JP7058607B2 - カスタマイズされた骨－インプラントハイブリッド移植片 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、2016年4月1日に出願された米国出願番号62/317,165の優先権の恩典を主張し、その内容全体を参照により本明細書に組み入れる。
発明の分野
本発明は、概して、組織工学、より具体的にはカスタマイズされた骨-インプラントハイブリッド移植片に関する。
発明の背景
世界の歯科用インプラント及び補綴市場は、2014年度に119億ドルを計上しており、2015年から2020年の予測期間の間に7.2％の年平均成長率（GAGR）で成長すると見込まれている。この大規模な市場拡大は、少なくとも一部分は、平均余命の延長により、骨格の外傷及び疾患率が増加し、歯のない人の数が増加したことによる。毎年、数百万の患者が、生体材料及び医療機器の移植を通じて生活の質を向上させている。顎顔面及び骨格の再建のための材料は、個々の適用例で異なり、金属、セラミック及び複合材料を含む。
好適な条件下で周囲組織と安定な結合 - オッセオインテグレーションを形成するという優れた力学的特性及び能力から、金属及び合金が一般的に使用されている。この結合の質は、インプラント材料のマクロ、マイクロ及びナノスケールでの表面特性に大きく依存する。しかし、補綴インプラントの完全な融合は時間がかかる上、骨の質の低さ、再生能の欠陥、及び今なお不明である他の要素によって特徴づけられる臨床状況ではしばしば失敗する。したがって、費用効果が高く、安全であり、かつ各臨床状況下の各患者に最適である材料を開発するために多大な研究努力が必要とされている。
本発明の主な実施形態の一部を以下に要約する。本発明のさらなる実施形態は、本特許出願の発明の詳細な説明、実施例、図面、及び特許請求の範囲の節に記載する。本特許出願の該節の各々の記載は、他の節と併せて解釈されることを意図している。さらに、本特許出願の該節の各々に記載の様々な実施形態は、様々な異なる方法で組み合わされてよく、かかる組み合わせのすべてが、本発明の範囲に含まれることを意図する。
幹細胞生物学、材料科学及び工学の進歩により、近年、研究室内で、組織発生の生物模倣アプローチ及び灌流バイオリアクターシステムと共に人工多能性幹細胞由来の前駆細胞を用いて機能的な組織置換物を作製することが可能となった。これらの発見の下、本発明は、インビトロで生成された組織移植片を、移植用の組織-インプラントハイブリッド移植片の作製に使用することができるという発見に一部基づいている。例えば、そのようなハイブリッドインプラントを作製するために、骨発生の生物模倣アプローチを用いて人工多能性幹細胞（iPSC）から生成された機能的な骨移植片が、インプラント材料と組み合わされうる。本明細書に記載されるように、本発明は、臨床用途、例えば対象への移植に適したまたは適合する、改善されたまたは新規の移植片の開発を促進するために使用することができる方法、組成物、システム及びキットを提供する。
したがって、本発明は、a）インプラント材料；及びb）足場を有する人工骨組織移植片を含む、骨-インプラントハイブリッド移植片であって、足場上に播種された細胞から構成され、インプラントと人工組織との間の安定な結合の形成を促進するよう培養される、移植片を提供する。
別の局面において、本発明は、a）1つまたは複数の組織形成細胞集団；b）2つまたはそれ以上の足場；及びc）インプラント材料を含む、骨-インプラントハイブリッド移植片を作製するためのキットを提供する。
別の局面において、本発明は、骨-インプラントハイブリッド移植片を製造する方法であって、組織移植片を形成するよう1つまたは複数の細胞集団を足場上で培養する段階であって、組織移植片が、インプラントと人工組織との間の安定な結合の形成を促進するようインプラント材料と共にインビトロで培養される、段階を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、組織移植片は、細胞培養足場を含む。いくつかの実施形態において、足場は、1センチメートル未満の厚さまたは約0.3ミリメートル～約10ミリメートルの厚さを有する。いくつかの実施形態において、足場は、脱細胞化骨組織、例えばウシ骨組織またはヒト骨組織から本質的になる。いくつかの実施形態において、足場は、天然材料もしくは合成材料、または天然材料及び合成材料の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、足場は、1つまたは複数の天然材料または合成材料を含む。合成材料の非限定的な例は、セラミック、セメントまたはポリマー複合材料を含む。いくつかの実施形態において、足場材料は、例えば、所望の試験条件下での性能を向上させるよう、機能化される。いくつかの実施形態において、足場は、例えば、サイトカイン、成長因子、合成分子等で修飾された、機能化材料を含む。いくつかの実施形態において、足場は、組織移植片と共にインプラント材料を培養するのに適応した開口部を含む。いくつかの実施形態において、2つ以上のインプラント材料が評価される。そのような実施形態において、2つ以上の足場が使用されうる（例えば、各インプラント材料に対して1つの足場）及び／または足場は、2つ以上の試験試料もしくはデバイスに適応するよう構成されうる、例えば、足場は、組織移植片と共に2つ以上のインプラント材料を培養するのに適応する2つ以上の開口部を有する。
いくつかの実施形態において、足場は、個人向けの再建術のために任意の所望のサイズ及び形状を有しうる。本明細書に記載されるまたは本明細書に記載される方法によって作製される任意の足場が、当技術分野で公知のまたは本開示に記載される任意のインプラントと共に使用されうる。
いくつかの実施形態において、組織移植片及びインプラント材料の培養は、静的培養条件下または動的培養条件下で行われる。いくつかの実施形態において、培養は、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9または約10週間行われる。いくつかの実施形態において、培養は、10週間より長く行われる。いくつかの実施形態において、培養は、所望のまたは適当な量の成熟組織が形成されるまで行われる。いくつかの実施形態において、培養は、培養容器、例えば灌流バイオリアクター、例えば本明細書に記載されるそれらの中で行われる。いくつかの実施形態において、培養容器は、バイオリアクター、スピナーフラスコ、回転式容器、灌流もしくは加圧システム、またはこれらの任意の組み合わせを含む。直接灌流及び圧入条件を含む培養条件が本明細書にさらに記載されている。
いくつかの実施形態において、組織移植片は、幹細胞もしくは前駆細胞、例えば人工多能性幹細胞由来の細胞、または本明細書に記載される任意の組織形成細胞を含む。いくつかの実施形態において、組織移植片は、骨移植片である。いくつかの実施形態において、組織移植片は、血管形成される。骨移植片及び血管形成された移植片を含む組織移植片並びにそのような組織移植片の製造方法が、本明細書に記載されている。本発明は、本明細書に記載される任意の組織移植片、組織試料、組織セグメントもしくは組織部分または本明細書に記載される任意の方法によって製造される任意の組織を含む、本明細書に記載される任意の組織を含みうる。
本発明のいくつかの実施形態において、インプラント材料は、デバイスまたはデバイスの一部である。実施形態において、デバイスは、クラスI医療機器、クラスII医療機器もしくはクラスIII医療機器及び／または連邦食品・医薬品・化粧品法（FDCA）の第201条(h)において「疾患の診断もしくは処置において使用することが意図されておりまたは人間もしくは他の動物の構造もしくは任意の機能に影響を及ぼすことが意図されており、かつその主目的を化学的作用を通じて達成するのではなく、その主目的の達成のために代謝されることに依存しない、機器、装置等」として定義されている医療機器を含むがこれらに限定されない医療機器である。いくつかの実施形態において、インプラント材料は、合成材料または天然材料または合成材料及び天然材料の組み合わせでありうる。いくつかの実施形態において、インプラント材料は、性能の向上のために（例えば、サイトカイン、成長因子または合成分子を用いて）機能化されうる。いくつかの実施形態において、インプラント材料は、1つまたは複数のサイトカイン、成長因子または合成分子を含みうる。いくつかの実施形態において、インプラント材料は、インプラントまたはデバイスの表面上にコーティングを含みうる。そのような実施形態において、インプラント材料は、インプラントまたはデバイスの露出した外表面上にコーティングを含みうる。そのような実施形態において、インプラントまたはデバイスの内側（例えば、露出していない）部分は、露出した表面上のコーティングと同じまたは異なる材料を含みうる、例えば、インプラントの内側部分は、チタンを含みえ、表面コーティングは、組織適合性に関してスクリーニングされた、新素材、例えば、所望のまたは指定の化学性能、トポロジー及び／または表面エネルギーを有する材料を含みうる。
インプラント材料またはデバイスと共に人工組織移植片を培養している間にまたは培養した後に、組織の特性、及び／または材料もしくはデバイスの特性、及び／または組織と材料もしくはデバイスとの相互作用を評価または測定することによって、組織適合性が決定されうる。例えば、細胞接着、遊走、生存率及び増殖、形成された組織の質、遺伝子発現、タンパク質発現、石灰化（例えば、骨の場合）、または任意の他の所望の特性を評価することによって、材料またはデバイスに対する組織または細胞の反応が決定されうる。いくつかの実施形態において、そのような決定は、組織と材料またはデバイスとの境界面のまたはその付近の細胞を評価することによって実施されうる。組織と材料またはデバイスとの相互作用は、例えば、材料もしくはデバイスへの細胞の遊走または材料もしくはデバイス上／周囲での細胞の増殖を決定することによって評価されうる。材料またはデバイスの融合の強さまたは規模は、生物力学的方法、例えば引き抜き（pull-out）試験、押し出し（push-out）試験、除去トルク試験またはねじ抜き（screw-out）試験を用いて評価されうる。いくつかの実施形態において、インプラント材料に対する組織の任意の分子及び／または生物反応が評価されうる。いくつかの実施形態において、インプラント材料が組織移植片に対して適合性であるかどうかの決定は、以下の1つまたは複数：インプラント材料と組織移植片との融合；組織移植片の量及び／もしくは質；インプラント材料と組織移植片との相互作用；インプラント材料への及び／もしくはインプラント材料上での及び／もしくはインプラント材料の周囲での細胞の遊走；組織移植片における及び材料周辺の細胞／組織における遺伝子及び／もしくはタンパク質の発現；インプラント材料と組織移植片との相互作用の強さ；またはインプラント材料の生物力学、を決定することを含む。いくつかの実施形態において、この決定は、コンピュータ断層撮影（CT）、マイクロトモグラフィー（マイクロCT）、顕微鏡法、電子顕微鏡法、走査電子顕微鏡法、免疫組織化学、ウェスタンブロット及び酵素アッセイ、PCR、染色体分析、組織学、表面形状測定、X線光電子分光分析（XPS）並びに／または任意の他の高解像度特徴づけによる。当業者は、本明細書に記載される方法が例にすぎないこと及び様々な他の方法が当技術分野で公知であり本発明に関連して使用されうることを理解するであろう。
いくつかの実施形態において、本発明は、骨等の機能性組織の、インビトロでの現行の生成方法に関する障害を克服するために用いることができる新規の方法、組成物、及び装置を提供する。いくつかの実施形態で、本発明が提供する方法は、特定の組織部位（例えば、構築、置換、または修復されるべき組織部位）の3次元モデルを用い、カスタマイズされた組織培養足場、カスタマイズされた組織移植片、及び／またはかかる組織移植片の製造用のカスタマイズされたバイオリアクターを作製する。いくつかのかかる実施形態では、該組織培養足場、組織移植片、及び／またはバイオリアクターは、それらが、所望の組織部位またはそのセグメントに対応するサイズ及び形を備えるように設計及び製造される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、最終的な組織移植片を製造するためにその後組み立てられ／結合されうる2つ以上の組織移植片セグメントの製造によって、組織移植片を作製することを含む。かかる方法は、本書では、分節付加組織工学（SATE）法と言うことがある。本書に記載の様々な異なる方法に加えて、本発明は、カスタマイズされた組織移植片、カスタマイズされた組織培養足場、カスタマイズされたバイオリアクター、カスタマイズされたバイオリアクターの移植片チャンバー、及びカスタマイズされたバイオリアクターの移植片チャンバー挿入物を含めた特定の組成物及び装置も提供する。本発明のこれら及び他の実施形態は、下記及び本特許明細書全体を通して、より詳細に記載される。
いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片及びそれらのセグメント（組織移植片セグメント）の様々な製造方法を提供する。
1つのかかる実施形態において、本発明は、組織移植片を製造する方法であって、足場上で1つまたは複数の細胞集団を培養して組織移植片を形成する段階を含む、方法を提供する。
1つのかかる実施形態において、本発明は、製造、置換、または修復されるべき組織部分の3次元モデルを獲得する段階を含む、組織移植片の製造方法を提供する。
別のかかる実施形態において、本発明は、（a）製造、置換、または修復されるべき組織部分の3次元モデルを獲得する段階、及び（b）該3次元モデルを2つ以上のセグメント（モデルセグメント）に分割する段階を含む、組織移植片の製造方法を提供する。
別のかかる実施形態において、本発明は、製造、置換、または修復されるべき組織部分の3次元モデルを獲得する段階を含む組織移植片の製造方法であって、該モデルが2つ以上のセグメント（モデルセグメント）に分割されている、方法を提供する。
別のかかる実施形態において、本発明は、2つ以上の組織移植片セグメントを製造または獲得する段階を含む、組織移植片の製造方法を提供する。
別のかかる実施形態において、本発明は、2つ以上の組織移植片セグメントを組み立てる段階を含む、組織移植片の製造方法を提供する。
別のかかる実施形態において、本発明は、（a）2つ以上の組織移植片セグメントを製造または獲得する段階、及び（b）該2つ以上の組織移植片セグメントを組み立てて組織移植片を形成する段階を含む、組織移植片の製造方法を提供する。
別のかかる実施形態において、本発明は、（a）製造、置換、または修復されるべき組織部分の3次元モデルを獲得する段階、（b）該3次元モデルを2つ以上のモデルセグメントに分割する段階、（c）2つ以上の組織移植片セグメントを製造する段階であって、各組織移植片セグメントが、段階（b）の該モデルセグメントのうちの1つに対応するサイズ及び形を有する、段階、並びに（d）該2つ以上の組織移植片セグメントを組み立てて組織移植片を形成する段階を含む、組織移植片の製造方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片セグメント（例えば、上述したように、または本書の他の部分に記載の通り、組織移植片の製造に用いられる）の製造方法であって、製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分のセグメント（組織セグメント）またはその3次元モデル（モデルセグメント）に対応するサイズ及び形を有する足場を獲得する段階を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片セグメント（例えば、上述したように、または本書の他の部分に記載の通り、組織移植片の製造に用いられる）の製造方法であって、製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分（組織セグメント）またはその3次元モデルに対応するサイズ及び形を有する足場前駆体を獲得する段階、並びに該足場前駆体を分割（例えばスライス）して2つ以上の足場を形成する段階であって、該足場が、製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分のセグメント（組織セグメント）またはその3次元モデル（モデルセグメント）に対応するサイズ及び形を有する段階を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片セグメント（例えば、上述した、または本書の他の部分に記載の方法のうちの1つと併せて使用するため）の製造方法であって、（i）製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分のセグメント（組織セグメント）またはその3次元モデル（モデルセグメント）に対応するサイズ及び形を有する足場を獲得する段階、並びに（ii）1つ以上の細胞集団を該足場に適用する段階を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片セグメント（例えば、上述した、または本書の他の部分に記載の方法のうちの1つと併せて使用するため）の製造方法であって、（i）製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分のセグメント（組織セグメント）またはその3次元モデル（モデルセグメント）に対応するサイズ及び形を有する足場を獲得する段階、（ii）1つ以上の細胞集団を該足場に適用する段階、並びに（iii）該細胞を該足場上で培養して組織移植片セグメントを形成する段階を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片セグメント（例えば、上述した、または本書の他の部分に記載の方法のうちの1つと併せて使用するため）の製造方法であって、（i）製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分のセグメント（組織セグメント）またはその3次元モデル（モデルセグメント）に対応するサイズ及び形を有する足場を獲得する段階、（ii）1つ以上の細胞集団を該足場に適用する段階、（iii）該足場を収容するように構成された移植片チャンバー（例えば、該足場に対応する内部のサイズ及び形を有する移植片チャンバーまたは移植片チャンバー挿入物を有する）を含む培養容器を獲得する段階、（iv）該培養容器の該移植片チャンバーに該足場を挿入する段階、並びに（v）該細胞を、該培養容器内で該足場上で培養して組織移植片セグメントを形成する段階を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片セグメント（例えば、上述した、または本書の他の部分に記載の方法のうちの1つと併せて使用するため）の製造方法であって、（i）製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分のセグメント（組織セグメント）またはその3次元モデル（モデルセグメント）に対応するサイズ及び形を有する足場を獲得する段階、（ii）該足場を収容するように構成された移植片チャンバーを含む培養容器（例えば、該足場に対応する内部のサイズ及び形を有する移植片チャンバーまたは移植片チャンバー挿入物を有する）を獲得する段階、（iii）該培養容器の該移植片チャンバーに該足場を挿入する段階、（iv）1つ以上の細胞集団を該移植片チャンバーの該足場に適用する段階、並びに（v）該細胞を、該培養容器内で該足場上で培養して組織移植片セグメントを形成する段階を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片または組織移植片セグメントの製造に使用されうる足場の様々な製造方法を提供する。
1つのかかる実施形態において、本発明は、製造、置換、または修復されるべき組織部分の3次元モデルを獲得する段階を含む、足場の前駆体の製造方法であって、該足場の前駆体が、該組織部分またはその3次元モデルに対応するサイズ及び形を有する、方法を提供する。
1つのかかる実施形態において、本発明は、製造、置換、または修復されるべき組織部分の3次元モデルを獲得する段階を含む、足場の製造方法であって、該足場が、該組織部分のセグメントまたは該組織部分の3次元モデルのセグメントに対応するサイズ及び形を有する、方法を提供する。
別のかかる実施形態において、本発明は、足場の製造方法であって、（a）製造、置換、または修復されるべき組織部分の3次元モデルを獲得する段階、及び（b）該3次元モデルを2つ以上のセグメント（モデルセグメント）に分割する段階を含む、方法を提供する。
別のかかる実施形態において、本発明は、製造、置換、または修復されるべき組織部分の3次元モデルを獲得する段階を含む、足場の製造方法であって、該モデルが2つ以上のセグメント（モデルセグメント）に分割されている、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、足場の製造方法であって、製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分、またはその3次元モデルに対応するサイズ及び形を有する足場の前駆体を獲得する段階、並びに該足場前駆体を分割（例えばスライス）して2つ以上の足場を形成する段階であって、該足場の各々が、製造、置換、もしくは修復されるべき組織部分のセグメント（組織セグメント）またはその3次元モデル（モデルセグメント）に対応するサイズ及び形を有する段階を含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本書に記載の該組織移植片及び／または組織移植片セグメントの製造に用いるのに適したバイオリアクター、バイオリアクターの移植片チャンバー、またはバイオリアクターの移植片チャンバー挿入物の様々な製造方法を提供する。
1つのかかる実施形態において、本発明は、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片チャンバー、またはバイオリアクターの移植片チャンバー挿入物の製造方法であって、製造、置換、または修復されるべき組織部分の3次元モデルを獲得する段階を含む、方法を提供する。
別のかかる実施形態において、本発明は、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片チャンバー、またはバイオリアクターの移植片チャンバー挿入物の製造方法であって、（a）製造、置換、または修復されるべき組織部分の3次元モデルを獲得する段階、及び（b）該3次元モデルを2つ以上のセグメント（モデルセグメント）に分割する段階を含む、方法を提供する。
別のかかる実施形態において、本発明は、製造、置換、または修復されるべき組織部分の3次元モデルを獲得する段階を含む、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片チャンバー、またはバイオリアクターの移植片チャンバー挿入物の製造方法であって、該モデルが、2つ以上のセグメント（モデルセグメント）に分割されている、方法を提供する。
別のかかる実施形態において、本発明は、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片チャンバー、またはバイオリアクターの移植片チャンバー挿入物の製造方法であって、（a）製造、置換、または修復されるべき組織部分の3次元モデルを獲得する段階、（b）該3次元モデルを2つ以上のモデルセグメントに分割する段階、並びに（c）各々が段階（b）の該モデルセグメントのうちの1つのサイズ及び形に対応する内部のサイズ及び形を有する、2つ以上のバイオリアクター、バイオリアクターの移植片チャンバー、またはバイオリアクターの移植片チャンバー挿入物を製造する段階を含む、方法を提供する。
上述した方法に加えて、かかる実施形態の多くの変化形が想定され、これらは、限定されないが、上述した方法もしくは上述した方法の段階のいずれか1つ以上を組み合わせた実施形態または上述した方法の段階のいずれかの順序を変えた実施形態を含めて、本発明の範囲内である。
いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片、及びそのセグメント（組織移植片セグメント）を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、本書に記載の方法のいずれかを用いて作製された組織移植片及び組織移植片セグメントを提供する。
