KR20070091157A - 단백질 단리 및 정제 - Google Patents

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미리암 바스티다 비르히리
블란카 롬파르트 로요
파블로 마르사발 루나
마르가리타 토렌트 쿠에트글라스
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에라 바이오테크, 에스.에이.
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Abstract

숙주 세포들에서 재조합 단백질체-유사 조립체들 (RPBLAs)로서 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법이 개시되며, 여기에서 융합 단백질을 예정된 밀도를 갖는 RPBLAs 로서 발현하는 형질전환된 숙주 세포들의 수성 균질물이 제공된다. 상이한 밀도의 영역들이 상기 균질물 중에 형성되어 상대적으로 증가된 농도의 RPBLAs를 함유하는 영역 및 상대적으로 고갈된 농도의 RPBLAs를 함유하는 영역을 제공한다. 상기 RPBLAs-고갈된 영역은 상대적으로 증가된 농도의 RPBLAs의 영역으로부터 분리되어, 상기 융합 단백질을 정제한다. 상기 상대적으로 증가된 농도의 RPBLAs의 영역은 그 후 원하는 바에 따라, 수집될 수 있다.

Description

단백질 단리 및 정제{PROTEIN ISOLATION AND PURIFICATION}
본 발명은 재조합 단백질체-유사 조립체들 (recombinant protein body-like assemblies: RPBLAs) 중에서 축적된 재조합 단백질들을 정제하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 밀도 차이에 의해, 기타 숙주 세포의 세포 소기관들로부터의 단리를 허용하는, 재조합 단백질체-유사 조립체 내의 재조합 단백질들의 단리를 제공하며, 여기에서 바람직한 재조합 단백질은 농축되어, 기타 세포 성분들로부터 분리되고 쉽게 회수될 수 있다.
단백질체들 (PBs)은 단백질 축적에 대해 특수화된 세포내의 세포 소기관들 (또는 직경이 약 1-3 미크론이고 막에 의해 둘러싸인 큰 액포들)이다. 이들은 종자와 같은, 일부 특이적 식물 조직들에서 자연적으로 형성되어, 발아 및 모종 성장을 위한 아미노산들의 주요 공급원으로서의 역할을 한다.
저장 단백질들은 소포체 (ER)의 내강 내로, 신호 펩티드를 통해 공-번역적으로(co-translationally) 삽입되어 ER 내로 또는 액포들 내로 봉입되고 (packaged) (Galili 등, 1993 Trends Cell Biol. 3:437-443) 이들 세포내 구역들 내부의 다량체성 단위들 내로 조립되어, (ER)-유도된 단백질체들 (PBs) 또는 단백질 저장 액포들 (PSV)로 불리우는 특이적 세포 소기관들을 발생시킨다 (Okita 및 Rogers, 1996 Annu. Rev. Plant Physiol Mol. Biol . 47:327-350; Herman 및 Larkins, 1999 Plant Cell 11:601-613; Sanderfoot 및 Raikel, 1999 Plant Cell 11:629-642).
쌍떡잎 식물들의 저장 단백질들은 7S 글로불린 또는 비실린 (vicilin) 유형, 11S 글로불린 또는 레규민(legumin) 유형 단백질들과 같은 일차적으로 가용성인 단백질들이고, 다른 단백질들 (즉, 프로테아제 저해제들, 단백질저해 효소들, 렉틴류 (lectins) 등), 당류 및 염류와 함께 PSVs 내에서 격리된다.
PSVs와 대조적으로, PBs (1-3 미크론)는 주로, 곡류의 극소수성 저장 단백질인 (예로서, 옥수수의 제인 및 밀의 글리아딘) 프롤라민류를 격리하고, 다른 보조 단백질들은 적다 (Herman 및 Larkins, 1999 Plant Cell 11:601-613).
현재, 소포체를 제외하고, PBs 는 식물 종자들 외의 다른 조직들에서는 발견된 적이 없다. 소포체들은 크기가 작고 (0.2-0.4 마이크로미터), 아기장대 (Arabidopsis) 잎들에서 단지 곤충들에 의한 상처 및 씹힘에 의해서만 형성되고, 정상적인 조건 하에서는 발생되지 않는다 (Matsushima 등, 2003 Plant J. 33:493-502).
식물 PBs 형성, 저장 단백질 조립 및 표적화 (targeting)를 연구하기 위해 유전공학적 시도들이 사용되어 왔다. 재조합 단백질들, 주로 식물 저장 단백질들이 아기장대 및 담배에서 발현 및 봉입되는 경우, (생장 조직으로서) PBs 를 함유하지 않은 식물 조직들은 이들 세포 소기관들을 "새로이" 발생시키는 것으로 나타났다 (Bagga 등, 1997 Plant Cell 9:1683-1696 및 Bagga 등, 1995 Plant Physiol. 107:13-23, 및 US 특허 제 5,990,384호, 제 5,215,912호, 및 제 5,589,616호; 및 Geli 등, 1994 Plant Cell 6:1911-1922).
유전자 전이 (transgenic) 담배 식물에서 발현된 옥수수 베타-제인은 잎 세포들에서 새롭게 형성된 ER-유도된 PBs 에서 정확하게 표적화되었다 (Bagga 등, 1995 Plant Physiol. 107:13-23). 옥수수 감마-제인 및 아기장대 식물에서 발현된 절단된(truncated) 감마-제인 cDNAs 도 잎들에서 신규 ER-유도된 PBs 에서 축적된다 (Geli 등, 1994 Plant Cell 6:1911-1922). 옥수수 내배유에서 발현된 리신-풍부 감마-제인들 (Torrent 등 1997 Plant Mol. Biol. 34(1):139-149)은 옥수수 PBs 에서 축적되고, 내생 제인들과 함께 공동 분포 위치된다 (co-localized). 알파 제인 유전자를 발현하는 유전자 전이 담배 식물들은, 알파-제인이 PBs 를 형성할 수 없다는 것을 증명하였다. 그러나, 알파- 및 감마-제인이 공동발현된 경우, 알파-제인의 안정성이 증가되었으며, 두 단백질들 모두 ER-유도된 단백질체들에서 공동 분포위치되었다 (Coleman 등, 1996 Plant Cell 8:2335-2345). 신규 PBs의 형성도, 메티오닌 풍부 10 kDa 델타-제인으로 형질 전환된 유전자 전이 콩에서 설명되었다 (Bagga 등, 2000 Plant Sci. 150:21-28).
재조합 저장 단백질들은 개구리 난모세포들(Xenopus oocytes) 및 효모와 같은 비식물성 숙주계의 PBs-유사 세포 소기관들에서도 조립된다. Rosenberg 등, 1993 Plant Physiol 102:61-69 은 효모에서 밀 감마-글리아딘의 발현을 보고하였다. 상기 유전자는 정확히 발현되었으며, 그 단백질은 ER-유도된 PBs 에서 축적되었다. 개구리 난모세포들에서, Torrent 등 (1994 Planta 192:512-518)은, 단백질을 암호화하는 전사물들(transcripts)이 난모세포들 내로 미세주입된 경우 감마 제 인도 PB-유사 세포소기관들 내에서 축적된다는 것을 증명하였다. 알파-제인을 사용한 Hurkman 등, 1981 J. Cell Biol. 87:292-299 및 감마-글리아딘을 사용한 Altschuler 등, 1993 Plant Cell 5:443-450은 개구리 난모세포들에서 유사한 결과를 얻었다.
생물공학 (유전공학)분야에서의 기초적인 업적들 중 하나는, 유기체가 치료, 준의약식품(nutraceutical) 또는 산업용 용도의 단백질을 제조하도록 유전적으로 조작하는 능력이다. 박테리아, 효모, 작물 식물들 및 포유류 세포 배양물들의 발효액으로부터 재조합 단백질들을 제조 및 회수하기 위한 방법들이 제공된다. 숙주 세포들에서의 단백질 발현을 위한 상이한 시도들이 기재되어 왔다. 이러한 시도들의 근본적인 목적들은: 단백질 발현 수준, 단백질 안정성 및 단백질 회수이다 (Menkhaus 등, 2004 Biotechnol. Prog. 20: 1001-1014; Evangelista 등, 1998 Biotechnol. Prog. 14:607-614).
단백질 회수와 관련된 문제를 해결할 수 있는 한 전략은 분비작용이다. 그러나, 분비는 때로 좋지 않은 발현 수준 및 생성물 불안정성을 연루한다. 또 다른 전략으로는 세포 내에서 가장 유리한 위치에서 재조합 단백질을 축적하는 것이다. 이 전략은 테트라펩티드 (HDEL/KDEL)의 C-말단 연장을 공학적으로 조작함에 의해 재조합 단백질을 ER 로 향하게 함에 의해 광범위하게 사용되어 왔다 (Conrad 및 Fiedler, 1998 Plant Mol . Biol . 38:101-109).
이종성 단백질에 융합된 식물 저장 단백질 또는 저장 단백질 도메인들(domains)을 함유하는 융합 단백질들은 재조합 단백질들을 ER 로 보내기 위한 다 른 방법으로 시도되어 왔다 (WO 2004003207). 한 흥미로운 융합 전략으로, 식물 지방체들 (oil bodies)의 구성 단백질인 올레오신에 융합된 재조합 단백질들의 제조가 있다. 지방체들의 특이적 특징들은 2-상(two-phase) 계를 사용한 단백질의 용이한 회수라는 점에서 유리하다 (van Rooijen 및 Moloney, 1995 Bio/Technology 13:72-77).
이종성 단백질들은 식물 세포들에서 성공적으로 발현되어 왔으며 (Horn 등, 2004 Plant Cell Rep. 22:711-720; Twyman 등, 2003, Trends in Biotechnology 21:570-578; Ma 등, 1995, Science 268: 716-719; Richter 등, 2000 Nat. Biotechnol. 18:1167-1171), 일부에서는, 재조합 단백질의 발현이 ER-유도된 PB 또는 PSV (PSV)로 향하여 왔다. Yang 등 (2003 Planta 216:597-603)은, 글루텔린 및 글로불린 저장 단백질들의 종자-특이적 프로모터들을 사용하여 쌀 종자들에서 인간 리소자임을 발현하였다. 면역세포화학 결과들은 재조합 단백질이 ER-PBs 에 위치되고, 내생의 쌀 글로불린들 및 글루텔린들과 함께 축적되었다는 것을 나타내었다. 유전자 전이 담배 식물에서 인간 사이토메갈로바이러스 (human cytomegalovirus: hCMV)의 당단백질 B 의 발현이, 쌀의 글루텔린 프로모터를 사용하여 실시되어 왔다. Tackaberry 등, 1999 Vaccine 17:3020-3029. 최근, Arcalis 등, 2004 Plant Physiology 136:1-10 은, 쌀 종자들에서 C-말단 연장 (KDEL)을 사용하여 인간 혈청 알부민 (HSA)을 발현하였다. 상기 재조합 HSA 는 내생의 쌀 저장 단백질들과 함께 PSVs 에 축적되었다.
