CN108350417A - 使用含有层粘连蛋白片段的培养基的细胞培养方法 - Google Patents

使用含有层粘连蛋白片段的培养基的细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种细胞培养方法，其特征在于，包含使用含有具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段的培养基培养细胞的步骤，不含在将细胞接种于培养容器之前将层粘连蛋白或层粘连蛋白片段包被于培养容器的步骤。通过本方法，与以往的使用预包被有层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的培养容器培养细胞的方法相比，能够以较少的层粘连蛋白片段使用量实现同等的培养效率。

Description

使用含有层粘连蛋白片段的培养基的细胞培养方法
技术领域
本发明涉及使用含有层粘连蛋白片段的培养基培养细胞的方法、及含有层粘连蛋白片段的细胞培养用培养基。
背景技术
人ES细胞、人iPS细胞等人多能干细胞在再生医疗中的应用在世界范围内受到关注。为了将人多能干细胞用于再生医疗，需要开发安全且稳定地培养这些干细胞并使其增殖的培养技术。
本发明人报道了：对人ES细胞所表达的整联蛋白的类型进行分析的结果是，α6β1整联蛋白是人ES细胞的主要的粘附受体，以及，人层粘连蛋白(特别是由α3β3γ2构成的层粘连蛋白332及由α5β1γ1构成的层粘连蛋白511)的重组蛋白作为人ES细胞的无饲养细胞培养基质有用(参照非专利文献1)。此外，本发明人报道了：通过使用层粘连蛋白511的E8片段(层粘连蛋白511E8)作为无饲养细胞培养基质，使以往难以实现的人多能干细胞的基于单个分散的传代培养成为可能(参照专利文献1、非专利文献2)。
目前，重组人层粘连蛋白511E8片段已有销售(商品名：iMatrix-511、Nippi.Inc.)，人层粘连蛋白511E8作为人ES细胞、人iPS细胞等人多能干细胞的培养基质开始迅速普及。但是，在以人层粘连蛋白511E8作为基质培养细胞时，需要在培养容器的表面大量预包被人层粘连蛋白511E8。因此，以往的方法存在培养成本提高的问题。此外，通常在包被培养基质时，将用磷酸缓冲液等制备的培养基质溶液添加到培养容器中并在约4℃～约37℃下孵育数小时至一晚的操作是必不可少的。因此，如果能够实现培养成本的降低和包被步骤的省略，则能够期待更广泛地利用人层粘连蛋白511E8作为多能干细胞的培养基质。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开公报第2011/043405号
非专利文献
非专利文献1：Miyazaki T，Futaki S，Hasegawa K，Kawasaki M，Sanzen N，Hayashi M，Kawase E，Sekiguchi K，Nakatsuji N，Suemori H.Recombinant humanlaminin isoforms can support the undifferentiated growth of human embryonicstem cells.Biochem.Biophys.Res.Commun.375：27-35，2008.
非专利文献2：Miyazaki T，Futaki S，Suemori H，Taniguchi Y，Yamada M，Kawasaki M，Hayashi M，Kumagai H，Nakatsuji N，Sekiguchi K，Kawase E.Laminin E8fragments support efficient adhesion and expansion of dissociated humanpluripotent stem cells.Nat Commun.3，1236.Doi：10.1038/ncomms2231，2012.
