ES2763433T3

ES2763433T3 - Aplicación de laminina a cultivos de células endoteliales de la córnea

Info

Publication number: ES2763433T3
Application number: ES14831100T
Authority: ES
Inventors: Noriko Koizumi; Naoki Okumura; Shigeru Kinoshita; Friedrich E Kruse; Ursula Schloetzer-Schrehardt
Original assignee: Senju Pharmaceutical Co Ltd; Doshisha Co Ltd; Kyoto Prefectural PUC
Current assignee: Senju Pharmaceutical Co Ltd; Doshisha Co Ltd; Kyoto Prefectural PUC
Priority date: 2013-11-27
Filing date: 2014-11-26
Publication date: 2020-05-28
Anticipated expiration: 2034-11-26
Also published as: JP2016539641A; JP6470286B2; RU2016125225A; EP3074508B1; CA2931280A1; JP2019054828A; JP2020188778A; RU2704984C1; MX2016006915A; EP3074508A1; BR112016011096A2; WO2015080297A1; US11624053B2; CN105814195A; US20170002318A1

Abstract

Uso de un agente seleccionado entre el grupo que consiste en laminina 511, laminina 521 o un fragmento de laminina 511-E8, que se expresa en células endoteliales de la córnea, en un procedimiento para promover in vitro el crecimiento de células endoteliales de la córnea.

Description

DESCRIPCIÓN

Aplicación de laminina a cultivos de células endoteliales de la córnea

Descripción detallada de la invención!

rCampo técnicol

La presente invención se refiere al uso de laminina como un componente para el cultivo o el crecimiento de cultivos de células endoteliales de la córnea.

Antecedentes de la técnica!

Las células endoteliales de la córnea humana están presentes a una densidad de aproximadamente 3000 células por milímetro cuadrado en el nacimiento. Sin embargo, una vez deterioradas, las células endoteliales de la córnea humana no tienen capacidad de regenerarse. Como tales, las células endoteliales de la córnea se consideran difíciles de cultivar. Debido al estado actual, en que es difícil cultivar o hacer crecer células endoteliales de la córnea en técnicas de trasplante, un tratamiento o cirugía sobre un endotelio de córnea es prácticamente imposible. Hay una escasez de donación de córneas en Japón, donde se llevan a cabo aproximadamente 1700 casos de trasplantes de córneas anualmente de forma ambulatoria en comparación con los aproximadamente 2600 pacientes en espera de trasplante de córnea.

IListado de citas!

Referencias de patentes!

[PTL1] Publicación japonesa abierta a consulta n.° 2011-78370

[PTL 2] Documento WO 2013/047763

[PTL 3] Documento WO 2011/024070

[PTL 4] Documento WO 2010/140464

Referencias no de patentes!

[NPTL 1] Journal of the Medical Society of Toho University Vol.56, N.° 1, Página. 39 (01.01.2009)

[NPTL 2] Nippon Ganka Gakkai Zasshi [Journal of Japanese Ophthalmological Society] Vol.105, edición extra, Página.196 (15.03.2001)

[NPTL 3] J Biol Chem. Sep 13, 2013. [Publicación electrónica antes de impresión]

[NPTL 4] PLoS One. 2013; 8(1):e53648. doi: 10.1371/journal.pone.0053648. Publicación electrónica Ene 7, 2013 [NPTL 5] Cell Adh Migr. Ene-Feb 2013; 7(1):142-9. doi: 10.4161/cam.22125. Publicación electrónica Oct 17, 2012 [NPTL 6] J Cell Biochem. Feb 15, 2007; 100(3):545-56.

rSumario de la invención!

Polución al problema!

Los inventores de la presente solicitud han consumado la presente invención descubriendo que una laminina específica es útil para el cultivo y el crecimiento de endotelios de la córnea. Por consiguiente, la presente invención representa los siguientes artículos representativos:

La presente invención se refiere al uso de un agente seleccionado entre el grupo que consiste en la laminina 511, la laminina 512, o el fragmento de laminina 511-E8 que se expresa en células endoteliales de la córnea en un procedimiento para promover el crecimiento de las células endoteliales de la córnea.

En una realización, las lamininas comprenden laminina 511 (alfa5 beta1 gamma1) y laminina 521 (alfa5 beta2 gamma 1).

En una realización, el fragmento de laminina tiene capacidad de adhesión celular de las células endoteliales de la córnea.

En una realización, las células endoteliales de la córnea son de ser humano.

En una realización, el agente está presente en un medio.

En una realización, el agente se reviste sobre un recipiente de cultivo.

Se desvela también en el presente documento:

(1) Una composición para cultivar o hacer crecer células endoteliales de la córnea, que comprende al menos un agente que consiste en lamininas y fragmentos de las mismas que se expresan en células endoteliales de la córnea.

(2) La composición de acuerdo con el artículo 1, en la que las lamiminas comprenden laminina 511 (alfa5 beta1 gammal) y laminina 512 (alfa5 beta2 gamma 1).

(3) La composición de acuerdo con el artículo 1 o 2, en la que los fragmentos promueven la capacidad de adhesión celular de las células endoteliales de la córnea.

(4) La composición de acuerdo con una cualquiera de los artículos 1-3, en la que el agente es laminina 511, laminina 521 o un fragmento de laminina 511-E8.

(5) La composición de acuerdo con una cualquiera de los artículos 1-4, en la que las células endoteliales de la córnea son de ser humano.

(6) Un medio para cultivar células endoteliales de la córnea, que comprende la composición de acuerdo con uno cualquiera de los artículos1-5.

(7) Un recipiente de cultivo para células endoteliales de la córnea, que se reviste con la composición de acuerdo con el artículo 1.

(8) Un procedimiento para cultivar células endoteliales de la córnea que comprende la etapa de utilizar la composición de acuerdo con uno cualquiera de los artículos 1-5.

(9) Un procedimiento para cultivar células endoteliales de la córnea que comprende la etapa de utilizar el medio de acuerdo con el artículo 6.

(10) Un procedimiento para cultivar células endoteliales de la córnea que comprende la etapa de utilizar el recipiente de acuerdo con el artículo 7.

rEfectos ventajosos de la invención!

La presente invención proporciona un componente que permite el cultivo, el mantenimiento, y el crecimiento de células endoteliales de la córnea (en particular, células endoteliales de la córnea humana).

[Breve descripción de los dibujos!

La Figura 1 es un diagrama que muestra la expresión del ARNm de diversas cadenas de laminina en células endoteliales de la córnea humana. El diagrama, desde la izquierda, muestra un marcador de pesos moleculares, una cadena a1, cadena a2, cadena a3, cadena a4, cadena a5, cadena p1, cadena p2, cadena p3, cadena p4, cadena y1, cadena y2, y cadena y3 de la laminina.

La Figura 2 muestra la expresión del ARNm de diversas cadenas de integrina en células endoteliales de la córnea humana. La hilera superior, desde la izquierda, muestra la cadena a1, cadena a2, cadena a3, cadena a4, cadena a5, cadena a6, cadena a7, cadena a8, cadena a9, cadena a10, cadena a11, cadena aE, cadena aV, y cadena aL de la integrina. La hilera inferior, desde la izquierda, muestra la cadena aM, cadena aX, cadena aD, cadena aIIb, cadena p1, cadena p2, cadena p3, cadena p4, cadena p5, cadena p6, cadena p7, y cadena p8 de la integrina. La Figura 3A-Figura 3C muestra en su conjunto el análisis de expresión de diversas cadenas de integrina en células endoteliales de la córnea humana mediante citometría de flujo. La Figura 3A muestra el análisis de expresión de diversas cadenas de integrina en células endoteliales de la córnea humana mediante citometría de flujo. La hilera superior, desde la izquierda, muestra las integrinas a1, a2, y a3. La hilera inferior, desde la izquierda, muestra las integrinas a4, a5, y a6.

La Figura 3B muestra también el análisis de expresión de diversas cadenas de integrina en células endoteliales de la córnea humana mediante citometría de flujo. La hilera superior, desde la izquierda, muestra las integrinas aE, aV, y aL. La hilera inferior, desde la izquierda, muestra las integrinas aM, aX, y aIIb (CD41a).

La Figura 3C muestra también el análisis de expresión de diversas cadenas de integrina en células endoteliales de la córnea humana mediante citometría de flujo. La hilera superior, desde la izquierda, muestra las integrinas aIIb (CD41b), p1, y p2. La hilera inferior, desde la izquierda, muestra las integrinas p3, p4, y p7.

La Figura 4 es una fotografía que muestra que la laminina 511 y la laminina 521 promueven la adhesión celular de las células endoteliales de la córnea humana. La hilera superior, desde la izquierda, muestra la laminina 511, la laminina 521, y la laminina 211. La hilera inferior, desde la izquierda, no muestra revestimiento, revestimiento de FNC, y revestimiento de gelatina. La escala es 50 pm.

La Figura 5 es una gráfica que muestra que la laminina 511 y la laminina 521 promueve la adhesión celular de las células endoteliales de la córnea humana. El eje y indica el número de células (% del control). El eje x, desde la izquierda, no indica revestimiento (control), laminina 511, laminina 521, laminina 211, revestimiento de FNC, revestimiento de gelatina, y fragmento 511-E8 de laminina.

La Figura 6 es una gráfica que muestra que un fragmento de laminina 511-E8 promueve la adhesión celular de las células endoteliales de la córnea humana. El eje y indica el número de células (% del control). El eje x, desde la izquierda, no indica revestimiento (control), cada concentración de fragmentos de laminina 511-E8 (en orden: 0,001 pg/cm2, 0,01 pg/cm2, 0,1 pg/cm2, 0,5 pg/cm2, 1,0 pg/cm2, y 1,5 pg/cm2), y la mezcla de revestimiento de FNC.

La Figura 7 es un gráfico que muestra que la laminina 511, la laminina 521, y los fragmentos de laminina 511-E8 promueven la adhesión celular de las células endoteliales de la córnea humana. El eje y indica el valor relativo (%) de la absorbancia de BrdU con respecto al control. El eje x, desde la izquierda, no indica revestimiento (control), laminina 511, laminina 521, laminina 211, mezcla de revestimiento de FNC, y fragmentos de laminina 511-E8 (desde la izquierda, 0,5 pg/cm2, 1,0 pg/cm2, y 1,5 pg/cm2).

La Figura 8 es una fotografía de un microscopio de contraste de fases en el día 2 del cultivo, que muestra que la laminina 511 y la laminina 521 potencian la eficacia de cultivar células endoteliales de la córnea. La parte superior izquierda muestra la laminina 511, la parte inferior derecha muestra la laminina 521, la parte inferior izquierda muestra la laminina 211, y la parte inferior derecha no muestra revestimiento. La barra indica 100 pm.

La Figura 9 es una fotografía de un microscopio de contraste de fases en el día 20 del cultivo, que muestran que la laminina 511 y la laminina 521 permiten cultivar células endoteliales de la córnea humana a una alta densidad. La parte superior izquierda muestra la laminina 511, la parte inferior derecha muestra la laminina 521, la parte inferior izquierda muestra la laminina 211, y la parte inferior derecha no muestra revestimiento. La barra indica 100 |jm.

La Figura 10 es una fotografía que muestra que la laminina 511 y la laminina 521 permiten cultivar células endoteliales de la córnea humana a una alta densidad celular. El colorante rojo indica Na+/K+-ATPasa y el colorante azul indica DAPI. La parte superior izquierda muestra la laminina 511, la parte inferior derecha muestra la laminina 521, la parte inferior izquierda muestra la laminina 211, y la parte inferior derecha no muestra revestimiento. La barra indica 100 jm .

La Figura 11 es una fotografía que muestra que la laminina 511 y la laminina 521 permiten cultivar células endoteliales de la córnea humana a una alta densidad celular. El colorante verde indica ZO-1 y el colorante azul indica DAPI. La parte superior izquierda muestra la laminina 511, la parte inferior derecha muestra la laminina 521, la parte inferior izquierda muestra la laminina 211, y la parte inferior derecha no muestra revestimiento. La barra indica 100 jm .

La Figura 12 es un gráfico que indica que la adhesión celular de una célula endotelial de la córnea humana está promovida incluso en un cultivo en el que la laminina 521 y el fragmento de laminina 511-E8 se añaden a un medio de cultivo. El eje y indica el número de células (% del control). El eje x, desde la izquierda, no indica revestimiento (control), cada concentración de laminina 521 (en orden: 1,0 jg /cm 2, 2,0 jg /cm 2y 4,0 jg/cm 2), cada concentración de los fragmentos de laminina 511-E8 (en orden: 1,0 jg /cm 2, 2,0 jg/cm 2 y 4,0 jg /cm 2), y la mezcla de revestimiento de FNC.

Descripción de las realizaciones!

La presente invención se describe a continuación. A lo largo de la presente memoria descriptiva, una expresión en forma singular debe entenderse como que abarca la forma plural del concepto salvo que se indique específicamente otra cosa. Por consiguiente, un artículo singular (por ejemplo, "un", "uno/a", "el/la" y similares en Inglés) debe entenderse que abarcan la forma plural del concepto salvo que se indique específicamente otra cosa. Además, los términos usados en el presente documento deben entenderse que se usan en el significado como convencionalmente se usa en la técnica salvo que se indique de forma específica otra cosa. Por consiguiente, a menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y la terminología científica específica utilizados en el presente documento utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la cual pertenece la presente invención. en el caso de una contradicción, prevalecerá la presente memoria descriptiva (incluyendo las definiciones).

(Definición)

Como se usa en el presente documento, "célula endotelial de la córnea" se usa en el significado que convencionalmente se usa en la técnica. La córnea es uno de los tejidos laminares que constituyen un ojo. La córnea es transparente y está localizada en la parte más próxima al entorno externo. En seres humanos, la córnea se considera como consistente en cinco capas, en orden desde el exterior (superficie del cuerpo), el epitelio de la córnea, la membrana de Bowman, la sustancia propia, la membrana de Descemet (membrana basal del endotelio de córnea), y el endotelio de córnea. En particular, salvo que se especifique otra cosa, las partes diferentes de las del epitelio y el endotelio pueden denominarse juntas como "estroma de la córnea" y se denominan como tales en el presente documento. Como se usa en el presente documento, "HCEC" es una abreviatura de células endoteliales de la córnea humana. Se entiende que para las células endoteliales usadas en la presente invención, se pueden usar células de origen natural, así como células diferenciadas a partir de un citoblasto, es decir, células inducidas por diferenciación a partir de IPS o similares.

Como se usa en el presente documento, "aislado" se refiere a un estado en el que la cantidad de materiales que se reúnen naturalmente en las células en un entorno normal es al menos reducida, y preferentemente un estado de estar prácticamente exentas de dichos materiales. Por consiguiente, una célula, tejido o similar aislada se refiere a una célula que está sustancialmente exenta de otros materiales (por ejemplo, otras células, proteínas, o ácidos nucleicos) que se reúnen en la célula en un entorno natural.

Como se usa en el presente documento, "formulación endotelial de la córnea" se refiere a cualquier formulación o agente medicinal que comprende el endotelio de córnea o una célula del endotelio de córnea. Debido a que se pueden formular las células endoteliales de la córnea que se producen y cultivan con un procedimiento de la presente invención, se puede fabricar una formulación/agente endotelial de la córnea usando células endoteliales de la córnea que se cultivan y producen con un procedimiento de la presente invención.

Como se usa en el presente documento, "matriz extracelular" se denomina también (ECM) y se refiere a un material que existe entre células somáticas, independientemente de si la célula es una célula epitelial o una célula no epitelial. Debido a que una matriz extracelular se produce generalmente por células, una matriz extracelular es un material biológico. Un dominio extracelular está implicado no solo en el tejido de apoyo sino también en la constitución del entorno interno necesario para la supervivencia de todas las células somáticas. Una matriz extracelular se produce generalmente a partir de células de tejido conectivo. Sin embargo, algunas son secretadas a partir de las propias células que tienen una membrana basal, tales como una célula epitelial o una célula endotelial. Una matriz extracelular se divide básicamente en componentes fibrosos y una matriz que rellena el espacio entre los componentes fibrosos. Los componentes fibrosos incluyen fibras de colágeno y fibras elásticas. El constituyente básico de la matriz es glucosamino glicano (mucopolisacárido ácido), cuya mayoría forma una macromolécula de proteoglicanos (complejo de mucopolisacárido ácido-proteína) mediante la unión con una proteína no de colágeno. Además, la matriz comprende laminina en la membrana basal, microfibrillas en la periferia de las fibras elásticas, fibras, y una glicoproteína tal como fibronectina sobre la superficie celular. la estructura básica es la misma en el tejido especializado. Por ejemplo, en el cartílago hialino, se produce una matriz de cartílago que comprende una cantidad característicamente grande de proteoglicanos por un condrioblasto, y en el hueso, se produce una matriz ósea en que tiene lugar la calcinosis por un osteoblasto. En este sentido, los materiales representativos que constituyen una matriz extracelular incluyen, aunque no de forma limitativa, colágeno I, colágeno III, colágeno IV, colágeno V, elastina, colágeno VIII, vitronectina, fibronectina, laminina, tromboespondina, y proteoglicanos (por ejemplo, decorina, biglicano, fibromodulina, lumicano, ácido hialurónico, agrecano y similares). Se pueden utilizar diversas matrices extracelulares que tienen un papel en la adhesión celular en la presente invención.

