JP2023025311A - タンパク質の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】植物を発現宿主とした目的タンパク質製造方法の提供。【解決手段】目的タンパク質の製造方法であって、目的タンパク質を含有する植物から該目的タンパク質を抽出する工程を含み、前記抽出が、有効成分の存在下で実施され、前記有効成分が、酸化防止剤および／または金属封鎖剤であり、前記目的タンパク質が、前記抽出時にＨＡタグを含む、方法。【選択図】なし

Description

本発明は、植物を発現宿主とするタンパク質の製造方法に関するものである。

植物は、組み換えタンパク質の発現宿主として利用されている。

植物においては、過酸化水素の存在下で植物内在性ペルオキシダーゼによりチロシン残基間でジチロシン架橋が形成されることが知られている（非特許文献１）。

また、標的分子にHAタグ等のチロシン残基を含むペプチドタグを付加し、ペルオキシダーゼによりチロシン残基間でジチロシン架橋を形成させることにより、それら標的分子を結合させる方法が報告されている（非特許文献２～３）。

また、アスコルビン酸等の酸化防止剤は、植物からの組み換えタンパク質の抽出の際に利用される場合がある（非特許文献４）。

林 隆久, 細胞壁が植物の成長をコントロールしている, 蛋白質核酸酵素, 1992 Nov;37(15):2968-76. Minamihata K. et al., Site-specific protein cross-linking by peroxidase-catalyzed activation of a tyrosine-containing peptide tag. Bioconjug Chem. 2011 Jan 19;22(1):74-81. Montanari E. et al., Tyrosinase-Mediated Bioconjugation. A Versatile Approach to Chimeric Macromolecules. Bioconjug Chem. 2018 Aug 15;29(8):2550-2560. Renate S. et al., Quantitative control of Lettuce mosaic virus fitness and host defence inhibition by P1-HCPro. Summa Phytopathol. 2007 Jun 33(2):119-123.

本発明は、植物を発現宿主とするタンパク質の生産を向上させる新規な技術を提供することを課題とする。

本発明者らは、HAタグの付加により目的タンパク質の植物での発現量が顕著に向上することを見出した。本発明者らは、さらに、HAタグを付加して植物で発現した目的タンパク質を植物から抽出する際に、目的タンパク質に由来する副生物の生成が認められること、および酸化防止剤または金属封鎖剤の利用により当該副生物の生成を低減して目的タンパク質を効率的に回収できることを見出した。これらの知見に基づき、本発明は完成した。

すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
目的タンパク質の製造方法であって、
目的タンパク質を含有する植物から該目的タンパク質を抽出する工程を含み、
前記抽出が、有効成分の存在下で実施され、
前記有効成分が、酸化防止剤および／または金属封鎖剤であり、
前記目的タンパク質が、前記抽出時にHAタグを含む、方法。
［２］
前記抽出の前に、さらに、前記目的タンパク質をコードする遺伝子を有する植物に該遺伝子を発現させることにより前記目的タンパク質を含有する植物を取得する工程を含む、前記方法。
［３］
前記植物が、ナス科（Solanaceae）植物である、前記方法。
［４］
前記植物が、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）またはタバコ（Nicotiana
tabacum）である、前記方法。
［５］
前記目的タンパク質が、植物の葉から抽出される、前記方法。
［６］
前記有効成分が、Ｌ－アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、亜硫酸、トコフェロール、エトキシキン、システイン、γ－グルタミルシステイン、還元型グルタチオン、二酸化マンガン、カタラーゼ、及びEDTAから選択される１種またはそれ以上の成分である、前記方法。
［７］
前記有効成分が、Ｌ－アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、亜硫酸、及びEDTAから選択される１種またはそれ以上の成分である、前記方法。
［８］
前記有効成分が、Ｌ－アスコルビン酸である、前記方法。
［９］
前記有効成分が前記酸化防止剤を含む場合、前記抽出時の前記酸化防止剤の使用濃度が、２５ｍＭ以上である、前記方法。
［１０］
前記有効成分が前記酸化防止剤を含む場合、前記抽出時の前記酸化防止剤の使用濃度が、２５～１５００ｍＭである、前記方法。
［１１］
前記有効成分が前記酸化防止剤を含む場合、前記抽出時の前記酸化防止剤の使用濃度が、５０～１５０ｍＭである、前記方法。
［１２］
前記有効成分が前記金属封鎖剤を含む場合、前記抽出時の前記金属封鎖剤の使用濃度が、１ｍＭ以上である、前記方法。
［１３］
前記有効成分が前記金属封鎖剤を含む場合、前記抽出時の前記金属封鎖剤の使用濃度が、５～５０ｍＭである、前記方法。
［１４］
前記有効成分が、前記抽出の開始時に抽出液に含有されているか、前記抽出の開始から１分以内に抽出液に供給される、前記方法。
［１５］
前記HAタグが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のペプチドである、前記方法：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１～４個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含むペプチドであって、チロシン残基を含み、且つ、目的タンパク質に付加することにより植物における目的タンパク質の発現量を増大させる機能を有するペプチド；
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
を含むペプチドであって、チロシン残基を含み、且つ、目的タンパク質に付加することにより植物における目的タンパク質の発現量を増大させる機能を有するペプチド。
［１６］
前記HAタグが、チロシン残基を１～５個含む、前記方法。
［１７］
前記目的タンパク質が、前記抽出時に前記HAタグを１～５個含む、前記方法。
［１８］
前記目的タンパク質が、異種タンパク質である、前記方法。
［１９］
前記目的タンパク質が、ヒト由来タンパク質である、前記方法。
［２０］
前記目的タンパク質が、多量体タンパク質である、前記方法。
［２１］
前記多量体タンパク質を構成するサブユニットの全てが、前記抽出時に前記HAタグを含む、前記方法。
［２２］
前記多量体タンパク質を構成するサブユニットの全てが、それぞれ、前記抽出時に前記HAタグを１～５個含む、前記方法。
［２３］
前記目的タンパク質が、細胞外タンパク質、成長因子、およびNotchリガンドから選択
される１種またはそれ以上のタンパク質である、前記方法。
［２４］
前記目的タンパク質が、ラミニンまたはその部分配列である、前記方法。
［２５］
前記目的タンパク質が、ラミニン511E8である、前記方法。
［２６］
前記抽出の後に、さらに、前記抽出により得られた抽出物から前記目的タンパク質を回収することを含む、前記方法。

本発明によれば、植物を発現宿主とするタンパク質の生産を向上させることができる。

HAタグを付加してベンサミアナタバコで発現し、L-アスコルビン酸ナトリウム（Vitamin C；V.C）の添加または未添加の条件で抽出したヒトLaminin511E8のSDS-PAGEでの解析結果を示す図（写真）。 HAタグを付加してベンサミアナタバコで発現し、L-アスコルビン酸ナトリウム（Vitamin C；V.C）の添加または未添加の条件で抽出したDLL4-Fc、FGF-4、及びHGFのウエスタンブロッティングでの解析結果を示す図（写真）。 HAタグを付加してベンサミアナタバコで発現し、各種濃度でL-アスコルビン酸ナトリウム（Vitamin C；V.C）を添加した条件で抽出したヒトLaminin511E8のSDS-PAGEでの解析結果を示す図（写真）。 HAタグを付加してベンサミアナタバコで発現し、各種濃度でL-アスコルビン酸ナトリウム（Vitamin C；V.C）を添加した条件で抽出したヒトLaminin511E8のSDS-PAGEでの解析結果を示す図。 HAタグを付加してベンサミアナタバコで発現し、各種添加剤を添加した条件で抽出したヒトLaminin511E8のSDS-PAGEでの解析結果を示す図（写真）。 HAタグを付加してベンサミアナタバコで発現し、各種添加剤を添加した条件で抽出したヒトLaminin511E8のSDS-PAGEでの解析結果を示す図。

本発明の方法は、目的タンパク質の製造方法であって、目的タンパク質を含有する植物から該目的タンパク質を抽出する工程を含み、前記抽出が酸化防止剤および／または金属封鎖剤の存在下で実施され、前記目的タンパク質が前記抽出時にHAタグを含む、方法である。同工程を、「抽出工程」ともいう。また、目的タンパク質を含有する植物からの該目的タンパク質の抽出を、単に、「抽出」ともいう。「抽出工程」と「抽出」は代替可能に用いられてもよい。酸化防止剤および／または金属封鎖剤を、「有効成分」ともいう。

本発明の方法は、抽出工程の前に、さらに、目的タンパク質を含有する植物を取得する工程を含んでいてもよい。同工程を、「植物取得工程」ともいう。

目的タンパク質を含有する植物は、目的タンパク質をコードする遺伝子を有する植物に同遺伝子を発現させることにより取得することができる。すなわち、植物取得工程は、例えば、目的タンパク質をコードする遺伝子を有する植物に該遺伝子を発現させる工程であってよい。植物取得工程は、具体的には、例えば、目的タンパク質をコードする遺伝子を有する植物に該遺伝子を発現させることにより目的タンパク質を含有する植物を取得する工程であってもよい。目的タンパク質をコードする遺伝子を「目的タンパク質遺伝子」ともいう。目的タンパク質遺伝子の発現を「目的タンパク質の発現」ともいう。

すなわち、本発明の方法の一態様は、目的タンパク質の製造方法であって、目的タンパク質をコードする遺伝子を有する植物に該遺伝子を発現させる（すなわち目的タンパク質を発現させる）ことにより目的タンパク質を含有する植物を取得する工程、および取得した植物（すなわち目的タンパク質を含有する植物）から該目的タンパク質を抽出する工程を含み、前記抽出が有効成分の存在下で実施され、前記目的タンパク質が前記抽出時にHAタグを含む、方法であってよい。

また、本発明の方法の一態様は、言い換えると、目的タンパク質の製造方法であって、目的タンパク質をコードする遺伝子を有する植物に該遺伝子を発現させる（すなわち目的タンパク質を発現させる）工程、および発現した目的タンパク質を前記植物から抽出する工程を含み、前記抽出が有効成分の存在下で実施され、前記目的タンパク質が前記抽出時にHAタグを含む、方法であってよい。

