CN109072180A - 骨髓基质细胞衍生的细胞外基质蛋白提取物及其用途 - Google Patents
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Abstract
公开了骨髓基质细胞衍生的细胞外基质蛋白提取物,其可用于间充质干细胞的扩增和增殖以及用于各种治疗应用。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年3月30日提交的美国临时申请第62/315460号的权益,其内容通过引用并入本文。
背景技术
A.技术领域
本发明总体上涉及细胞衍生的细胞外基质及其用途。
B.相关技术描述
间充质干细胞(MSC)由于其免疫调节微环境、刺激血管生成和形成多种细胞类型的能力,已经显示出可用于包括促进组织修复和再生在内的多种治疗应用。然而,与MSC疗法相关的障碍之一是获得用于临床治疗的MSC的相关数目。已经发现,由骨髓基质细胞产生的细胞外基质(ECM)促进增殖并维持MSC处于其未分化状态,如US8084023、US8388947和US8961955中所公开,所有这些文献通过引用整体并入本文。这些特定的ECM在如培养皿等基底上生长并附着。ECM附着的其他基底包括如PCT申请PCT/US2015/058335中所公开的微载体,该申请通过引用整体并入本文。然而,值得注意的是,由于这种配置的固定性质,即ECM物理附着于它们所生长的基底上,因此这些ECM的使用目前对于其他应用是受限制的,例如将ECM作为补充物直接添加到细胞生长培养基中;将ECM与其他生物材料或医疗器械(即直接递送到骨损伤部位的骨替代材料)混合;用ECM涂覆可能不利于产生ECM的细胞的附着的表面;以及将ECM并入载体中,例如并入凝胶、液体、或粉末如陶瓷粉末中。
发明内容
本发明提供了一种解决方案,以解决上述本领域中与骨髓基质细胞衍生的ECM的使用有关的局限性和缺陷,所述ECM物理附着于其生长的基底上,即ECM与基底直接接触。该解决方案的前提是从骨髓基质细胞衍生的ECM所生长的基底中物理移出该ECM,并去除其全部或部分可溶性蛋白质,从而产生骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物。出于本发明的目的,上述骨髓基质细胞ECM(不溶性)蛋白提取物是指下列任一术语并定义为下列任一术语:“骨髓基质细胞衍生的细胞外基质蛋白提取物”、“骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物”、“髓基质细胞衍生的细胞外基质蛋白提取物”、“髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物”、“细胞外基质蛋白提取物”、“ECM(不溶性)蛋白提取物”或“ECM蛋白提取物”。
本发明的骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物是由骨髓基质细胞产生的无细胞三维(3D)基质,其不再附着于其所生长的基底上,并且原来存在于ECM中的全部或部分可溶性蛋白质已被去除。令人惊讶的发现,本发明的骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物表现出比可溶性蛋白仍然存在的骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白更强的MSC刺激作用。此外,本发明的骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物表现出比仍附着在其所生长的基底上的骨髓基质细胞衍生的ECM更强的MSC刺激作用。在不受理论约束的情况下,骨髓基质细胞衍生的ECM的可溶性蛋白质可以对细胞生长具有抑制作用。
与使用仍附着于其所生长的基底的ECM相比,使用本发明的ECM蛋白提取物具有许多优点。非限制性实例包括:将ECM蛋白提取物作为补充物直接添加到细胞生长培养基中;将ECM蛋白提取物与其他生物材料或医疗器械(即直接递送到骨损伤部位的骨替代材料)混合;用ECM蛋白提取物浸涂各种表面,而不是使ECM生长在表面上;和/或用ECM蛋白提取物涂覆可能不利于产生ECM的细胞的附着的表面。另外,ECM蛋白提取物可以并入载体中,例如并入凝胶、液体、或粉末如陶瓷粉末中,用于ECM蛋白提取物的递送。
骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物的重要治疗用途是其在骨组织工程中的用途,例如骨形成、骨再生和骨键合。与单独使用其他骨再生材料如陶瓷粉末相比,本发明的骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物与陶瓷粉末联合使用时在体内促进更强的骨再生。
本发明的骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物也可用于使MSC在培养中增殖和扩增,并在培养中维持MSC处于未分化状态。
在本发明的一个方面,公开了细胞外基质(ECM)蛋白提取物,其包含:在基底上生长并且含有不溶性和可溶性蛋白质的骨髓基质细胞衍生的ECM,其中ECM不附着于其所生长的基底,并且其中原本存在于ECM中的全部或部分可溶性蛋白质已被去除。
在本发明的另一个方面,公开了细胞外基质(ECM)蛋白提取物,其基本由以下组分组成:在基底上生长并且含有不溶性和可溶性蛋白质的骨髓基质细胞衍生的ECM,其中ECM不附着于其所生长的基底,并且其中原本存在于ECM中的全部或部分可溶性蛋白质已被去除。
在本发明的另一个方面,公开了细胞外基质(ECM)蛋白提取物,其由以下组分组成:在基底上生长并且含有不溶性和可溶性蛋白质的骨髓基质细胞衍生的ECM,其中ECM不附着于其所生长的基底,并且其中原本存在于ECM中的全部或部分可溶性蛋白质已被去除。
