TWI450735B - 修補軟骨組織之組合物及其製備方法 - Google Patents

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Description

修補軟骨組織之組合物及其製備方法
本發明係關於一種修補軟骨組織之組合物及其製備方法，特別關於一種利用內皮先驅細胞以修補軟骨組織之組合物及其製備方法。
軟骨組織位於骨骼和骨骼的關節交接面，是一層厚約1至2毫米的白色透明組織，主要功能在於傳遞骨組織上下硬骨的應力、吸收硬骨層對關節面的衝擊力、降低關節面之間的摩擦力，以及配合肌肉韌帶組織使關節活動產生不同方向的滑動及滾動等運動模式，因此，軟骨組織能夠保護關節內的骨組織，並且減緩骨頭承受外在力量時的磨損。
然而，軟骨組織是一種無血管、淋巴系統以及神經的結締組織，主要為透明軟骨(Hyaline Cartilage)、第二型膠原蛋白(type II collagen)、醣蛋白(proteoglycans)組成。一旦軟骨組織受損，由於鄰近軟骨細胞的數目係非常有限，不足以修復損傷，更何況還有受限於細胞外基質的包覆，難以遷移到受傷的部位的問題。
目前已知的是，當受傷程度到達軟骨下層硬骨(subchondral bone)時，會引發修復的反應，但是所生成的新組織大多為纖維性軟骨(fibrocartilage)組織，其主要是為第一型膠原蛋白(type I collagen)。由於纖維性軟 骨組織缺乏與軟骨應有的生物力學特性且又無透明軟骨的功能，因此會逐漸降解(degradation)，難以使骨骼恢復到傷害前的正常運動狀態。
目前用於軟骨組織修復的方法依軟骨組織受損的程度差異而有不同，針對輕症者通常使用物理治療、口服藥物或類固醇即可減輕關節疼痛及腫脹。
然而，對於軟骨組織已有磨損或剝落之患者，通常必須透過注射玻尿酸(Hyaluronic Acid)以及鑽孔手術(Drilling)等方式進行治療。而對於關節嚴重磨損的患者，只能採取手術方法來改善，甚至是直接進行人工關節置換術(Arthroplasty)。然而，金屬關節的壽命有限，往往需要再進行另一次手術。
而近年來，利用組織工程進行軟骨組織修復的發展相當快速，包括骨軟骨組織移植(Osteochondral grafting)或是軟骨細胞植入(Chondrocyte Implantation)。然而，兩種療法都須先透過侵入性的方式拿取其他部位的軟骨組織並再施以手術將組織或細胞植入患部，在拿取過程中，已造成新的軟骨傷害與受損。其中，軟骨細胞移植療程中患者必須經歷至少二次手術的疼痛。更甚者，還會造成細胞來源處的缺陷及退化，或者軟骨細胞的分布不均勻等問題。加上於療程中，體外培養細胞需耗時三至四週，因此患者需要經歷長時間的等候及煎熬。更重要的是，來源細胞經培養後大多係生成纖維性軟骨細胞，其主要成份為第一型膠原蛋白，而非關節軟骨所需含有第二型膠原蛋白的 透明軟骨，所能提供的修補效果有限。
因此，如何提供一種侵入性較低，且製備時間短之組合物製備方法，以提供能在組織修補療程中，形成較高比例之透明軟骨組織的組合物，從而改良利用組織工程修補軟骨組織的功效及應用範圍，已成為重要課題之一。
有鑑於上述課題，本發明之目的為提供一種侵入性較低，且製備時間短之組合物及其製備方法，以提供能在組織修補療程中，形成較高比例之透明軟骨組織的組合物，從而改良利用組織工程修補軟骨組織的功效及應用範圍。
為達上述目的，依據本發明之一種修補軟骨組織之組合物包含一支架以及複數內皮先驅細胞。內皮先驅細胞附著於支架。
在一實施例中，支架之材料係為生物相容性物質。
在一實施例中，支架之材料包括聚己內酯、聚乳酸、聚甘醇酸、聚乳酸-甘醇酸共聚物、聚對二氧環已酮、聚酐、聚二酯、聚正酯、膠原蛋白、明膠、透明質酸、幾丁質或聚乙二醇。
