人类。在一些实施方案中，羊水源自分娩前，并从约10周胎龄直至分娩、或从约10周至约23周胎龄、或从约10周至约16周胎龄、或从约12周胎龄直至分娩、或从约12周至约23周胎龄、或从约12周至约16周胎龄采集。在一些实施方案中，通过羊膜穿刺术手术采集来源于分娩前的羊水。可以通过本领域已知的技术(例如在Murphy等人,Amniotic FluidStem Cells,Perinatal Stem Cells,Second Ed.2013中公开的那些)，从羊水中获得并分离细胞。
羊水由具有以下能力的细胞组成：这些细胞能够自发分化为来源于所有3个胚胎胚层(外胚层、内胚层、中胚层)的细胞类型，或者是用本领域技术人员已知的特定生长因子或生长因子组合处理的结果。即，单个细胞具有被诱导以表达特异于三个胚层中的任一个的基因的能力。羊水还包含不同细胞类型的混合物，其包括来源于发育中的胎儿、从胎儿羊膜、皮肤以及消化道、呼吸道和泌尿生殖道脱落的细胞。由于羊水和胎盘膜的起源，这些细胞可以保持高度专能的(multipotent)分化潜能，并包含含有所有三个胚层的细胞的细胞群。所述羊水细胞可包含干细胞。在一些实施方案中，所述羊水细胞是分离的干细胞。在一些实施方案中，所述羊水细胞包含具有分化为来源于所有3个胚胎胚层(外胚层、内胚层、中胚层)的细胞类型的能力的干细胞，和/或专能干细胞(multipotent stem cell)，和/或多能干细胞。
本发明的羊水细胞来源的ECM由多种蛋白质组成。可以通过本领域已知的技术鉴定所述ECM的蛋白质，所述技术包括质谱分析和免疫组织化学染色。所述ECM可以包括但不限于表2中列出的组分(请参阅下面的实施例2)及其任何变体、衍生物或同工型。所述羊水细胞来源的ECM可以包括表2中的任何成分及其任何变体、衍生物或同工型的任何组合。在一些实施方案中，组合可以包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白、波形蛋白和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。在一些实施方案中，所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2。在一些实施方案中，所述聚集蛋白的同工型是同工型6。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型，基本上由其组成，或由其组成。在一些实施方案中，所述羊水细胞来源的ECM不包含核心蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖和胶原(III)中的任意一种或全部。表2中最丰富的胶原蛋白是胶原蛋白I、IV和XVIII。表1中描述了本发明的羊水细胞来源的ECM和骨髓细胞来源的基质之间在蛋白质上的一些显著差异。
表1
羊水细胞来源的ECM(AFC-基质)和骨髓细胞来源的基质(BM-基质)之间的差异
本发明的羊水细胞来源的ECM(AFC-ECM)可以通过以下方法在体外产生：(a)从羊水中分离细胞，
(b)将分离的细胞接种到细胞培养容器上或涂有基底的细胞培养容器上，
(c)向细胞培养容器中添加培养基，以及
(d)培养所述细胞，从而产生AFC-ECM，以及
(e)任选地，使所述AFC-ECM脱细胞。
本文公开了一种体外产生细胞来源的细胞外基质(ECM)的方法，所述方法包括：
(a)从羊水中分离细胞，
(b)将分离的细胞接种到细胞培养容器上或涂有基底的细胞培养容器上，
(c)向细胞培养容器中添加培养基，以及
(d)培养所述细胞，从而产生细胞来源的ECM，以及
(e)任选地，使所述细胞来源的ECM脱细胞。
本文公开了一种通过以下所述方法体外产生的羊水细胞来源的细胞外基质(AFC-ECM)，所述方法包括：
(a)从羊水中分离细胞，
(b)将分离的细胞接种到细胞培养容器上或涂有基底的细胞培养容器上，
(c)向细胞培养容器中添加培养基，以及
(d)培养所述细胞，从而产生AFC-ECM，以及
(e)任选地，使所述AFC-ECM脱细胞。
可以使用允许细胞立即或在培养一段时间后形成汇合的单层的任何接种密度。在一些实施方案中，所述接种密度为约10个细胞/cm2–约100000个细胞/cm2、或约100个细胞/cm2–约75000个细胞/cm2、或约500个细胞/cm2–约50000个细胞/cm2、或约500个细胞/cm2–约10000个细胞/cm2、或约500个细胞/cm2–约5000个细胞/cm2、或约500个细胞/cm2–约2500个细胞/cm2、或约1000个细胞/cm2–约25000个细胞/cm2、或约2000个细胞/cm2–约10000个细胞/cm2、或约3000个细胞/cm2–约5000个细胞/cm2。