在本发明的另一个方面,公开了包含细胞外基质(ECM)蛋白提取物的组合物,该ECM蛋白提取物包含以下组分、基本上由以下组分组成或由以下组分组成:在基底上生长并且含有不溶性和可溶性蛋白质的骨髓基质细胞衍生的ECM,其中ECM不附着于其所生长的基底,并且其中原本存在于ECM中的全部或部分可溶性蛋白质已被去除。在一些实施方案中,组合物还包含载体。在其他实施方案中,载体是凝胶、含水液体或陶瓷粉末。
在本发明的另一个方面,公开了由包括以下步骤的方法制备的骨髓基质细胞衍生的细胞外基质(ECM)蛋白提取物:
(a)获得活的骨髓基质细胞;
(b)在基底上培养骨髓基质细胞以在基底上产生3D ECM;
(c)使ECM中的骨髓基质细胞脱细胞化;
(d)从基底上物理移出ECM;
(e)在搅拌下使ECM与含水组分接触以溶解并分离ECM的可溶性蛋白
质,和
(f)将含水组分与ECM的剩余不可溶部分(蛋白提取物)分开。
在本发明的另一个方面,公开了制备骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物的方法,该方法包括:
(a)获得活的骨髓基质细胞;
(b)在基底上培养骨髓基质细胞以在基底上产生3D ECM;
(c)使ECM中的骨髓基质细胞脱细胞化;
(d)从基底上物理移出ECM;
(e)在搅拌下使ECM与含水组分接触以溶解并分离ECM中的可溶性蛋白质,和
(f)将含水组分与ECM的剩余不可溶部分(蛋白提取物)分开。
上述步骤(d)和(e)可以同时进行。步骤(d)中的从基底上物理移出ECM不包括ECM的酶促消化。然而,步骤(d)中的从基底上物理移出ECM包括从基底上机械移出ECM,例如用铲刀或刮刀;和/或包括在搅拌下从基底上移出ECM,例如用混合器、均化器或超声波仪。步骤(e)中的搅拌可以包括混合或均质化,其可以使用超声处理或物理混合(例如用铲刀或均化器)或本领域已知的其他混合/均化技术进行。
如整个说明书和权利要求书所述,本发明的ECM蛋白提取物包含骨髓基质细胞衍生的ECM,其中ECM不附着于其所生长的基底。短语“其中ECM不附着于其所生长的基底”是指例如上述方法步骤(b)中使用的基底。在本发明的某些非限制性实施方案中,可以进一步加工所产生的本发明的ECM蛋白提取物,使得它们之后附着于其他基底(例如,与提取物所生长的基底不同的基底)。这种另外的基底可以是与提取物生长的基底相同类型的基底。
从ECM中去除原本存在于骨髓基质细胞衍生的ECM中的所有或部分可溶性蛋白,从而产生本发明的ECM蛋白提取物。当骨髓基质细胞衍生的ECM从其生长的基底上被物理移出并在搅拌下与含水组分接触时,ECM分裂成碎片,一些蛋白质会分散,从ECM中分离或溶解,并保留在含水组分中。搅拌使ECM分裂成碎片,与ECM仍然附着于基底时简单地清洗ECM表面相比,搅拌还使得ECM与含水组分实现更大的表面接触。将该含水组分/可溶性蛋白质混合物与ECM的不可溶部分分开。不可溶部分是ECM蛋白提取物。因此,当在本发明的上下文中使用时,术语“可溶性蛋白质”是指水溶性蛋白质以及悬浮在和/或溶解在含水组分中的轻蛋白质和蛋白质片段。设想去除的含水组分/可溶性蛋白质混合物可以具有研究、临床和治疗应用。
在本发明的另一个方面,公开了用于扩增间充质干细胞(MSC)的方法,该方法包括将MSC与包含细胞外基质(ECM)蛋白提取物的组合物一起培养,该ECM蛋白提取物包含以下组分、基本上由以下组分组成或由以下组分组成:在基底上生长并且包含不溶性和可溶性蛋白质的骨髓基质细胞衍生ECM,其中ECM不附着于其所生长的基底,并且其中原本存在于ECM中的全部或部分可溶性蛋白质已被去除。
在本发明的另一个方面,公开了包含细胞外基质(ECM)蛋白提取物的骨形成组合物,该ECM蛋白提取物包含以下组分、基本上由以下组分组成或由以下组分组成:在基底上生长并且包含不溶性和可溶性蛋白质的骨髓基质细胞衍生的ECM,其中ECM不附着于其所生长的基底,并且其中原本存在于ECM中的全部或部分可溶性蛋白质已被去除。在一些实施方案中,组合物还包含载体。在其他实施方案中,载体是凝胶、含水液体或陶瓷粉末。在其他实施方案中,陶瓷粉末是羟基磷灰石或羟基磷灰石/磷酸三钙。
在本发明的另一个方面,公开了在对象中生成骨的方法,其包括向对象施用包含细胞外基质(ECM)蛋白提取物的组合物,该ECM蛋白提取物包含以下组分、基本上由以下组分组成或由以下组分组成:在基底上生长并且包含不溶性和可溶性蛋白质的骨髓基质细胞衍生的ECM,其中ECM不附着于其所生长的基底,并且其中原本存在于ECM中的全部或部分可溶性蛋白质已被去除。在一些实施方案中,组合物还包含载体。在其他实施方案中,载体是凝胶、含水液体或陶瓷粉末。在其他实施方案中,陶瓷粉末是羟基磷灰石或羟基磷灰石/磷酸三钙。
在一些实施方案中,用于制备ECM蛋白提取物的骨髓基质细胞是鼠、兔、猫、狗、猪、马科或灵长类动物的细胞。在其他实施方案中,骨髓基质细胞是人类细胞。在其他实施方案中,骨髓基质细胞是马科动物细胞。在其他实施方案中,骨髓基质细胞是鼠科动物细胞。在其他实施方案中,骨髓基质细胞是分离的骨髓间充质干细胞。
在一些实施方案中,骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物在含氧量正常的条件下产生。
