JP2024026851A - 羊水細胞由来細胞外マトリックスおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】羊水細胞由来細胞外マトリックスおよびその使用の提供。【解決手段】羊水から単離された細胞からin vitroで得られた細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)、ならびに幹細胞を含む接着細胞の単離、維持、および増殖のための使用ならびに幹細胞の分化のための使用の方法が開示される。本発明は、人工多能性幹細胞(iPSC)および胚性幹細胞(ES)を含むがこれらに限定されない多能性幹細胞(PSC)の単離、拡大、および増殖を支持する細胞由来細胞外マトリックス(ECM)に関連する当技術における上述の限界および欠陥の少なくともいくつかに対する解決策を提供する。【選択図】なし
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関連出願への相互参照
本出願は、2018年10月3日出願の米国仮特許出願第62/740,817号の利益を主張し、該出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2018年10月3日出願の米国仮特許出願第62/740,817号の利益を主張し、該出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は一般に、細胞由来の細胞外マトリックスならびに、哺乳動物細胞の単離、維持、および増殖、ならびに幹細胞の分化を含むその使用に関する。
in vitro細胞培養はおそらく、全ての細胞生物学ならびに再生医療および組織工学の発展している分野において最も普遍的で重要、かつあまりよく理解されていない一面である。第1に、これによって細胞の挙動の観察が可能になり、それにより細胞機能の種々の態様を詳細に研究することができる。第2に、これによって特定の細胞群の数を増加させることができる。基礎研究ならびに多くの臨床応用のためには、少量の生体試料から大量の比較的まれな細胞を獲得することが必要である。in vitro細胞培養によって、少数の細胞を体外で拡大してより適切な数の細胞を獲得することが可能になる。最後に、これにより細胞を後日の使用のために保存することが可能になる。in vitroで細胞数を拡大し、後日の使用のために生存している細胞を凍結することによって、比較的少量の生体試料から数日、数か月、またはさらには数年もの期間にわたって複数の実験のための細胞を獲得することができる。
細胞培養が普遍的に存在しているにも関わらず、in vitro培養が細胞の生来の特徴に及ぼす効果は比較的理解が不十分なままである。本発明者らの現在の実施の多くは意図的な思想、計画、および実験からではなく、その代わりに偶然の観察から生じている。哺乳動物細胞の培養は1900年代の初期に始まり、1911年にAlexis CarrelおよびMontrose Burrowsが最初にin vitroにおける哺乳動物組織の培養について科学論文に発表した。彼らは、哺乳動物組織の切片を切り出してこれを顕微鏡のスライド上に置くことによって組織の生理学および解剖学を研究していた。その際、彼らはいくつかの細胞が組織からスライド上に遊走することに気付いた。彼らは続いて細胞を永久的に培養するための技法を記述した。現在では彼らの観察のいくつかは妥当でないようであるが、彼らの研究は現代の細胞培養の道を開くものであった。
造血幹細胞(HSC)の発見の後、世界中のグループが(HSC)を研究していた。HSCの(懸濁液中での)培養の間、骨髄細胞の副集団がプラスチックフラスコの底に固着して増殖し始めることが観察された。これらの細胞は後にHSCとは区別できることが認識され、最終的に間葉系幹細胞(MSC)と名付けられた。MSCの発見に繋がるこの偶然の観察のために、MSCおよびその他の多くの哺乳動物の細胞型を定義する属性としてプラスチックへの接着が今でも広く用いられている。
プラスチック基材上で細胞を培養することには問題があり、これはなぜなら、細胞機能の調節における微小環境の重要な役割を実証する、現在では文献で広く受け入れられている実質的な証拠が存在するからである。微小環境は幹細胞および前駆細胞の分化を方向づけるのに役立ち、成熟した細胞型の挙動を調節していることが示されてきた。
細胞を天然の環境から取り出してin vitroで拡大すると、細胞はその周囲の細胞外マトリックスまたは微小環境から、細胞の周囲の組成および状況に関する重要な情報を細胞に中継する重要な手掛りを失う。細胞の微小環境の変化は、これらの細胞の挙動に重大な影響を有する。大部分の接着細胞をin vitroで単離し拡大する現在の標準法は、ポリスチレン(プラスチック)からなる培養容器中に細胞を入れることである。ポリスチレンは細胞の接着および成長を促進するために何らかの方法で処理されているが、多くの場合、表面は細胞にとって完全に異物である。他の場合には、表面は個別のマトリックスタンパク質(たとえばフィブロネクチンまたはコラーゲン)またはタンパク質のある種の組合せでコーティングされていることもある。これらの単純な基材は、天然の微小環境の複雑さならびに正常な細胞機能における微小環境の重要な役割を無視している。細胞は直ちに、細胞がその天然の環境にある場合とは大きく異なる様式で、異物環境に応答し始める。
プラスチック基材上で細胞を培養することにおけるこの問題に対処するために、5つの主なアプローチが現在採用されている。
1.問題を無視する。in vivoで期待される機能と一致する所望の機能を達成する試みの代わりに、適切なマトリックス基材がなくても特定の所望の機能を示す細胞を発見するために、種々の培地の中で数多くの細胞型を試験することができる。このアプローチは洗練されておらず、変数の複雑な相互干渉および細胞と細胞外マトリックスとの間の相互作用の幅広さのために、所望の結果を得ることに失敗することが多い。
2.重要な成分を同定する。多くの学究的な研究室およびいくつかの企業は、細胞を単離した元の組織を考慮し、その組織の中で細胞機能に重要であり得る特有の要素を探すというアプローチをとってきた。次いで僅か1つのまたは数個のマトリックス成分からなる単純な基材上で細胞を培養する。天然には、マトリックスはある場合には100を超える異なるタンパク質を含む極めて複雑な環境であるため、このアプローチは失敗することが多い。細胞は、細胞が必要とせず受容するシグナルに対するのとちょうど同じように、細胞が必要とするが受容できないシグナルに強く応答する。
3.ショットガンアプローチ。MATRIGEL(商標)等のタンパク質ゲルの使用は、一種のショットガンアプローチを採用している。ゲルが多くの異なる細胞型のための必要な結合モチーフを含むと予想されるという希望のもとに、多くの異なるマトリックスタンパク質を含むゲルが生み出される。このアプローチは、細胞を特定の方向に押しやる手掛りを提供すること、または細胞が期待している全ての手掛りを提供できないことによって、失敗することがある。
4.組織由来のマトリックス。これは、典型的には遺伝的に同様の動物から目的の組織を単離し、組織を物理的に破壊しまたは化学的に消化して溶液または均一な懸濁液を得て、次いで分解した組織で培養容器をコーティングすることを含む、生物模倣アプローチである。たとえば、サテライト細胞を培養しようとすれば、筋肉を収集し、組織をホモジナイズし、次いでホモジナイズした筋肉で培養容器をコーティングして、細胞を播種してもよい。この方法はいくつかの重要な理由で失敗することが多い。第1に、特定の組織型の中であっても、幹細胞/前駆細胞のニッチは組織のそれ以外とは異なっていることがある。筋肉を単純にホモジナイズしても、適切なニッチが生み出されることを保証するものではない。第2に、ニッチは生化学的な手掛りに加えて構造的および物理的な手掛りからなっている。生化学的手掛りの多く/大部分が組織ホモジネート中に存在しても、構造は破壊されており、細胞は極めて異なる機械的手掛りを感知し得る。最後に、組織由来マトリックスの生産性は組織の利用可能性による。これは可能な細胞培養の全量に影響し、ロット間の変動の原因となる。
5.細胞由来のマトリックス。培養中の細胞を誘導してその培養容器中にマトリックスを分泌させることができる。このマトリックスはin vivoのニッチについて利用可能な最良の近似であり、in vitroで製造することができる。細胞をin vitroで誘導してマトリックスを作り出すことができ、その後、続いてたとえばマトリックスの構造および化学反応性を保持するように非イオン化界面活性剤を用いることによって、細胞をマトリックスから除去することができる。このアプローチは、いくつかの重要な利点を有している。(1)マトリックス構造を再形成して撹乱されないようにすることができる。(2)目的の組織/細胞型に基づいてマトリックスをカスタマイズできる。(3)マトリックスは幹細胞および前駆細胞のニッチに特異的であることができる。(4)マトリックスを大量に製造することができる。
細胞由来のマトリックスに関しては、全ての細胞型を効率よく単離して任意の所与の細胞由来マトリックス上で拡大できるわけではない。実際上、多能性幹細胞(PSC)は、支持成長基材について他の細胞の型とは極めて異なる要件を有しているようである。マトリックスを産生するために用いられる特定の細胞型はマトリックスの組成に影響を及ぼし、したがってそのマトリックスに対する種々の細胞型の反応に影響を及ぼすことが知られている(Marinkovic, M. et al., One size does
not fit all: developing a cell-specific
niche for in vitro study of cell behavior. Matrix Biol. 54-55, 426-441 (2016)を参照)。米国特許第8,084,023号で開示された以前の研究は、骨髄間質または間葉系幹細胞によって産生された細胞外マトリックスの産生および組成を記載している(Chen, X. et al., Extracellular Matrix Made
by Bone Marrow Cells Facilitates Expansion of Marrow-Derived Mesenchymal Progenitor Cells and Prevents Their Differentiation into Osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research 22, 1943-1956 (2007)およびLai, Y. et al., Reconstitution of marrow-derived extracellular matrix ex vivo: a robust culture system for expanding
large-scale highly functional human mesenchymal stem cells. Stem cells and development 19, 1095-107 (2010)も参照)。この骨髄細胞由来マトリックスは他のMSCの拡大を支持することが示されたが、他の型の幹細胞、具体的には人工多能性幹細胞(iPSC)の接着および成長には効果的ではなかった。iPSCは、MSCよりもずっと広いカテゴリーから細胞および組織を形成する拡張された可能性を示した。これは特に興味深い課題を表しており、これはなぜなら、標準的な培養条件下でiPSCのコンフルエントな単層を成長させることが困難なため、iPSCから細胞由来マトリックスを産生させることが実用的でないためである。以前の細胞由来マトリックスの主な限界は、組織特異的マトリックス(たとえば骨髄MSCからの骨髄マトリックス、脂肪MSCからの脂肪マトリックス、またはhUVECからの内皮マトリックス)を作製するために、標的の細胞集団が既に出発基材に接着できることが必要であることである。iPSC、胚性幹細胞(ES)、および多くの他の細胞型における困難さは、これらが単純な基材には容易に接着しないことである。
細胞由来のマトリックスに関しては、全ての細胞型を効率よく単離して任意の所与の細胞由来マトリックス上で拡大できるわけではない。実際上、多能性幹細胞(PSC)は、支持成長基材について他の細胞の型とは極めて異なる要件を有しているようである。マトリックスを産生するために用いられる特定の細胞型はマトリックスの組成に影響を及ぼし、したがってそのマトリックスに対する種々の細胞型の反応に影響を及ぼすことが知られている(Marinkovic, M. et al., One size does
not fit all: developing a cell-specific
niche for in vitro study of cell behavior. Matrix Biol. 54-55, 426-441 (2016)を参照)。米国特許第8,084,023号で開示された以前の研究は、骨髄間質または間葉系幹細胞によって産生された細胞外マトリックスの産生および組成を記載している(Chen, X. et al., Extracellular Matrix Made
