CN113728092A - 心肌细胞在羊水细胞来源的ecm上成熟化的方法、细胞构建体及用于药物化合物的心脏毒性和致心律失常筛查的用途 - Google Patents

心肌细胞在羊水细胞来源的ecm上成熟化的方法、细胞构建体及用于药物化合物的心脏毒性和致心律失常筛查的用途 Download PDF

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Abstract

本文公开了使用体外来源于从羊水分离的细胞的细胞来源细胞外基质(AFC‑ECM)用于在培养中使来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞(不成熟的hiPSC‑CM)成熟化形成成熟心肌细胞的方法。本文还公开了在AFC‑ECM上包含这些成熟心肌细胞的单层的细胞构建体，其用于药物化合物的心脏毒性和/或致心律失常筛查测定。本文还公开了使用这样的细胞构建体体外测定药物化合物的心脏毒性和/或致心律失常作用的方法。

Description

心肌细胞在羊水细胞来源的ECM上成熟化的方法、细胞构建体 及用于药物化合物的心脏毒性和致心律失常筛查的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年2月21日提交的美国临时专利申请第62/808690号的权益，该临时专利申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开总的涉及来源于人类干细胞的心肌细胞在细胞来源的细胞外基质上的细胞构建体的用途、制备所述构建体的方法以及使用所述构建体进行药物化合物的心脏毒性和致心律失常筛查测定的方法。
背景技术
心脏毒性，或心脏毒性的感知可能性，是研究和选择新药期间毒性相关药物损耗的首要原因。成为主要候选药物的新化学实体的心脏安全性测试是药物发现与开发产品线的一个关键方面。心脏和非心脏药物的大量心脏副作用由药物与一个或多个心脏离子通道的相互作用引起。心脏离子通道调节细胞的兴奋性、收缩性和整体心脏功能，并且心脏离子通道功能的改变可能导致心源性猝死。这促成国际协调会议(ICH)发布候选药物测试指南。
IHC的当前临床前候选药物测试指南(ICH S7A和S7B药理学研究)依赖于转基因异源细胞和体内动物模型。人们越来越认识到，这些研究，如hERG测定和QT延长研究，不能准确预测人类的心脏毒性和致心律失常风险。自2005年以来，药物化合物的心脏安全性几乎完全由其对心电图(ECG)的QT间期或动作电位持续时间(APD)的影响或潜在影响以及导致称为尖端扭转型室速(TdP)的危及生命的心律失常的可能性来确定。然而，QT延长并不是TdP的理想指标，因为延长QT间期的药物并不总是引起TdP。现已认识到QT延长参数只是致心律失常的替代标志物。来自临床前和临床试验的数据已表明，在QT延长的幅度与发生致命性心律失常如TdP的风险之间没有固定的关系。
因此，美国食品和药物管理局(FDA)及药物发现领域中的其他利益相关者已呼吁临床前心脏毒性测试的发展。提出的新范式称为综合体外致心律失常测定(CiPA)。CiPA倡议(http://cipaproject.org/)的一个组成部分包括将从人类干细胞来源的心肌细胞收集的数据纳入心脏毒性和致心律失常测定。这些新提出的指导方针的总体目标在于提供更准确和全面的基于机制的致心律失常潜力评估，从而更准确地评估新药的风险。在审查所提出的CiPA倡议的指导方针时，FDA确定了在人类心肌细胞可纳入到新倡议中之前必须取得的两项进展。首先，人类干细胞来源的心肌细胞的生长和成熟状态需要被推进到更接近成人心肌细胞的结构和功能。其次，必须开发出使用这些细胞的可靠的高通量筛选平台。
目前通常采用三种类型的系统来体外评价心肌细胞的电生理学：1)膜片钳系统；2)微电极阵列(MEA)系统；和3)电压敏感染料(VSD)可视化方法。在非常早期的研究中最常使用手动膜片钳系统来评价单个细胞的电生理学。这些设备虽然提供准确且灵敏的离子电流测量，但不能用于更接近地模拟心脏组织中的细胞-细胞相互作用的体外细胞系统。MEA系统包括并入到细胞培养孔中的电极，从而允许穿过孔的电流的测量。虽然允许在体外细胞系统中进行高通量分析并能够测量阻抗，但这些系统的空间分辨率低，不提供动作电位形状的数据，并阻碍细胞的直接可视化及评估更接近地模拟心脏组织结构的3-D培养系统的能力。VSD系统正引起人们的兴趣，因为它们解决了上述当前技术的许多缺点，其特征包括：1)允许高通量分析；2)提供高的空间分辨率；3)允许遍及培养皿的脉冲传播的可视化；和4)允许修改培养条件，包括添加细胞外基质，从而获得更自然的测试环境。
迄今为止，使用来源于人类干细胞如诱导性多潜能干细胞的心肌细胞在心脏毒性和致心律失常测定筛查方面取得的成功有限。来源于诱导性人类多潜能干细胞的心肌细胞(hiPSC-CM)是可商购获得的并可作为可解冻并以单层接种的在低温保存的小瓶从若干公司购买。这些hiPSC-CM是可在体外大规模制备。另外，可针对特定个体从患者特异性hiPSC获得hiPSC-CM。然而，要使hiPSC-CM成为新的CiPA倡议范式的一个有意义的部分，仍有一些障碍需要克服。1)必须推进hiPSC-CM结构和功能的成熟化。值得指出的是，目前可用的hiPSC-CM中不存在Kir2.1钾通道并且钠通道表达低。目前可用的hiPSC-CM在功能和结构上都非常不成熟。绝大多数目前使用的基于hiPSC-CM的致心律失常筛查测定依赖于不成熟的胎儿样细胞，这些细胞与成体心肌细胞的功能结构不同。2)需要在高通量电生理学筛选平台中对hiPSC-CM单层进行电起搏。绝大多数目前的基于hiPSC-CM的致心律失常筛查仅仅依赖于场电位持续时间(MEA技术)或动作电位持续时间延长(VSD技术)作为TdP诱导的替代标志物。这是一个限制，因为并非所有延长动作电位(QT间期)的药物都会导致致命性TdP心律失常。虽然在培养中使用MatrigelTM ECM和骨髓细胞来源的ECM已实现不成熟的hiPSC-CM的一定成熟化状态，但在致心律失常筛查测定中使用这些hiPSC-CM在观察心律失常激活模式时并未产生与在人类TdP病例中，尤其是在低风险和高风险药物之间已知会发生的相一致的结果。
因此，需要先进的材料和新的方法来精确评估和筛查药物化合物的心脏安全性以准确、可靠并高效地开发新的候选药物。
发明内容
本公开提供了一种在与候选药物的心脏安全性的评估和筛查相关的领域中的上述限制和缺陷中的至少一些的解决方案。所述解决方案以来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)的发现为前提，该基质可用于人类干细胞来源的心肌细胞的成熟化。然后可在具有AFC-ECM的细胞构建体中使用这些成熟的心肌细胞用于药物的心脏毒性和致心律失常测试。
在一个方面，公开了一种使来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞成熟化的方法，所述方法包括：(a)提供来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞(不成熟的hiPSC-CM)；(b)提供体外来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)；(c)使不成熟的hiPSC-CM与AFC-ECM接触；和(d)在培养基中用AFC-ECM培养所述不成熟的hiPSC-CM以诱导所述不成熟的hiPSC-CM的成熟化，从而形成成熟的心肌细胞；其中所述成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构的杆状细胞为特征。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞具有与如图6至图14中的任一个所示相似或相同的形态。在一些实施方案中，将不成熟的hiPSC-CM接种在AFC-ECM上。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞在AFC-ECM上形成为单层，从而形成在AFC-ECM上包含成熟心肌细胞的单层的细胞构建体，其中成熟的心肌细胞排列在AFC-ECM上。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM不表达内向整流钾通道Kir2.1。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM不包括具有独特肌节结构的杆状细胞。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM可以具有比成熟的心肌细胞少的线粒体、具有紊乱的肌丝、具有圆形形状和/或具有单个核为特征。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞还可以具有比不成熟的hiPSC-CM大的量的线粒体、具有有条理的紧凑的肌丝和/或具有两个核(双核)为特征。
在另一个方面，公开了一种细胞构建体，其在来源于从羊水体外分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)上包含成熟的心肌细胞的单层，其中所述成熟的心肌细胞为AFC-ECM培养的来源于人类诱导性多潜能干细胞的心肌细胞(hiPSC-CM)，并且其中所述成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构的杆状细胞为特征。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞具有与如图6至图14中的任一个所示相似或相同的形态。在一些方面，成熟的心肌细胞包括内向整流Kir2.1钾通道和/或表达内向整流钾通道Kir2.1。在某些方面，成熟的心肌细胞可在培养中在AFC-ECM上从来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞(不成熟的hiPSC-CM)成熟化，其中所述成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构(条纹外观)的杆状细胞为特征。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞的单层排列在AFC-ECM上。在一些实施方案中，构建体上存在纤维轨迹。在一些实施方案中，AFC-ECM包含层黏连蛋白、胶原蛋白α-1(XVIII)、基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、集聚蛋白、波形蛋白和胶原蛋白α-2(IV)和/或其同种型。在一些实施方案中，胶原蛋白α-1(XVIII)的同种型为同种型2。在一些实施方案中，集聚蛋白的同种型为同种型6。在一些实施方案中，AFC-ECM还包含纤维黏连蛋白和/或其同种型。在一些实施方案中，AFC-ECM不含核心蛋白聚糖、基底膜蛋白多糖和/或胶原蛋白(III)。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM不包括具有独特肌节结构的杆状细胞。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM可以具有比成熟的心肌细胞少的线粒体、具有紊乱的肌丝、具有圆形形状和/或具有单个核为特征。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞还可以具有比不成熟的hiPSC-CM大的量的线粒体、具有有条理的紧凑的肌丝和/或具有两个核(双核)为特征。
在另一个方面，公开了一种制备成熟的心肌细胞在体外来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)上的细胞构建体的方法，所述方法包括：(a)提供来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞(不成熟的hiPSC-CM)；(b)提供体外来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)；(c)将不成熟的hiPSC-CM接种在AFC-ECM上；和(d)在培养基中在AFC-ECM上培养所接种的不成熟的hiPSC-CM以诱导所述不成熟的hiPSC-CM成熟化为成熟的心肌细胞并在AFC-ECM上形成成熟的心肌细胞的单层，从而形成细胞构建体，其中所述成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构的杆状细胞为特征。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞具有与如图6至图14中的任一个所示相似或相同的形态。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞的单层排列在AFC-ECM上。在一些实施方案中，细胞构建体上存在纤维轨迹。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM不包括具有独特肌节结构的杆状细胞。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM可以具有比成熟的心肌细胞少的线粒体、具有紊乱的肌丝、具有圆形形状和/或具有单个核为特征。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞还可以具有比不成熟的hiPSC-CM大的量的线粒体、具有有条理的紧凑的肌丝和/或具有两个核(双核)为特征。