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于，提供一种与使用预包被有层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的培养容器培养细胞的以往的方法(预包被法)相比能够以较少的层粘连蛋白片段使用量实现同等的培养效率的细胞培养方法。
用于解决问题的方法
本发明为了解决上述课题而包含以下的发明。
[1]一种细胞培养方法，其特征在于，包含使用含有具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段的培养基培养细胞的步骤，不含在将细胞接种于培养容器之前将层粘连蛋白或层粘连蛋白片段包被于培养容器的步骤。
[2]根据前述[1]所述的细胞培养方法，其特征在于，将细胞接种于未预包被层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的培养容器并进行培养。
[3]根据前述[1]或[2]所述的细胞培养方法，其中，具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段为层粘连蛋白E8片段。
[4]根据前述[1]～[3]中任一项所述的细胞培养方法，其特征在于，培养基的层粘连蛋白片段浓度为如下浓度：在培养容器中的液量中，每1cm2该培养容器的培养面含有0.03μg～2μg的层粘连蛋白片段。
[5]根据前述[4]所述的细胞培养方法，其特征在于，培养基的层粘连蛋白片段浓度为如下浓度：在培养容器中的液量中，每1cm2该培养容器的培养面含有0.06μg～0.5μg的层粘连蛋白片段。
[6]根据前述[1]～[5]中任一项所述的细胞培养方法，其中，整联蛋白为整联蛋白α6β1、α6β4、α3β1、α7β1。
[7]根据前述[1]～[6]中任一项所述的细胞培养方法，其中，细胞为哺乳动物细胞。
[8]根据前述[7]所述的细胞培养方法，其中，细胞为哺乳动物细胞的干细胞或由该干细胞分化而得到的细胞。
[9]根据前述[8]所述的细胞培养方法，其中，细胞为多能干细胞。
[10]一种细胞培养用培养基，其特征在于，含有具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段。
[11]根据前述[10]所述的细胞培养用培养基，其中，层粘连蛋白片段浓度为0.15μg/ml～10μg/ml。
发明效果
根据本发明，可以提供与以往的预包被法相比能够以较少的层粘连蛋白片段使用量实现同等的培养效率的细胞培养方法。此外，可以提供用于这样的方法的细胞培养用培养基。本发明的细胞培养方法无需预先将层粘连蛋白片段包被于培养容器，因此能够缩短细胞培养操作所需要的时间。此外，能够降低层粘连蛋白片段的使用量，因此能够降低培养成本。进而，能够排除包被时的人为误差，能够提供不依赖于培养操作的熟练度的简便的培养方法。
附图说明
图1是示出将本发明的细胞培养方法中的人多能干细胞的培养基质浓度依赖性的粘附效率与预包被法进行比较的结果的图，(A)为H9人ES细胞的结果，(B)为253G1人iPS细胞的结果。
图2是示出本发明的细胞培养方法及预包被法中的人多能干细胞的粘附状态的图。
图3是示出将本发明的细胞培养方法中的人多能干细胞的增殖速度与预包被法进行比较的结果的图。
图4是示出本发明的细胞培养方法中的人多能干细胞的增殖状态的图。
具体实施方式
[细胞培养方法]
本发明的细胞培养方法为包含使用含有具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段(以下有时简记为“层粘连蛋白片段”)的培养基培养细胞的步骤、不含在将细胞接种于培养容器之前将层粘连蛋白或层粘连蛋白片段包被于培养容器的步骤的细胞培养方法。即，本发明的培养方法不需要在以往的预包被法中必需的、对培养容器进行包被的步骤。