by Bone Marrow Cells Facilitates Expansion of Marrow-Derived Mesenchymal Progenitor Cells and Prevents Their Differentiation into Osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research 22, 1943-1956 (2007)およびLai, Y. et al., Reconstitution of marrow-derived extracellular matrix ex vivo: a robust culture system for expanding
large-scale highly functional human mesenchymal stem cells. Stem cells and development 19, 1095-107 (2010)も参照)。この骨髄細胞由来マトリックスは他のMSCの拡大を支持することが示されたが、他の型の幹細胞、具体的には人工多能性幹細胞(iPSC)の接着および成長には効果的ではなかった。iPSCは、MSCよりもずっと広いカテゴリーから細胞および組織を形成する拡張された可能性を示した。これは特に興味深い課題を表しており、これはなぜなら、標準的な培養条件下でiPSCのコンフルエントな単層を成長させることが困難なため、iPSCから細胞由来マトリックスを産生させることが実用的でないためである。以前の細胞由来マトリックスの主な限界は、組織特異的マトリックス(たとえば骨髄MSCからの骨髄マトリックス、脂肪MSCからの脂肪マトリックス、またはhUVECからの内皮マトリックス)を作製するために、標的の細胞集団が既に出発基材に接着できることが必要であることである。iPSC、胚性幹細胞(ES)、および多くの他の細胞型における困難さは、これらが単純な基材には容易に接着しないことである。
Marinkovic, M. et al., One size does not fit all: developing a cell-specific niche for in vitro study of cell behavior. Matrix Biol. 54-55, 426-441 (2016)
Chen, X. et al., Extracellular Matrix Made by Bone Marrow Cells Facilitates Expansion of Marrow-Derived Mesenchymal Progenitor Cells and Prevents Their Differentiation into Osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research 22, 1943-1956 (2007)
Lai, Y. et al., Reconstitution of marrow-derived extracellular matrix ex vivo: a robust culture system for expanding large-scale highly functional human mesenchymal stem cells. Stem cells and development 19, 1095-107 (2010)
本発明は、人工多能性幹細胞(iPSC)および胚性幹細胞(ES)を含むがこれらに限定されない多能性幹細胞(PSC)の単離、拡大、および増殖を支持する細胞由来細胞外マトリックス(ECM)に関連する当技術における上述の限界および欠陥の少なくともいくつかに対する解決策を提供する。解決策は羊水細胞由来の細胞外マトリックスの使用を前提としている。羊水中に見出される、拘束されておらず(uncommitted)容易に接着し、高度に増殖性の周産期の細胞の使用により、驚くべきことにこれらのPSCの接着、単離、拡大、および増殖を支持する細胞外マトリックス(ECM)の創製が可能になる。この技術的達成は、従来技術の細胞由来ECMでは不可能であった。さらに、本発明の羊水細胞由来細胞外マトリックス(AFC-ECM)は、間葉系幹細胞、体細胞、前駆細胞、成熟細胞、および複数の胚葉由来の細胞等の他の幹細胞を含むがこれらに限定されない接着細胞型の単離、拡大、および増殖に有効である。驚くべきことに、本発明のAFC-ECMは、骨髄細胞由来のECMと比較して、骨髄によって産生されたMSCの増殖の増大を支持する。さらに、本発明のAFC-ECMは、幹細胞の分化細胞型への分化を支持することができる。
本発明の一態様では、羊水から単離された細胞からin vitroで得られた細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)が開示される。一部の実施形態では、ECMは、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む。一部の実施形態では、コラーゲンアルファ-1(XVIII)のアイソフォームは、アイソフォーム2である。一部の実施形態では、アグリンのアイソフォームは、アイソフォーム6である。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、デコリン、ペルレカン、およびコラーゲン(III)のいずれか1つまたは全てを含まない。一部の実施形態では、羊水から単離された細胞は幹細胞を含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは脱細胞化される。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、表2(実施例2を参照)に列挙した成分の任意の1つ、任意の組合せ、もしくは全て、および/または表2に列挙した成分の任意のバリアント、誘導体、もしくはアイソフォーム、好ましくは表2に列挙した成分の全て、および/またはその任意の誘導体もしくはアイソフォームを含む。
本発明の一態様では、羊水から単離された細胞からin vitroで得られた細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)が開示される。一部の実施形態では、ECMは、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む。一部の実施形態では、コラーゲンアルファ-1(XVIII)のアイソフォームは、アイソフォーム2である。一部の実施形態では、アグリンのアイソフォームは、アイソフォーム6である。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、デコリン、ペルレカン、およびコラーゲン(III)のいずれか1つまたは全てを含まない。一部の実施形態では、羊水から単離された細胞は幹細胞を含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは脱細胞化される。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、表2(実施例2を参照)に列挙した成分の任意の1つ、任意の組合せ、もしくは全て、および/または表2に列挙した成分の任意のバリアント、誘導体、もしくはアイソフォーム、好ましくは表2に列挙した成分の全て、および/またはその任意の誘導体もしくはアイソフォームを含む。
本発明の別の態様では、培養中の接着細胞を増殖させる方法であって、接着細胞を培養培地中で細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)の存在下で培養してそれにより接着細胞を増殖させるステップを含み、細胞由来のECMが、羊水から単離された細胞からin
vitroで得られる、方法が開示される。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む。一部の実施形態では、コラーゲンアルファ-1(XVIII)のアイソフォームは、アイソフォーム2である。一部の実施形態では、アグリンのアイソフォームは、アイソフォーム6である。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、デコリン、ペルレカン、またはコラーゲン(III)を含まない。一部の実施形態では、羊水から単離された細胞は、幹細胞を含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、脱細胞化される。一部の実施形態では、接着細胞は、哺乳動物の接着細胞を含む。一部の実施形態では、接着細胞は、幹細胞、体細胞、前駆細胞、成熟細胞、または複数の胚葉由来の細胞を含む。一部の実施形態では、接着細胞は、幹細胞を含む。一部の実施形態では、幹細胞は、未分化の状態で維持されている。一部の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞(PSC)を含む。一部の実施形態では、PSCは、人工PSC(iPSC)および/または胚性幹細胞(ES)を含む。一部の実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞(MSC)を含む。一部の実施形態では、MSCは、骨髄から得られる。一部の実施形態では、接着細胞は、前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前駆細胞は、内皮前駆細胞を含む。一部の実施形態では、接着細胞は、成熟細胞を含む。一部の実施形態では、成熟細胞は、軟骨細胞を含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、表2に列挙した成分の任意の1つ、任意の組合せ、もしくは全て、および/または表2に列挙した成分の任意のバリアント、誘導体、もしくはアイソフォーム、好ましくは表2に列挙した成分の全て、および/またはその任意の誘導体もしくはアイソフォームを含む。
vitroで得られる、方法が開示される。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む。一部の実施形態では、コラーゲンアルファ-1(XVIII)のアイソフォームは、アイソフォーム2である。一部の実施形態では、アグリンのアイソフォームは、アイソフォーム6である。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、デコリン、ペルレカン、またはコラーゲン(III)を含まない。一部の実施形態では、羊水から単離された細胞は、幹細胞を含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、脱細胞化される。一部の実施形態では、接着細胞は、哺乳動物の接着細胞を含む。一部の実施形態では、接着細胞は、幹細胞、体細胞、前駆細胞、成熟細胞、または複数の胚葉由来の細胞を含む。一部の実施形態では、接着細胞は、幹細胞を含む。一部の実施形態では、幹細胞は、未分化の状態で維持されている。一部の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞(PSC)を含む。一部の実施形態では、PSCは、人工PSC(iPSC)および/または胚性幹細胞(ES)を含む。一部の実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞(MSC)を含む。一部の実施形態では、MSCは、骨髄から得られる。一部の実施形態では、接着細胞は、前駆細胞を含む。一部の実施形態では、前駆細胞は、内皮前駆細胞を含む。一部の実施形態では、接着細胞は、成熟細胞を含む。一部の実施形態では、成熟細胞は、軟骨細胞を含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、表2に列挙した成分の任意の1つ、任意の組合せ、もしくは全て、および/または表2に列挙した成分の任意のバリアント、誘導体、もしくはアイソフォーム、好ましくは表2に列挙した成分の全て、および/またはその任意の誘導体もしくはアイソフォームを含む。