在另一个方面，公开了一种体外测定药物化合物的心脏毒性和/或致心律失常作用的方法，所述方法包括使药物化合物与整个说明书中公开的细胞构建体中的任一种的成熟心肌细胞接触，并观察成熟心肌细胞的电生理学的变化以确认药物化合物是否对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用。成熟心肌细胞的电生理学的变化证实药物化合物对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用。成熟心肌细胞的电生理学的变化可包括但不限于APD延长、APD延长加转子和/或各种类型的心律失常，如快速心律失常(TA)、静止(Q)、迟后去极化(DAD)和/或早后去极化(EAD)。观察还可包括细胞活力、细胞密度和/或细胞形态。在一些实施方案中，成熟心肌细胞的电生理学的变化为动作电位持续时间(APD)的延长。在一些实施方案中，成熟心肌细胞的电生理学的变化为早后去极化(EAD)。在一些实施方案中，成熟心肌细胞的电生理学的变化为迟后去极化(DAD)。在一些实施方案中，成熟心肌细胞的电生理学的变化为动作电位持续时间延长(APD延长)加转子。在一些实施方案中，成熟心肌细胞的电生理学的变化为心律失常。在一些方面，细胞构建体可通过包括以下的方法来制备：(a)提供来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞(不成熟的hiPSC-CM)；(b)提供体外来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)；(c)将不成熟的hiPSC-CM接种在AFC-ECM上；和(d)在培养基中在AFC-ECM上培养所接种的不成熟的hiPSC-CM以诱导所述不成熟的hiPSC-CM成熟化为成熟的心肌细胞并在AFC-ECM上形成成熟的心肌细胞的单层，从而形成细胞构建体，其中所述成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构的杆状细胞为特征。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞具有与如图6至图14中的任一个所示相似或相同的形态。在一个实施方案中，不成熟的hiPSC-CM不表达内向整流钾通道Kir2.1。在另一个实施方案中，成熟的心肌细胞的单层排列在AFC-ECM上。在另一个实施方案中，细胞构建体上存在纤维轨迹。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM不包括具有独特肌节结构的杆状细胞。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM可以具有比成熟的心肌细胞少的线粒体、具有紊乱的肌丝、具有圆形形状和/或具有单个核为特征。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞还可以具有比不成熟的hiPSC-CM大的量的线粒体、具有有条理的紧凑的肌丝和/或具有两个核(双核)为特征。
另外，在本发明的上下文中公开了以下实施方案1至20：
实施方案1为一种用于使来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞成熟化的方法，所述方法包括：
(a)提供来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞(不成熟的hiPSC-CM)；
(b)提供体外来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)；
(c)使不成熟的hiPSC-CM与AFC-ECM接触；和
(d)在培养基中用AFC-ECM培养所述不成熟的hiPSC-CM以诱导所述不成熟的hiPSC-CM的成熟化，从而形成成熟的心肌细胞；
其中所述成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构的杆状细胞为特征。
实施方案2为实施方案1的方法，其中将所述不成熟的hiPSC-CM接种在AFC-ECM上。
实施方案3为实施方案1或2中任一项的方法，其中成熟的心肌细胞在AFC-ECM上形成为单层，从而形成在AFC-ECM上包含成熟心肌细胞的单层的细胞构建体，其中成熟的心肌细胞排列在AFC-ECM上。
实施方案4为实施方案1至3中任一项的方法，其中不成熟的hiPSC-CM不表达内向整流钾通道Kir2.1。
实施方案5为一种细胞构建体，其在来源于从羊水体外分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)上包含成熟心肌细胞的单层，其中所述成熟的心肌细胞为AFC-ECM培养的来源于人类诱导性多潜能干细胞的心肌细胞(hiPSC-CM)，并且其中所述成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构的杆状细胞为特征。
实施方案6为实施方案5的细胞构建体，其中成熟的心肌细胞的单层排列在AFC-ECM上。
实施方案7为实施方案5或6中任一项的细胞构建体，其中构建体上存在纤维轨迹。
实施方案8为实施方案5至7中任一项的细胞构建体，其中AFC-ECM包含层黏连蛋白、胶原蛋白α-1(XVIII)、基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、集聚蛋白、波形蛋白和胶原蛋白α-2(IV)和/或其同种型。
实施方案9为实施方案8的细胞构建体，其中胶原蛋白α-1(XVIII)的同种型为同种型2，和/或其中集聚蛋白的同种型为同种型6。
实施方案10为实施方案8或9中任一项的细胞构建体，其中AFC-ECM还包含纤维黏连蛋白和/或其同种型。
实施方案11为实施方案5至10中任一项的细胞构建体，其中AFC-ECM不含核心蛋白聚糖、基底膜蛋白多糖和/或胶原蛋白(III)。
实施方案12为一种用于制备成熟的心肌细胞在体外来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)上的细胞构建体的方法，所述方法包括：
(a)提供来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞(不成熟的hiPSC-CM)，
(b)提供体外来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)；
(c)将所述不成熟的hiPSC-CM接种在AFC-ECM上；
(d)在培养基中在AFC-ECM上培养所接种的不成熟的hiPSC-CM以诱导所述不成熟的hiPSC-CM成熟化为成熟的心肌细胞并在AFC-ECM上形成成熟的心肌细胞的单层，从而形成细胞构建体；
其中所述成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构的杆状细胞为特征。
实施方案13为实施方案12的方法，其中成熟的心肌细胞的单层排列在AFC-ECM上。
实施方案14为实施方案12或13中任一项的方法，其中细胞构建体上存在纤维轨迹。
实施方案15为一种用于体外测定药物化合物的心脏毒性和/或致心律失常作用的方法，所述方法包括使药物化合物与实施方案5至11的细胞构建体中的任一种的成熟心肌细胞接触，并观察成熟心肌细胞的电生理学的变化以确认药物化合物是否对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用。
实施方案16为实施方案15的方法，其中成熟心肌细胞的电生理学的变化为动作电位持续时间(APD)的延长，并且其中APD的延长证实药物化合物对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用。
实施方案17为实施方案15的方法，其中成熟心肌细胞的电生理学的变化为早后去极化，并且其中早后去极化(EAD)证实药物化合物对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用。
实施方案18为实施方案15的方法，其中成熟心肌细胞的电生理学的变化为迟后去极化，并且其中迟后去极化(DAD)证实药物化合物对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用。
实施方案19为实施方案15的方法，其中成熟心肌细胞的电生理学的变化为动作电位持续时间(APD)加转子，并且其中APD的延长加转子证实药物化合物对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用。
实施方案20为实施方案15的方法，其中成熟心肌细胞的电生理学的变化为心律失常，并且其中心律失常证实药物化合物对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用。
术语“约”或“大约”定义为本领域普通技术人员所理解的接近于，并且在一个非限制性实施方案中，所述术语定义为在10％以内，优选在5％以内，更优选在1％以内，最优选在0.5％以内。
术语“基本上”及其变体定义为包括10％以内、5％以内、1％以内或0.5％以内的范围。
如本文所用，术语“重量/重量％”或“重量％”是指基于包含该组分的材料(例如，组合物)的总重量计组分的重量百分数。在一个非限制性实例中，100克组合物中的10克组分为组合物总重量中10重量/重量％的该组分。如本文所用，术语“体积/体积％”或“体积％”是指基于包含该组分的材料(例如，组合物)的总体积计组分的体积百分数。在一个非限制性实例中，100mL组合物中的10mL组分为组合物总体积中10体积/体积％的该组分。如本文所用，术语“重量/体积％”是指基于包含该组分的材料(例如，组合物)的总体积计组分的重量百分数。在一个非限制性实例中，100mL组合物中的10克组分为组合物总体积中10重量/体积％的该组分。如本文所用，术语“体积/重量％”是指基于包含该组分的材料(例如，组合物)的总重量计组分的体积百分数。在一个非限制性实例中，100克组合物中的10mL组分为组合物总体积中10体积/重量％的该组分。
当在权利要求书和/或说明书中使用时，术语“抑制”或“减少”或“防止”或“避免”包括任意可测量的减小或完全抑制以取得期望的结果。
术语“有效的”，如在说明书和/或权利要求书中使用该术语，指的是足以实现期望的、期待的或预期的结果。
词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是容他性的或开放式的而不排除另外的、未记载的要素或方法步骤。
在与术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”(或这些词语的任意变体)结合使用时，不使用数量词可能指“一个”，但其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或不止一个”的含义一致。
组合物及其使用方法可“包含”整个说明书中公开的任意成分或步骤，“基本上由”整个说明书中公开的任意成分或步骤“组成”，或“由”整个说明书中公开的任意成分或步骤“组成”。关于过渡表述“基本上由……组成”，在一个非限制性方面，本文公开的细胞构建体的基本和新颖特征在于其在药物化合物的心脏毒性和/或致心律失常筛查测试中的用途，因为它们具有使来源于干细胞的心肌细胞成熟化至类似成熟的天然成体心肌细胞和天然心脏组织的成熟状态的能力。
预期本说明书中讨论的任意实施方案可结合本发明的任意方法或组合物实施，反之亦然。此外，可使用本发明的组合物来实现本发明的方法。
本发明的其他目的、特征和优点将从以下具体实施方式变得显而易见。然而，应理解，具体实施方式和具体实施例虽然指示了本发明的具体实施方案，但仅作为示意给出，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将从该具体实施方式变得显而易见。
附图说明
图1：使用10x物镜在100x倍率下羊水细胞来源的ECM的明场图像的显微照片。
图2：羊水细胞来源的ECM和骨髓细胞来源的ECM的3个代表性40×40um切片的原子力显微照片，示出了形貌、黏附和刚度。
图3：散点图，示出了骨髓细胞和羊水细胞来源的ECM的黏附和刚度(弹性模量)的量化。每个点代表独立的测量点。
图4：显微照片，示出了iPSC在羊水细胞来源的ECM和骨髓细胞来源的ECM上培养的第0天和第2天。
图5：在羊水细胞来源的ECM和骨髓细胞来源的ECM存在下培养的iPSC的生长曲线图。
图6：单孔中AFC-ECM上成熟心肌细胞的显微照片–3.13mm2。
图7：单孔中AFC-ECM上成熟心肌细胞的显微照片–2.15mm2。
图8：单孔中AFC-ECM上成熟心肌细胞的显微照片–1.46mm2。
图9：单孔中AFC-ECM上成熟心肌细胞的显微照片–0.54mm2。
图10：单孔中AFC-ECM上成熟心肌细胞的显微照片–0.54mm2。
图11：单孔中AFC-ECM上成熟心肌细胞的显微照片–0.54mm2。
图12：单孔中AFC-ECM上成熟心肌细胞的显微照片–0.54mm2。
图13：单孔中AFC-ECM上成熟心肌细胞的显微照片–0.13mm2。
图14：单孔中AFC-ECM上成熟心肌细胞的显微照片–0.04mm2。
图15：单孔中标准MatrigelTM ECM上心肌细胞的显微照片–3.13mm2。
图16：单孔中标准MatrigelTM ECM上心肌细胞的显微照片–2.15mm2。
图17：单孔中标准MatrigelTM ECM上心肌细胞的显微照片–1.46mm2。
图18：单孔中标准MatrigelTM ECM上心肌细胞的显微照片–0.54mm2。
图19：单孔中标准MatrigelTM ECM上心肌细胞的显微照片–0.13mm2。
图20：单孔中BM-ECM上成熟心肌细胞的显微照片–2.15mm2。
图21：单孔中BM-ECM上成熟心肌细胞的显微照片–1.46mm2。
图22：在多孔板中使用在AFC-ECM上的成熟心肌细胞记录动作电位或钙瞬态测量的仪器的配置示意图。
图23：基线和药物E4031后，从在MatrigelTM ECM、BM-ECM和AFC-ECM上培养的心肌细胞记录的自发动作电位记录。
图24：与药物E4031接触后，来自在MatrigelTM ECM、BM-ECM和AFC-ECM上培养的心肌细胞的稳定转子(TdP样心律失常)数目的条形图。
图25：对各种药物从在AFC-ECM上培养的成熟心肌细胞记录的自发动作电位记录。
图26：对每个所列药物的所有剂量记录的总心律失常的条形图。
图27：在10倍于每种所列药物的有效治疗血浆浓度(ETPC)下具有心律失常的孔的％的条形图。
图28：每种所列药物的动作电位三角形化(APD90-APD30)以时间(毫秒)表示的条形图。
图29：所列药物中的一些中的每一个的动作电位三角形化(APD90-APD30)以时间(毫秒)表示的条形图，比较了在AFC-ECM(SBS-AF基质)上与在MatrigelTM ECM上的心肌细胞的心肌细胞性能。
图30：所列药物的最大药物诱导动作电位三角形化的条形图，比较了来自Cellular Dynamics的
Figure BDA0003314271920000121
hiPSC-CM(空白圆圈)与来自Ncardia的Cor.