식물들의 생물공장 (biofcatories)로서의 적용에 대한 한 장애는 다운스트 림(downstream) 공정에 대한 연구가 더 필요하다는 것이다. 식물들로부터의 단백질 정제는, 식물계의 복잡성으로 인해 어려운 일이다. 추출물의 식물 고형분들은 크고, 밀집하며 비교적 증가되어 있다 (9-20 중량%) (Menkhaus 등, 2004 Biotechnol . Prog. 20:1001-1014의 리뷰 참조). 현재, 재조합 단백질 정제 기술들은 추출물들의 정화, 지질 및 색소를 제거하기 위한 용매 처리, 및 몇몇 이온-교환 및 겔-여과 크로마토그래피 컬럼들에 의한 단백질 또는 펩티드 정제를 포함한다. 기존 프로토콜들은 각 식물-숙주계 및 재조합 단백질에 대한 특정 용매들 또는 수용액들의 사용에 의존한다. 당 기술분야에서는 형질 전환된 숙주들로부터의 재조합 단백질 회수를 위한 효율적이고 일반적인 절차들이 필요하다. 이러한 필요는, 식물 숙주들에서 제조된 재조합 단백질들이 단리되어야만 하는 경우들에 특히 관련된다. 숙주들 및 단백질들의 다양성 및 그들 사이의 상이한 물리-화학적 성질들은 재조합 생성물들을 농축 및 회수하기 위한 효율적인 방법을 요구하였다. 이하에 개시되는 본 발명은 재조합적으로 발현된 단백질들의, 진균 및 포유류 세포들과 같은 비-고등 식물 유기체들로부터의 회수를 용이하게 하고, 개선시키기 위한 한 방법을 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 형질 전환된 숙주들로부터 재조합 단백질 회수를 위한 효율적이고 일반적인 절차 또는 방법을 제공한다. 여기 제시된 해결책은 기타 숙주-세포의 세포 소기관들 단백질들로부터의 재조합 단백질체-유사 조립체들(RPBLAs)의 단리가, 밀도에 기초한 기술, 특히 밀도 쿠션(cushion) 또는 밀도 구배 원심분리 기술들에 의해, 예측되지 않은 양호한 수율로 실시될 수 있다는 발견에 기초한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 RPBLAs 로서 숙주 세포에서 발현된 재조합 융합 단백질을 정제하는 방법을 고려한 것이다. 고려된 방법에 따라, 융합 단백질을 RPBLAs 로서 발현하는 형질 전환된 숙주 세포들의 수성 균질물이 제공된다. 그러한 RPBLAs 은, 상이한 융합 단백질들마다 다를 수 있지만, 분리될 특정 융합 단백질에 대해 알려진, 예정된 밀도를 가진다. RPBLAs 의 예정된 밀도는 전형적으로 그 균질물에 존재하는 실질적으로 모든 내생의 숙주 세포 단백질들의 밀도보다 크며, 전형적으로 약 1.1 내지 약 1.35 g/ml 이다. 상이한 밀도의 영역들이 균질물 중에서 형성되어, 상대적으로 증가된 농도의 RPBLAs 를 함유하는 영역 및 상대적으로 고갈된 농도의 RPBLAs 를 함유하는 영역을 제공한다. 상기 RPBLAs-고갈 영역은 상대적으로 증가된 농도의 RPBLAs 영역으로부터 분리되어, 상기 융합 단백질을 정제한다. 상대적으로 증가된 농도의 RPBLAs 영역은, 그 후 RPBLAs 또는 그 안의 융합 단백질의 단리 전에, 수집되거나, 하나 이상의 시약들로 처리되거나 또는 하나 이상의 절차들에 투입될 수 있다.
바람직한 실시에서, 융합 단백질은 함께 연결된 두 개의 폴리펩티드 서열들을 함유하며, 여기에서 하나의 서열은 단백질체 유도 서열 (PBIS)의 서열인 한편, 다른 하나는 약물 분자, 효소 등과 같은 관심 대상의 생성물의 서열이다. 바람직한 단백질체-유도 서열들은 감마-제인, 알파-제인 또는 쌀 프롤라민과 같은 프롤라민 화합물들의 서열이다.
여기서 숙주 세포들은, 고등 식물들, 진균 및 효모, 포유류 세포들과 같은 동물 세포들 및 조류 세포들과 같은 진핵성 세포들이다. 이러한 세포들은 신선한 생물 자원(biomass)으로부터 직접 수득되는 것과 같이 신선한 것일 수 있거나, 또는 건조된 생물 자원으로부터 수득되는 것과 같이 건조된 것일 수 있다; 생물 자원은, 살아있는 유기체들 또는 세포들, 예컨대 배양 매질 또는 예로서 식물 잎과 같이 살아있는 유기체로부터 수득되는 덩어리(mass)로 이해된다.
도면들은 본 개시의 일부를 형성하며,
도 1 은, 도의 맨 위에 나타낸 담배 식물들의 일시적 (아그로박테리아 이용 주입: agroinfiltration)이고 안정한 형질 전환에 사용된 이중(binary) 벡터들의 개략적 표시이다. 효모 형질 전환에 사용된 두 개의 벡터들을 도의 중간에 나타내었다. 포유류 세포 배양물들의 일시적인 형질 감염에 사용된 벡터들을 맨 밑에 나타내었다. RX3는 27 kD 감마-제인의 N 말단, 22az는 22kD 의 알파 제인, 22aZt는 22kD 의 알파-제인의 N-말단 도메인, rP13는 13kD 쌀 프롤라민, 및 CS 는 절단 부위이다.
도 2는 4 개의 부분들, 도 2A-2D 로 되어 있다. 도 2A 는 유전자 전이 담배 식물들의 잎에서의 RX3-T20 및 RX3-EGF 융합 단백질들의 축적을 보여준다. 가용성 단백질들을 야생형 (wt) 및 유전자 전이 담배 잎들로부터 (2 및 4 래인들) 추출하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔들 상에서 분석하고, 니트로셀룰로오스 막으로 이동시킨 후, 감마-제인 항혈청을 사용하여 면역 블롯 분석하였다. 분자량을 왼쪽에 나타내었다. RX3-유도된 융합 단량체 (M) 및 이량체 (D)를 화살표로 나타내었다.
도 2B 는 밀도 구배 분획들에서 RX3-T20 및 RX3-EGF 융합 단백질들의 면역 블롯 분석을 나타낸다. 형질 전환된 담배의 습윤 (신선한) 잎들의 정화된 균질물들을 단계별 수크로오스 구배 상에 (42%-49%-56%-65% w/w) 부하하였다. 균질물, 상등액, 중간상(interphase) 및 펠렛 분획물들에서 RX3-EGF 및 RX3-T20 융합 단백질들 축적을 감마-제인 항체를 사용하여 면역블롯함에 의해 분석하였다. 각 래인은 균등한 부피의 모든 분획들에 대응한다. H, 균질물; S, 상등액; F42, 중간상 42-49% w/w; F49, 중간상 49-56% w/w; F56, 중간상 56-65% w/w; F65, 65% 수크로오스 하의 펠렛. 분자량들을 왼쪽에 나타내었다. RX3-유도된 융합 단량체 (M) 및 이량체들 (D)을 화살표로 표시하였다.
도 2C 는 형질 전환된 담배 잎들의 밀도 구배 분획들에서 p19RX3EGF 에 의해 발현된 RX3-EGF 융합 단백질의 SDS-PAGE 및 은 염색 분석을 나타낸다. PBP 버퍼 중의 담배의 습윤 (신선한) 잎들의 청정한 균질물들을 단계별 수크로오스 (42%-49%-56%-65% w/w) 구배에 부하하였다. 균질물, 상등액, 중간상 및 펠렛 분획들 중에서의 RX3-EGF 융합 단백질 축적을, 15% SDS-PAGE에 의해 분석하고, 은 염색으로 전개하였다. 각 래인은 균등한 부피의 모든 분획들에 대응한다. 화살표들은 RX3-EGF 단백질을 나타낸다. H, 균질물; S, 상등액; F42, 중간상 42-49% w/w 수크로오스; F49, 중간상 49-56% w/w; F56, 중간상 56-65% w/w; F65, 65% 수크로오스 하의 펠렛. 분자량들을 왼쪽에 나타내었다.
도 2D 는 습윤 및 건조 담배 잎들에서의 RX3-T20 및 RX3-EGF 축적의 SDS-PAGE 및 면역 블롯 결과들을 나타낸다. 담배 잎들을 37℃ 에서 1 주일 동안 건조 시키고, 습기 없는 용기 중에서 5 달 동안 저장하였다. 동량의 습윤 (W) 및 건조된 (D) 형질 전환 담배 잎들로부터 추출한 가용성 단백질들을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 및 감마-제인 항혈청을 사용한 면역 블롯에 의해 분석하였다 (래인 1 및 2). 건조 시료들 중의 밀집한 구조물들 중에서의 RX3-EGF 및 RX3-T20 의 축적을 수크로오스 구배 (20%-30%-42%-56% w/w)중에서 건조 잎 균질물들의 분획화에 의해 분석하였다. 상등액, 중간상 및 펠렛 분획물들 중에서 RX3-EGF 및 RX3-T20 융합 단백질들의 축적을 감마-제인 항체를 사용한 면역 블롯에 의해 분석하였다. 동량의 각 분획들을 부하하였다. S, 상등액; F20, 중간상 20%-30% w/w 수크로오스; F30, 중간상 30%-42% w/w 수크로오스; F42, 중간상 42%-56% w/w 수크로오스; F56, 56% 수크로오스 하의 펠렛.
도 3 은 도 3A 및 3B 의 두 부분으로 나뉜다. 도 3A 는 아그로박테리아를 이용하여 주입된 담배 모종들 중에서의 RX3-EGF 및 RX3-T20 축적을 나타낸다. 총 가용성 단백질들을 SDS-PAGE 및 감마-제인 항혈청을 사용한 면역 블롯에 의해 분석하였다. Wt = 야생형 대조구 담배 모종들; 분자량들을 왼쪽에 나타내었다. RX3-유도된 융합 단량체 (M), 이량체 (D) 및 삼량체들 (T)을 화살표로 나타내었다.
도 3B 는 아그로박테리아를 이용하여 주입된 담배 모종들의 세포 내 분획화를 나타낸다. 정화된 모종 균질물들을 단계별 수크로오스 구배 상에 부하하였다(20%-30%-42%-56% w/w). 상등액, 중간상 및 펠렛 분획물들 중에서의 RX3-T20 및 RX3-hGH 융합 단백질들의 축적을 감마-제인 항체를 사용한 면역 블롯에 의해 분석하였다. 동량의 각 분획들을 래인 당 하나씩 부하하였다. S, 상등액; F20, 중간 상 20%-30% w/w 수크로오스; F30, 중간상 30%-42% w/w 수크로오스; F42, 중간상 42%-56% w/w 수크로오스; F56, 56% 수크로오스 하의 펠렛. 분자량들을 왼쪽에 나타내었다. RX3-유도된 융합 단량체 (M) 및 이량체들 (D)을 화살표로 나타내었다.
도 4 는 도 4A, 4B 및 4C의 세 부분으로 나뉜다. 도 4A 는 수크로오스 쿠션을 통한 원심 분리 후의 RX3-T20 및 RX3-EGF 단백질 농도를 나타낸다. 유전자 전이 담배 잎들의 정화된 균질물들을 수크로오스 쿠션 (42% w/w) 상에 부하하였다. 원심분리 후, 상등액 및 펠렛 중의 RX3-EGF 및 RX3-T20 융합 단백질들의 축적을 감마-제인 항체를 사용한 면역 블롯에 의해 분석하였다. 각 래인은 동량의 분획들에 대응한다. H, 균질물; S, 상등액; P, 펠렛 쿠션. 분자량들을 왼쪽에 나타내었다. RX3-유도된 융합 단량체 (M) 및 이량체들 (D)을 화살표로 나타내었다.
도 4B 는 수크로오스 쿠션을 통한 원심분리 후 RX3-EGF 단백질 정제를 나타낸다. 유전자 전이 담배 잎들의 정화된 균질물들을 수크로오스 쿠션 (42% w/w) 상에 부하하였다. 원심분리 후, 균질물, 상등액 및 펠렛 분획물들의 단백질 패턴들을 15% SDS-PAGE 및 은 염색에 의해 분석하였다. 각 래인은 동량의 분획들에 대응한다. RX3-EGF 단량체 (M) 및 이량체들 (D)을 화살표로 나타내었다. H, 균질물; S, 상등액; P, 펠렛 쿠션. 분자량들을 왼쪽에 나타내었다.
도 4C 는 저속 원심 분리 (LSC) 후의 RX3-EGF 단백질 농도 및 정제를 나타낸다. RX3-EGF-발현 담배 잎들의 정화된 균질물들을 1000xg 에서 10 분 동안 원심분리하고, 펠렛 (P1, 래인 2) 및 상등액 (S, 래인 1)을 겔 전기영동 및 감마-제인 항체를 사용한 면역 블롯에 의해 분석하였다. 저속 원심 분리(LSC) 펠렛 P1 을 버 퍼화된 5% 트리톤X-100-함유 매질 중에서 세척하고, 두 번째 원심 분리 후, 동량의 LSC P1 펠렛 (래인 7), 세척 후 상등액 (W, 래인 8) 및 최종 펠렛 P2 (래인 9)를 15% SDS-PAGE 및 은 염색에 의해 분석하였다. 이들 시료들을 일 회의 수크로오스 쿠션 원심분리 후 수득된 펠렛 P1 (래인 3)로부터 균등한 시료들 (래인 3-5)과 비교하고, LSC 펠렛과 같이, 동일한 세척 절차에 투입하였다. RX3-EGF 단량체 (M) 및 이량체들(D)을 화살표로 나타내었다.