1つの実施形態において、本発明は、2つ以上の組織移植片セグメントを含む組織移植片を提供する。1つの実施形態では、本発明は、2つ以上の組織移植片セグメントを含む組織移植片であって、置換もしくは修復されるべき組織部分、またはその3次元モデルに対応する形及びサイズを有する組織移植片を提供する。
1つの実施形態において、本発明は、2つ以上の組織移植片セグメントを含む組織移植片であって、各組織移植片セグメントが、最大厚さ（すなわち、その最も厚い点）約0．3mm～約10mmを有する組織移植片を提供する。
1つの実施形態において、本発明は、2つ以上の組織移植片セグメントを含む組織移植片であって、各組織移植片セグメントが、幹細胞または前駆細胞（例えば、人工多能性幹細胞）から分化した組織細胞を含む組織移植片を提供する。
1つの実施形態において、本発明は、2つ以上の組織移植片セグメントを含む組織移植片であって、各組織移植片セグメントが、幹細胞または前駆細胞（例えば、人工多能性幹細胞）から分化した内皮細胞等の内皮細胞を含む組織移植片を提供する。
1つの実施形態において、本発明は、インプラント材料（すなわち、チタンまたは鋼鉄）及び2つ以上の組織移植片セグメントを含む組織移植片であって、各組織移植片セグメントが、最大厚さ（すなわち、その最も厚い点）約0．3mm～約10mmを有する血管組織移植片を提供する。
1つの実施形態において、本発明は、インプラント材料（すなわち、チタンまたは鋼鉄）及び2つ以上の骨移植片セグメントを含むカスタマイズされた骨移植片であって、各骨移植片セグメントが、最大厚さ（すなわち、その最も厚い点）約0．3mm～約10mmを有し、該骨移植片が、幹細胞または前駆細胞（例えば、人工多能性幹細胞）由来の骨細胞及び、幹細胞または前駆細胞（例えば、人工多能性幹細胞）由来の内皮細胞を含む、血管形成された骨移植片を提供する。
上述した組織移植片に加えて、かかる組織移植片の多くの変化形が想定され、これらは、限定されないが、本明細書の他の部分に記載されたもの、及び上述のまたは本出願の他の部分に記載された1つ以上の要素のいずれかを組み合わせたものを含めて、本発明の範囲内である。
いくつかの上記実施形態において、該組織移植片または組織移植片セグメントは、骨組織移植片または骨組織移植片セグメントである。いくつかの実施形態では、該組織移植片または組織移植片セグメントは、軟骨移植片または軟骨移植片セグメントである。
いくつかの上記実施形態において、該組織移植片または組織移植片セグメントは、非ヒト霊長類、ヒツジ、またはげっ歯類（ラットやマウス等）由来細胞等の哺乳類細胞を含む。いくつかの上記実施形態では、該組織移植片または組織移植片セグメントは、ヒト細胞を含む。いくつかの上記実施形態では、該組織移植片または組織移植片セグメントは、該組織移植片が移植されるべき対象と同じ対象由来の細胞集団（すなわち、自己細胞）の1つ以上を含む。いくつかの上記実施形態では、該組織移植片または組織移植片セグメントは、幹細胞または前駆細胞、例えば、人工多能性幹細胞由来の細胞集団の1つ以上を含む。
いくつかの上記実施形態において、該組織移植片または組織移植片セグメントは、血管形成される。いくつかの上記実施形態では、該組織移植片または組織移植片セグメントは、内皮細胞、例えば、人工多能性幹細胞等の幹細胞もしくは前駆細胞から誘導された内皮細胞を含む。
いくつかの上記実施形態において、該組織移植片セグメントは、例えば最も厚い部分で、厚さが約20mmもしくはそれ以下、15mmもしくはそれ以下、または10mmもしくはそれ以下である。例えば、いくつかの上記実施形態では、該組織移植片セグメントは、例えば最も厚い部分で、厚さが約0．3mm～約10mmである。
いくつかの上記実施形態において、該培養容器は、直接灌流バイオリアクター等のバイオリアクターである。いくつかの上記実施形態では、該足場または組織移植片セグメントは、圧入状態でバイオリアクターに配置される。いくつかの上記実施形態では、組織移植片セグメントは、直接灌流下及び／または圧入状態でバイオリアクターにおいて培養される。
いくつかの上記実施形態において、該足場は、コンピュータ支援製造、3次元印刷、注型、フライス加工、レーザ切断、ラピッドプロトタイピング、またはこれらの任意の組み合わせを用いて生成またはカスタマイズされる。
いくつかの上記実施形態において、該バイオリアクター、バイオリアクターの移植片チャンバー、またはバイオリアクターの移植片チャンバー挿入物は、コンピュータ支援製造、3次元印刷、注型、フライス加工、レーザ切断、ラピッドプロトタイピング、またはこれらの任意の組み合わせを用いて生成またはカスタマイズされる。
いくつかの上記実施形態において、該組織移植片は、生体適合性接着剤、ステッチ、縫合糸、ステープル、プレート、ピン、ねじ、またはこれらの任意の組み合わせを用いて連結された2つ以上の組織移植片セグメントを含む。
いくつかの実施形態において、本発明が提供する方法、組成物、及び装置、並びにそこから製造された組織は、治療目的（病理学的または外傷性組織欠陥の修復等）、美容目的、または、モデル系での疾病の研究もしくは治療法の開発用を含めて、様々な用途に有用でありうる。
[本発明1001]
a）インプラント材料；及び
b）足場を有する人工骨組織移植片
を含む、骨-インプラントハイブリッド移植片であって、
足場上に播種された細胞から構成され、インプラント材料への細胞の接着を促進するよう培養される、移植片。
[本発明1002]
インプラント材料がチタンまたは鋼鉄を含む、本発明1001の移植片。
[本発明1003]
組織移植片が幹細胞または前駆細胞由来の細胞を含む、本発明1001の移植片。
[本発明1004]
組織移植片が人工多能性幹細胞由来の細胞を含む、本発明1001の移植片。
[本発明1005]
足場が約0.3ミリメートル～約10ミリメートルの厚さを有する、本発明1001の移植片。
[本発明1006]
足場が1センチメートル未満の厚さを有する、本発明1001の移植片。
[本発明1007]
足場が脱細胞化骨組織から本質的になる、本発明1001の移植片。
[本発明1008]
骨組織がウシ骨組織である、本発明1007の移植片。
[本発明1009]
骨組織がヒト骨組織である、本発明1007の移植片。
[本発明1010]
足場が1つまたは複数の合成材料を含む、本発明1001の移植片。
[本発明1011]
合成材料が、セラミック、セメント、ポリマー複合材料またはこれらの任意の組み合わせを含む、本発明1010の移植片。
[本発明1012]
足場が機能化されている、本発明1001の移植片。
[本発明1013]
足場が、インプラント材料に適応した1つまたは複数の開口部を含む、本発明1001の移植片。
[本発明1014]
培養が静的条件下で行われる、本発明1001の移植片。
[本発明1015]
培養が動的条件下で行われる、本発明1001の移植片。
[本発明1016]
培養が、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9または約10週間行われる、本発明1001の移植片。
[本発明1017]
培養が10週間より長く行われる、本発明1001の移植片。
[本発明1018]
培養が培養容器中で行われる、本発明1001の移植片。
[本発明1019]
培養容器が、バイオリアクター、スピナーフラスコ、回転式容器、灌流もしくは加圧システムまたはこれらの任意の組み合わせを含む、本発明1001の移植片。
[本発明1020]
組織移植片が骨移植片である、本発明1001の移植片。
[本発明1021]
組織移植片が血管形成される、本発明1001の移植片。
[本発明1022]
組織移植片が2つまたはそれ以上の細胞型を含む、本発明1001の移植片。
[本発明1023]
足場が、カスタマイズされた形状及び／またはサイズを有する、本発明1001の移植片。
[本発明1024]
足場に播種された細胞が、インプラント材料の周囲での新しい組織の形成を促進する、本発明1001の移植片。
[本発明1025]
細胞が間葉系前駆細胞を含む、本発明1003の移植片。
[本発明1026]
インプラント材料に対する組織の分子的及び／または生物学的反応を決定するために分析される、本発明1001の移植片。
[本発明1027]
分析が、以下：
a）インプラント材料と組織移植片との融合；
b）組織移植片の量及び／もしくは質；
c）インプラント材料と組織移植片との相互作用；
d）インプラント材料への及び／もしくはインプラント材料上での及び／もしくはインプラント材料の周囲での細胞の遊走；
e）細胞接着、細胞形態、細胞生存率及び／もしくは細胞増殖；
f）組織移植片における遺伝子及び／もしくはタンパク質の発現及び／もしくは放出；
g）インプラント材料と組織移植片との相互作用の強さ；または
h）インプラント材料の生物力学
の1つまたは複数を決定することを含む、本発明1026の移植片。
[本発明1028]
分析が、コンピュータ断層撮影（CT）法、マイクロトモグラフィー（マイクロCT）法、顕微鏡法、電子顕微鏡法、走査電子顕微鏡法、免疫組織化学法、組織学法またはこれらの任意の組み合わせを含む、本発明1027の移植片。
[本発明1029]
a）1つまたは複数の組織形成細胞集団；
b）1つまたは複数の足場；及び
c）インプラント材料
を含む、骨-インプラントハイブリッド移植片を作製するためのキット。
[本発明1030]
各組織形成細胞集団が足場に事前適用されている、本発明1029のキット。
[本発明1031]
インプラント材料がチタンである、本発明1029のキット。
[本発明1032]
少なくとも1つの細胞集団が、幹細胞または前駆細胞由来の細胞を含む、本発明1029のキット。
[本発明1033]
少なくとも1つの細胞集団が、人工多能性幹細胞由来の細胞を含む、本発明1029のキット。
[本発明1034]
各足場が約0.3ミリメートル～約10ミリメートルの厚さを有する、本発明1029のキット。
[本発明1035]
各足場が1センチメートル未満の厚さを有する、本発明1029のキット。
[本発明1036]
各足場が脱細胞化骨組織から本質的になる、本発明1029のキット。
[本発明1037]
足場が機能化されている、本発明1029のキット。
[本発明1038]
骨組織がウシ骨組織である、本発明1036のキット。
[本発明1039]
骨組織がヒト骨組織である、本発明1036のキット。
[本発明1040]
足場が1つまたは複数の合成材料を含む、本発明1029のキット。
[本発明1041]
合成材料が、セラミック、セメント、ポリマー複合材料またはこれらの任意の組み合わせを含む、本発明1040のキット。
[本発明1042]
足場が、インプラント材料に適応した1つまたは複数の開口部を含む、本発明1029のキット。
[本発明1043]
組織移植片を形成するために足場上で1つまたは複数の細胞集団を培養する段階を含む、骨-インプラントハイブリッド移植片を製造する方法であって、
組織移植片が、インプラント材料への細胞の接着を促進するようインプラント材料と共に培養される、
方法。
[本発明1044]
組織移植片が骨移植片である、本発明1043の方法。
[本発明1045]
組織移植片が軟骨移植片である、本発明1043の方法。
[本発明1046]
組織移植片が血管形成される、本発明1043の方法。
[本発明1047]
組織移植片が約1センチメートルまたはそれ未満の厚さを有する、本発明1043の方法。
[本発明1048]
組織移植片が約0.3ミリメートル～約10ミリメートルの厚さを有する、本発明1043の方法。
[本発明1049]
足場が、コンピュータ支援製造、3次元印刷、注型、フライス加工、レーザ切断、ラピッドプロトタイピングまたはこれらの任意の組み合わせを用いて生成される、本発明1043の方法。
[本発明1050]
細胞が人工多能性幹細胞由来である、本発明1043の方法。
[本発明1051]
細胞が、骨形成細胞及び／または骨形成細胞に分化することができる細胞を含む、本発明1043の方法。
[本発明1052]
細胞が、血管形成細胞及び／または血管形成細胞に分化することができる細胞を含む、本発明1043の方法。
[本発明1053]
細胞が内皮前駆細胞を含む、本発明1043の方法。
[本発明1054]
インプラント材料に組織移植片を結合させる段階を含む、本発明1001～1028のいずれかの骨-インプラントハイブリッド移植片を形成する方法。
[本発明1055]
インプラント材料に結合させる前に、組織移植片に細胞が播種される、本発明1055の方法。
[本発明1056]
インプラント材料に結合させた後に、組織移植片に細胞が播種される、本発明1055の方法。
[本発明1057]
インプラント材料と組織移植片とが、ねじ込み結合される、本発明1055の方法。
[本発明1058]
インプラント材料と組織移植片とが、手作業により結合されるまたは機械化されたツールを介して結合される、本発明1055の方法。
[本発明1059]
組織移植片に穴をあけ、その穴にインプラント材料を挿入することによって、インプラント材料と組織移植片とが結合される、本発明1055の方法。
（左パネル）骨格異常のデジタルモデルを作り出し、分割（ここでは、A、B、及びCと標示した3つのセグメントに分割）し、カスタマイズされた生体材料製足場及びバイオリアクターを組み立てるのに使用する；（右パネル）CADソフトを用いて作り出された灌流バイオリアクターの上部（A）及び下部（B）の例。 骨形成前駆細胞及び血管前駆細胞は、hiPSCから生成し、灌流バイオリアクターにおいて、カスタマイズされた骨誘導性足場（ここでは、A、B、及びCと標示した3つの足場）で共培養する。 人工的に作り出された血管形成された骨セグメント（ここでは、A、B、及びCと標示した3つのセグメント）は、生体適合性骨接着剤を用いて組み立てられ、並びに／または3D印刷されたチタン製ピン及び穴を用いて強化される。大きな動物で臨床的に意義のある骨格異常を修復するため、さらなる研究が計画されうる。 図4A：修復されるべき骨欠損のデジタル再構成（暗灰色）付きヒト大腿骨3次元デジタルモデル。図4B：図4Aに示した骨欠損のデジタルモデルの5つのモデルセグメント（暗灰色）への分割。該モデルセグメントは、サイズ及び形が該モデルセグメントの各々に対応する生体材料製の細胞の足場（淡灰色）の製造を行うために用いることができる。 本発明によって提供される例示的な細胞培養の足場の斜視図。図5Aは、単一の足場の拡大図を示す。該足場は、本書に記載の通り、組織の部分のデジタル画像に基づいて設計及び製造されうる。図5Bは、異なる形とサイズの複数の足場を示す。複数の足場は、本書に記載の通り、例えば、大きな骨移植片の相補的セグメントの製造に用いることができる。 本発明によって提供される例示的な複数チャンバーバイオリアクターの断面図。 骨形成条件下で7週間、静的培養条件または動的培養条件の下で人工骨移植片をインプラント材料（チタンねじ）と共に培養した本発明の実施形態のフローチャート。このチャートは、組織に対するインプラント材料の生体適合性を決定するために実施することができる方法及び分析の例、例えば組織の細胞傷害性、マイクロCT、引き抜き試験、硬組織学（hard histology）及びDNA量、RNA発現並びにタンパク質産生及び放出を含む。 マルチウェル細胞培養皿での静的培養の例。 マルチウェル細胞培養皿での静的培養の例。 動的培養のための灌流バイオリアクターの例。 左パネルは、チタンねじミニインプラントを示している。右パネルは、脱石灰化ウシ骨足場に挿入されたチタンミニインプラントを示している。 骨細胞は、脱石灰化ウシ骨足場上で増殖し、チタンインプラント上に遊走する。生きた健常な骨細胞は緑色に染色され、死んだ細胞は赤色に染色されている。上パネルは、インプラント上で増殖する生きた骨細胞を示している。下パネルは、インプラントに向かう（インプラントの縁が点線により示されている）及びインプラント上への骨細胞の遊走を示している。 インプラント／骨移植片構築物において組織学を実施するため、この構築物を樹脂で包埋し、改訂版Erben 1779プロトコル（Reinhold G. Erben, J Histochem Cytochem 45: 307 (1997)）にしたがい切片化した。 インプラント／骨移植片構築物の断面の組織学的染色は、チタンインプラントの表面上で増殖する骨細胞を示している。Stevenel's blueを使用して、新たに形成された骨組織内の細胞の核を染色した（青色）。脱石灰化ウシ骨足場は、茶色に染色されている。 左パネルは、その中心部にインプラント材料の挿入に対応する開口部を有する足場の上面図を示している。右パネルは、足場の開口部に挿入された仮想の材料またはインプラントまたはデバイスの上面図を示している。 図13A～13Fは、ヒトiPSC-MP細胞の表現型特徴づけに関する一連の図面である。図13A：未分化1013Aヒト人工多能性幹細胞株は、OCT4（緑色）、SOX2（緑色）及びTRA-1-60（赤色）に関して陽性である。核はDAPIで染色されている（青色）。スケールバー：200μm。図13B：第4継代（P4）及び第10継代（P10）における間葉系1013A由来間葉系前駆細胞（1013A-MP）及び骨髄由来間葉系幹細胞株1（BMSC1）の形態。スケールバー：100μm。図13C：1013A-MPは、10継代を超えて培養したとき、BMSC1よりも高い増殖能を示す（数値は増殖中の累積培養日数を示している）。図13D：フローサイトメトリーによる特徴づけは、1013A-MPとBMSC1とで類似する表面抗原プロフィールを明らかにしている。図13E：1013A-MP及びBMSC1は、OCT4（緑色）、SOX2（緑色）及びTRA-1-60（赤色）に関して染色すると、陰性である。核はDAPIで染色されている（青色）。スケールバー：50μm。図13F：1013A-MP及びBMSC1は、多能性遺伝子を発現しないが（限定量のZPF42を除く）、いくつかの中胚葉系統特異的遺伝子を発現する。データは、平均±SDを表している（n=3、P<0.05；アスタリスクは、1013A-MP株とBMSC1株の間の有意差を示している）。 図14A～14Eは、インプラント材料をスクリーニングする生物模倣プラットフォームに関する一連の画像である。図14A：チタンミニインプラント（高さ6 mm、直径2 mm）。図14B：Tiインプラントを固定する脱細胞化骨足場の構築物。図14C：播種3日後の生きているiPSC-MP細胞（緑色；1013A株）を示す蛍光顕微鏡画像から生成されたモザイク像。図14D：インプラント-足場境界面の生きている細胞（緑色）及び死んでいる細胞（赤色）を示す高拡大率共焦点画像（10倍）。図14E：骨形成培地中での培養の7週間後にVan Giesonピクロフクシンで染色されたスクリーニングプラットフォームのモザイク断面図。 ヒト人工多能性幹細胞からの骨組織置換物の作製。皮膚生検由来のヒト線維芽細胞を、非組み込み型ベクターを用いて再プログラムした。次いで生成されたiPSC株を間葉系統に誘導し、脱細胞化骨足場に播種した。この細胞-足場構築物を、灌流バイオリアクター内で5週間培養し、次いで免疫不全マウスに3ヵ月間移植した。外植片の分析により、表現型において安定かつ成熟した骨様組織の形成が明らかになった。 図16A～16Cは、足場へのインプラントの挿入及び力学的安定性に関する一連の図面である。図16A：挿入前にM1.6タップを用いて足場の中心部に対して垂直にねじ穴を作製した。図16B：0.2 mm/sの速度でインプラントを取り出すInstron DynaMite 8841（商標）テスター。図16C：手作業または機械化された挿入の後にインプラントを取り出すのに要する引き抜き力の間の比較。 図17A～17Fは、インプラント材料を試験するための生物模倣プラットフォームに関する一連の図面である。図17A：チタンインプラント（高さ6 mm、直径2 mm）を固定する脱細胞化ウシ骨足場。図17B：播種3日後の生きているiPSC-MP細胞（緑色；1013A株）を示す蛍光顕微鏡画像から生成されたモザイク像。図17C：インプラント-足場境界領域の生きている細胞（緑色）及び死んでいる細胞（赤色）を示す底面高拡大率共焦点画像。図17D：骨形成培地中での培養の7週間後にVan Giesonピクロフクシンで染色された試験プラットフォームのモザイク断面図。図17E：播種3日後の試験プラットフォームのマイクロコンピュータ断層撮影再構築。図17F：骨-インプラント境界面のEDS分析。 インプラント材料と連結された骨試料に関する灌流システム内の流体力学を示すComsol Multiphysics（商標）におけるシミュレーション研究。この結果は、流体の速度及び圧並びに骨-インプラント構築物のボリューム全体において細胞に加わったせん断応力に対するインプラントによる影響が、無視できる程度であることを示している。 実施例3で考察されているように骨前駆細胞が播種され培養された脱細胞化骨足場への挿入後に、インプラント（チタン及びステンレス鋼）を取り出すのに要する引き抜き力の間の比較のグラフである。 骨組織の発生に対するバイオリアクターの影響を示す一連の画像である。低拡大率組織学的顕微鏡写真。灌流バイオリアクターにおいて5週間、脱細胞化ウシ足場上で培養されたH9由来の前駆細胞の構築物は、静的培養由来の構築物と比較して均一な組織形成及びより濃厚な組織マトリクスを示した（上）。灌流バイオリアクターにおける骨マトリクスタンパク質のより多量の付着が、コラーゲン（Massonトリクロム、青色；中央上）、オステオポンチン（茶色；中央）、骨シアロタンパク質（茶色；中央下）及びオステオカルシン（茶色；下）の陽性染色によって確認された。第3週及び第5週の静的培養構築物においては、最低限の染色しか観察されなかった。（差し込み図）陰性染色対照。 骨組織の発生に対するバイオリアクターの影響を示す一連の画像である。低拡大率組織学的顕微鏡写真。灌流バイオリアクターにおいて5週間、脱細胞化ウシ足場上で培養された1013A由来の前駆細胞の構築物は、静的培養由来の構築物と比較して均一な組織形成及びより濃厚な組織マトリクスを示した（上）。灌流バイオリアクターにおける骨マトリクスタンパク質のより多量の付着が、コラーゲン（Massonトリクロム、青色；中央上）、オステオポンチン（茶色；中央）、骨シアロタンパク質（茶色；中央下）及びオステオカルシン（茶色；下）の陽性染色によって確認された。第3週及び第5週の静的培養構築物においては、最低限の染色しか観察されなかった。（差し込み図）陰性染色対照。 骨組織の発生に対するバイオリアクターの影響を示す一連の画像である。低拡大率組織学的顕微鏡写真。灌流バイオリアクターにおいて5週間、脱細胞化ウシ足場上で培養されたBC1由来の前駆細胞の構築物は、静的培養由来の構築物と比較して均一な組織形成及びより濃厚な組織マトリクスを示した（上）。灌流バイオリアクターにおける骨マトリクスタンパク質のより多量の付着が、コラーゲン（Massonトリクロム、青色；中央上）、オステオポンチン（茶色；中央）、骨シアロタンパク質（茶色；中央下）及びオステオカルシン（茶色；下）の陽性染色によって確認された。第3週及び第5週の静的培養構築物においては、最低限の染色しか観察されなかった。（差し込み図）陰性染色対照。 実施例3で考察されているように骨前駆細胞が播種され7週間培養された脱細胞化骨足場への挿入後に、インプラント（チタン及びステンレス鋼）を取り出すのに要する引き抜き力の間の比較のグラフである。
発明の詳細な説明
本発明は、人工組織移植片、例えば、インプラント材料（例えば、チタンまたは鋼鉄）と、骨材料（例えば、骨前駆細胞を播種され非自然発生的な骨材料を形成するよう培養された脱細胞化骨足場）とを含む骨移植片を提供する。
本発明のインプラントは、幅広い医学的用途を有する。例えば、歯科及び整形外科において、補綴材は、歯のない人及び骨格異常を患った患者を処置するために日常的に使用されており、世界市場は、毎年数十億ドルに相当する。これらのデバイスは、この10年間で多くの患者の生活を改善しているが、限られた量の骨組織、骨の量及び／または乏しい骨の質により特徴づけられる臨床例においては効果的でない。例えば、頭蓋骨と歯との間の境界面における大規模な顎顔面異常の再建は、総合的アプローチ及び多くの場合、複数回の手術を必要とし、そのため治癒及びリハビリ期間が長期化する。したがって、より安全かつより効果的な処置法、例えば欠けている歯だけでなくその歯を固定する失われた骨組織をも置換する移植片及び／または補綴を患者に提供するために、新しい戦略が必要とされている。