＜１＞植物
抽出工程に用いられる植物（すなわち目的タンパク質を含有する植物）における目的タンパク質の含有量は、目的タンパク質を回収できる限り、特に制限されない。抽出工程に用いられる植物における目的タンパク質の含有量は、植物の乾燥重量１ｇ当たり、例えば、０．０００１ mg以上、０．００１ｍｇ以上、０．０１ｍｇ以上、０．１ｍｇ以上、ま
たは１ｍｇ以上であってもよく、１００ｍｇ以下、５０ｍｇ以下、または１０ｍｇ以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。

目的タンパク質遺伝子を有する植物は、目的タンパク質の生産能を有する。「目的タンパク質の生産能」とは、目的タンパク質を発現し植物内に蓄積する能力を意味してよい。「目的タンパク質の生産能」とは、具体的には、適切な条件で培養した際に目的タンパク質を発現し植物内に蓄積する能力を意味してよい。目的タンパク質遺伝子を有する植物による目的タンパク質の生産量は、目的タンパク質を回収できる限り、特に制限されない。例えば、抽出工程に用いられる植物における目的タンパク質の含有量は、目的タンパク質遺伝子を有する植物による目的タンパク質の生産量と読み替えてよい。

植物は、目的タンパク質を発現し植物内に蓄積できるものであれば、特に制限されない。目的タンパク質を発現する植物を、「宿主」または「発現宿主」ともいう。

植物としては、ナス科（Solanaceae）植物、キク科（Asteraceae）植物、ウリ科（Cucurbitaceae）植物、ラン科（Orchidaceae）植物、イネ科（Poaceae）植物、アブラナ科（Brassicaceae）植物が挙げられる。ナス科植物としては、タバコ属（Nicotiana）植物、ナス属（Solanum）植物、トウガラシ属（Capsicum）植物が挙げられる。タバコ属植物とし
ては、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）やタバコ（Nicotiana tabacum）が挙げられる。ナス属植物としては、トマト（Solanum lycopersicum）、ナス（Solanum melongena）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）が挙げられる。トウガラシ属植物としては、トウガラシ（Capsicum annuum）が挙げられる。キク科植物としては、アキノノゲシ属
（Lactuca）植物が挙げられる。アキノノゲシ属植物としては、レタス（Lactuca sativa
）が挙げられる。ウリ科植物としては、キュウリ属（Cucumis）植物が挙げられる。キュ
ウリ属植物としては、メロン（Cucumis melo）が挙げられる。ラン科植物としては、コチョウラン属（Phalaenopsis）植物が挙げられる。コチョウラン属植物としては、コチョウラン（Phalaenopsis Aphrodite）が挙げられる。イネ科植物としては、イネ属（Oryza）
植物やトウモロコシ属（Zea）植物が挙げられる。イネ属植物としては、イネ（Oryza sativa）が挙げられる。トウモロコシ属植物としては、トウモロコシ（Zea mays）が挙げら
れる。アブラナ科植物としては、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）植物が挙げられる。
シロイヌナズナ属植物としては、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）が挙げられる。植物としては、特に、ベンサミアナタバコやタバコ等のタバコ属植物が挙げられる。

「植物」とは、植物体の全体を意味してもよく、植物体の一部を意味してもよい。すなわち、目的タンパク質の発現および抽出には、いずれも、植物体の全体を用いてもよく、植物体の一部を用いてもよい。植物体の一部としては、植物細胞、カルス、種子、芽、葉、茎、幹、根、花弁、果実が挙げられる。植物体の一部としては、特に、葉が挙げられる。

目的タンパク質は、植物を宿主として発現可能なものであれば、特に制限されない。タンパク質は、宿主由来のタンパク質であってもよく、異種タンパク質（heterologous protein）であってもよい。「異種タンパク質（heterologous protein）」とは、同タンパク質を発現する宿主（すなわち、目的タンパク質を発現する植物）にとって外来性（exogenous）であるタンパク質を意味する。「異種タンパク質（heterologous protein）」とは
、具体的には、宿主に導入された、宿主が本来的に有しない遺伝子から発現するタンパク質を意味してよい。目的タンパク質は、例えば、天然に存在するタンパク質であってもよく、それらを改変したタンパク質であってもよく、人工的にアミノ酸配列をデザインしたタンパク質であってもよい。目的タンパク質は、例えば、微生物由来のタンパク質であってもよく、植物由来のタンパク質であってもよく、動物由来のタンパク質であってもよく、ウイルス由来のタンパク質であってもよい。目的タンパク質は、特に、ヒト由来のタンパク質であってもよい。目的タンパク質は、単量体タンパク質であってもよく、多量体タンパク質であってもよい。多量体タンパク質は、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。目的タンパク質は、分泌性タンパク質であってもよく、非分泌性タンパク質であってもよい。なお、「タンパク質」には、オリゴペプチドやポリペプチド等の、ペプチドと呼ばれるものも包含される。

目的タンパク質として、具体的には、酵素、生理活性タンパク質、レセプタータンパク質、抗原タンパク質、その他のタンパク質が挙げられる。

酵素としては、セルラーゼ、トランスグルタミナーゼ、プロテイングルタミナーゼ、イソマルトデキストラナーゼ、プロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、コラゲナーゼ、およびキチナーゼが挙げ
られる。

生理活性タンパク質としては、成長因子（増殖因子）、ホルモン、サイトカイン、抗体関連分子が挙げられる。

成長因子（増殖因子）としては、上皮成長因子（Epidermal growth factor；EGF）、インスリン様成長因子-1（Insulin-like growth factor-1；IGF-1）、トランスフォーミン
グ成長因子（Transforming growth factor；TGF）、神経成長因子（Nerve growth factor；NGF）、脳由来神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic factor；BDNF）、血管内皮細胞増殖因子（Vascular endothelial growth factor；VEGF）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor；G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor；GM-CSF）、血小板由来成長因子（Platelet-derived growth factor；PDGF）、エリスロポエチン（Erythropoietin；EPO）、トロンボポエチン（Thrombopoietin；TPO）、酸性線維芽細胞増殖因子（Acidic
fibroblast growth factor；aFGFまたはFGF1）、塩基性線維芽細胞増殖因子（Basic fibroblast growth factor；bFGFまたはFGF2）、線維芽細胞増殖因子（Fibroblast growth factor；FGF-4）、角質細胞増殖因子（Keratinocyte growth factor；KGF-1またはFGF7や
、KGF-2またはFGF10）、肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor；HGF）、幹細胞因
子（Stem Cell Factor；SCF）、アクチビン（Activin）が挙げられる。アクチビンとしては、アクチビンA, C, Eが挙げられる。

ホルモンとしては、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン（somatostatin）、ヒト成長ホルモン（human growth hormone；hGH）、副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone；PTH）、カルシトニン（calcitonin）、エキセナチド（exenatide）が挙げられる。

サイトカインとしては、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor；TNF）が挙げられる。

また、生理活性タンパク質は、タンパク質全体であってもよく、その一部であってもよい。タンパク質の一部としては、例えば、生理活性を有する部分が挙げられる。生理活性を有する部分として、具体的には、例えば、副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone；PTH）の成熟体のN末端３４アミノ酸残基からなる生理活性ペプチドTeriparatideが挙げら
れる。

「抗体関連分子」とは、完全抗体を構成するドメインから選択される単一のドメインまたは２もしくはそれ以上のドメインの組合せからなる分子種を含むタンパク質を意味してよい。完全抗体を構成するドメインとしては、重鎖のドメインであるVH、CH1、CH2、およびCH3、ならびに軽鎖のドメインであるVLおよびCLが挙げられる。抗体関連分子は、上述
の分子種を含む限り、単量体タンパク質であってもよく、多量体タンパク質であってもよい。なお、抗体関連分子が多量体タンパク質である場合には、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。抗体関連分子として、具体的には、完全抗体、Fab、F(ab’)、F(ab’)₂、Fc、重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）からなる二量体、Fc融合タンパク質、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Fv（scFv）、sc(Fv)₂、ジスルフィド結合Fv（sdFv）、diabody、VHHフラグメント（nanobody（登録商標））が挙げられる。抗体関連分子として、
より具体的には、トラスツズマブ（Trastuzumab）、アダリムマブ（Adalimumab）、ニボ
ルマブ（Nivolumab）が挙げられる。

レセプタータンパク質としては、生理活性タンパク質やその他の生理活性物質に対するレセプタータンパク質が挙げられる。その他の生理活性物質としては、ドーパミン等の神
経伝達物質が挙げられる。なお、レセプタータンパク質は、対応するリガンドが知られていないオーファン受容体であってもよい。

抗原タンパク質は、免疫応答を惹起できるものであれば、特に制限されない。抗原タンパク質は、例えば、想定する免疫応答の対象に応じて適宜選択できる。抗原タンパク質は、例えば、ワクチンとして使用することができる。

その他のタンパク質としては、Liver-type fatty acid-binding protein（LFABP）、蛍光タンパク質、イムノグロブリン結合タンパク質、アルブミン、Notchリガンド、フィブ
ロイン様タンパク質、細胞外タンパク質が挙げられる。蛍光タンパク質としては、Green Fluorescent Protein（GFP）が挙げられる。イムノグロブリン結合タンパク質としては、Protein A、Protein G、Protein Lが挙げられる。アルブミンとしては、ヒト血清アルブ
ミンが挙げられる。Notchリガンドとしては、DLL1、DLL3、DLL4、Jagged-1、Jagged-2が
挙げられる。フィブロイン様タンパク質としては、WO2017/090665やWO2017/171001に開示されたものが挙げられる。

