JP2017085963A - ラミニンフラグメント含有培地を用いる細胞培養方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントを含む培地を用いて細胞を培養する工程を含み、細胞を培養容器に播種する前にラミニンまたはラミニンフラグメントを培養容器にコーティングする工程を含まないことを特徴とする細胞培養方法。
【選択図】なし
Description
[1]インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントを含む培地を用いて細胞を培養する工程を含み、細胞を培養容器に播種する前にラミニンまたはラミニンフラグメントを培養容器にコーティングする工程を含まないことを特徴とする細胞培養方法。
[2]ラミニンまたはラミニンフラグメントがプレコーティングされていない培養容器に細胞を播種して培養することを特徴とする前記[1]に記載の細胞培養方法。
[3]インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントが、ラミニンE8フラグメントである前記[1]または[2]に記載の細胞培養方法。
[4]培地のラミニンフラグメント濃度が、培養容器あたりの液量中に、該培養容器の培養面1cm2あたり0.03μg〜2μgのラミニンフラグメントを含有する濃度であることを特徴とする前記[1]〜[3]のいずれかに記載の細胞培養方法。
[5]培地のラミニンフラグメント濃度が、培養容器あたりの液量中に、該培養容器の培養面1cm2あたり0.06μg〜0.5μgのラミニンフラグメントを含有する濃度であることを特徴とする前記[4]に記載の細胞培養方法。
[6]インテグリンがインテグリンα6β1、α6β4、α3β1、α7β1である前記[1]〜[5]のいずれかに記載の細胞培養方法。
[7]細胞が哺乳動物細胞である前記[1]〜[6]のいずれかに記載の細胞培養方法。
[8]細胞が哺乳動物細胞の幹細胞または該幹細胞から分化した細胞である前記[7]に記載の細胞培養方法。
[9]細胞が多能性幹細胞である前記[8]に記載の細胞培養方法。
[10]インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントを含有することを特徴とする細胞培養用培地。
[11]ラミニンフラグメント濃度が、0.15μg/ml〜10μg/mlである前記[10]に記載の細胞培養用培地。
本発明の細胞培養方法は、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメント(以下、単に「ラミニンフラグメント」と記す場合がある)を含む培地を用いて細胞を培養する工程を含み、細胞を培養容器に播種する前にラミニンまたはラミニンフラグメントを培養容器にコーティングする工程を含まない細胞培養方法である。すなわち、本発明の培養方法は、従来のプレコーティング法では必須である培養容器にコーティングする工程が不要である。
(a)ラミニンフラグメント含有培地に細胞を懸濁して細胞懸濁液を調製し、当該細胞懸濁液を培養容器に播種する方法、
(b)ラミニンフラグメントを含有しない培地に細胞を懸濁して細胞懸濁液を調製し、当該細胞懸濁液にラミニンフラグメントを添加した後、当該細胞懸濁液を培養容器に播種する方法、または
(c)ラミニンフラグメントを含有しない培地に細胞を懸濁して細胞懸濁液を調製し、当該細胞懸濁液を培養容器に播種した後、培地にラミニンフラグメントを添加する方法、
のいずれの方法であってもよい。
本発明の第二の実施形態は、ラミニンフラグメントを含有しない培地を用いて細胞懸濁液を調製する工程と、調製した細胞懸濁液にラミニンフラグメントを添加する工程と、ラミニンフラグメントを添加した細胞懸濁液を培養容器に播種する工程と、培養対象細胞の培養に適して条件で培養を行う工程を含む。
本発明の第三の実施形態は、ラミニンフラグメントを含有しない培地を用いて細胞懸濁液を調製する工程と、調製した細胞懸濁液を培養容器に播種する工程と、播種後の細胞懸濁液にラミニンフラグメントを添加する工程と、培養対象細胞の培養に適して条件で培養を行う工程を含む。
本発明の細胞培養方法において行われる細胞培養の各操作手法はいずれも公知であり、当業者は容易に実施することができる。
フィーダー細胞(例えばMEF)と共培養しているヒト多能性幹細胞の培養ディッシュ(3〜5日目)に細胞剥離液(例えば、霊長類ES細胞用細胞剥離液(リプロセル RCHETP002、1mg/ml dispase/DMEM−F12、10mg/ml collagenaseIV/DMEM−F12など)を添加して(例えば1ml/60mmディッシュ)、37℃で5分間恒温処理し、ヒト多能性幹細胞とMEFを剥離する。細胞を15ml遠心チューブに移し、培地を約10ml入れて細胞を懸濁した後、5分間チューブを静置してコロニーのみを沈降させる。上清を除去し、同様の操作を2回以上繰り返して、ヒト多能性幹細胞のコロニーのみを沈降させ、回収する。