Figure BDA0003314271920000122
hiPSC-CM(黑圈)在所列药物的任意浓度下的心肌细胞性能。图来自Blinova et al,2018,CellReports。
图31：在MatrigelTM ECM与AFC-ECM上培养的hiPSC-CM的显微照片，其中对肌钙蛋白I进行免疫荧光染色，使用DAPI标记细胞核。
图32：在MatrigelTM ECM与AFC-ECM上培养的hiPSC-CM的显微照片，其中对α-辅肌动蛋白进行免疫荧光染色，使用DAPI标记细胞核。
图33：在MatrigelTM ECM与AFC-ECM上培养的hiPSC-CM的显微照片，其中对cTnT和N钙黏蛋白进行免疫荧光染色，使用DAPI标记细胞核。
图34：在MatrigelTM ECM与AFC-ECM上培养的单个hiPSC-CM细胞的显微照片，其中对cTnT进行免疫荧光染色，使用DAPI标记细胞核。
图35：在MatrigelTM ECM与AFC-ECM上培养的单个hiPSC-CM细胞的显微照片，其中对α-辅肌动蛋白进行免疫荧光染色，使用DAPI标记细胞核。
图36：图35中示出的单个细胞的细胞圆度的比较图。
图37：在MatrigelTM ECM与AFC-ECM上培养的hiPSC-CM的显微照片，其中对cTnI表达进行免疫荧光染色，使用DAPI标记细胞核。
图38：在MatrigelTM ECM和AFC-ECM上的hiPSC-CM的cTnI表达和GAPDH的蛋白质印迹。
图39：在MatrigelTM ECM与AFC-ECM上的hiPSC-CM的cTnI表达相对于GAPDH的图。
图40：用MitoTracker Red对线粒体染色的MatrigelTM ECM与AFC-ECM上的hiPSC-CM的显微照片。
图41：该图示出了MatrigelTM ECM与AFC-ECM上hiPSC-CM的MitoTrakerTM Red荧光强度/心肌细胞。
图42：在涂覆在微电极阵列(MEA)板上的MatrigelTM ECM和AFC-ECM上培养的hiPSC-CM的显微照片(透射光)。
具体实施方式
已在培养中在体外来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)上成熟化的人类干细胞来源的心肌细胞，如来源于人类诱导性多潜能干细胞的那些(hiPSC-CM)，已证实比不成熟的hiPSC-CM或在其他ECM如MatrigelTM ECM和骨髓细胞来源的ECM上成熟化的hiPSC-CM具有更好、更一致的心脏毒性和致心律失常测定结果。在AFC-ECM上成熟化的hiPSC-CM出人意料地表现出比在其他ECM如MatrigelTM ECM上和甚至在其他天然细胞来源的ECM如骨髓细胞来源的ECM上成熟化的hiPSC-CM更高的成熟状态，如由它们在正常成人心脏组织的心肌细胞中所见的细胞形态和肌节结构所示。此外，正如蛋白质印迹技术所证实的那样，对在AFC-ECM上培养的hiPSC-CM比在MatrigelTM ECM上培养的hiPSC-CM观察到cTnI(心肌肌钙蛋白I)蛋白的更稳健表达。并且，与在MatrigelTM ECM上培养的hiPSC-CM相比，在AFC-ECM上培养的hiPSC-CM具有更多的线粒体并且线粒体具有更多的极化内膜电位。因此，AFC-EMC可刺激hiPSC-CM中的线粒体生物合成、成熟化和功能运作。正常成人或成熟的人类心脏的人组织以具有肌节结构(条纹外观)的杆状细胞为特征。心肌细胞的形态和肌节结构可通过显微术(透射光或通过免疫荧光染色)以视觉方式识别。作为一个非限制性实例，在AFC-ECM上成熟化的心肌细胞的形态和肌节结构可通过杆状细胞的存在清楚地看到，所述杆状细胞具有由图14的显微照片中的箭头标识的条纹外观。另外，不需要使用有机硅底物如PDMS来取得这些结果。出人意料的是，包含AFC-ECM和已在培养中在AFC-ECM上从不成熟的hiPSC-CM成熟化的成熟心肌细胞的单层的细胞构建体已经证明是有用的，例如，在体外筛查测定中以高的通量允许药物诱导的心律失常如尖端扭转型室速(TdP)的一致可视化。这种“培养皿中的TdP”技术比依赖于场电位持续时间(MEA技术)或动作电位持续时间延长作为药物诱导的TdP的替代标志物是一大进步。因此，本文公开的细胞构建体和方法通过开发更全面并可预测的体外心律失常测定，允许在体外模型中可视化心律失常事件而不是致心律失常的间接指标的简单极化和去极化事件，从而超越了当前的CiPA倡议的指导方针。本公开中概述的细胞系统和方法允许在体外人类心脏单层模型系统中传播和可视化心律失常事件。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM不包括具有独特肌节结构的杆状细胞。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM可以具有比成熟的心肌细胞少的线粒体、具有紊乱的肌丝、具有圆形形状和/或具有单个核为特征。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞可以具有有着独特肌节结构(条纹外观)的杆状细胞为特征。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞还可以具有比不成熟的hiPSC-CM大的量的线粒体、具有有条理的紧凑的肌丝和/或具有两个核(双核)为特征。
本文公开了一种用于使用体外来源于从羊水分离的细胞的细胞来源细胞外基质(AFC-ECM)在培养中使来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞(不成熟的hiPSC-CM)成熟化形成成熟心肌细胞(成熟的hiPSC-CM)的方法。本文还公开了在AFC-ECM上包含这些成熟心肌细胞的单层的细胞构建体，其可用于药物化合物的心脏毒性和/或致心律失常筛查测定。本文还公开了用于使用这样的细胞构建体体外测定药物化合物的心脏毒性和/或致心律失常作用的方法。
A.羊水细胞来源的细胞外基质(AFC-ECM)
围产期细胞可分为三组：来自羊水的细胞；来自胎盘的细胞；和来自脐带的细胞。羊水具有若干细胞来源，包括来源于发育中的胎儿的从胎儿羊膜、皮肤及消化道、呼吸道和泌尿生殖道脱落的细胞。胎盘也有若干细胞来源，包括膜片(羊膜和绒毛膜)、绒毛和血液。脐带细胞通常来自两个来源：脐带血和华顿氏胶。来自这三种围产期来源的细胞可包括干细胞。用于产生本发明的羊水细胞来源的ECM的细胞从哺乳动物的羊水获得，哺乳动物包括但不限于人(智人)、鼠、兔、猫、狗、猪、马或灵长类动物。在优选的实施方案中，细胞来自人的羊水。羊水可源自足月分娩(大于约37周孕龄)或早产(小于约37周孕龄)的人类。早产包括晚期早产(约33周至约37周孕龄)、中度早产(约29周至约33周孕龄)和极早早产(约23周至约29周孕龄)。羊水可源自存在羊水的任意孕龄的分娩前的人，并可与分娩时的羊水来源合并。通常，在分娩前，通过羊膜穿刺术收集羊水。在一些实施方案中，羊水源自足月分娩、早产、晚期早产、中度早产、极早早产或分娩前的人或其组合。在一些实施方案中，羊水源自分娩前并从约10周孕龄直至分娩、或从约10周至约23周孕龄、或从约10周至约16周孕龄、或从约12周孕龄直至分娩、或从约12周至约23周孕龄或约12周至约16周孕龄期间收集。在一些实施方案中，源自分娩前的羊水通过羊膜穿刺术收集。可通过本领域已知的技术，如Murphy et.al.,Amniotic Fluid Stem Cells,Perinatal Stem Cells,Second Ed.2013中公开的那些，来从羊水获得和分离细胞。
羊水由能够自发地或因用本领域技术人员已知的特定生长因子或生长因子的组合处理而分化成来源于所有3个胚胎胚层(外胚层、内胚层、中胚层)的细胞类型的细胞组成。即，单个细胞有能力被诱导表达对三个胚层中的任一个具有特异性的基因。羊水还含有不同细胞类型的混合物，包括来源于发育中的胎儿的从胎儿羊膜、皮肤及消化道、呼吸道和泌尿生殖道脱落的细胞。由于羊水和胎盘膜的起源，故这些细胞可保持高度多能的分化潜能并包含含有所有三个胚层的细胞的细胞群体。羊水细胞可包含干细胞。在一些实施方案中，羊水细胞为分离的干细胞。在一些实施方案中，羊水细胞包含具有分化成来源于所有3个胚胎胚层(外胚层、内胚层、中胚层)和/或多能干细胞和/或多潜能干细胞的细胞类型的能力的干细胞。
本文公开的羊水细胞来源的ECM可包含各种蛋白质。ECM的蛋白质可通过本领域已知的技术来鉴定，并且可以包括质谱法和免疫组织化学染色。ECM可包括但不限于表2中所列的组分(参见下面的实施例1)及其任意变体、衍生物或同种型。羊水细胞来源的ECM可包括表2中的任意组分及其任意变体、衍生物或同种型的任意组合。在一些实施方案中，组合可包含、基本上组成为或组成为：层黏连蛋白、胶原蛋白α-1(XVIII)、基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、集聚蛋白、波形蛋白和胶原蛋白α-2(IV)和/或其同种型。在一些实施方案中，胶原蛋白α-1(XVIII)的同种型为同种型2。在一些实施方案中，集聚蛋白的同种型为同种型6。在一些实施方案中，细胞来源的ECM还包含、基本上组成为或组成为纤维黏连蛋白和/或其同种型。在一些实施方案中，羊水细胞来源的ECM不含核心蛋白聚糖、基底膜蛋白多糖和胶原蛋白(III)中的任一种或全部。表1中描述了本发明的羊水细胞来源的ECM与骨髓细胞来源的基质之间蛋白质的一些值得注意的差异。
表1
羊水细胞来源的ECM(AFC-基质)与骨髓细胞来源的基质(BM-基质)之间的差异
Figure BDA0003314271920000161
羊水细胞来源的ECM可通过以下方法产生：
(a)从羊水分离细胞，
(b)将分离出的细胞接种到细胞培养容器上或涂覆有底物的细胞培养容器上，
(c)向细胞培养容器中加入培养基，和
(d)培养细胞，从而产生细胞来源的ECM，和
(e)任选地对细胞来源的ECM脱细胞。
可使用允许细胞在培养中立即或一段时间后形成融合单层的任意细胞接种密度。在一些实施方案中，接种密度为约10个细胞/cm2至约100000个细胞/cm2，或约100个细胞/cm2至约75000个细胞/cm2，或约500个细胞/cm2至约50000个细胞/cm2，或约500个细胞/cm2至约10000个细胞/cm2，或约500个细胞/cm2至约5000个细胞/cm2，或约500个细胞/cm2至约2500个细胞/cm2，或约1000个细胞/cm2至约25000个细胞/cm2，或约2000个细胞/cm2至约10000个细胞/cm2，或约3000个细胞/cm2至约5000个细胞/cm2。
适合于细胞培养的任意类型的容器均可用于本发明。实例包括但不限于细胞培养瓶、T型瓶、搅拌瓶、旋转瓶、发酵罐和生物反应器。当被置于摇摆平台或振动器上时，摇瓶、振动烧瓶、试管和其他容器也是合适的容器。细胞培养容器可涂覆有底物以允许更好的细胞黏附。用于涂覆细胞容器的合适底物的一个非限制性实例为纤维黏连蛋白。
各种可商购获得的细胞培养基，例如，α最低必需培养基(α-MEM)(Thermo FisherScientific，纽约格兰德岛)，适合于培养羊水细胞。可通过向培养基中添加各种补充物质来改良可商购获得的培养基，例如，碳酸氢钠、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、两性霉素B和/或血清。血清可以是胎牛血清。培养基也可以是无血清的。另外，可向培养基或改良培养基中添加物质如L-抗坏血酸来诱导细胞产生ECM。