複雑な骨格再建を管理及び処置する現行の方法に革命を起こす可能性を秘めている骨-インプラントハイブリッド移植片を、患者特異的な細胞から作製することができることが実証された。1つの局面において、本開示は、インプラント（チタンまたは他の補綴物）を解剖学的形状の生物模倣足場（天然または合成）に連結し、次いでその足場-インプラント構築物に患者特異的な細胞を播種してインビボまたはインビトロでカスタマイズされた骨-インプラント移植片を成長させ、その後にそれを移植することを想定している。実施形態において、インプラント材料は、インビトロでこの人工組織を培養した後及び患者への移植の前に連結／固定されうる。
本明細書に記載されるように、1つの実施形態において、本発明者らは、チタンインプラント（直径2 mm、高さ6 mm）を脱細胞化ウシ骨足場（直径8 mm、高さ3～4 mm）に固定し、このインプラント-足場構築物にヒトiPSC-MPを播種してインプラント周囲で生きた組織を成長させた。このインプラントを足場に連結するため、タップ固定スタンド及びM1.6タップを用いて足場の中心部で垂直ねじ穴を作製し、次いでインプラントを手作業でまたは機械的に（リニアトルク安定化アームを備えたASG XPAC（登録商標）SD2500電気スクリュードライバーを2000度の回転角度で用いて）のいずれかで挿入した。ASG XPAC（登録商標）SD2500を使用することで、例えばトルク値及び／または回転角度を制御することにより、インプラントを確実に足場に設置することが可能となる。インプラントを足場に設置した後、インプラント-足場構築物をμCTを通じて画像化し、足場の構造的特徴（空隙率、孔サイズ及び分布）に関するデータを取得し、インプラントと足場との間の接触面積を概算した。次いでその後、Instron DynaMite（登録商標）8841テスターを用いて、引き抜き、押し出し及びトルク試験を含む生物力学試験を行った。重回帰分析を行い、足場密度及び構造的特徴と、異なる設置方法を用いて達成された一次インプラント安定性との間の関連性を排除した。
リニアトルク安定化アームにより支持された電気スクリュードライバーの使用により、足場（または細胞を播種された足場、または所望の期間、すなわち、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週もしくはそれ以上の期間、細胞と共に培養された足場）へのインプラントの正確な設置が可能となると見込まれる。
インプラントの正確な設置は、足場の損壊及びインプラントの動きを減らすのに重要であり、より均一な試料間の骨対インプラント接触面積を達成すると考えられる。骨対インプラント接触面積は、インビボでのインプラントと組織との間の相互作用の強さに影響するので（一次及び二次の両方）、再現可能なインプラント設置戦略は、インビトロでインプラント材料を試験するためのプラットフォームの精度を高めるのに重要である。
この技術は、民間人及び退役軍人により良い処置選択肢を提供し、手術の数、リハビリ期間及びこの医療負担に関連する医療費を減らすことができる。インプラント周囲で個人向けの生きた骨を成長させる能力もまた、変性障害または骨壊死患者におけるオッセオインテグレーションの向上のための骨コーティングの開発を促進する。
いくつかの実施形態において、骨移植片は、骨発生の生物模倣アプローチを用いてインビトロで人工多能性幹細胞から作製される（de Peppo et al., PNAS 110(21): 8680-5 (2013)）。
いくつかの実施形態において、本発明は、一部分において、血管形成された骨移植片等の組織移植片、並びに、例えば、かかる組織移植片の製造に用いるのに適したバイオリアクター装置を含む、かかる組織移植片の製造方法及び製造装置を提供する。いくつかの実施形態では、本書に記載の方法は、例えば、骨移植片等の組織移植片を、分節付加骨工学（SABE）及び／または分節付加組織工学（SATE）によってインビトロで生成するために用いられうる。いくつかの実施形態では、本発明が提供する方法は、インビトロで組織のセグメントを成長させるため、組織の部分のデジタルモデル、及び／もしくはカスタマイズされた組織培養足場、並びに／またはカスタマイズされたバイオリアクターを利用する。いくつかの実施形態では、該足場及びバイオリアクターのサイズ及び形は、限定されないが、医療用画像、コンピュータ支援設計（CAD）、及び／またはコンピュータ支援製造（CAM）戦略が挙げられる革新的な工学戦略を用いて、所望の組織移植片のサイズ及び形に対応するようにカスタマイズされうる。いくつかの実施形態では、機能性組織は、所望の（1または複数の）組織を形成可能な任意の適切な細胞、例えば、造骨細胞（例えば、骨移植片の製造用の）もしくは血管形成細胞（例えば、血管組織移植片の製造用の）、または、所望の組織形成細胞に分化できる任意の細胞、例えば、前駆細胞もしくは多能性細胞を用いて成長させることができる。いくつかの実施形態では、かかる細胞は、患者自身の細胞（すなわち、自己細胞）であっても、これを含んでもよく、また、患者自身の細胞由来の細胞、例えば、人工多能性幹細胞であっても、これを含んでもよい。いくつかの実施形態では、バイオリアクターでの培養の後、複数の組織セグメントを組み立て、互いに固着して（例えば、「レゴ様」手法で）組織移植片、例えば、特定の組織部分、例えば、置換または再建される必要のある組織部分の寸法と幾何学的形態に対応する組織移植片を形成してもよい。かかる技術は、本書では、分節付加組織工学（SATE）、または、特に骨の場合は、分節付加骨工学（SABE）と言うことがある。
いくつかの実施形態において、本発明が提供する組織移植片及び方法は、臨床応用、例えば、対象における骨欠損等の組織欠損を修復または置換するために、組織もしくは代替組織の再現性のある及び／または大規模な製作を可能にするために用いられうる。本出願の実施例及び他の節にさらに記載されるように、本発明のいくつかの実施形態は、血管形成された機能性組織移植片、例えば、血管形成された機能性骨移植片を作製するために用いることができる。幾何学的に定義された大きな組織移植片の、例えば人工多能性幹細胞等の細胞を用いた製造は、幹細胞生物学と医用工学との間の接点での新規な革新的戦略であって、臨床応用、病変のモデリング、及び薬剤スクリーニングを非限定的に含む様々な目的に用いることができる。
本発明の主な実施形態の一部は、本出願の上記発明の概要の節、並びに実施例、図面、及び特許請求の範囲にも記載されている。詳細な説明の節は、本発明の組成物及び方法に関したさらなる説明を提供し、本出願の発明の概要、実施例、図面、及び特許請求の範囲の節を含めた本特許出願の他の節のすべてと併せて解釈されることを意図している。
略称及び定義
略称「CAD」はコンピュータ支援設計を指す。
略称「CAM」はコンピュータ支援製造を指す。
略称「CNC」はコンピュータ数値制御を指す。
本明細書において、「細胞／足場」、「足場／細胞」、「細胞／足場構築物」、「細胞／足場複合体」、「足場／細胞構築物」、及び「足場／細胞複合体」という用語は、同じ意味で使われ、細胞が適用された足場を指す。
本明細書において、「約」及び「およそ」という用語は、数値に関連して使用された場合、表示の値の＋または－20％の範囲内を意味する。
さらなる定義及び略称は、本特許明細書の他の部分に記載されるか、または、当技術分野では周知である。
サイズ及び形の変動
本明細書において、「対応した」及び「対応する」という用語は、2つ以上の要素のサイズ及び形の整合が検討される本発明の任意の実施形態に関して使用された場合、この節に記載のサイズ及び形の変動のいずれかを意味しうる。この節に記載のかかる変動は、2つ以上の要素のサイズ及び形の整合が検討される本発明の実施形態のすべてに等しく適用することができる。かかる要素としては、組織部分、組織モデル、組織移植片、モデルセグメント、組織セグメント、バイオリアクター、バイオリアクターチャンバー（例えば、バイオリアクターの移植片チャンバー）及び挿入物（例えば、バイオリアクターの移植片チャンバー挿入物）、足場、足場前駆体、細胞／足場構築物、並びに本出願に記載の本発明の他の要素が挙げられる。
この節の例示的実施形態は、本発明の二つの要素‐第一の要素及び第二の要素‐の間のサイズ及び形の変動を記載している。しかしながら、本発明は、任意の所望の数の要素、例えば、3、4、5、またはそれ以上が、本書に記載の通り、対応するサイズ及び形を有しうることを考慮している。限定されないが、本明細書の他の部分に記載されたもの、及び、上述した、または本出願の他の部分に記載の要素の任意の1つ以上を組み合わせるものを含めて、要素の多数の組み合わせが想定され、これらは本発明の範囲内である。この節に記載の変動は、要素がサイズ及び形によって整合されうる任意のかかる組み合わせに等しく適用される。
第一の要素が第二の要素に対応するサイズ及び形を有するいくつかの実施形態では、該第一の要素は、該第二の要素と、同じ、ほぼ同じ、または大体同じサイズ及び形を有する。第一の要素が第二の要素に対応するサイズ及び形を有するいくつかの実施形態では、該第一の要素は、該第二の要素と、同様の、または相補的なサイズ及び形を有する。
第一の要素が第二の要素のサイズ及び形に対応するサイズ及び形を有するいくつかの実施形態では、該第一の要素のサイズ及び形は、該第二の要素のサイズ及び形の、プラスマイナス0．1％、0．2％、0．3％、0．4％、0．5％、0．6％、0．7％、0．8％、0．9％、1％、1．5％、2％、2．5％、3％、3．5％、4％、4．5％、5％、5．5％、6％、6．5％、7％、7．5％、8％、8．5％、9％、9．5％、10％、10．5％、11％、11．5％、12％、12．5％、13％、13．5％、14％、14．5％、15％、15．5％、16％、16．5％、17％、17．5％、18％、18．5％、19％、19．5％、または20％変動する。
例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、特定の組織部分（例えば、構築、置換、または修復されるべき組織の部分）に対応するサイズ及び形を有する3次元モデルを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞の足場、バイオリアクター、移植片チャンバー、移植片チャンバー挿入物、及び／または組織セグメントに対応するサイズ及び形を有する3次元モデルセグメントを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、組織部分モデル、モデルセグメント、バイオリアクター、移植片チャンバー、移植片チャンバー挿入物、組織セグメント、及び／または組織移植片に対応するサイズ及び形を有する細胞の足場または細胞の足場前駆体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、組織部分モデル、モデルセグメント、足場、移植片チャンバー、移植片チャンバー挿入物、組織セグメント、及び／または組織移植片に対応するサイズ及び形を有するバイオリアクターを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、組織部分モデル、モデルセグメント、組織セグメント、及び／または組織移植片に対応する形及びサイズを有するバイオリアクターの移植片チャンバーまたはバイオリアクターの移植片チャンバー挿入物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、モデルセグメント、バイオリアクター、足場、移植片チャンバー、及び／または移植片チャンバー挿入物に対応するサイズ及び形を有する組織セグメントを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、特定の組織部分及び／または特定の組織部分の3次元モデルに対応するサイズ及び形を有する組織移植片を提供する。
サイズ及び形の許容される変動は、サイズ及び形によって整合されるべき2つ以上の要素の所望の機能に基づいて決定されうる。第一の要素が第二の要素のサイズ及び形に対応するサイズ及び形を有するいくつかの実施形態では、該第一及び第二の要素は、一方または両方の要素に所望の機能を実行させる、及び／または所望の特性を備えさせるのに適切な、任意の適切なサイズ及び形を有することができる。例えば、いくつかのかかる実施形態では、組織移植片が組織部分を適切に修復することが可能だという条件で、該組織移植片は修復されるべき該組織部分に対応するサイズ及び形を有する。いくつかのかかる実施形態では、細胞の足場が移植片チャンバーまたは移植片チャンバー挿入物に圧入状態で収まるという条件で、該細胞の足場は、該移植片チャンバーまたは移植片チャンバー挿入物に対応するサイズ及び形を有する。
さらに、当業者には、サイズ及び形のその他の許容される変動が決定されうること、並びに、かかる変動は、本発明の範囲に含まれることが意図されることが理解されよう。
3次元モデル
本発明のいくつかの実施形態において、例えば、組織移植片または組織移植片セグメントの製造用の鋳型としての役割を果たすため、及び／または、かかる組織移植片もしくは組織移植片セグメントの製造に用いられる足場の製造用の鋳型の役割を果たすため、及び／または、組織移植片、組織移植片セグメント、もしくは組織-インプラントハイブリッド移植片の製造に用いられうるバイオリアクター、バイオリアクターチャンバー、もしくはバイオリアクターチャンバーの挿入物の製造用の鋳型の役割を果たすため、特定の組織もしくは組織部分の3次元モデルが生成され、並びに／または使用されうる。例えば、図4A～4B及び図6を参照されたい。いくつかの実施形態では、かかる3次元モデルは、目的の組織部分の3次元形状及びサイズを表すデジタルモデル等のデジタルモデルである。例えば、体内の構造のデジタルモデルもしくは画像等の3次元モデルまたは画像は、当技術分野で周知の任意の適切な方法によって生成することができ、例えば、X線を用いて体内の構造及び器官の詳細画像を作製するコンピュータ断層撮影（CT）（マイクロCT等の小型CTを含む）が挙げられる。いくつかの実施形態では、医療用画像工学を用いて所望の組織部分、例えば、骨格異常等の欠損を含む組織部分のデジタルモデルを生成することができ、その後、このデジタルモデルは、例えば、所望の組織移植片または組織移植片セグメントの製造に用いられるように特注設計された足場及び／またはバイオリアクターの製造を可能にすることによって、組織移植片、及び／または1つ以上の組織移植片セグメントの製造を容易にするために使用されうる。組織部分のモデルは、好ましくは、解剖学的に正確で、体の組織部分及び／または所望の組織移植片に対応する寸法、配置、サイズ、及び形を有する。いくつかの実施形態では、該組織の部分は、外傷性または病理学的欠損等の欠損を含んでよい。いくつかの実施形態では、かかる欠損は、本発明に従って製造された組織移植片を用いて修復することができる。組織部分のデジタルモデルは、任意の適切なコンピュータ支援設計（CAD）ソフト、例えば、Autocad（商標）、Solidworks（商標）、ProE（商標）、またはCreo（商標）を用いて作り出すことができる。いくつかの実施形態では、組織部分のデジタルモデルは、編集され、例えば、本発明に従って製造されうる組織移植片セグメントを表す、及び／またはかかる組織移植片セグメントの製造に用いることができる足場またはバイオリアクターチャンバーを表す、2つ以上のより小さい下位部分またはセグメント（これらは「モデルセグメント」または「モデル部分」と呼んでもよい）に分割／区分化されうる。該モデルセグメントの厚さは、同じ厚さを有する組織移植片セグメントが効果的にバイオリアクターで灌流されうるように選ばれうる。したがって、いくつかの実施形態では、モデルセグメント、及び／または対応する組織移植片セグメント（例えば、骨移植片セグメント）は、厚さまたは最大厚さが約1cmもしくはそれ以下である。いくつかの実施形態では、該モデルセグメント及び／または対応する組織移植片セグメントは、厚さまたは最大厚さが、約0．3mm～約10mm、約0．3mm～約5mm、もしくは約0．3mm～約1mmである。いくつかの実施形態では、該モデルセグメント及び／または対応する組織移植片セグメントは、厚さが、約0．3、約0．5、約1、約1．5、約2、約2．5、約3、約3．5、約4、約4．5、約5、約5．5、約6、約6．5、約7、約7．5、約8、約8．5、約9、約9．5、もしくは約10mmである。
本書に記載のデジタルモデル等の該モデルは、カスタマイズされたバイオリアクター及び／またはカスタマイズされた足場を設計及び製造するために用いて、該相補的モデルに対応するサイズ及び形を有する体の組織移植片セグメントを成長させることができる。デジタルモデルの場合、該モデルまたはモデルセグメントは、任意の適切なファイル形式、例えば、IGESもしくはSLT形式を用いて作り出されてよく、またはこれに変換されてよく、また、任意の適切なコンピュータ支援製造（CAM）ソフト、例えば、SprutCAM（商標）を用いて作り出されてよく、またはこれに取り込まれてもよい。カスタマイズされたバイオリアクター及び足場の製造は、本書にさらに記載する。
本発明が提供する組織及びそのセグメントのデジタルモデルは、本書に記載の通り、生成され、編集され、または操作されうる。さらに、当業者には、その他の適切な方法を用いて、本書に記載の通り、組織やそのセグメントのデジタルモデルを生成、編集、または操作してもよいことが理解されよう。
細胞の足場
いくつかの実施形態において、本発明は、組織移植片及び／または組織移植片セグメントの製造に、例えば、本書に記載の通りに用いるのに適切な足場を提供する。足場は、使用目的に適した細孔径、空隙率、及び／または機械的性質を有した任意の適切な材料から作製されうる。かかる適切な材料は、通常、非毒性、生体適合性、及び／または生分解性であり、所望の組織移植片型の細胞、例えば、骨組織移植片の場合は造骨細胞によって浸潤可能である。かかる材料の限定されない例としては、脱細胞化組織（脱細胞化骨等）、コラーゲン、ラミニン、及び／もしくはフィブリン等を含む材料またはこれらの1つ以上の細胞外基質（「ECM」）成分、並びに天然もしくは合成ポリマーまたは複合体（セラミック／ポリマー複合材料等）が挙げられる。いくつかの実施形態では、該足場は、細胞によって吸収可能（例えば、再吸収可能な材料）でありうるが、他の実施形態では、非再吸収性足場が使用されてもよい。いくつかの実施形態では、該足場は、上記材料のいずれか、もしくはその任意の組み合わせを含み、上記材料のいずれか、もしくはその任意の組み合わせからなり、または基本的に上記材料のいずれか、もしくはその任意の組み合わせからなりうる。
いくつかの実施形態において、足場の寸法及び配置は、上述した通り、デジタルモデル等の、組織部分または組織セグメントの3次元モデルのものに対応し、及び／または所望の組織移植片セグメントの組織移植片のものに対応する。いくつかの実施形態では、足場の寸法及び配置は、かかるモデルに基づいて設計または選択することができ、バイオリアクター内の足場上で、細胞、例えば、本書に記載の組織形成細胞または他の細胞の培養を容易にし、さらに後述するように、例えば、サイズ及び形がモデルもしくはモデルセグメントに対応する組織移植片または組織移植片セグメントを製造する。いくつかの実施形態では、足場を、適切なサイズ及び形のバイオリアクターチャンバーに収まるように設計し、該足場及び細胞を、圧入状態で、その中で直接灌流（例えば、該組織移植片及び／または組織移植片セグメントの製造過程で）させてもよい。図5A～5Bは、本書に記載の例示的足場を示す。
いくつかの実施形態では、該足場は、コンピュータ支援製造を用いて生成またはカスタマイズされる。例えば、組織モデルセグメントのファイルは、当技術分野で周知の任意の適切な方法を用いて幾何学的に定義された足場の製作を行わせるためのCAMソフト、またはその組み合わせ、例えば、コンピュータ制御のフライス加工法、ラピッドプロトタイピング法、レーザ切断法、3次元印刷、及び／もしくは注型技術とともに用いられうる。いくつかの実施形態では、該足場の製造は、ラピッドプロトタイピング、フライス盤、注型技術、レーザ切断、及び／もしくは3次元印刷、またはこれらの任意の組み合わせの使用を含む。いくつかの実施形態では、該足場の製造は、該製造がレーザ切断またはフライス盤の使用を含む場合等に、コンピュータ数値制御の使用を含む。例えば、上述した通りにCADソフトを用いて生成されたデジタルモデル等のデジタルモデルを処理して、コンピュータ数値制御（CNC）フライス盤（例えば、Tormach（商標）、Bridgeport（商標））を駆動させるための適切な符号（「Gコード」等）を生成し、該足場を所望の形及びサイズ（例えば、組織セグメントのデジタルモデルのものに対応する）に切断するために、適切な工作機械工具ビットを選択し、機械加工経路のプログラムを組むことができる。
本発明が提供する足場は、本書に記載の通りに設計及び製造されうるが、当業者には、様々な他の設計及び製造方法を用いて本発明の足場を生成してもよいことが理解されよう。
バイオリアクター
いくつかの実施形態において、本発明は、例えば本書に記載の、組織移植片及び組織移植片セグメントの製造に用いるのに適した、バイオリアクター等の培養容器を提供する。いくつかの実施形態では、該バイオリアクターは、灌流バイオリアクター、例えば、直接灌流バイオリアクターである。組織工学用途の灌流バイオリアクターは、培養システムであって、通常、限定されないが、細胞／足場構築物が配置される1つ以上のチャンバー（本書では、「移植片チャンバー」と言う）、培地容器、管材回路、及び養分と酸素の大量輸送を可能にするポンプを含めたいくつかの要素からなる。灌流バイオリアクターは、培地が該細胞／足場構築物の周りまたは中を灌流されるかによって、間接または直接システムに大別されうる。バイオリアクターの総説については、その内容を本書に引用して援用するSladkova et al. （Processes 2（2）494－525（2014））を参照されたい。
直接灌流バイオリアクターでは、細胞／足場構築物は、培地が該細胞／足場構築物の周りではなく、強制的に該細胞／足場構築物を通過するように、圧入形式で適切な移植片チャンバーに配置される。直接灌流バイオリアクターは、様々なヒト骨コンピテント細胞及び生体材料製足場との組み合わせを用いて代用骨を人工的に作り出すために用いられている。さらに、骨工学の場合、細胞／足場構築物の様々な組み合わせの直接灌流は、細胞生存及び細胞増殖、並びに成熟した骨様組織の形成をインビトロで支援しうることを研究が実証している（総説については、Sladkova上述を参照）。
いくつかの実施形態において、本発明は、新規な直接灌流バイオリアクター等の、特定の新規なバイオリアクター、並びにかかる新規なバイオリアクターの設計及び作製方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態モデルでは、デジタルモデル等の、組織部分またはそのセグメントのモデルは、上述した通り、1つ以上の細胞／足場構築物を圧入形式で直接灌流条件下で収容できるバイオリアクターの設計及び製造に用いることができる。いくつかのかかる実施形態では、組織セグメントのCADファイルは、該バイオリアクターの移植片チャンバーが、ここで製造されるべき組織移植片または組織移植片セグメントのものに対応するように特注設計されたサイズ及び配置を有するように、また、該足場及び／または組織移植片／組織移植片セグメントが、該バイオリアクターの移植片チャンバーに圧入配置でぴったり収まるように、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片チャンバー、またはバイオリアクターの移植片チャンバー挿入物を製作するために用いられうる。かかるバイオリアクター、またはその該移植片チャンバーもしくは移植片チャンバー挿入物は、任意の適切な材料から作製されうる。バイオリアクター、またはその挿入物の製造に適した材料は、当技術分野で周知であり、任意のかかる材料を用いることができる。例えば、いくつかの実施形態では、バイオリアクター、またはそのチャンバーもしくは挿入物は、ステンレス鋼等の不活性金属製でよく、または生体適合性プラスチックもしくは当技術分野で周知の他の適切な材料製でよい。