还公开了本发明的以下实施方案1-18。实施方案1是一种细胞外基质(ECM)蛋白提取物,其包含:在基底上生长并且含有不溶性和可溶性蛋白质的骨髓基质细胞衍生的ECM,其中ECM不附着于其所生长的基底上,并且其中原本存在于ECM中的全部或部分可溶性蛋白质已被去除。实施方案2是包含实施方案1的细胞外基质(ECM)蛋白提取物的组合物。实施方案3是实施方案2的组合物,其中组合物还包含载体。实施方案4是实施方案3的组合物,其中载体是凝胶、含水液体或陶瓷粉末。实施方案5是通过包括以下步骤的方法制备的细胞外基质(ECM)蛋白提取物:(a)获得活的骨髓基质细胞;(b)在基底上培养骨髓基质细胞以在基底上产生3D ECM;(c)使ECM中的骨髓基质细胞脱细胞化;(d)从基底上物理移出ECM;(e)在搅拌下使ECM与含水组分接触以溶解并分离ECM的可溶性蛋白质;以及(f)将含水组分与ECM的剩余不可溶部分(蛋白提取物)分开。实施方案6是实施方案1或5的ECM蛋白提取物,其中基底是细胞培养容器、塑料盖玻片或微载体。实施方案7是实施方案1、5或6中任一项的ECM蛋白提取物,其中基底预涂有纤连蛋白。实施方案8是制备细胞外基质(ECM)蛋白提取物的方法,该方法包括:(a)获得活的骨髓基质细胞;(b)在基底上培养骨髓基质细胞以在基底上产生3D ECM;(c)使ECM中的骨髓基质细胞脱细胞化;(d)从基底上物理移出ECM;(e)在搅拌下使ECM与含水组分接触以溶解并分离ECM的可溶性蛋白质;以及(f)将含水组分与ECM的剩余不可溶部分(蛋白提取物)分开。实施方案9是实施方案8的方法,其中基底是细胞培养容器、塑料盖玻片或微载体。实施方案10是实施方案8或9的方法,其中基底预涂有纤连蛋白。实施方案11是用于扩增间充质干细胞(MSC)的方法,该方法包括与实施方案2的组合物一起培养MSC。实施方案12是包含实施方案1的ECM蛋白提取物的骨形成组合物。实施方案13是实施方案12的组合物,其中组合物还包含载体。实施方案14是实施方案13的组合物,其中载体是凝胶、含水液体或陶瓷粉末。实施方案15是实施方案14的组合物,其中陶瓷粉末为羟基磷灰石或羟基磷灰石/磷酸三钙。实施方案16是在对象中生成骨的方法,该方法包括向对象施用实施方案12至15中任一项的组合物。实施方案17是实施方案1或5的ECM蛋白提取物,其中ECM蛋白提取物包含α-1-抗蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白前体、α-2-巨球蛋白、α-辅肌动蛋白-1、膜联蛋白A2、双糖链蛋白聚糖、陷窝蛋白-1、胶原蛋白α-1(I)、胶原蛋白α-1(II)、胶原蛋白α-1(III)、胶原蛋白α-1(VI)、胶原蛋白α-1(XII)、胶原蛋白α-1(XIV)、胶原蛋白α-2(I)、胶原蛋白α-2(V)、胶原蛋白α-2(VI)、胶原蛋白α-3(VI)、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VI型胶原蛋白、饰胶蛋白聚糖、延伸因子1-α、EMILIN-1、内质蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、纤蛋白-1(Fibulin-1)、纤蛋白-2(Fibulin-2)、半乳凝素-1-智人(人)、干扰素诱导的GTP结合蛋白、核纤层蛋白-A/C、层粘连蛋白、LIM结构域和肌动蛋白结合蛋白1、穿透素相关蛋白、骨膜蛋白(Periostin)、骨膜蛋白前体(PN)、串珠蛋白聚糖(Perlecan)、纤溶酶原、网蛋白、抑制蛋白-1、橡胶延伸因子蛋白、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白H1、血清白蛋白、黏结蛋白聚糖-1、腱生蛋白前体(TN)(人)、血小板应答蛋白-1、转化生长因子-β诱导蛋白、转凝蛋白、波形蛋白中的一种或多于一种。实施方案18是实施方案1或5的ECM蛋白提取物,其中原本存在于ECM中的全部或部分已去除的可溶性蛋白质包括α-1-抗蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白前体、α-2-巨球蛋白、α-辅肌动蛋白-1、膜联蛋白A2、双糖链蛋白聚糖、陷窝蛋白-1、胶原蛋白α-1(I)、胶原蛋白α-1(II)、胶原蛋白α-1(III)、胶原蛋白α-1(VI)、胶原蛋白α-1(XII)、胶原蛋白α-1(XIV)、胶原蛋白α-2(I)、胶原蛋白α-2(V)、胶原蛋白α-2(VI)、胶原蛋白α-3(VI)、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VI型胶原蛋白、饰胶蛋白聚糖、延伸因子1-α、EMILIN-1、内质蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、纤蛋白-1、纤蛋白-2、半乳凝素-1-智人(人)、干扰素诱导的GTP结合蛋白、核纤层蛋白-A/C、层粘连蛋白、LIM结构域和肌动蛋白结合蛋白1、穿透素相关蛋白、骨膜蛋白、骨膜蛋白前体(PN)、串珠蛋白聚糖、纤溶酶原、网蛋白、抑制蛋白-1、橡胶延伸因子蛋白、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白H1、血清白蛋白、黏结蛋白聚糖-1、腱生蛋白前体(TN)(人)、血小板应答蛋白-1,转化生长因子-β诱导蛋白、转凝蛋白、波形蛋白中的一种或多于一种。
术语“哺乳动物”包括但不限于鼠科(如小鼠、大鼠)哺乳动物、兔、猫、狗、猪、马科(如马、驴)哺乳动物和灵长类动物(例如猴、猿、人)。在本发明上下文的特定方面,哺乳动物可以是鼠科哺乳动物、马科哺乳动物或人。
术语“约”或“近似”被定义为本领域普通技术人员所理解的接近于,并且在一个非限制性实施方案中,该术语被定义为在10%以内,优选5%以内,更优选1%以内,最优选0.5%以内。
词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包含性的或开放式的并且不排除附加的未列举的要素或方法步骤。
当没有数量词的要素与术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”一起使用时,可以表示“一”,但其也符合“一个或更多个”、“至少一个”、和“一个或多于一个”的含义。
组合物及其使用方法可以“包括”在整个说明书中公开的任何成分或步骤、“基本上由所述成分或步骤组成”或“由所述成分或步骤组成”。