适用于细胞培养的任何类型的容器均可用于本发明。实例包括但不限于细胞培养瓶、T形瓶、搅拌瓶、旋转瓶、发酵罐和生物反应器。放置在摇动平台或振动器上时，摇动瓶(Rocking bottle)、振动瓶(shaking flask)、试管和其他容器也是合适的容器。所述细胞培养容器可以涂覆有基底，以实现更好的细胞粘附。用于涂覆细胞容器的合适基底的非限制性实例是纤连蛋白。
多种市售的细胞培养基适于培养羊水细胞，例如α最小必需培养基(α-MEM)培养基(Thermo Fisher Scientific，Grand Island，NY)。可以通过向培养基中添加各种补充物质来修改所述市售培养基，所述补充物质例如碳酸氢钠、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、两性霉素B和/或血清。所述血清可以是胎牛血清。所述培养基也可以不含血清。另外，可以将诸如L-抗坏血酸的物质添加至培养基或经修改的培养基中以诱导细胞产生ECM。
初始培养基可以在培养过程中的不同时间更换和/或替换为另一种培养基。例如，初始培养基可以是“完全培养基”，然后在培养过程中被“诱导培养基”替代。“完全培养基”的非限制性实例包含(α-MEM)加2mM L-谷氨酰胺加抗生素-抗真菌药加15％胎牛血清。“诱导培养基”的非限制性实例包含“完全培养基”加50mM L-抗坏血酸。
羊水细胞的培养可以在培养箱中在37℃，5％CO2和90％湿度下进行。培养可以在多种环境条件下进行，所述环境条件包括但不限于常氧条件，即大气中的氧气为20-21％，或低氧条件。
使羊水细胞的羊水细胞来源的ECM脱细胞可包括去除活的羊水细胞或使所述羊水细胞不存活。所述羊水细胞可以通过使用本领域已知的方法从所述ECM中脱细胞，所述方法可以包括但不限于裂解羊水细胞，然后通过洗涤除去裂解的羊水细胞。可以使用多种物质从所述ECM中去除羊水细胞。非限制性实例包括在PBS缓冲液中含有TRITON X-100和氢氧化铵的“提取缓冲液”。在ECM已经脱去羊水细胞之后，所得到的ECM基本上是无细胞的或没有活的羊水细胞的。如果使用饲养细胞，则所述脱细胞方法也适用于存在于ECM上的任何活的饲养细胞，从而导致ECM基本不含或不含活的饲养细胞。所述脱细胞方法也适用于存在于所述ECM上的任何活细胞，从而导致ECM基本不含或不含任何活细胞。因此，脱细胞的ECM意味着ECM是无细胞的，这意味着ECM不含任何活细胞。
在一些实施方案中，所述羊水细胞来源的ECM是三维(3D)ECM。
上文描述的方法也适用于从其他围产期细胞生产细胞来源的ECM，所述其他围产期细胞例如来自脐带(包括脐带血和沃顿胶)的细胞；以及来自胎盘组织(包括膜片(羊膜和绒毛膜)、绒毛和血液)的细胞。
在一个实施方案中，通过以下方法在体外产生围产期细胞来源的ECM：
(a)从脐带中分离细胞，
(b)将分离的细胞接种到细胞培养容器上或涂有基底的细胞培养容器上，
(c)向细胞培养容器中添加培养基，以及
(d)培养所述细胞，从而产生细胞来源的ECM，以及
(e)任选地，使所述细胞来源的ECM脱细胞。
在一些实施方案中，所述从脐带分离的细胞来自脐带血和/或沃顿胶。
在另一个实施方案中，通过以下方法在体外产生围产期细胞来源的ECM：
(a)从胎盘中分离细胞，
(b)将分离的细胞接种到细胞培养容器上或涂有基底的细胞培养容器上，
(c)向细胞培养容器中添加培养基，以及
(d)培养所述细胞，从而产生细胞来源的ECM，以及
(e)任选地，使所述细胞来源的ECM脱细胞。
在一些实施方案中，所述从胎盘组织分离的细胞来自膜片(羊膜和/或绒毛膜)、绒毛和/或血液。
在本发明的一个方面，公开了一种细胞来源的细胞外基质(ECM)，其在体外衍生于从脐带分离的细胞。在一些实施方案中，所述从脐带分离的细胞来自脐带血和/或沃顿胶。
在本发明的另一个方面，公开了一种细胞来源的细胞外基质(ECM)，其在体外衍生于从胎盘组织分离的细胞。在一些实施方案中，所述从胎盘组织分离的细胞来自膜片(羊膜和/或绒毛膜)、绒毛和/或血液。
B.扩增/增殖粘附细胞的方法
扩增/增殖粘附细胞的方法包括获得所述粘附细胞并在本发明的羊水细胞来源的ECM存在的情况下对其进行培养。在一些实施方案中，所述粘附细胞是哺乳动物粘附细胞。可以使用允许细胞立即或在培养一段时间后形成汇合的单层的任何接种密度。在一些实施方案中，所述接种密度为约10个细胞/cm2-约100000个细胞/cm2、或约100个细胞/cm2-约75000个细胞/cm2、或约500个细胞/cm2-约50000个细胞/cm2、或约500个细胞/cm2-约10000个细胞/cm2、或约500个细胞/cm2-约5000个细胞/cm2、或约500个细胞/cm2-约2500个细胞/cm2、或约1000个细胞/cm2-约25000个细胞/cm2、或约2000个细胞/cm2-约10000个细胞/cm2、或约3000个细胞/cm2-约5000个细胞/cm2。在多种实施方案中，所述粘附细胞为干细胞、体细胞、祖细胞、成熟细胞和/或来自多个胚层的细胞。