いくつかの実施形態において、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片チャンバー、またはバイオリアクターの移植片チャンバー挿入物は、コンピュータ支援製造を用いて生成またはカスタマイズされる。例えば、いくつかのかかる実施形態では、組織セグメントのファイルは、CAMソフトに組み込まれて、幾何学的に定義された足場及び／または組織移植片もしくは組織移植片セグメントを、当技術分野で周知の任意の適切な方法またはその組み合わせを用いて収容可能なバイオリアクター、バイオリアクターの移植片チャンバー、もしくはバイオリアクターの移植片チャンバー挿入物の製作または特注製造を行うことができる。いくつかのかかる実施形態では、該バイオリアクターの製造または特注製造は、ラピッドプロトタイピング法の使用、フライス盤の使用、注型技術の使用、レーザ切断の使用、及び／もしくは3次元印刷の使用を含みうる。いくつかの実施形態では、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片チャンバー、もしくはバイオリアクターの移植片チャンバー挿入物の製作または特注製造は、該製造または特注製造過程が、レーザ切断もしくはフライス盤の使用を含む場合等に、コンピュータ数値制御法の使用を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、例えば上述した通りにCADソフトを用いて生成されたデジタルモデルを処理して、コンピュータ数値制御（CNC）フライス盤（例えば、Tormach（商標）、Bridgeport（商標））を駆動させるための該適切なGコードを生成し、及び／または該バイオリアクター、バイオリアクターの移植片チャンバー、もしくはバイオリアクターの移植片チャンバー挿入物の材料を所望の形（例えば、該組織セグメントのデジタルモデルと相補的な）に切断するために、適切な工作機械工具ビットを選択し、及び／または機械加工経路のプログラムを組んでもよい。さらに、デジタルドローイング及びシミュレーションソフトを用いて、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片チャンバー、もしくはバイオリアクターの移植片チャンバー挿入物の設計を最適化し、その制御された製造または特注製造を行うことができる。いくつかの実施形態では、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片チャンバー、またはバイオリアクターの移植片チャンバー挿入物は、組織または組織セグメントのデジタルモデルに基づいて設計され、細胞、例えば、組織形成細胞または本書に記載のもしくは当技術分野で周知の他の細胞の足場上での培養を容易にし、該組織または組織セグメントの相補的デジタルモデルに対応するサイズ及び形を有する組織移植片または組織移植片セグメントを製造することができる。
いくつかの実施形態において、本発明のバイオリアクターは1つ以上の要素を含んでいてよく、これらの要素は、例えばねじまたは錠または他の固定システムで互いに固着されて、移植片チャンバーを非限定的に含む1つ以上の内部チャンバーを形成する。1つの実施形態では、バイオリアクターは、培地用の容器、流体の入り口及び1つ以上の流路を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のバイオリアクターは、所望の形及びサイズの足場、組織移植片、もしくは組織移植片セグメントを収容するように設計またはカスタマイズされる移植片チャンバーを含んでもよい。1つの実施形態では、これは、該バイオリアクターそのものを所望の形及びサイズを有する移植片チャンバーを備えるように設計またはカスタマイズすることによって達成されてもよい。別の実施形態では、これは、バイオリアクターの内部に配置された場合に所望の形及びサイズを備える移植片チャンバーを製造する移植片チャンバー挿入物を用いて達成されてもよい。1つの実施形態では、本発明のバイオリアクターは、厚さが約0．3mm～約10mmの足場、組織移植片、または組織移植片セグメントを収容するのに十分なサイズの移植片チャンバーを含む。いくつかの実施形態では、該足場及び／または組織移植片セグメントは、本書では「フレーム」とも言うことがある移植片チャンバー挿入物を用いて該移植片チャンバーに配置されてもよい。上述した通り、フレームまたは移植片チャンバー挿入物は、移植片チャンバーのサイズ及び形をカスタマイズするため、並びに、所望に応じて、足場及び／または組織移植片セグメントを該移植片チャンバーの正しい位置に置くために使用されて、例えば、該組織移植片セグメントの、直接灌流下、圧入状態での培養を可能にし、該足場及び／または組織移植片セグメントを通る流体の流れを最大にし、該足場及び／または組織移植片セグメントの周りの流体の流れを最小にしうる。いくつかの実施形態では、該移植片チャンバーは、一般的な形またはサイズを有してよいが、1つ以上のフレームまたは移植片チャンバー挿入物を用いて、所望に応じて、該移植片チャンバーのサイズ及び形（例えば、内側のサイズ及び形）を、該足場及び／または組織移植片セグメントを収容するようにカスタマイズしてもよい。フレームまたは移植片チャンバー挿入物は任意の適切な材料から作製されてよい。例えば、いくつかの実施形態では、該フレーム及び／または移植片チャンバー挿入物は、シリコーンやシリコーン様材料等の生体適合性で非毒性の成形可能なプラスチックを含んでも、該プラスチックから基本的になっていても、該プラスチックからなっていてもよい。いくつかのかかる実施形態では、該フレーム及び／または移植片チャンバー挿入物は、ポリジメチルシロキサン（PDMS）を含んでよい。フレームまたは移植片チャンバー挿入物は、限定されないが、本書に記載の方法を含めて、任意の適切な方法によって設計及び製造されうる。
いくつかの実施形態において、本発明のバイオリアクターは、複数の組織移植片セグメントの集団培養を容易にするために複数の移植片チャンバーを含みうる（図6参照）。例えば、1つの実施形態では、本発明のバイオリアクターは、所望に応じて、1、2、3、4、5、またはそれ以上の組織移植片セグメントの培養物を収容するように構成されうる。
いくつかの実施形態において、バイオリアクター、バイオリアクターの移植片チャンバー、及び移植片チャンバーのフレームまたは挿入物は、本発明で規定されているように、本書に記載の通りに、例えば、コンピュータ支援設計（CAD）及びコンピュータ支援製造（CAM）法を用いて、設計及び製造することができる。しかしながら、当業者には、本発明のバイオリアクター、バイオリアクターの移植片チャンバー、及びバイオリアクターの移植片チャンバーのフレームまたは挿入物を生成並びにカスタマイズするため、様々な他の方法を用いてもよいことが理解されよう。
細胞
本書に記載の通り、本発明の組織移植片または組織移植片セグメントの製造において、任意の適切な、または所望の種類の細胞もしくは複数の細胞が使用されうる。通常、選ばれた（1つまたは複数の）細胞は、所望の組織移植片（例えば、血管形成された骨移植片については、本書でさらに説明される、間葉系前駆細胞及び内皮前駆細胞または、骨及び血管の形成に適したもしくは形成が可能な他の細胞種類）の形成が可能であり、または、所望の（1つまたは複数の）組織形成細胞に分化可能な任意の（1つまたは複数の）細胞（例えば、多能性細胞）である。使用されうる細胞の限定されない例としては、多能性細胞、幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、前駆細胞、組織形成細胞、または分化した細胞が挙げられる。
該使用される細胞は、任意の適切な起源由来でよい。いくつかの実施形態では、該細胞はヒトの細胞でありうる。いくつかの実施形態では、該細胞は、哺乳類細胞であってよく、限定されないが、非ヒト霊長類、ヒツジ、またはげっ歯類（ラットやマウス等）由来の細胞が挙げられる。例えば、細胞は、組織バンク、細胞バンク、またはヒト対象から入手されうる。いくつかの実施形態では、該細胞は、自己細胞、例えば、得られた組織移植片がその後移植される予定の対象から採取された細胞であり、または、該細胞は、かかる自己細胞から誘導されてもよい。いくつかの実施形態では、該細胞は、「適合」ドナーから採取されてよく、または、該細胞は、「適合」ドナーから採取された細胞から誘導されてもよい。細胞及び組織移植では、ドナーとレシピエントの細胞は、当技術分野で周知の方法で適合されうる。例えば、ヒト白血球抗原（HLA）タイピングが、組織または細胞ドナーとレシピエントを適合させ、移植片拒絶反応の危険を低減するために広く用いられている。HLAは、ほとんどの体細胞に見られるタンパク質マーカーであり、免疫系によって、体内に属する細胞とそうではない細胞を見分けるために用いられる。HLA適合性は、レシピエントが移植されたものを異物と認識する可能性が低いため、移植の成功の可能性が高まる。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、使用される細胞は、HLA適合細胞またはHLA適合細胞から誘導された細胞であり、例えば、組織移植片を受ける予定のレシピエント対象とHLA適合したドナー対象から採取された細胞である。いくつかの実施形態では、使用される細胞は、レシピエントの免疫系によって認識されることを防ぐために修飾された細胞（例えば、普遍細胞）でよい。いくつかのかかる実施形態では、該細胞は、遺伝子組み換え普遍細胞である。例えば、いくつかの実施形態では、該普遍細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスI発現抑制細胞（すなわち、Figueiredo et al． Biomed Res Int （2013）参照）等のMHC普遍細胞でよい。ヒトMHCタンパク質は、それらが最初に白血球で発見されたため、HLAと呼ばれる。普遍細胞は、いかなるレシピエントにも使用される可能性があり、それ故、適合細胞の必要性を回避する。
いくつかの実施形態において、本発明の組織移植片作製に用いられる細胞は、人工多能性幹細胞（iPSC）等の多能性幹細胞であるか、またはこれらを含む。いくつかのかかる実施形態では、該多能性幹細胞は、組織移植片を受ける予定の対象から採取された細胞（すなわち、自己細胞）から生成されうる。他のかかる実施形態では、該多能性幹細胞は、異なる、すなわち、組織移植片を受ける予定の対象ではない個体から採取された細胞（すなわち、同種異系細胞）から生成されうる。いくつかのかかる実施形態では、該多能性幹細胞は、異なる個体、すなわち、組織移植片を受ける予定の対象ではないが、例えば上述した通り、「適合」ドナーである異なる個体から採取された細胞から生成されうる。いくつかの実施形態では、使用される細胞は、骨細胞等の分化した細胞である。いくつかの実施形態では、該分化した細胞は、人工多能性幹細胞等の多能性幹細胞由来である。いくつかの実施形態では、該分化した細胞は、分化した体細胞の分化転換によって、または、多能性細胞（多能性幹細胞または人工多能性幹細胞等）、例えば、体細胞から生成された人工多能性幹細胞の分化転換によって得られてもよい。
多能性幹細胞は、（a）自己複製並びに（b）3胚葉すべて（すなわち、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）の細胞を製造するように分化することが可能な細胞である。「人工多能性幹細胞」とは、胚性幹細胞（ESC）同様、3胚葉すべての細胞への分化能を維持しながら長期にわたって培養することができるが、ES細胞（これらは胚盤胞の内細胞塊から得られる）とは異なり、体細胞由来、すなわち、潜在能力がより狭く、より決められており、実験的操作なしでは、3胚葉すべての細胞を生じさせることができない細胞由来の多能性幹細胞を網羅する。iPSCは、通常、hESC様形態を有し、核‐細胞質比が大きく、明確な境界及び卓越した核の平坦なコロニーとして成長する。さらに、iPSCは通常、限定されないが、アルカリホスファターゼ、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3／4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGF 1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、TERT、及びzfp42が挙げられる、当業者に周知の1つ以上の肝要な多能性マーカーを発現する。さらに、iPSCは、他の多能性幹細胞同様、一般的に奇形腫を形成しやすい。加えて、iPSCは、一般的に、生物の外胚葉、中胚葉、または内胚葉組織の形成またはこれら組織への寄与が可能である。
例示的なiPSCとしては、TakahashiとYamanaka（Cell 126（4）：663－76（2006）、その内容を全体として本書に引用して援用する）による記載の通り、Oct－4、Sox－2、c－Myc、及びKlf遺伝子が導入された細胞が挙げられる。他の例示的なiPSCは、OCT4、SOX2、NANOG、及びLIN28が導入された細胞である（Yu，et al．，Science 318：1917－1920（2007）、その内容を全体として本書に引用して援用する）。当業者には、iPSC製造のため、OCT4、SOX2、KLF4、MYC、Nanog、及びLin28からなる群から選ばれた因子等のリプログラミング因子の様々な異なる混合物が使用できることが分かるであろう。本書に記載のiPSC製造方法は、例示にすぎず、限定されることを意図されない。正確には、当技術分野で周知の任意の適切な方法またはリプログラミング因子の混合物が使用できる。リプログラミング因子が用いられる実施形態では、かかる因子は、当技術分野で周知の任意の適切な手段を用いて供給されうる。例えば、いくつかの実施形態では、センダイウィルスベクター等の任意の適切なベクターが使用されうる。いくつかの実施形態では、リプログラミング因子は、修飾RNA法及び系を用いて供給されうる。様々な異なるリプログラミング因子の供給方法及び系が当技術分野で知られており、任意のかかる方法または系が使用されうる。
多能性幹細胞等の細胞培養用に適する任意の培地を本発明に従って使用してよく、いくつかのかかる培地が当技術分野で知られている。例えば、多能性幹細胞の培養用の培地は、Knockout（商標）DMEM、20％Knockout（商標）血清代替物、非必須アミノ酸、2．5％FBS、Glutamax、β‐メルカプトエタノール、10ng／μLのbFGF、及び抗生物質を含みうる。使用される培地は、この培地を変動させたものでもよく、例えば、2．5％FBSを除いたもの、knockout血清代替物がより多いもしくは少ない％のもの、または、抗生物質を除いたものでもよい。使用される培地は、ヒト多能性幹細胞の増殖を未分化状態で支援する、mTeSR（商標）（STEMCELL Technologiesから入手可能）、Nutristem（商標）（Stemgent（商標）から入手可能）、もしくはES培地、または当技術分野で周知の他の適切な培地等の他の適切な培地でもよい。対象から採取された細胞集団からの多能性幹細胞の他の例示的な生成／獲得方法は、本出願の実施例に示す。
いくつかの実施形態において、多能性幹細胞は、所望の細胞種類、例えば、造骨細胞もしくは血管形成細胞、またはその他の所望の細胞種類に分化させられる。本発明が提供する分化した細胞は、当技術分野で周知の様々な方法で、例えば、成体幹細胞、胚性幹細胞（ESC）、胚盤葉上層幹細胞（EpiSC）、及び／または人工多能性幹細胞（iPSC；多能性状態にリプログラミングされた体細胞）を用いて誘導されうる。例えば、様々な分化因子を用いた、多能性幹細胞の有向分化または自然発生的分化の方法が、当技術分野で知られている。多能性幹細胞の分化は、当技術分野で周知の様々な方法を用いて観察されうる。幹細胞と分化因子処理細胞間のパラメータの変化は、該処理細胞が分化したことを示しうる。顕微鏡観察を用いて、分化の過程の細胞の形態を直接観察してもよい。
本発明の実施形態の各々において、本書に記載の組織移植片及び組織移植片セグメントを製造するために、限定されないが、多能性幹細胞もしくは前駆細胞または分化した細胞が挙げられる、任意の適切なまたは所望の種類の細胞を用いることができる。いくつかの実施形態では、該多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞でよい。人工多能性幹細胞が用いられる実施形態では、かかる細胞は、対象から採取された分化した体細胞から、例えば、かかる分化した体細胞を1つ以上のリプログラミング因子と接触させることによって誘導されうる。いくつかの実施形態では、多能性細胞は、所望の系列、例えば、間葉系列または内皮細胞系列の方向に誘導されていてもよい。いくつかの実施形態では、該分化した細胞は、任意の適切な種類の分化した細胞でありうる。いくつかの実施形態では、該分化した細胞は、多能性幹細胞（人工多能性幹細胞等の）から、例えば、かかる多能性細胞を1つ以上の分化因子と接触させることによって誘導されうる。いくつかの実施形態では、該分化した細胞は、別の分化した細胞種類の、例えば、該細胞を1つ以上のリプログラミング因子と接触させることによる分化転換によって誘導されうる。分化した細胞を含む本発明の様々な実施形態において、かかる分化した細胞は、限定されないが、骨細胞及び血管細胞が挙げられる任意の所望の分化した細胞種類でよい。
細胞／足場構築物
本書に記載の細胞種類などの任意の適切なもしくは所望の細胞種類を、足場に適用もしくは播種して、本発明の組織移植片または組織移植片セグメントを製造することができる。
いくつかの実施形態において、細胞は足場に適用される前に分化した状態にあってよい。例えば、いくつかの実施形態では、分化した細胞は、得られて直接用いられてよい。同様に、いくつかの実施形態では、非分化の細胞を、当技術分野で周知の任意の適切な方法に従って、例えば培養皿もしくはマルチウェルのプレート、または懸濁状態で、適切な期間または時間、例えば、所望の程度の細胞増殖もしくは分化または他のパラメータが達成されるまで培養してもよく、その後、該分化した細胞を該足場に移し、続いて、該細胞／足場構築物をバイオリアクターに挿入し、組織移植片または組織移植片セグメントの成長を促してもよい。いくつかの実施形態では、非分化細胞（例えば、幹細胞（iPSC等）や前駆細胞）が該足場に適用されてもよい。かかる実施形態では、該非分化細胞は、該足場で培養されつつ、分化を経てもよい。細胞は、静的及び動的方法（例えば、バイオリアクターシステムを用いて）またはその組み合わせを用いて適用することができる。大きな組織インプラント移植片を操作する際、動的システムは均一な播種を容易にする。
いくつかの実施形態において、2つ以上の異なる細胞集団を足場に播種して、細胞／足場構築物を製造してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、血管形成された骨移植片の製造用に、造骨細胞と血管形成細胞の両方を足場に播種し、共培養してしてもよい（図7参照）。いくつかの実施形態では、該2つ以上の細胞集団は、該細胞／足場構築物が該バイオリアクターに挿入される前に、適切な時間、例えば、所望の程度の増殖もしくは分化または他のパラメータが達成されるまで該足場で共培養される。細胞集団は、任意の成長段階または分化段階の、任意の所望の細胞種類及びその任意の組み合わせを含んでも、それらから本質的になっていても、それらからなっていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、各細胞集団は、異なる組織を形成可能な細胞を含んでよく、例えば、血管形成された骨移植片の製造については、第一の集団が間葉系前駆細胞等の骨を形成可能な細胞を含み、第二の集団が内皮前駆細胞等の血管を形成可能な細胞を含む。いくつかの実施形態では、各細胞集団は、同じ組織（例えば骨）を形成可能な細胞を含んでよいが、各細胞集団は、異なる分化段階（例えば、間充織幹細胞及び骨髄間質細胞）にありうる。共培養されるべき細胞集団は、所望に応じて、同時にまたは異なる時間に足場に適用されてよい。2つ以上の細胞集団が異なる時間に適用される場合、共培養の並びまたは順番（例えば、どの集団が最初に足場に適用されるか、どの集団が2番目に足場に適用されるか、等）は、所望に応じて選択されてよく、例えば、所望に応じて、使用される細胞種類、該細胞集団の状態、増殖、もしくは分化、または、他のパラメータによる。2つ以上の細胞集団が足場に適用されるべき場合、それらは、所望に応じて、任意の適切な細胞比で適用されうる。例えば、いくつかの実施形態では、2つの異なる細胞集団は、約1：1、または、約2：8～約8：2の任意の比で播種されうる。いくつかの実施形態では、該細胞集団は、約2：8、約3：7、約4：6、約5：5、約6：4、約7：3、または約8：2の比で播種されうる。
細胞／足場構築物は、バイオリアクターに、所望に応じて、任意の適切な点、例えば、細胞播種の直後、播種後の細胞培養の特定の期間の後、該播種された細胞が所望の分化状態または他の所望の段階に達した後に移されうる。いくつかの実施形態では、該細胞／足場構築物は、バイオリアクターに挿入され、圧入状態で培養されて、組織移植片または組織移植片セグメントを形成させる。組織／移植片の成長は、限定されないが、組織学的及び免疫組織化学的検査、生化学分析、高分解能特性化技術（例えば、SEM、FIB－TEM、Tof－SIMS）、撮像法（例えば、CTまたはマイクロCT）、並びに機械的検査（例えば、ヤング率、引張及び圧縮強さ）が挙げられる、当技術分野で周知の任意の適切な定性的または定量的手法を用いて評価できる。
当業者には、無数の細胞の変動及び組み合わせ並びに培養方法が、本発明の範囲に含まれることが理解されよう。例えば、細胞の播種法及び比、分化因子の濃度、及び共培養の順序を含む細胞培養法は、通常、使用される所望の細胞種類または製造される組織移植片に応じて決定されよう。
組織移植片、並びにその組み立て及び使用
いくつかの実施形態において、本発明は、複数の組織移植片セグメントから組み立てられる組織移植片、例えば骨移植片を提供する。本発明は、かかる組織移植片の作製方法もまた提供する。かかる方法は、分節付加組織工学（SATE）法と言うことがある。特に骨移植片の場合、かかる方法は、分節付加骨工学（SABE）法と言うことがある。任意の適切な時点、例えば、所望の特性を有する組織移植片セグメントが製造されたとき、組織移植片セグメントは、それらが製造されたバイオリアクターから取り出すことができ、複数の組織移植片セグメントを一緒に組み立て、所望のサイズ及び形、例えば、置換されるべき組織部分に対応するサイズ及び形を有する組織移植片を形成することができる。
組み立てられた組織移植片セグメントは、該セグメントの意図される組み立てを維持できる任意の適切な手段または方法によって、互いに固着または結合されうる。例えば、通常、かかる固着手段または方法は、例えば、該組み立てられた組織移植片が対象に移植される予定の場合、非毒性、生体適合性、及び／または再吸収可能（例えば、体内に吸収されることが可能）である。例えば、いくつかの実施形態では、該組織移植片セグメントは、所望に応じて、接着剤、ステッチもしくは縫合糸、ステープル、プレート、ピン及び穴、ねじ、ボルト等を用いて互いに固着されうる。いくつかの実施形態では、該組織セグメントを互いに固着するために使用される手段は、生体適合性もしくは再吸収可能、またはその両方である。
接着剤が該移植片セグメントを互いに固着するために用いられるいくつかの実施形態において、該接着剤は、生体適合性接着剤、例えば、NovoSorb（商標）（PolyNovo Biomaterials，メルボルン）等の生体適合性ポリマー接着剤または任意のゲル、液体、ゴム様物質、もしくは、2つ以上の組織移植片セグメントを互いに固着可能な他の生体適合性接着材料でよい。例えば、骨移植片の場合、骨移植片セグメントを互いに固着するために用いることができる例示的な骨接着剤としては、限定されないが、ポリウレタン系及びポリメチルメタクリレート系骨接着剤等のポリマー系またはポリマー骨接着剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、該接着剤は、テープ、例えば、サージカルテープでありうる。いくつかの実施形態では、組織移植片セグメントは、例えばプラスチック、金属（例えば、チタン）または他の適切な材料製の、1つ以上のプレート、ピン、ねじ、ボルト、ステープル、ステッチ、縫合糸等を用いて互いに固着されうる。いくつかの実施形態では、かかるピン、ねじ、ボルト、ステープル、ステッチ、縫合糸等は、3D印刷または当技術分野で周知の他の適切な方法を用いて製造されうる。
いくつかの実施形態において、組織移植片が対象に移植される場合等に、例えば、該組み立てられた組織移植片セグメント間の接続を強化するため、及び／または宿主組織に該組織移植片を結合、固定、もしくは固着するために、該組み立てられた組織移植片セグメントを互いに固着する様々な異なる手段及び／または方法が併用されうる（図8参照）。例えば、いくつかの実施形態では、本書に記載の人工的に作り出された骨移植片セグメントは、生体適合性骨接着剤及び金属製または再吸収可能なピンの両方を用いて一緒に組み立てることができる。