本発明の別の態様では、幹細胞の分化細胞型への分化を誘導する方法であって、分化培地中の細胞由来細胞外マトリックス(ECM)の存在下で幹細胞を培養するステップを含み、細胞由来ECMが、羊水から単離された細胞からin vitroで得られる、方法が開示される。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む。一部の実施形態では、コラーゲンアルファ-1(XVIII)のアイソフォームは、アイソフォーム2である。一部の実施形態では、アグリンのアイソフォームは、アイソフォーム6である。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、デコリン、ペルレカン、またはコラーゲン(III)を含まない。一部の実施形態では、羊水から単離された細胞は、幹細胞を含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、脱細胞化される。一部の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞(PSC)を含む。一部の実施形態では、PSCは、人工PSC(iPSC)を含む。一部の実施形態では、PSCは、胚性幹細胞(ES)を含む。一部の実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞(MSC)を含む。一部の実施形態では、MSCは、骨髄から得られる。一部の実施形態では、分化細胞型は、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、または筋細胞を含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、表2に列挙した成分の任意の1つ、任意の組合せ、もしくは全て、および/または表2に列挙した成分の任意のバリアント、誘導体、もしくはアイソフォーム、好ましくは表2に列挙した成分の全て、および/またはその任意の誘導体もしくはアイソフォームを含む。
本発明の別の態様では、細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)をin vitroで産生する方法であって、
(a)羊水から細胞を単離するステップ、
(b)単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種するステップ、
(c)培養培地を細胞培養容器に添加するステップ、および
(d)細胞を培養し、それにより細胞由来のECMを産生するステップ、および
(e)必要に応じて細胞由来のECMを脱細胞化するステップ
を含む方法が開示される。一部の実施形態では、羊水からの単離された細胞は、幹細胞を含む。一部の実施形態では、基材は、フィブロネクチンである。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む。一部の実施形態では、コラーゲンアルファ-1(XVIII)のアイソフォームは、アイソフォーム2である。一部の実施形態では、アグリンのアイソフォームは、アイソフォーム6である。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、デコリン、ペルレカン、およびコラーゲン(III)を含まない。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、表2に列挙した成分の任意の1つ、任意の組合せ、もしくは全て、および/または表2に列挙した成分の任意のバリアント、誘導体、もしくはアイソフォームを含む。
(a)羊水から細胞を単離するステップ、
(b)単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種するステップ、
(c)培養培地を細胞培養容器に添加するステップ、および
(d)細胞を培養し、それにより細胞由来のECMを産生するステップ、および
(e)必要に応じて細胞由来のECMを脱細胞化するステップ
を含む方法が開示される。一部の実施形態では、羊水からの単離された細胞は、幹細胞を含む。一部の実施形態では、基材は、フィブロネクチンである。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む。一部の実施形態では、コラーゲンアルファ-1(XVIII)のアイソフォームは、アイソフォーム2である。一部の実施形態では、アグリンのアイソフォームは、アイソフォーム6である。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、デコリン、ペルレカン、およびコラーゲン(III)を含まない。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、表2に列挙した成分の任意の1つ、任意の組合せ、もしくは全て、および/または表2に列挙した成分の任意のバリアント、誘導体、もしくはアイソフォームを含む。
本発明の別の態様では、羊水細胞由来細胞外マトリックス(AFC-ECM)が開示され、これは、
(a)羊水から細胞を単離するステップ、
(b)単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種するステップ、
(c)培養培地を細胞培養容器に添加するステップ、および
(d)細胞を培養し、それによりAFC-ECMを産生するステップ、および
(e)必要に応じてAFC-ECMを脱細胞化するステップ
を含む方法によってin vitroで産生される。一部の実施形態では、羊水からの単離された細胞は、幹細胞を含む。一部の実施形態では、基材は、フィブロネクチンである。一部の実施形態では、AFC-ECMは、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む。一部の実施形態では、コラーゲンアルファ-1(XVIII)のアイソフォームは、アイソフォーム2である。一部の実施形態では、アグリンのアイソフォームは、アイソフォーム6である。一部の実施形態では、AFC-ECMは、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む。一部の実施形態では、AFC-ECMは、デコリン、ペルレカン、およびコラーゲン(III)を含まない。一部の実施形態では、AFC-ECMは、表2に列挙した成分の任意の1つ、任意の組合せ、もしくは全て、および/または表2に列挙した成分の任意のバリアント、誘導体、もしくはアイソフォームを含む。
(a)羊水から細胞を単離するステップ、
(b)単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種するステップ、
(c)培養培地を細胞培養容器に添加するステップ、および
(d)細胞を培養し、それによりAFC-ECMを産生するステップ、および
(e)必要に応じてAFC-ECMを脱細胞化するステップ
を含む方法によってin vitroで産生される。一部の実施形態では、羊水からの単離された細胞は、幹細胞を含む。一部の実施形態では、基材は、フィブロネクチンである。一部の実施形態では、AFC-ECMは、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む。一部の実施形態では、コラーゲンアルファ-1(XVIII)のアイソフォームは、アイソフォーム2である。一部の実施形態では、アグリンのアイソフォームは、アイソフォーム6である。一部の実施形態では、AFC-ECMは、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む。一部の実施形態では、AFC-ECMは、デコリン、ペルレカン、およびコラーゲン(III)を含まない。一部の実施形態では、AFC-ECMは、表2に列挙した成分の任意の1つ、任意の組合せ、もしくは全て、および/または表2に列挙した成分の任意のバリアント、誘導体、もしくはアイソフォームを含む。
本発明の別の態様では、臍帯から単離された細胞からin vitroで得られた細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)が開示される。一部の実施形態では、臍帯から単離された細胞は、臍帯血および/またはWhartonのゼリーからのものである。
本発明の別の態様では、胎盤組織から単離された細胞からin vitroで得られた細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)が開示される。一部の実施形態では、胎盤組織から単離された細胞は、膜シート(羊膜および/または絨毛膜)、絨毛、および/または血液からのものである。
本発明の文脈において、実施形態1~53も開示される。実施形態1は、羊水から単離された細胞からin vitroで得られた細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)である。実施形態2は、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む、実施形態1に記載の細胞由来のECMである。実施形態3は、コラーゲンアルファ-1(XVIII)の前記アイソフォームが、アイソフォーム2であり、および/またはアグリンの前記アイソフォームが、アイソフォーム6である、実施形態2に記載の細胞由来のECMである。実施形態4は、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む、実施形態2または3のいずれか一項に記載の細胞由来のECMである。実施形態5は、デコリン、ペルレカン、および/またはコラーゲン(III)を含まない、実施形態1から4のいずれか一項に記載の細胞由来のECMである。実施形態6は、羊水から単離された前記細胞が、幹細胞を含む、実施形態1から5のいずれか一項に記載の細胞由来のECMである。実施形態7は、脱細胞化されている、実施形態1から6のいずれか一項に記載の細胞由来のECMである。
実施形態8は、培養中の接着細胞を増殖させる方法であって、前記接着細胞を培養培地中で細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)の存在下で培養してそれにより前記接着細胞を増殖させるステップを含み、前記細胞由来のECMが、羊水から単離された細胞からin vitroで得られる、方法である。実施形態9は、前記細胞由来のECMが、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む、実施形態8に記載の方法である。実施形態10は、コラーゲンアルファ-1(XVIII)の前記アイソフォームが、アイソフォーム2であり、および/またはアグリンの前記アイソフォームが、アイソフォーム6である、実施形態9に記載の方法である。実施形態11は、前記細胞由来のECMが、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む、実施形態9または10のいずれか一項に記載の方法である。実施形態12は、前記細胞由来のECMが、デコリン、ペルレカン、および/またはコラーゲン(III)を含まない、実施形態8から11のいずれか一項に記載の方法である。実施形態13は、羊水から単離された前記細胞が、幹細胞を含む、実施形態8から12のいずれか一項に記載の方法である。実施形態14は、前記細胞由来のECMが、前記接着幹細胞と接触する前に脱細胞化される、実施形態8から13のいずれか一項に記載の方法である。実施形態15は、前記接着細胞が、哺乳動物の接着細胞を含む、実施形態8から14のいずれか一項に記載の方法である。実施形態16は、前記接着細胞が、幹細胞、体細胞、前駆細胞、成熟細胞、または複数の胚葉由来の細胞を含む、実施形態8から15のいずれか一項に記載の方法である。実施形態17は、前記接着細胞が、幹細胞を含む、実施形態16に記載の方法である。実施形態18は、前記幹細胞が、未分化の状態で維持されている、実施形態17に記載の方法である。実施形態19は、前記幹細胞が、多能性幹細胞(PSC)を含む、実施形態17または18のいずれか一項に記載の方法である。実施形態20は、前記PSCが、人工PSC(iPSC)を含む、実施形態19に記載の方法である。実施形態21は、前記PSCが、胚性幹細胞(ES)を含む、実施形態19に記載の方法である。実施形態22は、前記幹細胞が、間葉系幹細胞(MSC)を含む、実施形態17または18のいずれか一項に記載の方法である。実施形態23は、前記MSCが、骨髄から得られる、実施形態22に記載の方法である。実施形態24は、前記接着細胞が、前駆細胞を含む、実施形態16に記載の方法である。実施形態25は、前記前駆細胞が、内皮前駆細胞を含む、実施形態24に記載の方法である。実施形態26は、前記接着細胞が、成熟細胞を含む、実施形態16に記載の方法である。実施形態27は、前記成熟細胞が、軟骨細胞を含む、実施形態26に記載の方法である。