在一些实施方案中，所述粘附细胞为干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞为多能干细胞(PSC)或间充质干细胞(MSC)。多能干细胞(PSC)可以自我更新并分化为三个胚层：外胚层、内胚层和中胚层中的任何一个，所有组织和器官都由其发育而来。胚胎干细胞(ES)是目前唯一已知的天然多能干细胞。诱导多能干细胞(iPSC)也是PSC。iPSC源自通常取自成年组织的细胞或成年细胞，并被重新编程至胚胎干细胞的水平。生产iPSC的方法是本领域众所周知的。间充质干细胞(MSCs)是专能基质细胞。MSC可以从以下非限制性来源获得：骨髓、脐带组织(例如沃顿胶、脐带血)、脂肪组织和羊水。在一些实施方案中，所述干细胞维持在未分化状态并保持其干性。
在一些实施方案中，所述粘附细胞是体细胞，也称为生长的细胞(vegetal cell)，其是多细胞生物中的除了生殖细胞、配子、胚细胞、配子母细胞或未分化干细胞以外的任何生物细胞。
在一些实施方案中，所述粘附细胞是来自多个胚层的细胞，包括来自外胚层、内胚层和/或中胚层的细胞。
在一些实施方案中，所述粘附细胞是祖细胞，包括但不限于内皮祖细胞(EPC)、成血管细胞、胰腺祖细胞、来自骨膜的祖细胞以及骨髓基质细胞。
在一些实施方案中，所述粘附细胞是成熟细胞，包括但不限于软骨细胞和成骨细胞。
适合在培养中增殖粘附细胞的细胞培养技术是本领域已知的并且可以被遵循。用于细胞增殖的合适的市售培养基包括但不限于：可从Miltenyl Biotec获得的StemMACSTMiPS-Brew XF；α最小必需培养基(αMEM)，其可补充有胎牛血清、抗生素-抗真菌药(抗-抗)和/或可以从Gibco获得的GlutaMaxTM；以及Iscove改良的DMEM培养基(IMDM)，其可补充有胎牛血清、抗生素-抗真菌药(抗-抗)、GlutaMax和/或生长因子如EGF和FGF。在一些实施方案中，不使用Rock抑制剂。一旦细胞开始接近汇合(例如，由明场显微镜确定)，就可以将细胞手动传代，通过将大的集落切成较小的集落，然后通过将其从培养皿中物理剥离并将其放置在新鲜的羊水细胞来源的ECM板上来将其重新铺板。此程序可以无限重复。在一些实施方案中，公开了在培养中增殖粘附细胞的方法，所述方法包括在培养基中在细胞来源的细胞外基质(ECM)存在下培养所述细胞，从而增殖所述粘附细胞，其中所述细胞来源的ECM在体外衍生于从羊水分离的细胞。
上文描述的扩增/增殖粘附细胞的方法也适用于在存在其他围产期细胞来源的ECM的情况下在培养中扩增/增殖粘附细胞的用途。在一些方面，公开了在培养中增殖粘附细胞的方法，所述方法包括在培养基中在细胞来源的细胞外基质(ECM)存在下培养所述粘附细胞，从而增殖所述粘附细胞，其中所述细胞来源的ECM在体外衍生于从脐带或胎盘组织分离的细胞。在一些实施方案中，所述从脐带分离的细胞来自脐带血和/或沃顿胶。在其他实施方案中，所述从胎盘组织分离的细胞来自膜片(羊膜和/或绒毛膜)、绒毛和/或血液。
C.诱导干细胞分化的方法
本文公开了诱导干细胞分化为分化的细胞类型的方法，所述方法包括在分化培养基中在细胞来源的细胞外基质(ECM)存在下培养干细胞，其中所述细胞来源的ECM在体外衍生于从羊水分离的细胞，即本发明的羊水细胞来源的ECM。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM包含层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白、波形蛋白和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。在一些实施方案中，所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2。在一些实施方案中，所述聚集蛋白的同工型是同工型6。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM不包含核心蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖或胶原(III)。在一些实施方案中，所述从羊水分离的细胞包括干细胞。在一些实施方案中，所述细胞来源的ECM是脱细胞的。所述干细胞可以是多能干细胞(PSC)，例如诱导型PSC(iPSC)或胚胎干细胞(ES)。所述干细胞可以是间充质干细胞(MSC)。MSC可以从以下非限制性来源获得：骨髓、脐带组织(例如沃顿胶、脐带血)、脂肪组织和羊水。在一些实施方案中，所述MSC获自骨髓。在一些实施方案中，所述分化的细胞类型可以是脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞或肌细胞。