該組織移植片セグメントを一緒に組み立て及び固着した後、得られた組織移植片は、対象に移植することができ、ここで、組織移植片は、さらに対象の組織（骨移植片の場合、周囲の骨等）に固定されてもよい。いくつかの実施形態では、本発明が提供する方法及び組成物は、組織移植片を、治療及び／または美容用途を含む臨床応用のために、人工的に作り出すのに使用されうる。かかる用途の限定されない例としては、組織欠損もしくは損傷または組織損失の修復もしくは置換、組織再建もしくは復元、組織強化（例えば、組織損傷もしくは組織の損失の進行の防止もしくは遅延のため）、または、外科装置の移植支援（例えば、骨移植片は、関節代用品、プレート、もしくはねじ等の外科的に埋め込まれた装置の周囲で骨の修復を助けるために用いることができる）が挙げられる。いくつかの実施形態では、対象は、けが、疾病、先天性異常、外傷、または感染によって引き起こされた組織欠損または組織損失を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の組織移植片を対象に移植して、該対象の組織欠損、組織損失、もしくは組織損傷を修復または置換することを含む、組織欠損、組織損失、もしくは組織損傷の修復または置換方法を提供する。いくつかの実施形態では、該組織移植片は、修復または置換される組織のものに対応するサイズ及び形を有する。本発明の組織移植片は、本書に示した分節付加組織工学すなわちSATE法を用いて製造することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の組織移植片は、2つ以上の組織移植片セグメントを含んでも、これらからなっていても、これらから本質的になっていてもよいとともに、該組織移植片セグメントは、厚さが約1cm未満、または、厚さが約0．3mm～約10mmである。いくつかの実施形態では、かかる組織移植片は、例えば対象自身の細胞または組織（例えば、自己細胞または組織）が該組織移植片の生成に用いられた場合、自家移植片（autograft；自己生成（autogenous、autogeneic、またはautogenic）移植片とも言う）でありうる。いくつかの実施形態では、該組織移植片は、例えばドナー及びレシピエント対象が、例えばHLA適合性で適合している場合、同種移植片である（例えば、組織移植片は、レシピエント対象と同じ種のドナー対象から採取した細胞または組織から生成される）。いくつかの実施形態では、該組織移植片は、異種移植片である（例えば、組織移植片は、レシピエント対象と異なる種のドナー対象から採取した細胞または組織から生成される）。例えば、ヒト組織を含む組織移植片は、ヒツジ等の非ヒト哺乳類に、例えば特定のインビボ試験等を行うために、移植されてもよい。
本発明に従って製造され、対象に移植された組織移植片は、例えば上述した通り、任意の適切な、組織の固着が可能な方法で、該対象の既存の構造（例えば組織）に固定、結合、または固着されうる。いくつかの実施形態では、該移植された組織移植片は、接着剤、ステッチもしくは縫合糸、ステープル、プレート、ピン等によって固着される。いくつかの実施形態では、対象の体内に該組織移植片を固着する手段は、生体適合性もしくは再吸収可能またはその両方である。
本発明（すなわち、実施例3）を通じて生成された人工骨移植片の骨マトリクス組成が、図20A～20Cに示されている。多孔性の骨構造は、コラーゲン1、オステオポンチン、オステオカルシン及び骨シアロタンパク質（salioprotein）を含む濃厚な細胞合成マトリクスで満たされている。このマトリクスはまた、天然の組織とは異なる濃度及び比で他の構造的及び生物学的に活性なタンパク質を含み、それによってこの2つの骨材料が区別される。
図21に示されるように、インプラント部位における細胞活性及び組織形成（すなわち、インプラント材料への播種細胞の接着）により、強度の増加が見られる。この増加は、インビボ実験から示されているように、チタンインプラントにおいて有意かつより高い。
実施形態において、骨材料に対するインプラントの接着強度は、播種細胞の培養後に15、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、150、300、350、400、500、600、700、800、900、1000パーセントまたはそれ以上増加する。
骨
骨は、基質に取り囲まれたコラーゲンの枠組みの中にHA結晶が平行な層として配列されている複雑な階層構造を有する2相で多孔性の複合材料である。
成熟骨組織のECMは、30～40パーセントの有機マトリクスと60～70パーセント（乾燥重量）の無機基質から構成される。有機物は、主として、プロテオグリカン凝集物（主としてバイグリカン及びデコリン）及び糖タンパク質を含む基質に埋め込まれたI型コラーゲン原線維（85～90パーセント）からなる。糖タンパク質は、非コラーゲンタンパク質（NCP）の大部分を占め、シアロタンパク質、アルカリホスファターゼ、オステオネクチン、オステオカルシン及びオステオポンチンを含む。ほとんどのNCPの配列は、カルシウムに対して高い親和性を有する高密度のアミノ酸、例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸残基を含む。無機物は、主として、分子式Ca10(PO4)6(OH)2を有するヒドロキシアパタイト（HA）の形態のリン酸カルシウム結晶からなるが、重炭酸塩／エステル、クエン酸塩／エステル、マグネシウム、カリウム及びナトリウムも見られる。
本発明の人工骨
組織工学骨のECMは、シアロタンパク質、アルカリホスファターゼ、オステオネクチン、オステオカルシン及びオステオポンチンを含む。新たに形成される骨の無機物含量は、天然の骨よりも低く、それは、異なるカルシウム対リン比を有する非晶質及び結晶性リン酸カルシウム（リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム等）を含む、異なる形態で配置されたリン酸カルシウム無機物から構成される。
空隙率及び力学的特性
骨梁の空隙率は、解剖学的位置の違いにより異なり、30～95％の範囲（大部分は、75～95％の範囲）である。それはまた、同じ解剖学的位置でも種間で異なりうる。
実施形態において、細胞が脱細胞化骨足場に播種された後、その細胞は新しい組織を生成し、この新しい組織が足場の孔を実質的に完全に閉塞するまで空隙を満たし始める。したがって足場の空隙率は、培養時間と共に、例えば3日後に10～20％、3週間後に30～50％、5週間後に75～90％及び完全な成熟時に最大100％、減少する。空隙率の減少速度はまた、細胞増殖能、成長因子の使用、動的培養下での培養、初期播種密度等に依存する。
骨は、数MPaの圧縮強度という非常に強い力学的特性を有する。一方新しく形成される骨は圧縮強度に関して非常に弱く、その正確な値は、培養の長さ及び与えられた培養条件下での用いられた細胞の石灰化能に依存する。
モデル系及びスクリーニング方法
いくつかの実施形態において、本発明は、様々な生物学的過程または生物学的特性の研究についてのモデル系、並びに、かかる生物学的過程及び／または生物学的特性への様々な活性物質の影響を検査するためのスクリーニング方法を提供する。いくつかの実施形態では、かかる生物学的過程としては、例えば、疾病もしくは障害に関連するもの、または外科的処置に関連するものを挙げることができる。いくつかのかかる実施形態では、かかる生物学的過程または特性としては、例えば、生物組織の形成に関するもの（限定されないが、組織移植片の製造）、例えば、様々な細胞種類の分化もしくは培養に関するもの、様々な細胞種類の機能性組織の形成能に関するもの、または、組織（もしくは組織移植片）の該生物学的、機械的、免疫学的、もしくは他の生物学的特性に関するもの等を挙げることができる。例えば、本書に記載の方法、組成物（例えば、組織移植片）、及び装置（例えば、バイオリアクター）は、特定の疾病もしくは障害の研究用のモデル、または、幹細胞（例えば、iPSC）等の細胞の、機能性組織の形成能の研究用モデル系等のモデル系において、またはこれらと併せて、用いることができる。同様に、本書に記載の方法、組成物（例えば、組織移植片）、及び装置（例えば、バイオリアクター）は、1つ以上の活性物質（薬物もしくは他の活性物質等）が、細胞の組織移植片等の機能性組織の形成能に与える影響の研究用のスクリーニング系において、またはこれらと併せて、用いることができる。例えば、1つの実施形態において、本発明は、疾病もしくは障害の進行の治療、防止、もしくは遅延に、または、特定の組織の形成（例えば、幹細胞から）の支援に、または、1つ以上の所望の特性を有する組織移植片の製造に有用でありうる活性物質の同定方法であって、（a）本発明の組織移植片をインビトロまたはインビボで試験剤と接触させること、並びに（b）該試験剤の該組織移植片及び／または上述した生物学的過程もしくは特性のうちの1つへの影響を評価することを含む、方法を提供する。いくつかのかかる方法は、組織移植片を対照活性物質と接触させ、該試験剤の影響と対照活性物質の影響を比較することを含んでもよい。いくつかのかかる実施形態では、該組織移植片は、前駆細胞、多能性細胞（人工多能性幹細胞等）、自己細胞（対象自身の細胞等）、または（i）所望の（1つまたは複数の）組織の形成、もしくは（ii）所望の（1つまたは複数の）組織の形成が可能な細胞への分化が可能な任意の細胞から誘導された細胞を含む。いくつかの実施形態では、該組織移植片は、血管組織移植片でありえ、ここで該組織移植片は、内皮細胞または他の血管細胞、例えば、前駆細胞（内皮前駆細胞等）、多能性細胞（人工多能性幹細胞等）、自己細胞（対象自身の細胞等）、もしくは（i）内皮及び／もしくは血管形成、もしくは（ii）内皮及び／もしくは血管形成が可能な細胞への分化が可能な任意の細胞から誘導されたものを含む。いくつかの実施形態では、該組織移植片は、人工多能性幹細胞を用いて生成される。いくつかの実施形態では、該組織移植片は、特定の疾病または障害を有する対象由来の細胞を含む。いくつかの実施形態では、本発明の血管組織移植片は、血管系の疾病または障害研究用のモデル系等のモデル系において、またはこれらと併せて、用いることができる。いくつかの実施形態では、本発明の血管組織移植片は、1つ以上の活性物質（薬物または他の活性物質等）の血管組織への影響の研究用のスクリーニング系において、またはこれらと併せて、用いることができる。
スクリーニングされる試験剤は、多くの化学的分類を含むが、典型的にそれらは化合物、例えば有機分子、及びしばしばオリゴヌクレオチドまたは100ダルトン超かつ約2,500ダルトン未満の分子量を有する低分子有機化合物（すなわち、低分子）である。試験剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要とされる官能基を含み、それらは典型的に、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくはこれらの化学官能基の少なくとも2つを含む。試験剤は、しばしば、上記官能基の1つまたは複数で置換された環状炭素もしくは複素環構造及び／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含む。試験剤はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造アナログまたは組み合わせを含む生体分子の中から見出される。
活性物質は、合成または天然化合物のライブラリを含む幅広い供給源から入手されうる。例えば、無作為化オリゴヌクレオチドの発現を含む幅広い有機化合物及び生体分子の無作為及び直接合成のための多くの手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリが利用可能であり、容易に作製される。さらに、天然のまたは合成により作製されたライブラリ及び化合物は、従来的な化学、物理及び生化学手段を通じて容易に修飾される。公知の薬理学的活性物質は、構造アナログを生成するよう、直接的または無作為的な化学修飾、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（amidification）に供されうる。
1つの局面において、本発明において使用される活性物質は、ポリヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはRNA分子である。様々な局面において、活性物質は、ポリヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはRNA分子、例えばマイクロRNA、dsRNA、siRNA、stRNA及びshRNAでありうる。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の組織移植片を含むモデル系を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、本発明は、非ヒト哺乳類である対象に移植された本発明の組織移植片を含むモデル系を提供する。1つのかかる実施形態では、該非ヒト哺乳類はヒツジである。いくつかの実施形態において、本発明は、インプラント材料が対象への移植に適するかどうかを判断する（実施例2を参照）のに使用される、本発明の組織移植片または組織セグメントを含むモデル系を提供する。例えば、いくつかのかかる実施形態では、インプラント材料は、生体適合性、機械的性質、または毒性等の所望の特性について、スクリーニングまたは検査されうる。いくつかのかかる実施形態では、インプラント材料は、合成材料もしくは天然材料、または合成及び天然材料の混合物でよい。本発明が提供するモデル系は、発症機序の理解、治療標的の定義、及び化合物のスクリーニングの実施などを含めて、限定されないが、移植用の材料のスクリーニングもしくは試験（実施例2を参照）、並びに所定の組織特異的条件下で疾病を研究するため等、様々な目的に用いることができる。
さらに、当業者には、本書に記載の方法、組成物（例えば、組織移植片）、及び装置（例えば、バイオリアクター）は、様々な異なるモデル系及びスクリーニング方法において、またはこれらと併せて、用いることができることが理解されよう。
対象
いくつかの実施形態において、本発明の組織移植片の製造に用いられる細胞は、必要または所望に応じて、任意の対象から採取または誘導されうる。いくつかの実施形態では、本発明が提供する方法（例えば、治療方法）及び組成物（例えば、組織移植片）は、必要または所望に応じて（例えば、病理学的もしくは外傷性組織欠損の修復のため、または美容もしくは再建目的用）任意の対象に使用されうる。いくつかの実施形態では、該対象はヒトである。いくつかの実施形態では、該対象は、哺乳類であって、限定されないが、非ヒト霊長類、ヒツジ、またはげっ歯類（ラットやマウス等）を含む。いくつかの実施形態では、第一の対象はドナー対象であり、第二の対象はレシピエント対象である。いくつかのかかる実施形態では、該ドナー対象または該ドナー対象の細胞は、該レシピエント対象または該レシピエント対象の細胞と、例えば、HLA型適合性によって適合しうる。
血管形成された骨移植片
1つの実施形態において、本発明は、血管形成された骨移植片の製造方法であって、（a）骨部分の3次元モデルを獲得する段階；（b）段階（a）の3次元モデルを2つ以上の骨セグメントモデルに分割する段階；（c）（i）段階（b）の骨セグメントモデルの各々に対応するサイズ及び形を有する足場を獲得すること；（ii）該足場を保持するように構成された内部チャンバーを有するバイオリアクターを獲得すること；（iii）（1）造骨細胞、または造骨細胞に分化可能な細胞、及び（2）血管形成細胞、または血管形成細胞に分化可能な細胞を該足場に適用すること；（iv）該バイオリアクター内で該細胞を該足場上で培養して骨移植片セグメントを形成すること；（v）該骨移植片セグメントを該バイオリアクターから取り出すことを含む、2つ以上の骨移植片セグメントを製造する段階；（d）段階（c）で製造された2つ以上の骨移植片セグメントを組み立てて、段階（a）の骨部分に対応するサイズ及び形を有する骨移植片を形成する段階、を含む方法を提供する。1つの実施形態では、（c）の（iii）で足場に適用される細胞は、多能性細胞、人工多能性細胞、前駆細胞、分化した細胞、またはこれらの任意の組み合わせを含む。1つの実施形態では、（c）の（iii）の（1）の細胞は、骨髄間質細胞、間充織幹細胞、間葉系列に誘導された多能性細胞、もしくは分化した骨細胞、またはこれらの任意の組み合わせを含む。1つの実施形態では、（c）の（iii）の（2）の細胞は、内皮前駆細胞、内皮細胞系列に誘導された多能性細胞、もしくは分化した内皮細胞、またはこれらの任意の組み合わせを含む。1つの実施形態では、該骨移植片セグメントは、厚さが約1cmまたはそれ以下である。1つの実施形態では、該骨移植片セグメントは、厚さが約0．3mm～約10mmである。1つの実施形態では、該骨移植片セグメントの組み立ては、接着剤、1つ以上のピン及び穴、または両方を用いて行われる。1つの実施形態では、該ピンは金属製または再吸収可能である。1つの実施形態では、該ピンはチタンである。1つの実施形態では、該接着剤は、生体適合性骨接着剤、例えば、NovoSorb（商標）（PolyNovo Biomaterials、メルボルン）等のポリマー、または任意のゲル、液体、ゴム様物質、もしくは2つ以上の骨セグメントを互いに固着可能な他の生体適合性材料である。骨接着剤の例としては、限定されないが、ポリウレタン系及びポリメチルメタクリレート系骨接着剤等のポリマー系骨接着剤が挙げられる。1つの実施形態において、本発明は、対象の骨部分の修復または置換方法であって、上述した段階（a）～（d）を含み、さらに、該骨移植片を対象に移植して、該対象の該骨部分を修復または置換することを含む方法を提供する。1つの実施形態において、本発明は、本発明の方法によって製造された血管形成された骨移植片を提供する。別の実施形態において、本発明は、対象の骨部分を修復または置換するための血管形成された骨移植片であって、該骨移植片が2つ以上の骨移植片セグメントを含み、該2つ以上の骨移植片セグメントが互いに連結されて、修復または置換されるべき該骨部分に対応するサイズ及び形を有する血管形成された骨移植片を形成する血管形成された骨移植片を提供する。いくつかの実施形態では、該骨移植片セグメントは、前駆細胞（間葉系前駆細胞等）、多能性細胞（人工多能性幹細胞等）、自己細胞（対象自身の細胞等）、または、（i）骨の形成、もしくは（ii）骨の形成が可能な細胞への分化が可能な任意の細胞から誘導された骨細胞を含む。いくつかの実施形態では、該骨移植片セグメントは、前駆細胞（内皮前駆細胞等）、多能性細胞（人工多能性幹細胞等）、自己細胞（対象自身の細胞等）、もしくは、（i）内皮及び／もしくは血管の形成、もしくは（ii）内皮及び／もしくは血管の形成が可能な細胞への分化が可能な任意の細胞から誘導された内皮または血管細胞を含む。いくつかの実施形態では、各骨セグメントは、最大厚さが約1cmより小さく、または、最大厚さが約0．3mm～約10mmである。
いくつかの実施形態において、上記方法に従って用いられる、または上記骨移植片の製造に用いられる細胞は、それらが自己細胞、もしくは自己細胞由来であるように、該骨移植片が配置される同じ対象から誘導されるか、または同じ対象から採取された細胞から誘導される。1つの実施形態では、該細胞は、例えば、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、クローン幹細胞、または成体幹細胞（骨髄系幹細胞等）等の多能性幹細胞から誘導される。いくつかの実施形態では、該人工多能性幹細胞は、該骨移植片が配置される同じ対象から、または、HLA適合等の適切に適合したドナーから採取された体細胞から誘導されうる。いくつかの実施形態では、該細胞は、間充織幹細胞及び／または内皮前駆細胞である。いくつかの実施形態では、該細胞は、該足場に、細胞比1：1、または、約2：8～約8：2の任意の比で播種される。
いくつかの実施形態において、本発明は、骨移植片の製造に用いるのに適する、本書に記載のバイオリアクター等の培養容器を提供する。かかる培養容器は、細胞／足場構築物を挿入し、圧入状態で培養することが可能な1つ以上のカスタマイズされた移植片チャンバーを含む灌流バイオリアクターでよい。バイオリアクターは、互いに固着される上部要素及び下部要素を含んでよい。1つの実施形態では、該上部要素は、培地用の容器、流体の出口、及び1つ以上の流路を含む。1つの実施形態では、該下部要素は、流体の入り口及び1つ以上の流路を含む。1つの実施形態では、該培養容器は、コンピュータ支援製造を用いて生成される。1つの実施形態では、該コンピュータ支援製造は、コンピュータ数値制御フライス盤及び／または3次元印刷を含む。
いくつかの実施形態において、該移植片チャンバーは、機能性の骨の成熟まで、該（1つまたは複数の）足場／細胞構築物を収容するカスタマイズされた（1つまたは複数の）チャンバーでよい。いくつかの実施形態では、移植片チャンバーは、厚さ約0．3mm～約10mmの骨のセグメントを収容するのに十分なサイズのものである。
いくつかの実施形態において、該足場及び／または骨セグメントは、フレームまたは挿入物を用いて該移植片チャンバーに配置されうる。フレームまたは挿入物は、所望に応じて移植片チャンバーのサイズ及び形をカスタマイズし、該足場及び／または骨セグメントを該移植片チャンバーに配置して、該骨セグメントを直接灌流下、圧入状態で培養し、該足場及び／または骨セグメントを通る流体の流れを最大にし、該足場及び／または骨セグメントの周りの流体の流れを最小にするために用いられうる。いくつかの実施形態では、該移植片チャンバーは、一般的な形またはサイズを有してよいが、（1つまたは複数の）フレームまたは挿入物を用いて、所望に応じて、該移植片チャンバーのサイズ及び形（例えば、内側のサイズ及び形）を、該足場及び／または骨セグメントを収容するようにカスタマイズしてもよい。フレームまたは挿入物は、任意の適切な材料、例えば、生体適合性で非毒性の成形可能なプラスチック製でよい。
1つの実施形態において、本発明は、例えば、本書に記載の通りの骨移植片の製造用に適する足場を提供する。1つの実施形態では、該足場はコンピュータ支援製造を用いて生成される。別の実施形態では、該製造は、コンピュータ数値制御フライス盤、注型技術、レーザ切断、及び／または3次元印刷を含む。1つの実施形態では、該足場は、脱細胞化骨組織から基本的になる。1つの実施形態では、該足場は、合成セラミック／ポリマー複合材料を含む。1つの実施形態では、該足場は、細胞による吸収が可能な材料から基本的になる。
いくつかの実施形態において、本発明は、骨疾患もしくは障害及び／または血管疾患もしくは障害用モデル系であって、本発明の血管形成された骨移植片を含むモデル系を提供する。1つの実施形態において、本発明は、骨の欠損、欠陥、疾患、または障害用のモデル系であって、2つ以上の骨移植片セグメントを含む血管形成された骨移植片を含むモデル系であり、該2つ以上の骨移植片セグメントが、互いに連結されて骨移植片を形成するモデル系を提供する。1つの実施形態において、本発明は、骨の欠損、欠陥、疾患、または障害の治療に有用でありうる化合物の同定方法であって、（a）互いに連結されて骨移植片を形成する2つ以上の骨移植片セグメントを含む骨移植片をインビボまたはインビトロで試験剤と接触させ、（b）該試験剤が、（a）の骨移植片の、機能を改善するか、成長を高めるか、または変性を防止もしくは遅延させるかどうかを決定することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、該骨の欠損、欠陥、疾患、または障害は、先天性、病的、もしくは外傷性欠損、美容目的の処置、変性疾患、悪性形質転換に伴う外科的切除、または慢性感染症を含む。1つの実施形態において、本発明は、血管疾患または障害の治療に有用でありうる化合物の同定方法であって、（a）互いに連結されて血管形成された骨移植片を形成する2つ以上の血管形成された骨移植片セグメントを含む血管形成された骨移植片をインビボまたはインビトロで試験剤と接触させ、（b）該試験剤が、該血管疾患または障害の治療または進行の防止もしくは遅延をさせるかどうかを決定することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、該骨移植片セグメントは、前駆細胞（間葉系前駆細胞等）、多能性細胞（人工多能性幹細胞等）、自己細胞（対象自身の細胞等）、または、（i）骨の形成、もしくは（ii）骨の形成が可能な細胞への分化が可能な任意の細胞から誘導された骨細胞を含む。いくつかの実施形態では、該骨移植片セグメントは、前駆細胞（内皮前駆細胞等）、多能性細胞（人工多能性幹細胞等）、自己細胞（対象自身の細胞等）、もしくは（i）内皮及び／もしくは血管形成、もしくは（ii）内皮及び／もしくは血管形成が可能な細胞への分化が可能な任意の細胞から誘導された内皮または血管細胞を含む。いくつかの実施形態では、各骨セグメントは、最大厚さが約1cmより小さいか、または、最大厚さが約0．3mm～約10mmである。