도 5 는 도 5A 및 5B의 두 부분으로 나뉜다. 도 5A 는 형질 감염된 포유류 세포들 중에 축적된 RX3-Ct, RX3-EGF 및 RX3-hGH 재조합 융합 단백질들의 세포 내 분포를 나타낸다. 형질 감염된 세포 균질물들을 단계별 수크로오스 (20%-30%-42%-56% w/w) 구배에 부하하였다. 원심 분리 후, 상등액, 중간상 및 펠렛 분획물들 중에서의 RX3-Ct, RX3-EGF 및 RX3-hGH 융합 단백질들의 축적을 감마-제인 항체를 사용한 면역 블롯에 의해 분석하였다. GFP 의 시안 형광 변이물들인, ECGP를 발현하는 플라스미드 pECFP-N1 (Clontech)으로 형질 감염된 세포들을 대조군으로서 사용하고, ECGP 를 항-GFP 항혈청을 사용함에 의해 면역검출하였다. H, 균질물; S, 상등액; F20, 중간상 20%-30% w/w 수크로오스; F30, 중간상 30%-42% w/w 수크로오스; F42, 중간상 42%-56% w/w 수크로오스; F56, 56% 수크로오스 하의 펠렛.
도 5B 는 저속 원심 분리 후의 CHO-발현된 RX3-EGF 단백질 농도를 나타낸다. RX3-EGF-발현 CHO 세포들로부터의 균질물들을 2500xg 에서 10 분 동안 원심 분리시키고, 펠렛 (P, 래인 2) 및 상등액 (S, 래인 1)을 겔 전기 영동 및 감마-제인 항체를 사용한 면역 블롯에 의해 분석하였다. 분자량들을 왼쪽에 나타내었다.
도 6 은 형질 전환된 효모 세포들 중에 축적된 RX3-EGF 및 RX3-hGH 재조합 융합 단백질들의 세포 내 분포를 나타낸다. 형질 전환된 효모로부터 용균된 스페로플라스트들(spheroplasts)을 단계별 수크로오스 (20%-30%-42%-56% w/w) 구배들 상에 부하하였다. 원심 분리 후, 상등액, 중간상 및 펠렛 분획물들 중에서의 RX3-EGF 및 RX3-hGH 융합 단백질들의 축적을 감마-제인 항체를 사용한 면역 블롯에 의해 분석하였다. H, 용균된 스페로플라스트들 균질물; S, 상등액; F20, 중간상 20%-30% w/w 수크로오스; F30, 중간상 30%-42% w/w 수크로오스; F42, 중간상 42%-56% w/w 수크로오스; F56, 56% 수크로오스 하의 펠렛. 분자량들을 왼쪽에 나타내었다.
도 7A 는 아그로박테리아를 이용하여 주입된 담배 모종들에서 축적된 재조합 융합 단백질들의 세포 내 분포를 나타낸다. 정화된 모종 균질물들을 단계별 수크로오스 (20%-30%-42%-56% w/w) 구배들 상에 부하하였다. 상등액, 중간상 및 펠렛 구배 분획물들 중에서의 rP13-Ct, rP13-EGF 및 rP13-hGH 융합 단백질 축적을항-칼시토닌, 항-EGF 및 항-hGH 항체들을 사용한 면역 블롯에 의해 분석하였다. 두 가지 유형의 알파-제인 유전자를 사용하여 균등한 연구를 수행하였다. 칼시토닌 (Ct) 및 EGF 를 알파 제인의 N-말단 도메인 (22aZt)에 융합시키고, hGH 를 완전한 알파 제인 유전자 (22aZ)에 융합시켰다. 동량의 각 분획들을 래인 당 하나씩 부하하였다. S, 상등액; F20, 중간상 20%-30% w/w 수크로오스; F30, 중간상 30%-42% w/w 수크로오스; F42, 중간상 42%-56% w/w 수크로오스; F56, 56% 수크로오스 하의 펠렛.
도 7B 는 단계별 수크로오스 (10%-42%-56%-62% w/w) 구배들 상에 부하된 유전자 전이된 담배주들로부터의 정화된 잎 균질물들을 사용한 결과들을 나타낸다. 항-EGF 항체를 사용한 면역 블롯은 동량의 각 분획물들의 rP13-EGF 및 22aZt-EGF 의 분포를 나타낸다. S, 상등액; F10, 중간상 10%-42% w/w 수크로오스; F42, 중간상 42%-56% w/w 수크로오스; F56, 중간상 56%-62% w/w 수크로오스; F62, 62% 수크로오스 하의 펠렛.
도 8 은 RPBLAs 로부터의 RX3-T20 및 RX3-EGF 융합 단백질 회수를 나타낸다. 밀도 쿠션 또는 단계별 구배로부터 수득된 RPBLA 분획물들을 환원제들 존재 하에서 재현탁하였다. 가용화된 (S) 및 비가용화된 단백질들 (P)을 감마-제인 항혈청을 사용한 면역 블롯에 의해 분석하였다. 분자량들을 왼쪽에 나타내었다. RX3-유도된 융합 단량체 (M), 이량체 (D) 및 삼량체들 (T)을 화살표들에 의해 나타내었다.
본 발명은 몇 가지 잇점들 및 장점들을 갖는다.
한 잇점은, 이의 사용으로, 발현된 생성물과 가용성 세포 물질들의 나머지 부분의 밀도 차이에 근거하여, 발현된 단백질들의 비교적 간단하고 신속한 정제가 가능하다는 것이다.
따라서, 본 발명의 한 장점은, 숙주 유기체 및 세포 배양물들로부터의 내생의 화합물들 (또는 비-재조합 생성물들)을 제거할 수 있는 방법을 제공한다는 것이다.
본 발명의 또 다른 잇점은, 신선하거나 또는 건조된 생물 자원 (숙주 유기체)으로부터 재조합 펩티드들 또는 단백질들을 정제하기 위한 신뢰성 있고, 재현가 능한 방법을 제공한다는 것이다.
본 발명은 일반적으로, 형질 전환된 유기체들 또는 세포 배양물들로부터 관심 대상의 재조합 단백질들 및 펩티드들을 단리 및 정제하는 다운스트림 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 숙주 세포들 중에서 재조합 단백질체-유사 조립체들 (RPBLAs)로서 발현 및 축적되는 재조합 융합 단백질의 정제 방법을 고려한다. RPBLAs 은 세포들 내에서 고밀도 침적물들을 형성하는 저장 단백질 도메인들에 의해 유도된 재조합 융합 단백질 조립체들이다. 이들 밀집한 침적물들은 세포질, 내막계 세포 소기관들, 미토콘드리아, 색소체들 중에서 축적되거나 또는 분비될 수 있다. 고려된 방법에 따라, 융합 단백질을 RPBLAs 로서 발현하는 형질 전환된 숙주 세포들의 수성 균질물이 제공된다. 상기 균질물은 바람직하게는 사용을 위해 정화된다. 상이한 밀도의 영역들이 상기 균질물 중에 형성되어, 상대적으로 증가된 농도의 RPBLAs를 함유하는 영역 및 상대적으로 고갈된 농도의 RPBLAs를 함유하는 영역이 제공된다. RPBLA-고갈된 영역은 상대적으로 증가된 RPBLAs 농도의 영역으로부터 분리되어, 그 융합 단백질을 정제한다. 상대적으로 증가된 RPBLAs 농도 영역은 그 후 RPBLAs 또는 그 안의 융합 단백질의 단리 전에, 수집되거나 또는 하나 이상의 시약으로 처리될 수 있거나, 또는 하나 이상의 절차들에 투입된다.
바람직한 실시에서, 상기 융합 단백질은 함께 연결된 두 개의 폴리펩티드 서열들을 함유하고, 여기에서 하나의 서열은 단백질체 유도 서열 (PBIS)의 서열인 한편, 다른 하나는 약물 분자 및 효소 등과 같은 관심 대상의 폴리펩티드 생성물의 서열이다. 바람직한 PBIS 는 감마-제인, 알파-제인 또는 쌀 프롤라민과 같은 프롤라민 화합물들의 서열들이다.
본 방법의 한 측면은 바람직한 융합 단백질을 재조합 단백질체-유사 조립체들 (RPBLAs)로서 발현 및 축적하는 숙주 유기체 또는 세포 배양물의 수성 균질물 또는 기타 적합한 추출물 (본 명세서에서는 집합적으로 균질물로서 언급됨)의 제공을 포함한다. 상기 균질물은, 여과와 같은 것에 의해 세포 파편들을 제거하기 위하여, 전형적으로 사용 전에 예비-정화 (정화)된다. 융합 단백질-함유 단백질체 유사 구조물들(RPBLAs), 지질, 가용성 단백질들, 세포의 세포 소기관들, 당, 색소 및 알칼로이드들을 함유하는 균질물은 단계별 밀도 구배 상에 직접적으로 부하되고, 상기 균질물은 원심분리와 같은 것에 의해, 그의 구성분들의 밀도에 기초하여 분리된다. 상이한 밀도의 영역들이 원심 분리 동안 균질물 중에 형성되어, 상대적으로 증가된 농도의 RPBLA를 함유하는 영역 및 상대적으로 고갈된 농도의 RPBLA를 함유하는 영역이 제공된다. 바람직한 융합 단백질-함유 RPBLAs 를 특정 밀도 중간상에서에서 수집할 수 있다. 이 절차는 약 90 퍼센트 이상의 발현된 재조합 융합 단백질을, 약 80 퍼센트 이상의 순도로 회수하는 것을 가능하게 하였다.
본 발명의 또 다른 측면은 일단계 밀도 쿠션에 의해 바람직하게는 정화된 균질물로부터의 RPBLA 단리 방법을 고려한다. 여기에서, 바람직하게는 정화된 균질물은 내생의-오염 화합물들이 상기 밀도 쿠션을 지나지 못하도록 특정 밀도 쿠션 상에 부하되고, 밀집한 RPBLAs 가 상기 쿠션을 지나서 회수될 수 있도록 원심 분리에 의해 분리된다. 상기 논의된 상이한 밀도 영역들은 균질물 중에 형성되어, 상대적으로 증가된 농도의 RPBLA를 함유하는 영역 (쿠션 이하의 영역) 및 상대적으로 고갈된 농도의 RPBLA를 함유하는 영역 (쿠션 이상의 영역)을 제공한다. 따라서, 상기 재조합 단백질체-유사 조립체들의 밀도는 쿠션의 밀도보다 크다.
또 다른 구현예에서, 상기 바람직하게는 정화된 균질물은 수크로오스 또는 기타 첨가된 밀도-제공 용질의 부재 하에, 원심 분리에 의해 직접 분리된다. 다시, 상기 원심 분리는 균질물 중에 형성되어 상대적으로 증가된 농도의 RPBLA를 함유하는 영역 (펠렛) 및 상대적으로 고갈된 농도의 RPBLA를 함유하는 영역 (상등액)을 제공하는 상이한 밀도의 영역들을 제공한다. 상기 RPBLAs 는 그 후 분리되어 RPBLAs 및 그에 의한 융합 단백질의 정제를 제공할 수 있다.
본 발명은 형질 전환된 숙주 세포들 중에 형성된 세포 소기관들인, RPBLAs 내에서 발현된 재조합 펩티드 또는 단백질의 회수 방법을 제공한다. 여기에서 숙주 세포들은 고등 식물, 효모 및 진균, 배양된 포유류 세포들, 유전자 전이된 동물로부터의 세포들, 동물의 알 등과 같은 동물 세포들 및 조류 세포들의 세포들과 같은 진핵성 세포들이다. 이들 세포들은 배양 매질 또는 식물 잎 또는 동물과 같이 살아있는 유기체로부터 직접 얻어지는 것과 같은 신선한 것일 수 있거나, 또는 건조된 것일 수 있다.
상기 재조합 단백질체-유사 조립체들은, 상이한 융합 단백질들에 따라 다를 수 있지만, 분리될 특정 융합 단백질에 대해 알려진 예정된 밀도를 갖는다. RPBLAs 의 상기 예정된 밀도는 상기 균질물 중에 존재하는 실질적으로 모든 내생의 숙주 세포 단백질들의 밀도보다 전형적으로 크며, 전형적으로 약 1.1 내지 약 1.35 g/ml 이다. RPBLAs 의 높은 밀도는, 재조합 융합 단백질들의 다량체들로서 조립 및 축적되는 일반적인 능력에 기인하다.