本发明的培养方法中使用的培养容器没有特别限定，任意的培养容器都可以适当使用。具体而言，可列举：培养面没有进行任何包被的培养容器、培养面包被有培养基质(胞外基质)的培养容器、培养面实施过电荷处理等细胞粘附加工处理的培养容器等。本发明的培养方法中，优选使用未预包被层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的培养容器。未预包被层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的培养容器是指培养容器的培养面上未预包被层粘连蛋白(全长层粘连蛋白)及层粘连蛋白片段(全长层粘连蛋白的一部分)中的任一者的培养容器，包括培养面未进行任何包被的培养容器、包被有除层粘连蛋白及层粘连蛋白片段以外的培养基质的培养容器、培养面实施过电荷处理等细胞粘附加工处理的培养容器等。本发明的培养方法中使用的培养容器的材质、形状等没有特别限定，可以适当使用例如玻璃制或塑料制的培养皿、烧瓶、多孔板、培养玻片等。此外，还可以适当使用聚合物膜制的培养袋。
具体而言，本发明的培养方法可以是以下任一方法：
(a)将细胞悬浮于含有层粘连蛋白片段的培养基中而制备细胞悬浮液，将该细胞悬浮液接种于培养容器的方法；
(b)将细胞悬浮于不含层粘连蛋白片段的培养基中而制备细胞悬浮液，向该细胞悬浮液中添加层粘连蛋白片段后，将该细胞悬浮液接种于培养容器的方法；或
(c)将细胞悬浮于不含层粘连蛋白片段的培养基中而制备细胞悬浮液，将该细胞悬浮液接种于培养容器后，向培养基中添加层粘连蛋白片段的方法。
层粘连蛋白为由α链、β链及γ链这3条亚基链构成的异三聚体分子。已知α链有α1～α5这5种，β链有β1～β3这3种，γ链有γ1～γ3这3种，通过它们的组合，存在至少12种以上的异形体(本说明书中，例如将“层粘连蛋白α5β1γ1”记作“层粘连蛋白511”。其它异形体也同样来记载。)。本发明的培养方法中使用的层粘连蛋白片段只要是具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段即可。作为这样的层粘连蛋白片段，优选形成了异三聚体的层粘连蛋白片段。具体为α链、β链及γ链中的至少1条、优选至少2条、更优选全部3条链比全长短的层粘连蛋白片段。层粘连蛋白片段形成了异三聚体这一点可以通过将层粘连蛋白片段供于SDS-PAGE并检测条带数等来确认。层粘连蛋白片段具有整联蛋白结合活性这一点可以通过固相结合分析等来确认。
层粘连蛋白的来源没有特别限定，可以使用源自各种生物的层粘连蛋白。优选源自哺乳动物的层粘连蛋白。作为哺乳动物，可列举例如人、小鼠、大鼠、牛、猪等，没有限定。其中，特别优选使用源自人的层粘连蛋白。在为了得到人的再生医疗材料而培养人干细胞的情况下，需要满足从培养体系排除异源成分的无异源物质条件的培养环境，因此优选使用源自人的层粘连蛋白。
作为本发明的培养方法中使用的层粘连蛋白片段，从整联蛋白结合活性的强弱、作为重组蛋白的表达效率的观点出发，优选层粘连蛋白E8片段(以下记作“层粘连蛋白E8”。)。层粘连蛋白的E8是将小鼠层粘连蛋白111用弹性蛋白酶消化而得到的片段中被鉴定为具有强细胞粘附活性的片段(Edgar D.，Timpl R.，Thoenen H.The heparin-bindingdomain of laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth andneuronal survival.EMBO J.，3：1463-1468，1984.、Goodman SL.，Deutzmann R.，von derMark K.Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promotenonneuronal cell adhesion and spreading.J.Cell Biol.，105：589-598，1987.)。推定在用弹性蛋白酶对小鼠层粘连蛋白111以外的层粘连蛋白进行消化时也存在与小鼠层粘连蛋白111E8相当的片段，但还没有利用弹性蛋白酶将小鼠层粘连蛋白111以外的层粘连蛋白消化并分离、鉴定出E8片段的报告。层粘连蛋白E8是从α链的C末端片段除去球形结构域4及5后的片段(以下记作“α链E8”)、β链的C末端片段(以下记作“β链E8”)及γ链的C末端片段(以下记作“γ链E8”)形成了三聚体的片段，三聚体的分子量为约150～约170kDa。α链E8通常由约770个氨基酸构成，N末端侧的约230个氨基酸与三聚体形成有关。β链E8通常由约220～约230个氨基酸构成。γ链E8通常由约240～约250个氨基酸构成。本发明中使用的层粘连蛋白E8不要求为层粘连蛋白的弹性蛋白酶消化产物，只要为具有与小鼠层粘连蛋白111的E8同样的细胞粘附活性、具有同样的结构、具有同等程度的分子量的层粘连蛋白的片段即可。