実施形態28は、幹細胞の分化細胞型への分化を誘導する方法であって、分化培地中の細胞由来細胞外マトリックス(ECM)の存在下で前記幹細胞を培養するステップを含み、前記細胞由来ECMが、羊水から単離された細胞からin vitroで得られる、方法である。実施形態29は、前記細胞由来のECMが、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む、実施形態28に記載の方法である。実施形態30は、コラーゲンアルファ-1(XVIII)の前記アイソフォームが、アイソフォーム2であり、および/またはアグリンの前記アイソフォームが、アイソフォーム6である、実施形態29に記載の方法である。実施形態31は、前記細胞由来のECMが、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む、実施形態29または30のいずれか一項に記載の方法である。実施形態32は、前記細胞由来のECMが、デコリン、ペルレカン、および/またはコラーゲン(III)を含まない、実施形態28から31のいずれか一項に記載の方法である。実施形態33は、羊水から単離された前記細胞が、幹細胞を含む、実施形態28から32のいずれか一項に記載の方法である。実施形態34は、前記幹細胞が、多能性幹細胞(PSC)を含む、実施形態28から33のいずれか一項に記載の方法である。実施形態35は、前記PSCが、人工PSC(iPSC)を含む、実施形態34に記載の方法である。実施形態36は、前記PSCが、胚性幹細胞(ES)を含む、実施形態34に記載の方法である。実施形態37は、前記幹細胞が、間葉系幹細胞(MSC)を含む、実施形態28から33のいずれか一項に記載の方法である。実施形態38は、前記MSCが、骨髄から得られる、実施形態22に記載の方法である。実施形態39は、前記分化細胞型が、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、または筋細胞を含む、実施形態37または38のいずれか一項に記載の方法である。
実施形態40は、細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)をin vitroで産生する方法であって、(a)羊水から細胞を単離するステップ、(b)前記単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種するステップ、(c)培養培地を前記細胞培養容器に添加するステップ、および(d)前記細胞を培養し、それにより細胞由来のECMを産生するステップ、および(e)必要に応じて前記細胞由来のECMを脱細胞化するステップを含む方法である。実施形態41は、前記羊水からの前記単離された細胞が、幹細胞を含む、実施形態40に記載の方法である。実施形態42は、前記基材が、フィブロネクチンである、実施形態40または41に記載の方法である。実施形態43は、前記細胞由来のECMが、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む、実施形態40から42のいずれか一項に記載の方法である。実施形態44は、コラーゲンアルファ-1(XVIII)の前記アイソフォームが、アイソフォーム2であり、および/またはアグリンの前記アイソフォームが、アイソフォーム6である、実施形態43に記載の方法である。実施形態45は、前記細胞由来のECMが、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む、実施形態43または44のいずれか一項に記載の方法である。実施形態46は、前記細胞由来のECMが、デコリン、ペルレカン、および/またはコラーゲン(III)を含まない、実施形態40から45のいずれか一項に記載の方法である。
実施形態47は、羊水細胞由来細胞外マトリックス(AFC-ECM)であって、(a)羊水から細胞を単離するステップ、(b)前記単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種するステップ、(c)培養培地を前記細胞培養容器に添加するステップ、および(d)前記細胞を培養し、それにより前記AFC-ECMを産生するステップ、および(e)必要に応じて前記AFC-ECMを脱細胞化するステップを含む方法によってin vitroで産生されたAFC-ECMである。実施形態48は、前記羊水からの前記単離された細胞が、幹細胞を含む、実施形態47に記載の方法である。実施形態49は、前記基材が、フィブロネクチンである、実施形態47または48に記載の方法である。実施形態50は、前記細胞由来のECMが、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む、実施形態47から49のいずれか一項に記載の方法である。実施形態51は、コラーゲンアルファ-1(XVIII)の前記アイソフォームが、アイソフォーム2であり、および/またはアグリンの前記アイソフォームが、アイソフォーム6である、実施形態50に記載の方法である。実施形態52は、前記細胞由来のECMが、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む、実施形態50または51のいずれか一項に記載の方法である。実施形態53は、前記細胞由来のECMが、デコリン、ペルレカン、および/またはコラーゲン(III)を含まない、実施形態47から52のいずれか一項に記載の方法である。
用語「幹様特徴」または「幹細胞性」は、幹細胞においてまたは幹細胞に関連して観察され得る特徴を意味する。たとえば、幹様特徴の1つは、異なる細胞型に分化する能力、自己再生の能力、ある条件(低酸素条件を含む)における生存の能力、化学療法剤に対する耐性の能力、および広範囲のマーカーの発現から選択することができる。
用語「アイソフォーム」は、生体分子またはタンパク質の異なる形態を意味する。生体分子またはタンパク質の異なる形態は、種々のプロセスまたは機構によって産生され得る。生体分子がタンパク質である実施形態では、アイソフォームは配列中で1つまたは複数のアミノ酸が異なるタンパク質であり得る。たとえば、タンパク質のアイソフォームは遺伝子の対立形質であり得る。あるいは、タンパク質のアイソフォームは、代替のスプライシング、RNA編集、翻訳後プロセシング等の産生物であり得る。
用語「約」または「ほぼ」は、当業者に理解されるものと近いものとして定義され、1つの非限定的な実施形態では、この用語は10%以内、好ましくは5%以内、より好ましくは1%以内、最も好ましくは0.5%以内であると定義される。
用語「実質的に」およびその変形形態は、10%以内、5%以内、1%以内、または0.5%以内の範囲を含むと定義される。
用語「wt%」、「vol%」、または「mol%」は、それぞれその成分を含む全重量、材料の総体積、または全モル数に基づく成分の重量パーセント、成分の体積パーセント、または成分のモルパーセントを意味する。非限定的な例では、材料100グラム中の成分10グラムは、成分10wt%である。
用語「阻害する」もしくは「低減する」もしくは「防止する」もしくは「回避する」、またはこれらの用語の任意の変形形態は、特許請求の範囲および/または明細書中で使用される場合には、所望の結果を達成するための任意の測定可能な低減または完全な阻害を含む。
用語「有効な」は、その用語が明細書および/または特許請求の範囲で使用される場合には、所望の、期待した、または意図した結果を達成するために適切であることを意味する。
単語「含む(comprising)」(ならびに「comprise」および「comprises」等の任意の形のcomprising)、「有する(having)」(ならびに「have」および「has」等の任意の形のhaving)、「含む(including)」(ならびに「includes」および「include」等の任意の形のincluding)、または「含む(containing)」(ならびに「contains」および「contain」等の任意の形のcontaining)は包括的またはオープンエンドであり、さらなる、言及していない要素や方法ステップを排除しない。
単語「1つの(「a」または「an」)」の使用は、用語「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」、または「含む(containing)」(またはこれらの単語の任意の変形形態)と併せて使用される場合、「1つの(one)」を意味し得るが、「1つまたは複数の(one or more)」、「少なくとも1つの(at least one)」、および「1つまたは2つ以上の(one or more than one)」の意味とも一致する。
組成物およびその使用のための方法は、本明細書全体で開示する成分またはステップのいずれか「を含み」、「本質的にそれらからなり」、または「それらからなる」ことができる。1つの非限定的な態様において、移行句「本質的に~からなる」に関して、本発明の細胞由来の細胞外マトリックスの基礎的で新規な特徴は、これが(1)羊水から単離された細胞からin vitroで得られ、(2)PSCの接着、単離、拡大、および/または増殖を支持する環境を提供することである。
本明細書で論じるいずれの実施形態も、本発明のいずれの方法または組成物に関しても実施可能であり、逆もそうであることが意図されている。さらに、本発明の組成物は、本発明の方法を達成するために用いることができる。
本発明のその他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の実施形態を示しているが、説明のためのみに提供していることを理解されたい。それは、本発明の精神および範囲内で種々の変形および改変がこの詳細な説明から当業者には明らかになるからである。
本発明は、羊水から単離された細胞からin vitroで得られる細胞由来細胞外マトリックス(ECM)およびECMを作製する方法を開示する。哺乳動物細胞であってよい接着細胞の単離、維持、および拡大/増殖のためにECMを用いる方法も開示される。
哺乳動物細胞の機能は、主としてそれが存在する環境、たとえば細胞外マトリックスによって決定される。細胞はその環境に存在するシグナル(ポジティブシグナル)に、また必要ではあるが存在しないシグナル(ネガティブシグナル)に、反応する。非拘束幹細胞は、幹細胞の生存および幹細胞性を維持するために必要なニッチモチーフを含むマトリックスを産生することができるが、より成熟した細胞が分泌できる、幹細胞を特定の運命に進める多くの系列特異的シグナルを欠いている可能性がある。理論に縛られるわけではないが、未成熟の細胞、たとえば周産期の細胞または周産期の幹細胞は、骨髄間質細胞由来のECM等の当技術で以前開示されたECMとは異なるECMを産生しており、間葉系幹細胞(MSC)よりも高い潜在性を有する多能性幹細胞(PSC)等の幹細胞のより良い単離および拡大/増殖を可能にし得ることが示唆される。質量分析によって、以前から知られていた細胞由来のECMと比較して、本発明の羊水細胞由来のECMは、3種の胚葉の全てに見出されるマトリックスタンパク質を含み、骨形成系列に強く関連する特定のタンパク質を欠いていることが示された。さらに、本発明のECMは多能性細胞の接着および拡大を促進することが知られているラミニン等の特定のモチーフを含んでいた。
A.羊水細胞由来細胞外マトリックス(AFC-ECM)
A.羊水細胞由来細胞外マトリックス(AFC-ECM)
周産期の細胞は3つの群、即ち羊水からの細胞、胎盤からの細胞、および臍帯からの細胞に分けることができる。羊水は、胎児の羊膜、皮膚、ならびに消化管、呼吸器官、および尿生殖器官から脱落した発育中の胎児由来の細胞を含むいくつかの細胞源を有している。胎盤も、膜シート(羊膜および絨毛膜)、絨毛、および血液を含むいくつかの細胞源を有している。臍帯細胞は一般に2つの供給源、即ち臍帯血およびWhartonのゼリーに由来する。これら3つの周産期供給源からの細胞は、幹細胞を含み得る。本発明の羊水細胞由来ECMを産生するために用いられる細胞は、ヒト(homo sapiens)、マウス、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、または霊長類を含むがこれらに限定されない哺乳動物の羊水から得られる。好ましい実施形態では、細胞はヒトの羊水からのものである。羊水は満期産(妊娠期間約37週より長い)、または早期産(妊娠期間約37週未満)のヒトから供給を受けることができる。早期産は、後期早期産(妊娠期間約33週~約37週)、中期早期産(妊娠期間約29週~約33週)、および極早期産(妊娠期間約23週~約29週)を含む。羊水は羊水が存在する任意の妊娠期間で出生の前にヒトから供給を受けることができ、出生の際の羊水の供給源と合わせることができる。一般には、出生に先立って羊水穿刺の術式によって羊水を収集する。一部の実施形態では、羊水は満期産、早期産、後期早期産、中期早期産、極早期産において、もしくは出生前に、またはそれらの組合せで、ヒトから供給を受ける。一部の実施形態では、羊水は出生前に供給を受け、妊娠期間約10週から出生まで、または妊娠期間約10週から約23週まで、または妊娠期間約10週から約16週まで、または妊娠期間約12週から出生まで、または妊娠期間約12週から約23週まで、または妊娠期間約12週から約16週まで、収集する。一部の実施形態では、出生前に供給を受ける羊水は、羊水穿刺の手順によって収集する。細胞は当技術で公知の技法、たとえばMurphy et. al., Amniotic Fluid Stem Cells, Perinatal Stem Cells, Second Ed. 2013に開示された技法によって羊水から得られ、単離され得る。