用于将干细胞分化成分化的细胞类型的细胞培养技术是本领域已知的并且可以被遵循。多种可商购获得的分化培养基都适合使用，并且对于特定的所需分化细胞类型可以是特异性的。例如，成脂分化培养基可以包含含有FBS、IBMX、地塞米松、胰岛素和/或吲哚美辛的DMEM。另一个实例是成骨细胞分化培养基，其可以是补充有地塞米松和/或L-抗坏血酸-2-磷酸酯的生长培养基。
上文描述的诱导干细胞分化的方法也适用于在分化培养基中存在其他围产期细胞来源的ECM的情况下培养干细胞的用途。在一些方面，公开了一种诱导干细胞分化为分化的细胞类型的方法，所述方法包括在分化培养基中在细胞来源的细胞外基质(ECM)存在下培养干细胞，其中所述细胞来源的ECM在体外衍生于从脐带或胎盘组织分离的细胞。在一些实施方案中，所述从脐带分离的细胞来自脐带血和/或沃顿胶。在其他实施方案中，所述从胎盘组织分离的细胞来自膜片(羊膜和/或绒毛膜)、绒毛和/或血液。
实施例
纳入以下实施例以说明本发明的某些非限制方面。本领域技术人员应理解，在以下实施例中公开的技术代表申请人发现的在本发明的实践中可以良好发挥作用的技术。然而，本领域技术人员应当理解，根据本公开，可以在所公开的特定实施方案中做出许多改变，并且仍然获得类似或相似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。
实施例1-羊水细胞来源的ECM的产生
使用以下程序制备了四种羊水细胞来源的ECM(基质A、基质B、基质C和基质D)：将从4个供体的足月分娩(>37周胎龄)收集的羊水中无菌分离的细胞接种到纤连蛋白包被的经组织培养处理的培养瓶上，并在培养器中在完全培养基中于37℃在5％CO2和90％RH下培养。所述完全培养基为α最小必需培养基(aMEM)加2mM L-谷氨酰胺加抗生素-抗真菌药加15％胎牛血清。
在第3-4天，从培养瓶中吸出一半的所述完全培养基，并用一半的新的完全培养基代替。将培养瓶放回与上述相同的条件下的培养器中。
在第7-8天，从培养瓶中吸出所述完全培养基，并用诱导培养基重新装满。将培养瓶放回与上述相同的条件下的培养器中。所述诱导培养基是完全培养基加50mM L-抗坏血酸。
在第10-11天，从培养瓶中吸出所述诱导培养基，并将培养瓶内部形成的ECM用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次。然后从培养瓶中吸出PBS。将提取缓冲液添加到培养瓶中，并在室温下培养7-10分钟以使每种ECM脱细胞，然后从培养瓶中吸出所述提取缓冲液。所述提取缓冲液是含有0.5％(v/v)Triton-X100和20mM氢氧化铵(NH4OH)的PBS。
将培养瓶中每种脱细胞的ECM用PBS洗涤3次，然后用无菌水洗涤一次，然后从培养瓶中吸出无菌水。使培养瓶中的四种脱细胞的ECM在室温下干燥，然后在4℃下保存。
使用10倍物镜以100倍放大率拍摄的羊水细胞来源的ECM(基质B)的明视野图像的显微照片示于图1。图2中示出了羊水细胞来源的ECM(基质B)和骨髓细胞来源的ECM的3个代表性的40x 40um切片的原子力显微照片，其显示了形貌、粘附性和刚度。所述骨髓细胞来源的ECM和羊水细胞来源的ECM在结构和物理上是不同的。如图3a(粘附性)和图3b(刚度)的散点图(其中BM＝骨髓细胞来源的ECM，AD＝羊水细胞来源的ECM(基质B))所示，骨髓细胞来源的ECM和羊水细胞来源的ECM的粘附性和刚度(弹性模量)的定量显示，与羊水ECM相比，骨髓ECM的刚度高10倍，粘附力低3倍。每个点代表一个独立的测量点。
实施例2-羊水细胞来源的ECM的组成
通过质谱法确定实施例1中产生的每种羊水细胞来源的ECM的组成。表2中列出了所述组分及其谱图计数和分子量。
表2
羊水细胞来源的ECM组分
实施例3-iPSC在羊水细胞来源的ECM上的增殖