在一實施例中，支架係為多孔隙支架。
在一實施例中，內皮先驅細胞係源自於待修補軟骨組織之一個體的血液。
在一實施例中，組合物係為植入使用之組合物。
在一實施例中，組合物係植入於一個體之軟骨組織與 其周圍之骨組織的鄰接處。
在一實施例中，內皮先驅細胞係誘發一個體之軟骨組織與其周圍之骨組織生長以進行修補。
為達上述目的，本發明另提供一種修補軟骨組織之組合物的製備方法，包括以下步驟：提供一支架；植入複數內皮先驅細胞於支架以及於支架上培養內皮先驅細胞。
在一實施例中，支架之材料係為生物相容性物質。
在一實施例中，支架之材料包括聚己內酯、聚乳酸、聚甘醇酸、聚乳酸-甘醇酸共聚物、聚對二氧環已酮、聚酐、聚二酯、聚正酯、膠原蛋白、明膠、透明質酸、幾丁質或聚乙二醇。
在一實施例中，支架係為多孔隙支架。
在一實施例中，內皮先驅細胞係源自於待修補軟骨組織之一個體的血液。
在一實施例中，組合物係為植入使用之組合物。
在一實施例中，組合物係植入於一個體之軟骨組織與其周圍之骨組織的鄰接處。
在一實施例中，內皮先驅細胞係誘發一個體之軟骨組織與其周圍之骨組織生長以進行修補。
在一實施例中，內皮先驅細胞於植入支架前係體外培養不超過一週。
在一實施例中，內皮先驅細胞於支架上培養不超過一天。
在本發明中所稱之「修補」一詞意指透過物質或手 段，達到恢復、維持、或改善生物組織之功能的動作。較佳地，修補係指恢復、維持、或改善已受損之生物組織之功能的動作。
承上所述，本發明所提供之一種修補軟骨組織之組合物及其製備方法，係由內皮先驅細胞與細胞支架材料結合而成，由於透過抽血等簡易程序即可取得內皮先驅細胞，故能改善過去為取骨髓幹細胞而必須進行的侵入式開刀或抽髓所造成的負擔。此外，利用內皮先驅細胞製成的組合物更具有培養時間短以及所需細胞數量少等優點，可以縮短軟骨修補的療程。
更佳的是，本發明之內皮先驅細胞與生物支架結合之組合物及其製備方法更有以下應用上的優勢。其一，內皮先驅細胞可取自患者本身，故能避免異體，甚至異種移植可能產生的免疫排斥或是感染的問題。其二，組合物能夠誘發軟骨組織與其周圍之骨組織生長以進行修補，並高度生成透明軟骨組織，較有助提升修補效果，以及恢復患者關節完全的關節功能。在實際應用中，與習知技術相較，本發明所提供之組合物及其製備方法具有減少手術次數，縮短療程，卻可達到快速且有效修補軟骨組織之功效。
以下將參照相關圖式，說明依本發明較佳實施例之一種修補軟骨組織之組合物及其製備方法，其中相同的元件將以相同的參照符號加以說明。
圖1A為依據本發明一實施例之組合物的外觀示意圖，圖1B為依據本發明一實施例之組合物的照片圖，其中，圖1A係為方便本發明描述所繪製，實際之組合物外觀如圖1B所示。請參考圖1A及1B所示，本發明所提供之一種修補軟骨組織的組合物1包括一支架11及複數內皮先驅細胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)12。其中，內皮先驅細胞12附著於支架11。本實施例中，軟骨組織修復係為透過組合物1的植入，從而以恢復或改善軟骨組織受損處的狀況為前提，在受損處發生軟骨細胞新生，或軟骨細胞對受損處進行填補。以下將先針對組合物1說明之。
在本實施例中，組合物1係供植入使用，當然，其他可使組合物1達到鄰近軟骨組織待修補處之方式亦可使用，本發明於此不限。當組合物1植入一個體時，其較佳係植入於待修補之軟骨組織鄰近處，且位於軟骨組織與其周圍之骨組織的鄰接處。在此所謂之「個體」較佳係為一生物體，其主要包括哺乳類動物，如老鼠、人類、兔、牛、羊、豬、猴、狗、貓等，較佳係為人類。而軟骨組織較佳可以為人類關節軟骨組織。