回収したヒト多能性幹細胞のコロニーを単一細胞に分散させる。単一細胞に分散させる方法は特に限定されないが、例えば、EDTA溶液でヒト多能性幹細胞コロニーを恒温処理した後、ピペットマンで数回フラッシングすることにより、単一細胞状態に分散させる方法等が挙げられる。
フィーダー細胞との共培養から作製した単一細胞状態のヒト多能性幹細胞、あるいはフィーダーフリー培養から分散剥離した単一細胞状態のヒト多能性幹細胞を、10μMのROCK阻害剤を含む培地に懸濁し、例えばラミニン511E8を0.5μg/cm2の濃度でプレコーティングした培養容器に、約1×104〜2×104cells/cm2(細胞数は培地に依存して異なる)の播種密度になるように播種する。培養は、用いた培地に適合するCO2濃度条件で行い、培地の交換は毎日または培地使用説明書の指示通りに行う。
フィーダー細胞との共培養またはプレコーティング法で維持培養しているヒト多能性幹細胞を分散剥離した後、ラミニン511E8を約1.25μg/mlの濃度で含有する培地に懸濁し、培養ディッシュに、約200μl/cm2(培養面積)の液量で、約1×104〜約2×104cells/cm2の播種密度になるように播種する。播種細胞数は、用いた培地に応じて適宜選択され、上記範囲に限定されない。培地には、細胞播種時に10μMのROCK阻害剤の添加が必要であるが、培地交換以後は添加を必要としない。培養は、用いた培地に適合するCO2濃度条件で行い、培地の交換は毎日または培地使用説明書の指示通りに行う。なお、ラミニンフラグメントを含有しない培地で細胞懸濁液を調製し、播種後にラミニン511E8溶液を最終濃度が約1.25μg/mlになるように添加してもよい。なお、ヒト多能性幹細胞は単一細胞状態で播種することが好ましいが、これに限定されず、細胞塊が混在した状態で播種してもよい。
本発明は、インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントを含有する細胞培養用培地を提供する。本発明の培地に使用できるインテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントおよび培地の種類は、上述のとおりである。培地に含まれるラミニンフラグメント濃度は、通常0.15μg/ml〜10μg/mlの範囲から選択され、0.3μg/ml〜2.5μg/mlであることが好ましく、0.5μg/ml〜1.25μg/mlであることがより好ましい。本発明の培地を用いることにより、上記本発明の細胞培養方法において、培地にラミニフラグメントを添加してラミニンフラグメント含有培地を自製する工程を省略することができる。また、上記本発明の細胞培養方法において、均質なラミニンフラグメント含有培地を使用できる点で、培養細胞の品質管理を容易に行うことが可能となる。
(1)細胞外基質
iMatrix−511は株式会社ニッピより購入した(Nippi #892011)。ラミニン521はBioLamina社より購入した(BioLamina #BLA-LN521-02)。ビトロネクチンは和光純薬より購入した(Wako #220-02041)。
ヒトES細胞は、National Stem Cell Bankより購入した株(H9)を使用した。ヒトiPS細胞は京都大学iPS細胞研究所が作製した253G1株を使用した。各細胞は、各機関が推奨するフィーダー細胞との共培養法に従って維持培養した後、更にフィーダーフリー培養法で維持培養した細胞を、通常の維持培養方法と本発明の培養方法(添加法)に分けて培養した。
プレコーティング法では、iMatrix−511、ラミニン521およびビトロネクチンの各培養基質を、最終コーティング濃度が0〜4μg/cm2の範囲になるようにDulbecco’s PBS(DPBS)(Wako #045-29795)で希釈し、溶液50μlを96ウェルマイクロプレート(BD #351172)に加え、37℃ CO2インキュベーター内で3時間静置することでプレコーティング処理を行った。一方の本発明の細胞培養方法(以下、「本発明の方法」と記す。)では、細胞継代時に細胞懸濁液に各培養基質溶液をそれぞれ直接添加し、プレコーティング処理は行わなかった。