細胞外タンパク質としては、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、オステオポンチン、ラミニン、それらの部分配列が挙げられる。ラミニンは、α鎖、β鎖、およびγ鎖からなるヘテロ三量体構造を有するタンパク質である。ラミニンとしては、哺乳類のラミニンが挙げられる。ラミニンのサブユニット鎖（すなわち、α鎖、β鎖、およびγ鎖）としては、５種のα鎖（α１～α５）、３種のβ鎖（β１～β３）、３種のγ鎖（γ１～γ３）が挙げられる。ラミニンは、これらサブユニット鎖の組み合わせによって種々のアイソフォームを構成する。ラミニンとして、具体的には、例えば、ラミニン111、ラ
ミニン121、ラミニン211、ラミニン213、ラミニン221、ラミニン311、ラミニン321、ラミニン332、ラミニン411、ラミニン421、ラミニン423、ラミニン511、ラミニン521、ラミニン523が挙げられる。ラミニンの名称中の数字は、左からα鎖、β鎖、およびγ鎖の種類
を示す。すなわち、例えば、「ラミニン511」とは、α５鎖、β１鎖、およびγ１鎖から
なるヘテロ三量体構造を有するタンパク質を意味する。ラミニンの部分配列としては、ラミニンのE8断片であるラミニンE8が挙げられる。ラミニンE8は、具体的には、α鎖のE8断片（α鎖E8）、β鎖のE8断片（β鎖E8）、およびγ鎖のE8断片（γ鎖E8）からなるヘテロ三量体構造を有するタンパク質である。ラミニンE8のサブユニット鎖（すなわち、α鎖E8、β鎖E8、およびγ鎖E8）を総称して、「E8サブユニット鎖」ともいう。E8サブユニット鎖としては、上記例示したラミニンサブユニット鎖のE8断片が挙げられる。ラミニンE8は、これらE8サブユニット鎖の組み合わせによって種々のアイソフォームを構成する。ラミニンE8として、具体的には、例えば、ラミニン111E8、ラミニン121E8、ラミニン211E8、
ラミニン221E8、ラミニン332E8、ラミニン421E8、ラミニン411E8、ラミニン511E8、ラミ
ニン521E8が挙げられる。ラミニンE8の名称中の数字は、左からα鎖、β鎖、およびγ鎖
の種類を示す。すなわち、例えば、「ラミニン511E8」とは、ラミニン511のE8断片を意味し、具体的には、α５鎖のE8断片（α５鎖E8）、β１鎖のE8断片（β１鎖E8）、およびγ１鎖のE8断片（γ１鎖E8）からなるヘテロ三量体構造を有するタンパク質を意味する。

「α鎖E8」とは、α鎖のＣ末端付近の領域を意味してよく、具体的には、α鎖の球状ドメイン４および５を除くＣ末端断片を意味してもよく、より具体的には、α鎖の球状ドメイン４および５を除くＣ末端の７８０～８３０（例えば７９０～８００）アミノ酸残基の断片を意味してもよい。「β鎖E8」とは、β鎖のＣ末端断片を意味してよく、具体的には、β鎖のＣ末端の２２０～２３０アミノ酸残基の断片を意味してもよい。「γ鎖E8」とは、γ鎖のＣ末端断片を意味してよく、具体的には、γ鎖のＣ末端の２４０～２５０アミノ酸残基の断片を意味してもよい。ヒトのα５鎖E8としては、GenBank Accession No. NP_005551のアミノ酸番号２５３４～３３２７の部位が挙げられる。ヒトのβ１鎖E8としては
、GenBank Accession No. NP_002282のアミノ酸番号１５６１～１７８６の部位が挙げら
れる。ヒトのγ１鎖E8としては、GenBank Accession No. NP_002284のアミノ酸番号１３
６４～１６０９の部位が挙げられる。

目的タンパク質遺伝子および目的タンパク質は、それぞれ、例えば、公知の塩基配列およびアミノ酸配列を有していてよい。公知の塩基配列およびアミノ酸配列としては、Genbank等のデータベースに登録されたものや各種特許文献および非特許文献に記載のものが
挙げられる。なお、「遺伝子またはタンパク質が塩基配列またはアミノ酸配列を有する」という表現は、特記しない限り、遺伝子またはタンパク質が当該塩基配列またはアミノ酸配列を含むことを意味してよく、遺伝子またはタンパク質が当該塩基配列またはアミノ酸配列からなる場合も包含してよい。

目的タンパク質遺伝子および目的タンパク質は、それぞれ、公知の塩基配列およびアミノ酸配列を有する遺伝子およびタンパク質のバリアントであってもよい。バリアントは、所望の機能を有するものであれば、特に制限されない。バリアントは、例えば、保存的バリアントであってもよい。「保存的バリアント」とは、元の機能が維持されたバリアントをいう。保存的バリアント等のバリアントとしては、例えば、公知の塩基配列およびアミノ酸配列を有する遺伝子およびタンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。なお、由来する生物種で特定されるタンパク質は、当該生物種において見出されるタンパク質そのものに限られず、当該生物種において見出されるタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらのバリアントを包含するものとする。バリアントは、当該生物種において見出されてもよく、見出されなくてもよい。すなわち、例えば、「ヒト由来タンパク質」とは、ヒトにおいて見出されるタンパク質そのものに限られず、ヒトにおいて見出されるタンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質およびそれらのバリアントを包含するものとする。

「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（例えば、活性または性質）に対応する機能（例えば、活性または性質）を有することを意味する。遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることを意味する。

以下、保存的バリアント等のバリアントについて例示する。

目的タンパク質遺伝子および目的タンパク質のホモログは、例えば、公知の塩基配列またはアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、目的タンパク質遺伝子のホモログは、例えば、各種生物の染色体を鋳型にして、公知の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。

目的タンパク質遺伝子は、公知のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお、上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。

上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の元の機能が維持される保存的変異であってよい。保存的変異の代表的なものは、保存的置換
である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間
で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸であ
る場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性
アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu
、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、Lys
からAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、Phe
からTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。

また、目的タンパク質遺伝子は、公知のアミノ酸配列全体に対して、例えば、50%以上
、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。

また、目的タンパク質遺伝子は、公知の塩基配列から調製され得るプローブ、例えば公知の塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、例えばDNA、であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、
いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、同一性が高いDNA同士、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件を挙げることができる。

上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上述の遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いるこ
とができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダ
イゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。

また、宿主によってコドンの縮重性が異なるので、目的タンパク質遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。すなわち、目的タンパク質遺伝子は、遺伝コードの縮重による上記例示した目的タンパク質遺伝子のバリアントであってもよい。例えば、目的タンパク質遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されていてもよい。

なお、アミノ酸配列間の「同一性」とは、blastpによりデフォルト設定のScoring Parameters（Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence＝11, Extension＝1；Compositional Adjustments：Conditional compositional score matrix adjustment）を用いて算出され
るアミノ酸配列間の同一性を意味する。また、塩基配列間の「同一性」とは、blastnによりデフォルト設定のScoring Parameters（Match/Mismatch Scores＝1,-2；Gap Costs＝Linear）を用いて算出される塩基配列間の同一性を意味する。

上述した目的タンパク質および目的タンパク質遺伝子のバリアントに関する記載は、後述する付加配列およびそれをコードする塩基配列にも準用できる。

目的タンパク質は、上記例示したような目的タンパク質のアミノ酸配列に加えて、他のアミノ酸配列を含んでいてもよい。当該他のアミノ酸配列を、「付加配列」ともいう。すなわち、目的タンパク質は、付加配列との融合タンパク質であってもよい。「目的タンパク質が付加配列を含む」または「目的タンパク質が付加配列との融合タンパク質である」とは、特記しない限り、抽出時、発現時、および／または最終的に目的タンパク質が付加配列を含むことを意味してよい。また、言い換えると、目的タンパク質遺伝子は、上記例示したような目的タンパク質遺伝子の塩基配列に加えて、付加配列をコードする塩基配列を含んでいてもよい。

目的タンパク質は、例えば、付加配列を含む形態で（すなわち付加配列との融合タンパク質として）発現し、且つ、抽出時または最終的には当該付加配列の一部または全部を失っていてもよい。すなわち、目的タンパク質は、発現時に付加配列を含み、且つ、抽出時または最終的には当該付加配列の一部または全部を含まなくてもよい。「目的タンパク質が付加配列を含む形態で発現する」または「目的タンパク質が発現時に付加配列を含む」とは、目的タンパク質が少なくとも発現時に付加配列を含むことを意味し、抽出時の目的タンパク質または最終的に得られる目的タンパク質が付加配列を含むことを必ずしも意味しない。

目的タンパク質は、例えば、付加配列を含む形態で（すなわち付加配列との融合タンパク質として）抽出され、且つ、最終的には当該付加配列の一部または全部を失っていてもよい。すなわち、目的タンパク質は、抽出時に付加配列を含み、且つ、最終的には当該付加配列の一部または全部を含まなくてもよい。「目的タンパク質が付加配列を含む形態で抽出される」または「目的タンパク質が抽出時に付加配列を含む」とは、目的タンパク質が少なくとも抽出時に付加配列を含むことを意味し、最終的に得られる目的タンパク質が付加配列を含むことを必ずしも意味しない。

他のアミノ酸配列は、本発明の目的を損なわない限り、特に制限されない。付加配列は、例えば、その利用目的等の諸条件に応じて適宜選択できる。付加配列としては、シグナルペプチド（シグナル配列ともいう）、ペプチドタグ、プロテアーゼの認識配列が挙げられる。付加配列は、例えば、目的タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはその両方に連結されてよい。付加配列としては、１種のアミノ酸配列を用いてもよく、２種またはそれ以上のアミノ酸配列を組み合わせて用いてもよい。

シグナルペプチドは、目的タンパク質を発現する植物で機能するものであれば、特に制限されない。シグナルペプチドとしては、アルカリキチナーゼ（Basic chitinase）のシ
グナルペプチド、顆粒結合デンプン合成酵素（Granule-bound starch synthase；GBSS）
のシグナルペプチド、リブロース－１，５－ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase；RuBisCo）の小サブユニットのシグナルペプチド、ブチリルコリンエステラーゼ（Butyrylcholinesterase；BChE）のシ
グナルペプチドが挙げられる。シグナルペプチドは、例えば、発現した目的タンパク質を特定の細胞内小器官または細胞内区画に移送または局在化するために利用されてよい。シグナルペプチドは、具体的には、例えば、発現した目的タンパク質を小胞体に移送または局在化するために利用されてよい。シグナルペプチドは、発現後に（例えば、目的タンパ
ク質の移送または局在化の際に）除去されてもよい。すなわち、例えば、抽出時の目的タンパク質および最終的に得られる目的タンパク質はシグナルペプチドを有しなくてよい。