其中，支架11之材料可為生物可分解性物質、生物可吸收性物質或生物可相容性物質，或兼具以上三種性質之任意組合之物質。其具體包括聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚乳酸(polylactic acid,PLA)、聚甘醇酸(polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸-甘醇酸共聚物 (poly(lactic-co-glycolic)acid,PLGA)、聚對二氧環已酮(poly(p-dioxanone))、聚酐(polyanhydride)、聚二酯(polyethylene terephthalate,PET)、聚正酯(polyorthoester,POE)、膠原蛋白(collagen)、明膠(gelatin)、透明質酸(hyaluronic acid)、幾丁質(chitosan)或聚乙二醇(poly(ethylene glycol),PEG)，然本發明在此不限。在本實施例中，支架11之材料實質上係為聚乳酸-甘醇酸共聚物。
當中，聚乳酸-甘醇酸共聚物係由聚乳酸及甘醇酸依不同比例聚合而成。實用上，聚乳酸及甘醇酸之混合比例的範圍可由約1：1至約9：1，具體如50：50、60：40、65：35、70：30、75：25、80：20、85：15、90：10。其中，聚乳酸的含量越高的共聚物，其降解速度則越慢，例如組合物1之聚乳酸及甘醇酸之混合比例係為85：15，依照此比例所形成之支架11，係可供組合物1達到較佳之軟骨組織修補功效。
另外，支架11亦可以塗佈、披覆或以其他有利於細胞生長的物質修飾，其包括生長因子或天然物質，本發明於此亦不限制。支架11較佳為多孔隙支架，同樣有利於細胞附著與生長。
內皮先驅細胞12係取自於待修補軟骨組織之一個體的血液，其較佳係經由抽取該個體之血液，並透過數次離心取得純化之內皮先驅細胞12。
根據上述的材料以及比例條件備好支架11。其中，支 架11的製備方法係為本發明所技術領域中具有通常知識者所能理解者，於此不再贅述。其後，先將取自於個體之全血血液加入HBSS(Hank's緩衝食鹽溶液，Hank's Balanced Salt Solution)，並透過例如Ficoll-Hypaque進行離心。取分層後的單核細胞部分，並再經反覆離心，將剩餘細胞培養於塗佈有纖維連接蛋白(fibronectin)的培養盤上可得內皮先驅細胞12。
接著，將含有內皮先驅細胞12的溶液注射在支架11上，並將兩者共同置於容器中進行靜置培養，便可以形成本發明之組合物1。詳言之，由於支架11係為一多孔隙支架，內皮先驅細胞12可以任意分佈的方式附著於支架11表面上，或附著於支架11的孔隙結構中，或兩種之組合，本發明在此不限。
承上述，內皮先驅細胞12植入支架11上後，僅需相當短的時間即可完成組合物1的製備，相較於習知技術從細胞植入到組合物製備完成動輒需要超過一個月以上的時間，本發明具有立即使用，縮短治療時間的優勢。其是因組合物1較佳是在個體內軟骨組織與其周圍之骨組織的鄰接處，誘導軟骨組織與其周圍之骨組織生長或移動，以完成修補，而非體外培養去生成一團組織細胞，直接填補軟骨組織之缺損。是故，本發明之內皮先驅細胞12在支架11上的培養時間短，只要能達到穩定附著的效果即可。實際應用上，培養的時間可以為一天、兩天、一週或兩週，較佳是不超過一天。基於相同原因，支架11所選用之材 料無須經過表面之改質即可供使用，當然，在更佳的實施例中，支架11可以藉由表面改質的方法，進一步縮短內皮先驅細胞12附著所需的時間，本發明於此不限。