初始培养基可在培养过程中的不同时间下更换和/或替换为另一培养基。例如，初始培养基可以是“完全培养基”并然后在培养过程中替换为“诱导培养基”。“完全培养基”的一个非限制性实例含有(α-MEM)加2mM的L-谷氨酰胺加抗生素-抗真菌剂加15％的胎牛血清。“诱导培养基”的一个非限制性实例含有“完全培养基”加50mM的L-抗坏血酸。
羊水细胞的培养可在37℃、5％CO2和90％湿度的孵育箱中进行。培养可在各种环境条件下进行，包括但不限于常氧条件，即大气中20％至21％的氧气，或低氧条件。
使羊水细胞来源的ECM脱羊水细胞可包括去除存活的羊水细胞或使羊水细胞不存活。可通过使用本领域已知的方法从ECM脱羊水细胞，并可包括但不限于裂解羊水细胞然后通过洗涤去除裂解的羊水细胞。可使用各种物质来从ECM去除羊水细胞。非限制性实例包括在PBS缓冲液中含有TRITON X-100和氢氧化铵的“提取缓冲液”。在ECM已被脱羊水细胞后，所产生的ECM由此基本上不含细胞或不含存活的羊水细胞。如果使用了饲养细胞，则脱细胞方法也适用于ECM上存在的任意存活的饲养细胞，从而产生基本上不含或不含存活的饲养细胞的ECM。脱细胞方法还适用于ECM上存在的任意存活的细胞，从而产生基本上不含或不含任意存活的细胞的ECM。因此，经脱细胞的ECM意味着该ECM是无细胞的，这意味着该ECM不含任意存活的细胞。
在一些实施方案中，羊水细胞来源的ECM(AFC-ECM)是三维的(3D)ECM。
上文描述的方法也适用于从其他围产期细胞产生细胞来源的ECM，所述其他围产期细胞如来自脐带的细胞，包括脐带血和华顿氏胶；和来自胎盘组织的细胞，包括膜片(羊膜和绒毛膜)、绒毛和血液。
在一个实施方案中，围产期细胞来源的ECM通过以下方法产生：
(a)从脐带分离细胞，
(b)将分离出的细胞接种到细胞培养容器上或涂覆有底物的细胞培养容器上，
(c)向细胞培养容器中加入培养基，和
(d)培养细胞，从而产生细胞来源的ECM，和
(e)任选地对细胞来源的ECM脱细胞。
在一些实施方案中，从脐带分离出的细胞来自脐带血和/或华顿氏胶。
在另一个实施方案中，围产期细胞来源的ECM通过以下方法产生：
(a)从胎盘组织分离细胞，
(b)将分离出的细胞接种到细胞培养容器上或涂覆有底物的细胞培养容器上，
(c)向细胞培养容器中加入培养基，和
(d)培养细胞，从而产生细胞来源的ECM，和
(e)任选地对细胞来源的ECM脱细胞。
在一些实施方案中，从胎盘组织分离出的细胞来自膜片(羊膜和/或绒毛膜)、绒毛和/或血液。
在一个方面，公开了一种体外来源于从脐带分离的细胞的细胞来源的细胞外基质(ECM)。在一些实施方案中，从脐带分离出的细胞来自脐带血和/或华顿氏胶。
在另一个方面，公开了一种体外来源于从胎盘组织分离的细胞的细胞来源的细胞外基质(ECM)。在一些实施方案中，从胎盘组织分离出的细胞来自膜片(羊膜和/或绒毛膜)、绒毛和/或血液。
B.细胞构建体和使不成熟的hiPSC-CM成熟化的方法
本文公开了一种用于使来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞成熟化的方法，所述方法包括：(a)提供来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞(不成熟的hiPSC-CM)；(b)提供体外来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)；(c)使不成熟的hiPSC-CM与AFC-ECM接触；和(d)在培养基中用AFC-ECM培养所述不成熟的hiPSC-CM以诱导所述不成熟的hiPSC-CM的成熟化，从而形成成熟的心肌细胞(成熟的hiPSC-CM)；其中所述成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构的杆状细胞为特征。正常成人心脏组织以具有肌节结构(条纹外观)的杆状细胞为特征。心肌细胞的形态和肌节结构可通过显微术以视觉方式识别。作为一个非限制性实例，在AFC-ECM上成熟化的心肌细胞的形态和肌节结构可通过杆状细胞的存在清楚地看到，所述杆状细胞具有由图14的显微照片中的箭头标识的条纹外观。
本文还公开了一种细胞构建体，其在来源于从羊水体外分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)上包含成熟心肌细胞的单层，其中所述成熟的心肌细胞为AFC-ECM培养的来源于人类诱导性多潜能干细胞的心肌细胞(hiPSC-CM)，并且其中所述成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构的杆状细胞为特征。在某些方面，成熟的心肌细胞可在培养中在AFC-ECM上从来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞(不成熟的hiPSC-CM)成熟化，其中所述成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构的杆状细胞为特征。在一些方面，成熟的心肌细胞包括内向整流Kir2.1钾通道和/或表达内向整流钾通道Kir2.1。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞的单层排列在AFC-ECM上。在一些实施方案中，构建体上存在纤维轨迹。在一些实施方案中，AFC-ECM包含层黏连蛋白、胶原蛋白α-1(XVIII)、基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、集聚蛋白、波形蛋白和胶原蛋白α-2(IV)和/或其同种型。在一些实施方案中，胶原蛋白α-1(XVIII)的同种型为同种型2，和/或其中集聚蛋白的同种型为同种型6。在一些实施方案中，AFC-ECM还包含纤维黏连蛋白和/或其同种型。在一些实施方案中，AFC-ECM不含核心蛋白聚糖、基底膜蛋白多糖和/或胶原蛋白(III)。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM不包括具有独特肌节结构的杆状细胞。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM可以具有比成熟的心肌细胞少的线粒体、具有紊乱的肌丝、具有圆形形状和/或具有单个核为特征。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞还可以具有比不成熟的hiPSC-CM大的量的线粒体、具有有条理的紧凑的肌丝和/或具有两个核(双核)为特征。
本文还公开了一种用于制备在体外来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)上包含成熟的心肌细胞的细胞构建体的方法，所述方法包括：(a)提供来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞(不成熟的hiPSC-CM)；(b)提供体外来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)；(c)将不成熟的hiPSC-CM接种在AFC-ECM上；和(d)在培养基中在AFC-ECM上培养所接种的不成熟的hiPSC-CM以诱导所述不成熟的hiPSC-CM成熟化为成熟的心肌细胞并在AFC-ECM上形成成熟的心肌细胞的单层，从而形成细胞构建体，其中所述成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构的杆状细胞为特征。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞的单层排列在AFC-ECM上。在一些实施方案中，构建体上存在纤维轨迹。
不成熟的hiPSC-CM可从商业来源获得，如从Cellular Dynamics International-FUJI以商品名
Figure BDA0003314271920000201
获得和从Takara Bio以商品名
Figure BDA0003314271920000202
获得。
Figure BDA0003314271920000203
心肌细胞、
Figure BDA0003314271920000204
心肌细胞2和
Figure BDA0003314271920000205
心肌细胞是可得到的在小瓶中的来源于人类诱导性多潜能干细胞(hiPSC)的低温保存的存活的心肌细胞。也可在实验室环境中针对特定个体从患者特异性hiPSC生成不成熟的hiPSC-CM。在这种情况下，hiPSC的分化可使用小分子方案来实现以到第8天至第10天时获得跳动的心肌细胞，其中在为期7天的分化期期间的不同天使用GSK3抑制剂、RPMI/B27减去胰岛素、Wnt抑制剂和RPMI/B27加上胰岛素。生成不成熟的hiPSC-CM的方法的合适的非限制性实例在美国公开2015/0329825中有公开，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM不表达内向整流钾通道Kir2.1。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM不包括具有独特肌节结构的杆状细胞。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM可以具有比成熟的心肌细胞少的线粒体、具有紊乱的肌丝、具有圆形形状和/或具有单个核为特征。
AFC-ECM可使用本公开中公开的制备方法获得并可具有如本公开中所描述的特征。在一些实施方案中，AFC-ECM在与不成熟的hiPSC-CM接触之前被脱细胞。