设想可以根据本发明的任何方法或组合物来实现本说明书中讨论的任何实施方案,反之亦然。此外,本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
根据以下详细描述,本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而,应该理解的是,尽管指出了本发明的特定实施方案,但是详细描述和特定实例仅仅是以示例的方式给出的,因为根据该详细描述在本发明的精神和范围内的各种变化和修改方案对于本领域的普通技术人员而言是明显的。
附图说明
图1:用ECM蛋白提取物、基底上的ECM(阳性对照)、具有可溶性蛋白质的ECM、上清液和阴性对照(2-D培养皿)刺激MSC后的总细胞数。
图2:用ECM蛋白提取物、基底上的ECM(阳性对照)、具有可溶性蛋白质的ECM、上清液和阴性对照(2-D培养皿)刺激MSC后的绝对SSEA4阳性细胞数。
图3:用不同浓度的ECM蛋白提取物、阳性对照和阴性对照刺激MSC后的总细胞数。
图4:用不同浓度的ECM蛋白提取物、阳性对照和阴性对照刺激MSC后的绝对SSEA4阳性细胞数。
图5:用不同浓度的ECM蛋白提取物、阳性对照和阴性对照刺激MSC后的总细胞数——匹配的ECM批次。
图6:用不同浓度的ECM蛋白提取物、阳性对照和阴性对照刺激MSC后的绝对SSEA4阳性细胞数——匹配的ECM批次。
图7:A组(对照)在2周时的X射线图像。
图8:A组(对照)在4周时的X射线图像。
图9:B组(HA/TCP)在2周时的X射线图像。
图10:B组(HA/TCP)在4周时的X射线图像。
图11:C组(HA/TCP+ECM蛋白提取物)在2周时的X射线图像。
图12:C组(HA/TCP+ECM蛋白提取物)在4周时的X射线图像。
图13:对于研究的前6只动物,A组(对照)、B组(HA/TCP)和C组(HA/TCP+ECM蛋白提取物)在4周后的显微CT图像。
图14:对于研究的前6只动物,A组(对照)、B组(HA/TCP)和C组(HA/TCP+ECM蛋白提取物)在4周后的微CT复合图像。
图15:研究的前6只动物在4周后的ROI骨体积。
具体实施方式
A.骨髓基质细胞衍生的细胞外基质(ECM)蛋白提取物
本发明的骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物是由骨髓基质细胞产生的三维(3D)ECM,其中ECM不附着于其所生长的基底,并且原来存在于ECM中的全部或部分可溶性蛋白质已被去除。因此,骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物具有与原始骨髓基质细胞衍生的ECM不同的组成。
用于产生ECM蛋白提取物的细胞是从哺乳动物骨髓获得的基质细胞。骨髓基质细胞可以从各种来源获得,例如髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或其他髓腔。骨髓基质细胞可以通过对相关领域技术人员而言显而易见的常规方法获得和培养。骨髓基质细胞含有MSC和其他细胞,例如成纤维细胞、脂肪细胞、巨噬细胞、成骨细胞、破骨细胞、内皮干细胞和内皮细胞。存在于骨髓中的MSC可以与骨髓中存在的其他细胞分离,分离的MSC可以用作骨髓基质细胞以形成骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物。骨髓基质细胞可以来自各种哺乳动物物种。非限制性实例是人、灵长类动物、鼠、马科动物、兔、猫、狗或猪。
骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物由各种蛋白质组成。ECM蛋白提取物的组分可以通过本领域已知的方法鉴定,该方法可以包括免疫组织化学染色和质谱。骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物可以包括但不限于表1中列出的下列组分。
表1
骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物可以包括表1中任意组分的任意组合。
骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物可以通过以下方法产生:
(a)获得活的骨髓基质细胞;
(b)在基底上培养骨髓基质细胞以在基底上产生3D ECM;
(c)使ECM中的骨髓基质细胞脱细胞化;
(d)从基底上物理移出ECM;
(e)在搅拌下使ECM与含水组分接触以溶解并分离ECM的可溶性蛋白质,和
(f)将含水组分与ECM的剩余不可溶部分(蛋白提取物)分开。
关于步骤(a),骨髓基质细胞可以从各种来源获得,例如髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或其他髓腔。骨髓基质细胞可以通过对相关领域技术人员而言显而易见的常规方法获得和培养。骨髓基质细胞含有MSC和其他细胞,例如成纤维细胞、脂肪细胞、巨噬细胞、成骨细胞、破骨细胞、内皮干细胞和内皮细胞。存在于骨髓中的MSC可以与骨髓中存在的其他细胞分离,分离的MSC可以用作骨髓基质细胞以形成骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物。骨髓基质细胞可以来自各种哺乳动物物种。非限制性实例是人、灵长类动物、鼠、马科动物、兔、猫、狗或猪。