透過上述之方法形成本發明之組合物1後，接著，即根據待修補之軟骨組織位置進行植入的動作。詳細而言，於本實施例中，組合物1係植入於軟骨組織與其周圍之骨組織的鄰接處，更佳地，組合物1係植入受損之透明軟骨(Hyaline Cartilage)組織與其下層硬骨組織的交界處，或稱受損之骨軟骨處。另外，此處所指之「受損」係為軟骨組織之磨損、軟化、破碎或消失，導致軟骨組織不全甚至是剝落的情形產生。另外，此處所指之「植入」係透過開創性傷口，於個體之體表面進行開口之動作，並將組合物1送入預設之處。植入方式有助醫護人員更精確地將組合物1設置於正確之位置，以提升修補之效果。然本發明於此不限，於其他實施例中，亦可透過注射方式置入組合物1於個體內，其具有可節省時間、並減輕患者疼痛的優點。
將組合物1植入待修補處後，透過附著於支架11上，內皮先驅細胞12可停留於植入位置而不會有流動甚至離開該位置的問題。進一步而言，內皮先驅細胞12係透過誘發個體之軟骨組織與其周圍之骨組織生長以進行修補。亦即，透過內皮先驅細胞12的植入，可促使軟骨組織及/或骨組織增殖、生長與分化，從而產生新生之透明軟骨細胞，並覆蓋及/或填補受損之部位。
在本實施例中，內皮先驅細胞12係由抽血之方式並 加以純化而取得，在細胞來源的取得上並無侵入生物體之動作，因此個體僅需經歷將組合物1「植入」之一次性手術，故可免除透過手術或抽取骨髓等侵入性方式取得細胞，進一步降低患者的疼痛以及手術過程中可能產生之風險。
本發明亦提供如上述組合物的製備方法。圖2為依據本發明一實施例之用於修補軟骨組織之組合物的製備方法的步驟流程圖。請參考圖2所示，在本實施例中，用於修補軟骨組織之組合物的製備方法包括以下步驟：提供一支架(S21)；植入複數內皮先驅細胞於支架(S23)；以及於支架上培養內皮先驅細胞(S25)。惟上述步驟的技術內容與實施細節均已揭露於上，並同時還可參考下述實驗例，於此不再贅述。另外，支架之製備方式及內皮先驅細胞純化方式可參考一般細胞支架製備與全血血液單核細胞分離的作業方法，其係為本發明所屬技術領域具有通常知識者所能理解者，於此亦不再贅述。
特別須說明的是，上述之製備方法中，內皮先驅細胞於植入支架前係體外培養一天、兩天、一週或兩週，較佳是不超過一週，亦即，自生物體內抽血後取得之內皮先驅細胞，僅需短時間的純化及培養，即可進行貼附於支架，其乃是因為本發明中使用的內皮先驅細胞較佳係作為誘發個體內的軟骨組織及/或其周圍骨組織生長，從而完成修補，故細胞用量不多，有效縮短組合物的製備時間。
另外，同前所述，於本實施例中，內皮先驅細胞於支 架上培養不超過一天即可完成貼附。整體而言，自抽血取得細胞來源後七天內即可完成組合物的製備方法，並將本發明之組合物植入待修補部位，具有節省人力、物力、及治療時間之優勢，並可加速修補之進行。
接下來將以實驗例代表說明本發明之組合物之製備過程，以及將組合物植入至活體組織的實際操作方式及效果。然需注意的是，以下之說明是用來詳述本發明以使此熟習該項技術者能夠據以實現，但並非用以限定本發明之範圍。
實驗例1 內皮先驅細胞與支架之結合
以濃度為10%之Trypsin將內皮先驅細胞培養在培養皿中。另外，將製備好之聚乳酸-甘醇酸支架浸潤於濃度75%的酒精中以將其消毒。以PBS清洗五次，再將聚乳酸-甘醇酸支架放入24孔微孔盤中備用。利用濃度為10%之胰蛋白酶(Trypsin)收集先前培養的內皮先驅細胞，並進行計數，調整細胞濃度至5 x 105 cells/mL以供植入使用。接著利用注射器將100 μL的細胞溶液注入含有支架之微孔盤內，並確認細胞溶液已完全覆蓋支架中後，放置於37℃的環境下生長4小時。再於37℃的環境下加入1.5 mL的培養液，並靜置培養24小時後即以電子顯微鏡在明視野下進行觀察及拍照，結果如圖3所示。