以下の実施例は、本発明の利点及び特徴をさらに説明するために提供されるものであるが、本発明の範囲を限定することは意図されていない。それらは使用されうるものの典型例であるが、当業者に公知の他の手法、方法または技術も代替的に使用されうる。
実施例1
大きな骨格異常の修復のための血管形成された骨移植片の人工的作出
はじめに
世界中でますます多くの患者が、外傷、先天性異常、及び疾病に起因する骨欠損に冒されており、骨修復及び再生療法の米国総年間市場は、2017年までに35億に達すると予測される。これら患者に対する、人工材料のインプラントまたは骨組織の移植に頼る現行の治療は最善ではなく、多数の臨床例において、骨格の完全性及び機能性を回復するための別の治療戦略が求められている。
本実施例は、複雑な骨格異常の治療を改善するため、ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）からの血管形成された骨移植片を人工的に作り出すための戦略を提案する。とりわけ、事実上無限の数の任意の患者のために、健康な骨を構築する自己骨形成原細胞及び血管細胞をhiPSCから誘導する能力は、前例のない治療的資源を意味する。血管形成された代用骨は、骨の発達の生体模倣足場‐バイオリアクター手法を用いて人工的に作り出される。コンピュータ支援及びラピッドプロトタイピング技術が、任意の形及びサイズの代用骨の製造を可能にする。大きな骨欠損のデジタルモデルが作り出され、その後、3D印刷等のコンピュータ支援設計及び製造技術を用いて、カスタマイズされた生体材料製足場及びバイオリアクターを製造するために用いられる相補的な下位部分に分割される（図1参照）。該工学戦略案は、大きな骨移植片の灌流培養に伴う制約を克服する。間葉系前駆細胞及び内皮前駆細胞は、任意の可能なリプログラミング法を用いて生成されたhiPSCから誘導され、その後、対応する足場と組み合わされ、機能性血管組織が成熟するまで灌流バイオリアクターで培養される（図2参照）。人工的に作り出された骨セグメントは、元の欠損の形と寸法を合わせるため、その後、生体適合性骨接着剤を用いて組み立てられ（レゴ様手法）、及び／または3D印刷されたチタンの穴とピンを用いて補強される。今後の研究は、複雑な骨格異常の様々な動物モデルを用いて、hiPSCから人工的に作り出された骨の治療可能性を探ることに向けられるであろう（図3参照）。
幾何学的に定義された血管形成された大きな骨移植片をhiPSCから人工的に作り出すことは、重度の骨量減少によって特徴づけられる骨格異常の治療に対する新規な解決法を意味し、多くの患者に個別治療をもたらす機会をもたらす。重要なこととして、かかる骨移植片は、骨の発達及び病理の研究のための、並びに新薬及び試験生体材料のスクリーニングの研究のための適格なモデルを表す。
本実施例は、骨格異常の治療の改善のため、血管形成された骨移植片を、ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）から人工的に作り出すために設計された研究について記載する。患者特異的骨移植片は、インビトロでの骨の発達の生体模倣足場‐バイオリアクター手法を用いて人工的に作り出され、コンピュータ支援及びラピッドプロトタイピング技術の助けを借りて、具体的な臨床的必要性を満たすようカスタマイズされる。患者特異的なカスタマイズされた骨移植片の人工的作出は、重度の骨減少によって特徴づけられる臨床的症状において、骨格の完全性及び機能性を回復するための革新的治療の発展に用いられうる。
骨格再建療法は、例えば、先天性及び外傷性骨格異常の再建、美容目的の処置、悪性形質転換後の変性疾患及び外科的切除、並びに慢性感染症に伴う骨欠損を取り除くために必要である。骨の置換及び修復療法に対する世界市場は巨大であり、骨組織代替物の必要性は、人口の急増と平均余命の延長によって、増え続けている。今日、加齢に伴う骨折が報告されている高齢者の数は世界中で年間1億人を超えると推定され、この数は、次の数十年間に増え続け、高齢者（＋65歳）の数は、2050年までに約20億人になると予測されている。したがって、複雑な骨の再建に対する効果的な治療の開発への新たな手法が求められている。生体模倣組織工学戦略は、近年、機能性組織の成熟を導く機械的な刺激及び適切な環境を与えるバイオリアクターにおいて、適切な培養条件下、骨コンピテント細胞を生体材料と接合させることによる機能性代用骨のインビトロ培養について研究されている。ヒト間葉幹細胞を骨誘導性足場‐灌流バイオリアクターシステムで培養して、幾何学的に定義された代用骨を人工的に作り出そうとする試みが近年報告されている。しかしながら、1）成体組織由来の幹細胞の限られた再生能、2）血管新生の欠如、及び3）直接灌流バイオリアクターでの大きな代用骨の培養に関する制約は対処されなかったもののが、すべてが、大きく複雑な骨格異常の治療の改善用の機能性移植片を人工的に作り出す能力に影響を与える。特に、大きな細胞／足場構築物の人工的作出は、この大きな構築物による流れ抵抗のため、直接灌流バイオリアクターを用いることは難しい。足場内での新生組織の発達は、該構築物を通る流体の灌流を次第に制限し、灌流システムの機能にマイナスの結果をもたらす。独自の調査で、4x4mmの構築物を直接灌流バイオリアクターで5週間培養した場合に、同様の状況が観察されることが証明された。
本実施例は、血管形成された代用骨をhiPSCから人工的に作り出し、医用撮像法、コンピュータ支援技術、及びラピッドプロトタイピングの組み合わせを採用して、臨床的に意義のある代用骨の灌流バイオリアクターでの構築を可能にするための研究を提案する。本戦略は、骨欠損という負担に対処するための新規で革新的な解決法を意味し、多くの患者の健康状態と生活の質を改善することによって、その臨床解釈は著しい社会的影響を持つであろう。これらの研究は、多能性幹細胞の成熟組織及び器官への機能分化の理解に重要な、hiPSCの生態についての新たな洞察も与えるであろう。さらに、hiPSCで人工的に作り出された血管形成された骨移植片は、健康状態及び病的状態での組織発達を研究するための、並びに天然の骨環境のいくつかの面に類似した状況で新たな活性物質及び生体材料を試験するための貴重な高忠実度モデルを提供するであろう。
背景
骨は、固有の再生及び自己修復能力を見せるが、この能力は、小さな骨折に限られており、多数の病態で、組織の完全性及び機能性を回復するための再建的治療が必要とされている。現行の治療は、自己及び／もしくは同種異系の骨移植片の移植、または、骨伝導性及び骨誘導性の移植片材料のインプラントに基づいている。自己骨移植片は、免疫忍容性並びに骨の再生及び修復を支援する必須成分の供給のため、骨置換治療の代表的な治療であるものの、その臨床的利用は、限られた供給力及びドナー部位の病的状態により、しばしば限定される。その一方、同種異系脱細胞化骨移植片は、大量に得られるが融合が遅く、感染伝播の危険を伴い、移植片拒絶反応につながる免疫不適合を呈しうる。人工材料のインプラントは、疾病の伝播、複雑な形、及び供給力といった自己及び同種異系移植片が直面する制限の一部を克服するが、融合に劣り、しばしば生体材料関連の感染をもたらし、生物学的機能性と機械的適合性を欠き、インプラントの失敗及び交換につながる。骨組織工学は、無限量に成長しうる代用骨を人工的に作り出す可能性をもたらし特定の臨床的必要性を満たすため、有望な治療の解決法を象徴する。成体組織由来のヒト間葉幹細胞（hMSC）は、有望な結果を伴って骨工学用途に広く用いられているが、限られた供給力、不十分な再生能、並びにインビトロでの増殖及びドナーの年齢に伴う機能性の低下のため、臨床応用の可能性が限られる。
サイズ範囲が約1cmの代用自家骨は、成体幹細胞から成長され、実験動物及びヒトでの骨の治癒を促すために用いられている。しかしながら、それらの臨床的サイズへの拡大及び機能性は、血液の供給不足、並びに培養成体幹細胞の限られた増殖及び血管形成能のために限定される。適切な血液供給が、正常な骨折治癒の必須要素として認められており、骨折部位の血管形成不全は、不良転帰が生じる際の第一要件である。血液供給の減少は、移植組織の低酸素状態と壊死につながり、骨形成の低下（「萎縮骨」）をもたらしうる。同様に、血管供給への連結がない大きな細胞化代用骨の移植は、該移植物の内部領域で細胞死をもたらしうる。細胞生存及び骨再生を促進するため、最近の組織工学的手法は、代用骨内への内皮前駆細胞または血管網の移植を含んでいる。内皮細胞及び骨形成原細胞の直接共培養モデルにおける好ましい効果が研究で示されている。さらに、内皮細胞とBMSCの共移植がインビボでの骨新生を促進したこと、並びに、代用骨内で人工的に作り出された内皮網が、宿主の血管系と機能的に吻合しうることを研究が示唆する。
多能性幹細胞は、高い再生能及び健康な骨組織を構築するすべての特異性細胞への分化能を呈する。核のリプログラミング技術を用いて誘導された場合、多能性幹細胞は、個別の用途のための患者特異的代用骨の構築を可能にする。最近、間葉系前駆細胞及び内皮前駆細胞の両方が、多能性幹細胞から誘導されており、大きな骨格異常の再構築の改善のための血管形成された代用骨の無制限の構築への新たな機会を開いている。それ故、重度の骨格異常及び骨障害に冒された多くの患者に対する安全かつ有効な治療を発展させるため、人工多能性幹細胞から血管形成された骨移植片を人工的に作り出す可能性を探索することは重要である。
結果
本発明者らは、成体組織由来の間充織幹細胞及びヒト多能性幹細胞からの代用骨の培養に幅広い経験がある。hMSC、及びヒト胚性幹細胞（hESC）株由来の間葉系前駆細胞の相対的再生能を調べる一連の研究は、hESCから誘導された間葉系前駆細胞の骨工学用途への比較優位を示した。バイオリアクター中での足場における単層及び3D培養の研究は、hESCから誘導された間葉系前駆細胞が、形態、表面抗原、及び包括的な遺伝子発現プロファイルの観点からhMSCに高度に似ているが、より高い増殖力、生合成活性、及び石灰化特性を呈することを示し、これらはすべて、骨工学用途の機能性代替物の無制限の構築において最重要な特徴である。該誘導プロトコルは、非組み込み型ベクターに基づく異なるリプログラミング技術を用いて異なる組織から生成されたhiPSC株にまで拡張され、個別の用途のための安全な患者特異的代用骨を人工的に作り出す可能性を開いている。hiPSC株は、多能性と核型を評価するため、間葉系列へ7日間誘導される前に、免疫組織化学によって特徴づけられた。間葉状表現型は、フローサイトメトリー、並びに、単層培養（骨形成、脂質生成）及びペレット培養（軟骨形成）での表面マーカー発現及び分化能の調査によって特徴づけられた。骨形成系列への分化は、アルカリホスファターゼ及び石灰化によって確認され、軟骨形成系列への分化は、グリコサミノグリカンによって示され、脂質生成系列への分化は脂質特性化によって示された。
細胞を、次に、脱細胞化骨足場（4mmΦx4mm高さ）に播種し、免疫不全マウスへの12週間の皮下移植前の5週間、骨形成培地で一定の灌流下（直線流速800μm／秒）で培養し、安定性とさらなる組織の成熟を評価した。人工的に作り出された骨の組織学的及び免疫組織化学的分析を、バイオリアクターでの培養及び免疫不全マウスでの皮下移植の後に行った。顕微鏡写真は、表現型的に安定した骨状組織の成熟及び血管新生を認めた。人工的に作り出された骨のマイクロCT分析は、ミネラル濃度及び構造パラメータの増加を認めた。
要するに、これらの結果が示すのは、間葉系前駆細胞は、hiPSC株から誘導することができ、個別の用途における骨格異常の修復治療用の、成熟した、表現型的に安定な骨組織を人工的に作り出すのに利用できるということである。すべての研究において、灌流バイオリアクターは、それらが生物力学的刺激を細胞に与え、構築物の内部で細胞の生存を支援し、厚く均質な骨状基質の産生をもたらすため、骨の発達のためには特に重要であることが示された。研究は、ここで、幾何学的に複雑な大きな骨格異常の治癒を改善するための血管形成された代用骨を人工的に作り出すために適切なプロトコルの開発に向けられる。予備研究で、機能性内皮前駆細胞が、hESC株から誘導されうることが示された。管理された条件での胚様体の分化の後、単離されたCD34陽性細胞は、DiI－Ac－LDLを特異的に内在化し、Matrigel（商標）にプレーティングされた際に管を形成することが可能であった。この手法は、患者特異的多細胞複合代用骨の構築のため、hiPSCに置き換えられている。
さらに、3D培養における血管新生の予備研究で、hiPSCから誘導された間葉系前駆細胞及びヒト骨髄間質細胞（BMSC）とヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）との共培養が、細胞がフィブリン塊に埋め込まれた場合、または、骨格修復治療用のより適合する基材の典型となる脱細胞化骨足場に播種された場合の両方において、長期にわたる血管網の形成をもたらすことが示された。興味深いことに、血管構造の数と安定性は、HUVECが、hiPSCから誘導された間葉系前駆細胞とともにフィブリン塊で培養された場合、及びヒトBMSCとともにフィブリン塊で培養された場合に、同様であった。落射蛍光顕微鏡写真で、播種後3週間で、安定な3D血管網の存在を認めた。塊断面のヘマトキシリン／エオシン染色では、hiPSC株1013Aから誘導された間葉系前駆細胞とBMSCのHUVECとの共培養の両方について、播種後4週間で、構築物全体に中空血管の存在を認めた。インビトロでの血管網の形成を追跡するため、フィブリン塊に埋め込む前に、細胞集団を異なるVybrant追跡用色素で特異的に標識し、骨形成誘導培地及び内皮誘導培地の混合物中で、組織学的分析用の回収の前に4週間培養した。HUVECを単独で培養した場合には、血管構造は観察されず、血管新生の支援及び誘導に対する間葉細胞の組織の極めて重要な役割を示唆した。インビトロでの血管形成された骨組織の成熟を支援するための改良されたプロトコルを開発するために、この発見の根底にある分子機構を同定する研究が行われうる。
同様の結果が、細胞を脱細胞化骨足場（8mmΦx2mm高さ）に播種し、骨形成及び血管誘導条件で6週間培養した場合に観察された。オステオカルシン、オステオポンチン、及び骨シアロタンパク質のポジティブ染色法によって証明された骨状組織の成熟は、構築物の内部での中空血管網の形成を伴った。免疫組織化学的検査は、該管状構造が内皮マーカーCD31に対して陽性であったことを示した。
血管形成された骨組織形成を改善する可能性を探索するため、並びに、他のhiPSC株の、血管形成された骨移植片を人工的に作り出す可能性を評価するために、異なる播種比、及び培養条件を試験することができる。さらなる研究は、血管形成過程における灌流バイオリアクターでの動的条件の影響を探索することを目的とする。適切な血管形成プロトコルの開発は、生体模倣骨誘導足場‐灌流バイオリアクター手法との併用で、複雑な骨格異常の個別の修復治療用の血管形成された骨移植片の構築を可能にするであろう。
研究設計及び方法
本実施例は、系統特異的な骨形成前駆細胞及び内皮前駆細胞の誘導から開始して、これら前駆細胞を、インビトロでの機能性骨組織の制御された発達を保証する「生体模倣」足場‐バイオリアクターモデルにて共培養する段階的分化手法を用いて、hiPSCから血管形成された骨移植片を人工的に作り出すことを提案する。幾何学的に複雑な大きな骨格異常の再建用のカスタマイズされた代用骨の製作を可能にするため、コンピュータ支援及びラピッドプロトタイピング技術が用いられる。カスタマイズされた患者特異的な骨移植片の人工的作出を用いて、重度の骨量の減少によって特徴づけられる臨床症状における骨格の完全性及び機能性を回復するための革新的治療を発展させることができる。本実施例は、以下に記載の通り、3つの下位プロジェクトを説明する。
1．骨格モデルのコンピュータ支援設計（CAD）並びに生体材料製足場及び灌流バイオリアクターのコンピュータ支援製造（CAM）
パート1の目的は、骨格異常のデジタルモデルを創出及び精緻化し、カスタマイズされた生体材料製足場及び灌流バイオリアクターの設計と製造を導くことである。骨格異常のデジタルモデルは、CADソフトを用いて作り出されて相補的下位部分に分割され、その後、これらのモデルは、対応するサイズ及び形の生体材料製足場及びカスタマイズされた灌流バイオリアクターのコンピュータ支援製作の参照として使用される。バイオリアクターは、各特異的細胞／足場構築物を、圧入形式で収容し、直接灌流下での培養を可能にするため、該デジタルモデルを用いて機械加工及び／または自由形状製作される。
骨格異常のデジタルモデルは、CADソフト（例えば、Autocad（商標）、Solidworks（商標）、ProE（商標）、Creo（商標））を用いて作り出される。提案される工学戦略の治療可能性を実証するため、この手法を異なるサイズ及び形の欠損モデルに拡大することができる。CADでの骨格異常の参照モデルは、編集され、灌流システムに影響を与えずに灌流バイオリアクターで培養可能なより小さい相補的下位部分（レゴ様組み立て部品）に分割される。分割された骨試料ファイルは、次に共通IGESまたはSLTフォーマットで保存され、CAMソフト（例えば、SprutCAM（商標））に取り込まれる。CAMソフトで生成されたファイルは、次に処理されて、コンピュータ数値制御（CNC）フライス盤（例えば、Tormach（商標）、Bridgeport（商標））を操縦するための適切なGコードを生成し、適切な工作機械工具ビットを選択し、機械加工経路のプログラムを組んで、該足場を所望の分節形状に切断する。適切なサイズの骨梁（ウシ及び／またはヒト）のプラグがドリルで穴開けされ、骨髄を除去するために高圧水蒸気で洗浄され、その後、前述（de Peppo et al． Proc Natl Acad Sci USA 110（21）：8680－5（2013））の通り細胞物質を取り除くために連続的に洗浄される。脱細胞化骨プラグは、次に凍結乾燥され、該骨格異常の分割された試料の形及びサイズに対応する足場の製作に用いられる。合成の、再吸収可能な機械的適合性セラミック／ポリマー複合材料は、臨床応用のための代用骨の再現性のある大規模製作のために必須の要件を示すため、その使用可能性が並行して模索される。製作された足場は、滅菌され、細胞の播種の前に培地中で一晩調整される。CADで編集された分割された骨試料ファイルは、次に、直接灌流条件下、圧入形式で、（1つまたは複数の）細胞／足場構築物を収容可能なカスタマイズされたバイオリアクターを設計するために用いられる。該CADファイルは共通フォーマットに再び変換され、CAM及び／または3D印刷ソフトに取り込まれ、異なるプラスチック材料を用いてバイオリアクターを製作するのに用いられる。各バイオリアクターは、例えば、金属製ねじで互いに固着されることになる2つの部分（上部及び下部）で構成される。該細胞／足場構築物は、該上部及び下部要素の間で培養される。該下部は、限定されないが、流動灌流の入り口及び流路、並びに該細胞／足場構築物を収容するための解剖学的に造形されたチャンバーを含む主要素を具備する。該上部は、培地の容器及び流動灌流の出口等の要素を具備する。該入り口と出口を連結し、蠕動ポンプの制御によって該バイオリアクター全体にわたって灌流させるために、管系を用いることができる。
2．カスタマイズされた灌流バイオリアクターでの血管形成された骨の人工的作出
パート2の目的は、血管形成された患者特異的骨移植片をインビトロで人工的に作り出すことである。非組み込み型ベクターを用いて異なる組織からリプログラミングしたhiPSC株は、血管形成された機能性骨組織の成熟を導くために、生体模倣条件下、骨誘導性足場‐灌流バイオリアクターシステムでの培養に先立って、間葉及び内皮細胞系列へと誘導される。
異なるドナー及び起源組織（BC1及び1013A株）から、非組み込み型ベクターを用いてリプログラミングしたhiPSCは、間葉及び内皮細胞系列へと誘導される前に、増殖され、多能性について特徴づけられ、核型分類される。誘導された前駆細胞は、増殖され、フローサイトメトリーで特徴づけられ、遺伝的正常性を評価するために核型分類される。インビトロでの骨形成及び内皮の表現型を評価するため、組織学的及び免疫組織化学的検査、生化学的及び形態学的分析、並びに遺伝子発現解析を含めた定性的及び定量的手法が用いられる。血管誘導は、単層培養及び胚様体において、特異的因子（BMP－4、アクチビン、bFGF、VEGF）の存在下で検査される。分化した前駆細胞は、表面抗原発現（CD34、CD31、KDR、C－KIT）に基づいて分類され、内皮の培地で培養される。前駆細胞の収率、生存能力、増殖、及び表現型‐特異的マーカー発現（CD31、vWF、VE－カドヘリン、SMA）は、フローサイトメトリー、免疫蛍光、及び遺伝子発現によって評価される。ネットワーク形成及び発芽は、共培養研究の前に、コラーゲン／フィブロネクチン／Matrigel（商標）に封入して検査される。hiPSCから誘導した間葉系前駆細胞及び内皮前駆細胞の質と機能性を評価するために、市販のBMSC（Lonza）及びHUVEC（Lonza）が参照株として用いられる。血管形成された骨組織を人工的に作り出すため、hiPSCから誘導した間葉系前駆細胞及び内皮前駆細胞は、脱細胞化骨足場（またはその他）に共播種され、バイオリアクター中、骨形成及び内皮の混合培地で、培養される。予備分化、細胞の播種比、分化因子の濃度、及びフィブリン封止剤の使用は、インビトロでの血管形成された完全骨移植片の発達のための最適培養条件を設計するために模索される。バイオリアクターでの培養は、血管形成された成熟組織の形成まで、3～5週間行われる。組織発達は、組織学的及び免疫組織化学的検査、生化学分析、高分解能特性化技術（SEM、FIB－TEM、Tof－SIMS）、撮像法（マイクロCT）、並びに機械的検査（ヤング率、引張及び圧縮強さ）を含めた定性的及び定量的手法を用いて評価される。
3．人工的に作り出された骨セグメントの接着及び安定性の評価
パート3の目的は、複雑な骨格の再建のためのカスタマイズされた骨移植片を製作することである。人工的に作り出された血管形成された骨セグメントは、生体適合性骨接着剤を用いて骨格異常の形に合わせるために組み立てられるか、または、3D印刷された金属製（例えば、チタン）もしくは再吸収可能なピン及び穴を用いて補強される。今後の研究は、臨界サイズの骨格異常（負荷及び無負荷解剖学的部位の両方で）の動物モデルでの人工的に作り出された骨の安全性及び有効性の調査に向けられるであろう。
人工的に作り出された骨セグメントは、大きな骨移植片を結合させるために生体適合性骨接着剤を用いて骨格異常のモデルの形を合わせるために組み立てられるか、または3D印刷された金属製（例えば、チタン）もしくは再吸収可能なピン及び穴を用いて補強される。今後の研究は、複雑な臨界サイズの骨格異常（負荷及び無負荷骨格部位の両方で）の動物モデルでの人工的に作り出された骨の安全性及び再生能の調査に向けられるであろう。例えば、成体動物の大腿骨頭欠損のデジタルモデルは、医用撮像法（CTスキャン）並びに加工及び分割された（上述の通り）3D画像を用いて作り出され、本書に記載の通り、血管形成された骨を人工的に作り出すために用いられる。次に、生成されたデジタルモデル（上述した通り）に合う程度まで大腿骨頭を取り除くための大腿骨頭骨切り術が該動物で行われ、人工的に作り出された血管形成された骨をその場所に配置して、骨格の完全性及び機能性を回復させる。再生組織の組織発達、治癒、及び品質は、医用撮像法を用いてインビボで、並びにそれに続く外植で組織学的及び免疫組織化学的手法、高分解能特性化技術（例えば、SEM、FIB－TEM、Tof－SIMS）、並びに機械的検査（例えば、ヤング率、引張及び圧縮強さ）を用いて評価される。