可以使用US8,084,023、US8,388,947和US8,961,955中公开的培养方法和技术进行步骤(b),所有这些文献通过引用整体并入本文;还可以使用本领域已知的其他培养方法和技术进行步骤(b)。用于产生步骤(b)的ECM然后在步骤(c)中使ECM脱细胞化的方法的实例如下:将新鲜分离的鼠股骨骨髓细胞以3×105个细胞/cm2接种到组织培养塑料上,并在补充有谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)(Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)和15%预先选择的胎牛血清(FBS,Atlanta Biologicals,Lawrenceville,GA)的α-MEM(Thermo-Fisher Scientific,Grand Island,NY)中培养7天。然后将细胞以1×104个细胞/cm2接种到涂有纤连蛋白的塑料盖玻片上,并在上述补充的α-MEM培养基中培养7天。然后将抗坏血酸(50μg/ml)(Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)添加到细胞培养物中再培养8天。在用PBS充分洗涤后,通过将细胞与含有PBS中的20mMNH4OH的0.5%Triton X-100在37℃下孵育5分钟从ECM中去除细胞。然后将ECM在37℃下用100μg/ml的DNA酶(Sigma Chemical Company,St.Louis,MO)处理1小时。将板用PBS洗涤三次,然后向板中加入2.0ml含有50μg/ml庆大霉素和0.25μg/ml两性霉素B的PBS。骨髓基质细胞的培养可以在含氧量正常的条件下进行,即空气中有20%至21%的氧气,并且还可以包括37℃、5%的CO2和90%湿度的条件。步骤(B)中的基底可以是用于细胞培养以产生细胞衍生的ECM的任何基底。基底的非限制性实例包括细胞培养容器,例如组织培养皿和培养瓶、桶和反应器;塑料盖玻片,例如THERMANOX盖玻片;聚(丙交酯-co-乙交酯)基底;合成的水凝胶,例如聚丙烯酰胺、PEG;胶原支架;以及微载体,例如CYTODEX 1。在培养骨髓基质细胞之前,可以用蛋白质如纤连蛋白预先涂覆基底。
步骤(d)和(e)可以同时进行。步骤(d)中的从基底上物理移出ECM不包括为移出ECM进行的ECM的酶促消化。然而,步骤(d)中的从基底上物理移出ECM包括从基底上机械移出ECM,例如用铲刀或刮刀;和/或包括在搅拌下从基底上移出ECM,例如用混合器、均化器或超声波仪。步骤(e)中的搅拌可以包括混合或均质化,其可以使用超声处理或物理混合(例如用铲刀或均化器)或本领域已知的其他混合/均化技术进行。
步骤(f)可以使用离心或过滤,或本领域已知的其他分离方法进行。
该方法还可以包括在步骤(b)、(c)、(d)、(e)或(f)之后进行的辐照。
骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物可以是无菌的。它可以通过辐照、化学灭菌(例如环氧乙烷)、加热(例如高压釜)或其他灭菌手段进行灭菌。骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物可以是冻干的。
使骨髓基质细胞的ECM脱细胞化可以包括去除活的骨髓基质细胞或使骨髓细胞不能存活。可以通过使用本领域已知的方法使ECM中的骨髓基质细胞脱细胞化,该方法可以包括但不限于裂解骨髓基质细胞,然后通过洗涤去除裂解的骨髓基质细胞。可以使用各种物质从ECM中去除骨髓基质细胞,这些物质包括TRITON X-100和PBS缓冲液中的氢氧化铵。在ECM经过骨髓基质细胞脱细胞化后,所得ECM基本上不含骨髓基质细胞。
含水组分可以是水、水溶液如缓冲液或基于水的培养基。含水组分可以不含酶。
原本存在于骨髓基质细胞衍生的ECM中的全部或部分可溶性蛋白从ECM中去除,从而产生本发明的ECM蛋白提取物。当骨髓基质细胞衍生的ECM被物理地从其生长的基底上移出并在搅拌下与含水组分接触时,ECM被分裂成碎片,一些蛋白质会分散,从ECM中分离或溶解,并保留在含水组分中。搅拌使ECM分裂成碎片,与仍然附着于基底时简单地清洗ECM表面相比,搅拌还使得ECM与含水组分实现更大的表面接触。将该含水组分/可溶性蛋白质混合物与ECM的不溶部分分开。不溶部分是ECM蛋白质提取物。因此,当在本发明的上下文中使用时,术语“可溶性蛋白质”是指水溶性蛋白质以及悬浮在和/或溶解在含水组分中的轻蛋白质和蛋白质片段。设想去除的含水组分/可溶性蛋白质混合物可具有研究、临床和治疗应用。存在于含水组分/可溶性蛋白质混合物中的可溶性蛋白质可以包括表1中任意组分的任意组合。
从骨髓基质细胞ECM中去除的可溶性蛋白质的量可以是原来存在于ECM中的可溶性蛋白质的全部(100%)或部分,即95%至100%、或90%至100%、或85%至100%、或80%至100%、或75%至100%、或70%至100%、或65%至100%、或60%至100%、或55%至100%、或50%至100%、或45%至100%、或40%至100%、或35%至100%、或30%至100%、或25%至100%、或20%至100%、或15至100%、或10%至100%、或5%至100%、或1%至100%、或85%至90%、或80%至90%、或75%至90%、或70%至90%、或65%至90%、或60%至90%、或55%至90%、或50%至90%、或45%至90%、或40%至90%、或35%至90%、或30%至90%、或25%至90%、或20%至90%、或15%至90%、或10%至90%、或5%至90%、或1%至90%、或75%至80%、或70%至80%、或65%至80%、或60%至80%、或55%至80%、或50%至80%、或45%至80%、或40%至80%、或35%至80%、或30%至80%、或25%至80%、或20%至80%、或15%至80%、或10%至80%、或5%至80%、或1%至80%、或65%至70%、或60%至70%、或55%至70%、或50%至70%、或45%至70%、或40%至70%、或35%至70%、或30%至70%、或25%至70%、或20%至70%、或15%至70%、或