ペプチドタグとしては、HAタグ、Hisタグ、FLAGタグ、GSTタグ、Mycタグ、HSVタグ、V5タグ、T7タグ、Strep-tag II、CBD（Chitin Binding Domein）、MBP（maltose binding protein）、CBP（cellulose binding protein）、TRX（Thioredoxin）、GFP（green fluorescent protein）、HRP（horseradish peroxidase）、ALP（Alkaline Phosphatase）、抗体のFc領域が挙げられる。HAタグについては、後述する。Hisタグとしては、6xHisタグや10xHisタグが挙げられる。ペプチドタグは、例えば、発現した目的タンパク質の検出または精製に利用されてよい。

プロテアーゼの認識配列としては、Factor Xaプロテアーゼの認識配列やproTEVプロテ
アーゼの認識配列が挙げられる。プロテアーゼの認識配列は、例えば、発現した目的タンパク質の切断に利用できる。具体的には、例えば、目的タンパク質をペプチドタグ等の付加配列との融合タンパク質として発現する場合、目的タンパク質と付加配列の連結部にプロテアーゼの認識配列を挿入することにより、発現した目的タンパク質から対応するプロテアーゼを利用して付加配列を切断し、付加配列を有しない目的タンパク質を得ることができる。

目的タンパク質は、抽出時（すなわち抽出工程の実施時）にHAタグを含む。言い換えると、抽出時の目的タンパク質は、HAタグを含む。抽出工程においては、同工程に用いられる植物に含有される目的タンパク質が抽出される。よって、「抽出時の目的タンパク質」とは、抽出工程に用いられる植物に含有される目的タンパク質と同義であってよい。また、抽出工程に用いられる植物に含有される目的タンパク質は、植物において発現し蓄積した目的タンパク質である。よって、「抽出時の目的タンパク質」とは、植物において発現し蓄積した目的タンパク質と同義であってよい。

また、目的タンパク質が抽出時にHAタグを含むためには、目的タンパク質はHAタグを含む形態で植物において発現し蓄積する必要がある。すなわち、目的タンパク質は、発現時にもHAタグを含む。すなわち、目的タンパク質は、HAタグを含む形態で発現する。言い換えると、目的タンパク質遺伝子は、HAタグをコードする塩基配列を含む。HAタグを含む形態で目的タンパク質を発現することにより、目的タンパク質の発現量を増大させることができる。すなわち、HAタグを含む形態で目的タンパク質を発現することにより、HAタグを含まない形態で目的タンパク質を発現する場合と比較して、目的タンパク質の発現量を増大させることができる。目的タンパク質の発現量の増大は、例えば、目的タンパク質遺伝子の転写の増大、目的タンパク質の翻訳の増大、目的タンパク質の分解の低減、またはそれらの組み合わせによるものであってよい。

以下、HAタグについて記載する。目的タンパク質は、例えば、発現時、抽出時、および／または最終的に、以下のような態様でHAタグを含んでいてよい。目的タンパク質は、特に、少なくとも、発現時および抽出時に、以下のような態様でHAタグを含んでいてよい。

HAタグとしては、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドやそのバリアントが挙げられる。すなわち、「HAタグ」という用語には、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドに加え、そのバリアントが包含されるものとする。HAタグのバリアントについては、上述した目的タンパク質のバリアントに関する記載を準用できる。

HAタグのバリアントは、チロシン残基を含み、且つ、元の機能が維持されている限り、特に制限されない。HAタグのバリアントは、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／ま
たは付加されたアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。なお、HAタグのバリアントにおける上記「１又は数個」とは、具体的には、例えば、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１～２個を意味してよい。また、HAタグのバリアントは、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列全体に対して、好ましくは50%以上、より好
ましくは60%以上、さらに好ましくは70%以上、特に好ましくは80%以上の同一性を有する
アミノ酸配列を有するペプチドであってもよい。

HAタグが含むチロシン残基の個数は、有効成分の非存在下で目的タンパク質を植物から抽出した場合に目的タンパク質に由来する副生物の生成が認められる限り、特に制限されない。HAタグが含むチロシン残基の個数は、具体的には、例えば、１～１０個、１～５個、２～４個、または３個であってもよい。

HAタグのバリアントについての「元の機能が維持されている」とは、同バリアントが、目的タンパク質に付加することにより植物における目的タンパク質の発現量を増大させる機能を有することを意味してよい。同機能を、「HAタグの機能」ともいう。或るペプチドがHAタグの機能を有するかどうかは、例えば、同ペプチドを付加して目的タンパク質を植物で発現した場合の目的タンパク質の発現量が同ペプチドを付加せずに目的タンパク質を植物で発現した場合の目的タンパク質の発現量よりも多いことを確認することにより確認できる。タンパク質の発現量は、例えば、SDS-PAGEまたはウエスタンブロッティングにより決定できる。

HAタグをコードする塩基配列は、上記例示したようなHAタグをコードする限り、特に制限されない。

目的タンパク質に含まれるHAタグの個数は、本発明の目的を損なわない限り、特に制限されない。目的タンパク質に含まれるHAタグの個数は、例えば、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、または５個以上であってもよく、２０個以下、１５個以下、１０個以下、７個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。目的タンパク質に含まれるHAタグの個数は、具体的には、例えば、１～１０個、１～５個、２～４個、または３個であってもよい。目的タンパク質に含まれるHAタグの個数は、特に、３個であってもよい。目的タンパク質がHAタグを２個またはそれ以上含む場合、それらHAタグのアミノ酸配列は、互いに同一であってもよく、なくてもよい。目的タンパク質がHAタグを２個またはそれ以上含む場合、HAタグについての説明はそれらHAタグに独立に適用できる。

目的タンパク質におけるHAタグの位置は、本発明の目的を損なわない限り、特に制限されない。HAタグは、例えば、目的タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、またはその両方に連結されてよい。HAタグは、特に、少なくとも、目的タンパク質のＮ末端に連結されてよい。HAタグは、例えば、上記例示した個数で目的タンパク質のＮ末端またはＣ末端にのみ連結されていてもよく、それぞれ上記例示した個数で目的タンパク質のＮ末端およびＣ末端に連結されていてもよく、合計で上記例示した個数となるように目的タンパク質のＮ末端およびＣ末端に連結されていてもよい。なお、目的タンパク質がHAタグに加えてそれ以外の付加配列を含む場合、HAタグおよびそれ以外の付加配列の位置は、例えば、HAタグ以外の付加配列の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。例えば、目的タンパク質がＮ末端にHAタグとシグナルペプチドを含む場合、シグナルペプチドは、HAタグよりもＮ末端側に連結されてよい。また、例えば、目的タンパク質がＮ末端にHAタグとそれ以外のペプチドタグを含む場合、HAタグ以外のペプチドタグは、HAタグよりもＮ末端側に連結されてもよく、HAタグよりもＣ末端側に連結されてもよい。

目的タンパク質が多量体タンパク質である場合、目的タンパク質を構成するサブユニッ
トの内の１つのみがHAタグを含んでいてもよく、目的タンパク質を構成するサブユニットの内の２つまたはそれ以上（例えば全て）がHAタグを含んでいてもよい。目的タンパク質が多量体タンパク質である場合、特に、目的タンパク質を構成するサブユニットの全てがHAタグを含んでいてよい。目的タンパク質を構成するサブユニットの内の２つまたはそれ以上がHAタグを含む場合、それらサブユニットに含まれるHAタグの構成（例えば、アミノ酸配列、個数、位置）は、互いに同一であってもよく、なくてもよい。目的タンパク質を構成するサブユニットの内の２つまたはそれ以上がHAタグを含む場合、HAタグについての説明はそれらサブユニットに含まれるHAタグに独立に適用できる。なお、目的タンパク質が多量体タンパク質である場合、「目的タンパク質がHAタグをX個含む」とは、目的タン
パク質を構成するサブユニットの内の少なくともいずれか１つがHAタグをX個含むことを
意味し、目的タンパク質を構成するサブユニットの内の２つまたはそれ以上（例えば全て）がそれぞれHAタグをX個含む場合も包含する。

目的タンパク質遺伝子は、上記例示したような目的タンパク質をコードするものであれば、特に制限されない。

なお、「遺伝子」という用語は、対応する発現産物をコードする限り、DNAに限られず
、任意のポリヌクレオチドを包含してよい。すなわち、「目的タンパク質遺伝子」とは、目的タンパク質をコードする任意のポリヌクレオチドを意味してよい。目的タンパク質遺伝子は、DNAであってもよく、RNAであってもよく、その組み合わせであってもよい。目的タンパク質遺伝子は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。目的タンパク質遺伝子は、一本鎖DNAであってもよく、一本鎖RNAであってもよい。目的タンパク質遺伝子は、二本鎖DNAであってもよく、二本鎖RNAであってもよく、DNA鎖とRNA鎖からなるハイブリッド鎖であってもよい。目的タンパク質遺伝子は、単一のポリヌクレオチド鎖中に、DNA
残基とRNA残基の両方を含んでいてもよい。目的タンパク質遺伝子は、イントロンを含ん
でいてもよく、含んでいなくてもよい。目的タンパク質遺伝子の態様は、目的タンパク質の発現手段等の諸条件に応じて適宜選択できる。

目的タンパク質遺伝子またはその構成要素は、例えば、クローニングにより取得できる。具体的には、例えば、目的タンパク質を有する生物からのクローニングにより目的タンパク質遺伝子の部分配列（例えば、付加配列をコードする塩基配列を含まない目的タンパク質遺伝子）を取得し、付加配列をコードする塩基配列の導入等の改変を実施することにより、目的タンパク質遺伝子を取得できる。クローニングには、ゲノムDNAやcDNA等の核
酸を利用できる。また、目的タンパク質遺伝子は、化学合成によっても取得できる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。

取得した目的タンパク質遺伝子またはその構成要素は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。すなわち、目的タンパク質遺伝子またはその構成要素を改変することにより、そのバリアントを取得することができる。目的タンパク質遺伝子またはその構成要素の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。部位特異的変異法としては
、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、目的
タンパク質遺伝子またはその構成要素のバリアントを化学合成によって直接取得してもよい。