在与AFC-ECM接触时，不成熟的hiPSC-CM可在悬浮体中，或者可将细胞直接接种到在合适的细胞培养容器中或上或在多孔板中的AFC-ECM上。合适的多孔板的非限制性实例包括6-、12-、24-、48、96-和384-孔板。在一些实施方案中，在形成AFC-ECM之前，将细胞培养容器或多孔板的接触表面涂覆以聚二甲基硅氧烷(PDMS)。在一些实施方案中，在形成AFC-ECM之前，不将细胞培养容器或多孔板的接触表面涂覆以PDMS。可使用不成熟hiPSC-CM的任意细胞接种密度。在一些实施方案中，使用允许细胞在培养中立即或一段时间后形成融合单层的不成熟hiPSC-CM的细胞接种密度。可根据需要改变细胞密度以改善单层的形成。在多孔板中，将不成熟的hiPSC-CM细胞放置在每个孔的中心。各种多孔板中不成熟hiPSC-CM的细胞接种密度的非限制性实例如下：在6孔板中，每孔可接种约200000个细胞；在12孔板中，每孔可接种约150000个细胞；在24孔板中，每孔可接种约175000个细胞；在48孔板中，每孔可接种约100000个细胞；在96孔板中，每孔可接种约50000个细胞；在384孔板中，每孔可接种约15000个细胞。在一些实施方案中，不成熟hiPSC-CM的细胞接种密度为在96孔板中每孔约50000个细胞。在一些实施方案中，细胞接种密度为在6孔板中每孔约200000个细胞。为了诱导不成熟的hiPSC-CM的成熟化，向与AFC-ECM接触的不成熟的hiPSC-CM中添加合适的培养基如RPMI培养基或Media 199培养基，并使用标准细胞培养技术与AFC-ECM一起培养细胞一段时间，通常7天，直至细胞成熟化为与天然成体心肌细胞具有相似形态的成熟心肌细胞。在最初的3天至4天内，不成熟的hiPCS-CM会黏附，从而形成连续的单层，并开始成熟化过程。出人意料的是，心肌细胞成熟化的时间段可能为7天或短于7天，而使用其他底物时通常远更长的时间段是典型的，例如长达100天。这些成熟心肌细胞的形态可以具有独特肌节结构(条纹外观)的杆状细胞为特征，肌节结构是肌肉的基本收缩单位，可使用常规的光学显微镜技术可视化。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞还可以具有比不成熟的hiPSC-CM大的量的线粒体、具有有条理的紧凑的肌丝和/或具有两个核(双核)为特征。并且，AFC-ECM可自然地产生成熟心肌细胞遵循的纤维轨迹。这使更接近地模拟天然心脏的单层产生一定程度的各向异性。因此，在AFC-ECM的形成期间已由羊水细胞按天然的各向异性构型铺设而排列AFC-ECM后，心肌细胞可在AFC-ECM上自然地排列。在各种实施方案中，不成熟的hiPSC-CM在培养中变成熟的时间段可为4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、25天、30天、40天、50天、60天、70天、80天、90天、100天、110天或120天。优选地，心肌细胞成熟化的时间段为14天，或更优选地10天，或甚至更优选地7天。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM在培养中变成熟的时间段为7天。在一些实施方案中，将不成熟的hiPSC-CM接种在AFC-ECM上。在一些实施方案中，在培养过程中，成熟的心肌细胞在AFC-ECM上形成为融合单层，从而形成在AFC-ECM上包含成熟心肌细胞的单层的细胞构建体。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞排列在AFC-ECM上。在一些实施方案中，将不成熟的hiPSC-CM接种在多孔板中的AFC-ECM上。在一些实施方案中，多孔板具有聚二甲基硅氧烷(PDMS)的插入物。在一些实施方案中，多孔板不具有PDMS的插入物。
C.用于测定药物化合物的心脏毒性和/或致心律失常作用的方法
本文公开了一种体外测定药物化合物的心脏毒性和/或致心律失常作用的方法，所述方法包括使药物化合物与整个说明书中公开的细胞构建体中的任一种的成熟心肌细胞接触，并观察成熟心肌细胞的电生理学的一个或多于一个变化以确认药物化合物是否对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用。成熟心肌细胞的电生理学的一个或多于一个变化表明并证实药物化合物对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用。成熟心肌细胞的电生理学的一个或多个变化可包括但不限于APD延长、APD延长加转子和/或各种类型的心律失常，如快速心律失常(TA)、静止(Q)、迟后去极化(DAD)和/或早后去极化(EAD)。在一些实施方案中，成熟心肌细胞的电生理学的变化为动作电位持续时间(APD)的延长。在一些实施方案中，成熟心肌细胞的电生理学的变化为早后去极化(EAD)。在一些实施方案中，成熟心肌细胞的电生理学的变化为迟后去极化(DAD)。在一些实施方案中，成熟心肌细胞的电生理学的变化为动作电位持续时间(APD)加转子。在一些实施方案中，成熟心肌细胞的电生理学的变化为心律失常。在一些实施方案中，成熟心肌细胞的电生理学的变化为快速心律失常(TA)。在一些实施方案中，成熟心肌细胞的电生理学的变化为静止(Q)。观察还可包括细胞活力、细胞密度和/或细胞形态。在一些方面，细胞构建体可通过包括以下的方法来制备：(a)提供来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞(不成熟的hiPSC-CM)；(b)提供体外来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)；(c)将不成熟的hiPSC-CM接种在AFC-ECM上；和(d)在培养基中在AFC-ECM上培养所接种的不成熟的hiPSC-CM以诱导所述不成熟的hiPSC-CM成熟化为成熟的心肌细胞并在AFC-ECM上形成成熟的心肌细胞的单层，从而形成细胞构建体，其中所述成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构的杆状细胞为特征。在其他方面，方法可包括使药物化合物与整个说明书中公开的细胞构建体中的任一种接触并观察心脏毒性和/或致心律失常事件。在一种特别的情况下，方法包括：(a)提供来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞(不成熟的hiPSC-CM)；(b)提供体外来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)；(c)将不成熟的hiPSC-CM接种在AFC-ECM上；(d)在培养基中在AFC-ECM上培养所接种的不成熟的hiPSC-CM以诱导所述不成熟的hiPSC-CM成熟化为成熟的心肌细胞并在AFC-ECM上形成成熟的心肌细胞的单层，从而形成细胞构建体；(e)使药物化合物与构建体的成熟心肌细胞的单层接触；和(f)观察成熟心肌细胞的电生理学的变化以确认药物化合物是否对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用；其中所述成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构的杆状细胞为特征。在一些实施方案中，将不成熟的hiPSC-CM接种在多孔板中的AFC-ECM上。在一些实施方案中，多孔板具有聚二甲基硅氧烷(PDMS)的插入物。在一些实施方案中，多孔板不具有PDMS的插入物。在一些实施方案中，不成熟的hiPSC-CM不表达内向整流钾通道Kir2.1。在一些实施方案中，成熟的心肌细胞的单层排列在AFC-ECM上。在一些实施方案中，细胞构建体上存在纤维轨迹。
心脏毒性和/或致心律失常测试可使用适合于测量这样的活动的任意类型的设备进行。在一些实施方案中，成熟心肌细胞的单层在AFC-ECM上的细胞构建体如上文所述制备。在成熟化过程(通常为7天或短于7天)后，使用读板器观察每个孔的电生理学。向每个孔中加载合适的电压敏感或钙敏感荧光染料。非限制性的电压敏感染料包括可从ThermoFisher商购获得的FluoVoltTM 染料。在一些实施方案中，读板器可依赖于与合适的照明相结合的合适的高时空CCD相机，所述合适的照明有如激发每种染料所适宜的波长的发光二极管(LED)。这样的高时空CCD相机可从SciMeasure商购获得。在一些实施方案中，相机图像采集速率大于或等于150帧每秒。在一些实施方案中，相机和镜头组合设计为使得其允许以足够的分辨率同时可视化多孔板的所有孔以观察动作电位和钙波传播。将每个板居中于相机系统下方，打开照明，开始相机采集并记录电生理学活动。实验在约37℃下进行。在获得基线读数后，将待测试的药物加到孔中并记录影响。记录自发活动达足够长的时间以获得图像，例如至少10秒。图像可存储在计算机上。分析图像并可使用图像分析软件量化动作电位持续时间、传导速度、搏动率和激活模式。电波模式的可视化对于药物化合物引起潜在致命性心律失常如尖端扭转型室速(TdP)的作用的测定很重要。因此，除了提供关于化合物对自发动作电位持续时间的影响的信息外，本文公开的方法还可提供关于脉冲传导速度和激活模式的信息，具体取决于所用设备的类型。
D.扩增/增殖哺乳动物干细胞的方法
本文还公开了使用体外来源于从羊水分离的细胞的细胞来源细胞外基质(AFC-ECM)用于哺乳动物细胞的分离、维持和扩增/增殖的方法。在所有细胞生物学以及再生医学和组织工程的发展领域中，体外细胞培养可能是最普遍、最重要但缺乏了解的方面。首先，其允许观察细胞行为，以便可详细研究细胞功能的各个方面。其次，其允许增加特定细胞团的数量。对于基础研究以及许多临床应用，都需要从少量生物样本获得大量相对稀有的细胞。体外细胞培养允许在身体外扩增少量细胞以获得更多相关的数量。最后，其允许存储细胞以备后用。通过体外扩增细胞数量并冷冻活细胞以备后用，相对较小的生物样本可在数天、数月或甚至数年的时间内为多个实验产生细胞。
尽管细胞培养无处不在，但体外培养对细胞的天然特性的影响仍相对缺乏了解。许多当前的实践并非源于深思熟虑、规划和实验，而是源于偶然的观察。哺乳动物细胞培养始于20世纪早期，在1911年，Alexis Carrel和Montrose Burrows首次发表了一篇关于体外哺乳动物组织培养的学术论文。他们通过切割哺乳动物组织的切片并将切片置于显微镜载玻片上来研究组织的生理学和解剖学。然后他们注意到一些细胞从组织中迁移到载玻片上。他们接着描述了永久培养细胞的技术。现在看来，他们的一些观察结果可能无效，但他们的工作为现代细胞培养铺平了道路。
在发现造血干细胞(HSC)之后，全世界的团体都开始研究(HSC)。在其培养(悬浮)期间，观察到骨髓细胞的亚群黏到塑料烧瓶的底部并开始增殖。后来认识到这些细胞不同于HSC，并最终被称为间充质干细胞(MSC)。由于这种偶然的观察导致了MSC的发现，故塑料黏附仍被广泛用作MSC和许多其他哺乳动物细胞类型的定义属性。
在塑料底物上培养细胞的做法可能成问题，因为现在在文献中广为接受的大量证据表明了微环境在调节细胞功能中的关键作用。微环境已被证实有助于指导干细胞和祖细胞的分化，并调节成熟细胞类型的行为。
当从其天然环境取出细胞以进行体外扩增时，它们会从其周围的细胞外基质或微环境失去重要线索，这些线索将关于其周围环境的组成和状态的重要信息传递给细胞。细胞微环境的变化会对这些细胞的行为产生深远的影响。体外分离和扩增大多数贴壁细胞的当前标准是将细胞置于由聚苯乙烯(塑料)组成的培养容器中。聚苯乙烯可能已经以某种方式进行了处理以促进细胞附着和生长，但在大多数情况下，表面对细胞来说是完全陌生的。在其他情况下，表面可能被涂覆以单独的基质蛋白(例如，纤维黏连蛋白或胶原蛋白)或某些蛋白质组合。这些简单的底物无视天然微环境的复杂性以及微环境在正常细胞功能中的关键作用。细胞将立即开始以与细胞在其天然环境中时大不相同的方式对这种陌生环境做出反应。
目前采用五大方法来解决这种在塑料底物上培养细胞的问题：
1.忽略问题-不是尝试取得与体内预期的功能相匹配的期望功能，而是可在各种培养基中测试多种细胞类型以找到在没有适宜的基质底物的情况下表现出特定的期望功能的细胞。这种方法并不复杂，但由于变量之间复杂的相互影响以及细胞与细胞外基质之间相互作用的广度，故经常无法产生期望的结果。
2.找出关键组分-许多学术实验室和若干公司采取了考虑自其分离细胞的组织并寻找该组织中对于细胞功能可能很重要的独特要素的方法。然后在由仅一种或几种基质组分组成的简单底物上培养细胞。这种方法经常失败，因为基质自然是非常复杂的环境，在一些情况下包含超过一百种不同的蛋白质。细胞对它们需要但无法接收到的信号与它们不需要但确实接收到的信号作出同样强烈的反应。
3.霰弹枪法-蛋白质凝胶如MATRIGELTM 的使用采用一种霰弹枪法。创建一种凝胶，其含有许多不同的基质蛋白质，希望其含有许多不同细胞类型所需的结合基序。这种方法可能因提供将细胞推向特定方向的线索或未能提供细胞所期望的所有线索而失败。