10%至70%、或5%至70%、或1至70%、或55%至60%、或50%至60%、或45%至60%、或40%至60%、或35%至60%、或30%至60%、或25%至60%、或20%至60%、或15%至60%、或10%至60%、或5%至60%、或1%至60%、45%至50%、或40%至50%、或35%至50%、或30%至50%、或25%至50%、或20%至50%、或15%至50%、或10%至50%、或5%至50%、或1%至50%、或35%至40%、或30至40%、或25%至40%、或20%至40%、或15%至40%、或10%至40%、或5%至40%、或1%至40%、或25%至30%、或20%至30%、或15%至30%、或10%至30%、或5%至30%、或1%至30%、或20%至25%、或15%至25%、或10%至25%、或5%至25%、或1%至25%、或15%至20%、或10%至20%、或5%至20%、或1%至20%、或10%至15%、或5%至15%、或1%至15%、或5%至10%、或1%至10%、或1%至5%。
各种可商购获得的细胞培养基,例如α-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific,Grand Island,NY)可用于培养骨髓基质细胞,并且也可以是用于溶解ECM的水溶性成分的含水组分。可商购获得的培养基可以通过向培养基中加入各种补充物质来改良,补充物质例如为碳酸氢钠、L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素、两性霉素B和/或血清。血清可以是胎牛血清。培养基也可以不含血清。另外,可以将例如L-抗坏血酸的物质添加到培养基或改良培养基中以诱导ECM的细胞产生。
B.哺乳动物MSC扩增和增殖的方法
在未分化状态下对哺乳动物MSC进行扩增和增殖的方法包括获得哺乳动物MSC并用本发明的骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物来培养MSC。
哺乳动物MSC的培养可以在含氧量正常的条件下进行。
哺乳动物MSC可以从各种来源获得,包括但不限于骨髓。骨髓可以从各种来源获得,例如髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或其他髓腔。哺乳动物MSC可以从其他来源获得,包括但不限于胚胎卵黄囊、胎盘、脐带组织、脐带血、骨膜、骨小梁、脂肪组织、滑膜、骨骼肌、乳牙、胎儿胰腺、肺、肝、羊水、胎儿和少儿的皮肤和血液。分离和建立MSC培养物的方法通常是相关领域技术人员已知的。用于从脐带血中分离MSC的新方法公开在美国专利公开2012/0142102中,其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中,哺乳动物MSC是人MSC。
C.组织工程
本发明的骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物可用于各种组织工程应用,例如骨和软骨再生,以及骨键合。体内研究表明,与单独使用羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)相比,骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物与HA/TCP联合使用时显示出更大的骨体积再生。
骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物可以与载体以及骨再生材料联合使用或单独用于骨组织工程应用。载体和骨再生材料的非限制性实例包括陶瓷粉末,例如HA或HA/TCP;凝胶;和含水液体。在一些实施方案中,将骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物与HA或HA/TCP组合。
实施例
包括以下实施例以说明本发明的某些非限制性方面。本领域技术人员应该理解,以下实施例中公开的技术代表申请人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术。然而,根据本公开内容,本领域技术人员应当理解,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。
实施例1
从骨髓基质细胞衍生的ECM产生骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物
使用以下步骤从脱细胞的骨髓基质细胞ECM制备骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物:
(a)将1ml无血清培养基(MEMα培养基078-5077)添加到三个150mm培养皿的每一个中,在培养皿中预先产生骨髓基质细胞衍生的ECM并去除活的基质细胞。
(b)用腻子刮刀机械地刮下第一培养皿的ECM以使ECM在培养皿表面上松散,并用刮刀将内容物混合。
(c)然后将第一培养皿的ECM/培养基混合物倒入第二培养皿中。
(d)用刮刀刮下第二培养皿的ECM,并用刮刀将第二培养皿的内容物混合。
(e)然后将第二培养皿的混合物倒入第三培养皿中。
(f)用刮刀刮下第三培养皿的ECM,并用刮刀将第三培养皿的内容物混合。
(g)然后将第三培养皿的混合物转移到15ml锥形管中。
(h)用0.5ml无血清培养基洗涤三个150mm培养皿的每一个,并将洗涤液添加到含有ECM/培养基混合物的15ml锥形管中。
(i)将15ml锥形管超声处理4次,每次2分钟,每次的时间间隔为1分钟,采用放大率90%,脉冲01,01。
(j)将来自15ml锥形管的混合物样品吸取到1.5ml Eppendorf管中,并以15000Xg离心5分钟。
(k)去除含有可溶性蛋白质的上清液,留下不可溶沉淀物,即ECM蛋白提取物。