目的タンパク質遺伝子を有する植物は、例えば、同遺伝子を植物に導入することにより取得できる。目的タンパク質遺伝子を植物に導入する形態は特に制限されない。目的タン
パク質遺伝子は、発現可能に植物に保持されていればよい。目的タンパク質遺伝子を発現可能に含む構造物を「目的タンパク質遺伝子の発現カセット」ともいう。すなわち、植物は、目的タンパク質遺伝子の発現カセットの形態で目的タンパク質遺伝子を有していてよい。例えば、目的タンパク質遺伝子をDNA等の転写を要する形態で植物に導入する場合、
目的タンパク質遺伝子は、当該植物で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。また、目的タンパク質遺伝子の発現には、さらに、他の発現調節配列（例えば、エンハンサーやターミネーター）を併用してもよい。すなわち、目的タンパク質遺伝子の発現カセットは、目的タンパク質遺伝子に加えて、例えば、発現調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）を適切な位置に含んでいてよい。植物において、目的タンパク質遺伝子は、染色体外に存在していてもよく、染色体上に導入されていてもよい。２つまたはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が発現可能に植物に保持されていればよい。なお、植物は、所望の程度に目的タンパク質を発現するまで目的タンパク質遺伝子を有していれば足りる。すなわち、植物は、目的タンパク質の発現後には、目的タンパク質遺伝子を有していてもよく、いなくてもよい。例えば、植物は、抽出時には、目的タンパク質遺伝子を有していてもよく、いなくてもよい。

プロモーターは、目的タンパク質を発現する植物において機能するものであれば、特に制限されない。「植物において機能するプロモーター」とは、植物においてプロモーター活性を有するプロモーターを意味する。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、目的タンパク質遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターは、目的タンパク質遺伝子の固有のプロモーターよりも強力なプロモーターであってもよい。植物において機能するプロモーターとしては、植物由来のプロモーターや植物ウイルス由来のプロモーターが挙げられる。植物由来のプロモーターとしては、Plant Promoter Database（ppdb）に記載のものが挙げられる。植物由来のプロモーターと
して、具体的には、ユビキチンプロモーターが挙げられる。植物ウイルス由来のプロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（Cauliflower mosaic virus；CaMV）、コメリナイエローモトルウイルス（Commelina yellow mottle virus；CoYMV）、イネツングロ桿状ウイルス（Rice tungro bacilliform virus；RTBV）、サトウキビ桿状ウイルス（Sugarcane bacilliform virus；SCBV）、大豆クロロチックモトルウイルス（Soybean chlorotic mottle virus；SbCMV）、ゴマノハグサモザイクウイルス（Figwort mosaic virus
；FMV）、カーネーションエッチドリングウイルス（Carnation etched ring virus；CERV）、落花生クロロチックストリークウイルス（Peanut chlorotic streak virus；PCSV）
、イチゴ葉脈バンディングウイルス（Strawberry vein banding virus；SVBV）、カカオ
膨梢ウイルス（Cacao swollen shoot virus；CSSV）、キャッサバ葉脈モザイクウイルス
（Cassava vein mosaic virus；CsVMV）等のDNAウイルス由来のプロモーターが挙げられ
る。カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）由来のプロモーターとしては、CaMVの35Sプ
ロモーターや19Sプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポー
ター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの
論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128
(1995)）等に記載されている。

目的タンパク質遺伝子は、例えば、同遺伝子を含むベクター（具体的には、同遺伝子の発現カセットを含むベクター）を用いて植物に導入することができる。目的タンパク質遺伝子を含むベクターを、「目的タンパク質遺伝子の発現ベクター」ともいう。目的タンパク質遺伝子の発現ベクターは、例えば、目的タンパク質遺伝子を含む核酸断片（例えばDNA断片）をベクターと連結することにより、構築することができる。目的タンパク質遺伝
子の発現ベクターを植物に導入することにより、同遺伝子を植物に導入することができる。ベクターは、薬剤耐性遺伝子などのマーカーを備えていてもよい。また、ベクターは、
挿入された遺伝子を発現するためのプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の発現調節配列を備えていてもよい。目的タンパク質遺伝子の発現ベクターの構築の際には、例えば、予め構築した目的タンパク質遺伝子の発現カセットをベクターに挿入してもよく、目的タンパク質遺伝子をベクターに備わった発現調節配列と連結してベクター上で目的タンパク質遺伝子の発現カセットを構築してもよい。ベクターは、植物の種類や目的タンパク質遺伝子の導入形態等の諸条件に応じて適宜選択できる。植物への遺伝子導入に用いることができるベクターとしては、プラスミドベクターやウイルスベクターが挙げられる。プラスミドベクターとしては、pRIシリーズベクター（TaKaRa BIO）、pCambiaシリーズベクター（Cosmo Bio）、pBIシリーズベクター（Thermo Fisher Scientific）等のバイナリーベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、植物ウイルス由来のベクターが挙げられる。植物ウイルス由来のベクターとしては、タバコモザイクウイルス（Tobacco mosaic virus；TMV）やササゲモザイクウイルス（Cowpea mosaic virus；CPMV）等のRNA
ウイルス由来のベクターや、上記例示したようなDNAウイルス由来のベクターが挙げられ
る。RNAウイルス由来の発現ベクターは、例えば、目的タンパク質遺伝子を含むDNAベクターを構築し、さらに逆転写により感染性RNAとして調製することができる。

また、目的タンパク質遺伝子は、例えば、同遺伝子を含む核酸断片（具体的には、同遺伝子の発現カセットを含む核酸断片）を植物に導入することによっても、植物に導入することができる。そのような核酸断片としては、直鎖状DNAや直鎖状RNAが挙げられる。

ベクターや核酸断片等の核酸を植物に導入する方法は、植物の種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。植物にベクターや核酸断片等の核酸を導入する方法としては、アグロバクテリウム法、ウィスカー法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法が挙げられる。また、ベクターがウイルスベクターである場合は、同ベクター（すなわちウイルス）を植物に感染させることにより、植物に同ベクターを導入することができる。

目的タンパク質遺伝子を導入する処理に供した植物は、例えば、そのまま、目的タンパク質遺伝子を有する植物として目的タンパク質の発現に利用してよい。また、例えば、目的タンパク質遺伝子を導入する処理に供した植物から目的タンパク質遺伝子を有する子孫世代の植物を取得し、当該子孫世代の植物を目的タンパク質遺伝子を有する植物として目的タンパク質の発現に利用してもよい。

目的タンパク質遺伝子を有する植物は、目的タンパク質を発現し植物内に蓄積できる限り、任意の性質を有していてよい。

＜２＞目的タンパク質の発現
目的タンパク質遺伝子を有する植物を栽培することにより、目的タンパク質を発現することができ、以て植物内に目的タンパク質を蓄積することができる。「植物の栽培」には、細胞培養や組織培養に限られず、植物体全体の栽培等の、いわゆる「栽培」も包含される。栽培により、植物は、例えば、増殖、生育、および／または分化してもよく、しなくてもよい。

培養条件は、目的タンパク質が発現する限り、特に制限されない。培養条件は、例えば、植物の種類等の諸条件に応じて適宜設定できる。培養は、例えば、植物の培養に用いられる通常の条件で実施することができる。培養は、例えば、液体培地または土壌を利用して実施してよい。液体培地または土壌は、例えば、肥料等の植物の培養に有用な成分を含有していてよい。また、必要により、目的タンパク質の発現を誘導してよい。培養は、例えば、明条件、暗条件、またはそれらの組み合わせで実施してよい。培養温度は、例えば、５～４０℃、１０～３５℃、または１５～３０℃であってよい。培養は、例えば、目的タンパク質が所望の程度に発現するまで実施してよい。培養期間は、例えば、１時間以上
、３時間以上、６時間以上、１２時間以上、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上であってもよく、３０日以下、２０日以下、１５日以下、１０日以下、７０日以下、または５日以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。培養期間は、具体的には、例えば、４～１０日であってもよい。

このようにして目的タンパク質遺伝子を有する植物を培養することにより、目的タンパク質を含有する植物が得られる。

＜３＞目的タンパク質の抽出
抽出工程は、有効成分の存在下で実施される。抽出工程を有効成分の存在下で実施することにより、目的タンパク質に由来する副生物の生成を低減することができる。すなわち、有効成分を利用することにより、有効成分を利用しない場合と比較して、抽出工程における目的タンパク質に由来する副生物の生成を低減することができる。目的タンパク質に由来する副生物を、単に、「副生物」ともいう。

「目的タンパク質に由来する副生物」とは、目的タンパク質に由来する意図しない生成物を意味してよい。副生物は、目的タンパク質の全体に由来するものであってもよく、目的タンパク質の一部に由来するものであってよい。例えば、目的タンパク質が多量体タンパク質である場合、副生物は、多量体タンパク質を構成する複数個または複数種のサブユニットの内の少なくとも１個または少なくとも１種に由来するものであってもよく、それらサブユニットの全てに由来するものであってもよい。副生物としては、目的タンパク質に由来する、意図しない共有結合が生じた生成物が挙げられる。意図しない共有結合は、例えば、目的タンパク質分子内および／または目的タンパク質分子間で生じてよい。「共有結合が目的タンパク質分子内で生じる」とは、目的タンパク質が多量体タンパク質である場合にあっては、共有結合が目的タンパク質分子内のサブユニット間で生じる場合も包含される。意図しない共有結合としては、ジチロシン架橋が挙げられる。ジチロシン架橋としては、目的タンパク質に含まれるHAタグ内に存在するチロシン残基間で生じるジチロシン架橋が挙げられる。副生物として、具体的には、目的タンパク質の類縁体や目的タンパク質の凝集体が挙げられる。「目的タンパク質の類縁体」とは、目的タンパク質に由来する副生物であって、目的タンパク質分子内に意図しない共有結合を生じたものを意味してよい。目的タンパク質の類縁体としては、目的タンパク質が多量体タンパク質である場合に、多量体タンパク質分子内の２個またはそれ以上のサブユニットがジチロシン架橋等の意図しない共有結合で結合することにより生じた生成物が挙げられる。「目的タンパク質の凝集体」とは、目的タンパク質に由来する副生物であって、目的タンパク質分子間に意図しない共有結合を生じたものを意味してよい。目的タンパク質の凝集体としては、２分子またはそれ以上の目的タンパク質がジチロシン架橋等の意図しない共有結合で結合することにより生じた生成物が挙げられる。副生物は、例えば、可溶性のものであってもよく、沈殿性のものであってもよい。