4.组织来源的基质-这是一种仿生方法，通常涉及从基因上相似的动物分离目标组织，以物理方式破坏或以化学方式消化该组织以获得溶液或均匀悬浮液，并然后用经解构的组织涂覆培养容器。例如，希望培养卫星细胞的人可能会收集肌肉，将组织匀浆，并然后在接种细胞之前在经匀浆的肌肉中涂覆培养容器。由于一些原因，这种方法经常失败。首先，即使在特定的组织类型内，干细胞/祖细胞生态位也可能与组织的其余部分不同。简单地将肌肉匀浆并不能保证产生适宜的生态位。其次，除了生化线索外，生态位还包括结构和物理线索。即使组织匀浆液中存在许多/大多数生化线索，但结构已被破坏，故细胞可能感知到非常不同的机械线索。最后，组织来源的基质的可制造性取决于组织的可得性。这会影响可能的细胞培养总量并导致批次间的变异性。
5.细胞来源的基质-可诱导培养中的细胞在其培养容器中分泌基质。该基质是体内生态位可获得的最佳逼近，并可体外制造。可在体外诱导细胞形成基质，然后可随后从基质去除细胞，例如通过使用非离子去污剂以保留基质的结构和化学。这种方法有若干关键优势。(1)基质结构可重新创建并不受干扰。(2)基质可根据目标组织/细胞类型来定制。(3)基质对于干细胞和祖细胞生态位可以是特异性的。(4)基质可大量制造。
关于细胞来源的基质，并非所有细胞类型都可在任意给定的细胞来源的基质上有效地分离和扩增。事实上，与其他类型的细胞相比，多潜能干细胞(PSC)对支持性生长底物的需求似乎大不相同。已知用于产生基质的特定细胞类型会对基质的组成和因此各种细胞类型对该基质的反应产生影响(参见Marinkovic,M.et al.,One size does not fit all:developing a cell-specific niche for in vitro study of cell behavior.MatrixBiol.54–55,426–441(2016))。US 8084023中公开的先前工作描述了由骨髓基质或间充质干细胞产生的细胞外基质的产生和组成(也参见Chen,X.et al.,Extracellular MatrixMade by Bone Marrow Cells Facilitates Expansion of Marrow-Derived MesenchymalProgenitor Cells and Prevents Their Differentiation into Osteoblasts.Journalof Bone and Mineral Research 22,1943–1956(2007)和Lai,Y.et al.,Reconstitutionof marrow-derived extracellular matrix ex vivo:a robust culture system forexpanding large-scale highly functional human mesenchymal stem cells.Stemcells and development 19,1095–107(2010))。这种骨髓细胞来源的基质已被证明会支持其他MSC的扩增，但对其他类型干细胞的附着和生长无效，特别是诱导性多潜能干细胞(iPSC)。iPSC已表现出从比MSC远更广泛的类别形成细胞和组织的更大潜力。这是一个特别有趣的挑战，因为在标准培养条件下生长iPSC的融合单层的困难使得从iPSC产生细胞来源的基质是不切实际的。先前的细胞来源基质的主要限制在于，为了制备组织特异性基质(例如，来自骨髓MSC的骨髓基质、来自脂肪MSC的脂肪基质或来自hUVEC的内皮基质)，有必要使目标细胞群体已经能够黏附到起始底物上。iPSC、胚胎干细胞(ES)和许多其他细胞类型的困难在于它们不容易黏附到简单的底物上。
本公开提供了一种在与支持多潜能干细胞(PSC)的分离、扩增和增殖的细胞来源细胞外基质(ECM)相关的领域中的上述限制和缺陷中的至少一些的解决方案，所述多潜能干细胞包括但不限于诱导性多潜能干细胞(iPSC)和胚胎干细胞(ES)。所述解决方案以羊水细胞来源的细胞外基质的使用为前提。见于羊水中的未定型、易贴壁和高度增殖性的围产期细胞的使用允许产生出人意料地支持这些PSC的黏着、分离、扩增和增殖的细胞外基质(ECM)。使用现有技术的细胞来源的ECM不可能实现这一技术成就。
哺乳动物细胞的功能在很大程度上取决于它们所在的环境，例如细胞外基质。它们会对其环境中存在的信号(正信号)以及需要但不存在的信号(负信号)作出反应。未定型的干细胞很可能会产生这样的基质，其含有维持干细胞活力和干细胞特性所必需的生态位基序，但缺乏许多更成熟的细胞会分泌的谱系特异性信号，这些信号会推动干细胞走向特定的命运。不受理论束缚，但据称较不成熟的细胞，例如围产期细胞或围产期干细胞，可能产生与本领域先前公开的ECM如骨髓基质细胞来源的ECM不同的ECM，并可允许比间充质干细胞(MSC)具有更高潜能的干细胞如多潜能干细胞(PSC)的更好分离和扩增/增殖。质谱分析表明，与先前已知的细胞来源的ECM相比，本发明的羊水细胞来源的ECM含有在所有3个胚层中发现的基质蛋白质并缺乏与成骨谱系密切相关的特定蛋白质。而且，本公开的ECM含有已知会促进多潜能细胞黏着和扩增的特定基序，如层黏连蛋白。
多潜能干细胞(PSC)可自我更新并分化成三个胚层：外胚层、内胚层和中胚层中的任一个，所有组织和器官都从这些胚层发育而来。胚胎干细胞(ES)是目前唯一已知的天然多潜能干细胞。诱导性多潜能干细胞(iPSC)也是PSC。iPSC来源于通常取自成体组织的细胞或成体细胞，并重编程到胚胎干细胞的水平。用于产生iPSC的方法是本领域已知的。
扩增/增殖多潜能干细胞(PSC)的方法包括获得PSC并在本发明的羊水细胞来源的ECM的存在下培养它们。PSC可以是iPSC或ES。可使用允许细胞在培养中立即或一段时间后形成融合单层的任意接种密度。在一些实施方案中，接种密度为约10个细胞/cm2至约100000个细胞/cm2，或约100个细胞/cm2至约75000个细胞/cm2，或约500个细胞/cm2至约50000个细胞/cm2，或约500个细胞/cm2至约10000个细胞/cm2，或约500个细胞/cm2至约5000个细胞/cm2，或约500个细胞/cm2至约2500个细胞/cm2，或约1000个细胞/cm2至约25000个细胞/cm2，或约2000个细胞/cm2至约10000个细胞/cm2，或约3000个细胞/cm2至约5000个细胞/cm2。
在一些实施方案中，PSC保持在未分化状态并保持其干细胞特性。适合于培养中的PSC的增殖的细胞培养技术是本领域已知的。用于干细胞增殖的合适的可商购获得的培养基包括但不限于可自Miltenyl Biotec获得的StemMACSTM iPS-Brew XF。在一些实施方案中，不使用Rock抑制剂。细胞开始接近融合后(例如，如通过明场显微镜所确定)，可手动进行细胞传代，做法是将大的菌落切割成较小的菌落，然后通过以物理方式将它们从培养皿中取出并将它们置于羊水细胞来源的ECM的新板上来重新接种。此程序可无限重复。在一些实施方案中，公开了一种在培养中增殖多潜能干细胞(PSC)的方法，所述方法包括在培养基中存在细胞来源的细胞外基质(ECM)的情况下培养PSC，从而增殖PSC，其中所述细胞来源的ECM体外来源于从羊水分离的细胞。
上文描述的扩增/增殖PSC的方法也适用于在其他围产期细胞来源的ECM的存在下在培养中扩增/增殖PSC的用途。在一些实施方案中，公开了一种在培养中增殖多潜能干细胞(PSC)的方法，所述方法包括在培养基中存在细胞来源的细胞外基质(ECM)的情况下培养PSC，从而增殖PSC，其中所述细胞来源的ECM体外来源于从脐带或胎盘组织分离的细胞。在一些实施方案中，从脐带分离出的细胞来自脐带血和/或华顿氏胶。在其他实施方案中，从胎盘组织分离出的细胞来自膜片(羊膜和/或绒毛膜)、绒毛和/或血液。
实施例
包括以下实施例以说明本发明的某些非限制性方面。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表了本申请人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可对所公开的具体实施方案作许多改变并仍获得类似或相似的结果。
实施例1-羊水细胞来源的ECM(AFC-ECM)的产生
使用以下程序制备四种羊水细胞来源的ECM(基质A、基质B、基质C和基质D)：将从所收集的由4位供体足月分娩(>37周孕龄)的羊水无菌分离的细胞接种到涂覆了纤维黏连蛋白的经组织培养物处理的烧瓶上，并在完全培养基中于37℃、5％CO2和90％RH下在孵育箱中培养。完全培养基为α最低必需培养基(aMEM)加2mM的L-谷氨酰胺加抗生素-抗真菌剂加15％的胎牛血清。
在第3天至第4天，从烧瓶吸出一半的完全培养基并用一半新的完全培养基替换。将烧瓶放回在与上述相同条件下的孵育箱中。
在第7天至第8天，从培养瓶吸出完全培养基并补充以诱导培养基。将烧瓶放回在与上述相同条件下的孵育箱中。诱导培养基为完全培养基加50mM的L-抗坏血酸。
在第10天至第11天，从培养瓶吸出诱导培养基，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将烧瓶内已形成的ECM洗涤一次。然后从烧瓶吸出PBS。向烧瓶中添加提取缓冲液并在室温下孵育7分钟至10分钟以使每种ECM脱细胞，然后从烧瓶吸出提取缓冲液。提取缓冲液为含有0.5％(体积/体积)TRITON-X100和20mM氢氧化铵(NH4OH)的PBS。
将烧瓶中的每种经脱细胞的ECM用PBS洗涤三次，然后用无菌水洗涤一次，并然后从烧瓶吸出无菌水。让烧瓶中的四种经脱细胞的ECM在室温下干燥并然后在4℃下储存。
图1中示出了使用10x物镜在100x倍率下羊水细胞来源的ECM(基质B)的明场图像的显微照片。图2中示出了羊水细胞来源的ECM(基质B)和骨髓细胞来源的ECM的3个代表性40×40um切片的原子力显微照片，示出了形貌、黏附和刚度。骨髓细胞来源的和羊水细胞来源的ECM在结构和物理上不同。骨髓细胞来源的和羊水细胞来源的ECM的黏附和刚度(弹性模量)的量化显示，相对于羊水ECM，骨髓ECM的刚度高10倍，黏附低3倍，如图3a(黏附)和图3b(刚度)的散点图中所示，其中BM＝骨髓细胞来源的ECM，AD＝羊水细胞来源的ECM(基质B)。每个点代表独立的测量点。
实施例2-羊水细胞来源的ECM的组成
通过质谱法确定实施例1中产生的每种羊水细胞来源的ECM的组成。表2中列出了组分及其谱图计数和分子量。
表2
羊水细胞来源的ECM(AFC-ECM)的组分
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Figure BDA0003314271920000881
Figure BDA0003314271920000891
实施例3-iPSC在羊水细胞来源的ECM上的增殖
使用以下程序让诱导性多潜能干细胞(iPSC)在来自实施例1的羊水细胞来源的ECM(基质B)上增殖：使用37℃水浴解冻可商购获得的低温保存的iPSC。将细胞悬浮液稀释到用于干细胞增殖的可商购获得的培养基(Miltenyi Biotec MACS iPS Brew)中，并在具有2mL培养基/孔的6孔板中以大约1000个细胞/cm2接种到ECM上。不使用Rock抑制剂。在第1天，从培养中的细胞轻轻吸出全部体积的培养基并更换为新鲜培养基。每24小时用新鲜培养基替换全部培养基。细胞开始接近汇合后(如通过明场显微镜所确定的)，人工进行细胞传代，使用无菌针将大的菌落切割成大约100个较小的菌落，然后用无菌针以物理方式将它们从培养皿中取出并将它们置于ECM的新板上来重新接种。此程序可无限重复。