羊水は、自発的に、または当業者には公知の特定の成長因子もしくは成長因子の組合せによる処置の結果として、3つの胚葉(外胚葉、内胚葉、中胚葉)の全てから得られる細胞型に分化する能力を有する細胞を含む。即ち、単一の細胞が、3つの胚葉のいずれかに特異的な遺伝子を発現するように誘導される能力を有している。羊水はまた、胎児の羊膜、皮膚、ならびに消化管、呼吸器官、および尿生殖器官から脱落した発育中の胎児由来の細胞を含む異なる細胞型の混合物を含む。羊水および胎盤膜の起源により、これらの細胞は高度に複能性の分化の潜在性を維持し、3つの胚葉全ての細胞を含む細胞集団を含むことができる。羊水細胞は幹細胞を含み得る。一部の実施形態では、羊水細胞は単離された幹細胞である。一部の実施形態では、羊水細胞は3つの胚葉(外胚葉、内胚葉、中胚葉)の全てから得られる細胞型および/または複能性幹細胞(multipotent stem cell)および/または多能性幹細胞(pluripotent stem cell)に分化する能力を有する幹細胞を含む。
本発明の羊水細胞由来ECMは、種々のタンパク質を含む。ECMのタンパク質は質量分析および免疫組織化学染色を含む当技術で公知の技法によって同定することができる。ECMは、表2(以下の実施例2を参照)に列挙した成分およびそれらの任意のバリアント、誘導体、またはアイソフォームを含み得るが、これらに限定されない。羊水細胞由来ECMは、表2の成分のいずれかおよびそれらの任意のバリアント、誘導体、またはアイソフォームの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、組合せは、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含み、それらから本質的になり、またはそれらからなり得る。一部の実施形態では、コラーゲンアルファ-1(XVIII)のアイソフォームはアイソフォーム2である。一部の実施形態では、アグリンのアイソフォームはアイソフォーム6である。一部の実施形態では、細胞由来ECMは、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含み、それらから本質的になり、またはそれらからなる。一部の実施形態では、羊水細胞由来ECMは、デコリン、ペルレカン、およびコラーゲン(III)のうちいずれか1つまたはその全てを含まない。表2において最も豊富なコラーゲンはコラーゲンI、IV、およびXVIIIである。本発明の羊水細胞由来ECMと骨髄細胞由来マトリックスのタンパク質の間のいくつかの注目すべき相違を、表1に記載している。
本発明の羊水細胞由来ECM(AFC-ECM)は、以下のプロセス:
(a)羊水から細胞を単離するステップ、
(b)単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種するステップ、
(c)培養培地を細胞培養容器に添加するステップ、および
(d)細胞を培養し、それによりAFC-ECMを産生するステップ、および
(e)必要に応じてAFC-ECMを脱細胞化するステップ
によってin vitroで産生され得る。
(a)羊水から細胞を単離するステップ、
(b)単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種するステップ、
(c)培養培地を細胞培養容器に添加するステップ、および
(d)細胞を培養し、それによりAFC-ECMを産生するステップ、および
(e)必要に応じてAFC-ECMを脱細胞化するステップ
によってin vitroで産生され得る。
本明細書には、細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)をin vitroで産生する方法が開示され、方法は、
(a)羊水から細胞を単離するステップ、
(b)単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種するステップ、
(c)培養培地を細胞培養容器に添加するステップ、および
(d)細胞を培養し、それにより細胞由来のECMを産生するステップ、および
(e)必要に応じて細胞由来のECMを脱細胞化するステップ
を含む。
(a)羊水から細胞を単離するステップ、
(b)単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種するステップ、
(c)培養培地を細胞培養容器に添加するステップ、および
(d)細胞を培養し、それにより細胞由来のECMを産生するステップ、および
(e)必要に応じて細胞由来のECMを脱細胞化するステップ
を含む。
本明細書には、羊水細胞由来細胞外マトリックス(AFC-ECM)が開示され、これは、
(a)羊水から細胞を単離するステップ、
(b)単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種するステップ、
(c)培養培地を細胞培養容器に添加するステップ、および
(d)細胞を培養し、それによりAFC-ECMを産生するステップ、および
(e)必要に応じてAFC-ECMを脱細胞化するステップ
を含む方法によってin vitroで産生される。
(a)羊水から細胞を単離するステップ、
(b)単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種するステップ、
(c)培養培地を細胞培養容器に添加するステップ、および
(d)細胞を培養し、それによりAFC-ECMを産生するステップ、および
(e)必要に応じてAFC-ECMを脱細胞化するステップ
を含む方法によってin vitroで産生される。
細胞が直ちにまたは培養のある期間の後にコンフルエントな単層を形成することを可能にする任意の播種密度を用いてよい。一部の実施形態では、播種密度は約10細胞/cm2~約100,000細胞/cm2、または約100細胞/cm2~約75,000細胞/cm2、または約500細胞/cm2~約50,000細胞/cm2、または約500細胞/cm2~約10,000細胞/cm2、または約500細胞/cm2~約5,000細胞/cm2、または約500細胞/cm2~約2,500細胞/cm2、または約1,000細胞/cm2~約25,000細胞/cm2、または約2,000細胞/cm2~約10,000細胞/cm2、または約3,000細胞/cm2~約5,000細胞/cm2である。
本発明のため、細胞の培養に適した任意の型の容器を用いることができる。その例は細胞培養フラスコ、Tフラスコ、撹拌フラスコ、回転フラスコ、発酵槽、およびバイオリアクターを含むが、これらに限定されない。ロッキングボトル、振盪フラスコ、チューブ、およびその他の容器も、ロッキングプラットフォームまたは振とう機上に設置する場合には好適な容器である。細胞培養容器は、細胞の接着を改良するために基材でコーティングすることができる。細胞容器をコーティングするための好適な基材の非限定的な例は、フィブロネクチンである。
種々の市販の細胞培養用培地、たとえばアルファ最小必須培地(α-MEM)培養培地(Thermo Fisher Scientific、Grand Island、NY)が羊水細胞の培養のために好適である。種々の補助的な物質、たとえば重炭酸ナトリウム、L-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシンB、および/または血清を培地に添加することによって、市販の培養培地を改変することができる。血清はウシ胎児血清であってよい。培地は無血清であってもよい。さらに、ECMにおける細胞の産生を誘導するために、L-アスコルビン酸等の物質を培地または改変した培地に添加することができる。
当初の培養培地を培養プロセスの間の種々の時間で別の培地に交換および/または置き換えることができる。たとえば、当初の培地は「完全培地」であり、次いで培養プロセスの間に「誘導培地」に置き換えることができる。「完全培地」の非限定的な例は、(α-MEM)プラス2mMのL-グルタミンプラス抗生剤-抗真菌剤プラス15%のウシ胎児血清を含む。「誘導培地」の非限定的な例は、「完全培地」プラス50mMのL-アスコルビン酸を含む。
羊水細胞の培養はインキュベーター中37℃で、5%のCO2および90%の湿度で行なうことができる。培養は、正常酸素、即ち大気中20~21%の酸素中、または低酸素条件を含むが、これらに限定されない種々の環境条件下で行なうことができる。
羊水細胞の羊水細胞由来ECMの脱細胞化は、生きている羊水細胞を除去することまたは羊水細胞を生存不能にすることを含み得る。羊水細胞は、羊水細胞を溶解し、次いで溶解した羊水細胞を洗浄によって除去することを含み得るが、これらに限定されない当技術で公知の方法を用いてECMから脱細胞化することができる。ECMから羊水細胞を除去するために種々の物質を用いることができる。非限定的な例は、PBS緩衝液中にTRITON(登録商標) X-100および水酸化アンモニウムを含む「抽出緩衝液」を含む。羊水細胞からECMが脱細胞化された後、得られるECMは実質的に細胞を含まず、または生きている羊水細胞を含まない。フィーダー細胞を用いる場合には、脱細胞化法はECM上に存在するいずれの生きているフィーダー細胞にも適用され、したがってECMは生きているフィーダー細胞を実質的に含まないか、または含まない。脱細胞化法はECM上に存在するいずれの生きている細胞にも適用され、したがってECMはいずれの生きている細胞も実質的に含まないか、または含まない。したがって、脱細胞化されたECMはECMが無細胞であることを意味し、ECMがいずれの生きている細胞をも含まないことを意味する。
一部の実施形態では、羊水細胞由来ECMは三次元(3D)ECMである。
上記の方法は、臍帯血およびWhartonのゼリーを含む臍帯からの細胞、ならびに膜シート(羊膜および絨毛膜)、絨毛、および血液を含む胎盤組織からの細胞等の他の周産期細胞からの細胞由来ECMの産生にも適用される。
一実施形態では、周産期細胞由来ECMは以下のプロセスによってin vitroで産生される。
(a)臍帯から細胞を単離する、
(b)単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種する、
(c)培養培地を細胞培養容器に添加する、および
(d)細胞を培養し、それにより細胞由来ECMを産生する、および
(e)必要に応じて細胞由来ECMを脱細胞化する。
一部の実施形態では、臍帯から単離された細胞は臍帯血および/またはWhartonのゼリーからのものである。
(a)臍帯から細胞を単離する、
(b)単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種する、
(c)培養培地を細胞培養容器に添加する、および
(d)細胞を培養し、それにより細胞由来ECMを産生する、および
(e)必要に応じて細胞由来ECMを脱細胞化する。
一部の実施形態では、臍帯から単離された細胞は臍帯血および/またはWhartonのゼリーからのものである。
別の実施形態では、周産期細胞由来ECMは以下のプロセスによってin vitroで産生される。
(a)胎盤組織から細胞を単離する、
(b)単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種する、
(c)培養培地を細胞培養容器に添加する、および
(d)細胞を培養し、それにより細胞由来ECMを産生する、および
(e)必要に応じて細胞由来ECMを脱細胞化する。
一部の実施形態では、胎盤組織から単離された細胞は、膜シート(羊膜および/または絨毛膜)、絨毛、および/または血液からのものである。
(a)胎盤組織から細胞を単離する、
(b)単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種する、
(c)培養培地を細胞培養容器に添加する、および
(d)細胞を培養し、それにより細胞由来ECMを産生する、および
(e)必要に応じて細胞由来ECMを脱細胞化する。
一部の実施形態では、胎盤組織から単離された細胞は、膜シート(羊膜および/または絨毛膜)、絨毛、および/または血液からのものである。
本発明の一態様では、臍帯から単離された細胞からin vitroで得られた細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)が開示される。一部の実施形態では、臍帯から単離された細胞は、臍帯血および/またはWhartonのゼリーからのものである。
本発明の別の態様では、胎盤組織から単離された細胞からin vitroで得られた細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)が開示される。一部の実施形態では、胎盤組織から単離された細胞は、膜シート(羊膜および/または絨毛膜)、絨毛、および/または血液からのものである。
B.接着細胞を拡大/増殖する方法
B.接着細胞を拡大/増殖する方法