고려된 RPBLAs는 진핵 생물들 중에서 발현되고, 상기 나타낸 것과 같이, 그들의 밀도에 의해 전형적으로 특징화된다. 고등 식물 및 동물 세포들에서 발현된 경우, 상기 RPBLAs 는 전형적으로 구형의 형태이고, 약 1 미크론 (m)의 직경을 가지고, 둘러싼 막을 갖는다.
상기 융합 단백질들은 그들의 밀도에 의해 분리되고, 상기 밀도는 형질 감염된 세포에 존재하는 임의의 기타 단백질의 밀도보다 큰 경향이 있다. 밀도에 의한 상기 분리는, 전형적으로 원심 분리의 사용에 의해 실시되며, 이는 전 세계적으로 생화학 실험실들에서 일반적으로 행해지는 것과 같은 방법이다. 예시적인 상업적으로 이용가능한 원심분리기는 Beckman Coulter Avanti™ 모델 J-25 로, 이는 이후 일회의 쿠션 작동 및 직접 원심 분리에 사용된다. Beckman Coulter Optima™ XL-100K 초원심분리기 (로터 SW41Ti)를 구배 연구들에 사용하였다. 원심 분리는 종종, 염화 세슘과 같은 염 또는 수크로오스와 같은 당과 같이, 첨가된 밀도차-제공 용질의 존재하에서 실시된다. 균질물 및 밀도차 제공 용질의 조합은 균질물-용질 혼합물을 형성한다.
특정 구현예에서, 상기 재조합 융합 단백질들은 관심 대상의 생성물들 (예로서, 펩티드들 또는 단백질들) (표적들)에 펩티드 결합에 의해 연결된 단백질체-유도 서열들 (PBIS)을 함유하거나 또는 바람직하게는 이들로 이루어진다. PBIS 는, RPBLAs 중에서 단백질 도입 및/또는 축적을 매개하는 단백질 또는 아미노산 서열들이다. PBIS 의 예시적이고 비제한적인 예들은 저장 단백질들 또는 개질된 저장 단백질들을 포함하며, 예로서 프롤라민류 또는 개질 프롤라민류 또는 프롤라민 도메인들이 있다. 프롤라민류는 Shewry 등, 2002 J. Exp. Bot. 53(370):947-958 에서 리뷰되었다.
옥수수 저장 단백질인 감마-제인은, 4 개의 옥수수 프롤라민류 중의 하나이며, 옥수수 내배유 중의 총 단백질 중 10-15 퍼센트를 차지하며, 그 DNA 및 아미노산 잔기 서열들을 이하에 나타내었다. 기타 곡류 프롤라민류로서, 알파- 및 감마-제인류는 조면 소포체의 세포질 쪽의 막-결합된 폴리솜들에서 생합성되고, 내강 내에서 조립된 후, ER-유도된 PB 내로 격리된다 (Herman 등, 1999 Plant Cell 11:601-613; Ludevid 등, 1984 Plant Mol . Biol. 3:277-234; Torrent 등, 1986 Plant Mol . Biol . 7:93-403).
감마-제인은 하기 4 개의 특징적인 도메인들로 구성된다: i) 19 개의 아미노산들의 펩티드 신호, ii) 헥사펩티드 PPPVHL (서열 번호 1) 의 단위 8 개를 함유하는 반복 도메인 (53 aa), iii) 프롤린 잔기들이 다른 아미노산들과 번갈아 존재하는 ProX 도메인 (29 aa) 및 iv) 소수성 시스테인 풍부 C-말단 도메인(lll aa).
ER-유도된 단백질체들 (PBs)로 조립하는 감마-제인의 능력은 종자들에 제한되지 않는다. 실제로, 감마-제인 유전자가, 유전자 전이된 아기장대 식물들에서 구조적으로 발현되는 경우, 상기 저장 단백질은 잎살 세포들 중에서 ER-유도된 재조합 PBs 내에 축적되었다 (Geli 등, 1994 Plant Cell 6:1911-1922). ER-유도된 PB 내로의 감마-제인 침적의 원인이 되는 신호를 찾고자 (프롤라민류는 KDEL 신호를 갖지 않는다), 세로 (tandem) 반복 도메인을 포함하는 프롤린 풍부 N-말단 도메인이 ER 보유에 필요하다는 것과, C-말단 도메인이 PB 형성에 연루되었다는 것이 증명되어 왔다. 그러나, 이들 도메인들이 PB 조립을 촉진하는 메카니즘은 여전히 알려지지 않았다. 단백질체들은 종자들에서만 그러한 명칭으로 불리는 것이 적절하기 때문에, 다른 식물 기관들 및 비-고등 식물들에서 제조된 유사 구조물들은 일반적으로 재조합 단백질체 유사 조립체들 (RPBLAs)로서 언급된다.
예시적인 기타 유용한 프롤라민-유형 서열들을 그들의 GenBank 표시와 함께 아래 표에 나타내었다.
단백질 명 GenBank ID
α-제인 (22kD) M86591
알부민 (32kD) X70153
β-제인 (14kD) M13507
γ-제인 (27kD) X53514
γ-제인 (50kd) AF371263
δ-제인 (18kD) AF371265
δ-제인 (10kD) U25674
7S 글로불린 또는 비실린(Vicilin)형 NM113163
11S 글로불린 또는 레규민(Legumin)형 DQ256294
프롤라민 13kD AB016504
프롤라민 16kD AY427574
프롤라민 10kD AF294580
Altschul 등, 1997 Nucleic Acids Res . 25:3389-3402에 기재된 것과 같은, 모든 비-중복된 GenBank CDS 번역+PDB+SwissProt+PIR+PRF (환경 시료들 제외) 데이타베이스에서, 서열 번호 2 (RX3 단백질 서열), 서열 번호 3 (알파-제인 단백질 서열) 및 서열 번호 4 (쌀 프롤라민 단백질 서열)과 같은 질문(query)을 사용하여 BLAST 검색을 실시하여 추가의 유용한 서열들을 수득한다.
한 예시적인 개질 프롤라민은 (a) 신호 펩티드 서열, (b) 단백질 감마-제인의 반복 도메인 헥사펩티드 PPPVHL (서열 번호 1)의 하나 이상의 복제물들의 서열, (전체 도메인은 8 개의 헥사펩티드 단위들을 함유); 및 (c) 감마-제인의 ProX 도메인의 전체 또는 일부 서열을 포함한다. 예시적인 특정 개질 프롤라민들은, R3, RX3 및 P4 로서 하기에 나타낸 폴리펩티드들을 포함하며, 그의 DNA 및 아미노산 잔기 서열들도 하기에 나타내었다.
특히 바람직한 프롤라민들은 공개 출원 WO2004003207 호에 개시된 것과 같은 감마-제인 및 그의 성분 부분들인, 즉 쌀 rP13 단백질 및 22 kDa 의 옥수수 알파-제인의 N-말단 단편을 포함한다. 감마-제인 (27kD), 쌀 및 알파-제인 단백질들의 DNA 및 아미노산 잔기 서열들을 서열 번호 5 (DNA 서열) 및 서열 번호 6 (단백질 서열); 서열 번호 7 (RX3 DNA 서열) 및 서열 번호 8 (단백질 서열); 서열 번호 9 (R3 DNA 서열) 및 서열 번호 10 (단백질 서열); 서열 번호 11 (P4 DNA 서열) 및 서열 번호 12 (단백질 서열); 서열 번호 13 (X10 DNA 서열) 및 서열 번호 14 (단백질 서열)에 나타내었다.
rP13: (단백질 서열, 서열 번호 15 및 DNA 서열, 서열 번호 16) - 클론에 상동성인 13kD 쌀 프롤라민 - (GenBank AB016504) Sha 등, 1996 Biosci . Biotechnol . Biochem . 60(2):335-337; Wen 등, 1993 Plant Physiol . 101(3):1115-1116; Kawagoe 등, 2005 Plant Cell 17(4):1141-1153; Mullins 등, 2004 J. Agric . Food Chem . 52(8):2242-2246; Mitsukawa 등, 1999 Biosci . Biotechnol . Biochem . 63(11):1851-1858.
22kD 의 22aZt (단백질 서열, 서열 번호 17 및 DNA 서열, 서열 번호 18) 옥수수 알파-제인의 N-말단 단편 - (GenBank V01475) Kim 등, 2002 Plant Cell 14(3):655-672; Woo 등, 2001 Plant Cell 13(10):2297-2317; Matsushima 등, 1997 Biochim. Biophys. Acta 1339(1):14-22; Thompson 등, 1992 Plant Mol. Biol . 18(4):827-833.
관심 대상의 단백질들의 예들은 치료, 준의약식품, 생체제어 또는 산업용 용도를 갖는 임의의 단백질을 포함하며, 예로서 단일클론성 항체들 (IgG, IgM, IgA, 등과 같은 mAbs) 및 그의 단편들, 백신에 대한 항원들 (인간 면역 결핍 바이러스, HIV; 간염 B 전-표면 (pre-surface), 표면 및 중심 항원들, 위장염 코로나 바이러스 등), 호르몬 (칼시토닌, 성장 호르몬 등), 프로테아제 저해제, 항생제, 콜라겐, 인간 락토페린, 시토카인, 산업용 효소들 (가수분해효소, 글리코시다제, 옥시도-리덕타제 등)이 있다. 예시적인 관심 대상의 단백질들에 대한 예시적인 DNA 및 아미노산 잔기 서열들이 제공된다: (단백질 서열, 서열 번호 19 및 DNA 서열, 서열 번호 20) 연어 칼시토닌 BAC57417 .
hEGF - 신호 펩티드 없이 AAF85790 에 기초한 구축 (단백질 서열, 서열번호 21 및 DNA 서열, 서열 번호 22).
hGH - 신호 펩티드 없이 P01241 에 기초한 구축 (단백질 서열, 서열 번호 23 및 식물-선호된 코돈들, 서열 번호 24를 사용하고 천연 코돈들, 서열 번호 25를 사용한 DNA 서열).
또 다른 구현예에서, 재조합 융합 단백질은, PBIS 및 관심 대상의 생성물의 서열들에 추가하여, 스페이서 아미노산 서열을 더 함유한다. 상기 스페이서 아미노산 서열은 효소적 또는 화학적 수단에 의해 절단가능하거나 또는 절단가능하지 않은 아미노산 서열일 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서 아미노산 서열은 PBIS 및 관심 대상의 생성물 사이에 위치된다. 예시적인 아미노산 서열은 엔테로키나아제(enterokinase), Arg--C 엔도프로테아제 (endoprotease), Glu--C 엔도프로테아제, Lys--C 엔도프로테아제, Xa 인자 등과 같은 프로테아제에 의해 절단가능하다. 선택적으로, 아미노산 서열은 화학 시약에 의해 특이적으로 절단가능하게 암호화되어 있으며, 예로서 시아노겐 브로마이드는 메티오닌 잔기들에서 절단시킨다.
추가의 구현예에서, 형질 전환 목적에 사용되는 핵산 서열은 공동 명의의 특허 출원 WO 2004003207 에 개시된 바와 같으며, 이는 PBIS 및 관심 대상의 폴리펩티드 간의 절단가능한 아미노산 잔기 서열을 포함한다. 또한, 다른 구현예에서, 핵산 서열은 특허 출원 WO 2004003207에 개시된 바와 같지만, 절단가능한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열이 부재이다.