Como se usa en el presente documento, "laminina" es una proteína que constituye una membrana basal de una matriz extracelular. La laminina promueve multicelularidad a la construcción del tejido y el mantenimiento de la misma, la adhesión celular, la migración celular, y el crecimiento celular tienen una estrecha relación con las células cancerosas. Se considera que la laminina se va a expresar en un estadio temprano (estadio de 2 células). La laminina es un heterodímero que consiste en cada una de una cadena a, una cadena p y una cadena y. Para nombrar la laminina, se conoce la nomenclatura en el orden del descubrimiento (laminina-1, laminina-2, etc.). Sin embargo, debido a que no se considera la correspondencia con las subunidades, se emplea en el presente documento un nuevo procedimiento de denominación, en el que se describen conjuntamente el nombre de las subclases a, p, o y (un número de tres dígitos, a indica el dígito de las centenas, p indica el dígito de las unidades, y y indica el dígito de las unidades. en el caso de a1, p1 y y1, dicha laminina se denomina laminina 111. Para una laminina, se han descubierto cinco tipos de cadenas a, 3 tipos de cadenas p, y tres tipos de cadena y. Por consiguiente, el número máximo teórico de combinaciones es 5x3x3=45, y son posibles 45 tipos de moléculas de laminina. Sin embargo, se cree que no todas las combinaciones existen en la naturaleza. Cada subunidad se denomina LAMA1, LAMA2, LAMA3, LAMA4, o LAMA5 para una cadena a, LAMBI, LAMB2, o LAMB3 para una cadena p, y LAMC1, LAMC2, o LAMC3 para una cadena y. Las proteínas lamininas usadas en la presente invención pueden ser aquellas en forma natural o aquellas en una forma modificada en las que uno o más restos de aminoácidos están modificados reteniendo a la vez la actividad biológica, especialmente, la actividad de promoción de la adhesión celular. Además, las proteínas lamininas de la presente invención no están limitadas en el origen, el procedimiento de producción de las mismas o similares, siempre que la proteína laminina tenga las características descritas en el presente documento. Por consiguiente, las proteínas lamininas usadas en la presente invención pueden ser de cualesquiera proteínas de origen natural, proteínas expresadas a partir de un ADN recombinante mediante un procedimiento de ingeniería genética, o proteínas sintetizadas químicamente. El origen de las proteínas lamininas usadas en la presente invención no está particularmente limitado, pero se derivan preferentemente de un ser humano. Cuando se cultiva una célula humana con el fin de obtener un material médico, es preferible, aunque no de forma limitativa, usar una laminina obtenida de un ser humano a fin de evitar el uso de un material obtenido de otro animal.

Se conocen las moléculas de unión de la laminina. a1p1, a2p1, a2p2, a3p1, a6p1, a6p4, a7p1, a9p1, avp3, avp5, avp8 son integrinas conocidas como receptores de lamininas.

La siguiente Tabla describe las lamininas representativas y por tanto la explicación.

especificidad de unión de la integrina al sitio de expresión principal de la composición de laminina _________________________________________ (nombre)_________________________________________ a lp lY l (laminina-1)

a1p2Yl (laminina-3) ^{Tejido fetal}

a2p1Y1 (laminina-2)

a2p2Y1 (laminina-4) Músculos, nervios (células de Schwann) a2p1y3 (laminina-12)

a3p3Y2 (laminina-5)

a3p1Y1 (laminina-6) Piel, pulmón, y otro tejido epitelial

a3p2y1 (laminina-7)

a4p1Y1 (laminina-8)

a4p2Y1 (laminina-9) ^{Vaso sanguíneo}-esiHaa'áit

a5p1y1 (laminina-10) Vaso sanguíneo, hígado, pulmón, y otro tejido

a5p2y1 (laminina-11) epitelial a3¡Jl,cr6(Jl

Como se usa en el presente documento, "cadena a1(LAMA1) es una subunidad de una proteína laminina de una molécula de adhesión celular en una matriz extracelular, y se denomina LAMA1, LAMA, S-LAM-alfa, o similares. Para LAMA1 humana, las secuencias del gen y la proteína se registran como números de registro NCBI NM_005559 y NP_005550, respectivamente. OMIM se identifica con un número de registro 150320. cuando se usan para los fines del presente documento, se entiende que "cadena a l" o "LAMA1" significa no solo una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en el número de secuencia o el número de registro específico (o un ácido nucleico que codifica la proteína), sino también un derivado funcionalmente activo, un fragmento funcionalmente activo, o un homólogo del mismo, o un mutante codificado por un ácido nucleico que se hibrida a un ácido nucleico que codifica una proteína con una condición de rigor alta o baja.

Como se usa en el presente documento, "cadena a2(LAMA2) es una subunidad de una proteína laminina de una molécula de adhesión celular en una matriz extracelular, y se denomina LAMA2, LAMM, o similares. Para LAMA2 humana, las secuencias del gen y la proteína se registran como números de registro NCBI NM_000426 y NP_000417, respectivamente. OMIM se identifica con un número de registro 156225. cuando se usan para los fines del presente documento, se entiende que "cadena a2" o "LAMA2" significa no solo una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en el número de secuencia o el número de registro específico (o un ácido nucleico que codifica la proteína), sino también un derivado funcionalmente activo, un fragmento funcionalmente activo, o un homólogo del mismo, o un mutante codificado por un ácido nucleico que se hibrida a un ácido nucleico que codifica una proteína con una condición de rigor alta o baja.

Como se usa en el presente documento, "cadena a3" (LAMA3) es una subunidad de una proteína laminina de una molécula de adhesión celular en una matriz extracelular, y se denomina LAMA3, BM600, E170, LAMNA, LOCS, lama3a, o similares. Para LAMA3 humana, las secuencias del gen y la proteína se registran como números de registro NCBI NM_000227 y NP_000218, respectivamente. OMIM se identifica con un número de registro 600805. cuando se usan para los fines del presente documento, se entiende que "cadena a3" o "LAMA3" significa no solo una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en el número de secuencia o el número de registro específico (o un ácido nucleico que codifica la proteína), sino también un derivado funcionalmente activo, un fragmento funcionalmente activo, o un homólogo del mismo, o un mutante codificado por un ácido nucleico que se hibrida a un ácido nucleico que codifica una proteína con una condición de rigor alta o baja.

Como se usa en el presente documento, "cadena a4(LAMA4) es una subunidad de una proteína laminina de una molécula de adhesión celular en una matriz extracelular, y se denomina LAMA4, LAMA3, LAMA4M, CMD1JJ o similares. Para LAMA4 humana, las secuencias del gen y la proteína se registran como números de registro NCBI NM_001105206 y NP_001098676, respectivamente. OMIM se identifica con un número de registro 600133. cuando se usan para los fines del presente documento, se entiende que "cadena a4" o "LAMA4" significa no solo una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en el número de secuencia o el número de registro específico (o un ácido nucleico que codifica la proteína), sino también un derivado funcionalmente activo, un fragmento funcionalmente activo, o un homólogo del mismo, o un mutante codificado por un ácido nucleico que se hibrida a un ácido nucleico que codifica una proteína con una condición de rigor alta o baja.

Como se usa en el presente documento, "cadena a5(LAMA5) es una subunidad de una proteína laminina de una molécula de adhesión celular en una matriz extracelular, y se denomina LAMA5, KIAA1907, o similares. Para LAMA5 humana, las secuencias del gen y la proteína se registran como números de registro NCBI NM_005560 y NP_005551, respectivamente. OMIM se identifica con un número de registro 601033. cuando se usan para los fines del presente documento, se entiende que "cadena a5" o "LAMA5" significa no solo una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en el número de secuencia o el número de registro específico (o un ácido nucleico que codifica la proteína), sino también un derivado funcionalmente activo, un fragmento funcionalmente activo, o un homólogo del mismo, o un mutante codificado por un ácido nucleico que se hibrida a un ácido nucleico que codifica una proteína con una condición de rigor alta o baja.

Como se usa en el presente documento, "cadena p1(LAMB1) es una subunidad de una proteína laminina de una molécula de adhesión celular en una matriz extracelular, y se denomina LAMBI, CLM, LIS5, o similares. Para LAMBI humana, las secuencias del gen y la proteína se registran como números de registro NCBI NM_002291 y NP_002282, respectivamente. OMIM se identifica con un número de registro 150240. cuando se usan para los fines del presente documento, se entiende que "cadena p1" o "LAMB1" significa no solo una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en el número de secuencia o el número de registro específico (o un ácido nucleico que codifica la proteína), sino también un derivado funcionalmente activo, un fragmento funcionalmente activo, o un homólogo del mismo, o un mutante codificado por un ácido nucleico que se hibrida a un ácido nucleico que codifica una proteína con una condición de rigor alta o baja.

Como se usa en el presente documento, "cadena p2 (LAMB2) (laminina S) es una subunidad de una proteína laminina de una molécula de adhesión celular en una matriz extracelular, y se denomina LAMB2, LAMS, NPHS5, o similares. Para LAMB2 humana, las secuencias del gen y la proteína se registran como números de registro NCBI NM_002292 y NP_002283, respectivamente. OMIM se identifica con un número de registro 150325. cuando se usan para los fines del presente documento, se entiende que "cadena p2" o "LAMB2" significa no solo una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en el número de secuencia o el número de registro específico (o un ácido nucleico que codifica la proteína), sino también un derivado funcionalmente activo, un fragmento funcionalmente activo, o un homólogo del mismo, o un mutante codificado por un ácido nucleico que se hibrida a un ácido nucleico que codifica una proteína con una condición de rigor alta o baja.

Como se usa en el presente documento, "cadena p3(LAMB3) es una subunidad de una proteína laminina de una molécula de adhesión celular en una matriz extracelular, y se denomina LAMB3, BM600-125KDA, LAM5, LAMNB1, o similares. Para LAMB3 humana, las secuencias del gen y la proteína se registran como números de registro NCBI NM_000228 y NP_000219, respectivamente. OMIM se identifica con un número de registro 150310. cuando se usan para los fines del presente documento, se entiende que "cadena p3" o "LAMB3" significa no solo una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en el número de secuencia o el número de registro específico (o un ácido nucleico que codifica la proteína), sino también un derivado funcionalmente activo, un fragmento funcionalmente activo, un homólogo del mismo, o un mutante codificado por un ácido nucleico que se hibrida a un ácido nucleico que codifica una proteína con una condición de rigor alta o baja.

Como se usa en el presente documento, "cadena y1 (LAMC1) es una subunidad de una proteína laminina de una molécula de adhesión celular en una matriz extracelular, y se denomina LAMC1, LAMB2, o similares. Para LAMC1 humana, las secuencias del gen y la proteína se registran como números de registro NCBI NM_002293 y NP_002284, respectivamente. OMIM se identifica con un número de registro 150290. cuando se usan para los fines del presente documento, se entiende que "cadena y1" o "LAMC1" significa no solo una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en el número de secuencia o el número de registro específico (o un ácido nucleico que codifica la proteína), sino también un derivado funcionalmente activo, un fragmento funcionalmente activo, un homólogo del mismo, o un mutante codificado por un ácido nucleico que se hibrida a un ácido nucleico que codifica una proteína con una condición de rigor alta o baja.

Como se usa en el presente documento, "cadena y2 (LAMC2) es una subunidad de una proteína laminina de una molécula de adhesión celular en una matriz extracelular, y se denomina LAMC2, B2T, BM600, CSF, EBR2, EBR2A, LAMB2T, LAMNB2, o similares. Para LAMC2 humana, las secuencias del gen y la proteína se registran como números de registro NCBI NM_005562 y NP-005553, respectivamente. OMIM se identifica con un número de registro 150292. cuando se usan para los fines del presente documento, se entiende que "cadena y2" o "LAMC2" significa no solo una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en el número de secuencia o el número de registro específico (o un ácido nucleico que codifica la proteína), sino también un derivado funcionalmente activo, un fragmento funcionalmente activo, un homólogo del mismo, o un mutante codificado por un ácido nucleico que se hibrida a un ácido nucleico que codifica una proteína con una condición de rigor alta o baja.

Como se usa en el presente documento, "cadena y3 (LAMC3) es una subunidad de una proteína laminina de una molécula de adhesión celular en una matriz extracelular, y se denomina LAMC3, OCCM, o similares. Para LAMC3 humana, las secuencias del gen y la proteína se registran como números de registro NCBI NM_006059 y NP_006050, respectivamente. OMIM se identifica con un número de registro 604349. cuando se usan para los fines del presente documento, se entiende que "cadena y3" o "LAMC3" significa no solo una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en el número de secuencia o el número de registro específico (o un ácido nucleico que codifica la proteína), sino también un derivado funcionalmente activo, un fragmento funcionalmente activo, un homólogo del mismo, o un mutante codificado por un ácido nucleico que se hibrida a un ácido nucleico que codifica una proteína con una condición de rigor alta o baja.

Como se usa en el presente documento, "laminina expresada en células endoteliales de la córnea" se refiere a un tipo de gen de laminina que se expresa en un estado normal, o que se expresa preferentemente de forma significativa al nivel de la proteína, en células endoteliales de la córnea. a5, p1, p2, y y1 se confirma que se expresan mediante el análisis en el presente documento (Fig 2). Por consiguiente, se confirmó al menos que la laminina 511 y la laminina 521 se expresaban en células endoteliales de la córnea. Dev.Dyn.218, 213-234, 2000, y J.Biol.Chem. 277(15), 12741 12748, 2002 tienen una descripción detallada de la laminina 511. Para la laminina 511 o similares, es posible utilizar aquellas que están comercialmente disponibles. Por ejemplo, las proteínas recombinantes de laminina 511 y laminina 521 están comercialmente disponibles y obtenibles de BioLamina AB.

Como se usa en el presente documento, la "expresión" de un gen, polinucleótido, polipéptido o similar se refiere al gen o similar que se está sometiendo a un determinado efecto in vivo para estar en otra forma. Preferentemente, el término se refiere a un gen, polinucleótido o similar que se transcribe y traduce para estar en la forma de un polipéptido. Sin embargo, el gen, polinucleótido o similar que se transcribe para dar como resultado un ARNm puede estar en una forma de expresión. Aún preferentemente, dicha forma de polipéptido puede ser aquella que recibe el procesamiento tras la traducción (denominada como un derivado en el presente documento). Por ejemplo, Se puede determinar mediante cualquier procedimiento el nivel de expresión de cada cadena de laminina. De manera específica, el nivel de expresión de cada cadena de laminina puede encontrarse evaluando la cantidad de ARNm de cada cadena de laminina, la cantidad de proteína de cada cadena de laminina y la actividad biológica de la proteína de cada cadena de laminina. Se puede determinar la cantidad de ARNm o proteína de cada cadena de laminina mediante un procedimiento como se describe en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, "equivalente funcional" se refiere a cualquier cosa que la misma función prevista, pero una estructura diferente con respecto a la entidad sujeto original. Por consiguiente, se entiende que cuando se refiere a un "grupo que consiste en una laminina de cada cadena de laminina, o un equivalente funcional de la misma" o un "grupo que consiste en una laminina, cada cadena de laminina, y un equivalente funcional de la misma", lo siguiente está abarcado en lo anterior: una laminina o cada propia cadena de laminina, así como los fragmentos, mutantes o variantes de la laminina o cada cadena de laminina (por ejemplo, una variante de una secuencia de aminoácidos o similar) que tiene una o más capacidades de adhesión celular, regulación de la diferenciación y/o acción de promover el crecimiento sobre una célula del ojo o similar; y las sustancias que puedan cambiar en una laminina o en cada propia cadena de laminina, o un fragmento, mutante o variante de la laminina o de cada cadena de laminina en el momento de la acción (incluyendo, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una laminina o cada propia cadena de laminina, o un fragmento, mutante o variante de laminina o cada cadena de laminina y un vector, célula o similar que comprende dicho ácido nucleico). Un ejemplo representativo del "grupo que consiste en una laminina de cada cadena de laminina, o un equivalente funcional de la misma" o un "grupo que consiste en una laminina, cada cadena de laminina y un equivalente funcional de la misma" incluye al menos un agente seleccionado entre el grupo que consiste en la laminina y fragmentos de la misma. En la presente invención, se entiende que un equivalente funcional de una laminina o cada cadena de laminina puede usarse de forma similar a una laminina o cada cadena de laminina sin mención específica de la misma.

Como se usa en el presente documento, "fragmento" se refiere a un polipéptido o polinucleótido con una longitud de secuencia de 1 a n-1 con respecto a la longitud completa de un polipéptido o polinucleótido (longitud n). La longitud de un fragmento puede cambiarse de manera adecuada de acuerdo con el objetivo. Por ejemplo, Para un polipéptido, el límite inferior de la longitud del mismo incluye 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 y más aminoácidos. Además, las longitudes representadas por un número entero que no está específicamente relacionado en el presente documento (por ejemplo, el 11 y similares) puede también ser adecuada como límite inferior. Además, para un polinucleótido, el límite inferior de la longitud del mismo incluye 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 y más nucleótidos. Además, las longitudes representadas por un número entero que no está específicamente relacionado en el presente documento (por ejemplo, el 11 y similares) puede también ser adecuada como límite inferior. se entiende en el presente documento que los propios fragmentos de dicha cadena de laminina, cuando funcionan como un factor de actividad, por ejemplo, la promoción o el mantenimiento del crecimiento, están comprendidos en el alcance de la presente invención. De acuerdo con la presente invención, como se usa en el presente documento, el término "actividad" se refiere a una función de una molécula en el significado más amplio. La actividad abarca generalmente, aunque no se pretende que esté limitada a, la función biológica, la función bioquímica, la función física, o la función química de una molécula. la actividad abarca, por ejemplo, la actividad enzimática, la capacidad para interactuar con otra molécula y la capacidad de activar, promover, estabilizar, inhibir, suprimir, o desestabilizar una función de otra molécula, la estabilidad, y la capacidad de localizarse en una posición específica en una célula. Cuando sea aplicable, el término se dirige a una función de un complejo de proteína en el significado más amplio. Como se usa en el presente documento, la "función biológica", cuando se hace referencia a un gen o un ácido nucleico o polipéptido del anterior, se refiere a una función específica que el gen, ácido nucleico o polipéptido puede tener en un organismo vivo. "Función biológica" incluye, aunque no de forma limitativa, la creación de un anticuerpo específico, la actividad enzimática, que proporciona resistencia y similares. Como se usa en el presente documento, la función biológica puede ejercerse mediante la "actividad biológica". Como se usa en el presente documento, la "actividad biológica" se refiere a la actividad que un factor (por ejemplo, polinucleótido y proteína) puede tener en un organismo vivo, y la actividad que ejerce una variedad de funciones (por ejemplo, la actividad que promueve la transcripción) está abarcada en la misma. Por ejemplo, está abarcada también la actividad de activar o desactivar una molécula de la interacción con otra molécula. Cuando interactúan dos factores, la actividad biológica de los mismos puede pensarse como la unión de las dos moléculas y el cambio biológico resultante de las anteriores, por ejemplo, en el caso cuando se unen las dos moléculas, por ejemplo, las dos moléculas se unen si coprecipitan cuando se usa un anticuerpo contra una cualquiera de las moléculas. Por consiguiente, un procedimiento de determinación incluye observar dicha coprecipitación. Por ejemplo, cuando un factor es una enzima, la actividad biológica de la misma abarca la actividad enzimática de la misma. En otro ejemplo, cuando un factor es un ligando, está abarcada la unión a un receptor al cual se corresponde el ligando. Dicha actividad biológica puede medirse mediante una técnica bien conocida en la materia. Por consiguiente, "la actividad" se refiere a diversos indicadores medibles que indican o desvelan la unión (tanto de forma directa como indirecta) o una respuesta estimulada (es decir, que tiene un efecto medible en respuesta a alguna exposición o estimulación). Por ejemplo, "actividad" incluye un compuesto que se une a un polipéptido o polinucleótido de la presente invención, la cantidad de proteínas afectada en la dirección 5' o 3' tras alguna exposición o estimulación, o una medida de otra función análoga.