图4中示出了显微照片，该显微照片示出了iPSC在羊水细胞来源的ECM和骨髓细胞来源的ECM上培养的第0天和第2天。
图5中示出了在羊水细胞来源的ECM和骨髓细胞来源的ECM存在下培养的iPSC的iPSC菌落生长曲线图。
如图4和图5中可见，iPSC在羊水细胞来源的ECM存在下在培养中增殖，而在骨髓细胞来源的ECM存在下培养的iPSC没有生长。
实施例4–成熟心肌细胞在AFC-ECM上的细胞构建体的制备和不成熟的hiPSC-CM在AFC-ECM上的成熟化
使用以下方法制备在来源于体外羊水来源的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)上包含成熟心肌细胞的单层的细胞构建体。
使用如实施例1中所概述的方法，在96孔板中制备AFC-ECM(未使用有机硅插入物)。使用标准细胞培养技术，将可商购获得自Cellular Dynamics International-FUJI的不成熟hiPSC-CM(
Figure BDA0003314271920000902
心肌细胞)接种到AFC-ECM上。将不成熟的hiPSC-CM以每孔50000个细胞(96孔板)或每孔200000个细胞(6孔板)的密度接种，并在RPMI培养基中培养7天以在AFC-ECM上形成成熟心肌细胞的融合单层，从而形成成熟心肌细胞单层在AFC-ECM上的细胞构建体。
在7天期间，观察到不成熟的hiPSC-CM成熟化为成熟的天然成体心肌细胞的形态和排列，如以具有独特肌节结构的杆状细胞为特征。出于比较的目的，也在96孔板中接种
Figure BDA0003314271920000901
不成熟hiPSC-CM(未使用有机硅插入物)并以类似的方式在标准的MatrigelTM ECM上和如通过美国专利8084023中所公开的方法制备的骨髓细胞来源的ECM(BM-ECM)上培养，该专利通过引用并入本文。研究结果示于图6至图21中心肌细胞在不同ECM上的显微照片中。
如图6至图14中可见，AFC-ECM上的心肌细胞是成熟的杆状细胞，具有类似天然成体心肌细胞的独特肌节结构。在AFC-ECM上成熟化的心肌细胞的形态和肌节结构可通过杆状细胞的存在清楚地看到，所述杆状细胞具有由图14的显微照片中的箭头标识的条纹外观。这些图示出了AFC-ECM上纤维轨迹的存在，并还示出成熟心肌细胞的单层与AFC-ECM对齐，这与在天然成体心肌细胞和天然心肌组织中发现的特征非常相似。相比之下，如图15至图19和图20至图21中可见，在标准MatrigelTM ECM和BM-ECM上的心肌细胞分别类似于胎儿样心肌细胞而不具有天然成体心肌细胞或天然心肌组织的特征。
因此，在AFC-ECM上培养的不成熟hiPSC-CM比在标准MatrigelTM ECM或来自骨髓细胞的天然细胞来源的ECM上培养的不成熟hiPSC-CM达到了更高的成熟状态。很明显，hiPSC-CM形态受不同ECM的影响不同。
实施例5–使用成熟心肌细胞在AFC-ECM上的细胞构建体进行药物的高通量心脏毒性筛查测试
如实施例4中所述，使用96孔板(未使用有机硅插入物)制备成熟心肌细胞的单层在AFC-ECM上的细胞构建体。在7天的成熟化过程后，使用读板器使用以下高通量筛选方法观察每个孔的电生理学。将在Hanks平衡盐溶液中的FluoVoltTM 染料加载到每个孔中。使用与发光二极管(LED)相结合的高时空CCD相机(SciMeasure DaVinci camera)，如图22中的示意图所示。相机和镜头组合设计为使得其允许以足够的分辨率同时可视化96孔板的所有孔以观察动作电位和钙波传播。将每个板居中于相机系统下方，打开照明，开始相机采集并记录电生理学活动。实验在约37℃下进行。记录自发活动达至少10秒并将图像存储在计算机上。在获得基线读数后，向每个孔中添加500nM的药物E4031(hERG通道阻滞剂)。分析图像并使用图像分析软件量化动作电位持续时间、传导速度、搏动率和激活模式。出于比较的目的，在96孔板中(未使用有机硅插入物)在标准MatrigelTM ECM和骨髓细胞来源的ECM(BM-ECM)上如实施例4中所述培养不成熟的hiPSC-CM，并以与AFC-ECM研究相似的方式分析500nM的药物E4031(hERG通道阻滞剂)。E4031测试的结果示于图23和图24中。如图23中可见，记录的来自MatrigelTM ECM和BM-ECM上的心肌细胞的自发动作电位记录显示，药物E-4031仅引起动作电位持续时间(APD)延长；然而，在AFC-ECM上的成熟心肌细胞上，药物E-4031导致了APD延长加转子(TdP样心律失常)，这样的心律失常激活模式与已知在人类TdP病例中会发生的一致。因此，所有三种ECM都产生了反应预测的APD延长的心肌细胞单层，但只有AFC-ECM产生了显示APD延长转变为TdP特征性的快速心律失常的心肌细胞单层。如图24中可见，AFC-ECM上的心肌细胞100％以转子(TdP样心律失常)对药物E4031作出反应。
在另外的研究中，使用上述读板器方法在96孔板中用如实施例4中(无有机硅插入物)所制备的在AFC-ECM上的成熟心肌细胞测试药物多潘立酮(3μM)、丙吡胺(100μM)、阿齐利特(10μM)、D,1索他洛尔(100μM)、伊布利特(0.10μM)和苄普地尔(10μM)。测试的结果示于图25中。如从结果可见，各种药物引起了各种类型的心律失常，即快速心律失常(TA)、静止(Q)、早后去极化(EAD)，如记录中以符号表示的。作为对被FDA归类为具有导致患者TdP致命性心律失常的高风险的药物的反应的这些是观察到的心律失常类型的范围。
下表3和表4中示出的各种药物也使用如实施例4中所制备的在AFC-ECM上的成熟心肌细胞(无有机硅插入物)在96孔板中使用上述读板器方法进行了测试，并以符号表示在10倍于有效治疗血浆浓度(ETPC)下对所检测到的任意心律失常和APD90延长的观察结果。这些药物选自CiPA倡议的用于CiPA的验证和测试的化合物清单并被归类为具有导致患者致命性心律失常(TdP)的高风险、中风险或低风险。CiPA化合物的完整列表可见于http://cipaproject.org/wp-content/uploads/sites/24/2016/05/CiPA-Compounds.pdf。
表3
Figure BDA0003314271920000921
Figure BDA0003314271920000931
表4
Figure BDA0003314271920000932
来自表3和表4中测试的药物的数据的进一步分析在图26至图29中示出。图26以图表方式示出了每种药物化合物的任意剂量所观察到的心律失常总数。图27以图表方式示出了在特定的临床相关剂量，10倍于有效治疗血浆浓度(ETPC)下每种药物的心律失常相对发生率。
图28以图表方式示出了每种药物以时间(毫秒)表示的动作电位三角形化(APD90-APD30)。三角形化定义为从APD30到APD90的复极时间。动作电位三角形化(APD90-APD30)用作药物致心律失常的预测指标。图29示出了一些药物以时间(毫秒)表示的动作电位三角形化，比较了心肌细胞在AFC-ECM(SBS-AF基质)上与在MatrigelTM ECM上的心肌细胞测定性能。
图30以图表方式示出了所列药物的最大药物诱导动作电位三角形化，比较了来自Cellular Dynamics的
Figure BDA0003314271920000941
hiPSC-CM(空白圆圈)与来自Ncardia的
Figure BDA0003314271920000942
hiPSC-CM(黑圈)在所列药物的任意浓度下的心肌细胞性能。该图来自出版物Blinova et al,International Multisite Study of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-DerivedCardiomyocytes for Drug Proarrhythmic Potential Assessment,2018,Cell Reports24,3582-3592。与图28形成对比，在图30中示出的数据集中，高风险和中风险化合物之间几乎没有分层。因此，与其他天然细胞来源的ECM或MatrigelTM ECM相比，本公开的AFC-ECM提供了具有更现实可行的功能和药物反应性的更成熟的心肌细胞的产生。
实施例6-成熟心肌细胞在AFC-ECM上的细胞构建体的观察
按如上面在实施例4中所述的程序制备成熟心肌细胞在AFC-ECM上的细胞构建体，采用如下所述的修改：
将AFC-ECM沉积到Thermanox盖玻片上以便可使用激光扫描共聚焦显微术(NikonA1R)进行细胞的免疫染色和成像。
将MatrigelTM ECM施加到单独小组的Thermanox盖玻片上以供比较。
将来自Cellular Dynamics International-FUJI的细胞(
Figure BDA0003314271920000943
心肌细胞)以单层接种在这些涂覆有每种ECM的Thermanox盖玻片上，密度为6孔板中每孔200000个细胞。
在细胞培养基中孵育7天后，将细胞固定在3％的多聚甲醛中并应用可商购获得的一抗进行免疫细胞化学处理以确定hiPSC-CM中的细胞表达和定位。使用了以下针对关键心肌肌丝蛋白的一抗：肌钙蛋白I、α-辅肌动蛋白、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)和N-钙黏蛋白。使用可商购获得的荧光标记二抗进行检测。使用DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)荧光染色剂来标记细胞核。
用于细胞标记和可视化的所有程序为如通过引用并入本文的以下参考文献中所述。Herron,T.J.et al.Extracellular Matrix–Mediated Maturation of HumanPluripotent Stem Cell–Derived Cardiac Monolayer Structure andElectrophysiological Function.Circulation:Arrhythmia and Electrophysiology 9(2016).da Rocha,M.A.et al.Deficient cMyBP-C protein expression duringcardiomyocyte differentiation underlies human hypertrophic cardiomyopathycellular phenotypes in disease specific human ES cell derived cardiomyocytes.J.Mol.Cell.Cardiol.99,197-206(2016).da Rocha,A.M.et al.hiPSC-CM MonolayerMaturation State Determines Drug Responsiveness in High Throughput Pro-Arrhythmia Screen.Sci.Rep.7,13834(2017).