副生物の生成の低減としては、植物の乾燥重量当たりの副生物の生成量の低減、目的タンパク質の発現量に対する副生物の生成量の比率の低減、目的タンパク質の収量に対する副生物の生成量の比率の低減が挙げられる。

抽出時の副生物の生成を低減することにより、例えば、目的タンパク質の生産が向上してよい。目的タンパク質の生産の向上としては、植物の乾燥重量当たりの目的タンパク質の収量の増大、目的タンパク質の発現量に対する目的タンパク質の収量の比率の増大、副生物の生成量に対する目的タンパク質の収量の比率の増大が挙げられる。

抽出工程に用いられる植物は、目的タンパク質を含有する限り、特に制限されない。抽出工程には、植物体の全体を用いてもよく、植物体の一部を用いてもよい。また、抽出工
程には、取得した目的タンパク質を含有する植物の全体を用いてもよく、取得した目的タンパク質を含有する植物の一部を用いてもよい。例えば、植物体の全体を培養して目的タンパク質を含有する植物を取得し、その一部（例えば葉）を分取して抽出工程に用いてもよい。

有効成分としては、酸化防止剤および／または金属封鎖剤が用いられる。

「酸化防止剤」とは、直接的または間接的に対象物の酸化を抑制できる成分を意味してよい。酸化防止剤は、副生物の生成を低減できるものであれば、特に制限されない。副生物の生成の低減は、例えば、抽出系に存在する過酸化水素が酸化防止剤の利用により分解されることによるものであってよい。すなわち、酸化防止剤は、例えば、過酸化水素の除去に寄与するものであってよい。酸化防止剤としては、アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、亜硫酸、トコフェロール、エトキシキン、システイン、γ－グルタミルシステイン、還元型グルタチオン、二酸化マンガン、カタラーゼが挙げられる。これらの成分は、いずれも、過酸化水素の除去に寄与してよい。アスコルビン酸としては、Ｌ－アスコルビン酸が挙げられる。酸化防止剤としては、特に、Ｌ－アスコルビン酸等のアスコルビン酸、イソアスコルビン酸、亜硫酸が挙げられる。酸化防止剤としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。

「金属封鎖剤」とは、金属イオンを封鎖できる成分を意味してよい。金属封鎖剤を「キレート剤」ともいう。金属封鎖剤は、副生物の生成を低減できるものであれば、特に制限されない。金属封鎖剤としては、EDTA（ethylene diamine tetraacetic acid）、NTA（nitrilo triacetic acid）、DTPA（diethylene triamine pentaacetic acid）、HEDTA（hydroxyethyl ethylene diamine triacetic acid）、TTHA（triethylene tetramine hexaacetic acid）、PDTA（1,3-propanediamine tetraacetic acid）、DPTA-OH（1,3-diamino-2-hydroxypropane tetraacetic acid）、HIDA（hydroxyethyl imino diacetic acid）、DHEG（dihydroxyethyl glycine）、GEDTA（glycol ether diamine tetraacetic acid）、CMGA（dicarboxymethyl glutamic acid）、EDDS（(S,S)‐ethylene diamine disuccinic acid）、HEDP（hydroxyethylidene diphosphonic acid）、NTMP（nitrilotris (methylene phosphonic acid)）、PBTC（phosphonobutane tricarboxylic acid）、EDTMP（ethylene diamine tetra (methylene phosphonic acid)）が挙げられる。金属封鎖剤としては、特に、EDTAが挙げられる。金属封鎖剤としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。

塩を形成し得る成分は、いずれも、フリー体として使用されてもよく、塩として使用されてもよく、それらの組み合わせとして使用されてもよい。すなわち、「有効成分」という用語は、特記しない限り、フリー体の有効成分、もしくはその塩、またはそれらの組み合わせを意味してよい。具体的には、例えば、「アスコルビン酸」という用語は、特記しない限り、フリー体のアスコルビン酸、もしくはその塩、またはそれらの組み合わせを意味してよい。また、これらの成分（例えば、フリー体や塩）は、いずれも、特記しない限り、無水物および水和物を包含してよい。塩は、副生物の生成を低減できるものであれば、特に制限されない。例えば、カルボキシル基等の酸性基に対する塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロへキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。また、例えば、アミノ基等の塩基性基に対する塩としては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸、メチルマロン酸等の有機カルボン酸
との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩が挙げられる。具体的には、例えば、アスコルビン酸の塩としては、特に、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸カルシウムが挙げられる。また、具体的には、例えば、亜硫酸の塩としては、特に、亜硫酸ナトリウムが挙げられる。塩としては、１種の塩を用いてもよく、２種またはそれ以上の塩を組み合わせて用いてもよい。

有効成分の使用濃度は、副生物の生成を低減できる限り、特に制限されない。

有効成分の使用濃度は、例えば、１ｍＭ以上、３ｍＭ以上、５ｍＭ以上、７ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、１５ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、２５ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、６０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、８０ｍＭ以上、９０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、１２０ｍＭ以上、１５０ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、２５０ｍＭ以上、３００ｍＭ以上、３５０ｍＭ以上、４００ｍＭ以上、４５０ｍＭ以上、または５００ｍＭ以上であってもよく、１５００ｍＭ以下、１２００ｍＭ以下、１０００ｍＭ以下、９００ｍＭ以下、８００ｍＭ以下、７００ｍＭ以下、６００ｍＭ以下、５００ｍＭ以下、４５０ｍＭ以下、４００ｍＭ以下、３５０ｍＭ以下、３００ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、１５０ｍＭ以下、１４０ｍＭ以下、１３０ｍＭ以下、１２０ｍＭ以下、１１０ｍＭ以下、１００ｍＭ以下、９０ｍＭ以下、８０ｍＭ以下、７０ｍＭ以下、６０ｍＭ以下、または５０ｍＭ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。有効成分の使用濃度は、具体的には、例えば、２５～１５００ｍＭ、２５～１０００ｍＭ、２５～７００ｍＭ、２５～５００ｍＭ、２５～３００ｍＭ、２５～１５０ｍＭ、５０～１５０ｍＭ、６０～１４０ｍＭ、７０～１３０ｍＭ、８０～１２０ｍＭ、９０～１１０ｍＭ、１００～３００ｍＭ、２００～４００ｍＭ、３００～５００ｍＭ、４００～６００ｍＭ、１～１５０ｍＭ、３～１００ｍＭ、または５～５０ｍＭであってもよい。「有効成分の使用濃度」とは、抽出系（植物自体は除く）における有効成分の濃度を意味してよい。「有効成分の使用濃度」とは、具体的には、植物の破砕が実施される液体（植物自体は除く）における有効成分の濃度を意味してよい。「有効成分の濃度」とは、有効成分として２種またはそれ以上の成分を選択した場合には、特記しない限り、それら成分の総濃度を意味してよい。

有効成分が酸化防止剤を含む（すなわち、有効成分として少なくとも酸化防止剤が選択される）場合、酸化防止剤の使用濃度は、例えば、上記例示した有効成分の使用濃度の範囲であってよい。有効成分が酸化防止剤を含む場合、酸化防止剤の使用濃度は、例えば、特に、２５ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、６０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、８０ｍＭ以上、９０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、１２０ｍＭ以上、または１５０ｍＭ以上であってもよい。有効成分が酸化防止剤を含む場合、酸化防止剤の使用濃度は、具体的には、例えば、２５～１５００ｍＭ、２５～１０００ｍＭ、２５～７００ｍＭ、２５～５００ｍＭ、２５～３００ｍＭ、２５～１５０ｍＭ、５０～１５０ｍＭ、６０～１４０ｍＭ、７０～１３０ｍＭ、８０～１２０ｍＭ、９０～１１０ｍＭ、１００～３００ｍＭ、２００～４００ｍＭ、３００～５００ｍＭ、または４００～６００ｍＭであってもよい。「酸化防止剤の濃度」とは、酸化防止剤として２種またはそれ以上の成分を選択した場合には、特記しない限り、それら成分の総濃度を意味してよい。

有効成分が金属封鎖剤を含む（すなわち、有効成分として少なくとも金属封鎖剤が選択される）場合、金属封鎖剤の使用濃度は、例えば、上記例示した有効成分の使用濃度の範囲であってよい。有効成分が金属封鎖剤を含む場合、金属封鎖剤の使用濃度は、例えば、特に、１ｍＭ以上、３ｍＭ以上、５ｍＭ以上、７ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、１５ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、２５ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、または５０ｍＭ以上であってもよい。有効成分が金属封鎖剤を含む場合、金属封鎖剤の使用濃度は、具体的には、
例えば、１～１５０ｍＭ、３～１００ｍＭ、または５～５０ｍＭであってもよい。「金属封鎖剤の濃度」とは、金属封鎖剤として２種またはそれ以上の成分を選択した場合には、特記しない限り、それら成分の総濃度を意味してよい。

有効成分がカタラーゼを含む（すなわち、有効成分として少なくともカタラーゼが選択される）場合、カタラーゼの使用濃度は、例えば、１０Ｕ／ｍＬ以上、２０Ｕ／ｍＬ以上、５０Ｕ／ｍＬ以上、１００Ｕ／ｍＬ以上、２００Ｕ／ｍＬ以上、５００Ｕ／ｍＬ以上、１０００Ｕ／ｍＬ以上、２０００Ｕ／ｍＬ以上、５０００Ｕ／ｍＬ以上であってもよく、５０００００Ｕ／ｍＬ以下、２０００００Ｕ／ｍＬ以下、１０００００Ｕ／ｍＬ以下、５００００Ｕ／ｍＬ以下、２００００Ｕ／ｍＬ以下、１００００Ｕ／ｍＬ以下、５０００Ｕ／ｍＬ以下、２０００Ｕ／ｍＬ以下、１０００Ｕ／ｍＬ以下、または５００Ｕ／ｍＬ以下であってもよく、それらの矛盾しない組み合わせの範囲であってもよい。有効成分がカタラーゼを含む場合、カタラーゼの使用濃度は、具体的には、例えば、１０～１０００００Ｕ／ｍＬ、１００～５００００Ｕ／ｍＬ、または１０００～２００００Ｕ／ｍＬであってもよい。なお、pH 7.0、25°C、1分間で、1 μmolの過酸化水素を分解する酵素量を1 Uのカタラーゼ活性とする。