"funcionalmente activo" como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido, un fragmento o un derivado, que tiene función bioquímica, función de regulación, o función estructural de una proteína tal como actividad biológica de acuerdo con la realización asociada con el polipéptido, un fragmento o derivado, de la presente invención.

Como se usa en el presente documento, un "fragmento" de una laminina se refiere a cualquier fragmento de una laminina. Como un agente usado en la presente invención, se entiende que no solo la longitud completa de una laminina, sino también un fragmento de la laminina se puede usar siempre como el fragmento que tiene la función de la longitud completa de la laminina, particularmente, la capacidad de adhesión celular de una célula endotelial. Por consiguiente, un fragmento de una laminina usado en la presente invención generalmente tiene al menos una característica de la laminina. Dicha característica puede abarcar la capacidad de adhesión celular de una célula endotelial en particular.

Se describirá a continuación la secuencia de una laminina que se encuentra que se va a expresar en las células endoteliales de la córnea en la presente invención. Se entiende que estas lamininas indican los ejemplos representativos preferidos de la presente invención y la presente invención no está limitada a estos subtipos de laminina específicos.

Una secuencia de nucleótidos representativa de la cadena de la laminina a5 puede ser

(a) un polinucleótido que tiene la secuencia base descrita en la SEQ ID NO: 1 o un fragmento de secuencia de la misma;

(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma;

(c) un polinucleótido que codifica un polipéptido variante o un fragmento del mismo en el que uno o más aminoácidos tienen una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en una sustitución, adición y deleción en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 2, en la que un polipéptido variante tiene actividad biológica;

(d) un polinucleótido que es un mutante de alelo o un mutante de corte y empalme de la secuencia base descrita en la SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma;

(e) un polinucleótido que codifica una especie homóloga de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma;

(f) un polinucleótido que se hibrida con un polinucleótido de uno de (a)-(e) bajo condiciones rigurosas y codifica un polipéptido que tiene actividad biológica; o

(g) un polinucleótido que consiste en una secuencia base con una identidad de al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % con un polinucleótido de uno de (a) a (e) o una secuencia complementaria del mismo y codifica un polipéptido que tiene actividad biológica. En este sentido, la actividad biológica se refiere normalmente a la actividad de una cadena de laminina a5. Doi M y col., J.Biol.Chem. 277(15), 12741-12748, 2002 y la patente de Estados Unidos n.° 6.933.273 puede tomarse como referencia para las cadenas a5.

Una cadena de aminoácidos de una cadena de laminina a5 puede ser

(a) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma;

(b) un polipéptido que tiene actividad biológica y uno o más aminoácidos con una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en una sustitución, adición y deleción en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 2;

(c) un polipéptido codificado por un alelo mutante o un mutante de corte y empalme, de la secuencia base descrita en la SEQ ID NO: 1;

(d) un polipéptido que es una especie homóloga de la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 2; o (e) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % con un polipéptido de uno de (a) a (d). En este sentido, la actividad biológica se refiere normalmente a la actividad de una cadena de laminina a5. Doi M y col., J. Biol. Chem. 277(15), 12741-12748, 2002 y la patente de Estados Unidos n.° 6. 933. 273 puede tomarse como referencia para las cadenas a5.

Una secuencia de nucleótidos representativa de la cadena de la laminina p1 puede ser

(a) un polinucleótido que tiene la secuencia base descrita en la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de secuencia de la misma;

(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 4 o un fragmento de la misma;

(c) un polinucleótido que codifica un polipéptido variante o un fragmento del mismo en el que uno o más aminoácidos tienen una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en una sustitución, adición y deleción en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 4, en la que un polipéptido variante tiene actividad biológica;

(d) un polinucleótido que es un mutante de alelo o un mutante de corte y empalme de la secuencia base descrita en la SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma;

(e) un polinucleótido que codifica una especie homóloga de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 4 o un fragmento de la misma;

(g) un polinucleótido que consiste en una secuencia base con una identidad de al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % con un polinucleótido de uno de (a) a (e) o una secuencia complementaria del mismo y codifica un polipéptido que tiene actividad biológica. En este sentido, la actividad biológica se refiere normalmente a la actividad de una cadena de laminina p1. Pillarainen y col., J.Biol.Chem.262(22), 10454-10462, 1987 y la patente de Estados Unidos n.° 6.933.273 puede tomarse como referencia para las cadenas p1.

Una cadena de aminoácidos de una cadena de laminina p1 puede ser

(a) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 4 o un fragmento de la misma;

(b) un polipéptido que tiene actividad biológica y uno o más aminoácidos con una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en una sustitución, adición y deleción en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 4;

(c) un polipéptido codificado por un alelo mutante o un mutante de corte y empalme, de la secuencia base descrita en la SEQ ID NO: 3;

(d) un polipéptido que es una especie homóloga de la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 4; o (e) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % con un polipéptido de uno de (a) a (d). Pillarainen y col., J.Biol.Chem.262(22), 10454 10462, 1987 y la patente de Estados Unidos n.° 6.933.273 puede tomarse como referencia para las cadenas p1.

Una secuencia de nucleótidos representativa de la cadena de la laminina p2 puede ser

(a) un polinucleótido que tiene la secuencia base descrita en la SEQ ID NO: 5 o un fragmento de secuencia de la misma;

(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 6 o un fragmento de la misma;

(c) un polinucleótido que codifica un polipéptido variante o un fragmento del mismo en el que uno o más aminoácidos tienen una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en una sustitución, adición y deleción en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 6, en la que un polipéptido variante tiene actividad biológica;

(d) un polinucleótido que es un mutante de alelo o un mutante de corte y empalme de la secuencia base descrita en la SEQ ID NO: 5 o un fragmento de la misma;

(e) un polinucleótido que codifica una especie homóloga de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 6 o un fragmento de la misma;

(g) un polinucleótido que consiste en una secuencia base con una identidad de al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % con un polinucleótido de uno de (a) a (e) o una secuencia complementaria del mismo y codifica un polipéptido que tiene actividad biológica. En este sentido, la actividad biológica se refiere normalmente a la actividad de una cadena de laminina p2. Wewer UM y col., Genomics. 15 de nov, 1994; 24(2):243-52., 1987 y la patente de estados Unidos n.° 6.933.273 puede tomarse como referencia para las cadenas p2.

Una cadena de aminoácidos de una cadena de laminina p2 puede ser

(a) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 6 o un fragmento de la misma;

(b) un polipéptido que tiene actividad biológica y uno o más aminoácidos con una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en una sustitución, adición y deleción en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 6;

(c) un polipéptido codificado por un alelo mutante o un mutante de corte y empalme, de la secuencia base descrita en la SEQ ID NO: 5;

(d) un polipéptido que es una especie homóloga de la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 6; o (e) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % con un polipéptido de uno de (a) a (d). En este sentido, la actividad biológica se refiere normalmente a la actividad de una cadena de laminina p2. Wewer UM y col., Genomics. 15 de nov, 1994; 24(2):243-52., 1987 y la patente de estados Unidos n.° 6.933.273 puede tomarse como referencia para las cadenas a5.

Una secuencia de nucleótidos representativa de la cadena de la laminina y1 puede ser

(a) un polinucleótido que tiene la secuencia base descrita en la SEQ ID NO: 7 o un fragmento de secuencia de la misma;

(b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 8 o un fragmento de la misma;

(c) un polinucleótido que codifica un polipéptido variante o un fragmento del mismo en el que uno o más aminoácidos tienen una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en una sustitución, adición y deleción en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 8, en la que un polipéptido variante tiene actividad biológica;

(d) un polinucleótido que es un mutante de alelo o un mutante de corte y empalme de la secuencia base descrita en la SEQ ID NO: 7 o un fragmento de la misma;

(e) un polinucleótido que codifica una especie homóloga de un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 8 o un fragmento de la misma;

(g) un polinucleótido que consiste en una secuencia base con una identidad de al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % con un polinucleótido de uno de (a) a (e) o una secuencia complementaria del mismo y codifica un polipéptido que tiene actividad biológica. En este sentido, la actividad biológica se refiere normalmente a la actividad de una cadena de laminina y1. Pillarainen y col., J.Biol.Chem.263(14), 6751-6758, 1988 y la patente de Estados Unidos n.° 6.933.273 puede tomarse como referencia para las cadenas y1.

Una cadena de aminoácidos de una cadena de laminina y1 puede ser

(a) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 8 o un fragmento de la misma;

(b) un polipéptido que tiene actividad biológica y uno o más aminoácidos con una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en una sustitución, adición y deleción en la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 8;

(c) un polipéptido codificado por un alelo mutante o un mutante de corte y empalme, de la secuencia base descrita en la SEQ ID NO: 7;

(d) un polipéptido que es una especie homóloga de la secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 8; o (e) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % con un polipéptido de uno de (a) a (d). En este sentido, la actividad biológica se refiere normalmente a la actividad de una cadena de laminina y1. Pillarainen y col., J.Biol.Chem.263(14), 6751-6758, 1988 y la patente de Estados Unidos n.° 6.933.273 puede tomarse como referencia para las cadenas y1.

Como se usa en el presente documento, "proteína", "polipéptido", "oligopéptido" y "péptido" se usan de manera indistinta con el mismo significado, y se refieren a un polímero de una secuencia de aminoácidos de cualquier longitud. Este polímero puede ser una cadena lineal o una cadena ramificada, o una cadena cíclica. Los aminoácidos pueden ser naturales o no naturales, o pueden ser aminoácidos alterados. Este término puede abarcar también aquellos ensamblados en un complejo de una pluralidad de cadenas polipeptídicas. Este término abarca también un polímero de aminoácidos alterado natural o artificialmente. Dicha alteración abarca, por ejemplo, la formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra operación o alteración (por ejemplo, conjugación con un componente marcado). Esta definición abarca también, por ejemplo, un polipéptido que comprende uno o más análogos de aminoácidos (por ejemplo, que incluyen aminoácidos no naturales), compuestos análogos a péptidos (por ejemplo, peptoides) y otras alteraciones públicamente conocidas en el campo sujeto. Con respecto a la proteína de la presente invención (por ejemplo, cada cadena de laminina), un ADN que codifica cada gen de una cadena diana se incorpora en un vector adecuado, que se introduce en una célula eucariota o procariota usando un vector de expresión que se puede expresar en cualquier hospedador, y se deja que se expresa la cadena respectiva, obteniendo por tanto la proteína deseada. Las células hospedadoras que se pueden usar para expresar la laminina incluyen, sin limitación particular, células hospedadoras procariotas tales como ER. coli y bacillus subtilis, y células hospedadoras eucariotas tales como levaduras, hongos, células de insectos, plantas y células vegetales, y células de mamíferos. Los vectores construidos para expresar una cadena de laminina diana o similar se pueden introducir en la célula hospedadora anteriormente mencionada, usando una transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, una técnica de un cañón de partículas, precipitación con fosfato cálcico, el procedimiento del Agrobacterium, microinyección directa o similares. Vectores que comprenden células se hacen crecer en un medio de cultivo adecuado para producir las cadenas de laminina usadas en la presente invención, y las cadenas de laminina se purifican a partir de las células o del medio de cultivo, obteniendo por tanto cadenas de laminina o similares. La purificación puede llevarse a cabo usando cromatografía de exclusión molecular, HPLC, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de inmunoafinidad, o similares.

Como se usa en el presente documento, el "aminoácido" puede ser natural o no natural siempre que se cumpla el objetivo de la presente invención.

Como se usa en el presente documento, "polinucleótido", "oligopéptido" y "ácido nucleico" se usan de manera indistinta con el mismo significado, y se refieren un polímero de nucleótidos de cualquier longitud. Estos términos incluyen también "derivados de oligonucleótidos" o "derivados de polinucleótidos". El "derivado de oligonucleótido" o el derivado de polinucleótido" se refiere a un oligonucleótido o polinucleótido que incluye un derivado de nucleótido o en el que la unión entre nucleótidos es diferente entre la unión normal, y se usan de manera indistinta. Como para dicho oligonucleótido, lo siguiente se ilustra específicamente: 2' -O-metil-ribonucleótido; un derivado de oligonucleótido en el que la unión fosfodiéster en un oligonucleótido se convierte en una unión fosforotioato; un derivado de oligonucleótido en el que la unión fosfodiéster en un oligonucleótido se convierte en una unión de fosforamidita N3'-P5'; un derivado de oligonucleótido en el que la unión de la ribosa y el fosfodiéster en un oligonucleótido se convierten en una unión de péptido y ácido nucleico; un derivado de oligonucleótido en el que el uracilo en un oligonucleótido está sustituido por propinil uracilo en C5; un derivado de oligonucleótido en el que el uracilo en un oligonucleótido está sustituido por tiazol uracilo en C5; un derivado de oligonucleótido en el que la citosina en un oligonucleótido está sustituida por una propinil citosina en C5; un derivado de oligonucleótido en el que la citosina en un oligonucleótido está sustituida por citosina modificada con fenoxazina; un derivado de oligonucleótido en el que la ribosa en el ADN está sustituida por 2'-O-propilribosa; y un derivado de oligonucleótido en el que la ribosa en un oligonucleótido está sustituida por una 2'-metoxietoxi ribosa. A menos que se indique otra cosa, Se pretende que las secuencias de ácidos nucleicos específicas abarquen una variante alterada conservativamente (por ejemplo, para sustituir un codón degenerado) y una secuencia complementaria de la misma, de forma similar a las secuencias explícitamente indicadas. De manera específica, se puede conseguir un sustituto de un codón degenerado creando una secuencia en la que la tercera posición de uno o más codones seleccionas (o todos los codones) están sustituidos por una base mixta y/o un resto de desoxiinosina (Batzer y col., Nucleic Acid Res.19:5081(1991); Ohtsuka y col., J. Biol. Chem. 260: 2605-2608(1985); Rossolini y col., Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994)). Como se usa en el presente documento, "ácido nucleico" se usa de manera indistinta con el gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido, y polinucleótido. Como se usa en el presente documento, un "nucleótido" puede ser natural o no natural.

Como se usa en el presente documento, "gen" se refiere a un agente que define un rasgo genético. Normalmente, un gen se secuencia en un orden dado en un cromosoma. Un gen que define una estructura primaria de proteína se denomina un gen estructural, y un gen que afecta la expresión de la misma se denomina gen regulador. En el presente documento, "gen" puede referirse a "polinudeótido", "oligonudeótido" y "ácido nucleico".

Los aminoácidos pueden denominarse en el presente documento mediante códigos de tres letras públicamente conocidos de los mismos, o códigos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura bioquímica de la IUPAC-IUB. De forma similar, los nucleótidos pueden denominarse mediante códigos de una letra reconocidos generalmente. En el presente documento, la comparación de la similitud, identidad y homología de las secuencias de aminoácidos y secuencias de bases se calcula con los parámetros por defecto, y con una herramienta de análisis de secuencias, BLAST. Las búsquedas de identidad se realizan con, por ejemplo, BLAST 2.2.26 (presentado el 30 de octubre de 2011) de NCBI. Los valores de identidad usados en el presente documento se refieren a los valores alineados bajo condiciones por defecto usando el BLAST. Sin embargo, si se obtienen valores mayores debidos a cambios en los parámetros, el valor más alto se definirá por ser el valor para la identidad. Si la identidad se evalúa en una pluralidad de regiones, el valor más alto en las regiones se define por ser el valor de la identidad. La similitud es un valor numérico en el que aminoácidos similares se toman en consideración para el cálculo además de la identidad.

Como se usa en el presente documento, "polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas" se refiere a condiciones bien conocidas comúnmente usadas en el campo sujeto. Se entiende que se puede usar también, con respecto a la laminina usada en la presente invención, que aquella codificada por "polinucleótidos que se hibridan en condiciones rigurosas" con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos de las lamininas desveladas específicamente respectivas. Con un polinucleótido seleccionado entre los polinucleótidos de la presente invención usados como una sonda, el uso de una técnica de hibridación de colonias, una técnica de hibridación de placas o una técnica de hibridación mediante transferencia southern permite obtener dicho polinucleótido. De manera específica, significa un polinucleótido obtenido llevando a cabo la hibridación a 65 °C en presencia de NaCl de 0,7 a 1,0 M usando un filtro al cual se inmoviliza un ADN derivado de colonia o placa, y a continuación lavando el filtro en la condición de 65 °C con una solución SSC (solución salina-citrato de sodio) a una concentración de 0,1 a 2 veces (en la que la composición de la solución SSC de una concentración fría es cloruro de sodio 150 mM y citrato de sodio 15 mM). La hibridación puede llevarse a cabo de acuerdo con los procedimientos descritos en los documentos experimentales tales como Molecular Cloning 2a ed., Current Protocols in Molecular Biology, Suplemento 1-38, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Segunda Edición, Oxford University Press (1995). Aquí, las secuencias que comprenden solo una secuencia A o una secuencia T se excluyen preferentemente de las secuencias que se hibridan en condiciones rigurosas. Por lo tanto, los polipéptidos (por ejemplo, transtirretina) utilizados en la presente invención abarcan también un polipéptido codificado por una molécula que se hibrida en condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido específicamente descrito en la presente invención. Estas condiciones de rigor bajo incluyen llevar a cabo la hibridación durante 18 a 20 horas a 40 °C en un tampón que comprende formamida al 35 %, 5xSSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 5 mM, PVP al 0,02 %, BSA al 0,02 %, 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, y sulfato de dextrano al 10 % (peso/volumen); lavando 1 a 5 horas a 55 °C en un tampón que consiste en 2xSSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5mM, y SDS al 0,1 %; y lavando durante 1,5 horas a 60 °C en un tampón que consiste en 2xSSC, Tris-HCl 25 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM y SDS al 0,1 %.