其中，圖3係為將內皮先驅細胞貼附於聚乳酸-甘醇酸支架之實驗結果圖。請參考圖3所示，箭頭所指處係為以 貼附至聚乳酸-甘醇酸支架上的內皮先驅細胞。由本實驗例可知，內皮先驅細胞係可與聚乳酸-甘醇酸支架結合形成本發明之組合物。
實驗例2 組合物修補軟骨組織之效果
將四至五個月大之紐西蘭白色公兔(每隻重約2至3公斤，提供自國立成功大學實驗動物中心)於正式進行手術前先進行麻醉，於麻醉的過程中，將兔子的雙腿利用濃度1%的清潔液ethanol-iodine進行刮刷及消毒等動作。接下來再於內側髕骨上進行縱向及關節囊手術，以將膝關節暴露出來。於骨軟骨處以電鑽形成一直徑3 mm、深度3 mm之全厚度(full-thickness)缺陷，該位置係為一內側股骨髁(medial femoral condyle)之負重區域。
以無菌之生理食鹽水沖洗該露出區域。接下來，移除該缺陷處之碎片後，將兔子隨機分成三組，分別為無植入對照組(empty-defect，代號為ED)、植入對照組(PLGA-implanted，代號為PI)以及組合物植入組(EPC-PLGA)三組。ED組係在缺陷形成後，直接將傷口封起，並無植入任何材料；PI組係在缺陷形成後，將PLGA支架(無細胞附著)透過壓接的方式(press-fit fixation)置入缺陷處，再將傷口封起；而EPC-PLGA組則是在缺陷形成後，將EPC-PLGA組合物透過壓接的方式植入缺陷處，再將傷口封起。
手術後，所有實驗兔子係飼養於不鏽鋼籠內，並連續 給予抗生素(Enrofloxacin，劑量為25 mg/kg)及止痛藥(Ketoprofene)三日，而於膝蓋手術處則以普威隆碘(pocidone-iodine)塗敷七日。個組之兔子分別觀察其手術後之體重、食慾、傷口癒合狀況以及活動能力是否正常。於第四週及第十二週進行安樂死並觀察其缺陷處之變化，結果如圖4~6所示。
其中，圖4係為軟骨組織利用本發明之方法修補後之外觀圖，圖5係為利用顯微電腦斷層掃描(microCT)觀察骨組織利用本發明之方法修補後之結果圖。請同時參考圖4及圖5所示，上排及下排分別為第四週及第十二週之結果，由左至右依序為：無植入對照組(ED)、植入對照組(PI)以及組合物植入組(EPC-PLGA)。如圖所示，比較第四週三組的結果，證實利用本發明之內皮先驅細胞與聚乳酸-甘醇酸支架結合形成之組合物對軟骨組織之修補效果係較無植入對照組(ED)與植入對照組(PI)為佳，軟骨組織的缺陷處係有顯著之修補效果。而由第十二週之結果可更進一步看出組合物修補之效果。
其中，圖6係為經修補後軟骨組織之軟骨組織具有之第二型膠原蛋白之免疫組織化學染色結果。請參考圖6所示，左右二圖係分別為第四週及第十二週之結果，如圖所示，可看出經修補後之第二型膠原蛋白之狀況係如本發明之預期，且第十二週之結果較第四週之結果更為顯著。
由本實驗例可知，利用本發明方法，可有效的修補缺損之軟骨組織，並且隨著修補之天數增加，其效果更為顯 著。
綜上所述，本發明所提供之一種修補軟骨組織之組合物及其製備方法，係由內皮先驅細胞與細胞支架材料結合而成，由於透過抽血等簡易程序即可取得內皮先驅細胞，故能改善過去為取骨髓幹細胞而必須進行的侵入式開刀或抽髓所造成的負擔。此外，利用內皮先驅細胞製成的組合物更具有培養時間短以及所需細胞數量少等優點，可以縮短軟骨修補的療程。
更佳的是，本發明之內皮先驅細胞與生物支架結合之組合物及其製備方法更有以下應用上的優勢。其一，內皮先驅細胞可取自患者本身，故能避免異體，甚至異種移植可能產生的免疫排斥或是感染的問題。其二，組合物能夠誘發軟骨組織與其周圍之骨組織生長以進行修補，並高度生成透明軟骨組織，較有助提升修補效果，以及恢復患者關節完全的關節功能。在實際應用中，與習知技術相較，本發明所提供之組合物及其製備方法具有減少手術次數，縮短療程，卻可達到快速且有效修補軟骨組織之功效。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