使用以下程序，可以在培养中将诱导型多能干细胞(iPSC)在实施例1的羊水细胞来源的ECM(基质B)上增殖：使用37℃的水浴，将商购的冷冻保存的iPSC解冻。将细胞悬浮液稀释到商购的用于干细胞增殖的培养基(Miltenyi Biotec MACS iPS Brew)中，并在6孔板中以约1000个细胞/cm2接种到ECM上，所述6孔板中具有2mL培养基/孔。不使用Rock抑制剂。在第1天，从培养细胞中轻轻吸出全部培养基，并用新鲜培养基代替。每24小时，都将全部的培养基替换为新鲜的培养基。一旦细胞开始接近汇合(由明场显微镜确定)，就将细胞手动传代，使用无菌针将大的集落切成大约100个较小的集落，然后通过使用无菌针将其从培养皿中物理剥离并将其放置在新鲜的ECM的板上来将其重新铺板。此程序可以无限重复。
图4示出了一张显微照片，其显示了iPSC在羊水细胞来源的ECM和骨髓细胞来源的ECM上的第0天和第2天的培养。
图5示出了在羊水细胞来源的ECM和骨髓细胞来源的ECM的存在下培养的iPSC的iPSC集落生长曲线图。
从图4和图5可以看出，iPSC在羊水细胞来源的ECM存在下在培养中增殖，而在骨髓细胞来源的ECM存在下培养的iPSC没有生长。
在另一项研究中，将iPSC接种到羊水细胞来源的ECM(AFC-ECM)上。将细胞传代两次，然后收集RNA用于基因表达分析。使用定量PCR用于确定基因表达。如图6所示，在实验过程中，在AFC-ECM上生长的iPSC保持了多能性，并保持了核心多能转录因子POU5F1(OCT4)、SOX2和NANOG的表达。这些研究的结果表明，羊水细胞来源的ECM支持多能干细胞的自我更新和增殖。
实施例4-多种细胞类型在羊水细胞来源的ECM上的增殖
将从骨髓获得的间充质干细胞(MSC)、内皮祖细胞(EPC)和软骨细胞在标准市售培养基中以相等的接种密度接种到羊水细胞来源的ECM(AF-ECM)、骨髓细胞来源的ECM(BM-ECM)以及组织培养塑料(TCP)上。对于MSC和软骨细胞，所述培养基为无酚红修饰的α最小必需培养基(aMEM)，并补充有15体积％的胎牛血清、1％的抗生素-抗真菌药(抗-抗)和1％的GlutaMax。对于EPC，使用的是Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)，其补充有20％FBS、1％抗-抗、1％GlutaMax和生长因子(EGF和FGF)。如图7所示的显微照片显示了两种ECM相对于TCP的增殖增加。培养4天后的细胞增殖在图8a、图8b和图8c的柱状图中进行了定量。令人惊讶地，相对于骨髓细胞来源的ECM，所述羊水细胞来源的ECM支持MSC(由骨髓产生)的增殖增加。另外，图9示出了在每种基底上培养4天后通过流式细胞术测量的表达SSEA-4的MSC的百分比。SSEA-4表达在羊水细胞来源的ECM上培养后相对于其他基底是升高的。
实施例5-在羊水细胞来源的ECM上培养的MSC的分化
将从人类骨髓获得的间充质干细胞(MSC)以6×103个细胞/cm2接种在羊水细胞来源的ECM(AFC-ECM)上，并在生长培养基中培养14天。
为了评估细胞的成脂分化效率，将培养物在第7天转移到成脂培养基(DMEM，其含有10％FBS、0.5mM IBMX、10-6M地塞米松、10μM胰岛素和200μM吲哚美辛)中，再保持10天，在室温下用10％福尔马林固定1小时，然后用油红O染色。通过用油红O将分化的细胞染色，来验证成脂作用。在培养中，MSC分化为脂肪细胞后，油红O对在细胞内形成的脂质滴进行染色(红色染色)。如图10所示，显微照片示出了MSC在AFC-ECM上的成脂分化。
为了评估成骨分化的效率，将培养物转移到成骨细胞分化培养基(生长培养基，其补充有10-7M地塞米松(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和10-4M L-抗坏血酸-2-磷酸酯(WakoChemicals，Richmond，VA))中，再保持25天，在室温下用10％福尔马林固定1小时，然后再用1％硝酸银(Von KossaStaining)染色。通过用1％硝酸银对分化的细胞进行染色，来验证成骨作用。在培养中，MSC分化为成骨细胞后，硝酸银可将沉积的矿物质染色(深色染色)。如图11所示，显微照片示出了MSC在AFC-ECM上的成骨分化。这项研究表明，干细胞在羊水细胞衍生的ECM上培养时可以被诱导分化为分化的细胞类型。
Claims (53)
1.一种细胞来源的细胞外基质(ECM)，其在体外衍生于从羊水分离的细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞来源的ECM，其中所述ECM包含层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白、波形蛋白和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。
3.根据权利要求2所述的细胞来源的ECM，其中所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2，和/或其中所述聚集蛋白的同工型是同工型6。