层粘连蛋白片段可以为天然型，也可以为在维持其生物学活性的状态下1个或1个以上的氨基酸残基被修饰的修饰型。层粘连蛋白片段的制造方法没有特别限定，可列举例如下述方法：将由层粘连蛋白高表达细胞纯化而得到的全长层粘连蛋白用弹性蛋白酶等蛋白水解酶消化，对目标片段进行分取、纯化的方法；以重组蛋白形式来制造的方法等。从制造量、品质的均匀性、制造成本等观点出发，优选以重组蛋白形式来制造。
重组层粘连蛋白片段可以通过适当使用公知的基因重组技术来制造。作为重组层粘连蛋白片段的制造方法，例如可以通过下述方法制造：分别获取编码α链、β链及γ链的部分蛋白的DNA，将其分别插入到表达载体中，将得到的3种表达载体共导入到合适的宿主细胞中并使其表达，通过公知方法来纯化形成了三聚体的蛋白质。作为重组层粘连蛋白片段(层粘连蛋白E8)的制造方法，可列举例如Ido等(Ido，H et al.，J.Biol.Chem.282，11144-11154，2007.)的方法，但不限于该方法。编码构成主要的哺乳动物的层粘连蛋白的α链、β链、γ链的基因的碱基序列信息及各链的氨基酸序列信息可以由DDBJ、EMBL、GenBank等公知的数据库获得。需要说明的是，重组层粘连蛋白511E8正在以商品名iMatrix-511由Nippi.Inc.销售，可以适宜使用该市售品。
本发明的培养方法可以优选用于表达了层粘连蛋白结合性的整联蛋白的细胞的培养中。作为层粘连蛋白结合性的整联蛋白，可列举整联蛋白α6β1、α6β4、α3β1及α7β1。作为培养对象细胞，优选哺乳动物细胞，更优选哺乳动物的干细胞、及处于由干细胞向体细胞分化的过程中的细胞。干细胞包含成体干细胞、多能干细胞等。作为成体干细胞，可列举神经干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、心脏干细胞、肝脏干细胞、小肠干细胞等。作为多能干细胞，可列举ES细胞(胚胎干细胞)、iPS细胞(诱导多能干细胞)、mGS细胞(多能性生殖干细胞)、ES细胞与体细胞的融合细胞、MUSE细胞等。作为哺乳动物，可列举人、小鼠、大鼠、牛、猪等。其中，优选人。
例如，人ES细胞及人iPS细胞所表达的主要整联蛋白为整联蛋白α6β1，因此，本发明中，如果使用与整联蛋白α6β1的结合活性高的层粘连蛋白异形体的片段，则能够提供用于以维持多能干细胞的分化多能性(未分化性)的状态进行培养的有用的培养方法。作为与整联蛋白α6β1的结合活性高的层粘连蛋白异形体，可列举层粘连蛋白511、层粘连蛋白521、层粘连蛋白332、层粘连蛋白111(Matrix Biology25(2006)，189-197)。
例如，人神经前体细胞所表达的主要整联蛋白为整联蛋白α3β1或α7β1，因此，本发明中，如果使用与整联蛋白α3β1或α7β1的结合活性高的层粘连蛋白异形体的片段，则能够提供用于维持处于由多能干细胞向神经前体细胞分化的过程中的细胞或所建立的神经前体细胞的粘附和功能性的、有用的培养方法。作为与整联蛋白α3β1或α7β1的结合活性高的层粘连蛋白异形体，可列举层粘连蛋白111、层粘连蛋白211、层粘连蛋白511、层粘连蛋白521(J Neurosci Res.2006April；83(5)：845-856、Matrix Biology 25(2006)，189-197)。
例如，成肌细胞所表达的主要的整联蛋白为整联蛋白α7β1，因此，本发明中，如果使用与整联蛋白α7β1的结合活性高的层粘连蛋白异形体的片段，则能够提供用于维持处于由多能干细胞向成肌细胞分化的过程中的细胞或所建立的成肌细胞的粘附和功能性的、有用的培养方法。作为与整联蛋白α7β1的结合活性高的层粘连蛋白异形体，可列举层粘连蛋白111(J Cell Science 109，3139-3150(1996))。
例如，在心肌细胞的分化过程中，在分化初期阶段表达的主要的整联蛋白为整联蛋白α3β1和α6β1，随着分化的进行，主要的整联蛋白表达变成α7β1，因此，本发明中，如果在每个分化阶段分别使用与整联蛋白α3β1、α6β1、α7β1的结合活性高的层粘连蛋白异形体的片段，则能够提供用于维持处于由多能干细胞向心肌细胞分化的过程中的细胞或所建立的心肌细胞的粘附和功能性的、有用的培养方法。作为与整联蛋白α3β1、α6β1的结合活性高的层粘连蛋白异形体，可列举层粘连蛋白511、层粘连蛋白521、层粘连蛋白332，作为与整联蛋白α7(X2)β1的结合活性高的层粘连蛋白异形体，可列举层粘连蛋白211、层粘连蛋白111(Cardiovascular Research 47(2000)715-725)。