实施例2
用骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物进行体外MSC刺激
将骨髓MSC以6000个细胞/cm2接种于具有以下培养基迭代的组织培养皿中:
(a)悬浮于培养基中的18μg/ml骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物(来自实施例1k的沉淀物);
(b)悬浮于培养基中的未去除可溶性蛋白质的18μg/ml骨髓基质细胞衍生的ECM(来自实施例1i的完全提取物);
(c)添加到培养基中的3μg/ml上清液(来自实施例1k);
(d)阴性对照,仅使用培养基(指定为2D);
(e)阳性对照,采用在具有培养基的培养皿基底上生长并附着于培养皿基底的骨髓基质细胞衍生的ECM(指定为HPME)上进行接种。
将培养皿在37℃下孵育96小时,然后分离细胞并计数。使用流式细胞术分析细胞的SSEA4表达(MSC标志物)。图1中提供的数据是总细胞数,图2中提供的数据是绝对SSEA4阳性细胞数。
从图2可以看出,MSC的最强刺激出现在骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物(迭代(a)指定为“沉淀物”)中。
实施例3
ECM蛋白提取物与对照研究1的体外MSC刺激
将骨髓MSC以6000个细胞/cm2接种于具有以下培养基迭代的组织培养皿中:
(a)悬浮于培养基中的10μg/ml骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物;
(b)悬浮于培养基中的20μg/ml骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物;
(c)悬浮于培养基中的40μg/ml骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物;
(d)阴性对照,仅使用培养基(指定为2D);
(e)阳性对照,采用在具有培养基的培养皿基底上生长并附着于培养皿基
底的骨髓基质细胞衍生的ECM(称为1012-4HPME)上进行接种。
注:用于产生ECM蛋白提取物的骨髓基质细胞和研究1中附着于基底的ECM来自同一供体;然而,ECM蛋白提取物并不是由附着于基质的相同批次的ECM制成的。
将培养皿在37℃下孵育96小时,然后分离细胞并计数。使用流式细胞术分析细胞的SSEA4表达(MSC标志物)。图3中提供的数据是总细胞数,图4中提供的数据是绝对SSEA4阳性细胞数。
从图4可以看出,骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物显示出比阳性对照和阴性对照更强的MSC刺激。
实施例4
通过ECM蛋白质提取物与对照研究2的体外MSC刺激
将骨髓MSC以6000个细胞/cm2接种于具有以下培养基迭代的组织培养皿中:
(a)悬浮于培养基中的10μg/ml骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物;
(b)悬浮于培养基中的20μg/ml骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物;
(c)阴性对照,仅使用培养基(指定为2D);
(d)阳性对照,采用在具有培养基的培养皿基底上生长并附着于培养皿基底的骨髓基质细胞衍生的ECM(指定为1013.2HPME)上进行接种。
注:用于产生ECM蛋白提取物的骨髓基质细胞和研究2中附着于基底的ECM来自同一供体;ECM蛋白提取物是由附着于基质的相同批次的ECM制成的。
将培养皿在37℃下孵育96小时,然后分离细胞并计数。使用流式细胞术分析细胞的SSEA4表达(MSC标志物)。图5中提供的数据是总细胞数,图6中提供的数据是绝对SSEA4阳性细胞数。
从图6可以看出,骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物显示出比阳性对照和阴性对照更强的MSC刺激。
实施例5
体内骨科研究
在大鼠股骨节段性骨缺损(SBD)模型中对骨髓基质细胞ECM蛋白提取物进行体内评估。该研究包括三种治疗类型:A组-对照,无移植;B组-羟基磷灰石/磷酸三钙(MedtronicMini Granules)(HA/TCP)加自体骨髓;和C组-HA/TCP加自体骨髓加骨髓基质细胞ECM蛋白提取物。将每种疗法植入骨骼成熟Sprague-Dawley大鼠(>300gm)的股骨中骨干中形成的6mm SBD中。在缺损部位缝合之前,使用预钻孔的多指板和克氏针通过内部固定来稳定缺损部位。缺损部位用胶原膜(Oestogenics)包裹。定期拍摄每只研究大鼠的缺损部位的X射线图像。
安乐死后,取出股骨,在SkySCAN 1176微型CT扫描仪上,在9μm各项同性分辨率下,对股骨中骨干进行微计算机断层扫描(显微CT)。在包含所形成的6mm SBD的感兴趣体积中测量体积骨矿物质密度和骨小梁体积分数。还对股骨进行组织学评估,以确定缺损空间内的矿化程度。
A组(对照)在2周时的X射线图像显示在图7中。A组在4周时的X射线图像显示在图8中。B组(HA/TCP)在2周时的X射线图像显示在图9中。B组在4周时的X射线图像显示在图10中。C组(HA/TCP+ECM蛋白提取物)在2周时的X射线图像显示在图11中。C组在4周时的X射线图像显示在图12中。
对于研究的前6只动物,A组(对照)、B组(HA/TCP)和C组(HA/TCP+ECM蛋白提取物)在4周后的显微CT图像显示在图13中。对于研究的前6只动物,A组(对照组)、B组(HA/TCP)和C组(HA/TCP+ECM蛋白提取物)在4周后的显微CT复合图像显示在图14中。研究的前6只动物在4周后的ROI骨体积显示在图15中。从图15可以看出,相比于B组(仅用HA/TCP),C组(HA/TCP加骨髓基质细胞衍生的ECM蛋白提取物)显示出更大的骨再生。