4.根据权利要求2或3的任一项所述的细胞来源的ECM，其中所述细胞来源的ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型。
5.根据权利要求1-4的任一项所述的细胞来源的ECM，其中所述细胞来源的ECM不包含核心蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖和/或胶原(III)。
6.根据权利要求1-5的任一项所述的细胞来源的ECM，其中所述从羊水分离的细胞包括干细胞。
7.根据权利要求1-6的任一项所述的细胞来源的ECM，其中所述细胞来源的ECM是脱细胞的。
8.一种在培养中增殖粘附细胞的方法，所述方法包括在培养基中在细胞来源的细胞外基质(ECM)存在下培养所述粘附细胞，从而增殖所述粘附细胞，其中所述细胞来源的ECM在体外衍生于从羊水分离的细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞来源的ECM包含层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白、波形蛋白和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2，和/或其中所述聚集蛋白的同工型是同工型6。
11.根据权利要求9或10的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型。
12.根据权利要求8-11的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM不包含核心蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖和/或胶原(III)。
13.根据权利要求8-12的任一项所述的方法，其中所述从羊水分离的细胞包括干细胞。
14.根据权利要求8-13的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM在与粘附干细胞接触之前被脱细胞。
15.根据权利要求8-14的任一项所述的方法，其中所述粘附细胞包括哺乳动物粘附细胞。
16.根据权利要求8-15的任一项所述的方法，其中所述粘附细胞包括干细胞、体细胞、祖细胞、成熟细胞或来自多个胚层的细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述粘附细胞包括干细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述干细胞保持未分化状态。
19.根据权利要求17或18的任一项所述的方法，其中所述干细胞包括多能干细胞(PSC)。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述PSC包括诱导型PSC(iPSC)。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述PSC包括胚胎干细胞(ES)。
22.根据权利要求17或18的任一项所述的方法，其中所述干细胞包括间充质干细胞(MSC)。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述MSC获自骨髓。
24.根据权利要求16所述的方法，其中所述粘附细胞包括祖细胞。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述祖细胞包括内皮祖细胞。
26.根据权利要求16所述的方法，其中所述粘附细胞包括成熟细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述成熟细胞包括软骨细胞。
28.一种诱导干细胞分化为分化的细胞类型的方法，所述方法包括在分化培养基中在细胞来源的细胞外基质(ECM)存在下培养干细胞，其中所述细胞来源的ECM在体外衍生于从羊水分离的细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述细胞来源的ECM包含层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白、波形蛋白和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2，和/或其中所述聚集蛋白的同工型是同工型6。
31.根据权利要求29或30的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型。
