JP2013541344A - 支持体への細胞の結合を調節するための方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図12
Description
本発明は、細胞が親和性を通常有さない又は低い親和性しか通常有さない支持体(substrate)へのこれらの細胞の接着を促進するための方法に関する。本発明は、非筋ミオシンII阻害剤ブレビスタチンの使用、及び表面に親和性を有さない又は低い親和性しか有さない細胞で被覆された少なくとも1つの前記表面を有する機器にさらに関係する。
現在使用されている(成体幹細胞を含めた)治療上の細胞の多くは、固定(anchorage)/付着に依存する様式で増殖させ、これは、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞(iPS)などの潜在的な代替物にもあてはまる。しかしながら、かかる増殖は、規模及び経済性の厳しい制限を本質的に伴う。細胞培養増殖のために、細胞は、細胞が数時間のうちに付着する平面の表面上に典型的に播種され、増殖させ、タンパク質分解酵素及び/又はカルシウム除去を用いて採取される。付着は、均一なプロセスではなく、むしろ特定のゾーン、いわゆる限局的な接着ゾーンを通して起こる。いったん接着すると、細胞は、内部モータータンパク質を用いて張力を発揮する。したがって、細胞骨格は、組織化され、輸送、足場及び細胞生存を含めた種々のプロセスにおいて機能する。細胞の付着を外すと、これらは、モータータンパク質によって内部張力の増加に応じて急速に収縮し、すでに組織化された内部構造物(細胞骨格他)が妨害される。表面に再付着できない場合、かかる細胞は、付着依存性アポトーシス/アノイキスと呼ばれている細胞死プログラムを開始することになる。
本発明の目的は、細胞が親和性を通常有さない又は低い親和性しか通常有さない支持体へのこれらの細胞の接着を促進するための方法を提供することである。
A:10μΜブレビスタチンでの処理は、細胞クラスター形成を防止するのに対して、対照細胞(DMSO、PBS)及び10μΜ未満のブレビスタチンで処理された細胞は、単一の凝集体を形成した。
B:生細胞を、色素排除アッセイ(ヨウ化プロピジウム)を使用して、FACSによって定量化した。対照培養物(DMSO、PBS)と対照的に、5μΜを超えるブレビスタチンで処理された細胞は、平面培養における細胞と同様のある程度の生存能力を示した(約90%)。ブレビスタチンの生存増大効果は、10μΜでピークに達し、ブレビスタチンのより高い及びより低い濃度の両方で減少する、濃度依存性と思われた。
C:アポトーシス細胞を、アネキシンVアッセイ(ヨウ化プロピジウム)を使用して、FACSによって定量化した。対照培養物(DMSO、PBS)と対照的に、10μΜブレビスタチンで処理された細胞は、アポトーシスに対して保護された。
A)DMSO対照、
B)PBS対照、
C)10μΜ(−)ブレビスタチン。
USSCを、リペレント性のPTFE容器材料上で、10μΜ Bbで、3日間培養し、対照培養物と比較した。対照と比較して、ミオシン阻害下で著しく増大された細胞伸展が観察されたが、凝集体形成は観察されなかった。
浮遊培養における細胞生存を増大し、
浮遊培養における細胞凝集を減少させ、
さもなければ細胞培養に適さない支持体への付着及び支持体上での増殖を促進し、
特定の支持体への細胞の接着を調節するためのツールを提供し、
細胞転置の間、保護効果を有し、
細胞を凍結及び/又は解凍する間、細胞に及ぼす保護効果を有し、
細胞選別(例えばFACS)の間、保護効果を有し、
臍帯血及び骨髄MNC−単離物(一次組織)からの最初の細胞付着を改善し、
ミオシン阻害は、テフロン(登録商標)箔上での、BM−MSCの中程度の増大された播種及びCB−USSCの強い増大された付着をもたらし、
ミオシン阻害は、CB−USSCを有するテフロン(登録商標)上でのコンフルエントな成長につながり、
MSC−GM(無血清培地)における無血清条件下での播種は、ミオシン阻害によって、正に影響され、且つ
EGM2−MVにおける血清が低減された条件下での播種及び増殖は、ミオシン阻害によって、正に影響される。
Straight et al.:Science,2003,299,1743−1747
Walker,A.,Su,H.,Conti,M.A.,Adelstein,R.S.,Sato,N.:Nature Communications,2010,DCI:10.1038,ncomms1074
Claims (15)
- 支持体への細胞の接着を促進するための方法であって、細胞に非筋ミオシンII阻害剤ブレビスタチンを供給して、さもなければ細胞が十分な親和性を有さない表面に細胞が付着できるようにすることによって、支持体への細胞の接着が促進される方法。
- 前記支持体が、非固着性材料である又は少なくとも部分的に非固着性材料で被覆されている、請求項1に記載の方法。
- 前記非固着性材料が、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリフルオロエチレン(PFE)、ペルフルオロアルコキシ(PFA)、フッ素化エチレンプロピレン(FEP)、二酸化チタン化合物若しくは二酸化チタンを含む組成物、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記支持体が、医療機器、好ましくはステント、パッチ又は人工血管若しくは器官の表面である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記支持体が、複数のマイクロキャリアである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、付着依存性細胞、特に成体幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、浮遊培養条件下で増殖される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、血清が低減された培地又は無血清培地に懸濁される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、ブレビスタチンの存在下で凍結及び/又は解凍され、次いで前記支持体に接触させられる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞がさもなければ十分な親和性を有さない支持体への細胞の接着を促進するためのブレビスタチンの使用。
- 医療機器、好ましくはステント、パッチ又は人工血管若しくは器官の表面を、さもなければこの表面への親和性を有さない又は低い親和性しかを有さない細胞で被覆するためのブレビスタチンの使用。
- この表面への親和性を通常有さない又は低い親和性しか通常有さない細胞で被覆された少なくとも1つの表面を有する機器。
- 前記表面が、非固着性材料、好ましくはポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリフルオロエチレン(PFE)、ペルフルオロアルコキシ(PFA)、フッ素化エチレンプロピレン(FEP)、二酸化チタン化合物若しくは二酸化チタンを含む組成物、又はこれらの任意の組合せを含む、請求項12に記載の機器。
- 前記細胞が、付着依存性細胞、特に成体幹細胞、好ましくは間葉系幹細胞である、請求項12又は13に記載の機器。
- 医療機器、好ましくはステント、パッチ又は人工血管若しくは器官である、請求項12〜14のいずれか一項に記載の機器。
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