바람직한 구현예에서, 융합 단백질들은 동물, 동물 세포 배양물, 식물, 식물 세포 배양물, 진균 또는 조류와 같은 숙주 세포계를 하기를 함유하는 핵산 서열로 형질 전환하는 것을 포함하는 방법에 따라 제조된다: (i) 프레임 내에서 (ii)에 작동적으로 연결된 PBIS 를 코딩하는 제 1 핵산, (ii) 관심 대상의 생성물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 제 2 핵산 서열; 즉, PBIS 를 암호화하는 상기 핵산 서열은, 관심 대상의 폴리펩티드를 암호화하는 서열에 화학적으로 결합되어, 두 폴리펩티드들 모두가 그들의 적절한 리딩 프레임들 (reading frames)로부터 발현되도록 한다. 발현시, 생성되는 융합 단백질은 형질 전환된 숙주계 내에서 고밀도 재조합 단백질체 유사 조립체들로서 축적된다. 한 구현예에서, 제 1 핵산 서열 (i)의 3' 말단은 제 2 핵산 서열 (ii)의 5' 말단에 연결 (결합)된다. 또 다른 구현예에서, 제 1 핵산 서열 (i)의 5' 말단은 제 2 핵산 서열 (ii)의 3' 말단에 연결 (결합)된다. 또 다른 구현예에서, 상기 PBIS 는 저장 단백질 또는 개질 저장 단백질, 그의 분획 또는 개질 분획을 함유한다.
또 다른 구현예에서, 융합 단백질은, 동물, 동물 세포 배양물, 식물, 식물 세포 배양물, 진균 또는 조류와 같은 숙주 세포계를, 상기 언급된 상기 핵산 서열들 (i) 및 (ii)에 추가하여, 스페이서 아미노산 서열을 코딩하는 프레임 내 핵산 서열 (iii)을 함유하는 핵산 서열로 형질 전환하는 것을 포함하는 방법에 따라 제조된다. 상기 스페이서 아미노산 서열은, 상기 나타낸 것과 같이, 효소 또는 화학적 수단에 의해 절단 가능하거나 또는 절단 가능하지 않은 아미노산 서열일 수 있다. 한 특정 구현예에서, 상기 핵산 서열 (iii)은 상기 핵산 서열들 (i) 및 (ii)의 사이에 위치되며, 예로서 상기 제 3 핵산 서열 (iii)의 3' 말단이 제 2 핵산 서열 (ii)의 5' 말단에 연결된다. 또 다른 구현예에서, 제 3 핵산 서열 (iii)의 5' 말단은 제 2 핵산 서열 (ii)의 3' 말단에 연결된다.
여기 사용된 것과 같은, 식물 숙주 세포라는 용어는 외떡잎 식물 및 쌍떡잎 식물을 모두 포함하는 식물들, 및 특히 곡류 (예로서, 옥수수, 쌀, 귀리 등), 콩류 (예로서, 콩 등), 평짓과 식물 (cruciferous plant) (예로서, 아기장대 (Arabidopsis thaliana), 평지 (colza) 등) 및 가지과 식물 (solanaceous plant) (예로서, 감자, 토마토, 담배 등)을 포함한다.
식물 숙주계는 식물 세포들도 포괄한다. 식물 세포들은 현탁액 배양물들, 배들 (embryos), 분열조직 영역들, 유합 조직, 잎, 뿌리, 새싹들, 배우체들, 포자체, 꽃가루, 종자들 및 소포자들을 포함한다. 식물 숙주 세포계는 여러 단계에서의 성숙도에 있을 수 있으며, 액상 또는 고상 배양에서, 또는 화분, 온실 또는 들판에서의 흙 또는 적절한 매질 중에서 성장될 수 있다. 식물 숙주 세포계들의 발현은 일시적 또는 영구적일 수 있다. 식물 숙주 세포계는 그러한 식물, 종자, 자식 또는 잡종 자손의 임의의 클론, 생식적으로 또는 비생식적으로 생장된 영양번식체, 및 예로서 삽목(cuttings) 또는 종자와 같은 이들 중 어느 하나의 임의의 자손들도 의미하는 것이다.
아그로박테리움 튜메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 식물 세포들의 형질 전환은 쌍떡잎 식물들에서 전형적으로 가장 잘 실시된다. 외떡잎 식물들은 대개, 소위 원형질체들의 유전자 직접 전입 (direct gene transfer)이라고 불리는 방법에 의해 가장 쉽게 형질 전환된다. 유전자 직접 전입은 일반적으로 폴리에틸렌글리콜-매개된 전입에 의한 엘렉트로포레이션 (electroporation), 또는 필요한 DNA를 운반하는 마이크로사출물 (microprojectiles)에 의한 세포 폭격 (bombardment)에 의해 실시된다. 이들 형질 감염 방법들은 당 기술 분야에서 공지이므로 여기에서 추가의 논의를 필요로 하지 않는다. 또한, 적어도 쌀 및 옥수수가 아그로박테리움 (Agrobacterium)에 의해 형질 전환될 수 있다는 것에도 주목해야 한다. 형질 감염된 세포들 및 원형질체들로부터 전체 식물들을 재생하는 방법들도 공지이며, 이들은 식물 조직들로부터 원하는 단백질을 수득하기 위한 기술들과 같다. U.S. 특허 제 5,618,988 호 및 제 5,679,880 호 및 그 안의 인용들 참조.
고려된 방법은 재조합 융합 단백질의 회수 및 가용화도 포함할 수 있다. 따라서, 예로서 단계별 밀도 구배 또는 일단계 밀도 쿠션으로부터 수집된 RPBLAs 를 환원제를 함유하는 버퍼화된 용액 중에 현탁시키고 원심 분리시킨다. 상기 펠렛을 폐기하고, 원하는 바에 따라, 예로서 기존 크로마토그래피적 방법들에 의해, 더 정제되는 상기 상등액으로부터 재조합 단백질이 회수되었다.
추가의 상세한 설명 없이도, 본 기술 분야의 숙련자는 상기의 설명 및 하기의 상세한 실시예들을 사용하여, 본 발명을 그의 극대로 이용할 수 있을 것으로 믿는다. 하기 바람직한 특정 구현예들은, 따라서, 단지 예시적인 것으로 해석되는 것이며, 본 개시의 나머지 부분을 어떤 방식으로든 제한하지 않는 것이다.
실험 절차
실시예 1: 식물 형질 전환을 위한 플라스미드 구축
T20 및 인간 표피 성장 인자 (hEGF)의 코딩 서열들을 합성에 의해 수득하고, 식물에서의 발현을 위한 그의 코돈 이용을 최적화하기 위하여 개질하였다.
T20 의 36 개 아미노산들을 암호화하는 cDNA 서열의 첫 번째 가닥을 화학적 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 수득하였으며, Xa 인자 특이적 절단 부위 및 효소 제한 부위에 대응하는 서열을 상기 서열의 5' 말단에 첨가하였다. 이 합성 구축물 (서열 번호 26)을 폴리아크릴아미드 변성 겔에 의해 정제하였다.
이중가닥 (double-stranded) cDNA 를, 추가의 클로닝을 위해 제한 부위들을 함유하는 특정 T20 프라이머들을 사용한 PCR에 의해 수득하였다.
프라이머들:
V20전방 (서열번호 27)
V20역방향 (서열번호 28)
활성 hEGF 의 53 개 아미노산들을 암호화하는 합성 유전자를, 20 개의 중복 염기들을 갖는, 약 60 개의 염기들의 4 개의 올리고뉴클레오티드들을 사용하여, 프라이머 중복 연장 PCR 법에 의해 수득하였다. 합성 hEGF cDNA 는 Xa 인자 특이적 절단 부위에 대응하는 5' 링커 서열을 포함하였다. 상기 올리고뉴클레오티드들을 폴리아크릴아미드 변성 겔에 의해 정제하였다.
EGF1 (서열 번호 29)
EGF2 (서열 번호 30)
EGF3 (서열 번호 31)
EGF4 (서열 번호 32)
활성 hGH 의 191 개의 아미노산들을 암호화하는 합성 유전자를, 20 개의 중복 염기들을 갖는, 약 60 개 염기들의 15 개의 올리고뉴클레오티드들을 사용하는, 프라이머 중복 연장 PCR 법에 의해 수득하였다. 상기 합성 hGH cDNA는 엔테로키나아제 특정 절단 부위에 대응하는 5' 링커 서열을 포함하였다. 올리고뉴클레오티드들을, 폴리아크릴아미드 변성 겔에 의해 정제하였다.
hGH1 (서열 번호 33)
hGH2 (서열 번호 34)
hGH3 (서열 번호 35)
hGH4 (서열 번호 36)
hGH5 (서열 번호 37)
hGH6 (서열 번호 38)
hGH7 (서열 번호 39)
hGH8 (서열 번호 40)
hGH9 (서열 번호 41)
hGH10 (서열 번호 42)
hGH11 (서열 번호 43)
hGH12 (서열 번호 44)
hGH13 (서열 번호 45)
hGH14 (서열 번호 46)
hGH15 (서열 번호 47)
합성 T20 및 hEGF cDNA 를 아가로오스 겔 (Amersham)로부터 정제하고, pGEM 벡터 (Promega) 내로 클로닝하였다. BspHI 및 NcoI의 점착성 말단들을 함유하는 RX3 cDNA 단편 (감마-제인의 N-말단 도메인을 코딩)을, NcoI 로 미리 소화시킨 벡터 pCKGFPS65C 내로 삽입하였다 (Reichel 등, 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5888-5893) (특허 출원 WO2004003207에 기재된 바에 따름). T20 및 EGF 을 코딩하는 서열들을 프레임 내에서 RX3 서열에 융합시켰다. 구축물들 RX3-T20 및 RX3-EGF 을, 상기 T20 및 EGF 합성 유전자에 대한 GFP 코딩 서열의 치환에 의해 제조하였다.
pCRX3T20 및 pCRX3EGF 로 명명되는 결과의 구축물들은, 개선된 35S 프로모터로서 단백질의 전사에 관한 핵산 서열 (서열 번호 1), 담배 식각 바이러스 (tobacco etch virus) (TEV)로서 번역 개선제, T20 및 EGF 코딩 서열들, 및 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)로부터의 3' 폴리아데닐화 서열들을 포함하였다. 효과적인 식물 형질 전환 벡터들 p19RX3T20 및 p19RX3EGF은 HindIII/HindIII 발현 카세트들을 이중 벡터 pBin19 내로 삽입함에 의해 최종적으로 수득되었다 (Bevan, 1984 Nucleic Acids Research 12:8711-8721).
hGH를 암호화하는 cDNA를 RX3 N-말단 감마-제인 코딩 서열 (특허 WO2004003207)에 융합시키고, 개선된 CaMV 35S 프로모터 및 3' ocs 터미네이터를 함유하는 pUC18 유도된 플라스미드 내로 삽입하였다. 대응 융합 단백질 RX3-hGH 서열을 포함한, pUC18RX3hGH로 명명된 pUC18 유도된 플라스미드로부터의 발현 카세트를 pBin19 이중 벡터 내로 도입시켰다 (Bevan, 1984 Nucleic Acids Research 12:8711-8721).
22 kD 의 알파 제인 (22aZ)을 암호화하는 cDNA 및 13 kD의 쌀 프롤라민 (rP13)을 옥수수 W64A 및 세니아 (Senia) 쌀 품종으로부터의 cDNA 라이브러리로부터 각각 RT-PCR에 의해 증폭시켰다. 상기 PCR 반응에 사용된 올리고뉴클레오티드들은:
22aZ-5' (서열 번호 48)
22aZ-3' (서열 번호 49)
Rice13Prol-5' (서열 번호 50)
Rice13Prol-3' (서열 번호 51)
대응 PCR 단편들을 pCRII 벡터 (Invitrogen) 내로 클로닝하고, 서열화하고, 인핸스된(inhanced) CaMV 35S 프로모터, TEV 서열 및 3' ocs 터미네이터를 함유하는 pUC18 벡터들 내로 클로닝하였다. 상기 pCRII-rP13 을 SalI 및 NcoI에 의해 소화시키고, 동일한 효소에 의해 소화시킨 pUC18RX3Ct, pUC18RX3hGH 및 pUC18RX3EGF 플라스미드들 내로 클로닝시켜 각각 pUC18rP13Ct, pUC18rP13hGH 및 pUC18rP13EGF를 수득하였다. pCRII-22aZ 를 SalI/NcoI 에 의해 소화시키고, 동일한 효소에 의해 소화시킨 pUC18RX3Ct 및 pUC18RX3EGF 플라스미드 내로 클로닝시켜 pUC1822aZtCt 및 pUC1822aZtEGF를 각각 수득하였다. pCRII-22aZ 도 SalI/RcaI 에 의해 소화시키고, SalI/NcoI 에 의해 소화된 pUC18RX3hGH 플라스미드 내로 클로닝시켜 클론 pUC1822aZhGH를 수득하였다. 최종적으로, 모든 이들 pUC18-유도된 벡터들을 HindIII/EcoRI에 의해 pCambia 5300 내로 클로닝하였다.