Como para los equivalentes funcionales de la presente invención, se pueden usar aquellos en los que se insertan, sustituyen o eliminan uno o una pluralidad de aminoácidos, o se añaden a uno o ambos extremos en una secuencia de aminoácidos. En el presente documento, "uno o una pluralidad de aminoácidos se insertan, sustituyen o eliminan, o se añaden a uno o ambos extremos en una secuencia de aminoácidos" significa que la alteración se realiza mediante sustitución o similar de una pluralidad de aminoácidos que podría producirse naturalmente, mediante un procedimiento técnico bien conocido tal como mutagénesis dirigida a sitio, o mutación de origen natural.

Las secuencias de aminoácidos alteradas tales como cada cadena de laminina utilizada en la presente invención pueden ser aquellas en que, por ejemplo, 1 a 30, preferentemente de 1 a 20, más preferentemente 1 a 9, de forma aún más preferente 1 a 5, de forma particularmente preferente 1 a 2 aminoácidos se insertan, sustituyen, o eliminan, o añaden a uno o ambos extremos de los mismos. Las secuencias de aminoácidos alteradas pueden ser preferentemente dichas secuencias de aminoácidos que tienen una o una pluralidad (preferentemente, 1 o varias, o 1, 2, 3, o 4) sustituciones conservativas en la secuencia de aminoácidos de cada cadena o similar de laminina. En el presente documento, "sustitución conservativa" significa sustituir uno o una pluralidad de restos de aminoácidos con diferentes restos de aminoácidos químicamente similares de tal manera que no se alteren sustancialmente las funciones de la proteína. Por ejemplo, dichos casos pueden mencionarse cuando un resto hidrófobo dado se sustituye con otro resto hidrófobo, o cuando un resto polar dado se sustituye con otro resto polar que tiene la misma carga eléctrica. Los aminoácidos funcionalmente similares capaces de realizar dicha sustitución se conocen públicamente en el campo sujeto de cada aminoácido. Los ejemplos específicos de aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, valina, isoleucina, leucina, prolina, triptófano, fenilalanina, metionina y similares. Los ejemplos específicos de aminoácidos polares (neutros) incluyen glicina, serina, treonina, tirosina, glutamina, asparagina, cisteína y similares. Los ejemplos específicos de aminoácidos (básicos) que tienen una carga eléctrica positiva incluyen arginina, histidina, lisina y similares. Además, los ejemplos específicos de aminoácidos (ácidos) que tienen una carga eléctrica negativa incluyen asparagina ácida, ácido glutámico y similares.

Como se usa en el presente documento, "agente" puede ser, en un sentido amplio, cualquier sustancia o cualesquiera otros elementos (por ejemplo, energía tal como luz, radioactividad, calor y electricidad) siempre que la sustancia pueda usarse de forma intercambiable y pueda conseguir un objetivo previsto. Dichas sustancias incluyen, sin limitación, por ejemplo, una proteína, polipéptido, oligopéptido, péptido, polinucleótido, oligonucleótido, nucleótido, ácido nucleico (incluyendo, por ejemplo, ADN tal como ADN genómico y ADNc, ARN tal como ARNm), polisacáridos, oligosacáridos, lípidos, moléculas orgánicas con un bajo peso molecular(por ejemplo, hormonas, un ligando, un mensajero, moléculas orgánicas con un bajo peso molecular, moléculas sintetizadas mediante química combinatoria, molécula de bajo peso molecular que se puede utilizar como un medicamento (por ejemplo, un ligando de bajo peso molecular) y similares), y moléculas complejas de los mismos. Los agentes específicos de polinucleótidos incluyen normalmente, sin limitación, polinucleótidos que tienen complementariedad con una homología de secuencias dada para una secuencia del polinucleótido anteriormente mencionado (por ejemplo, 70 % o más de identidad de secuencias), un polipéptido análogo a un factor de transcripción que se une a una región promotora, y similares. Los agentes específicos de polipéptidos incluyen normalmente, sin limitación, un anticuerpo dirigido específicamente al polipéptido, o un derivado del mismo o un análogo del mismo (por ejemplo, un anticuerpo monocatenario), un ligando o receptor específico en un caso cuando el polipéptido es un receptor o un ligando, una matriz del mismo en un caso cuando el polipéptido es una enzima, y similares.

Como se usa en el presente documento, "cultivo" se refiere a células del sujeto en crecimiento, y en un sentido limitado, se refiere a un estado donde se mantiene la condición de las células sujeto, que podría de otra manera empeorar (por ejemplo, cuando el número de células no disminuirá sustancialmente). En un sentido limitado, el término se usa para tener el mismo significado que el mantenimiento del cultivo o el mantenimiento.

Como se usa en el presente documento, "crecimiento" se refiere a un estado donde el número de células aumenta.

Como se usa en el presente documento, "capacidad de crecimiento" se refiere a la capacidad de las células de crecer. A menos que se indique específicamente en el presente documento, un estado de crecimiento se refiere a la posibilidad de crecer en un estado estacionario. El "estado estacionario" se refiere a una condición normal para un organismo donde se mantiene la homeostasia del organismo vivo. Dicho estado puede determinarse fácilmente por los expertos en la materia. Por ejemplo, lo mencionado se puede confirmar mediante el análisis de la densidad celular, donde la densidad celular es casi constante sin cambio, o se reconoce la expresión de un marcador del crecimiento celular, o similar. Como se usa en el presente documento, "promoción del crecimiento" se refiere a un estado de crecimiento de una célula dada. Si una célula diana no creció al principio, el inicio de incluso un pequeño crecimiento correspondería a la promoción del crecimiento. Si una célula ya estaba creciendo y el nivel del crecimiento se mantuvo o se aumentó, y preferentemente aumentó, entonces esto correspondería a la promoción del crecimiento.

Como se usa en el presente documento, "citoblasto" se refiere a una célula que tiene la capacidad de diferenciarse en una pluralidad de sistemas de células (potencial multilinaje) y una capacidad de mantener el potencial multilinaje incluso después de la división celular (capacidad de autorenovación). Los citoblastos incluyen embriocitoblastos, células germinales, células IPS, citoblastos tisulares y similares. Las células endoteliales de la córnea que son el objetivo de la presente invención pueden ser células tales que se diferencian de citoblastos. La diferenciación de citoblastos en células endoteliales de la córnea puede conseguirse usando procedimientos públicamente conocidos en el campo sujeto.

Como se usa en el presente documento, "función celular normal" de la célula se refiere a una función que una célula posee originalmente cuando se trata de una célula específica tal como células endoteliales de la córnea. Con respecto a la célula endotelial de la córnea, dicha función incluye, sin limitación, ZO-1 y Na+/K+-ATPasa, capacidad adaptativa al trasplante de córnea (Matsubara M, Tanishima T: Wound-healing of the corneal endothelium in the monkey: a morphometric study, Jpn J Ophthalmol 1982, 26:264-273;

Matsubara M, Tanishima T: Wound-healing of corneal endothelium in monkey: an autoradiographic study, Jpn J Ophthalmol 1983, 27:444-450; Van Horn DL, Hyndiuk RA: Endothelial wound repair in primate cornea, Exp Eye Res 1975, 21:113-124 y Van Horn DL, Sendele Dd , Seideman S, Buco PJ: Regenerative capability of the corneal endothelium in rabbit and cat, Invest Ophthalmol Vis Sci 1977, 16:597-613), y similares.

ZO-1 y Na+/K+-ATPasa puede evaluarse observando la expresión de las proteínas por medios inmunitarios o a un nivel del ARNm tal como la RT-PCR. La confirmación de la expresión y/o la función de la Na+/K+-ATPasa y ZO-1 al mismo nivel que permite la confirmación de las células normales en cuanto a si las células sujetos tienen o no una función normal.

Como para la capacidad de adaptación al trasplante de córnea, se pueden llevar a cabo ensayos de implante de las células cultivadas mediante curetaje mecánico del endotelio de córnea como un modelo de queratopatía bullosa con animales experimentales tales como conejos. Sin embargo, debido a que las células endoteliales de la córnea de conejos crecen in vivo, no es posible negar la posibilidad de la cicatrización natural debido al crecimiento de las células endoteliales de la córnea de los hospedadores (Matsubara M, y col., Jpn J Ophthalmol 1982, 26:264-273; Matsubara M, y col., Jpn J Ophthalmol 1983, 27:444-450; Van Horn DL, y col., Exp Eye Res 1975, 21:113-124 y Van Horn DL, y col., Invest Ophthalmol Vis Sci 1977, 16:597-613). Por lo tanto, a fin de evaluar de forma más precisa la capacidad adaptativa al trasplante, es preferible evaluar el injerto en primates. Cuando se evaluó la capacidad adaptativa al trasplante en seres humanos, se evaluó la adaptabilidad en primates, tal como los monos comedores de cangrejos, después de al menos un mes, preferentemente al menos dos meses, más preferentemente al menos tres meses, aún de forma más preferente al menos seis meses, y además, aún más preferentemente al menos doce meses, por ejemplo. La confirmación de la capacidad adaptativa al trasplante en primates tales como monos son importante en la aplicación a seres humanos, en particular.

Como se usa en el presente documento, "BrdU" es una abreviatura de bromodesoxiuridina. Debido a que BrdU se incorpora como un análogo de dTTP en la síntesis del ADN, el ADN (del núcleo de la célula) en el que se incorpora el BrdU puede detectarse mediante un anticuerpo específico para BrdU que se incorpora en el ADN. Por consiguiente, BrdU se utiliza como un índice para mostrar una alta capacidad de crecimiento/capacidad de diferenciación.

Como se usa en el presente documento, "positivo para BrdU" se refiere a un estado donde un marcador celular, BrdU, se expresa en una célula diana.

Como se usa en el presente documento, "cultivos" se refiere a aquellos producidos cultivando células tales como el endotelio de córnea. Por consiguiente, "cultivos del endotelio de córnea" se refiere a los cultivos del endotelio de córnea, y la expresión se refiere normalmente a aquellos presentes en un estado diferente de los presentes in vivo. Los cultivos del endotelio de córnea obtenidos mediante procedimientos convencionales fueron problemáticos porque dichos cultivos tenían una capacidad de crecimiento baja y podrían llegar a transformarse fácilmente y perder las funciones (Peh GS, Beuerman RW, Colman A, Tan DT, Mehta JS (2011) Human corneal endothelial cell expansion for corneal endothelium transplantation: an overview. Transplantation 91: 811-819., Okumura N, Kay E, Nakahara M, Hamuro J, Kinoshita S, y col. (2013) Inhibition of TGF-p signaling enables human corneal endothelial cell expansion in vitro for use in regenerative medicine. PLoS One 8:e58000.). Por lo tanto, desde el punto de vista de los cultivos, dicha densidad celular podría no conseguirse para aquellos que se cultivaron durante un periodo de tiempo particularmente largo o aquellos que se subcultivaron. De manera específica, la densidad de las células endoteliales de la córnea disminuye fácilmente a lo largo del cultivo. La densidad endotelial de la córnea es uno de los índices más clínicamente importantes para el grado de salud. Por consiguiente, el cultivo a una alta densidad es importante desde el punto de vista de la medicina de regeneración. Además, es posible aumentar la densidad endotelial por adelantado y a continuación llevar a cabo la administración in vivo, que puede ser un agente terapéutico extremadamente importante. En este sentido, Es un hecho importante que la densidad celular que se disminuyó mediante un procedimiento de cultivo normal puede ahora aumentarse. El nivel normal del endotelio de córnea in vivo está comprendido en el intervalo de aproximadamente 2500-3000/mm2. La presente invención es ventajosa ya que la presente invención ha proporcionado una técnica para llevar la densidad celular de los cultivos al nivel anteriormente mencionado o para exceder el nivel.

Como se usa en el presente documento, "medio" se refiere a cualquier medio capaz de cultivar o hacer crecer las células endoteliales de la córnea, y el medio puede tomar cualquier forma, tal como medio líquido (medio de cultivo), medio de suspensión y medio sólido, según surja la necesidad y según sea adecuado. Los componentes para el medio usado para dichas células endoteliales de la córnea incluyen, por ejemplo, DMEM (GIBCO BRL), OptiMEM (Life Technologies), suero (por ejemplo, suero de feto de bovino (FBS), suero humano), factor de proliferación/factor de crecimiento (por ejemplo, b-FGF), sustancia antibiótica (por ejemplo, penicilina, estreptomicina, gentamicina) y similares.

Como se usa en el presente documento, "(cultivo) recipiente" se refiere a un recipiente para cultivar células endoteliales de la córnea. El tipo de recipientes de cultivo no está particularmente limitado, y se puede usar cualquier recipiente que se esteriliza para evitar la contaminación mediante bacterias y que son de cualquier material y de cualquier forma adecuada para cultivar células. Los ejemplos de dichos recipientes de cultivo incluyen, sin limitación, placas de cultivo, matraces de cultivo, cuencos de cultivo, placas de cultivo tales como de 96 pocillos, de 48 pocillos, de 12 pocillos, de 6 pocillos y de 4 pocillos, frascos de cultivo, usados generalmente en el campo sujeto.

(Técnicas generales)

La técnica de la biología molecular, la técnica bioquímica, los procesos microbiológicos usados en el presente documento son bien conocidos y se usan comúnmente en el campo sujeto, que se describe en, por ejemplo, Sambrook J. y col.(1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor y su 3a Ed.(20o1); Ausubel, F. M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F. M.(1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience;

Innis, M. A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F. M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F. M. (1995).Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M. A. y col. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F. M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, y las actualizaciones anuales; Sninsky, J. J. y col. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, Gait, M. J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M. J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R. L. y col. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. y col. (1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G. M. y col.(1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G. T. (1996). Bioconjugate Techniques, Academic Press, y BessatsuJikken Igaku "Idenshi Dounyu & Hatsugen Kaiseki Jikken Hou" Yodosha Co., Ltd., 1997. Con respecto a las células endoteliales de la córnea, el informe de Nancy Joyce y col., {Joyce, 2004 n.° 161} {Joyce, 2003 n.°.7} es bien conocido; sin embargo, como se ha mencionado anteriormente, la transformación de los fibroblastos es debida a un cultivo o subcultivo a largo plazo. Por consiguiente, los estudios de procedimientos de cultivo eficaces continúan aún actualmente.

Descripción de las realizaciones!

Se describirá a continuación la descripción de las realizaciones preferidas. Sin embargo, debe entenderse que las realizaciones son ejemplos de la presente invención y el alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones. Además, debe entenderse que los expertos en la materia pueden practicar fácilmente la modificación, alteración o similar comprendida en el alcance de la presente invención aunque en referencia a las siguientes realizaciones preferidas. Además, debe entenderse que cualquier realización puede combinarse.

En un aspecto, La presente invención proporciona el uso de un agente seleccionado entre el grupo que consiste en la laminina 511, laminina 521 o un fragmento de laminina 511-E8, que se expresa en células endoteliales de la córnea, en un procedimiento para promover el crecimiento de las células endoteliales de la córnea.

En una realización, las células endoteliales de la córnea son de ser humano.

En una realización, el agente está presente en un medio.

En una realización, el agente se reviste sobre un recipiente de cultivo.

Aunque un agente (laminina o similar) de la presente invención puede incluirse en un medio de cultivo para su uso, el agente puede revestirse sobre (o puede cubrir) una placa de cultivo para su uso. A fin de llevar a cabo un cultivo primario y/o un subcultivo de una célula diana, un medio adecuado (por ejemplo, se usa DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) u OptiMEM) y las células, que se recogen y separan, se siembran para el cultivo primario y se subcultivan en una placa de cultivo para el cultivo. En la presente invención, se puede obtener un buen resultado de crecimiento incluso con una cantidad de suero añadida a un medio que sea un 10 % menos. Asimismo, en la presente invención, además de una laminina o además de un revestimiento de una laminina, se puede añadir una citoquina (por ejemplo, un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)) a un medio como un aditivo. Un agente de la presente invención es útil en una célula aislada como se describe en los Ejemplos y en una célula endotelial inducida a partir de células iPS o ES. Además, se entiende que dicho agente es eficaz para la propia inducción.

La concentración de una laminina que se usa incluye, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 |jg a aproximadamente 500 jg/m l en una solución de medio de cultivo (por ejemplo, PBS). Para el revestimiento, una cantidad de aproximadamente 0,75 jg/cm 2 por unidad de área (por ejemplo, cm2) puede usarse para el revestimiento. para su uso en el tratamiento de un recipiente de cultivo, la cantidad de lamininas de la presente invención o los fragmentos de las mismas no está particularmente limitada. Se puede obtener un resultado favorable cuando se trata con una solución de laminina o fragmentos de la misma, preferentemente en la cantidad de aproximadamente 0,01 jg/m l o más, preferentemente aproximadamente 0,01 a 10 jg/ml, de forma aún más preferente de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 2 jg/ml. aproximadamente 0,01 a 10 jg/m l o aproximadamente 0,01 a aproximadamente 2 jg/m l de laminina o fragmentos de la misma corresponde a aproximadamente 0,0015 a 1,5 jg /cm 2 o aproximadamente 0,0015 a 0,3 jg/cm 2 como una cantidad de laminina o fragmentos de la misma en una fase sólida por área de un recipiente de cultivo.