細胞継代処理では、プレコーティング法条件でTeSR−E8培地を使用して維持培養しているH9ヒトES細胞または253G1ヒトiPS細胞に、5mM EDTA/DPBS溶液を加え、5〜8分間室温で恒温処理して細胞をシングル状態に分散剥離し、細胞数をカウントした。細胞は5×104cells/cm2の播種密度になるように各培地(100μl)に懸濁し、プレコーティング法のウェルには10μM Y−27632を添加、本発明の方法のウェルには10μM Y−27632と、最終iMatrix−511濃度が0〜2μg/cm2/100μlになるようにiMatrix−511のストック液を加えた。24時間後、培養上清を除いて、温めたDMEM−F12培地でウェルを洗浄した後、10%中性ホルマリン緩衝液を加えて10分間細胞を固定した。100%エタノールで10分間処理した後、プレートを完全に乾燥させ、10%Giemsa’s solution/90% MilliQ水で細胞を1時間染色した。プレートをMilliQ水で2回洗浄し、完全に風乾させた後、1%SDS水溶液を加えて細胞を可溶化し、マルチプレートリーダーを用いて波長560nmの吸光度を測定した。
これらの結果から、プレコーティング法よりも本発明の方法の方が、より低濃度のラミニンフラグメントで効率的に、細胞接着効果を促すことが明らかとなった。
実施例1のH9ヒトES細胞について、播種後24時間目の細胞接着の様子を顕微鏡で観察した。プレコーティング法は各培養基質1μg/cm2のウェルを、本発明の方法は各培養基質0.25μg/cm2のウェルを、培地で洗浄する前に観察した。
プレコーティング法では、iMatrix−511の最終コーティング濃度を1μg/cm2に固定した。本発明の方法では、培養容器の培養面1cm2あたり0.25μgのiMatrix−511を含有する濃度になるように、iMatrix−511のストック液を加えた。
TeSR−E8培地で維持培養しているH9ヒトES細胞に5mM EDTA/DPBS溶液を加え、5分間室温で恒温して細胞を単一状態に分散剥離し、細胞数をカウントした。細胞は2×104cells/cm2の播種密度になるように細胞懸濁液を調製し、プレコーティング法では10μM Y−27632を加えた後にプレコーティングした培養容器に、本発明の方法ではiMatrix−511のストック溶液と10μM Y−27632を加えた後にコーティング無し培養容器に、それぞれ細胞懸濁液を加えた。
本発明の方法で培養したH9ヒトES細胞の増殖の様子を、Day1(培養開始日)〜Day4まで、1日1回細胞を顕微鏡で観察した結果を図4に示した。スケールバーは200μmを示す。図4から明らかなように、本発明の方法で培養したH9ヒトES細胞は、培養途中で細胞の剥離が起きず、安定した接着と増殖が観察された。この結果から、本発明の方法においてiMatrix−511を用いれば、iMatrix−511の使用量がプレコーティング法より少なくて済むにもかかわらず、プレコーティング法と同等の高い増殖速度で細胞を増殖できることがわかった。
Claims (11)
- インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントを含む培地を用いて細胞を培養する工程を含み、細胞を培養容器に播種する前にラミニンまたはラミニンフラグメントを培養容器にコーティングする工程を含まないことを特徴とする細胞培養方法。
- ラミニンまたはラミニンフラグメントがプレコーティングされていない培養容器に細胞を播種して培養することを特徴とする請求項1に記載の細胞培養方法。
- インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントが、ラミニンE8フラグメントである請求項1または2に記載の細胞培養方法。
- 培地のラミニンフラグメント濃度が、培養容器あたりの液量中に、該培養容器の培養面1cm2あたり0.03μg〜2μgのラミニンフラグメントを含有する濃度であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 培地のラミニンフラグメント濃度が、培養容器あたりの液量中に、該培養容器の培養面1cm2あたり0.06μg〜0.5μgのラミニンフラグメントを含有する濃度であることを特徴とする請求項4に記載の細胞培養方法。
- インテグリンがインテグリンα6β1、α6β4、α3β1、α7β1である請求項1〜5のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 細胞が哺乳動物細胞である請求項1〜6のいずれかに記載の細胞培養方法。
- 細胞が哺乳動物細胞の幹細胞または該幹細胞から分化した細胞である請求項7に記載の細胞培養方法。
- 細胞が多能性幹細胞である請求項8に記載の細胞培養方法。
- インテグリン結合活性を有するラミニンフラグメントを含有することを特徴とする細胞培養用培地。
- ラミニンフラグメント濃度が、0.15μg/ml〜10μg/mlである請求項10に記載の細胞培養用培地。
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