실시예 2: 동물 및 효모 세포 형질 전환을 위한 플라스미드 구축
동물 세포들
성숙 칼시토닌 서열 (Ct, WO2004003207) 및 EGF 서열들에 대응하는 합성 유전자 및 hGH 를 암호화하는 cDNA를 RX3 N-말단 감마-제인 코딩 서열에 융합시키고 (특허 WO2004003207), 벡터 pUC18 내로 도입시켰다. 대응하는 융합 단백질 RX3- Ct, RX3-EGF 및 RX3-hGH 서열들을 함유하는 pUC18 유도된 플라스미드들 pUC18RX3Ct, pUC18RX3EGF 및 pUC18RX3hGH로부터의 SalI-BamHI 제한 단편들을 Xho I-Bam HI로 제한된 벡터 pcDNA3.1- (Invitrogen) 내로 도입시켰다. p3.1RX3CT, p3.1RX3EGF 및 p3.1RX3hGH 로 명명된 생성된 구축물들에서, 상기 융합 단백질 서열들은 CMV 프로모터 및 터미네이터 pA BGH 하에 있었다.
효모 세포들
대응 융합 단백질 RX3-EGF 및 RX3-hGH 서열들을 함유하는, 상기 기재된 pUC18 유도된 플라스미드들로부터의 SalI(블런트 말단 처리됨(blunt ended))-BamHI 제한 단편들을 EcoRI (블런트 말단 처리됨)-Bam HI 로 제한된 벡터 pYX243 (R&D Systems) 내로 도입하였다. 각각 c117 및 c118 로 명명된 생성된 구축물들에서, 상기 융합 단백질 서열들은 유도가능한 GAL 프로모터 하에 존재하였다.
실시예 3: 숙주 형질 전환
효모
사카로마이세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae ) 균주 ( leu2)를 LiAc 법 (Ito 등 1983, J. Bacteriol. 153:163-168)에 의해 상기 플라스미드 구축물들 c117 및 c118 로 형질 전환시키고, 형질 전환체들을 Leu- 플레이트들 상에서 선발하였다. 형질 전환체들을 갈락토오스-함유 매질 중에서 상기 형질 전환체들을 배양함에 의해 발현 분석들을 수행하였다.
식물 물질
담배 (니코티아나 타바쿰 변종 (Nicotiana tabacum var.) Wisconsin) 식물들을 16 시간의 광주기 (photoperiod)를 사용하여 24-26℃ 에서 시험관 내 성장 챔버 중에서 성장시켰다. 성체 식물들을 18-28℃ 사이, 55-65% 사이에서 유지된 습도의 온실에서, 평균 16 시간의 광주기를 사용하여 성장시켰다.
아그로박테리아 이용 주입법 (Vaquero 등, 1999 Proc . Natl . Acad . Sci ., USA 96(20):11128-11133; Kapila 등, 1997 Plant Sci . 122:101-108) 을 위해 종자들로부터 상기 기재된 시험관 내 조건 하에서 4-6 주 동안 모종들을 성장시켰다.
담배 안정성 형질 전환
이중 벡터들을 아그로박테리아 튜메파시엔스 (A. tumefaciens)의 LBA4404 균주 내로 전입시켰다. 담배 (Nicotiana tobaccum , W38) 잎의 원반상 조직들 (discs)을 Draper 및 Hamil 1988에 의해 다음에 기재된 것과 같이 형질 전환시켰다: Plant Genetic Transformation and Gene Expression . A Laboratory Manual (Eds. Draper, J., Scott, R., Armitage, P. 및 Walden, R.), Blackwell Scientific Publications. 재생된 식물들을, 200 mg/L 카나마이신을 함유하는 매질 중에서 선발하고, 온실로 이동하였다. T1 및 T2 세대들을 수득하기 위하여, 가장 높은 유전자 전이 생성물 수준을 갖는 유전자 전이된 담배 식물들을 재배하였다.
재조합 단백질 수준을 면역 블롯에 의해 검출하였다. 담배 잎들로부터의 총 단백질 추출물들을 브래드포드 (Bradford) 분석으로 정량하고, 15% SDS-PAGE 상에 서 분리하고, Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (Bio Rad)을 사용하여 니트로셀룰로오스 막들로 이동시켰다. 막들을 감마-제인 항혈청 (1/7000 희석)과 함께 인큐베이션시키고 (Ludevid 등 1985, Plant Science 41:41-48), 그 후 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 항체들(1/10000 희석, Amersham Pharmacia)과 함께 인큐베이션시켰다. 면역활성 밴드들을 개선된 화학발광 (ECL 웨스턴 블로팅 시스템, Amersham Pharmacia)에 의해 검출하였다.
담배의, 아그로박테리아 이용 주입
아그로박테리아 이용 주입법을 위해, 24-26℃ 에서 16 시간의 광주기를 사용하여, 시험관 내 성장 챔버에서 4-6 주 동안 종자로부터 모종들을 성장시켰다.
원하는 구축물을 함유하는 아그로박테리아 튜메파시엔스 균주 LB4404 를, 카나마이신 (50 mg/l) 및 리팜피신 (rifampicine) (100 mg/l)으로 보충된 LB 배지 (트립톤 10 g/l, 효모 추출물 5 g/l, NaCl 10 g/l) 상에서, 28℃ 에서 하룻밤 동안 (약 18 시간들) 진탕하며 (250rpm) 배양하였다. 그 후 아그로박테리아를 카나마이신 (50 mg/l) 및 리팜피신 (100 mg/l)으로 보충된 30 ml 의 LB 내에 접종시켰다. 28℃ 에서 하룻밤 동안 배양한 후 (약 18 시간들), 3000xg 에서 10 분 동안 원심 분리에 의해 아그로박테리아 세포들을 수집하여, pH 5.8의, MES (Sigma Chemical) 4.9 g/l 및 수크로오스 30 g/l 을 갖는 10 ml 의 액체 MS 매질 중에 재현탁하였다. 박테리아 배양물을 아그로박테리아 이용 주입을 위해 최종 OD600 0.1 로 조정하였 다. 그 후, 세포 배양물을 아세토시린곤 (acetosyringone)을 사용하여 최종 농도 0.2 mM 로 보강하고, 28 ℃ 에서 90 분 동안 인큐베이션하였다.
아그로박테리아 이용 주입을 위해, 모종들을 상기 현탁액으로 완전히 덮고, 진공 (100 KPa)을 5-6 초 동안 적용하였다. 상기 현탁액을 제거하고, 모종들을 16 시간의 광주기 하에서 4일 동안, 24-26℃에서 성장 챔버에서 유지하였다. 상기 모종 물질을 회수하고, 총 단백질 추출을 항-감마-제인 항체를 사용한 면역 블롯에 의해 분석하였다.
동물 세포 형질 전환
구축물들 p3.1RX3.EGF 및 p3.1RX3.hGH 을, 리포펙타민에 기초한 형질 감염법 (Invitrogen)에 의해 293T, Cos1 또는 CHO 배양된 포유류 세포들에 도입시켰다. 개선된 시안 형광 개질된 GFP의 유전자를 함유하는 플라스미드 pECFP-N1 (Clontech)로 형질 감염된 세포들을 대조군으로서 사용하였다.
실시예 4: 담배 잎들로부터의 단백질 추출
신선 식물 물질
식물 물질 (습윤 또는 건조 담배 잎들 또는 모종들)을 액체 질소 중에서 분쇄하고, Tris-HCl 50 mM pH 8, 200 mM 디티오트레이톨 (dithiothreitol) (DTT) 및 프로테아제 저해제들 [10 μM 아프로티닌 (Aprotinin), 1 μM 펩스타틴 (pepstatin), 100 μM 류펩타인(leupeptine), 100 μM 페닐메틸술포닐 플루오라이 드 (PMSF) 및 100 μM E64 (Sigma Chemical)]을 함유하는 추출 버퍼 T 와 함께 균질화하였다. 균질물들을 4℃에서 10000xg 로 30 분 동안 원심분리하여, 불용성 물질을 제거하였다. 총 가용성 단백질들 (TSP)을 브래드포드 단백질 분석 (BioRad)을 사용하여 정량하였다.
건조 담배 잎들 및 단백질 추출
성체 유전자 전이된 담배 잎들 및 야생형 담배 잎들을 여과지 상에서, 37℃의 방에서 2 주 동안 건조시켰다. 2 주 후, 잎들을 자르고, 실온에서 5 달 동안 저장하였다. 건조 물질의 총 가용성 단백질을, 신선 물질에 대해 기재된 것과 같은 방법으로 추출하고, 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
실시예 5: RPBLAs 제조
균질화
신선한 유전자 전이된 담배 잎들 및 건조된 유전자 전이된 담배 잎들, 및 아그로박테리아 이용 주입된 담배 모종들 (일시적 형질 전환)을, Tris 100 mM pH 8, KCl 50 mM, MgCl2 6 mM, 10% 수크로오스로 보충된 EDTA 10 mM 및 프로테아제 저해제들 (PMSF, 류펩타인, 아프로티닌, E-64)을 함유하는 PBP 추출 버퍼 중에서, 막자와 막자사발을 이용하여 0℃ 에서 분쇄하였다. 상기 균질물을 소형 로터 (7.5 mm 직경)가 있는 폴리트론 (IKA T25 Basic, 24.000 rpm)을 사용하여, 얼음 중에서 3-4 초 동안 약 10 회, 추가로 분쇄하였다. 파괴되지 않은 조직 및 세포들을 제거하기 위해, 4 층의 Miracloth (22-24 마이크로미터) (Calbiochem)를 통해 여과시켜 고형 물질을 제거하였다.
실시예 6: 동물 세포들로부터의 단백질들
형질 감염된 세포들을 배양 플레이트들로부터 긁어내어 회수하고, 이들을 균질화 B 매질 (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.9% NaCl, 프로테아제 저해제들이 있는 5mM EDTA) 중에 현탁하였다. 이 현탁액을 23 게이지의 바늘이 장착된 5 ml 주사기로 취하여, 약 30 회 방출해 내었다. 세포 파쇄를 위상차 현미경에 의해 모니터링하였다. 담배 잎 균질물들에 대해 설명된 것과 같이, 균질물을 단계별 수크로오스 구배 상에 부하하고, 원심분리하였다.
일시적으로 형질 감염된 세포들 중에서의 융합 단백질들의 축적은, 감마-제인에 대해 생성된 감마-제인 항체들을 사용하여, 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 48 시간의 형질 감염 후, 총 가용성 세포 단백질들을 버퍼 A (100 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% SDS, 0.5% Triton X-100, 2% 2-머캡토에탄올 및 프로테아제 저해제들)로 추출하였다. 세포 인큐베이션 매질의 분액들을 침전시키고, -20℃ 에서 저장하였다. 동량의 형질 감염된 세포들 및 매질로부터 추출된 단백질들을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하고, 면역검출을 위해 니트로셀룰로오스 시트들로 이동시켰다.
실시예 7: 불연속적 구배에 의한 분리
균질물을 50xg 에서 5 분 동안 4℃에서 원심 분리하여 정화된 추출물을 수득하였다. 불연속적 수크로오스 구배를 위해, 이 정화된 균질물 (상등액)을, PBP 버퍼 중의 2.5 ml의 20%-30%-42%-56% (w/w) 또는 42%-49%-56%-65% (w/w) 수크로오스로 구성된 단계별 구배 상에 적층시키고, 이를 진동-버켓 로터 (swining-bucket rotor) (SW41Ti) 중에서 80,000xg 에서, 제동 없이 4℃ 에서 120 분 동안 원심분리하였다 (Beckman Coulter Optima™ XL-100K 초원심분리기).
상기 상등액, 중간상들 및 펠렛 분획물들을 수집하였다. 상등액, 중간상 분획물들 및 펠렛의 균등한 분액들을 15% TCA 로 침전시키고, SDS-PAGE 및 융합 발현된 단백질들에 대한 특정 항체들을 사용하는 면역 블롯에 의해 분석하였다. 단백질들 RX3-EGF, RX3-T20, RX3-Ct, 및 RX3-INF 을 감마-제인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 검출하였다. 전기영동 겔들을, Morrissey 등, 1981 Anal. Biochem. 117:307-310 에 따른 은 염색에 의해 분석하여, PBs 내부에서의 재조합 단백질 대 오염물 단백질들의 풍부화를 평가하였다.