例如，角质形成细胞所表达的主要的整联蛋白为整联蛋白α6β4，因此，本发明中，如果使用与整联蛋白α6β4的结合活性高的层粘连蛋白异形体的片段，则能够提供用于维持处于由多能干细胞向角质形成细胞分化的过程中的细胞或所建立的角质形成细胞的粘附和功能性的、有用的培养方法。作为与整联蛋白α6β4的结合活性高的层粘连蛋白异形体，可列举层粘连蛋白332、层粘连蛋白511(The Journal of biological chemistry 287(22)，17975-17984，2012)。
需要说明的是，对于尚未进行详细的整联蛋白表达分析的细胞，在明确了在试管内或生物体内表达的层粘连蛋白异形体的情况下，也可以使用这些层粘连蛋白异形体的片段来提供用于维持细胞的粘附和功能性的有用的培养方法。例如，已经确认血管内皮细胞表达层粘连蛋白411及层粘连蛋白511、脂肪细胞表达层粘连蛋白411。因此认为，如果使用这些层粘连蛋白异形体的片段，则能够提供用于维持血管内皮细胞、脂肪细胞的粘附和功能性的有用的培养方法。
本发明的培养方法中使用的培养基没有特别限定，可以适当选择使用适合于培养对象细胞的培养的培养基。可以使用市售的培养基，也可以使用自制的培养基。培养基的层粘连蛋白片段浓度只要为能够以期望的粘附效率来培养培养对象细胞的浓度则没有特别限定。通常可以从以下浓度范围中选择，所述浓度范围为：在培养容器中的液量中，每1cm2该培养容器的培养面含有0.03μg～2μg的层粘连蛋白片段。优选为每1cm2培养面含有0.06μg～0.5μg的层粘连蛋白片段的浓度，更优选为每1cm2培养面含有0.1μg～0.25μg的层粘连蛋白片段的浓度。在此，如果将在培养容器中接种细胞时的液量设为例如200μl/cm2(培养面积)，则0.03μg/cm2～2μg/cm2相当于0.15μg/ml～10μg/ml，0.06μg/cm2～0.5μg/cm2相当于0.3μg/ml～2.5μg/ml，0.1μg/cm2～0.25μg/cm2相当于0.5μg/ml～1.25μg/ml。
本发明人已经确认：与预包被法相比，使用本发明的培养方法时，即使减少培养面的每单位面积的层粘连蛋白片段使用量，也可得到与预包被法同等的细胞粘附效率及细胞增殖速度(参照实施例)。因此，本发明的培养方法与以往的方法相比，不仅在培养时间的缩短、培养操作的简便性方面、而且在成本方面也是有利的方法。此外还有人指出，如果将细胞接种在预包被有层粘连蛋白片段的培养容器中，细胞会粘附于最初接触的层粘连蛋白片段，因此，细胞在培养面中的分布将变得不均匀。如果使用本发明的培养方法，则能够消除预包被法中的这种问题，能够使细胞均匀地分布于培养面。
本发明的第一实施方式包含：使用含有层粘连蛋白片段的培养基制备细胞悬浮液的步骤；将制备的细胞悬浮液接种于培养容器的步骤；和在适合于培养对象细胞的培养的条件下进行培养的步骤。
本发明的第二实施方式包含：使用不含层粘连蛋白片段的培养基制备细胞悬浮液的步骤；向制备的细胞悬浮液中添加层粘连蛋白片段的步骤；将添加有层粘连蛋白片段的细胞悬浮液接种于培养容器的步骤；和在适合于培养对象细胞的培养的条件下进行培养的步骤。
本发明的第三实施方式包含：使用不含层粘连蛋白片段的培养基制备细胞悬浮液的步骤；将制备的细胞悬浮液接种于培养容器的步骤；向接种后的细胞悬浮液中添加层粘连蛋白片段的步骤；和在适合于培养对象细胞的培养的条件下进行培养的步骤。
本发明的细胞培养方法中进行的细胞培养的各操作手法均是公知的，本领域技术人员可以容易地实施。
作为本发明的培养方法的一个实施方式，将培养人多能干细胞的情况示于以下。