En una realización preferida, la laminina incluye laminina 511 y laminina 521. Por consiguiente, En la presente realización, un agente de la presente invención puede ser laminina 511, laminina 521 o un fragmento de laminina 511-E8 de la misma.

Se puede usar cualquier fragmento como un fragmento de laminina 511 de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas de la presente invención, siempre que el fragmento se pueda usar en el cultivo (se puede denominar "mantenimiento" o "cultivo de mantenimiento en el presente documento, pero se usa con el mismo significado que cultivo) o crecimiento de células endoteliales de la córnea. Dicho fragmento es un fragmento de laminina 511-E8 o un fragmento de laminina 521 (el último no forma parte de la presente invención) (respectivamente, los números de secuencia 9, 10 (secuencia de ácido nucleico, secuencia de aminoácidos) y los números de secuencia 11, 12 (secuencia de ácido nucleico, secuencia de aminoácidos)) (véase Taniguchi Y, Ido H, Sanzen N, Hayashi M, Sato-Nishiuchi R, Futaki S, Sekiguchi K. The C-terminal region of laminin beta chains modulates the integrin binding affinities of laminins. J Biol Chem.

284:7820-7831, 2009. Disponible de Nippi, Incorporated). Un fragmento de laminina 511-E8 y un fragmento de laminina 521 son fragmentos obtenidos por el tratamiento con elastasa y están comprendidos por una porción de un dominio de doble espiral y tres dominios LG (LG1 a LG3) en la región del extremo C de la cadena a de un heterotrímero. Un fragmento E8 se considera como correspondiente a un sitio de unión a integrina de una molécula de heterotrímero en la que la cadena a, la cadena p y la cadena y de una laminina se ensamblan entre sí mediante un dominio de doble espiral. Por consiguiente, como fragmentos preferidos, se pueden usar aquellos en los que está sustancialmente retenido un sitio de unión a integrina en la longitud completa de la laminina. Se entiende que dicho fragmento puede prepararse mediante una alteración adecuada basada en la información sobre los fragmentos de laminina 511-E8 y los fragmentos de laminina 521.

En este sentido, un fragmento E8 de la laminina a5p lY l humana (denominada también "laminina 511-E8 humana" en el presente documento) significa un fragmento de laminina a5plY l humana (denominada también "laminina 511 humana" en el presente documento) que corresponde a un fragmento E8 de laminina a lp lY l de murino (denominada también laminina 111-E8 de murino" en el presente documento). Un fragmento E8 de una laminina se ha identificado como un fragmento con una fuerte actividad de adhesión celular entre los fragmentos que se obtienen digiriendo la laminina a lp lY l de murino (descrita, a partir de ahora en el presente documento como "laminina 111 de murino") con elastasa (Edgar D., Timpl R., Thoenen H. The heparin-binding domain of laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth and neuronal survival. EMBO J., 3:1463-1468, 1984., Goodman SL., DeutZmann R., von der Mark K. Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105: 589-598, 1987.). Para la laminina 511 humana y la laminina 332 humana, se presume la presencia de un fragmento que corresponde a la laminina 111-E8 de murino tras la digestión con elastasa. La laminina 511-E8 humana usada en la presente invención no se requiere que sea un producto de digestión de la elastasa de la laminina 511 humana. La laminina 511-E8 humana usada en la presente invención puede ser un fragmente de una laminina 511 humana que tiene una actividad de adhesión celular similar, estructura similar, y aproximadamente el mismo peso molecular que la laminina 111-E8 de murino. El procedimiento para fabricar laminina 511-E8 humana no está particularmente limitado. Por ejemplo, dicho procedimiento incluye un procedimiento para permitir la digestión de la longitud completa de la laminina 511 humana mediante una enzima proteolítica tal como elastasa para fraccionar y purificar un fragmento diana, un procedimiento para fabricar una proteína recombinante y similares. Se prefiere fabricar una proteína recombinante desde el punto de vista de la cantidad de fabricación, la uniformidad de la calidad, el coste de fabricación y similares. Se puede fabricar la laminina 511-E8 humana recombinante usando de forma adecuada una técnica de recombinación génica adecuada. El procedimiento de fabricar laminina 511-E8 humana recombinante, por ejemplo, puede fabricar laminina 511-E8 humana recombinante obteniendo ADN que codifica la proteína de cada cadena a, cadena p y cadena Y de la laminina 511-E8 humana, insertando cada ADN obtenido en un vector de expresión, expresando los tres tipos de vectores de expresión resultantes mediante cotransfección en las células hospedadoras adecuadas, y purificando las proteínas triméricas mediante un procedimiento conocido (por ejemplo, véase Hiroyuki Ido, y col, "The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin Y chains in integrin binding by laminins" The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.). JP 2011-78370 puede referirse a un procedimiento específico para la fabricación. Se pueden producir fragmentos similares usando laminina 521 humana, que se denomina "fragmento 521-E8 de laminina". Se entiende que dicho fragmento puede producirse de una manera similar que la laminina 511-E8, y que el mismo retiene una actividad similar a la de la laminina 511-E8.

El agente es laminina 511, laminina 521 o un fragmento de laminina 511-E8.

En una realización preferida, las células endoteliales de la córnea son de ser humano.

Las células endoteliales dirigidas por la presente invención pueden prepararse a partir de una córnea exfoliada retirando el endotelio de córnea natural de un donante de córnea sin perjudicar la integridad de la membrana de Descemet y la estructura y función de una capa estromal (por ejemplo, documento WO 2005/038015). Se puede usar una córnea exfoliada para cultivar células endoteliales de la córnea humana.

Se desvela también un recipiente de cultivo para células endoteliales de la córnea, revestido con un agente o de acuerdo con la presente divulgación.

La preparación de un recipiente cubierto o una placa de cultivo de una laminina o similar para cultivar células endoteliales de la córnea puede llevarse a cabo en referencia a un procedimiento conocido en la técnica. La preparación (revestimiento) de un recipiente de cultivo puede llevarse a cabo del siguiente modo: Por ejemplo, tras diluir una solución de laminina con tampón fosfato a 20 pg/ml se añadió a una placa de cultivo y se incubó durante dos horas a 37 °C (5 % CO²), la solución puede retirarse y lavarse dos veces cada una con el tampón fosfato en un medio para su uso.

Por consiguiente, en otro aspecto, la presente divulgación está relacionada con una composición para revestir en fase sólida (revestimiento) un recipiente de cultivo celular para cultivar una célula en células endoteliales de la córnea con un sistema que comprende al menos un agente seleccionado entre el grupo que consiste en las lamininas expresadas en células endoteliales de la córnea o un fragmento de las mismas (por ejemplo, laminina 511, laminina 521 o un fragmento de las mismas, o un agente para revestir en fase sólida (revestimiento) un recipiente de cultivo celular. En un aspecto, una composición o un agente de la presente divulgación es una composición de revestimiento o un agente de revestimiento. Se conoce en la materia un tratamiento técnico de lamininas en fase sólida sobre la superficie de un recipiente de cultivo. Por consiguiente, los expertos en la materia pueden usar cualquier recipiente de cultivo de acuerdo con el objetivo de la presente invención y aplicar un tratamiento al recipiente de acuerdo con la presente invención.

En otro aspecto, la presente divulgación está relacionada además con un kit que comprende la composición o agente anteriormente descrito. Un kit de la presente divulgación puede comprender además un medio de cultivo celular, un recipiente de cultivo celular o similares. un recipiente de cultivo celular puede ser, por ejemplo, una placa de cultivo prerrecubierta o una placa de cultivo prerrevestida. Alternativamente, un recipiente de cultivo celular de un kit puede estar en un estado en que al menos un agente seleccionado entre un grupo que consiste en lamininas expresadas en células endoteliales de la córnea o unos fragmentos de las mismas (por ejemplo, laminina 511, laminina 521 o un fragmento de las mismas) está en una fase sólida. Un recipiente de cultivo celular, una composición, un agente, y el kit de la presente divulgación se pueden usar en un procedimiento para cultivar una célula de mamífero en un sistema que comprende al menos un factor seleccionado entre un grupo que consiste en lamininas expresadas en células endoteliales de la córnea o un fragmento de las mismas (por ejemplo, laminina 511, laminina 521 o un fragmento de las mismas).

(Procedimiento para cultivar una célula endotelial de la córnea)

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para cultivar células endoteliales de la córnea, que utiliza una composición de la presente invención. Es decir, la presente invención proporciona un procedimiento para cultivar o hacer crecer células endoteliales de la córnea, que comprende la etapa de cultivar células endoteliales de la córnea usando un agente (laminina, un fragmento de la misma o similares) de la presente invención. Un agente (laminina, un fragmento de la misma, o similares) usado en un procedimiento de la presente invención se entiende que es capaz de usar cualquier forma descrita en el presente documento. Además, cualquier componente del cultivo se puede usar en un procedimiento de la presente invención siempre que el componente se pueda usar en el cultivo del endotelio de córnea, y se puede ilustrar un componente del cultivo de cualquier forma descrita en el presente documento.

En una realización, las células endoteliales de la córnea cultivadas en la presente invención son de primates. En una realización preferida, las células endoteliales de la córnea cultivadas en la presente invención son de un ser humano.

En una realización preferida, el cultivo de células diana mediante un procedimiento de la presente invención es para prevenir o tratar un trastorno endotelial de la córnea, y se puede usar concretamente para producir células, tejidos o similares para un trasplante.

Las condiciones de temperatura tras el cultivo de células endoteliales de la córnea no están particularmente limitadas en la medida en que crezcan células endoteliales de la córnea. Sin embargo, por ejemplo, la condición de temperatura es aproximadamente de 25 °C a aproximadamente 45 °C, o preferentemente aproximadamente de 30 °C a aproximadamente 40 °C considerando la eficacia del crecimiento, o preferentemente aún de aproximadamente 37 °C. Se lleva a cabo el procedimiento de cultivo en una estufa incubadora de células común en un entorno humidificado con una concentración de CO²de aproximadamente 5 a 10 %.

Cualquier componente que se pueda usar en el cultivo de un endotelio de córnea se puede usar como un componente del cultivo que se puede usar en la presente invención. Además, el componente del cultivo puede ser un componente del medio que se ha adquirido y usado convencionalmente o un componente desarrollado por separados para el endotelio de córnea. Los ejemplos de dicho componente del medio incluyen, aunque no de forma limitativa OptiMEM, DMEM, M199, MEM y similares (están disponibles de INVITROGEN o similares).

La presente invención se caracteriza por una actividad elevada de una variedad de lamininas específicas o fragmentos de las mismas utilizando un polipéptido y/o un péptido específico en un sistema de cultivo de células que comprende un agente (por ejemplo, laminina específica o un fragmento de la misma) de la presente invención en el cultivo de células. El polipéptido se selecciona entre el grupo que consiste en proteínas de la sangre diferentes de una proteína de matriz extracelular, que es suero, albúmina de suero, prealbúmina, inmunoglobulina, a-globulina, p-globulina, a1-antitripsina (a1-AT), haptoglobina (Hp), a2-macroglobulina (a2-M), a-fetoproteína (AFP), transferrina, proteína de unión a retinol (RBP) o adiponectina, y gelatina, proteína de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF), y peptona. En una realización de la presente invención, un polipéptido y/o un péptido que se puede usar como un componente adicional es, aunque no de forma limitativa, albúmina de suero, proteína de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF) o peptona, o el polipéptido y/o el péptido es inmunoglobulina o gelatina.

En la presente invención, preferentemente una proteína de la sangre y preferentemente aún una proteína de la sangre diferente de una proteína de la matriz extracelular se puede usar con un agente (laminina específica o un fragmento de la misma) de la presente invención. La proteína de la sangre se selecciona preferentemente entre suero, albúmina de suero, prealbúmina, inmunoglobulina, a-globulina, p-globulina, a1-antitripsina (a1-AT), haptoglobina (Hp), a2-macroglobulina (a2-M), a-fetoproteína (AFP), transferrina, proteína de unión a retinol (RBP) o adiponectina, que son todas proteínas de la sangre diferentes de una proteína de matriz extracelular. "Matriz extracelular" es una sustancia que rellena el espacio extracelular. Al mismo tiempo, la matriz extracelular tiene un papel esquelético (por ejemplo, cartílago o hueso de un animal), un papel de armazón en la adhesión celular (por ejemplo, membrana basal o fibronectina), un papel en retener o proporcionar un factor de crecimiento celular o similar (por ejemplo, factor de crecimiento celular FGF que se une al sulfato de heparán) y similar. Muchas de las células individuales que constituyen un organismo multicelular que se reconocen como vivas están enterradas en una cama o nido de una matriz extracelular. Los componentes principales de una matriz extracelular de un vertebrado, incluyendo seres humanos son glicoproteínas tales como colágeno, proteoglicanos, fibrobectina, y laminina (parcialmente, moléculas de adhesión celular). "Proteína de matriz extracelular" significa una proteína que constituye dicha matriz extracelular.

"Proteínas de la sangre diferentes que una proteína de matriz extracelular" en la presente invención significa proteínas de la sangre diferentes de una proteína de matriz extracelular implicada en la adhesión celular o similar. Son todas proteínas conocidas que los expertos en la materia pueden obtener adecuadamente. Las proteínas de la sangre diferentes de una proteína de matriz extracelular son preferentemente, aunque no de forma limitativa, albúmina de suero humano (HSA/disponible por ejemplo de Nacalai Tesque), albúmina de suero humano recombinante (rHSA/ por ejemplo, disponible de SIGMA-AlDRICH), o albúmina de suero de bovino (BSA/ por ejemplo, disponible de SIGMA-AlDRICH). Además, "proteínas de la sangre diferentes de una proteína de matriz extracelular" pueden ser inmunoglobulinas. Las inmunoglobulinas, incluyendo IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, son bien conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, una inmunoglobulina humana (IgG/ por ejemplo, disponible de Oriental Yeast Col, Ltd.) se puede usar sin limitarse a lo anterior.

La "gelatina" referida en el presente documento es una sustancia extraída añadiendo calor al colágeno, que es el principal componente del tejido conectivo tal como la piel, huesos, o tendones de un animal. El principal componente de la gelatina es proteína.

Como un componente adicional, se puede usar en el presente documento una proteína de la familia del factor de necrosis tumoral. El "Factor de necrosis tumoral, TNF)" es un tipo de citoquina. Estrechamente definidos, existen tres tipos de TNF, es decir, TNF-a, TNF-p (linfotoxina (LT)-a) y LT-p. "Proteínas de la familia TNF" incluye al menos 19 tipos de moléculas tales como un ligando activador del receptor de NFkB (RANKL), el ligando Fas y el ligando CD40. Preferentemente, se puede usar un ligando activador del receptor de NFkB (RANKL, sRANKL) como un ejemplo de una proteína de la familia TNF usada como un componente adicional usado en la presente invención.

En la presente invención, se puede utilizar una peptona como un componente adicional. "Peptona" es una proteína obtenida disolviendo una proteína con una enzima proteolítica. La proteína es digerida por pepsina en el estómago en una peptona in vivo, y la peptona resultante se digiere además en aminoácidos por el jugo pancreático secretado por el páncreas y por el jugo intestinal secretado por el yeyuno. Debido a que la peptona es adecuada como fuente nutritiva de microorganismos, se añade a menudo al medio. Una peptona como la mencionada fuente nutritiva de un medio se obtiene hidrolizando una proteína en aminoácidos y un péptido de bajo peso molecular. En general, Se usa comúnmente una peptona obtenida de una proteína láctea (caseína láctea) experimenta enzimolisis (utilizando una proteasa tal como pancreatina extraída del páncreas de un suínido). Se usa preferentemente una peptona derivada de una planta, pero no se limita a lo anterior. Por ejemplo, se selecciona una peptona entre el grupo que consiste en una peptona derivada de semillas de algodón, una peptona derivada de soja, una peptona derivada de trigo, y un péptido derivado de guisantes.

(Células endoteliales de la córnea y Formulación del endotelio de córnea) La presente divulgación proporciona células endoteliales de la córnea cultivadas y producidas mediante el procedimiento de acuerdo con la presente invención. La presente invención se puede considerar que tiene características que no existen en las células convencionales en que normalmente se obtienen células cultivadas o en crecimiento incluso cuando se lleva a cabo el cultivo normal y también cuando se lleva a cabo el subcultivo. Además, la característica más importante es que las células tienen características de células endoteliales de la córnea que son normales en sus funciones. En consecuencia, las células endoteliales de la córnea que la presente divulgación proporciona puede proporcionarse como una formulación, lo que significa que la presente divulgación proporciona una divulgación del endotelio de córnea. En consecuencia, la presente divulgación proporciona un procedimiento para fabricar una formulación del endotelio de córnea, que comprende la etapa de cultivar células endoteliales de la córnea usando una solución de cultivo que comprende el agente o la composición de acuerdo con la presente divulgación o un recipiente en el que se reviste el agente o la composición de acuerdo con la presente invención.

En un aspecto, la formulación de endotelio de córnea de acuerdo con la presente divulgación contiene un material base, y una capa de células endoteliales de la córnea sobre el material base.

El material base usado en la presente divulgación no está particularmente limitado siempre que soporte una capa de células endoteliales de la córnea cultivada y mantenga su forma in vivo durante un periodo de tiempo dado, preferentemente al menos tres días, tras el trasplante. Además, el material base usado en la presente divulgación puede ser aquél que tiene un papel de armazón en el cultivo de las células endoteliales de la córnea en un tubo de ensayo, o puede ser aquel que tiene un papel de soporte de la capa de células endoteliales de la córnea tras el cultivo. Preferentemente, el material base usado en la presente divulgación es aquel que tiene un papel como estructura usada para cultivar células endoteliales de la córnea y someterse directamente a trasplante tras la finalización del cultivo.

El material base usado en la presente divulgación incluye, por ejemplo, material muy polimérico derivado de productos naturales tales como colágeno, gelatina y celulosa; material macromolecular sintético tal como poliestireno, poliéster, policarbonato y poli(N-isopropil acrilamida); material polimérico biodegradable tal como ácido poliláctico y ácido poliglicólico; hidroxiapatita, amnios y similares.