실시예 8: 일단계 쿠션에 의한 분리
상기 기재된 바에 따라 제조된 균질물을, 8 ml (1.18 g/cm3) 의 42% (w/w) 수크로오스 쿠션 상에서, 24,000g, 4℃ 에서 120 분 동안 원심 분리하였다. 상등액, 계면 및 펠렛 분획물들을 회수하였다. RPBLAs는 상기 쿠션의 바닥에 침강되었 다. 단백질 분석을 위해, 이들 분획물들의 동량의 분액들을 15% TCA 중에서 침전시키고, 시료들을 15% SDS-PAGE 상에서 분리시키고, 은 염색으로 분석하였다. PB 분획 중에 존재하는 재조합 단백질들을 감마-제인 항체를 사용한 면역 블롯에 의해 검출하였다.
실시예 9: 단리된 RPBLAs 로부터의 재조합 단백질 회수
단계별 수크로오스 구배의 42%-56% (w/w) 중간상으로부터 단리된 또는 42% (w/w) 수크로오스의 밀도 쿠션에 의해 단리된 RPBLAs를 PBP 버퍼 중에서 세척하고, 16000xg 에서 5 분 동안의 간단한 원심 분리에 의해 회수하였다. RPBLAs 내부에 축적된 재조합 단백질들을, 나트륨 보레이트 12.5 mM pH 8, 0.1% SDS 및 2% 2-머캡토에탄올을 함유하는 1 부피의 SB 버퍼 중에서 가용화시켰다. 이 용액을 37℃ 에서 하룻밤 동안 (약 18 시간) 인큐베이션하였다. 한 분액을 실온, 16000xg 에서 10 분 동안 원심 분리하고, 그 상등액 및 펠렛을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 분석하여 완전한 단백질 가용화를 평가하였다.
실시예 10: 형질 감염된 효모 세포들로부터의 단백질들
재조합 융합 단백질들을 발현하는 사카로마이세스 세레비시에를 펠렛화하였다. 각 인큐베이션 매질의 분액들을 침전시키고, 분석을 위해 -20℃ 에서 저장하였다. 세포 펠렛들도 동결시키고, 해동 후 세포들을 유리 구슬들 및 매질 Y (50 mM HCl-Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 200 mM DTT 및 프로테아제 저해제 들)를 사용하는 표준 방법들에 의해 파괴하였다. 동량의 세포 및 매질 모두를 SDS-PAGE 및 재조합 발현된 단백질들에 대한 특정 항체를 사용하는 면역 블롯에 의해 분석하였다.
형질 전환된 효모 세포들로부터 세포 소기관들을 단리하기 위해 적용된 이 붕괴 방법은 Zinser 등, 1995 Yeast, 11:493-536에 기재된 스페로플라스트들의 온화한 (gentle) 용균에 근거하였다. 30 mL의 배양된 형질 전환된 효모 세포들 (약 0.5의 DO600)을 펠렛화하고, 1 M 소르비톨로 세척하고, 100 단위/ml 의 자이몰라제(zymolase)를 함유하는 1 mL 의 스페로플라스팅 버퍼 (1 M 소르비톨, 50 mM 인산 칼륨 pH 7.5, 14 mM 2-머캡토에탄올) 중에 현탁시켰다. 30℃ 에서 때때로 부드럽게 진탕하면서 20-30 분 동안 스페로플라스트 형성을 진행시켰다. 1000 g 에서 6 분 동안 침전시킨 후, 스페로플라스트들을 2-머캡토에탄올이 없는 스페로플라스팅 버퍼로 세척하고, 0.5 mL 의 빙냉 용균 버퍼 (0.3 M 소르비톨, 10 mM 트리에탄올아민, 1 mM EDTA 및 프로테아제 저해제들)중에 재현탁하였다. 얼음 상에서 때때로 부드럽게 진탕하면서 20분 후, 용균물들을 최종 농도 1.0 M 소르비톨로 조정하였다. 담배 잎 균질물들에 대해 기재된 것과 같이, 용균물들을 단계별 수크로오스 구배 상에 부하하고, 원심분리하였다. 분획물들을 SDS-PAGE 및 면역블롯에 의해 분석하였다.
결과들
실시예 A: 유전자 전이된 식물 생장 조직들로부터의 밀도 구배에 의한 RPBLAs의 단리 (정제)
RX3-EGF 및 RX3-T20 감마-제인 유도된 융합 단백질들을 코딩하는 유전자들을 아그로박테리움 튜메파시엔스를 통해 담배 식물들 내로 도입하였다. 형질 전환된 식물들을 면역 블롯에 의해 분석하여 보다 높은 재조합 단백질 발현을 갖는 식물들을 결정하였다. 도 2A 는 RX3EGF 및 RX3T20 단백질들 모두의 패턴을 나타낸다. 두 재조합 단백질들 모두, 모든 유전자 전이주들 (lines)에서 정확하게 축적된 것으로 나타난다는 것에 주목하여야 한다. 현저한 하부 밴드들은 융합 단백질들의 단량체 형태들에 대응하고, 보다 상부의 밴드들은 그의 이량체들에 대응한다. 융합 단백질들은 대개 다량체로서 축적되고, 면역 블롯에서 검출된 단량체 및 올리고머들의 양은 이황화 결합 감소 수준에 따라 달라진다.
담배 잎 추출물들을 밀도 단계별 구배 상에 부하하고, 상이한 분획들에서 재조합 단백질들의 축적을 면역 블롯에 의해 분석하였다 (도 2B). 도 2B 에 나타낸 결과들은, RX3-EGF 가 밀집한 RPBLAs에 대응하는 분획들 중에 나타났음을 나타낸다. 이들 세포 소기관들의 대부분은 1.2632 보다 높은 밀도들을 나타내었으며 (F56, 래인 6), 이들 중 현저한 부분은 1.3163 g/cm3 보다 높은 밀도를 나타내었다 (F65, 래인 7). 상기 RX3-T20 융합 단백질은 중간상 49%-56% 수크로오스 (래인 12) 중에 존재하였으며, 이는 RX3-T20 을 함유하는 RPBLAs 이 1.2241g/cm3 보다 높은 밀도를 갖는다는 것을 나타내며, 이들 중 현저한 부분은 1.2632 보다 더 밀집하였고, 현저한 부분은 1.2632 보다 더 큰 밀도를 가졌다 (래인 13).
담배 잎들 중에 형성된 이들 신규 RPBLAs 은 천연 옥수수 단백질체들의 범위 내의 밀도를 나타내거나 (Ludevid 등, 1984 Plant Mol . Biol . 3:227-234; Lending 등, 1989 Plant Cell 1:1011-1023), 또는 보다 더 밀집하다. RX3-T20 PBs 는 RX3-EGF PBs 보다 약간 (조금) 덜 밀집하다는 것에 주목해야 하며, 이는 관심 대상의 단백질의 일부 특정 성질들에 기인한다. 따라서, RPBLAs 축적 재조합 융합 단백질들이 일반적으로 존재하는 가용성 세포 부분들에 비해 높은 밀도들을 갖지만, RX3 도메인에 융합된 단백질의 특징들은 그러한 밀도에서의 변화들을 결정할 수 있다.
두 재조합 단백질들의 90% 이상이 밀집한 RPBLAs 분획물들 및 펠렛에서 회수되었음이 평가되었다(도 2B, 참조). 따라서, 밀도에 의한 RPBLAs 의 단리는 상기 융합 단백질들을 정제 (농축)하는데 유용한 계인 것으로 보인다.
RPBLAs 단리에 의한 재조합 단백질 RX3-EGF의 정제를 평가하기 위하여, 상이한 밀도 분획물들을 은 염색으로 분석하였다 (도 2C). 염색된 겔에서 알 수 있는 것과 같이, 90 % 이상의 담배 내생 단백질들이 구배 중 가용성 (S) 및 중간상 분획물들 (F422 및 F49) 중에 위치하였으며, 상기 분획물들에는 RX3-EGF 단백질이 부재하거나 거의 검출되지 않았다 (도 2B 참조). 따라서, 덜 밀집한 세포 소기관들 중에 존재하는 가용성 단백질들 및 단백질들의 덩어리는, 상기 구배의 하나 또는 두 분획들 (F56 및 F65)을 선택함에 의해, 폐기될 수 있다.
RPBLAs 분획물들 (F56 및 F65) 중에서 융합 단백질들 정제의 정도와 관련하여, RX3-EGF 단백질은 PBLS-함유 분획들 중에서 검출된 단백질들의 약 80 %를 차지하는 것으로 평가되었다. 이러한 결과는, RPBLAs 단리 절차를 사용하여, 단지 한 단계의 정제로 융합 단백질들의 높은 풍부화를 달성할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 B: 건조 식물 조직들로부터 단리된 RPBLAs 에서의 재조합 단백질들 회수
분자수준 배양에서 중요한 점은 식물 생물자원을 저장하기 위한 용이한 수단의 존재이다. 이러한 맥락에서, 건조는 저장 부피를 줄이고 생성물을 보존하기 위한 편리한 방법을 제공할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 건조는 종종 관심 대상의 단백질의 저하를 촉진한다. 재조합 단백질들을 함유하는 RPBLAs를 단리하기 위한 건조된 식물들의 사용은 산업적 목적에 큰 이익일 수 있을 것이다.
상기 기재된 것과 같이, RX3-EGF 및 RX3-T20 융합 단백질들을 축적하는 형질 전환된 담배 잎들을, 역시 상기 기재된 것과 같이 건조시켰다. 5 달 동안의 건조 저장 후, 재조합 단백질들의 안정성을 분석하였다. 동량의 습윤 (신선) (W, 래인 1) 및 건조 (D, 래인 2) 잎 조직들로부터의 단백질 추출물들을 면역 블롯에 의해 분석하였다 (도 2D). 도에서 알 수 있는 바와 같이, RX3-EGF 단백질은 건조된 형질 전환된 식물들에서 안정하였으며, 습윤 및 건조 식물들에서 회수된 양은 유사하였다 (래인 W 및 D 비교).
건조 잎들의 균질물들로부터의 융합 단백질들 (RX3EGF 및 RX3T20)의 단계별 밀도 구배들에서의 분포를 면역 블롯에 의해 분석하였다 (도 2 D, 래인 3-7). 흥미롭게도, 두 융합 단백질들 모두 1.1868 g/cm3 (F42 분획) 및 1.2632 g/cm3 (F56 분획) 보다 높은 밀도들을 나타내는 밀집한 구조물들로 회수되었다.
따라서, 재조합 단백질들은 RPBLAs 의 단리를 통해 건조된 조직들로부터 정제될 수 있으며, 이에 따라 이를 유전자 전이된 식물 수집 및 재조합 단백질 추출 및 정제는 시간에 독립적일 수 있음을 나타낸다. 이들 결과들에 일치하여, 감마-제인 융합 단백질들도 쌀 종자들 중의 RPBLAs 에 축적되었다.
실시예 C: 일시적으로 형질 전환된 담배 모종들로부터의 RPBLAs 의 단리에 의한 재조합 단백질 회수
일시적 발현계들은 재조합 단백질들의 단기간의 축적 거동을 시험하기 위한 편리한 도구일 수 있다. 따라서, 재조합 단백질들 RX3-EGF 및 RX3-T20도, 아그로박테리아 이용 주입을 통해 일시적으로 형질 전환된 담배 모종들에서 발현 및 축적되었다. 면역블롯에 의해 분석된 형질 전환된 모종들로부터의 단백질 추출물들 (도 3A)은 안정하게 형질 전환된 식물들로부터 관찰된 특징적인 복합 전기영동 패턴을 나타내며 (도 3A, 래인 4 및 2A, 래인 4 비교), 이는 융합 단백질들이 이 형질 전환 방법을 사용하여 정확하게 조립됨을 나타낸다.