接着細胞を拡大/増殖する方法は、接着細胞を得て、これを本発明の羊水細胞由来ECMの存在下で培養するステップを含む。一部の実施形態では、接着細胞は哺乳動物の接着細胞である。細胞が直ちにまたは培養のある期間の後にコンフルエントな単層を形成することを可能にする任意の播種密度を用いてよい。一部の実施形態では、播種密度は約10細胞/cm2~約100,000細胞/cm2、または約100細胞/cm2~約75,000細胞/cm2、または約500細胞/cm2~約50,000細胞/cm2、または約500細胞/cm2~約10,000細胞/cm2、または約500細胞/cm2~約5,000細胞/cm2、または約500細胞/cm2~約2,500細胞/cm2、または約1,000細胞/cm2~約25,000細胞/cm2、または約2,000細胞/cm2~約10,000細胞/cm2、または約3,000細胞/cm2~約5,000細胞/cm2である。種々の実施形態では、接着細胞は幹細胞、体細胞、前駆細胞、成熟細胞、および/または複数の胚葉由来の細胞である。
一部の実施形態では、接着細胞は幹細胞である。一部の実施形態では、幹細胞は多能性幹細胞(PSC)または間葉系幹細胞(MSC)である。多能性幹細胞(PSC)は自己再生して3つの胚葉、即ち外胚葉、内胚葉、および中胚葉のいずれかに分化することができ、これらから全ての組織および臓器が発育する。胚性幹細胞(ES)は、現在のところ唯一の公知の天然の多能性幹細胞である。人工多能性幹(iPSC)細胞もPSCである。iPSCは一般に成人組織または成人細胞から採取された細胞から誘導され、胚性幹細胞のレベルにまで再プログラミングされる。iPSCを産生する方法は当技術で公知である。間葉系幹細胞(MSC)は複能性間質細胞である。MSCは以下の非限定的な供給源、即ち骨髄、臍帯組織、たとえばWhartonのゼリー、臍帯血、脂肪組織、および羊水から得ることができる。一部の実施形態では、幹細胞は未分化の状態で維持され、その幹細胞性を維持する。
一部の実施形態では、接着細胞は植物性細胞としても知られる体細胞であり、これらは生殖細胞、配偶子、胚細胞、生殖母細胞、または未分化の幹細胞以外の多細胞生物中の任意の生物学的細胞である。
一部の実施形態では、接着細胞は、外胚葉、内胚葉、および/または中胚葉からの細胞を含む複数の胚葉由来の細胞である。
一部の実施形態では、接着細胞は、内皮前駆細胞(EPC)、血管芽細胞、膵前駆細胞、骨膜からの前駆細胞、および骨髄間質細胞を含むが、これらに限定されない前駆細胞である。
一部の実施形態では、接着細胞は、軟骨細胞および骨芽細胞を含むが、これらに限定されない成熟細胞である。
培養における接着細胞の増殖に好適な細胞培養技法は当技術で公知であり、それに従うことができる。細胞増殖のための好適な市販の培養培地は、Miltenyl Biotecから入手可能なStemMACS(商標)iPS-Brew XF、ウシ胎児血清、抗生剤-抗真菌剤(アンチ-アンチ)、および/またはGibcoから入手可能なGlutaMax(商標)を補充してもよいアルファ最小必須培地(aMEM)、ならびにウシ胎児血清、抗生剤-抗真菌剤(アンチ-アンチ)、GlutaMax、および/またはEGFおよびFGF等の成長因子を補充してもよいIscoveの改変ダルベッコ培地(IMDM)を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Rock阻害剤は使用しない。細胞が(たとえば、明視野顕微鏡法によって判定して)コンフルエンスに近づき始めれば、大きなコロニーをより小さなコロニーに切断し、次いでこれらをディッシュから物理的に持ち上げて羊水細胞由来ECMの新たなプレートに配置して再播種することによって、細胞を手作業で継代することができる。この手順は無限に繰り返すことができる。一部の実施形態では、培養中の接着細胞を増殖させる方法が開示され、該方法は細胞を培養培地中で細胞由来細胞外マトリックス(ECM)の存在下で培養してそれにより接着細胞を増殖させるステップを含み、細胞由来ECMは羊水から単離された細胞からin vitroで得られる。
上記の接着細胞を拡大/増殖する方法は、他の周産期細胞由来ECMの存在下における培養における拡大/増殖する接着細胞の使用にも適用される。一部の態様では、培養中の接着細胞を増殖させる方法が開示され、該方法は接着細胞を培養培地中で細胞由来細胞外マトリックス(ECM)の存在下で培養してそれにより接着細胞を増殖させるステップを含み、細胞由来ECMは臍帯または胎盤組織から単離された細胞からin vitroで得られる。一部の実施形態では、臍帯から単離される細胞は臍帯血および/またはWhartonのゼリーからのものである。他の実施形態では、胎盤組織から単離される細胞は膜シート(羊膜および/または絨毛膜)、絨毛、および/または血液からのものである。C.幹細胞の分化を誘導する方法
幹細胞の分化細胞型への分化を誘導する方法が本明細書で開示され、該方法は分化培地中の細胞由来細胞外マトリックス(ECM)の存在下で幹細胞を培養するステップを含み、細胞由来ECM、即ち本発明の羊水細胞由来ECMは、羊水から単離された細胞からin vitroで得られる。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む。一部の実施形態では、コラーゲンアルファ-1(XVIII)のアイソフォームは、アイソフォーム2である。一部の実施形態では、アグリンのアイソフォームは、アイソフォーム6である。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、デコリン、ペルレカン、またはコラーゲン(III)を含まない。一部の実施形態では、羊水から単離された細胞は、幹細胞を含む。一部の実施形態では、細胞由来のECMは、脱細胞化される。幹細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)等の多能性幹細胞(PSC)または胚性幹細胞(ES)であってよい。幹細胞は間葉系幹細胞(MSC)であってよい。MSCは以下の非限定的な供給源、即ち骨髄、臍帯組織、たとえばWhartonのゼリー、臍帯血、脂肪組織、および羊水から得ることができる。一部の実施形態では、MSCは骨髄から得られる。一部の実施形態では、分化した細胞型は脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、または筋細胞であってよい。
幹細胞の分化細胞型への分化のための細胞培養技法は当技術で公知であり、それに従うことができる。種々の市販の分化培地が使用に適しており、特定の所望の分化細胞型に特異的であり得る。たとえば、脂肪生成性の分化培地は、FBS、IBMX、デキサメタゾン、インスリン、および/またはインドメタシンを含むDMEMを含み得る。別の例は、デキサメタゾンおよび/またはL-アスコルビン酸-2-リン酸を補充した成長培地であってよい骨芽細胞分化培地である。
上記の幹細胞の分化を誘導する方法は、分化培地中の他の周産期細胞由来ECMの存在下で培養する幹細胞の使用にも適用される。一部の態様では、幹細胞の、分化した細胞型への分化を誘導する方法が開示され、該方法は幹細胞を分化培地中で細胞由来細胞外マトリックス(ECM)の存在下で培養するステップを含み、細胞由来ECMは臍帯または胎盤組織から単離された細胞からin vitroで得られる。一部の実施形態では、臍帯から単離される細胞は臍帯血および/またはWhartonのゼリーからのものである。他の実施形態では、胎盤組織から単離される細胞は膜シート(羊膜および/または絨毛膜)、絨毛、および/または血液からのものである。
以下の実施例は、本発明のある非限定的な態様を実証するために含まれている。当業者であれば、以下の実施例で開示される技法は本発明の実施において良好に機能するように本出願人によって発見された技法を表していることが認識できよう。しかし、当業者には、本開示に照らして本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示した特定の実施形態において多くの変更が可能であり、同様または類似の結果が得られることが認識されよう。
(実施例1)羊水細胞由来ECMの産生
(実施例1)羊水細胞由来ECMの産生
以下の手順を用いて、4種の羊水細胞由来ECM(マトリックスA、マトリックスB、マトリックスC、およびマトリックスD)を作製した。4名のドナーの満期産(妊娠期間37週より長い)から収集した羊水から無菌的に単離した細胞を、フィブロネクチンでコーティングした組織培養処理済みフラスコに播種し、完全培地中、37℃、5%CO2および90%のRHで、インキュベーター内で培養した。完全培地は、アルファ最小必須培地(aMEM)プラス2mMのL-グルタミンプラス抗生剤-抗真菌剤プラス15%のウシ胎児血清であった。
3~4日目に、完全培地の半分をフラスコから吸引し、半分の新たな完全培地で置き換えた。フラスコを上記と同じ条件のインキュベーターに戻した。
7~8日目に、完全培地を培養フラスコから吸引し、誘導培地を補充した。フラスコを上記と同じ条件のインキュベーターに戻した。誘導培地は、完全培地プラス50mMのL-アスコルビン酸であった。
10~11日目に、誘導培地を培養フラスコから吸引し、フラスコ内で形成されたECMをリン酸緩衝食塩水(PBS)で1回洗浄した。次いでPBSをフラスコから吸引した。抽出緩衝液をフラスコに加え、室温で7~10分インキュベートしてそれぞれのECMから細胞を除去し、次いで抽出緩衝液をフラスコから吸引した。抽出緩衝液は、0.5%(v/v)のTRITON(登録商標)-X100および20mMの水酸化アンモニウム(NH4OH)を含むPBSであった。
細胞を除去したフラスコ中のECMのそれぞれをPBSで3回、滅菌水で1回洗浄し、次いで滅菌水をフラスコから吸引した。細胞を除去したフラスコ中の4種のECMを室温で乾燥させ、次いで4℃で保存した。
10倍の対物レンズを用いる倍率100倍での羊水細胞由来ECM(マトリックスB)の明視野画像の顕微鏡写真を図1に示す。トポグラフィー、接着、および剛性を示す羊水細胞由来ECM(マトリックスB)および骨髄細胞由来ECMの3つの代表的な40×40umの切片の原子間力顕微鏡写真を図2に示す。骨髄細胞由来および羊水細胞由来のECMは構造的にも物理的にも区別できる。骨髄細胞由来および羊水細胞由来のECMの接着および剛性(弾性率)の定量により、図3a(接着)および図3b(剛性)の散布図に示すように、骨髄ECMが羊水ECMより10倍剛性で、3倍非接着性であることが示され、ここでBMは骨髄細胞由来のECM、ADは羊水細胞由来のECM(マトリックスB)である。各点は独立した測定点を表す。
(実施例2)羊水細胞由来ECMの組成
(実施例2)羊水細胞由来ECMの組成
実施例1で産生された羊水細胞由来ECMのそれぞれの組成を、質量分析によって決定した。成分をそのスペクトルカウントおよび分子量とともに表2に列挙する。
(実施例3)羊水細胞由来ECM上でのiPSCの増殖
人工多能性幹細胞(iPSC)を、以下の手順を用いて実施例1の羊水細胞由来ECM(マトリックスB)上で培養して増殖させた。凍結保存された市販のiPSCを、37℃の水浴を用いて解凍した。細胞懸濁液を幹細胞増殖用の市販の培地(Miltenyi Biotec、MACS iPS Brew)の中に希釈し、培地2mL/ウェルを有する6ウェルプレート中のECM上にほぼ1,000細胞/cm2をを播種した。Rock阻害剤は使用しなかった。1日目に、培地の全体積を培養中の細胞から穏やかに吸引し、新鮮な培地で置き換えた。24時間ごとに全培地を新鮮な培地で置き換えた。細胞が(明視野顕微鏡法によって判定して)コンフルエンスに近づき始めれば、無菌の針を用いて大きなコロニーをほぼ100個のより小さなコロニーに切断し、次いでこれらを無菌の針でディッシュから物理的に持ち上げてECMの新たなプレートに配置して再播種することによって、細胞を手作業で継代した。この手順は無限に繰り返すことができる。
羊水細胞由来ECMおよび骨髄細胞由来ECM上におけるiPSCの0日目および2日目の培養を示す顕微鏡写真を図4に示す。
羊水細胞由来ECMおよび骨髄細胞由来ECMの存在下で培養したiPSCのiPSCコロニー成長曲線のプロットを図5に示す。
図4および図5に見られるように、iPSCは羊水細胞由来ECMの存在下での培養において増殖した一方、骨髄細胞由来ECMの存在下で培養したiPSCは成長しなかった。
別の研究で、iPSCを羊水細胞由来ECM(AFC-ECM)上に播種した。細胞を2回継代し、次いで遺伝子発現の解析のためにRNAを収集した。定量PCRを用いて遺伝子発現を決定した。AFC-ECM上で成長したiPSCは実験の経過の間、多能性を維持し、図6に示すように、コア多能性転写因子POU5F1(OCT4)、SOX2、およびNANOGの発現を維持していた。これらの研究の結果、羊水細胞由来ECMは多能性幹細胞の自己再生および増殖を支持することが示唆される。
(実施例4)羊水細胞由来ECM上における種々の細胞型の増殖
(実施例4)羊水細胞由来ECM上における種々の細胞型の増殖