La forma del material base usado en la presente divulgación no está particularmente limitada siempre que soporte la capa de células endoteliales de la córnea y tenga una forma adecuada para el trasplante. Sin embargo, la forma es preferentemente una lámina. Cuando la formulación de acuerdo con la presente divulgación está en una forma de lámina, puede cortarse y usarse en un tamaño de acuerdo con un sitio de aplicación en el trasplante. Además, es también posible enrollar la lámina hasta estrecharla e insertarla en una herida. como un ejemplo específico preferible, se ilustra una lámina circular que cubre aproximadamente un 80 % del área de un endotelio de córnea lesionado. Además, es también preferible cortar la porción periférica del círculo con el fin de que se adhiera estrechamente a un sitio de aplicación.

En un aspecto preferible, el ejemplo del material base usado en la presente divulgación es colágeno. Como colágeno, puede usarse preferentemente la lámina de colágeno descrita en la Publicación japonesa abierta a consulta n.° 2004 24852. La lámina de colágeno sujeto puede prepararse a partir de, por ejemplo, amnios, de acuerdo con el procedimiento descrito en la Publicación japonesa abierta a consulta n.° 2004-24852.

A partir de ahora en el presente documento, se describirá la preparación de la capa de células endoteliales de la córnea como un ejemplo de una formulación de endotelio de córnea.

La capa de células endoteliales de la córnea usada en la presente divulgación comprende preferentemente al menos una de las siguientes características. Más preferentemente, la capa de células endoteliales de la córnea usada en la presente invención comprende dos o más de las siguientes características. Aún más preferentemente, la capa de células endoteliales de la córnea usada en la presente divulgación comprende las siguientes características.

(1) La capa de células tiene una estructura monocapa. Esta es una de las características que las capas de células endoteliales de la córnea de organismos vivos comprenden.

(2) la densidad celular en la capa de células es aproximadamente de 1.000 a aproximadamente 4.000 células/mm2. En particular, la densidad celular es preferentemente de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 3.000 células/mm2 cuando es receptor un adulto.

(3) La forma planar de las células que constituyen la capa de células es sustancialmente hexagonal. Esta es una de las características que comprenden las células que constituyen la capa de células endoteliales de la córnea en organismos vivos. La formulación de la presente divulgación es similar a las capas de células endoteliales de la córnea de organismos vivos, que es capaz de ejercer una función similar como las capas de células endoteliales de la córnea naturales y es capaz también de ejercer capacidad de crecimiento in vivo.

(4) Las células se disponen regularmente en la capa de células. En las capas de células endoteliales de la córnea de organismos vivos, las células que constituyen las capas se disponen regularmente. Por consiguiente, las funciones normales y la alta transparencia de las células endoteliales de la córnea se considera que se mantienen, y la función humectante de la córnea se ejerce adecuadamente. Por lo tanto, comprendiendo dichas características morfológicas, se espera que la formulación de acuerdo con la presente divulgación ejerza una función similar a la de las capas de células endoteliales de la córnea en organismos vivos.

El procedimiento de fabricación de acuerdo con la presente invención comprende la etapa de cultivar células endoteliales de la córnea usando el agente, la composición o el recipiente de acuerdo con la presente divulgación, y puede llevarse a cabo mediante, por ejemplo, el siguiente procedimiento.

<1> Extracción y cultivo de células endoteliales de la córnea en un tubo de ensayo

Las células endoteliales de la córnea se extrajeron de la córnea de un mismo receptor o un donante adecuado usando un procedimiento ordinario. En consideración a las condiciones de trasplante en la presente invención, pueden prepararse células endoteliales de la córnea derivadas de la misma raza.

Por ejemplo, la membrana de Descemet y la capa de células endoteliales de los tejidos de la córnea se exfolian a partir del parénquima de la córnea, se transfieren a una placa de cultivo y se tratan con dispasa o similar. En consecuencia, las células endoteliales de la córnea se desprenderán de la membrana de Descemet. Las células endoteliales de la córnea que permanecen en la membrana de Descemet pueden desprenderse mediante pipeteo o similar.

Tras la retirada de la membrana de Descemet, las células endoteliales de la córnea se cultivan en una solución de cultivo de acuerdo con la presente invención. Como para el cultivo o la solución de cultivo, por ejemplo, se puede usar lo siguiente: FBS( suero de feto de bovino) (por ejemplo, BIOWEST, número de catálogo: S1820-500), b-FGF (factor básico de crecimiento de fibroblastos)(por ejemplo, INVITROGEN, número de catálogo: 13256-029), y una sustancia antibiótica, tal como penicilina y estreptomicina, pueden añadirse de forma adecuada a DMEM comercialmente disponible (Medio Eagle modificado por Dulbecco) (por ejemplo, INVITROGEN, número de catálogo. 12320 o similar), seguido por la adición de componentes de un normalizador del cultivo de acuerdo con la presente invención. Mediante revestimiento del agente de acuerdo con la presente invención para llevar a cabo el cultivo, se promueve la adhesión de las células endoteliales de la córnea a la superficie de un recipiente de cultivo, llevando a cabo por tanto un crecimiento favorable. Además, cuando se lleva a cabo el cultivo añadiendo laminina a la solución del cultivo, es preferible usar una placa de cultivo, cuya superficie se reviste con colágeno de tipo I, colágeno de tipo IV, fibronectina, laminina o matriz extracelular de células endoteliales de la córnea de bovino o similares. Alternativamente, es posible usar un recipiente de cultivo ordinario que se trata con un agente de revestimiento comercialmente disponible tal como el FNC coating mix® (50 ml(AES-0407), ATHENA, número de catálogo: 0407). Las condiciones de temperatura para cultivar células endoteliales de la córnea no están particularmente limitadas siempre que crezcan células endoteliales de la córnea. Por ejemplo, la temperatura está comprendida en el intervalo de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 45 °C, y cuando se toma en consideración la eficacia de crecimiento, es preferentemente de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 40 °C, y aún más preferentemente aproximadamente 37 °C. El procedimiento de cultivo se lleva a cabo en dicho entorno de aproximadamente una concentración de CO²del 5 al 10 % bajo humidificación, En una estufa incubadora normal de cultivo de células.

<2> Subcultivo

Después que las células endoteliales de la córnea sometidas a cultivo se hacen crecer, Se puede llevar a cabo el subcultivo. Preferentemente, se lleva a cabo el subcultivo en el momento de ser subconfluente o confluente. El subcultivo puede llevarse a cabo del siguiente modo. En primer lugar, las células se tratan con tripsina-EDTA o similar de tal manera que las células se desprenden de la superficie del recipiente de cultivo. A continuación, las células se recogen. El normalizador del cultivo o el medio de acuerdo con la presente invención se añade a las células recogidas para obtener una suspensión de células. Es preferible llevar a cabo un tratamiento con centrífuga cuando las células se recogen o después de la recogida. El tratamiento con centrífuga sujeto permite la preparación de una suspensión de células con una alta densidad celular. La densidad celular preferible es aproximadamente de 1 a 2x106 células/ml. señalar que las condiciones para el tratamiento con centrífuga incluyen, sin limitación, por ejemplo, 500 rpm (30 g) a 1000 rpm (70 g), y 1 a 10 minutos.

La suspensión celular se siembra en un recipiente de cultivo similar al cultivo inicial anteriormente mencionado, sometiéndose por tanto a cultivo. Mientras que la tasa de dilución en el subcultivo varía de acuerdo con el estado de las células, pero es aproximadamente 1:2 a 1:4 y preferentemente 1:3. El subcultivo puede llevarse a cabo en condiciones de cultivo similares al cultivo inicial anteriormente mencionado. El tiempo de incubación varía de acuerdo con el estado de las células que se van a usar o similar, pero es de 7 a 30 días, por ejemplo. El subcultivo anteriormente mencionado puede llevarse a cabo múltiples veces según se considere necesario. Cuando se usa un agente de promoción de la adhesión celular (por ejemplo, un inhibidor de ROCK o similar) en el agente, la composición, el medio o el receptor de acuerdo con la presente invención, puede potenciarse la adhesión celular en un periodo inicial del cultivo, haciendo posible acortar el periodo de cultivo.

<3> Preparación de la capa de células endoteliales de la córnea

La suspensión celular se siembra sobre un material base tal como una lámina de colágeno, para someterla a cultivo. En esta fase, el número de células que se van a sembrar se ajusta de tal manera que se forma una densidad celular deseada de una capa de células en una formulación de endotelio de córnea que se fabrica en el extremo. De manera específica, las células se siembran de tal manera que se forma una capa de células de una densidad celular en el intervalo de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 4.000 células/mm2. El cultivo puede llevarse a cabo en condiciones similares al cultivo inicial anteriormente mencionado. El tiempo de incubación varía de acuerdo con el estado de las células que se van a usar, pero es, por ejemplo, de 3 a 30 días.

Llevando a cabo el cultivo como se ha descrito anteriormente, se obtiene una formulación de endotelio de córnea, en el que se forma una capa de células endoteliales de la córnea cultivada en el tubo de ensayo en el material base.

En la presente invención, la formulación de endotelio de la córnea puede comprender el agente o la composición de acuerdo con la presente invención, o un medio que comprende cualquiera de ellos, o la formulación del endotelio de la córnea puede mantenerse en un recipiente que contiene cualquiera de ellos, a fin de cultivar o hacer crecer células endoteliales de la córnea. la formulación del endotelio de córnea puede comprender el agente o la composición de acuerdo con la presente invención, o un medio que comprende cualquiera de ellos, o la formulación del endotelio de córnea puede mantenerse en un recipiente que contiene cualquiera de ellos, hasta que se somete a trasplante. La presente invención puede comprender una formulación de endotelio de córnea, el agente o la composición de acuerdo con la presente invención, o un medio que comprende cualquiera de ellos; y alternativamente, la presente invención proporciona una combinación con un recipiente que comprende cualquiera de ellos.

La formulación de endotelio de córnea obtenida mediante el procedimiento de fabricación de acuerdo con la presente invención puede usarse como un injerto en un tratamiento de enfermedades que requieren el trasplante del endotelio de córnea, tal como queratopatía bullosa, edema de córnea, leucoma de córnea, en particular, distrofia de córnea, y queratopatía bullosa producidas por un trastorno del endotelio de la córnea debido a una lesión externa o una cirugía oftálmica interna. La causa de dicha queratopatía bullosa, el trastorno del endotelio de la córnea o similar incluye un distrofia endotelial de la córnea de Fuchs, síndrome de seudoexfoliación, endoteliitis de la córnea y similares, además de cirugía.

el sujeto para la administración de la formulación de endotelio de córnea de acuerdo con la presente invención incluye mamíferos (por ejemplo, seres humanos, ratones, ratas, hámsteres, conejos, gatos, perros, vacas, ovejas, monos y similares) y preferentemente, primates (por ejemplo, seres humanos).

(Tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno o dolencia endotelial de la córnea)

La presente divulgación proporciona un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o dolencia endotelial de la córnea, que comprende células endoteliales de la córnea producidas mediante un procedimiento para cultivar o hacer crecer una célula endotelial de la córnea, que comprende la etapa de cultivar células endoteliales de la córnea usando un agente, composición o medio o un recipiente de la presente divulgación. Se entiende que un agente, composición, o medio o recipiente de la presente invención se puede usar en cualquier forma descrita en el presente documento. Por ejemplo, se pueden considerar las materias descritas en el presente documento, tales como (Una composición para cultivar o hacer crecer células endoteliales de la córnea), (Procedimiento para cultivar una célula endotelial de la córnea) y (célula endotelial de la córnea y formulación de endotelio de córnea). Además, se entiende que las células endoteliales de la córnea usadas como un medicamento pueden tomar cualquier forma usada en el presente documento. Por ejemplo, se puede considerar la materia descrita en (células endoteliales de la córnea y formulación endotelial de córnea).

En un aspecto, un medicamento de la presente divulgación es para el fin de tratar o prevenir el endotelio de la córnea de primates. Preferentemente, el sujeto de dicho tratamiento o prevención es un endotelio la córnea humano.

En un aspecto, las células endoteliales de la córnea usadas en un medicamento de la presente divulgación son de primates. Preferentemente, las células endoteliales de la córnea usadas en un medicamento de la presente invención son de un ser humano.

En un aspecto, la enfermedad, trastorno o dolencia endotelial de la córnea sobre la que hace diana un medicamento de la presente invención es queratopatía bullosa, endotelitis de la córnea, edema de córnea, leucoma y similar.

En un aspecto, se proporciona un medicamento de la presente invención en forma de lámina o como una suspensión.

En una realización, un medicamento de la presente invención comprende además un agente de promoción de la adhesión celular. El agente de promoción de la adhesión celular ejerce una acción de promoción de la adhesión sobre las células endoteliales de la córnea separadas del tejido de la córnea o las células endoteliales de la córnea separadas y subcultivadas. Dicho agente de promoción de la adhesión celular puede proporcionarse junto con o de forma separada de las células endoteliales de la córnea proporcionadas como un medicamento. En una realización específica, El agente de promoción de la adhesión celular usado en un medicamento de la presente invención incluye un inhibidor de la quinasa Rho. El inhibidor de la quinasa Rho incluye compuestos desvelados en las siguientes referencias: Patente de EE.UU. n.° 4678783, patente japonesa n.° 3421217, publicación internacional n.° WO 95/28387, publicación internacional n.° WO 99/2062, publicación internacional n.° WO 99/6140, publicación internacional n.° WO 02/076976, publicación internacional n.° WO 02/076977, publicación internacional n.° WO 2002/083175, publicación internacional n.° WO 02/100833, publicación internacional n.° WO 03/059913, publicación internacional n.° WO 03/062227, publicación internacional n.° WO 2004/009555, publicación internacional n.° WO 2004/022541, publicación internacional n.° WO 2004/108724, publicación internacional n.° WO 2005/003101, publicación internacional n.° WO 2005/039564, publicación internacional n.° WO 2005/034866, publicación internacional n.° WO 2005/037197, publicación internacional n.° WO 2005/037198, publicación internacional n.° WO 2005/035501, publicación internacional n.° WO 2005/035503, publicación internacional n.° WO 2005/035506, publicación internacional n.° WO 2005/080394, publicación internacional n.° WO 2005/103050, publicación internacional n.° WO 2006/057270, y publicación internacional n.° WO 2007/026664. Dichos compuestos pueden fabricarse mediante los procedimientos descritos en cada una de las referencias desveladas e incluyen, por ejemplo, 1-(5-Isoquinolinasulfonil)homopiperazina o una sal de la misma (por ejemplo, fasudil(1-(5-Isoquinolinasulfonil)homopiperazina)), y (+)-trans-4-(1-aminoetil)-1-(4-piridilcarbamoil) ciclohexanocarboxamida o una sal de la misma (por ejemplo, clorhidrato de Y-27632((R)-(+)-trans-(4-piridil)-4-(1-aminoetil)-ciclohexanocarboxamida monohidratado.

Las dianas de la administración (trasplantes) de un medicamento o procedimiento de la presente divulgación incluyen mamíferos (por ejemplo, seres humanos, ratones, ratas, hámsteres, conejos, gatos, perros, vacas, ovejas, monos y similares). Sin embargo, se prefieren los primates y se prefieren en particular los seres humanos. No se han conseguido resultados satisfactorios en un tratamiento endotelial de la córnea para primates. En este sentido, la presente divulgación proporciona un procedimiento y un medicamento terapéutico innovadores.

En otro aspecto, La presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad, trastorno o dolencia endotelial de la córnea, que comprende la etapa de usar las células endoteliales de la córnea producidas mediante un procedimiento para cultivar células endoteliales de la córnea de una manera normal, que comprende la etapa de cultivar células endoteliales de la córnea usando un agente, la composición, el medio. o un recipiente de la presente invención.

Tal como se ha descrito anteriormente, la presente invención se ha descrito presentando a la vez las realizaciones preferidas para facilitar la comprensión. A partir de ahora en el presente documento, la presente invención se describirá a través de Ejemplos. Sin embargo, la descripción anteriormente mencionada y los siguientes Ejemplos se proporcionan solo a fines ilustrativos y no se proporcionan con el fin de limitar la presente invención. Por consiguiente, el ámbito de la presente invención está limitado únicamente por las Reivindicaciones, no por las realizaciones o los Ejemplos descritos específicamente en el presente documento.

rEiemplos!

A partir de ahora en el presente documento, se describirá un ejemplo en que las células de las células endoteliales de la córnea de acuerdo con la presente invención se cultivan normalmente. Cuando sea aplicable, los estándares que muestra el Ministerio de sanidad, trabajo y bienestar, el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología, o similares se observaron para la manipulación de las muestras biológicas o similares, y cuando fue aplicable, la manipulación se llevó a cabo basándose en la Declaración de Helsinki o las consideraciones éticas creadas basándose en la declaración de Helsinki. Con respecto a la donación de ojos para los estudios, se obtuvieron cartas de consentimiento de los familiares cercanos en relación con todos los donantes muertos. El presente estudio se homologó mediante la revisión ética del banco de ojos SightLife™ (Seattle, WA).

(Procedimiento experimental: Tejido de córnea humana de calidad de estudio)

Doce córneas de donantes humanos se obtuvieron cada una del banco de ojos SightLife™ y todas las córneas se preservaron en un medio de preservación (Optisol; Chiron Vision Corporation, Irvine, CA) a 4 °C durante un periodo de menos de 14 días antes del cultivo primario.

(Análisis estadístico)

Se determinó la diferencia estadísticamente significativa (valor P) en un valor promedio de una comparación de dos muestras usando el test de la t del test de la t de Student. La diferencia estadísticamente significativa en la comparación de una pluralidad de conjuntos de muestras se analizó utilizando el test de comparación múltiple de Dunnett. Los valores que se muestran en el gráfico representan el promedio ±SE.