Claims (18)
1.一种细胞外基质(ECM)蛋白提取物,其包含:在基底上生长并且含有不溶性和可溶性蛋白质的骨髓基质细胞衍生的ECM,其中ECM不附着于其所生长的基底,并且其中原本存在于ECM中的全部或部分可溶性蛋白质已被去除。
2.一种组合物,其包含权利要求1所述的细胞外基质(ECM)蛋白提取物。
3.根据权利要求2所述的组合物,其中所述组合物还包含载体。
4.根据权利要求3所述的组合物,其中所述载体是凝胶、含水液体或陶瓷粉末。
5.一种细胞外基质(ECM)蛋白提取物,其通过包括以下步骤的方法制备:
(a)获得活的骨髓基质细胞;
(b)在基底上培养骨髓基质细胞以在基底上产生3D ECM;
(c)使ECM中的骨髓基质细胞脱细胞化;
(d)从基底上物理移出ECM;
(e)在搅拌下使ECM与含水组分接触以溶解并分离ECM的可溶性蛋白质,和
(f)将含水组分与ECM的剩余不可溶部分(蛋白提取物)分开。
6.根据权利要求1或5所述的ECM蛋白提取物,其中所述基底是细胞培养容器、塑料盖玻片或微载体。
7.根据权利要求1、5或6中任一项所述的ECM蛋白提取物,其中所述基底预涂有纤连蛋白。
8.一种制备细胞外基质(ECM)蛋白提取物的方法,所述方法包括:
(a)获得活的骨髓基质细胞;
(b)在基底上培养骨髓基质细胞以在基底上产生3D ECM;
(c)使ECM中的骨髓基质细胞脱细胞化;
(d)从基底上物理移出ECM;
(e)在搅拌下使ECM与含水组分接触以溶解并分离ECM的可溶性蛋白质,和
(f)将含水组分与ECM的剩余不可溶部分(蛋白提取物)分开。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述基底是细胞培养容器、塑料盖玻片或微载体。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其中所述基底预涂有纤连蛋白。
11.一种用于扩增间充质干细胞(MSC)的方法,所述方法包括与权利要求2所述的组合物一起培养MSC。
12.一种包含权利要求1所述的ECM蛋白提取物的骨形成组合物。
13.根据权利要求12所述的组合物,其中所述组合物还包含载体。
14.根据权利要求13所述的组合物,其中所述载体是凝胶、含水液体或陶瓷粉末。
15.根据权利要求14所述的组合物,其中所述陶瓷粉末为羟基磷灰石或羟基磷灰石/磷酸三钙。
16.一种在对象中生成骨的方法,其包括向对象施用权利要求12至15中任一项所述的组合物。
17.根据权利要求1或5所述的ECM蛋白提取物,其中所述ECM蛋白提取物包含α-1-抗蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白前体、α-2-巨球蛋白、α-辅肌动蛋白-1、膜联蛋白A2、双糖链蛋白聚糖、陷窝蛋白-1、胶原蛋白α-1(I)、胶原蛋白α-1(II)、胶原蛋白α-1(III)、胶原蛋白α-1(VI)、胶原蛋白α-1(XII)、胶原蛋白α-1(XIV)、胶原蛋白α-2(I)、胶原蛋白α-2(V)、胶原蛋白α-2(VI)、胶原蛋白α-3(VI)、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VI型胶原蛋白、饰胶蛋白聚糖、延伸因子1-α、EMILIN-1、内质蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、纤蛋白-1、纤蛋白-2、半乳凝素-1-智人(人)、干扰素诱导的GTP结合蛋白、核纤层蛋白-A/C、层粘连蛋白、LIM结构域和肌动蛋白结合蛋白1、穿透素相关蛋白、骨膜蛋白、骨膜蛋白前体(PN)、串珠蛋白聚糖、纤溶酶原、网蛋白、抑制蛋白-1、橡胶延伸因子蛋白、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白H1、血清白蛋白、黏结蛋白聚糖-1、腱生蛋白前体(TN)(人)、血小板应答蛋白-1、转化生长因子-β诱导蛋白、转凝蛋白、波形蛋白中的一种或多于一种。
18.根据权利要求1或5所述的ECM蛋白提取物,其中原本存在于ECM中的全部或部分已去除的可溶性蛋白质包括α-1-抗蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白前体、α-2-巨球蛋白、α-辅肌动蛋白-1、膜联蛋白A2、双糖链蛋白聚糖、陷窝蛋白-1、胶原蛋白α-1(I)、胶原蛋白α-1(II)、胶原蛋白α-1(III)、胶原蛋白α-1(VI)、胶原蛋白α-1(XII)、胶原蛋白α-1(XIV)、胶原蛋白α-2(I)、胶原蛋白α-2(V)、胶原蛋白α-2(VI)、胶原蛋白α-3(VI)、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、V型胶原蛋白、VI型胶原蛋白、饰胶蛋白聚糖、延伸因子1-α、EMILIN-1、内质蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、纤蛋白-1、纤蛋白-2、半乳凝素-1-智人(人)、干扰素诱导的GTP结合蛋白、核纤层蛋白-A/C、层粘连蛋白、LIM结构域和肌动蛋白结合蛋白1、穿透素相关蛋白、骨膜蛋白、骨膜蛋白前体(PN)、串珠蛋白聚糖、纤溶酶原、网蛋白、抑制蛋白-1、橡胶延伸因子蛋白、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白H1、血清白蛋白、黏结蛋白聚糖-1、腱生蛋白前体(TN)(人)、血小板应答蛋白-1、转化生长因子-β诱导蛋白、转凝蛋白、波形蛋白中的一种或多于一种。
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