使用在NIS Elements软件中分析的荧光图像量化细胞形状。使用细胞面积和周长，用已建立的数学公式量化细胞圆度；圆度指数＝4π*面积/周长2。
在一些情况下，使用MitoTrackerTM Red CMXRos(Thermo Fisher)对线粒体染色。
结果：与上面在实施例4中看到的结果一致，使用荧光标记和成像的数据表明AFC-ECM促进hiPSC-CM的快速(7天)成熟，并显示，在MatrigelTM ECM上培养的hiPSC-CM呈圆形形状且肌节紊乱，而在AFC-ECM上培养的同一批次的hiPSC-CM(同基因coparator)呈杆状形状且肌节和肌丝紧凑/组织紧密。
图31中的显微照片示出了在MatrigelTM ECM与AFC-ECM上培养的hiPSC-CM，其中对肌钙蛋白I进行免疫荧光染色，使用DAPI标记细胞核。图32中的显微照片示出了在MatrigelTM ECM与AFC-ECM上培养的hiPSC-CM，其中对α-辅肌动蛋白进行免疫荧光染色，使用DAPI标记细胞核。图33中的显微照片示出了在MatrigelTM ECM与AFC-ECM上培养的hiPSC-CM，其中对cTnT和N钙黏蛋白进行免疫荧光染色，使用DAPI标记细胞核。如图31至图33中可见，在MatrigelTM ECM上培养的hiPSC-CM呈圆形形状且肌节紊乱，而在AFC-ECM上培养的同一批次的hiPSC-CM(同基因coparator)呈杆状形状且肌节和肌丝紧凑/组织紧密。在图31至图33中用箭头标识了圆形细胞或杆状细胞的细胞的一些实例并用箭头标识了肌节的一些实例。图34中的显微照片示出了在MatrigelTM ECM与AFC-ECM上培养的单个hiPSC-CM细胞，其中对cTnT进行免疫荧光染色，使用DAPI标记细胞核，并显示，在MatrigelTM ECM上培养的细胞是圆形的，而在AFC-ECM上培养的细胞是杆状的。图35中的显微照片示出了在MatrigelTM ECM与AFC-ECM上培养的单个hiPSC-CM细胞，其中对α-辅肌动蛋白进行免疫荧光染色，使用DAPI标记细胞核，并显示，在MatrigelTM ECM上培养的细胞是圆形的，而在AFC-ECM上培养的细胞是杆状的。图36中的图表示出了图35中示出的单个细胞的细胞圆度比较，并显示，在MatrigelTM ECM上培养的细胞具有更高的圆度指数，表明其更圆。
图37中的显微照片示出了在MatrigelTM ECM与AFC-ECM上培养的hiPSC-CM，其中对cTnI表达进行免疫荧光染色，使用DAPI标记细胞核。图38示出了在MatrigelTM ECM和AFC-ECM上的hiPSC-CM对于cTnI表达和GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)的蛋白质印迹。图39的图表中示出了图38的蛋白质印迹的分析，示出了MatrigelTM ECM与AFC-ECM上的hiPSC-CM相对于GAPDH的cTnI表达。分析显示了AFC-ECM上的hiPSC-CM比MatrigelTM ECM上的hiPSC-CM的cTnI表达/GAPDH比率高，这表明AFC-ECM上的hiPSC-CM比MatrigelTM ECM上的hiPSC-CM更稳健的表达cTnI。
图40中的显微照片示出了经用MitoTracker Red对线粒体染色的MatrigelTM ECM与AFC-ECM上的hiPSC-CM，并显示AFC-ECM上的细胞具有更多的线粒体并且线粒体具有更多的极化内膜电位，如由更大的红色信号所证实的。图41中的图表示出了MatrigelTM ECM与AFC-ECM上的hiPSC-CM的MitoTrakerTM Red荧光强度/心肌细胞，并显示AFC-ECM上的hiPSC-CM具有更高的MitoTrakerTM Red荧光强度，表明这些细胞比MatrigelTM ECM上的hiPSC-CM具有更多的线粒体并且线粒体具有更多的极化内膜电位。
图42中的显微照片(透射光)示出了在涂覆在微电极阵列(MEA)板上的MatrigelTMECM和AFC-ECM上培养的hiPSC-CM。如图42中可见，在MatrigelTM ECM上培养的hiPSC-CM为圆形形状而在AFC-ECM上培养的hiPSC-CM为杆状形状。

Claims (20)

1.一种用于使来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞成熟化的方法，所述方法包括：
(a)提供来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞(不成熟的hiPSC-CM)；
(b)提供体外来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)；
(c)使不成熟的hiPSC-CM与AFC-ECM接触；和
(d)在培养基中用AFC-ECM培养不成熟的hiPSC-CM以诱导不成熟的hiPSC-CM的成熟化，从而形成成熟的心肌细胞；
其中成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构的杆状细胞为特征。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将不成熟的hiPSC-CM接种在AFC-ECM上。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中成熟的心肌细胞在AFC-ECM上形成为单层，从而形成在AFC-ECM上包含成熟心肌细胞的单层的细胞构建体，其中成熟的心肌细胞排列在AFC-ECM上。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中不成熟的hiPSC-CM不表达内向整流钾通道Kir2.1。
5.一种细胞构建体，所述细胞构建体在来源于从羊水体外分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)上包含成熟的心肌细胞的单层，其中成熟的心肌细胞为AFC-ECM培养的来源于人类诱导性多潜能干细胞的心肌细胞(hiPSC-CM)，并且其中成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构的杆状细胞为特征。
6.根据权利要求5所述的细胞构建体，其中成熟的心肌细胞的单层排列在AFC-ECM上。
7.根据权利要求5或6中任一项所述的细胞构建体，其中构建体上存在纤维轨迹。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的细胞构建体，其中AFC-ECM包含层黏连蛋白、胶原蛋白α-1(XVIII)、基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白、集聚蛋白、波形蛋白和胶原蛋白α-2(IV)和/或其同种型。
9.根据权利要求8所述的细胞构建体，其中胶原蛋白α-1(XVIII)的同种型为同种型2，和/或其中集聚蛋白的同种型为同种型6。
10.根据权利要求8或9中任一项所述的细胞构建体，其中AFC-ECM还包含纤维黏连蛋白和/或其同种型。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的细胞构建体，其中AFC-ECM不含核心蛋白聚糖、基底膜蛋白多糖和/或胶原蛋白(III)。
12.一种用于制备成熟的心肌细胞在体外来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)上的细胞构建体的方法，所述方法包括：
(a)提供来源于人类诱导性多潜能干细胞的不成熟心肌细胞(不成熟的hiPSC-CM)，
(b)提供体外来源于从羊水分离的细胞的细胞外基质(AFC-ECM)；
(c)将不成熟的hiPSC-CM接种在AFC-ECM上；
(d)在培养基中在AFC-ECM上培养所接种的不成熟的hiPSC-CM以诱导不成熟的hiPSC-CM成熟化为成熟的心肌细胞并形成成熟的心肌细胞在AFC-ECM上的单层，从而形成细胞构建体；
其中成熟的心肌细胞以具有类似成人心脏组织的独特肌节结构的杆状细胞为特征。
13.根据权利要求12所述的方法，其中成熟的心肌细胞的单层排列在AFC-ECM上。
14.根据权利要求12或13中任一项所述的方法，其中构建体上存在纤维轨迹。
15.一种用于体外测定药物化合物的心脏毒性和/或致心律失常作用的方法，所述方法包括使药物化合物与根据权利要求5至11中任一项所述的细胞构建体的成熟心肌细胞接触，并观察成熟心肌细胞的电生理学的变化以确认药物化合物是否对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用。
16.根据权利要求15所述的方法，其中成熟心肌细胞的电生理学的变化为动作电位持续时间(APD)的延长，并且其中APD的延长证实药物化合物对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用。
17.根据权利要求15所述的方法，其中成熟心肌细胞的电生理学的变化为早后去极化(EAD)，并且其中早后去极化(EAD)证实药物化合物对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用。
18.根据权利要求15所述的方法，其中成熟心肌细胞的电生理学的变化为迟后去极化(DAD)，并且其中迟后去极化(DAD)证实药物化合物对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用。
19.根据权利要求15所述的方法，其中成熟心肌细胞的电生理学的变化为动作电位持续时间(APD)加转子，并且其中APD的延长加转子证实药物化合物对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用。
20.根据权利要求15所述的方法，其中成熟心肌细胞的电生理学的变化为心律失常，并且其中心律失常证实药物化合物对成熟心肌细胞具有心脏毒性和/或致心律失常作用。
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