(Ejemplo 1: Expresión de una cadena de laminina y una cadena de integrina en células endoteliales de la córnea y una membrana de Descemet)

En el presente Ejemplo, se observó la expresión de una cadena de laminina en la membrana de Descemet, que es una membrana basal de la célula endotelial de la córnea.

(Materiales y procedimientos)

Se llevó a cabo la expresión del ARNm de una cadena de laminina usando el procedimiento de la PCR. Aunque no se muestran los datos, se verificó la expresión de las proteínas mediante inmunotinción.

Se diluyó un anticuerpo secundario con PBS y la solución resultante se incubó durante treinta minutos a temperatura ambiente. Se usó anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de conejo marcado (conjugado) con Alexa™ Fluor 488 (Número de catálogo: A11034; 1:1500; Molecular Probe-Invitrogen) como el anticuerpo secundario. Tras agitar y lavar dos veces con Triton al 0,15 %/PBS y una vez con PBS, se llevó a cabo la tinción nuclear con yoduro de propidio (Número de catálogo: SP29004-41; PI; Nacalai Tesque, Inc. Kyoto, Japón) y el anticuerpo secundario se incluyó cubriéndolo con una cubierta de vidrio. Se observó el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia con un microscopio de barrido de láser confocal (Olympus Fluoview, Tokyo, Japón) y se tomó una fotografía del mismo. Se muestran en la siguiente Tabla 1 las secuencias de cebadores de cadenas de laminina usadas en un procedimiento de la PCR. Se muestran en la siguiente Tabla 2 las secuencias de cebadores de las cadenas de integrina usadas en un procedimiento de la PCR. Se obtuvieron los cebadores de Life Technologies Japan Ltd (Número de catálogo: 10336022).

Tabla 1. Secuencias de oligonucleótidos para la PCR

Tamaño Gen Cebador de sentido directo Cebador de sentido contrario

(pb) Laminin 5’-GAGTCCGT CT CT CT GGACAT AG-3’ 5’-CGT GGCATT CACAGGGTT GAC-3’ (SEQ aa1 (SEQ ID NO: 9) ID NO: 10) 180 Laminin 5’-TGCTAGAATTTACCTCCGCTCG-3’ (SEQ 5’-GATCAAGTGGACAAGCCCTG-3’ (SEQ

203 a a2 ID NO: 11) ID NO: 12)

Laminin 5’-CTCCAAAGGCCCAACTCAAG-3’ (SEQ ID 5’-CCATAACTGCCTCCTTAGTCTC-3’ (SEQ

304 a a3 NO: 13) ID NO: 14)

Laminin 5’-CTTACGCAACACCACCGGATTC-3’ 5’-CCTTCTTCCAAGCAnCTCCG-3’ (SEQ

140 aa4 (SEQ ID NO: 15) ID NO: 16)

Laminin 5’-GAGGACT OAAGT OAAAACT CAA-3’ 5’-CCACTGAAGTTGTAAATGGTG-3’ (SEQ

221 a a 5 (SEQ ID NO: 17) ID NO: 18)

Laminin 5’-GATGGTGAACTTGAIGAAAAGT-3’ (SEQ

258 a/3í ID NO: 19)

Laminin

150 a @2

Laminin 144 a @3

Laminin 5’-GGCAGGCTACTTTGGATTTC-3’ (SEQ ID

204 a /34 NO: 25)

Laminin 5’-GAT GAGAT GGIG AC AGAT CAAG-3’ (SEQ

199 a y1 ID NO: 27)

Laminin

193 a y2

Laminin 5’-GGGATACAAGAGGGAGATGC-3’ (SEQ 5’-CATAGAAACCTGGCAAACAGC-3’ (SEQ aY3 ID NO: 31) ID NO: 32) 157

Tabla 2. Secuencias de oligonucleótidos para la PCR

Gen Cebador de sentido directo Cebador de sentido contrario ^Tamaño (pb) Integrina 5’-gaagaacctcctgaaacccttt-3’ (SEQ ID NO: 5'-tgatgtcatattggggaatgaa-3' (SEQ ID NO:

254 a l 33) 34)

Integrina 5’-tgatgggacagaagtaacatgc-3’ (SEQ ID NO: 5’-tggaccaacatcttcaaaactg-3’ (SEQ ID NO:

333 a2 35) 36)

Integrina 5’-ttcccactagaaggtctgggta-3’ (SEQ ID NO:

257 a3 5’-gctctgcctttggtttatctgt-3’ (SEQ ID NO: 37) *&)

Integrina 5’-atattcagtcggagctggtcat-3’ (SEQ ID NO: 39 5’-gcatatttgtcacttccaacga-3’ (SEQ ID NO: 40) a4 338 Integrina 5’-tcctcagcaagaatctcaacaa-3’ (SEQ ID NO:

a5 5’-gttgagtcccgtaactctggtc-3’ (SEQ ID NO: 42) 304

₄₁₎

Integrina 5'-agcaaggcagatggaataatgt-3' (SEQ ID NO: 5'-cagggtaggaatttcgatcaag-3' (SEQ ID NO:

a6 275

43) 44)

Integrina 5’-accgtgacctcatacttgacct-3’ (SEQ ID NO:

5’-caggtcaccttetacctcatcc-3’ (SEQ ID NO: 45 262 a7 46)

Integrina 5’-atggaaaatgtaaccaggatgg-3’ (SEQ ID NO: 5’-cagttatgaatgggcagaacaa-3’ (SEQ ID NO:

265 a8 47) 48)

Integrina 5’-acagtgtgctgttaggcaagaa-3’ (SEQ ID NO:

a9 5’-cactttcagcccatcaatatca-3’ (SEQ ID NO: 49 305

50)

Integrina

a10 5’-atcagtgtggttcagagggact-3’ (SEQ ID NO: 51 5’-gccctggctttgtagtattgtc-3’ (SEQ ID NO: 52) 330

Integrina 5’-ggacactgctgactacgtgaag-3’ (SEQ ID NO:

a11 5’-gcgtgtgctctctatgatgaag-3’ (SEQ ID NO: 54) 294

₅₃₎

(continuación)

Gen Cebador de sentido directo Cebador de sentido contrario ^Tamañ _{o (pb)}

Integrina 5’-tagcagtgaagaagctgacgag-3’ (SEQ ID NO: 5’-tctttcaggaagacgacagtga-3’ (SEQ ID NO:

300 aE 55) 56)

Integrina 5’-atctgtgaggtcgaaacaggat-3’ (SEQ ID NO: 5’-accttgccaataaaagctacca-3’ (SEQ ID NO:

aV 255

57) 58)

Integrina 5’-gaaccattgacaccagaagtga-3’ (SEQ ID NO:

aL 5’-ttcttcaaaccccaactgtctt.3' (SEQ ID NO: 60) 341

59)

Integrina 5’-gatcggctaagagaaggacaga-3’ (SEQ ID NO

aM 5’-cattgccacaattcttctcaaa-3’ (SEQ ID NO: 62) 330

61)

Integrina ^{5’-cgtgaagtatctctgagcatcg-3’ (SEQ ID NO:}

aX 5’-ccaacatctgcctttacattga-3’ (SEQ ID NO: 63 331

64) Integrina

accagatgaagggctttgt-3’ (SEQ ID NO: 65 5’-ggtctttgtacttctgcccatc-3’ (SEQ ID NO: 66) 296 aD 5’-tta

Integrina a 5’-gaaaagactgaggaggctgaga-3’ (SEQ ID NO: 5’-gagaaaatatccgcaactggag-3’ (SEQ ID NO:

Ilb 245

67) 68⁾

Integrina 5'-gctgaagactatcccattgacc-3' (SEQ ID NO:

5’-atttccagatatgcgctgtttt-3' (SEQ ID NO: 70) 321 31 69)

Integrina

132 5'-tgatggacctctcctactccat-3' (SEQ ID NO: 71 5'-gaaactggttggagttgttggt-3' (SEQ ID NO: 72) 258

Integrina 5’-tcccataagcatcaacaatgag-3’ (SEQ ID NO: 308 33 5’-tgtttaccactgatgccaagac-3’ (SEQ ID NO:73

74⁾

Integrina 5’-gaaggaaggtttcagatggatg-3’ (SEQ ID NO:

5’-gcttcacacctatttccctgtc-3’ (SEQ ID NO: 75) 316 34 76⁾

Integrina 5’-atcccagactgacaactctact-3’ (SEQ ID NO: 349 35 5’-gctggtgttcacaacagatgat-3’ (SEQ ID NO: 77

78)

Integrina 289 36 5’-tgtgactgtgglgaatgtgtgt-3’ (SEQ ID NO: 79¡ 5’-caccagctagtttgcacttgtc-3’ (SEQ ID NO: 80) Integrina ^{5’-cccaactgcagacttaggaatc-3’ (SEQ ID NO:}250 37 5’-cacttcagacgacacattccat-3’ (SEQ ID NO: 81

82)

Integrina

38 5’-gcattatgtcgaccaaacttca-3’ (SEQ ID NO: 83 5’-atttcttcaggcttctcacgtc-3’ (SEQ ID NO:84) 255

*Procedimiento de la PCR: Se llevó a cabo el procedimiento de la PCR en cada cadena de laminina y la cadena de integrina mediante la RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa mediante transcripción inversa semicuantitativa). Se adquirieron los cebadores de INVITROGEN, que es una compañía de síntesis de oligonucleótidos, y se usaron aquellos en los que se había llevado a cabo un tratamiento de desalación. Se usó el Mini kit RNEasy (QlAGEN Gmbh, Número de catálogo: 74106) para la extracción del ARN total de las células. Una membrana de Descemet que incluía células endoteliales de la córnea se exfolió de una córnea para su uso en investigación que se adquirió del banco de ojos Seattle y las células endoteliales de la córnea se exfoliaron mecánicamente con la membrana basal para su uso en la extracción de la córnea de las células endoteliales de la córnea. Se llevó a cabo una reacción de transcripción inversa (42 °C, sesenta minutos) sobre el ARN con ReverTra Ace (Toyobo Co., Ltd. (número de catálogo: TRT-101)), y CD166 y CD73 se amplificaron con GAPDH como patrón interno usando una Versión TAKARA Taq HotStart de la ADN polimerasa (Takara Bio Inc, Número de catálogo: RR001A). La misma cantidad de ADNc se amplificó mediante un dispositivo de la PCR (GeneAmp 9700; Applied Biosystems) y la siguiente pareja de cebadores. En la reacción de la PCR, se usaron los cebadores que se muestran en la Tabla 1, la Tabla 2 y aquellos descritos a continuación.

*GAPDH-F:GAGTCAACGGATTTGGTCGT (SEQ ID NO: 85)

*GAPDH-R:TTGATTTTGGAGGGATCTCG (SEQ ID NO: 86)

Un fragmento de ADNc amplificado se sometió a electroforesis con un gel de agarosa al 1,5 % (Nacalai Tesque, Número de catálogo: 01149-76) y se detectó mediante la tinción con bromuro de etidio (Nacalai Tesque, Número de catálogo: 14603-51).

* Citometría de flujo: Se sembró un endotelio de córnea humano en una placa de cultivo revestida con revestimiento FNC y se cultivó durante aproximadamente 14 días hasta alcanzar el estado de confluencia bajo la condición de CO²al 5 % a 37 °C. Las células se exfoliaron con TrypLE™ Select y se recogieron. A continuación, se llevó a cabo el análisis sobre un antígeno superficial de la cadena de integrina usando un citómetro de flujo (BD FACSCanto™ II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)) de acuerdo con el manual de instrucciones usando a la un Human Cell Surface Marker Screening Panel (BD Lyoplate™, BD Bio-sciences, Franklin Lakes, NJ).

La célula endotelial de la córnea humana se cultivó como se describe a continuación. la membrana de descemet que incluía células endoteliales de la córnea se exfolió de una córnea para su uso en investigación que se adquirió del Banco de ojos Seattle y la célula endotelial de la córnea se exfolió mecánicamente con la membrana basal. tras el desprendimiento (normalmente, tratado durante dos horas a 37 °C usando 1 mg/ml de colagenasa A (Roche Applied Science)) y recogida de la membrana basal usando colagenasa (ROCHE Número de catálogo: 10 103 586001), se llevó a cabo el cultivo primario. Para el medio, se usó un medio en el que se acondicionó lo siguiente para un alimentador de células 3T3: Medio líquido de suero reducido Opti-MEM I, (INVITROGEN, Número de catálogo: 31985 070) suero de feto de bovino al 8 % (FBS) (BIOWEST, Número de catálogo: S1820-500) 200 mg/ml de CaCl2-2H2O (S iGm A Número de catálogo: C7902-500G) sulfato de condroitina al 0,08 % (SIGMA número de catálogo: C9819-5G) 20 |jg/ml de ácido ascórbico (SIGMA Número de catálogo: A4544-25G) 50 jg/m l de gentamicina (INVITROGEN Número de catálogo: 15710-064) 5 ng/ml de EGF (INVITROGEN Número de catálogo: PHG0311). De manera específica, tras la digestión a 37 °C, HCEC obtenido de una córnea individual se resuspendió en un medio de cultivo y se sembró en placas en un pocillo de una placa de 12 pocillos revestido con la FNC Coating Mix™. El medio de cultivo se preparó de acuerdo con el protocolo publicado al cual se añadió una alteración parcial. Explicado de forma breve, se preparó un medio de cultivo básico, que contenía OptiMEM-I (Life Technologies), FBS al 8 %, 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), 1 pM de SB431542 (Merck Millipore), 20 pg/ml de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich), 200 mg/l de cloruro de calcio (Sigma-Aldrich), 0,08% de sulfato de condroitina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka) y 50 pg/ml de gentamicina. A continuación, se recogió un medio acondicionado tras cultivar fibroblastos 3T3 inactivados. La inactivación de los fibroblastos 3T3 se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente. Explicado de forma breve, se incubaron fibroblastos 3T3 confluentes durante dos horas a 37 °C con CO²al 5 % con 4 pg/ml de mitomicina C (MMC) (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd., Tokyo) y a< continuación lo resultante se trató con tripsina y se sembró en placas sobre una placa elástica a una densidad de 2x 104 células/cm2. Se cultivó HCEC en una atmósfera humidificada a 37 °C en 5 % CO², y el medio de cultivo se sustituyó cada tres días. Cuando HCEC alcanza el estado de confluencia en 14 a 28 días, Se enjuagó HCEC en Ca2+ y Mg2+ exento de PBS, tratado con tripsina con tripsina-EDTA al 0,05 % durante cinco minutos a 37 °C, y a continuación se subcultivó a una relación de 1:2.

(Resultados)

Cuando se observó la expresión de la cadena de laminina en la membrana de Descemet (membrana basal de las células endoteliales de la córnea), la expresión de la cadena de laminina a5, cadena de laminina p1, t cadena de laminina y1 fue prominente. Por otro lado, la expresión de la cadena de laminina a1, cadena de laminina a2, y cadena de laminina a3 no fue evidente (no se muestran los datos).

Como se muestra en la Figura 1, cuando se observó la expresión del ARNm de las cadenas de laminina de las células endoteliales de la córnea humana, la expresión de la cadena de laminina a5, cadena de laminina p1, cadena de laminina p2, t cadena de laminina y1 fue prominente. Por otro lado, la expresión de la cadena de laminina ex1, cadena de laminina a2, cadena de laminina a3, cadena de laminina a4, cadena de laminina p3, cadena de laminina y2, y cadena de laminina y3 no fue evidente.

Como se muestra en la Figura 2, se reconoció la expresión en la cadena de integrina a1, cadena de integrina a2, cadena de integrina a3, cadena de integrina a6, cadena de integrina a10, cadena de integrina a11, cadena de integrina p1, cadena de integrina p5, cadena de integrina p8, y cadena de integrina aV. Se reconoció también una expresión ligera en la cadena de integrina p3, cadena de integrina p4, y cadena de integrina p6. Por consiguiente, la materia anterior sugiere que las células endoteliales de la córnea expresan al menos una de a1 p1, a2p1, a3p1, a6p1, a7p1 y a6p4, que son integrinas conocidas como una integrina de unión a laminina.

Como se muestra en la Figura 3 (Fig. 3A, 3B y 3C), se reconoció la expresión de la cadena de la integrina a1, cadena de integrina a2, cadena de integrina a3, la cadena de la integrina a5, y la cadena de la integrina p1 como la expresión de un antígeno superficial.

(Ejemplo 2: Promoción de la adhesión celular de Células endoteliales de la córnea humana)

En el presente ejemplo, se usó un recipiente de cultivo revestido con laminina o similar para confirmar si la adhesión celular podría realizarse o no para las células endoteliales de la córnea humana.

(Materiales y procedimientos)

*laminina 511 (LN511, VERITAS Corporation)

*laminina 521(LN521, VERITAS Corporation)

*fragmento de laminina 511-E8 (382-02413, Nippi. Inc.)

*FNC coating mix® (50 ml(AES-0407), ATHENA, número de catálogo: 0407)

*gelatina (G1890-500G, Sigma-Aldrich Co. LLC.)

“ recipiente (3526, CORNING)

(Procedimiento) “Células endoteliales de la córnea humana (HCEC, Procedimiento de fuente y cultivo): se llevó a cabo el cultivo de HCEC como en el Ejemplo 1 mencionado anteriormente. Las células cultivadas se lavaron en Ca2+ y Mg2+ exentos de PBS, y se tripsinizaron a 37 °C durante cinco minutos c on triposina-EDTA al 0,05 %, seguido por siembra en placas de 12 pocillos revestidas con FNC Coating Mix®. El medio de cultivo se preparó de acuerdo con el protocolo publicado al cual se añadió una alteración parcial. Hablando de forma breve, se preparó un medio de cultivo fundamental que contenía OptiMEM-I(Life Technologies), FBS al 8%, 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), 10 pM de SB431542 (Merck Millipore), 20 pg/ml de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich), 200 mg/l de cloruro de calcio (Sigma-Aldrich), 0,08 % de sulfato de condroitina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka) y 50 pg/ml de gentamicina. A continuación, tras cultivar células de fibroblastos 3T3 inactivadas, se recuperó el medio acondicionado. La inactivación de las células de fibroblastos 3T3 se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente. Hablando de forma breve, las células de fibroblastos 3T3 confluentes se incubaron juntas con 4 pg/ml de mitomicina C (MMC) (Kyowa Hakko Kirin Col, Ltd, Tokyo) en atmósfera de CO²al 5 % a 37 °C durante dos horas, seguido por tratamiento con tripsina, y siembra en placas a una densidad de 2x104 células/cm2 sobre una placa de plástico. Las HCEH se cultivaron con CO²al 5 % a 37 °C en una atmósfera humidificada, y el medio de cultivo se sustituyó cada tres días.