作为培养人ES细胞或人iPS细胞时的培养基，可列举TeSR-E8(商品名、STEMCELLTechnologies)、StemFitAK03N(商品名、味之素株式会社)、StemFitAK02N(商品名、味之素株式会社)、mTeSR1(商品名、STEMCELL Technologies)、TeSR2(商品名、StemCellTechnologies)、STEMPRO hESC SFM(商品名、ThermoFisher Scientific)、NutriStem(商品名、Stemgent)、PSGro-free Human iPSC/ESC Growth Medium(商品名、StemRD)、StemEZ(商品名、Cellagen Technology)、Essential 8(商品名、ThermoFisher Scientific)、PluriSTEM Human ES/iPS Medium(商品名、Millipore)、PeproGrow hESC Embryonic StemCell Media(商品名、PeproTech)、L7hPSC Media(商品名、Lonza)、StemMACS(商品名、Milteny Biotech)、HyCell-Stem Media(商品名、Hyclone)、DEF-CS 500(商品名、Cellartis)、S-Medium(商品名、DS Pharma Biomedical)、Repro XF(商品名、Reprocell)、StemSure hPSC MediumΔ(商品名、Wako)等。
(1)从与饲养细胞的共培养体系中回收人多能干细胞
向与饲养细胞(例如MEF)一起进行了共培养的人多能干细胞的培养皿(第3～5天)中添加细胞剥离液(例如灵长类ES细胞用细胞剥离液(ReproCELL RCHETP002、1mg/ml分散酶/DMEM-F12、10mg/ml胶原酶IV/DMEM-F12等)(例如1ml/60mm培养皿)，在37℃下进行5分钟恒温处理，将人多能干细胞和MEF剥离。将细胞转移到15ml离心管中，加入约10ml培养基，将细胞悬浮后，将管静置5分钟，仅使集落沉降。除去上清，将同样的操作重复2次以上，仅使人多能干细胞的集落沉降并将其回收。
(2)人多能干细胞向单个细胞状态的转变
使回收的人多能干细胞的集落分散成单个细胞。分散成单个细胞的方法没有特别限定，可列举例如下述方法等：用EDTA溶液对人多能干细胞集落进行恒温处理后，用移液枪冲洗数次，从而使其分散成单个细胞状态。
(3)人多能干细胞的无饲养细胞培养(预包被法)
将通过与饲养细胞进行共培养而制作的单个细胞状态的人多能干细胞、或从无饲养细胞培养中分散剥离出的单个细胞状态的人多能干细胞悬浮于含有10μM的ROCK抑制剂的培养基中，例如以达到约1×104～2×104个细胞/cm2(细胞数因培养基而异)的接种密度的方式接种于以0.5μg/cm2的浓度预包被有层粘连蛋白511E8的培养容器中。培养在适合于所使用的培养基的CO2浓度条件下进行，每天进行培养基更换或按照培养基使用说明书的指示进行培养基更换。
以细胞增殖而导致培养面不足或集落内明显出现死细胞为标准来进行传代操作。传代方法没有限定，在培养容器中用细胞分散剥离液(例如5mM EDTA溶液)在室温下进行约5～约8分钟恒温处理，将人多能干细胞分散剥离。处理时间可根据使用的培养基适当选择。冲洗数次而将细胞完全剥离后，加入培养基进行中和稀释，回收到离心管中进行离心分离(1000×g，3分钟)。利用新鲜培养基悬浮细胞后，接种在例如预包被有层粘连蛋白511E8的培养容器中。需要说明的是，预包被法中的培养基质不限于层粘连蛋白511E8。
(4)向本发明的培养方法的转变
在将与饲养细胞进行共培养或通过预包被法进行维持培养的人多能干细胞分散剥离后，悬浮于以约1.25μg/ml的浓度含有层粘连蛋白511E8的培养基中，向培养皿中以约200μl/cm2(培养面积)的液量、以达到约1×104～约2×104个细胞/cm2的接种密度的方式进行接种。接种细胞数可根据使用的培养基适当选择，不限于上述范围。细胞接种时，培养基中需要添加10μM的ROCK抑制剂，但培养基更换以后则不需要添加。培养在适合于使用的培养基的CO2浓度条件下进行，每天进行培养基更换或按照培养基使用说明书的指示进行培养基更换。需要说明的是，也可以使用不含层粘连蛋白片段的培养基制备细胞悬浮液，接种后按照最终浓度达到约1.25μg/ml的方式添加层粘连蛋白511E8溶液。需要说明的是，人多能干细胞优选以单个细胞状态进行接种，但不限于这种方式，也可以以混有细胞块的状态进行接种。
[培养基]
本发明提供含有具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段的细胞培养用培养基。可用于本发明的培养基的具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段及培养基的种类如上所述。培养基中所含的层粘连蛋白片段浓度通常从0.15μg/ml～10μg/ml的范围中选择，优选为0.3μg/ml～2.5μg/ml，更优选为0.5μg/ml～1.25μg/ml。通过使用本发明的培养基，在上述本发明的细胞培养方法中可以省略向培养基中添加层粘连蛋白片段来自制含有层粘连蛋白片段的培养基的步骤。此外，在上述本发明的细胞培养方法中，可以使用均匀的含有层粘连蛋白片段的培养基，从这一点而言，能够容易地进行培养细胞的品质管理。