32.根据权利要求28-31的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM不包含核心蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖和/或胶原(III)。
33.根据权利要求28-32的任一项所述的方法，其中所述从羊水分离的细胞包括干细胞。
34.根据权利要求28-33的任一项所述的方法，其中所述干细胞包括多能干细胞(PSC)。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述PSC包括诱导型PSC(iPSC)。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述PSC包括胚胎干细胞(ES)。
37.根据权利要求28-33的任一项所述的方法，其中所述干细胞包括间充质干细胞(MSC)。
38.根据权利要求22所述的方法，其中所述MSC获自骨髓。
39.根据权利要求37或38的任一项所述的方法，其中所述分化的细胞类型包括脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞或肌细胞。
40.一种体外产生细胞来源的细胞外基质(ECM)的方法，所述方法包括：
(a)从羊水中分离细胞；
(b)将分离的细胞接种到细胞培养容器上或涂有基底的细胞培养容器上；
(c)向细胞培养容器中添加培养基；以及
(d)培养所述细胞，从而产生细胞来源的ECM；以及
(e)任选地，使所述细胞来源的ECM脱细胞。
41.根据权利要求40所述的方法，其中从羊水中分离的细胞包括干细胞。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述基底是纤连蛋白。
43.根据权利要求40-42的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM包含层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白、波形蛋白和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2，和/或其中所述聚集蛋白的同工型是同工型6。
45.根据权利要求43或44的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型。
46.根据权利要求40-45的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM不包含核心蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖和/或胶原(III)。
47.一种通过如下方法体外产生的羊水细胞来源的细胞外基质(AFC-ECM)，所述方法包括：
(a)从羊水中分离细胞，
(b)将分离的细胞接种到细胞培养容器上或涂有基底的细胞培养容器上，
(c)向细胞培养容器中添加培养基，以及
(d)培养所述细胞，从而产生AFC-ECM，以及
(e)任选地，使所述AFC-ECM脱细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中从羊水中分离的细胞包括干细胞。
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述基底是纤连蛋白。
50.根据权利要求47-49的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM包含层粘连蛋白、胶原α-1(XVIII)、基膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、聚集蛋白、波形蛋白和胶原α-2(IV)，和/或其同工型。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述胶原α-1(XVIII)的同工型是同工型2，和/或其中所述聚集蛋白的同工型是同工型6。
52.根据权利要求50或51的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM还包含纤连蛋白和/或其同工型。
53.根据权利要求47-52的任一项所述的方法，其中所述细胞来源的ECM不包含核心蛋白聚糖、串珠蛋白聚糖和/或胶原(III)。
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