骨髄、内皮前駆細胞(EPC)から得られた間葉系幹細胞(MSC)、および軟骨細胞を、標準的な市販の培地中、等しい播種密度で、羊水細胞由来ECM(AF-ECM)上、骨髄細胞由来ECM(BM-ECM)上、および組織培養プラスチック(TCP)上に播種した。MSCおよび軟骨細胞については、培地は15体積%のウシ胎児血清、1%の抗生剤-抗真菌剤(アンチ-アンチ)、および1%のGlutaMaxを補充したフェノールレッドを含まない改変されたアルファ最小必須培地(aMEM)であった。EPCについては、培地は20%のFBS、1%のアンチ-アンチ、1%のGlutaMax、および成長因子(EGFおよびFGF)を補充したIscoveの改変ダルベッコ培地(IMDM)であった。TCPと比較して2つのECM上で増加した増殖を示す顕微鏡写真を図7に示す。培養4日後の細胞の増殖を、図8a、図8b、および図8cの棒グラフで定量する。驚くべきことに、羊水細胞由来ECMは、骨髄細胞由来ECMと比較して(骨髄によって産生された)MSCの増加した増殖を支持する。さらに、図9は、それぞれの基材上で4日間培養した後のフローサイトメトリーによって測定したSSEA-4を発現するMSCのパーセンテージを示す。SSEA-4の発現は、羊水細胞由来ECM上での培養の後、他の基材と比較して上昇する。
(実施例5)羊水細胞由来ECM上で培養したMSCの分化
(実施例5)羊水細胞由来ECM上で培養したMSCの分化
ヒト骨髄から得られた間葉系幹細胞(MSC)を羊水細胞由来ECM(AFC-ECM)上に6×103細胞/cm2で播種し、成長培地中で14日間培養した。
細胞の脂肪生成分化効率を評価するため、培養液を7日目に脂肪生成性培地(10%のFBS、0.5mMのIBMX、10-6Mのデキサメタゾン、10μMのインスリン、および200μMのインドメタシンを含むDMEM)に移し、さらに10日間維持し、10%のホルマリンで室温で1時間固定し、次いでオイルレッドOで染色した。脂肪生成は分化した細胞をオイルレッドOで染色することによって検証される。オイルレッドOは、培養中におけるMSCの脂肪細胞への分化に続いて細胞内で形成される脂質液滴を染色(赤色染色)する。AFC-ECM上におけるMSCの脂肪生成分化を示す顕微鏡写真を図10に示す。
骨形成分化効率を評価するため、培養液を骨芽細胞分化培地(10-7Mのデキサメタゾン(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)および10-4MのL-アスコルビン酸-2-リン酸(Wako Chemicals、Richmond、VA)を補充した成長培地)に移し、さらに25日間維持し、10%のホルマリンで室温で1時間固定し、次いで1%の硝酸銀で染色(Von Kossa染色)した。骨形成は分化した細胞を1%の硝酸銀で染色することによって検証される。硝酸銀は、培養中におけるMSCの骨芽細胞への分化に続いて沈着する無機物を染色(暗染色)する。AFC-ECM上におけるMSCの骨形成分化を示す顕微鏡写真を図11に示す。この研究は、羊水細胞由来ECM上での培養において幹細胞を誘導して分化した細胞型に分化させることができることを実証している。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
羊水から単離された細胞からin vitroで得られた細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)。
(項目2)
ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む、項目1に記載の細胞由来のECM。
(項目3)
コラーゲンアルファ-1(XVIII)の前記アイソフォームが、アイソフォーム2であり、および/またはアグリンの前記アイソフォームが、アイソフォーム6である、項目2に記載の細胞由来のECM。
(項目4)
フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む、項目2または3のいずれか一項に記載の細胞由来のECM。
(項目5)
デコリン、ペルレカン、および/またはコラーゲン(III)を含まない、項目1から4のいずれか一項に記載の細胞由来のECM。
(項目6)
羊水から単離された前記細胞が、幹細胞を含む、項目1から5のいずれか一項に記載の細胞由来のECM。
(項目7)
脱細胞化されている、項目1から6のいずれか一項に記載の細胞由来のECM。
(項目8)
培養中の接着細胞を増殖させる方法であって、前記接着細胞を培養培地中で細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)の存在下で培養してそれにより前記接着細胞を増殖させるステップを含み、前記細胞由来のECMが、羊水から単離された細胞からin vitroで得られる、方法。
(項目9)
前記細胞由来のECMが、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む、項目8に記載の方法。
(項目10)
コラーゲンアルファ-1(XVIII)の前記アイソフォームが、アイソフォーム2であり、および/またはアグリンの前記アイソフォームが、アイソフォーム6である、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記細胞由来のECMが、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む、項目9または10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記細胞由来のECMが、デコリン、ペルレカン、および/またはコラーゲン(III)を含まない、項目8から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
羊水から単離された前記細胞が、幹細胞を含む、項目8から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記細胞由来のECMが、前記接着幹細胞と接触する前に脱細胞化される、項目8から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記接着細胞が、哺乳動物の接着細胞を含む、項目8から14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記接着細胞が、幹細胞、体細胞、前駆細胞、成熟細胞、または複数の胚葉由来の細胞を含む、項目8から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記接着細胞が、幹細胞を含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記幹細胞が、未分化の状態で維持されている、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記幹細胞が、多能性幹細胞(PSC)を含む、項目17または18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記PSCが、人工PSC(iPSC)を含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記PSCが、胚性幹細胞(ES)を含む、項目19に記載の方法。
(項目22)
前記幹細胞が、間葉系幹細胞(MSC)を含む、項目17または18のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記MSCが、骨髄から得られる、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記接着細胞が、前駆細胞を含む、項目16に記載の方法。
(項目25)
前記前駆細胞が、内皮前駆細胞を含む、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記接着細胞が、成熟細胞を含む、項目16に記載の方法。
(項目27)
前記成熟細胞が、軟骨細胞を含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
幹細胞の分化細胞型への分化を誘導する方法であって、分化培地中の細胞由来細胞外マトリックス(ECM)の存在下で前記幹細胞を培養するステップを含み、前記細胞由来ECMが、羊水から単離された細胞からin vitroで得られる、方法。
(項目29)
前記細胞由来のECMが、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
コラーゲンアルファ-1(XVIII)の前記アイソフォームが、アイソフォーム2であり、および/またはアグリンの前記アイソフォームが、アイソフォーム6である、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記細胞由来のECMが、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む、項目29または30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記細胞由来のECMが、デコリン、ペルレカン、および/またはコラーゲン(III)を含まない、項目28から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
羊水から単離された前記細胞が、幹細胞を含む、項目28から32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記幹細胞が、多能性幹細胞(PSC)を含む、項目28から33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記PSCが、人工PSC(iPSC)を含む、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記PSCが、胚性幹細胞(ES)を含む、項目34に記載の方法。
(項目37)
前記幹細胞が、間葉系幹細胞(MSC)を含む、項目28から33のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記MSCが、骨髄から得られる、項目22に記載の方法。
(項目39)
前記分化細胞型が、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、または筋細胞を含む、項目37または38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)をin vitroで産生する方法であって、
(a)羊水から細胞を単離するステップ、
(b)前記単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種するステップ、
(c)培養培地を前記細胞培養容器に添加するステップ、および
(d)前記細胞を培養し、それにより細胞由来のECMを産生するステップ、および
(e)必要に応じて前記細胞由来のECMを脱細胞化するステップ
を含む方法。
(項目41)
前記羊水からの前記単離された細胞が、幹細胞を含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記基材が、フィブロネクチンである、項目40または41に記載の方法。
(項目43)
前記細胞由来のECMが、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む、項目40から42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
コラーゲンアルファ-1(XVIII)の前記アイソフォームが、アイソフォーム2であり、および/またはアグリンの前記アイソフォームが、アイソフォーム6である、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記細胞由来のECMが、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む、項目43または44のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記細胞由来のECMが、デコリン、ペルレカン、および/またはコラーゲン(III)を含まない、項目40から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
羊水細胞由来細胞外マトリックス(AFC-ECM)であって、
(a)羊水から細胞を単離するステップ、
(b)前記単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種するステップ、
(c)培養培地を前記細胞培養容器に添加するステップ、および
(d)前記細胞を培養し、それにより前記AFC-ECMを産生するステップ、および
(e)必要に応じて前記AFC-ECMを脱細胞化するステップ
を含む方法によってin vitroで産生されたAFC-ECM。
(項目48)