实施例
以下通过实施例详细地说明本发明，但本发明不受这些例子限定。
[实验材料]
(1)胞外基质
iMatrix-511购自Nippi.Inc.(Nippi#892011)。层粘连蛋白521购自BioLamina公司(BioLamina#BLA-LN521-02)。玻连蛋白购自和光纯药(Wako#220-02041)。
(2)使用细胞
人ES细胞使用了购自National Stem Cell Bank的细胞株(H9)。人iPS细胞使用了京都大学iPS细胞研究所制作的253G1株。关于各细胞，在按照各机构推荐的与饲养细胞的共培养法进行维持培养后，进一步通过无饲养细胞培养法进行维持培养，将所得细胞分成通常的维持培养方法和本发明的培养方法(添加法)来进行培养。
[实施例1：本发明的细胞培养方法和预包被法中的、人多能干细胞的培养基质浓度依赖性的粘附效率的比较]
在预包被法中，按照最终包被浓度达到0～4μg/cm2的范围的方式将iMatrix-511、层粘连蛋白521及玻连蛋白各培养基质用杜氏PBS(Dulbecco’s PBS，DPBS)(Wako#045-29795)稀释，将溶液50μl加入到96孔微孔板(BD#351172)中，在37℃的CO2培养箱内静置3小时，由此进行预包被处理。另一方面，在本发明的细胞培养方法(以下记作“本发明的方法”。)中，在细胞传代时向细胞悬浮液中分别直接添加各培养基质溶液，不进行预包被处理。
细胞传代处理中，在预包被法条件下，向用TeSR-E8培养基进行维持培养的H9人ES细胞或253G1人iPS细胞中加入5mM EDTA/DPBS溶液，在室温下进行5～8分钟恒温处理，将细胞分散剥离成单个状态，对细胞数进行计数。细胞以达到5×104个细胞/cm2的接种密度的方式悬浮于各培养基(100μl)中，向预包被法的孔中添加10μM Y-27632，向本发明的方法的孔中添加10μM Y-27632并且按照最终iMatrix-511浓度达到0～2μg/cm2/100μl的方式添加iMatrix-511的储备液。24小时后除去培养上清，用温热的DMEM-F12培养基洗涤孔后，加入10％中性福尔马林缓冲液固定细胞10分钟。用100％乙醇处理10分钟后，将板完全干燥，用10％吉姆萨染色液(Giemsa’s solution)/90％MilliQ水将细胞染色1小时。将板用MilliQ水洗涤2次，完全风干后，加入1％SDS水溶液将细胞裂解，用酶标仪测定波长560nm的吸光度。
将结果示于图1的(A)及(B)。(A)为H9人ES细胞的结果，(B)为253G1人iPS细胞的结果。由图1(A)可知，在使用H9人ES细胞的情况下，在预包被法中，iMatrix-511(图中iM511)显示出与玻连蛋白(图中VN)同等以上、高于层粘连蛋白521(图中LM521)的最大细胞粘附。另一方面，在本发明的方法中，iMatrix-511显示出与预包被法同等的最大细胞粘附，而且在比预包被法低的浓度下显示出最大细胞粘附。此外，由图1(B)可知，在使用253G1人iPS细胞的情况下，在预包被法中，iMatrix-511显示出与玻连蛋白同等、高于层粘连蛋白521的最大细胞粘附。另一方面，在本发明的方法中，iMatrix-511显示出与预包被法同等的最大细胞粘附，而且在比预包被法低的浓度下显示出最大细胞粘附。
由这些结果可知，与预包被法相比，本发明的方法以更低浓度的层粘连蛋白片段有效地促进细胞粘附效果。
[实施例2：本发明的细胞培养方法和预包被法各自中的人多能干细胞的粘附状态]
对于实施例1的H9人ES细胞，用显微镜观察接种后第24小时的细胞粘附状态。预包被法中，在用培养基洗涤前对各培养基质1μg/cm2的孔进行观察，本发明的方法中，在用培养基洗涤前对各培养基质0.25μg/cm2的孔进行观察。