本書に記載の通り、血管形成された骨移植片は、個別の再建治療用に、ヒト人工多能性幹細胞由来の骨形成前駆細胞及び内皮前駆細胞を用いて人工的に作り出すことができる。内皮前駆細胞はhESC及びhiPSCの両方から誘導することができるが、該誘導の有効性は低く、誘導された前駆細胞は増殖能に乏しく、血管形成された大きな代用骨を人工的に作り出すための十分な細胞生成の可能性が制限される。hiPSCからの高増殖性の内皮前駆細胞誘導の最適化と並行して、適切な血管形成プロトコルの発展を加速するため、市販のHUVECを使い、その後該プロトコルをhiPSC由来の内皮前駆細胞に置き換えることができる。hiPSC由来の間葉系前駆細胞を、内皮細胞系列への誘導の前に必要量まで増殖させ、その後血管形成された代用骨を人工的に作り出すために用いてもよい。
本書に記載の通り、人工的に作り出された代用骨は、大きな骨移植片の結合用の生体適合性骨接着剤を用いて組み立て、骨格異常の形に適合させることができるが、高い荷重がかかる場所への移植後に安定した連結を確保するには不十分である可能性がある。この問題を解決するため、3D印刷された金属製または再吸収可能なピン及び穴を用いた補強を含めた別の解決法が試されるであろう。
ヒト幹細胞
ヒトiPSCからの血管形成された骨移植片の製造のため、段階的プロトコルが提案される。これは、（a）ヒトiPSCからの骨形成前駆細胞及び血管前駆細胞の分化及び増殖、並びにこれらの新たな組織形成についての機能的可能性の検査；（b）脱細胞化骨足場または他の生体適合性及び再吸収可能な生体材料製足場の製造及び播種；並びに（c）微小血管網の形成と併せて／連続して、造骨組織相の培養を含む。
細胞株：ヒトiPSC株1013A（NYSCF研究所にてセンダイウィルスによって得られた）及びBC1（エピソームプラスミドベクターによって得られた、Life Technologies製）を用いることができる。初期研究は、ESC株H9（Wicell Research Institute製）及び市販の成熟細胞（Lonza製BMSC及びHUVEC）と並行して行われる。
材料の調達先
ヒトiPSC株BC1は、Life Technologiesから入手した。もともとは匿名のドナーの骨髄から誘導されたこの株は、Cell Research（2011年1月18日）で発表された。この株は、対照株として用いられているが、これに対して今後の対照株が試験されるであろう。
ヒトiPSC株1013Aは、ニューヨーク幹細胞財団研究所にて、皮膚生検から得られた。
参照のBMSC及びHUVEC株は、市販されており、Lonzaから入手可能である。
結論
このプロトコルから生じたデータは、hiPSC由来の血管形成された代用骨開発の概念実証を提供すると期待されている。生体模倣条件で、足場及びバイオリアクターを用いて培養されたhiPSCによる骨形成及び血管新生についての新たな洞察が得られるであろう。さらに、人工的に作り出された血管形成された代用骨は、骨の発達及び疾患のインビトロ定量分析のための、並びに天然の骨環境の選択された局面に類似する枠組みの中で、活性物質及び生体材料試験（例えば、実施例2を参照）の貴重な高忠実度モデルを提供するであろう。
実施例2
インプラント材料をインビトロでスクリーニングするための生物模倣プラットフォーム
生物医学インプラント用のインビトロスクリーニングプラットフォームを、人工骨を用いて構築する。このスクリーニングプラットフォームは、3R原理（代替（Replacement）、削減（Reduction）、改善（Refinement）；以下参照）にしたがう動物試験の代替法の構築に寄与する。骨移植片を、インプラント材料をスクリーニングするための実験的プラットフォームとして作製する。骨移植片を、骨発生の生物模倣アプローチを用いて人工多能性幹細胞（iPSC）からインビトロで作製し、移植に適した化学的及び形状的特徴を有する材料をスクリーニング及び開発するための動物試験の代替法として使用する。3Dスクリーニングプラットフォームを、動物、ヒト及び合成人工骨で比較することによって金属インプラントについて検証する。
3R分野との関連性
頭蓋顔面骨及び骨格骨の欠陥は、患者に痛み、不快感及び心理的苦痛を与える。これらの状態は、アロプラスチック材料の移植を通じて改善することができるが、その開発には大規模な動物試験及び長い時間が必要となる。代替のヒト関連法を使用することで、動物モデルを用いずに新しいインプラントの効能及び安全性をスクリーニングし、より高い臨床可能性を有する製品の開発に寄与することができる。
提案されるスクリーニングプラットフォームを用いることで、単に動物を削減するだけでなく、長期的にはそれと完全に置き換えることができる。実際、骨-インプラント境界面で発生する生物学的及び化学的現象の精緻な特徴づけ及び理解は、ヒト患者への直接的適用のための知識に基づくアプローチを用いた新しいインプラント表面の開発を促進しうる。本発明は、新しいインプラント材料のスクリーニングのためにより安価に、より速く及び高スループット様式で使用することができ、動物試験を必要としない。
人工骨移植片を用いるインビトロスクリーニングプラットフォームの開発
iPSC由来間葉系前駆細胞と、脱細胞化骨足場と、スクリーニングするインプラント材料とを組み合わせることによって、骨移植片を作製する。骨発生の生物模倣アプローチを用いて骨移植片をインビトロで成長させ、これをインプラント材料に対する細胞反応、インプラントと人工骨組織との相互作用の強さ、及び骨-インプラント境界面の質を研究するために使用する。
チタンミニインプラント（ねじ、およそ高さ6 mm及び直径2 mm）を脱細胞化ウシ骨足場に挿入するために、このプラットフォームの幾何学的形態を標準化する。比較のために、Tiインプラントを機械加工し滅菌する。機械加工された表面は、動物及び臨床研究からの公開された結果の大部分を構成する。また、骨との最適な接触のために、さらには骨との結合のために、すなわち生物活性表面となるよう、現在のTi表面をさらに最適化する。インプラント表面の効果に関する正確な結論を導くために、インプラントの化学的及び形状的特徴を、表面形状測定、電子顕微鏡法、X線光電子分光分析（XPS）及びコンピュータ断層撮影（CT）を用いて研究する。ウシの中手骨関節の軟骨下部領域から、骨梁のプラグ（直径8 mm）をドリルで切り出す。直後に、プラグを高圧流水の下で洗浄して骨髄を除去し、次いで細胞物質及び遺伝物質を除去するよう異なる洗浄溶液を用いて連続処理する。脱細胞化後、骨プラグを凍結乾燥させ、厚さ3～4 mm及び直径8 mmの最終寸法に切断する。各個の足場を秤量及び測定してその密度を計算する。その後、選択された回転速度のモーター駆動トルクレンチを用いて脱細胞化ウシ骨足場（厚さ3～4 mm及び直径8 mm）にインプラントを挿入する。インプラントを足場の厚み全体にねじ込み、70％エタノール中での一晩の滅菌後に、このインプラント-足場構築物を、除去トルク試験を用いた相互作用の力学的安定性の測定に使用する。
多量の前駆細胞を生成するために、以前に確立されたプロトコルを用いてNYSCFから入手可能なヒトiPSC株（1013A株及び／もしくはBC1株）並びに／またはNIH登録株から間葉系前駆細胞を得、そして完全な特徴づけの後に、Tiインプラントを固定した脱細胞化骨足場に播種する。インビトロ及びインビボで骨形成細胞を生じ、骨組織を形成することが知られている市販のBMSCを播種した構築物を、すべての実験において参照として使用する。組織形成及びインプラント融合に対する初期細胞量の影響を研究するため、細胞を異なる密度（1～3百万個／試料）で播種する。細胞を播種した構築物を、5、7及び10週間、骨形成条件下で培養する。培養期間中、PrestoBlue（商標）アッセイを用いて細胞増殖を毎週概算する。ELISAを通じて骨特異的タンパク質（gla型オステオカルシン及びオステオポンチン）の放出及び乳酸デヒドロゲナーゼの量の測定を通じて細胞傷害性を研究するため、培養培地を各交換時に回収する。培養後、試料を収集して細胞生存率、インプラント材料に対する生物学的反応、インプラントと人工骨組織との相互作用の強さ及び骨-インプラント境界面の質を決定する。
この材料に対する生物学的反応は、分子生物学技術を通じて決定する。リアルタイムPCR、ウェスタンブロット及び酵素アッセイを通じてRUNX2、COL1A1、ALPL、OPN、OC及びPDGFRBを含む骨特異的遺伝子及びタンパク質の発現及び産生／活性を研究することによって、骨形成性分化を評価する。遺伝毒性は、Nanostring（商標）技術を用いた染色体分析を通じて決定する。コラゲナーゼ及びトリプシン処理の組み合わせを用いて構築物から細胞を剥離させ、必要数まで増殖させ、次いで分析のためのDNAを単離するために溶解させる。骨-インプラント境界面に関する大きな関心事である組織形成及び石灰化は、マイクロCT（μCT）分析並びに組織学的及び組織化学的方法を通じて評価する。組織学のために、試料をPMMAプラスチックで包埋し、縦方向に切断して切片にし、すりつぶし、Stevenel's blue、その後にvan Giesonピクロフクシン及びGoldner's Massonトリクロム染色を用いて染色する。骨マトリクスの付着を評価するため、試料を脱石灰化し、パラフィンで包埋し、切断し、オステオポンチン、骨シアロタンパク質及びオステオカルシンに対して染色する。決定すべき1つの重要なパラメータは、生体材料（人工骨システム）の生物力学特性、例えば、除去トルク及び引き抜き強さである。これを有意義にするために、試験を、インプラントのサイズ及び挿入力（トルク）に関して標準化し評価する必要がある（Johansson et al., Clin Implant Dent Relat Res 14(4): 603-11 (2012)を参照のこと；Buser et al., Int J Oral Maxillofac Implants 13 (5): 611-9 (1998)も参照のこと）。
スクリーニングプラットフォームの質に対する足場の起源の影響の評価
組織の成長並びにインプラントの安定性及び融合に対する骨の質の種間差の影響を研究するため、脱細胞化ウシ骨または脱細胞化ヒト骨のいずれかを用いて本明細書に記載されるようにしてスクリーニングプラットフォームを作製し、形成される組織の質、インプラントと新たに形成される組織との相互作用の強さ及び骨-インプラント境界面の質に対する足場の起源の影響を研究する。
本明細書に記載されるようにして、チタンねじを製造し、特徴づける。本明細書に記載されるようにして、ウシ及びヒトの死体組織の中手骨関節の軟骨下部領域から、骨梁のプラグ（直径8 mm）をドリルで切り出し、処理し、切断する。死体骨の検体は、LifeNet Health（登録商標）により提供される。各個の足場を秤量及び測定して密度を計算する。医用画像化法、電子顕微鏡法、高解像度特徴づけ法及び機械的試験の組み合わせを使用して、脱細胞化ヒト骨またはウシ骨から得られた足場の構造、組成及び質を研究及び比較する。足場の性質、新しい組織の形成及びインプラントと人工骨との相互作用の程度の間の任意の関連する相関性を見出すために、特徴づけの結果を使用する。特徴づけ後、本明細書に記載されるようにして、Tiインプラントを脱細胞化足場試料に設置し、この構築物にiPSC由来間葉系前駆細胞を播種し、骨形成条件下で数週間培養する（最適な週数は本明細書に記載されるようにして確立する）。細胞接着、生存率及び増殖、形成される組織の質、インプラントと新たに形成される組織との相互作用の強さ、並びに骨-インプラント境界面の質を、本明細書に記載されるようにして研究する。
スクリーニングプラットフォームの質に対する培養システムの影響の評価
インビトロでの組織の成長及びインプラント-組織相互作用に対する灌流バイオリアクターにおける動的条件の影響を、スクリーニングプラットフォームを（本明細書に記載されるようにして）作製し、それらを灌流バイオリアクターにおいて静的及び動的条件下で培養し、そして形成される組織の質及び量、インプラントと新たに形成される組織との相互作用の強さ並びに人工骨-インプラント境界面の質に対する灌流の影響を研究することによって研究する。
脱細胞化骨足場（ウシ及びヒト）の影響を決定した後、灌流バイオリアクターにおいて、形成される組織の質及び量、インプラントと新たに形成される組織との相互作用の強さ並びに人工骨-インプラント境界面の質に対する動的条件の影響を調査する。iPSC由来間葉系前駆細胞及びインプラントを固定する脱細胞化骨足場の構築物を、以前に確立されている灌流計画（0.8 mm/sの間質速度（interstitial velocity）（Grayson et al., Biotechnol Bioeng 108:1159-1170 (2011)）に相当する3.6 ml/分の一定流速）を用い、静的及び動的条件下で様々な週にわたって培養する。動的条件下で細胞に加わるせん断応力の程度を概算するため及び生理学的により妥当な応力に相当する灌流計画を特定する可能性を調査するため、医用画像化法、3D画像処理、デジタル設計及びシミュレーションソフトウェアの組み合わせを使用する。CTスキャンから得られるDICOMファイルを使用して、灌流方向に沿った足場の2D画像を再構築し、インプラントを固定するモデルを、流体力学環境をシミュレートするCOMSOL Multiphysics（商標）における灌流システムフレームワークに設置する（図18）。細胞接着、生存率及び増殖、形成される組織の質、インプラントと新たに形成される組織との相互作用の強さ並びに骨-インプラント境界面の質を、本明細書に記載されるようにして研究する。
スクリーニングプラットフォームを作製する上での合成足場の可能性の評価
インプラント材料をスクリーニングするために合成足場を使用する可能性を、骨に類似した特定の化学組成及び空隙率を有するセメント足場を製造し、それらにiPSC由来間葉系前駆細胞を播種し、そして本明細書に記載されるようにインプラント材料をスクリーニングする上でのそれらの可能性を研究することによって調査する。
高い費用及び長い処理時間を含む生物学的足場に伴う不利益を避けるために、異なる空隙率及び力学的特性を有する骨セメント足場を製造する溶解相アプローチを開発した。材料の観点からは、足場を複雑な形状に成形することが可能であり、足場材料は、骨の再生に適した化学組成を有し、（細胞が侵入することができる）十分なサイズの相互連結孔を含んでいると考えられる。天然形態に類似するマクロ多孔性を含む、天然の骨と類似の化学組成を有するバイオセラミック材料を設計することができる。バイオセラミック技術は、リン酸カルシウムセメント化学（CPC）に基づく。CPCは、一般に、2つの異なる化学物質であるアパタイトセメント（中性～アルカリ性pH）またはブルシャイトセメント（酸性pH）から見い出されうる（Ginebra et al., Acta Biomater 6(8): 2863-73 (2010)）。天然骨は、リン酸カルシウム相としてアパタイトを有し、アパタイトの形成は、細胞活性が関与する沈降型の化学によりもたらされる。類似の化学性質を有する合成材料は、沈降型の結合反応を用いた製造に適しておらず、代わりにセメント反応が使用されうる。ブルシャイト型及びアパタイト型の両セメントを所望の形状に成型し、溶解相のポリエチレングリコール粒子（PEG）の添加を通じてマクロ孔を形成する（Unosson et al., J Biomed Mater Res B (2015)）。成型されたセメントを、加湿及び加熱環境（例えば、37℃、相対湿度100％）下で硬化させ、その後に37℃で2日間、リン酸緩衝生理食塩水中で硬化させる。硬化させた足場を、径方向引張り及び圧縮強さについて、X線回折、走査電子顕微鏡法を通じて評価する。顕微鏡画像及び断面分析から孔サイズ分布を決定する。足場はその後に取り扱うことができ、本明細書に記載される方法からのインプットにしたがって試験を行う。脱細胞化骨足場の構築物を、すべての実験において対照として使用する。これらの研究からの結果は、このスクリーニング方法における天然骨の必要性に取って代わる可能性を評価するための最適な化学組成及びマクロ空隙率の知見を含みうる。
本発明者らは、成体組織由来の間葉系幹細胞（MSC）から及びヒト多能性幹細胞から並びに生体材料足場及びインプラントの合成及び分析からの骨置換物の培養に関する豊富な経験を有している。バイオリアクター内での静的または動的条件下での足場上における単層及び3D培養の研究は、多能性幹細胞由来の間葉系前駆細胞が、形態、分子指標及び骨分化能の点で骨髄由来ヒトMSC（BMSC）と高度に類似するが、それよりもずっと高い増殖能を示し、したがって組織工学用途に適していることを示した。特に、ヒトiPSCは、健常な骨組織を構成するすべての細胞型を発生させることができ、個人向け用途で患者特異的な骨組織移植片置換物を作製する可能性を広げる。高増殖性の間葉系前駆細胞をヒトiPSCから得（iPSC-MP；図13）、生体模倣セメント及び脱細胞化骨足場と組み合わせて、基礎及び応用研究のための組織移植片を作製した。
革新的な研究ツールを開発し、動物実験を減らすまたはそれと完全に置き換えるために、Tiミニインプラントを脱細胞化ウシ骨足場に固定し、これらの構築物にiPSC-MP細胞を播種し、骨形成条件下で最大7週間培養した。生／死アッセイ及び組織学的調査を用いた結果は、インプラントと人工骨移植片の十分な融合を示し（図14）、そのような結果は、インビトロでインプラント材料をスクリーニングするための生物模倣プラットフォームを作製するために使用することができる。研究は、このプラットフォームをさらに発展させ、その性能及びインビボ研究から得られる結果を予測する能力を向上させる最適な培養条件を発見することを目的としている。リン酸カルシウムマクロ孔セメント足場も構築し、ヒトiPSC-MP細胞の細胞接着、増殖及び骨形成分化を脱細胞化骨足場と同程度支持することが見出され、したがってこれは実験及び臨床用途の骨移植片を作製するために使用されうる。
骨-インプラント境界面における石灰化マトリクスの形成は、インビトロでのインプラント材料の力学的安定性に影響し、したがって動物及び患者への適用の結果を予測するために使用することができる結果に影響しうる。多能性幹細胞のいくつかの特定の系統への分化は、誘導法、遺伝的背景及びその他の要因により変化しうる。この不都合に対処するため、ゲノムが配列決定され生物学が公知となっている登録株を含むより多くの細胞株を使用する。市販のBMSC株も、スクリーニングプラットフォームを構築する上でのそれらの能力を調査するために、及び異なるiPSC株由来の間葉系前駆細胞の性能を検証するための参照株として、使用する。
長期的目標は、このスクリーニングプラットフォームで市販のインプラント及び生体材料をスクリーニングできるようにすることである。市販のインプラント材料の融合をインビトロで研究し、その結果を動物モデルにおける公開されているデータと比較する。化学及びトポグラフィーが公知となっているインプラントを、このインビトロ骨プラットフォームを用いてスクリーニングし、それらの固定能を、動物モデル／患者におけるインビボ研究から得られた結果と比較する。インビトロスクリーニングプラットフォームが利用可能となれば、従来的な大規模な（かつ高価な）前臨床モデルを用いて可能であったよりも徹底的に、新しい生体材料を開発及び分析することができるようになる。
実施例3
インプラント学の調査のための組織工学 - 生体材料試験におけるパラダイムシフト
生体材料は、組織の機能性を復元または強化することができ、現代の医療実務に必須である。歯科及び整形外科において、補綴材は、歯のない人及び骨格異常を患った患者を処置するために日常的に使用されており、世界市場は、毎年数十億ドルに相当する。これらのデバイスは、この10年間で多くの患者の生活を改善しているが、最適からはほど遠く、多くの臨床例において、例えば骨の質が乏しい人及び老齢の人において失敗している。したがって、費用効果に優れ、安全でありかつ各臨床状況下の各患者に最適である材料を開発するために多大な研究努力がなされている。残念ながら、利用可能な研究ツールには欠点があり、新しいブレイクスルー技術に照らして時代錯誤になりつつある。二次元（2D）法は、組織及び臓器の典型的な細胞構造並びに細胞運命の制御及び組織の機能に重要な細胞対細胞及び細胞対マトリクス相互作用を表現できないという点で、本質的な欠陥がある。加えて、2D法は、組織とインプラントとの間の相互作用の強さを研究する、したがって患者における新しいインプラント材料の融合能を予測する可能性を排除する。他方、動物研究は、時間及びリソースを集中させる必要のあるものであり、基本的に、組織の質、生理学及び代謝に種間差が存在するため信頼性を欠く。これらの研究はまた、不必要な苦痛を与えるものであり、代替のヒト関連方法が強く望まれている。これらの欠点を克服するために、及び利用可能な方法の間に存在するギャップを埋めるために、インプラント学、補綴学及び生体材料科学全般の研究開発に革命を起こす可能性を有する材料試験のための三次元（3D）組織プラットフォームを開発した。
組織工学アプローチを使用して、研究室内で機能的なヒト骨を成長させる。ヒト人工多能性幹細胞（iPSC）、生体模倣足場及び最先端培養システムを用いて骨組織を成長させ、インプラント材料の融合またはその失敗の原因となるメカニズムをより理解するために使用する。ヒトiPSCは、任意の患者から（例えば、小さな皮膚生検材料または血液滴を用いて）うることができ、これは単一の細胞リソースが骨組織を構成するすべての細胞型を生成することができることを表す。これにより、研究室内で患者特異的な骨を成長させることが可能となり、インプラント周囲の組織再生を促進する新しいインプラント材料または薬物により、処置に対する任意の特定の個体の生物学的応答を研究することが可能となる。ヒトiPSCを、以前に確立されたプロトコルを用いて関連細胞に分化させ、次いで個人向けの骨組織を成長させるために適合する足場材料と組み合わせる。構造及び力学的特性を調整した足場材料を使用することにより、特定の変性障害、例えば骨粗しょう症に典型的な骨環境を模倣する可能性が開き、ペトリ皿内で疾患をモデル化することが可能となる。研究室内での細胞増殖及び機能的な骨組織の形成を支援するため、休止時及び負荷条件下の天然骨環境に典型的なせん断応力値に相当する灌流計画の下で、バイオリアクターと呼ばれる最先端チャンバー内で組織を培養する。組織工学ヒト骨は、インビトロで生理学的または病理学的条件下での組織-インプラント相互作用プロセスを研究するため、並びに動物試験を必要性とせず、個人向けに製造可能であり幅広い臨床用途を示しうるより洗練されたインプラント材料及び治療法の開発を促進するための最先端ツールとして使用することができる。
簡潔に言うと、以下の事項に取り組む：1）最先端生体材料試験；2）ハイブリッド組織工学；及び3）個人向け医療。
研究の概要
この研究の全体目標は、最先端生体材料試験に組織工学ヒト骨を使用することである。このプロジェクトは、3R原理（代替、削減及び改善）に基づく動物試験の代替法の確立に寄与する。組織工学アプローチを使用して、機能的なヒト骨を研究室内で成長させる。人工多能性幹細胞（iPSC）、生体模倣足場及び最先端培養システムを用いてヒト骨を成長させ、インプラント材料の融合またはその失敗の原因となるメカニズムをより理解するためにこれを使用する。3D下での組織-インプラント相互作用プロセスに関する膨大な量の新規データ及び知見をうるのに加えて、提案される調査は、インビボ研究を必要とせず、かつ動物への不必要な苦痛を回避しつつ、個人向け処置、より洗練されたインプラント材料及び新しい治療法の開発を促進する。以下に列挙されているのは、記載される調査の期待される結果である。
1. インプラント学の調査のための組織工学
目的：生体材料試験のために組織工学ヒト骨を使用すること。ヒト骨を成長させ、インビトロで骨-インプラント相互作用プロセスを研究するための実験プラットフォームとして使用する。本発明者らは、個人向け処置及び新しいインプラント材料の開発に寄与すると考える。
2. 最先端疾患モデリングのための骨-インプラントプラットフォーム
目的：疾患を有するヒト骨のモデルを作製し、病理学的条件下で骨-インプラント相互作用プロセスを研究すること。骨粗しょう症患者で観察される典型的な特徴を示すヒト骨を成長させ、インプラントの失敗の原因を研究する。本発明者らは、地球人口の増加に伴う骨欠乏症の負担に取り組むためのより良いインプラント材料及び治療法を開発し、これは「ベビーブーム」世代の寿命及び年齢を延ばすと考える。
3. 薬物発見研究のための骨-インプラントプラットフォーム
目的：正常なまたは疾患を有するヒト骨のモデルを作製し、正常または病理学的条件下でのインプラントの融合を促進する新薬をスクリーニングすること。正常または疾患ヒト骨のモデルを（1または2のようにして）成長させ、骨-インプラント相互作用プロセスに対する異なる薬物の効果を研究する。本発明者らは、より安全かつより効果的であり、新しい及び市販のインプラントのオッセオインテグレーションの向上を促進する新薬の発見に寄与すると考える。