前記羊水からの前記単離された細胞が、幹細胞を含む、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記基材が、フィブロネクチンである、項目47または48に記載の方法。
(項目50)
前記細胞由来のECMが、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む、項目47から49のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
コラーゲンアルファ-1(XVIII)の前記アイソフォームが、アイソフォーム2であり、および/またはアグリンの前記アイソフォームが、アイソフォーム6である、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記細胞由来のECMが、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む、項目50または51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記細胞由来のECMが、デコリン、ペルレカン、および/またはコラーゲン(III)を含まない、項目47から52のいずれか一項に記載の方法。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
羊水から単離された細胞からin vitroで得られた細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)。
(項目2)
ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む、項目1に記載の細胞由来のECM。
(項目3)
コラーゲンアルファ-1(XVIII)の前記アイソフォームが、アイソフォーム2であり、および/またはアグリンの前記アイソフォームが、アイソフォーム6である、項目2に記載の細胞由来のECM。
(項目4)
フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む、項目2または3のいずれか一項に記載の細胞由来のECM。
(項目5)
デコリン、ペルレカン、および/またはコラーゲン(III)を含まない、項目1から4のいずれか一項に記載の細胞由来のECM。
(項目6)
羊水から単離された前記細胞が、幹細胞を含む、項目1から5のいずれか一項に記載の細胞由来のECM。
(項目7)
脱細胞化されている、項目1から6のいずれか一項に記載の細胞由来のECM。
(項目8)
培養中の接着細胞を増殖させる方法であって、前記接着細胞を培養培地中で細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)の存在下で培養してそれにより前記接着細胞を増殖させるステップを含み、前記細胞由来のECMが、羊水から単離された細胞からin vitroで得られる、方法。
(項目9)
前記細胞由来のECMが、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む、項目8に記載の方法。
(項目10)
コラーゲンアルファ-1(XVIII)の前記アイソフォームが、アイソフォーム2であり、および/またはアグリンの前記アイソフォームが、アイソフォーム6である、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記細胞由来のECMが、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む、項目9または10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
前記細胞由来のECMが、デコリン、ペルレカン、および/またはコラーゲン(III)を含まない、項目8から11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
羊水から単離された前記細胞が、幹細胞を含む、項目8から12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記細胞由来のECMが、前記接着幹細胞と接触する前に脱細胞化される、項目8から13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記接着細胞が、哺乳動物の接着細胞を含む、項目8から14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記接着細胞が、幹細胞、体細胞、前駆細胞、成熟細胞、または複数の胚葉由来の細胞を含む、項目8から15のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
前記接着細胞が、幹細胞を含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記幹細胞が、未分化の状態で維持されている、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記幹細胞が、多能性幹細胞(PSC)を含む、項目17または18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記PSCが、人工PSC(iPSC)を含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記PSCが、胚性幹細胞(ES)を含む、項目19に記載の方法。
(項目22)
前記幹細胞が、間葉系幹細胞(MSC)を含む、項目17または18のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記MSCが、骨髄から得られる、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記接着細胞が、前駆細胞を含む、項目16に記載の方法。
(項目25)
前記前駆細胞が、内皮前駆細胞を含む、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記接着細胞が、成熟細胞を含む、項目16に記載の方法。
(項目27)
前記成熟細胞が、軟骨細胞を含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
幹細胞の分化細胞型への分化を誘導する方法であって、分化培地中の細胞由来細胞外マトリックス(ECM)の存在下で前記幹細胞を培養するステップを含み、前記細胞由来ECMが、羊水から単離された細胞からin vitroで得られる、方法。
(項目29)
前記細胞由来のECMが、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
コラーゲンアルファ-1(XVIII)の前記アイソフォームが、アイソフォーム2であり、および/またはアグリンの前記アイソフォームが、アイソフォーム6である、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記細胞由来のECMが、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む、項目29または30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記細胞由来のECMが、デコリン、ペルレカン、および/またはコラーゲン(III)を含まない、項目28から31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
羊水から単離された前記細胞が、幹細胞を含む、項目28から32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記幹細胞が、多能性幹細胞(PSC)を含む、項目28から33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
前記PSCが、人工PSC(iPSC)を含む、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記PSCが、胚性幹細胞(ES)を含む、項目34に記載の方法。
(項目37)
前記幹細胞が、間葉系幹細胞(MSC)を含む、項目28から33のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記MSCが、骨髄から得られる、項目22に記載の方法。
(項目39)
前記分化細胞型が、脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、または筋細胞を含む、項目37または38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
細胞由来の細胞外マトリックス(ECM)をin vitroで産生する方法であって、
(a)羊水から細胞を単離するステップ、
(b)前記単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種するステップ、
(c)培養培地を前記細胞培養容器に添加するステップ、および
(d)前記細胞を培養し、それにより細胞由来のECMを産生するステップ、および
(e)必要に応じて前記細胞由来のECMを脱細胞化するステップ
を含む方法。
(項目41)
前記羊水からの前記単離された細胞が、幹細胞を含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記基材が、フィブロネクチンである、項目40または41に記載の方法。
(項目43)
前記細胞由来のECMが、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む、項目40から42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
コラーゲンアルファ-1(XVIII)の前記アイソフォームが、アイソフォーム2であり、および/またはアグリンの前記アイソフォームが、アイソフォーム6である、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記細胞由来のECMが、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む、項目43または44のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記細胞由来のECMが、デコリン、ペルレカン、および/またはコラーゲン(III)を含まない、項目40から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
羊水細胞由来細胞外マトリックス(AFC-ECM)であって、
(a)羊水から細胞を単離するステップ、
(b)前記単離した細胞を、細胞培養容器または基材でコーティングした細胞培養容器に播種するステップ、
(c)培養培地を前記細胞培養容器に添加するステップ、および
(d)前記細胞を培養し、それにより前記AFC-ECMを産生するステップ、および
(e)必要に応じて前記AFC-ECMを脱細胞化するステップ
を含む方法によってin vitroで産生されたAFC-ECM。
(項目48)
前記羊水からの前記単離された細胞が、幹細胞を含む、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記基材が、フィブロネクチンである、項目47または48に記載の方法。
(項目50)
前記細胞由来のECMが、ラミニン、コラーゲンアルファ-1(XVIII)、基底膜特異的ヘパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、アグリン、ビメンチン、およびコラーゲンアルファ-2(IV)、ならびに/またはそれらのアイソフォームを含む、項目47から49のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
コラーゲンアルファ-1(XVIII)の前記アイソフォームが、アイソフォーム2であり、および/またはアグリンの前記アイソフォームが、アイソフォーム6である、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記細胞由来のECMが、フィブロネクチンおよび/またはそのアイソフォームをさらに含む、項目50または51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記細胞由来のECMが、デコリン、ペルレカン、および/またはコラーゲン(III)を含まない、項目47から52のいずれか一項に記載の方法。
Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
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