有効成分を使用するタイミングは、副生物の生成を低減できる限り、特に制限されない。有効成分は、抽出工程の全期間において抽出系に存在していてもよく、抽出工程の一部の期間においてのみ抽出系に存在していてもよい。「抽出が有効成分の存在下で実施される」とは、有効成分が抽出工程の全期間において抽出系に存在することを要しない。有効成分は、例えば、抽出工程の開始時に抽出系に存在していてもよく、そうでなくてもよい。有効成分が抽出工程の開始時に抽出系に存在しない場合、抽出工程の開始後に有効成分が抽出系に供給される。有効成分が抽出工程の開始時に抽出系に存在しない場合、例えば、抽出工程の開始から５秒以内、１０秒以内、１５秒以内、２０秒以内、３０秒以内、または１分以内に有効成分が抽出系に供給されてよい。有効成分は、典型的には、抽出開始時に抽出系に存在していてよい。「抽出工程の開始時」とは、例えば、植物を破砕する処理を開始する時点を意味してよい。有効成分は、例えば、抽出工程の全期間において上記例示した濃度で抽出系に存在していてもよく、抽出工程の一部の期間においてのみ上記例示した濃度で抽出系に存在していてもよい。有効成分は、例えば、抽出工程の開始時に上記例示した濃度で抽出系に存在していてもよく、抽出工程の開始後に上記例示した濃度となるように抽出系に供給されてもよい。

抽出工程は、有効成分の存在下で実施すること以外は、例えば、植物からタンパク質を抽出する通常の方法により実施することができる。抽出は、例えば、植物を（具体的には植物を構成する細胞）を破砕することにより実施することができる。植物の破砕は、水や水性緩衝液等の液体中で実施できる。破砕は、例えば、植物細胞等の細胞を破砕する公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、超音波破砕法、ダイノミル法、ビーズ破砕、フレンチプレス破砕、ミルによる破砕、凍結乾燥粉末化処理、リゾチーム処理が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。

このようにして抽出工程を実施することにより、目的タンパク質を含有する抽出物（例えば破砕物）が得られる。

目的タンパク質は、適宜、抽出物（例えば破砕物）から回収することができる。すなわち、本発明の方法は、さらに、目的タンパク質を抽出物から回収する工程を含んでいてよい。目的タンパク質は、具体的には、目的タンパク質を含有する適当な画分として抽出物から回収することができる。そのような画分としては、抽出物の上清やその精製物が挙げられる。目的タンパク質は、所望の程度に精製されてよい。例えば、抽出物の上清を取得
し、抽出物の上清から目的タンパク質を精製してよい。抽出物の上清は、例えば、固液分離手段により取得できる。固液分離手段としては、濾過や遠心分離が挙げられる。目的タンパク質の精製は、例えば、タンパク質の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。

目的タンパク質は、遊離の状態で取得されてもよいし、樹脂等の固相に固定化された固定化酵素の状態で取得されてもよい。

回収した目的タンパク質は、適宜、製剤化してもよい。剤形は特に制限されず、目的タンパク質の使用用途等の諸条件に応じて適宜設定することができる。剤形としては、例えば、液剤、懸濁剤、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤が挙げられる。製剤化にあたっては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定化剤、矯味剤、矯臭剤、香料、希釈剤、界面活性剤等の薬理学的に許容される添加剤を使用することができる。

以下、非限定的な実施例を参照して、本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１
１．材料と方法
（１）タバコの栽培
目的タンパク質の発現宿主として、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana；以
下、単に「タバコ」という）を選択した。ウレタンマットに2倍に希釈した大塚液肥A処方を吸水させ、タバコ種子を播種した。ウレタンマットにラップをかけ、25℃、明所（16時間日長）で、2週間栽培した。子葉の展開を確認後、ラップを取り、ウレタンマットを小
分けにし、水耕栽培用パネルに移植した。水耕栽培用パネルを2倍に希釈した大塚液肥A処方を入れたバットに浮かせて、25℃、明所（16時間日長）、1,000 ppm CO₂条件下で、さ
らに3週間栽培を継続した。タバコを人工光型養液栽培装置（24℃、16時間日長、1,000 ppm CO₂）に定植し、さらに2週間栽培を継続し、本葉が12枚程度に展開したタバコを取得
した。取得したタバコを下記のインフィルトレーション処理に用いた。

（２）ベクターの構築とアグロバクテリウムへの導入
目的タンパク質として、ヒトLaminin511E8、DLL4-Fc、線維芽細胞増殖因子-4（FGF-4）、及び肝細胞増殖因子（HGF）を選択した。

ヒトLamininのα５鎖E8、β１鎖E8、γ１鎖E8のアミノ酸配列を配列番号２～４に、そ
れらをコードする塩基配列を配列番号５～７に示す。α５鎖E8のN末端に6個のHisからな
る付加配列を付加したアミノ酸配列、α５鎖E8のN末端に3個のHAタグと10個のHisからな
る付加配列を付加したアミノ酸配列、β１鎖E8のN末端に3個のHAタグからなる付加配列を付加したアミノ酸配列、およびγ１鎖E8のN末端に3個のHAタグからなる付加配列を付加したアミノ酸配列をデザインした。付加配列を含むα５鎖E8、β１鎖E8、およびγ１鎖E8、ならびに付加配列を含まないβ１鎖E8およびγ１鎖E8のそれぞれのN末端に小胞体への移
行シグナルを付加したアミノ酸配列をデザインし、それらをコードする遺伝子を合成した。6個のHisからなる付加配列のアミノ酸配列を配列番号８に、それをコードする塩基配列を配列番号９に示す。3個のHAタグと10個のHisからなる付加配列のアミノ酸配列を配列番号１０に、それをコードする塩基配列を配列番号１１に示す。3個のHAタグからなる付加
配列のアミノ酸配列を配列番号１２に、それをコードする塩基配列を配列番号１３に示す。小胞体への移行シグナルを配列番号１４に、それをコードする塩基配列を配列番号１５
に示す。

DLL4-Fcのアミノ酸配列を配列番号１６に、DLL4-Fcをコードする塩基配列を配列番号１７に示す。DLL4-FcのN末端に3個のHAタグと10個のHisからなる付加配列を付加し、さらにそのN末端に小胞体への移行シグナルを付加したアミノ酸配列をデザインし、それをコー
ドする遺伝子を合成した。

FGF-4のアミノ酸配列を配列番号１８に、それをコードする塩基配列を配列番号１９に
示す。FGF-4のN末端に3個のHAタグと10個のHisからなる付加配列を付加し、さらにそのN
末端に小胞体への移行シグナルを付加したアミノ酸配列をデザインし、それをコードする遺伝子を合成した。

HGFのアミノ酸配列を配列番号２０に、それをコードする塩基配列を配列番号２１に示
す。HGFのN末端に3個のHAタグと10個のHisからなる付加配列を付加し、さらにそのN末端
に小胞体への移行シグナルを付加したアミノ酸配列をデザインし、それをコードする遺伝子を合成した。

各遺伝子をアグロバクテリウム感染用のbinary vectorであるpRI201-ANに挿入し、各遺伝子を含むbinary vectorを得た。ヒトLaminin511E8については、３断片の遺伝子をそれ
ぞれ含むbinary vectorからそれら遺伝子の発現カセットを取得して連結し、連結物をpRI201-ANのL-borderとR-border間に挿入し、それら遺伝子のセットを含むbinary vectorを
得た。各遺伝子または遺伝子のセットを含むbinary vectorでAgrobacterium tumefaciens
EHA105を形質転換し、各遺伝子または遺伝子のセットを含むアグロバクテリウムを取得
した。

（３）アグロバクテリウムの培養
20 ml YEP培地（1％ Yeast Extract, 1% Peptone, 0.5%塩化ナトリウム）に抗生物質の100 mg/Lリファンピシリン及び50 mg/l カナマイシンを添加し、各遺伝子を含むアグロバクテリウムを植菌し、28℃で一晩振とう培養した。さらに、翌日500 ml YEP培地に、同様に抗生物質を添加し、20 ml YEP培地で増幅させた培養液を全量移植し、28℃で一晩培養
した。培養液は、500 mlの遠心ボトルに入れ、4,600 rpm, 22℃で10分間遠心し、菌体を
回収した。この菌体はMES buffer（1.952g/l MES, 2.033g/l MgCl2・6H2O, pH5.7）に懸
濁し、OD600が0.5になるように調整し、アグロバクテリウム懸濁液を取得した。取得した懸濁液を下記のインフィルトレーション処理に用いた。

（４）インフィルトレーション処理とサンプリング
タバコを、2 Lビーカーに入れたアグロバクテリウム懸濁液に、地上部全体が漬かるよ
うにゆっくり入れた。そのビーカーをデシケーター内に入れ、真空ポンプを用いて、-0.09 MPaになるまで減圧し、2分間静置した後、コックを開放し、減圧を解除した（これにより、アグロバクテリウム懸濁液が、葉組織表皮内に入り込む）。この操作を繰り返し、目的タンパク質ごとに、10株程度の感染処理を行った。感染処理を行ったタバコは、人工光型養液栽培装置（20℃、16時間日長、1,000 ppm CO₂）で栽培を行った。感染から7日目のタバコ葉を約50 gサンプリングし、-20℃で保存した。

（５）抽出と解析
タバコ葉20 gに対し、L-アスコルビン酸ナトリウム（Vitamin C；V.C）を含有しない抽出buffer（50 mM リン酸Na, 500 mM NaCl, pH 8.5）またはL-アスコルビン酸ナトリウム
を含有する抽出buffer（50 mM リン酸Na, 500 mM NaCl, 200 mM L-アスコルビン酸ナトリウム, pH 8.5）120 gを添加した。ハンドミキサー（商品名：スリム＆ライト ハンドブレンダー、型番：HB-202BKJ、メーカー名：Cuisinart）を用いてタバコ葉を3分間破砕した
。破砕物に1.0 M NaOHを添加してpH 8.5に調整した。4℃、10,000 xGで30分間遠心を実施した。デカント操作で上清を回収し、0.22 μmフィルターで濾過した。濾液をHis-affinity精製（表１）に供し、溶離液を回収した。溶離液をSDS-PAGEに供し、目的タンパク質を検出した。検出は、ヒトLaminin511E8についてはCBB染色により、DLL4-Fc、FGF-4、及びHGFについてはWestern blottingにより実施した。Western blottingは、DLL4-Fcについて
は抗Fc抗体を、FGF-4及びHGFについては抗HAタグ抗体を用いて実施した。