将结果示于图2。上段为预包被法的结果，下段为本发明的细胞培养方法的结果。标尺表示100μm。由图2可知，在本发明的方法中的iMatrix-511的情况下，H9人ES细胞显示出扁平的细胞粘附形态，在0.25μg/cm2的低浓度下，也显示与预包被法中的iMatrix-511的1μg/cm2同等的细胞粘附形态。另一方面，在层粘连蛋白521的情况下，在本发明的方法中得不到细胞粘附效果，呈存活的一部分聚集并漂浮的状态。
[实施例3：本发明的方法和预包被法的人多能干细胞的增殖速度的比较]
在预包被法中，将iMatrix-511的最终包被浓度固定在1μg/cm2。在本发明的方法中，按照达到每1cm2培养容器的培养面含有0.25μg的iMatrix-511的浓度的方式加入iMatrix-511的储备液。
向用TeSR-E8培养基进行维持培养的H9人ES细胞中加入5mM EDTA/DPBS溶液，在室温下恒温5分钟，将细胞分散剥离成单个状态，对细胞数进行计数。将细胞按照达到2×104个细胞/cm2的接种密度的方式制备细胞悬浮液，在预包被法中，加入10μM Y-27632后，向预包被后的培养容器中加入细胞悬浮液，在本发明的方法中，在加入iMatrix-511的储备溶液和10μM Y-27632后，向无包被的培养容器中加入细胞悬浮液。
将增殖速度图示于图3。由图3可知，预包被法的1μg/cm2和本发明的方法的0.25μg/cm2在显示同等的细胞粘附后细胞以相同的速度增殖。
对于用本发明的方法培养的H9人ES细胞的增殖状态，将第1天(培养开始日)～第4天每天一次用显微镜观察细胞，将所得的结果示于图4。标尺表示200μm。由图4可知，用本发明的方法培养的H9人ES细胞在培养过程中未发生细胞剥离，观察到稳定的粘附和增殖。由该结果可知，如果在本发明的方法中使用iMatrix-511，尽管iMatrix-511的使用量比预包被法少，但能够使细胞以与预包被法同样快的增殖速度进行增殖。
需要说明的是，本发明不受上述各实施方式及实施例限定，可在权利要求所示的范围内进行各种变更，将不同实施方式中分别公开的技术手段适当组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。此外，本说明书中记载的学术文献及专利文献全部以参考形式援引到本说明书中。

Claims (11)

1.一种细胞培养方法，其特征在于，包含使用含有具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段的培养基培养细胞的步骤，不含在将细胞接种于培养容器之前将层粘连蛋白或层粘连蛋白片段包被于培养容器的步骤。
2.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于，将细胞接种于未预包被层粘连蛋白或层粘连蛋白片段的培养容器并进行培养。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养方法，其中，具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段为层粘连蛋白E8片段。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞培养方法，其特征在于，培养基的层粘连蛋白片段浓度为如下浓度：在培养容器中的液量中，每1cm2该培养容器的培养面含有0.03μg～2μg的层粘连蛋白片段。
5.根据权利要求4所述的细胞培养方法，其特征在于，培养基的层粘连蛋白片段浓度为如下浓度：在培养容器中的液量中，每1cm2该培养容器的培养面含有0.06μg～0.5μg的层粘连蛋白片段。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的细胞培养方法，其中，整联蛋白为整联蛋白α6β1、α6β4、α3β1、α7β1。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的细胞培养方法，其中，细胞为哺乳动物细胞。
8.根据权利要求7所述的细胞培养方法，其中，细胞为哺乳动物细胞的干细胞或由该干细胞分化而得到的细胞。
9.根据权利要求8所述的细胞培养方法，其中，细胞为多能干细胞。
10.一种细胞培养用培养基，其特征在于，含有具有整联蛋白结合活性的层粘连蛋白片段。
11.根据权利要求10所述的细胞培养用培养基，其中，层粘连蛋白片段浓度为0.15μg/ml～10μg/ml。
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