1‧‧‧組合物
11‧‧‧支架
12‧‧‧內皮先驅細胞
S21~S25‧‧‧步驟
圖1A為依據本發明一實施例之組合物的外觀示意圖；圖1B為依據本發明一實施例之組合物的照片圖； 圖2為依據本發明一實施例之用於修補軟骨組織之組合物的製備方法的步驟流程圖；圖3係為將內皮先驅細胞貼附於聚乳酸-甘醇酸支架之實驗結果圖；圖4係為軟骨組織利用本發明之方法修補後之外觀圖；圖5係為利用顯微電腦斷層掃描(microCT)觀察骨組織利用本發明之方法修補後之結果圖；及圖6係為經修補後軟骨組織之軟骨組織具有之第二型膠原蛋白之免疫組織化學染色結果。
1‧‧‧組合物
11‧‧‧支架
12‧‧‧內皮先驅細胞

Claims (16)

  1. 一種修補軟骨組織之組合物，包括：一支架；以及複數內皮先驅細胞，附著於該支架，其中，該支架之材料為聚乳酸-甘醇酸共聚物，聚乳酸-甘醇酸共聚物內的聚乳酸及甘醇酸的比例為85：15。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中該支架之材料係為生物相容性物質。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中該支架係為多孔隙支架。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中該些內皮先驅細胞係源自於待修補軟骨組織之一個體的血液。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其係為植入使用之組合物。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之組合物，其係植入於一個體之軟骨組織與其周圍之骨組織的鄰接處。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中該些內皮先驅細胞係誘發一個體之軟骨組織與其周圍之骨組織生長以進行修補。
  8. 一種修補軟骨組織之組合物的製備方法，包括以下步驟：提供一支架；植入複數內皮先驅細胞於該支架；以及於該支架上培養該些內皮先驅細胞， 其中，該支架之材料為聚乳酸-甘醇酸共聚物，聚乳酸-甘醇酸共聚物內的聚乳酸及甘醇酸的比例為85：15。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之製備方法，其中該支架之材料係為生物相容性物質。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之製備方法，其中該支架係為多孔隙支架。
  11. 如申請專利範圍第8項所述之製備方法，其中該些內皮先驅細胞係源自於待修補軟骨組織之一個體的血液。
  12. 如申請專利範圍第8項所述之製備方法，其中該組合物係為植入使用之組合物。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之製備方法，該組合物係植入於一個體之軟骨組織與其周圍之骨組織的鄰接處。
  14. 如申請專利範圍第8項所述之製備方法，其中該些內皮先驅細胞係誘發一個體之軟骨組織與其周圍之骨組織生長以進行修補。
  15. 如申請專利範圍第8項所述之製備方法，其中該些內皮先驅細胞於植入該支架前係體外培養不超過一週。
  16. 如申請專利範圍第8項所述之製備方法，其中該些內皮先驅細胞於該支架上培養不超過一天。
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