(Procedimiento) Las HCEC se sembraron en cada pocillo de placas de 96 pocillos revestidos con laminina 511, laminina 521, laminina 211, gelatina, FNC Coating Mix®, y se observaron las células formadas después 24 horas usando un microscopio de contraste de fases. La siembra se llevó a cabo a una densidad de siembra de 5.000 células/pocillo en placas de cultivo de 96 pocillos, y se examinó el número de células adheridas en el punto de las 24 horas después de la siembra de células usando un Ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega Corporation, Madison, WI, Estados Unidos). Además, se evaluó la adhesión celular para las placas de cultivo revestidas con un fragmento de laminina 511-E8 (0,001-1,5 pg/cm2). Además, se añadieron diversas concentraciones de laminina 521 y fragmentos de laminina 511-E8 a los medios para la siembra y se evaluó de forma similar el número de células después de 24 horas.

(Medición del crecimiento celular mediante captación de BrdU)

De forma similar, se evaluó la captación de BrdU de HCEC revestidas con diversas matrices mediante ELISA. Se llevó a cabo la siembra en placas de cultivo de 96 pocillos a una densidad de siembra de 5.000 células/pocillo, seguido por cultivo durante la noche. A continuación, se añadió 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) al medio, seguido por cultivo durante la noche. Se retiró el medio, y se añadió una solución fijadora (Amersham cell proliferation biotrak ELISA system, versión 2) para la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se retiró la solución fijadora, y se añadió una solución de bloqueo (Amersham cell proliferation biotrak ELISA system, versión 2), seguido por una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se retiró la solución de bloqueo, y se añadió anticuerpo dirigido contra BrdU conjugado con peroxidasa, seguido por una incubación de 90 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado, y se añadió matriz de TMB (3,3',5,5'-tetrametil bencidina) (Amersham cell proliferation biotrak ELISA system, versión 2), seguido por una incubación de 5 a 30 minutos. La reacción se detuvo usando ácido sulfúrico 1 M, y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de placas. Se mostró el resultado como un valor promedio de cinco mediciones ± el error estándar.

(Resultado)

Como se muestra en la Figura 4, en presencia de laminina 511 y laminina 521, la adhesión y la extensión de las células endoteliales de la córnea fueron favorables, mientras que el crecimiento no fue favorable en otras condiciones.

Como se muestra en la Figura 5, en presencia de laminina 511 y laminina 521, se mostró que la adhesión celular de las células endoteliales de la córnea era favorable en comparación a otras condiciones.

Como se muestra en la Figura 6, En presencia de un fragmento de laminina 511-E8, se mostró que el crecimiento celular de células endoteliales de la córnea era favorable en comparación con otras condiciones. En particular, la adhesión celular se promovió favorablemente en la concentración de 0,1 a 1,5 pg/cm2.

Como se muestra en la Figura 7, en presencia de laminina 511, laminina 521 y un fragmento de laminina 511-E8, se mostró que el crecimiento celular de células endoteliales de la córnea era favorable en comparación con otras condiciones.

(Ejemplo 3: Análisis funcional de la laminina 511 y la laminina 521 en un cultivo celular de Células endoteliales de la córnea humana)

En el presente ejemplo, se llevó a cabo el análisis funcional de la laminina 511 y la laminina 521 en cultivos celulares de células endoteliales de la córnea humana.

(Materiales y procedimientos)

*Células endoteliales de la córnea humana (HCEC, Procedimiento de fuente y cultivo): Se llevó a cabo el cultivo de HCEC de la siguiente forma. Hablando de forma breve, las membranas de Descemet incluyendo células endoteliales de la córnea se exfoliaron de las de las córneas para su uso en investigación adquiridas del Banco de ojos Seattle; a continuación se exfolió mecánicamente la membrana basal junto con las células endoteliales de la córnea, que se exfoliaron después de la membrana basal usando colagenasa (ROCHE, número de catálogo: 10 103 586 001) (normalmente, se trataron durante dos horas usando 1 mg/ml de colagenasa A(Roche Applied Science) a 37 °C). tras la recuperación, se llevó a cabo el cultivo primario. En el cultivo primario, se llevó a cabo la siembra en placas a 1 pocillo de placas de 12 pocillos revestidos con laminina 511, laminina 521, laminina 211, FNC Coating Mix®. Para el medio se usó el mismo producto que en el Ejemplo 1. Se llevó a cabo la observación celular durante un periodo de tiempo utilizando un microscopio de contraste de fases.

*Procedimiento de observación de células para la tinción o similares (ensayo histológico): tras inmovilizar las HCEC cultivadas, se llevó a cabo la inmunotinción usando ZO-1, Na+/K+-ATPasa como un marcador relacionado con la función seguido por observación usando un microscopio de fluorescencia. Las HCEC se inmovilizaron con formaldehído al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA), seguido por incubación con albúmina de suero bovino al 1 % (BSA) durante 30 minutos. Se llevó a cabo el análisis químico del tejido inmunitario para la proteína relacionada con unión estrecha, ZO-1, y una proteína relacionada con una función de bombeo, Na+/K+ATPasa. Cada uno de los anticuerpos primarios se usó en una dilución 1:200. Para el anticuerpo secundario, se usó una dilución 1.2000 de anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de ratón marcado con Alexa Fluor™ 594 o marcado con Alexa Fluor™ 488 (Life Technologies). A continuación, los núcleos de las células se tiñeron con DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). A continuación, se observaron los portas usando un microscopio de fluorescencia (BZ-9000; Keyence, Osaka, Japón).

*Anticuerpos contra Na+/K+-ATPasa: se usaron los preparados por MILLIPORE (MILLIPORE número de catálogo: 05-369).

*Anticuerpos contra ZO-1: se usaron los preparados por Rabbit ZYMED LABORATORIES (ZYMED LABORATORIES número de catálogo: 61-7300).

(Resultado)

Como se muestra en la Figura 8, la laminina 511 y la laminina 521 mostraron realizar el cultivo de células de las células endoteliales de la córnea humana de forma más eficaz. Las fotografías muestran células dos días después del cultivo primario mediante un microscopio de contraste de fases.

Como se muestra en la Figura 9, la laminina 511 y la laminina 521 mostraron permitir el cultivo de células endoteliales de la córnea humana con una alta densidad de células. Las fotografías muestran células veinte días después del cultivo primario mediante un microscopio de contraste de fases.

como se muestra en las Figuras 10 y 11, la laminina 511 y la laminina 521 mostraron retener la actividad de ZO-1 y Na+/K+-ATPasa, y se demostró que el cultivo usando el procedimiento de acuerdo con la presente invención permite el crecimiento manteniendo a la vez las funciones normales. La densidad celular en la laminina 511 y la laminina 521 fue mayor en comparación con la laminina 211 y el control sin revestir.

Como se muestra en la Figura 12, la laminina 521 y el fragmento de laminina 511-E8 de diversas concentraciones se añadieron a los medios que se iban a sembrar, promoviendo por tanto la adhesión celular de las células endoteliales de la córnea.

(Ejemplo 4: formulaciones ilustrativas: Solución de cultivo para preparar una lámina de endotelio de córnea)

En el presente Ejemplo, como ejemplo de formulación, se fabricó del siguiente modo una solución de cultivo para preparar una lámina de endotelio de córnea que contenía un agente de la presente invención.

Se preparó una solución de cultivo que se muestra a continuación con un procedimiento convencional. Laminina 511, laminina 521 y/o un fragmento de la misma (0,75 pg/cm2)

Suero de feto de bovino (FBS) 10 ml

solución de penicilina-estreptomicina 1 ml

FGF básico 200 ng

DMEM cantidad adecuada

cantidad total 100 ml

Por ejemplo, BIOWEST (Número de catálogo: S1820-500) o los fabricados por Invitrogen se puede usar para el FBS. Para la solución de penicilina-estreptomicina, se pueden usar los fabricados por Nacalai Tesque (que contienen 5000 pg/ml de penicilina, 5000 pg/ml de estreptomicina). Además, por ejemplo, para el FGF básico, se pueden usar los fabricados por Invitrogen (INVITROGEN, Número de catálogo: 13256-029). Para el SB431542, se pueden usar los fabricados por Tocris Cookson Ltd, y para SB203580, los fabricados por la marca CALBIOCHEM. Para DMEM, se pueden usar los fabricados por Invitrogen.

(Ejemplo 5: formulaciones ilustrativas: composición para un recipiente para preservar o amplificar la córnea)

En el presente Ejemplo, como ejemplo de formulación, una solución para revestir un recipiente que comprende un agente de la presente invención se fabricó del siguiente modo.

Se preparó una solución de preservación que se muestra a continuación mediante un procedimiento convencional. Laminina 511, laminina 521 y/o un fragmento de la misma (0,75 pg/cm2)

Una cantidad adecuada de un tampón adecuado

Cantidad total 100 ml

Cada ingrediente puede obtenerse de forma similar al Ejemplo 4.

Tal como se ha descrito anteriormente, la presente invención se ilustra mediante el uso de las realizaciones preferidas de la presente invención. Sin embargo, se entiende que el ámbito de la presente invención debe interpretarse únicamente basándose en las reivindicaciones. La solicitud sujeto reivindica la prioridad de la solicitud de patente japonesa n.° 2013-244972 presentada el 27 de noviembre de 2013.

rAplicabilidad industrial!

Se proporcionan componentes de cultivo y un procedimiento de cultivo para promover el crecimiento de células del endotelio de la córnea. Se proporciona una técnica disponible en la industria asociada con una técnica relacionada con los implantes de córnea (industria de cultivo de células, fabricación de fármacos y similares).

(Texto libre del listado de secuencias)

SEQ ID NO: 1 secuencia de ácido nucleico de la cadena de laminina a5 (NM_005560)

SEQ ID NO: 2 secuencia de aminoácidos de la cadena de laminina a5 (NM_005551)

SEQ ID NO: 3 secuencia de ácido nucleico de la cadena de laminina p1 (NM_002291)

SEQ ID NO: 4 secuencia de aminoácidos de la cadena de laminina p1 (NM_002282)

SEQ ID NO: 5 secuencia de ácido nucleico de la cadena de laminina p2 (NM_002292)

SEQ ID NO: 6 secuencia de aminoácidos de la cadena de laminina p2 (NM_002283)

SEQ ID NO: 7 secuencia de ácido nucleico de la cadena de laminina y1 (NM_002293)

SEQ ID NO: 8 secuencia de aminoácidos de la cadena de laminina y1 (NM_002284)

SEQ ID NO: 9 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de laminina a1: 5'-GAGTCCGTCTCTCTGGACATAG-3'

SEQ ID NO: 10 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de laminina a1: 5'-CGTGGCATTCACAGGGTTGAC-3'

SEQ ID NO: 11 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de laminina a2: 5'-TGCTAGAATTTACCTCCGCTCG-3'

SEQ ID NO: 12 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de laminina a2: 5'-GATCAAGTGGACAAGCCCTG-3'

SEQ ID NO: 13 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de laminina a3: 5'-CTCCAAAGGCCCAACTCAAG-3'

SEQ ID NO: 14 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de laminina a3: 5'-CCATAACTGCCTCCTTAGTCTC-3'

SEQ ID NO: 15 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de laminina a4: 5'-CTTACGCAACACCACCGGATTC-3'

SEQ ID NO: 16 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de laminina a4: 5'-CCTTCTTCCAAGCATTCTCCG-3'

SEQ ID NO: 17 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de laminina a5: 5'-GAGGACTGAAGTGAAAACTCAA-3'

SEQ ID NO: 18 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de laminina a5: 5'-CCACTGAAGTTGTAAATGGTG-3'

SEQ ID NO: 19 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de laminina p1: 5'-GATGGTGAACTTGATGAAAAGT-3'

SEQ ID NO: 20 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de laminina p1: 5'-GGCTTATATCCTTTAGGAGTGA-3'

SEQ ID NO: 21 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de laminina p2: 5'-GATGATCGCATCCAAGGGAC-3'

SEQ ID NO: 22 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de laminina p2: 5'-GTCCAGAGTAGGGAGTCTCAG-3'

SEQ ID NO: 23 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de laminina p3: 5'-CCCAGATGGAGGAAGATGTC-3'

SEQ ID NO: 24 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de laminina p3: 5'-GTAGCTGAGTCTGTGGGCAG-3'

SEQ ID NO: 25 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de laminina p4: 5'-GGCAGGCTACTTTGGATTTC-3'

SEQ ID NO: 26 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de laminina p4: 5'-GCTTGAGGGATCATCTGGAC-3'

SEQ ID NO: 27 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de laminina Y1: 5'-GATGAGATGGTGACAGATCAAG-3'

SEQ ID NO: 28 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de laminina Y1: 5'-TTTCCAGTCTCTTCAATGGTAT-3'

SEQ ID NO: 29 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de laminina Y2: 5'-ATCGAAGGTTACTGCGGAATC-3'

SEQ ID NO: 30 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de laminina Y2: 5'-GTAGCCAGAAGCACAATCCTG-3'

SEQ ID NO: 31 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de laminina Y3: 5'-GGGATACAAGAGGGAGATGC-3'

SEQ ID NO: 32 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de laminina Y3: 5'-CATAGAAACCTGGCAAACAGC-3'

SEQ ID NO: 33 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina a l: 5'-gaagaacctcctgaaacccttt-3'

SEQ ID NO: 34 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina a1: 5'-tgatgtcatattggggaatgaa-3'

SEQ ID NO: 35 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina a2: 5'-tgatgggacagaagtaacatgc-3'

SEQ ID NO: 36 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina a2: 5'-tggaccaacatcttcaaaactg-3'

SEQ ID NO: 37 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina a3: 5'-gctctgcctttggtttatctgt-3' SEQ ID NO: 38 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina a3: 5'-ttcccactagaaggtctgggta-3'

SEQ ID NO: 39 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina a4: 5'-atattcagtcggagctggtcat-3'

SEQ ID NO: 40 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina a4: 5'-gcatatttgtcacttccaacga-3'

SEQ ID NO: 41 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina a5: 5'-tcctcagcaagaatctcaacaa-3'

SEQ ID NO: 42 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina a5: 5'-gttgagtcccgtaactctggtc-3'

SEQ ID NO: 43 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina a6: 5'-agcaaggcagatggaataatgt-3'

SEQ ID NO: 44 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina a6: 5'-cagggtaggaatttcgatcaag-3'

SEQ ID NO: 45 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina a7: 5'-caggtcaccttctacctcatcc-3'

SEQ ID NO: 46 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina a7: 5'-accgtgacctcatacttgacct-3'

SEQ ID NO: 47 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina a8: 5'-atggaaaatgtaaccaggatgg-3'

SEQ ID NO: 48 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina a8: 5'-cagttatgaatgggcagaacaa-3'

SEQ ID NO: 49 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina a9: 5'-cactttcagcccatcaatatca-3'

SEQ ID NO: 50 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina a9: 5'-acagtgtgctgttaggcaagaa-3'

SEQ ID NO: 51 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina a10: 5'-atcagtgtggttcagagggact-3'

SEQ ID NO: 52 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina a10: 5'-gccctggctttgtagtattgtc-3'

SEQ ID NO: 53 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina a11: 5'-ggacactgctgactacgtgaag-3'

SEQ ID NO: 54 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina a11: 5'-gcgtgtgctctctatgatgaag-3'

SEQ ID NO: 55 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina aE: 5'-tagcagtgaagaagctgacgag-3'

SEQ ID NO: 56 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina aE: 5'-tctttcaggaagacgacagtga-3'

SEQ ID NO: 57 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina aV: 5'-atctgtgaggtcgaaacaggat-3'

SEQ ID NO: 58 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina aV: 5'-accttgccaataaaagctacca-3'

SEQ ID NO: 59 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina aL: 5'-gaaccattgacaccagaagtga-3'

SEQ ID NO: 60 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina aL: 5'-ttcttcaaaccccaactgtctt-3'

SEQ ID NO: 61 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina aM: 5'-gatcggctaagagaaggacaga-3'

SEQ ID NO: 62 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina aM: 5'-cattgccacaattcttctcaaa-3'

SEQ ID NO: 63 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina aX: 5'-ccaacatctgcctttacattga-3'

SEQ ID NO: 64 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina aX: 5'-cgtgaagtatctctgagcatcg-3'

SEQ ID NO: 65 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina aD: 5'-ttaaccagatgaagggctttgt-3'

SEQ ID NO: 66 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina aD: 5'-ggtctttgtacttctgcccatc-3'

SEQ ID NO: 67 secuencia de cebador de sentido directo de la cadena de integrina aIIb: 5'-gaaaagactgaggaggctgaga-3'

SEQ ID NO: 68 secuencia de cebador de sentido contrario de la cadena de integrina aIIb: 5'

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de un agente seleccionado entre el grupo que consiste en laminina 511, laminina 521 o un fragmento de laminina 511-E8, que se expresa en células endoteliales de la córnea, en un procedimiento para promover in vitro el crecimiento de células endoteliales de la córnea.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las lamiminas comprenden laminina 511 (alfa5 beta1 gamma1) y laminina 521 (alfa5 beta2 gamma 1).

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que los fragmentos de laminina promueven la capacidad de adhesión celular de las células endoteliales de la córnea.

4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que las células endoteliales de la córnea son de ser humano.

5. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el agente está presente en un medio.

6. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el agente se reviste sobre un recipiente de cultivo.