２．結果
（１）Laminin511E8の発現について
Laminin511E8の結果を図１に示す。

α鎖のN末側に6個のHisを付加してLaminin511E8を発現させた場合、各断片の発現量が
低く、且つ標品（iMatrix-511）のβγ鎖よりも低分子の位置にβγ鎖の分解物と想定さ
れるバンドが認められた（図１のパネル（a））。一方、α鎖のN末側に3個のHAタグと10
個のHisを付加し、且つβ鎖とγ鎖のN末側に3個のHAタグを付加してLaminin511E8を発現
させた場合、各断片の発現量が劇的に増加し、且つβγ鎖の分解が抑制された（図１のパネル（b）および（c））。

ここで、α鎖、β鎖、γ鎖のそれぞれにHAタグを付加してLaminin511E8を発現させ、L-アスコルビン酸ナトリウムの非存在下で抽出を実施した場合、α鎖とβγ鎖が分子内共有結合したlaminin511E8類縁体と想定される高分子の濃いバンドが認められた（図１のパネ
ル（b））。一方、高濃度のL-アスコルビン酸ナトリウムの存在下で抽出を実施すること
により、laminin511E8類縁体が減少し、α鎖及びβγ鎖の濃いバンドが認められた（図１のパネル（c））。laminin511E8類縁体は、α鎖、β鎖、γ鎖のそれぞれに付加したHAタ
グ内に存在するTyr残基が、過酸化水素の存在下で植物内在性ペルオキシダーゼによりジ
チロシン架橋して生じたものと考えられる。よって、L-アスコルビン酸ナトリウム等のラジカルスカベンジャーを利用することにより、過酸化水素（ラジカル）を除去することができ、以てlaminin511E8類縁体の生成を抑制できると考えられる。

（２）DLL4-Fc、FGF-4、及びHGFの発現について
DLL4-Fc、FGF-4、及びHGFの結果を図２に示す。DLL4-Fc及びFGF-4の場合、3個のHAタグと10個のHisをN末側に付加して発現させ、L-アスコルビン酸ナトリウムを含有しない抽出バッファーで抽出したところ、高分子領域にタンパク質の凝集体が多数認められた。また、HGFの場合、3個のHAタグと10個のHisをN末側に付加して発現させ、L-アスコルビン酸ナトリウムを含有しない抽出バッファーで抽出したところ、タンパク質のバンドがほとんど認められなかったことから、ゲル内に入らない高分子量の凝集体を形成したと考えられる。これらの凝集体は、いずれも、各タンパク質がジチロシン架橋により結合したものと考えられる。一方、各タンパク質を高濃度のL-アスコルビン酸ナトリウムを含有する抽出バッファーで抽出したところ、凝集体のバンドは減少し、各タンパク質の濃いバンドが認められた（図２）。

実施例２
実施例１と同様の手順で、Laminin511E8を発現するタバコ葉からLaminin511E8を抽出し、解析を実施した。ただし、抽出には、L-アスコルビン酸ナトリウム（Vitamin C；V.C）を含有しない抽出buffer（50 mM リン酸Na, 500 mM NaCl, pH 8.5）または25, 50, 100, 200, または500 mM L-アスコルビン酸ナトリウムを含有する抽出buffer（50 mM リン酸Na, 500 mM NaCl, L-アスコルビン酸ナトリウム, pH 8.5）を用い、破砕物に1.0 M NaOHを
添加してpH 8.5に調整した後に４℃で一晩静置してから遠心を実施した。

結果を図３および４に示す。いずれの濃度のL-アスコルビン酸ナトリウムを含有する抽出バッファーで抽出した場合にも、laminin511E8類縁体の減少およびlaminin511E8の得量の向上が認められた。特に、50 mM以上のL-アスコルビン酸ナトリウムを含有する抽出バ
ッファーで抽出した場合に、laminin511E8類縁体はほぼ完全に消失した。また、特に、100 mMのL-アスコルビン酸ナトリウムを含有する抽出バッファーで抽出した場合に、laminin511E8の得量が最大となった。

実施例３
実施例１と同様の手順で、Laminin511E8を発現するタバコ葉からLaminin511E8を抽出し、解析を実施した。ただし、抽出には、添加剤を含有しない抽出buffer（50 mM リン酸Na, 500 mM NaCl, pH 8.5）または添加剤（200 mM L-アスコルビン酸ナトリウム, 200 mM
イソアスコルビン酸, 200 mM 亜硫酸ナトリウム, または10 mM EDTA）を含有する抽出buffer（50 mM リン酸Na, 500 mM NaCl, 添加剤, pH 8.5）を用い、破砕物に1.0 M NaOHを添加してpH 8.5に調整した後に４℃で一晩静置してから遠心を実施した。

結果を図５および６に示す。いずれの添加剤を含有する抽出バッファーで抽出した場合にも、laminin511E8類縁体の減少およびlaminin511E8の得量の向上が認められた。

＜配列表の説明＞
配列番号１：HAタグのアミノ酸配列
配列番号２：ヒトラミニンα５E8のアミノ酸配列
配列番号３：ヒトラミニンβ１E8のアミノ酸配列
配列番号４：ヒトラミニンγ１E8のアミノ酸配列
配列番号５：ヒトラミニンα５E8をコードする塩基配列
配列番号６：ヒトラミニンβ１E8をコードする塩基配列
配列番号７：ヒトラミニンγ１E8をコードする塩基配列
配列番号８：6個のHisからなる付加配列のアミノ酸配列
配列番号９：6個のHisからなる付加配列をコードする塩基配列
配列番号１０：3個のHAタグと10個のHisからなる付加配列のアミノ酸配列
配列番号１１：3個のHAタグと10個のHisからなる付加配列をコードする塩基配列
配列番号１２：3個のHAタグからなる付加配列のアミノ酸配列
配列番号１３：3個のHAタグからなる付加配列をコードする塩基配列
配列番号１４：小胞体への移行シグナルのアミノ酸配列
配列番号１５：小胞体への移行シグナルをコードする塩基配列
配列番号１６：DLL4-Fcのアミノ酸配列
配列番号１７：DLL4-Fcをコードする塩基配列
配列番号１８：FGF-4のアミノ酸配列
配列番号１９：FGF-4をコードする塩基配列
配列番号２０：HGFのアミノ酸配列
配列番号２１：HGFをコードする塩基配列

Claims (26)

1. 目的タンパク質の製造方法であって、
   目的タンパク質を含有する植物から該目的タンパク質を抽出する工程を含み、
   前記抽出が、有効成分の存在下で実施され、
   前記有効成分が、酸化防止剤および／または金属封鎖剤であり、
   前記目的タンパク質が、前記抽出時にHAタグを含む、方法。
2. 前記抽出の前に、さらに、前記目的タンパク質をコードする遺伝子を有する植物に該遺伝子を発現させることにより前記目的タンパク質を含有する植物を取得する工程を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記植物が、ナス科（Solanaceae）植物である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記植物が、ベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）またはタバコ（Nicotiana
   tabacum）である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記目的タンパク質が、植物の葉から抽出される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記有効成分が、Ｌ－アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、亜硫酸、トコフェロール、エトキシキン、システイン、γ－グルタミルシステイン、還元型グルタチオン、二酸化マンガン、カタラーゼ、及びEDTAから選択される１種またはそれ以上の成分である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記有効成分が、Ｌ－アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、亜硫酸、及びEDTAから選択される１種またはそれ以上の成分である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記有効成分が、Ｌ－アスコルビン酸である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記有効成分が前記酸化防止剤を含む場合、前記抽出時の前記酸化防止剤の使用濃度が、２５ｍＭ以上である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記有効成分が前記酸化防止剤を含む場合、前記抽出時の前記酸化防止剤の使用濃度が、２５～１５００ｍＭである、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記有効成分が前記酸化防止剤を含む場合、前記抽出時の前記酸化防止剤の使用濃度が、５０～１５０ｍＭである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記有効成分が前記金属封鎖剤を含む場合、前記抽出時の前記金属封鎖剤の使用濃度が、１ｍＭ以上である、請求項１～７および９～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記有効成分が前記金属封鎖剤を含む場合、前記抽出時の前記金属封鎖剤の使用濃度が、５～５０ｍＭである、請求項１～７および９～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記有効成分が、前記抽出の開始時に抽出液に含有されているか、前記抽出の開始から１分以内に抽出液に供給される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記HAタグが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のペプチドである、請求項１
    ～１４のいずれか１項に記載の方法：
    （ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を含むペプチド；
    （ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において、１～４個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含むペプチドであって、チロシン残基を含み、且つ、目的タンパク質に付加することにより植物における目的タンパク質の発現量を増大させる機能を有するペプチド；
    （ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対して５０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むペプチドであって、チロシン残基を含み、且つ、目的タンパク質に付加することにより植物における目的タンパク質の発現量を増大させる機能を有するペプチド。
16. 前記HAタグが、チロシン残基を１～５個含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記目的タンパク質が、前記抽出時に前記HAタグを１～５個含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記目的タンパク質が、異種タンパク質である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記目的タンパク質が、ヒト由来タンパク質である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記目的タンパク質が、多量体タンパク質である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記多量体タンパク質を構成するサブユニットの全てが、前記抽出時に前記HAタグを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記多量体タンパク質を構成するサブユニットの全てが、それぞれ、前記抽出時に前記HAタグを１～５個含む、請求項２０または２１に記載の方法。
23. 前記目的タンパク質が、細胞外タンパク質、成長因子、およびNotchリガンドから選択
    される１種またはそれ以上のタンパク質である、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記目的タンパク質が、ラミニンまたはその部分配列である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記目的タンパク質が、ラミニン511E8である、請求項１～２４のいずれか１項に記載
    の方法。
26. 前記抽出の後に、さらに、前記抽出により得られた抽出物から前記目的タンパク質を回収することを含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。

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