骨-インプラントハイブリッド移植片
目的：インプラント周囲で患者特異的な骨を成長させること。本発明者らは、インプラントを生物模倣足場（天然または合成）に連結し、次いでこれらの足場-インプラント構築物に患者特異的な細胞を播種して骨-インプラントハイブリッド移植片を成長させる。本発明者らは、複合的な顎顔面及び骨格の再建に関して高い治療能を有する製品を開発することを想定している。
背景
毎年、数百万の患者が、生体材料及び医療機器の移植を通じて生活品質を向上させている。骨格の再建のための材料は、個々の適用ごとに異なり、金属、セラミック及び複合材料を含む。好適な条件下で周囲組織と安定な結合 - オッセオインテグレーションを形成するそれらの力学的特性及び能力の良さから、金属及び合金が一般的に使用されている。この結合の質は、インプラント材料のマクロ、マイクロ及びナノスケールでの表面特性に大きく依存する。しかし、補綴インプラントの完全な融合には時間がかかり、骨の質の低さ、再生能の欠陥、及び今なお不明である他の要素によって特徴づけられる臨床状況ではしばしば失敗する。したがって、費用効果が高く、安全であり、かつ各臨床状況下の各患者に最適である材料を開発するために多大な研究努力が必要とされている。基礎的理解の確立並びに安全性及び効能の試験の両方のために、すべての新しいインプラント材料は、インビトロ及び前臨床モデルで徹底的に試験される必要がある。しかし、インビトロで毒性及び細胞適合性を試験する現在の方法は、技術的利用可能性が低く、3D下で及びヒト体内での正常または病理学的環境に類似する条件下での材料に対する複雑な組織反応に関する知見を提供できない。その結果、2D法は、組織-インプラント相互作用プロセスの完全な理解を達成するのに十分でない。他方、インビボ研究は、時間及びリソースを集中させる必要のあるものであり、通常、試料数によって偏りが生じ、組織の質及び代謝に関する種間差のために完全に信頼できるものではなく、したがって「患者内での生物力学的結果の大雑把な指標」を提供するにとどまる。動物モデルもまた、遺伝的要因の特定を妨げ、それが、リスクのある患者におけるインプラントの不十分な融合または失敗の原因となる。したがって、新しいブレイクスルー技術の観点から、利用可能な方法の間に存在するギャップの橋渡しをし、生体材料科学分野の研究開発を促進する新しい試験戦略を確立することが重要である。組織工学は、研究者がインビボ条件でその複合体に近い特徴を示す機能的組織を成長させることができるようにし、かつ組織-インプラント境界面で起こる現象に関する独自の視点を提供しうる。提案される調査は、インプラント材料に対する細胞反応、インプラントと人工組織との相互作用の強さ、及び骨-インプラント境界面の質を研究するための3Dインビトロプラットフォームとして組織工学ヒト骨を使用することを目的とする。この技術は、動物試験を必要とせず、個人向けにすることができかつ幅広い臨床用途を示しうるより洗練されたインプラント材料及び治療法の開発の前例のない可能性を広げる。
予備的結果
本発明者らは、成体組織から得られたヒト間葉系細胞及びヒト多能性幹細胞からの骨置換物の培養、生体材料足場及びインプラントの製造及び特徴づけ、並びにバイオリアクターシステムの設計及び検証に関する豊富な経験を有している。バイオリアクター内での静的または動的条件下での足場上における単層及び3D培養の研究により、本発明者らは、多能性幹細胞由来の間葉系前駆細胞が、形態、分子指標及び分化能の点で成体組織から単離された間葉系幹細胞と高度に類似することを示した。自家組織移植片を作製するため、高増殖性間葉系前駆細胞をヒト人工多能性幹細胞から得（iPSC-MP）、これらを使用して、骨発生のための生物模倣足場・灌流バイオリアクターアプローチを用いて骨移植片を成長させた（図15）。特に、ヒト人工多能性幹細胞は、基礎及び応用研究において並びに臨床において、骨組織を構成するすべての細胞型を発生させることができ、個人向け用途で生理学的に複雑な骨移植片を作製する可能性を広げることができる。
革新的な研究ツールを開発し、動物実験を減らすまたはそれと完全に置き換えるために、チタンインプラント（直径2 mm、高さ6 mm）を脱細胞化ウシ骨足場（直径8 mm、高さ3～4 mm）に固定し、このインプラント-足場構築物にヒトiPSC-MPを播種し、インプラント周囲で生きた組織を成長させた。このインプラントを足場に連結するため、足場の中心部で垂直ねじ込みを行い、次いでインプラントを手作業でまたは機械的に（2000度の回転角度で電気スクリュードライバーを用いて）のいずれかで挿入した。インプラント-足場の力学的安定性（一次安定性）を、引き抜き試験を通じて研究した（図16）。
インプラント-足場構築物上でのiPSC-MPの培養を、生／死アッセイ、硬組織学、マイクロコンピュータ断層撮影（μCT）及びエネルギー分散X線分光分析を通じて実証した。結果は、良好な細胞適合性及び3D下でのインプラント周囲における組織成長を明らかにし（図17）、これらは、そのような試験プラットフォームがインプラント、補綴及び生体材料に関する研究の実施を提供するという利点を強く示している。
プロジェクトの説明
組織工学ヒト骨は、組織-インプラント相互作用プロセスをインビトロで研究するため、インプラントの融合をもたらす機構を理解するため、並びに個人向けにすることができ、より良い臨床結果をもたらすことができる次世代材料及び治療法を開発するための（動物試験に代わる）3D実験プラットフォームとして使用される。ヒト骨は、本発明者らによって以前に確立された工学的戦略を用いてインビトロで人工多能性幹細胞及び生物模倣足場から成長させる。
形成する組織とインプラント材料との相互作用を、分子生物学、生化学アッセイ、組織学的調査、医用画像化法、高解像度特徴づけ技術及び生物力学試験の組み合わせを用いて評価する。
1. インプラント学調査のための組織工学
インプラント材料を試験するために、組織工学ヒト骨を使用する。市販のインプラント材料、例えばチタン及びステンレス鋼を試験し、その結果を、動物及び臨床試験からの以前に公開されているデータと比較する。これは、インビボ研究についてのこの試験プラットフォームの予測値に関する知見を提供する。形状測定、電子顕微鏡法及びX線光電子分光分析（XPS）を通じて、化学的及び形状的特徴を研究するためにインプラントを特徴づける。以前に報告されているようにして、ウシの中手骨関節の軟骨下部領域から骨梁のプラグ（直径8 mm）をドリルにより切り出す（de Peppo et al., Proc Natl Acad Sci USA, 21; 110 (21): 8680-5 (2013)）。脱細胞化後、足場を3～4 mmの最終厚さになるよう切断する。各足場の密度を計算し、図16に示されるようにインプラントと連結する。この足場-インプラント構築物をCT走査し、足場の特徴（密度、空隙率、接触面積等）と細胞なしでのインプラントの力学的安定性（一次安定性）との間の関係を研究する。足場-インプラント構築物を細胞と共に培養した後に達成される相互作用の強さ（二次安定性）を測定したときに見出だされるあらゆる効果を考慮する。滅菌後、足場-インプラント構築物に（NYSCFの確立されたプロトコル及び／またはNIH登録株を用いて得られる）ヒトiPSC-MPを播種し、その試料を、機能的組織が成熟するまで骨形成条件下で培養する。最適化研究を行い、試験プラットフォームの質に対する足場の起源、細胞密度並びに培養時間及び条件の影響を評価する。本発明者らは、細胞動員、毒性、増殖、分化及び遺伝的安定性、並びに新たに形成される組織の境界面における内容及び質を研究する。本発明者らは、PrestoBlue（商標）アッセイを用いて細胞増殖を毎週概算する。本発明者らは、ELISAを通じて骨特異的タンパク質の放出を、及び乳酸デヒドロゲナーゼの量の測定を通じて細胞傷害性を研究するため、培養培地を各交換時に回収する。本発明者らは、リアルタイムPCR、Nanostring（商標）、ウェスタンブロット及び酵素アッセイを通じて骨特異的因子の発現及び産生／活性を研究することによって骨形成分化を研究する。本発明者らは、染色体分析を通じて抽出された細胞の遺伝毒性を研究する。本発明者らは、マイクロCT（μCT）分析、硬及び軟組織学並びに免疫組織化学を通じて、骨-インプラント境界面に関する大きな関心事である組織形成及び石灰化を研究する。本発明者らは、組織-インプラントシステムの生体力学特性、例えば引き抜き強さ及び除去トルクを研究する。これを有意義にするために、試験を、インプラントのサイズ及び挿入力（トルク）に関して標準化し評価する。重要なこととして、本発明者らは、境界面で形成されるマトリクスの量及び質と組織-インプラント相互作用の強さとの間の関連性に注目する。引き抜き後、本発明者らは、インプラント表面と付着しているマトリクスの質との間のあらゆる関連性を調査するため、SEM、XPS及び飛行時間型二次イオン質量分析（Tof-SIMS）を通じてインプラントを再度特徴づける。この一連の研究は、組織-インプラント相互作用プロセスに関する新しい知見を提供するのに加えて、インビボ研究に関する試験プラットフォームの予測値を明らかにする。予測的であるならば、これらの研究は、市場で入手可能なインプラントをプレスクリーニングし、患者をより良い処置選択肢の方に導く可能性を広げる。
合成足場：高い費用及び長い処理時間を含む生物学的足場に伴う不利益を避けるために、本発明者らは、調整可能な形状、空隙率及び力学的特性を有する骨セメント足場を製造する従来的な及び／または追加の製造技術を使用する。最初に、本発明者らは、定義された化学的及び構造的特徴を有するブルシャイト及びアパタイトベースの足場を製造する溶解相アプローチを使用し、それらを図16に示されるようにインプラント材料と連結する。あるいは、本発明者らは、足場とインプラントとの間の良好な一次力学的安定性を達成するために、硬化反応前にインプラントをセメントペースト中に入れる。本発明者らは、直径方向の引張り及び圧縮強さ、X線回折及びXPSを通じた化学、並びに走査電子顕微鏡法及びμCTを通じた構造的特徴に関して足場を特徴づける。次いで、本発明者らは、細胞を播種して組織を成長させ、このプラットフォームを用いて組織-インプラント相互作用を研究する上での合成材料の適性を評価する。足場の構造（例えば、空隙率、孔サイズ及び孔分布）を制御することによって、本発明者らは、個々の病理学的状態に典型的な天然骨組織の微小環境を模倣し、ペトリ皿内で疾患モデルを構築することができる。
バイオリアクター内での培養：動的条件下での培養は、組織の再生及び石灰化を促進することが公知である。試験プラットフォームの妥当性を向上させるため、本発明者らは、以前に記載されたように直接灌流バイオリアクター内で試料を培養し、新たに形成される組織の量及び質に対する動的条件の影響を調査する。必要な場合、本発明者らは、バイオリアクター設計を最適化し、より高い生理学的妥当性の応力、すなわち休止時または負荷条件下の天然骨環境に典型的なせん断応力値に相当する灌流計画を見出すために、Comsol Multiphysicsにおいてシミュレーション研究を行う。ここでも、本発明者らは、1）のように、細胞の動員、生存率、増殖及び分化、並びに形成される組織の内容及び量、新たに形成される組織とインプラントとの相互作用の強さ、並びに骨-インプラント境界面の質を研究する。
他の細胞型：医療機器を骨の空洞または欠陥部に移植する際、骨-インプラント境界面で、炎症、再生及び再形成が重なる一連の分子及び細胞現象が発生する。しかし、その基本メカニズムは今なお明らかでなく、現在の研究ツールを用いて解明することは困難である。本発明者らは、これらの疑問に答え、3D環境下での材料に対する異なる細胞型の生物学的反応をより理解するためにこの試験プラットフォームを使用する。本発明者らはまた、治癒プロセスの間の各細胞型の寄与並びに血小板、炎症細胞、骨形成細胞及び破骨細胞間に存在する分子的及び生物学的関係を研究する。本発明者らは、医療機器の移植後に体内で起こる良い事及び悪い事を理解するために、細胞を同時にまたは連続して播種する共培養システムを構築する。融合をもたらす一連の現象を理解することは、再生プロセスを制御することができるインプラント表面の設計を手助けする。
新しいインプラント及び生体材料の開発：インプラントの化学、トポグラフィー及び設計はすべて、インビボで組織-インプラント境界面において起こる分子及び細胞現象に影響し、より高い治療能を有するインプラントを開発するために調査が行われている。本発明者らは、本明細書に記載される試験プラットフォームを使用して、新しいインプラントを開発する。本発明者らは、それらの組織適合性及び融合能を改善するよう、インプラントの化学及びトポグラフィーを調整し、設計を変更する。本発明者らは、医療等級のチタンインプラントから出発する。本発明者らは、異なる技術を用いて異なるスケールでインプラントを改良し、改善された治癒をもたらすより良い表面特性を有するインプラントを漸進的にスクリーニングする。特に、本発明者らは最近、インプラント材料のナノパターン形成が、2Dシステムにおける細胞反応を誘導することができることを実証し、現在は、コロイダルリソグラフィーを使用してインプラントの表面を（化学及びトポグラフィーの両面で）改良し、これらの改良が3D下で組織-インプラント相互作用にどのように影響するかを研究している。異なるタイプの生体材料の組織適合性を試験するために、この試験プラットフォームの対応版を調査する。本発明者らは、選択された特性を有する材料のプラグを収容できるドーナツ様骨移植片を作製し、以前に到達できなかった条件下で生体適合性、骨誘導性及び骨伝導性を試験する。そのようなシステムは、より安価で、より安全で、より効果的な生物医学材料の開発のために生体材料調査を行う方法を根本的に変化させることができる。
2. 進行疾患モデリングのための骨-インプラントプラットフォーム
整形外科用インプラントのオッセオインテグレーションは、骨構造及び質の劣化が原因で高齢患者において限定的であり、世界規模の高齢化により課される課題に対処する新しい解決策が必要とされている。この提案で示される技術により、本発明者らは、骨粗しょう症患者における骨微小環境の重要な局面を再現することが可能となり、高齢者における移植の失敗の原因を明らかにするのを補助することができる。本発明者らは、骨粗しょう症の骨の構造を模倣する生体材料足場（天然または合成）を作製し、次いで高齢患者において典型的な状態を模倣するようそれらをインプラント材料に連結させる。高齢患者で観察される乏しい骨再生特性をシミュレートするため、本発明者らは、増殖条件下での長期間インビトロ培養から得られる老化iPSC-MPを使用する。本発明者らは、病理学的条件下での組織-インプラント相互作用の生物学及び生体力学を研究するために、これらの加齢骨モデルを使用する。これらのモデルにより、世界規模で増加する患者のためのより良いインプラント材料及び治療法の設計が可能となる。
3. 薬物送達調査のための骨-インプラントプラットフォーム
新しい候補薬は、安全性及び効能を評価するため、最初にインビトロで、次に動物で試験される。このプロセスは、多額の投資を伴い、長期間を要し、しばしば利用可能な研究ツールの不足により失敗する。薬物毒性学（pharmacotoxicology）の分野において、従来的な方法に代わるより優れた方法の開発及び検証が大いに求められている。本発明者らは、インプラント材料を固定する正常なまたは疾患を有するヒト骨のモデルを成長させ、骨-インプラント相互作用プロセスに対する様々な薬物の効果を研究する。より成功の可能性が高い薬物発見のために既存の方法の間のギャップを埋める架け橋となりうることに加えて、このプラットフォームは、インビトロでの正確な薬力学及び薬物動態研究に関して新しい展望を広げる。本発明者らは、選択された灌流計画の下でバイオリアクターシステム内で試料を培養することによって薬物クリアランスに対する循環の影響をシミュレートすることを試みる。ペトリ皿において3Dで疾患の骨-インプラントモデルを構築する能力は、この分野に革命を起こし、より短い期間内での良い治療薬の発見を促進しうる。
4. 骨-インプラントハイブリッド移植片
頭蓋骨と歯との間の境界面における大きな顎顔面欠陥の再建は、多くの場合、複数回の手術並びに長い治癒及びリハビリ時間を必要とする。現在の処置は、不完全であり、それら自身がさらなる合併症をもたらしうる。これらの患者により良い処置選択肢を提供するため、本発明者らは、インプラント材料の周囲で解剖学的形状の患者特異的な骨組織を成長させる。本発明者らは、歯科用インプラント（または他の補綴）を生物模倣足場（天然または合成）に連結し、その後にこの足場-インプラント構築物に患者特異的な細胞を播種し、研究室内でカスタマイズされた骨-インプラント移植片を成長させる。人工組織のサイズを大きくする目的で、本発明者らは最近、国際特許出願PCT/US2014/72579に記載される分節付加組織工学（segmental additive tissue engineering；SATE）と呼ばれる代替の工学戦略を提案及び開発した。
意義
骨格再建に対する要望は日々強まっており、新しいインプラントシステムの開発は産業界、学術界及び研究機関で常に行われている。基礎的理解の確立並びに安全性及び効能試験の両方のために、すべての新しいインプラント材料は、インビトロで及び前臨床モデルで試験される必要がある。しかし、これらの方法は、大きな欠点があり、多額の費用と共に数年に及ぶ期間を必要としうる。組織工学は、生体材料科学に新しい研究可能性を提供し、本発明者らが医療機器と我々の身体との複雑な相互作用を研究及び理解する方法に関する新しい視点を提供する。この報告に記載される試験プラットフォームは、用途の広い研究ツールであり、任意で、インプラント材料の融合、またはその失敗の原因となる様々なメカニズムにさらに光をあてるよう改良することができる。この新しい技術は、動物試験を必要としないより発展した処置の開発を促進すると考えられる。
本発明は、上記実施例を参照して記載されているが、その改良物及び派生物も本発明の意図及び範囲に包含されることが理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (33)

  1. a）インプラント材料；及び
    b）足場を有する人工骨組織移植片
    を含む、骨-インプラントハイブリッド移植片であって、
    前記移植片が人工多能性幹細胞由来の間葉系前駆細胞を含み、前記間葉系前駆細胞が足場上に播種され、インプラント材料への該細胞の接着を促進するよう培養された、前記移植片。
  2. a）1つまたは複数の組織形成細胞集団であって、該組織形成細胞集団の少なくとも1つが人工多能性幹細胞由来の間葉系前駆細胞を含む、組織形成細胞集団；
    b）1つまたは複数の足場；及び
    c）インプラント材料
    を含む、骨-インプラントハイブリッド移植片を作製するためのキット。
  3. インプラント材料がチタンまたは鋼鉄を含む、請求項1記載の移植片または請求項2記載のキット。
  4. 組織移植片が、間葉系前駆細胞および内皮前駆細胞を含む、請求項1記載の移植片。
  5. 足場が、（i）0.3ミリメートル～10ミリメートル；または（ii）1センチメートル未満の厚さを有する、請求項1記載の移植片または請求項2記載のキット。
  6. 足場が脱細胞化骨組織から本質的になる、請求項1記載の移植片または請求項2記載のキット。
  7. 骨組織が（i）ウシ骨組織または（ii）ヒト骨組織である、請求項6記載の移植片またはキット。
  8. 足場が1つまたは複数の合成材料を含み；任意で合成材料が、セラミック、セメント、ポリマー複合材料またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項1記載の移植片または請求項2記載のキット。
  9. 足場が機能化されている、請求項1記載の移植片または請求項2記載のキット。
  10. 足場が、インプラント材料に適応した1つまたは複数の開口部を含む、請求項1記載の移植片または請求項2記載のキット。
  11. 培養が静的条件下で行われる、請求項1記載の移植片。
  12. 培養が動的条件下で行われる、請求項1記載の移植片。
  13. 培養が、（i）2、3、4、5、6、7、8、9または10週間行われる；または（ii）10週間より長く行われる、請求項1記載の移植片。
  14. 培養が培養容器中で行われる、請求項1記載の移植片。
  15. 培養容器が、バイオリアクター、スピナーフラスコ、回転式容器、灌流もしくは加圧システムまたはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項14記載の移植片。
  16. 組織移植片が骨移植片である、請求項1記載の移植片。
  17. 組織移植片が血管形成される、請求項1記載の移植片。
  18. 組織移植片が2つまたはそれ以上の細胞型を含む、請求項1記載の移植片。
  19. 足場が、カスタマイズされた形状及び／またはサイズを有する、請求項1記載の移植片。
  20. 足場に播種された細胞が、インプラント材料の周囲での新しい組織の形成を促進する、請求項1記載の移植片。
  21. インプラント材料に対する組織の分子的及び／または生物学的反応を決定するために分析された請求項1記載の移植片であって、
    任意で、前記分析が、以下：
    a）インプラント材料と組織移植片との融合；
    b）組織移植片の量及び／もしくは質；
    c）インプラント材料と組織移植片との相互作用；
    d）インプラント材料への及び／もしくはインプラント材料上での及び／もしくはインプラント材料の周囲での細胞の遊走；
    e）細胞接着、細胞形態、細胞生存率及び／もしくは細胞増殖；
    f）組織移植片における遺伝子及び／もしくはタンパク質の発現及び／もしくは放出；
    g）インプラント材料と組織移植片との相互作用の強さ；または
    h）インプラント材料の生物力学
    の1つまたは複数を決定することを含む、
    前記移植片。
  22. 分析が、コンピュータ断層撮影（CT）法、マイクロトモグラフィー（マイクロCT）法、顕微鏡法、電子顕微鏡法、走査電子顕微鏡法、免疫組織化学法、組織学法またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項21記載の移植片。
  23. 各組織形成細胞集団が足場に事前適用されている、請求項2記載のキット。
  24. 1つまたは複数の組織形成細胞集団が、内皮前駆細胞を含む、請求項2記載のキット。
  25. 組織移植片を形成するために足場上で1つまたは複数の組織形成細胞集団を培養する段階を含む、骨-インプラントハイブリッド移植片を製造する方法であって、
    少なくとも1つの該組織形成細胞集団が、人工多能性幹細胞由来の間葉系前駆細胞を含み、
    組織移植片が、インプラント材料への組織形成細胞の接着を促進するようインプラント材料と共に培養される、
    方法。
  26. 組織移植片が骨移植片である、請求項25記載の方法。
  27. 組織移植片が軟骨移植片である、請求項25記載の方法。
  28. 組織移植片が血管形成される、請求項25記載の方法。
  29. 組織移植片が、（i）1センチメートルまたはそれ未満；あるいは（ii）0.3ミリメートル～10ミリメートルの厚さを有する、請求項25記載の方法。
  30. 足場が、コンピュータ支援製造、3次元印刷、注型、フライス加工、レーザ切断、ラピッドプロトタイピングまたはこれらの任意の組み合わせを用いて生成される、請求項25記載の方法。
  31. 1つまたは複数の細胞集団が人工多能性幹細胞由来である、請求項25記載の方法。
  32. 組織形成細胞が、（ii）血管形成細胞及び／または血管形成細胞に分化することができる細胞；または（iii）内皮前駆細胞を含む、請求項25記載の方法。
  33. インプラント材料に組織移植片を結合させる段階を含み、任意で、（iii）インプラント材料と組織移植片とが、ねじ込み結合される；（iv）インプラント材料と組織移植片とが、手作業により結合されるまたは機械化されたツールを介して結合される；あるいは（v）組織移植片に穴をあけ、その穴にインプラント材料を挿入することによって、インプラント材料と組織移植片とが結合される、請求項25～32のいずれか一項記載の骨-インプラントハイブリッド移植片を形成する方法。
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