보다 높은 분자량 융합 단백질인 RX3-hGH 의 발현 또한 일시적으로 형질 전환된 담배에서 분석되었다 (도 3A, 래인 4). 밀도 구배들 상에서 세포내 분획화 후, RX3-T20 및 RX3-hGH 융합 단백질들 모두, RPBLAs 분획물들에 대응하는 밀집한 분획들에서 회수되었으며 (도 3B, 래인 4, 5 및 9, 10), 이는 1.1868 g/cm3 (F42) 및 1.2632 g/cm3 (F56) 보다 높은 밀도를 나타내었다. 일시적 발현은 따라서, 단기간으로, 원하는 재조합 단백질을 함유하는 PBs의 특정 밀도 성질들을 시험하는데 사용될 수 있다.
실시예 D: 저속 및 중속 원심 분리에 의한 재조합 단백질들의 회수
밀집한 재조합 단백질체 유사 조립체들을 통한 재조합 단백질들을 정제하는데 사용되는 절차를 간단화하기 위하여, 두 개의 추가적인 선택적 방법들을 수행하였다: i) 정화된 균질물들을 단지 하나의 밀집한 수크로오스 쿠션을 통해 원심분리하고 (도 4 A, B), ii) 정화된 균질물들을 저속 원심 분리 (즉, 1000-2500xg 에서 10 분 동안)로 간단히 원심분리하였다.
상기 기재된 결과들에 일치하여, RX3-EGF 및 RX3-T20 단백질들 모두, 1.1868 g/cm3 수크로오스 쿠션을 통한 원심 분리 후 수득된 펠렛들 중에서 높은 수율로 (90% 이상) 회수되었다 (도 4A, 래인 4 및 6). 추가로, RX3-EGF 단백질의 정제는, 도 4B의 은 염색된 겔에서 알 수 있는 바와 같이 매우 높았으며, 여기에서 오염물 담배 내생 단백질들은 대응 펠렛에서 거의 검출되지 않았다 (래인 4).
단계별 밀도 구배들에 비교시, 이 방법의 주요 장점은 재조합 단백질들의 산업적 제조에 대한, 이의 쉬운 확장성 (scalability)에 있다. 쿠션 밀도 뿐 아니라 점도 및 삼투성과 같은 기타 성질들은 각 경우에서, 재조합 단백질들의 회수 및 정제를 최적화하기 위하여, 조정될 수 있다는 것에 주목하여야 한다.
추가적으로, 저속 원심 분리 (LSC)도 융합 단백질 함유 단백질체 유사 구조물들을 농축 및 정제하기 위해 분석되었다 (도 4C, LSC). 이 결과들은, 1000xg 에서 10 분 후, 실질적으로 모든 RX3-EGF 융합 단백질이 펠렛 중에서 회수되었음을 나타내었다 (도 4C 래인 2). 그러나, 이 펠렛에 함유된 단백질들의 염색은, 1.1868 g/cm3 수크로오스 쿠션 (도 4C, 래인 3 및 7 비교)을 통한 원심 분리 후 수득된 것에 비해, 상기 융합 단백질이 높은 순도로 정제되지 않음을 나타내었다.
그 후, 저속 원심 분리에 의해 수득된 제 1 펠렛을 5% Triton X-100을 함유하는 버퍼를 사용함에 의해 세척하였다. 세척 후, 시료를 12,000xg 에서 5 분 동안 원심 분리하였으며, 흥미롭게도, P1 펠렛 중에 존재하는 오염 단백질들의 덩어리가, 세척 및 원심 분리 후 제거되었으며, 그리고 이 새로운 펠렛 (P2, 도 4C, 래인 9)은 매우 풍부화된 RX3-EGF 단백질을 함유하였다. 래인 9에서 단백질들의 패턴 및 양은, Triton X-100 함유 버퍼 중에서 수크로오스 쿠션을 통한 원심 분리 후에 수득된 펠렛을 세척한 후 수득된 것 (도 4C, 래인 5) 과 유사하다는 점에 주목하여야 한다. 저속 원심분리 대안 방법은 융합 단백질들을 함유하는 구조물들의 높은 밀도에 기초한 것이며, 원심 분리 조건들은 크기 확장 전에 모든 목적들에 맞게 최적화될 수 있다.
실시예 E: 형질 감염된 동물 세포들로부터의 RPBLAs 의 단리에 의한 재조합 단백질 회수
저장 단백질-유도된 융합 단백질들도, 형질 감염된 동물 세포들 중에서 밀집한 재조합 PB-유사 조립체들의 형성을 유도하는지의 여부를 결정하기 위한 연구들을 수행하였다. 균질화된 형질 감염된 포유류 세포들로부터의 세포 소기관들의 세포내 분포를 단계별 밀도 구배들을 사용하여 분석하였다. 세 개의 상이한 세포 배양 유형들, 293T (인간 유래), Cos1 (원숭이 유래) 및 CHO (햄스터 유래)을, 세 개의 상이한 융합 단백질들 RX3-Ct, RX3-EGF 및 RX3-hGH을 코딩하는 cDNA 의 사용에 의해 형질 감염시켰다. pECFP-N1 (Clontech)로 형질 감염된 Cos1 세포들을 대조군으로서 사용하였다. 구배 분획물들을 상기 기재된 것과 같이 수집하고, 면역 블롯에 의해 분석하였다 (도 5A).
형질 감염된 세포들 중에서 발현된 재조합 RX3-유도된 단백질들을 감마-제인 항혈청을 사용하여 검출하였다. 상이한 수집된 분획물들 중에서 대조군 ECGP의 검출은, 토끼에서 발생된 항-GFP 항혈청을 사용하여 수행하였다.
예측된 바와 같이, 가용성 ECGP 단백질을 상등액 분획물 중에서 회수되었으며 (S, 도 5A, 래인 2), 미립성 세포 분획물들이 침강된 중간상 및 펠렛 분획물들 중에서는 이 단백질은 흔적도 검출되지 않았다. 반면에, RX3CT, RX3EGF 및 RX3hGH 는 밀집한 분획물들 F30, F42 및 F56 에 주로 존재하였으며 (도 5A), 이는 감마-제인 유도된 융합 단백질들이 이들 밀집한 분획물들 (1.1270 내지 1.2632 g/cm3 의 밀도)로부터 수득될 수 있음을 나타낸다. 이들 결과들은 면역세포화학에 의해 얻은 결과들과 일치하였으며, 여기에서 융합 단백질들은 ER 및 직경 약 1 내지 약 1.4 미크론의 재조합 단백질체 유사 조립체들 중에 위치되어 있었다.
현저한 양의 재조합 단백질이 RX3-Ct- 및 RX3-hGH-형질 감염된 세포들로부터의 구배들의 가용성 분획 중에서 회수되었다. 이는 아마도, ER 내에 함유된 아직 조립되지 않은 융합 단백질들의 가용화를 허용하는, 균질화 동안의 과도한 세포 파괴로 인한 것이다.
저속 원심 분리 (LSC, 도 5B) 또한, RX3-EGF를 발현하는 CHO 세포들로부터의 균질물들을 사용하여 분석하였다. 도 5B 에서 알 수 있는 바와 같이, 융합 단백질 덩어리를 2500xg 펠렛 (래인 2) 중에서 회수하였으며, 이는 융합 단백질들이 밀도에 기초한 방법들에 의해 회수될 수 있는 동물 세포들 중에서 밀집한 단백질체 유사 구조체들에 축적된다는 것을 확인시켜 주는 것이다.
실시예 F: 밀도 구배에 의한, 형질 전환된 효모로부터의 재조합 단백질들의 회수
형질 전환된 효모 중에서 융합 단백질들을 함유하는 밀집한 구조물들의 형성도 단계별 밀도 구배에 의해 분석하였다. RX3-EGF 및 RX3-hGH 융합 단백질들을 코딩하는 cDNAs 를 효모 형질 전환 벡터들을 통해, 표준 절차들을 사용하여 사카로마이세스 세레비시에 내로 도입시켰다. 세포 소기관들을 단리하는데 적용된 파쇄 방법은, 방법들에서 기재된 것과 같이, 스페로플라스트들의 온화한 용균에 근거하였다. 포유류 세포들 또는 담배 잎 균질물들에 대해 기재된 것과 같이, 용균물들을 단계별 수크로오스 구배 상에 부하하고, 원심 분리하였다. 분획들을 SDS-PAGE 및 면역 블롯에 의해 분석하였다.
분획화 결과들을 표 6에 나타내었으며, 여기에서 두 단백질들 RX3-EGF 및 RX3-hGH 대부분이, 구배 중의 중간상 F30 (도 6, 래인 4) 중에 위치되었음을 알 수 있다. 이 분획은 1.1270 내지 1.1868 g/cm3 사이의 밀도를 갖는 세포내 구조물들을 함유한다. 유의한 양의 융합 단백질들은 상기 상등액 및 F20 분획에서는 검출되지 않았으며, 이는 상기 융합 단백질들이 효모 세포들 중에서 조립된다는 것을 나타낸다. 효모 세포들의 감소된 크기 (3 미크론 이하)는 단지 작은 RPBLAs 의 형성만을 허용할 수 있으며, 이러한 RPBLAs 는 식물 및 동물 세포들 중에서 관찰되는 것들보다 덜 밀집한 것이다. 임의의 경우에, 이들은 원심 분리에 의해 대부분의 다른 세포 단백질들로부터 단리 및 정제될 수 있다.
실시예 G: 밀도 구배에 의한 상이한 저장 단백질 도메인들로부터의 융합 단백질들의 회수
그들의 밀도 성질들을 통한, 감마-제인 유도된 융합 단백질들의 정제는, 기타 저장 단백질들로부터 유도된 융합 단백질들로도 확장할 수 있다. 여기서, 본 발명자들은, 13kD의 쌀 프롤라민 (rP13) 및 22 kD 의 알파-제인 (22aZt)으로부터 유도된 융합 단백질들이, 어떻게 단계별 수크로오스 구배들 상에서 RPBLAs 에 대응하는 밀집한 분획물들 중에 축적되는지를 보여준다 (도 7). 13kD 의 쌀 프롤라민 (rP13) 및 22 kD 알파-제인 [전체 길이 형태 (22aZ) 또는 N-말단 도메인 (22aZt)] 의 선발은 그들 사이의, 그리고 RX3 도메인에 대한, 상동성의 부족에 근거하였다. 뜻밖에도, 두 저장 단백질들 모두 매우 밀집된 RPBLAs 를 제조하였으며, 단계별 밀도 구배에 투입된 경우, 상기 RPBLAs 는 보다 밀집한 계면들중에서 회수되었다 (도 7A).
칼시토닌 서열은, CaMV35S 프로모터 하에 있는 rP13 및 22aZt 서열들과 함께 프레임 내에서 융합되었으며, 아그로박테리움 튜메파시엔스 내로 도입되었다. 담배 모종들을 일시적으로 형질 전환시키고, 잎 균질물들을 단계별 밀도 구배에 투입하였다. 수집된 분획물들을, SDS-PAGE 및 토끼에서 발생된 항-칼시토닌 항혈청을 사용한 면역 블롯에 의해 분석하였다.
도 7A (래인 4-5, 및 9-10)에서 알 수 있는 바와 같이, 보다 많은 양의 두 융합 단백질들 rP13Ct 및 22aZtCt 모두가 F42 및 F56 분획들에 위치되었으며, 이는 융합 단백질 정제를 위해 단리될 수 있는, 1.1868 g/cm3 보다 높은 밀도들을 갖는 재조합 PB-유사 조립체들의 존재를 나타내는 것이다. 상기 결과들은 또한, 융합 단백질들을 함유하는 재조합 PB-유사 조립체들의 밀도가 융합물 내에 포함된 저장 단백질의 기능에 따라 다를 수 있음도 나타낸다.
쌀 프롤라민 (rP13-hGH) 및 전체 길이 알파 제인 (22aZ-hGH) 에 융합된 hGH 을 사용하여 아그로박테리아 이용 주입 연구들을 수행하였다. 다시 한 번, RPBLAs 의 대다수가 F42 및 F56 분획들 (도 7A 래인 4-5 및 래인 9-10)에서 관찰되었지만, 흥미롭게도 이번에는 일부 비-조립된 융합 단백질이 상등액 및 저밀도 계면들 (래 인 1-2 및 6-7)에서도 검출되었다. 이러한 효과는 hGH의 rP13 및 22aZ에 대한 부분적 가용화 효과에 의해 설명될 수 있다.
상기 융합 단백질들 rP13-EGF 및 22aZ-EGF 를 발현하는 유전자 전이 담배 식물들이 아그로박테리움 튜메파시엔스 형질 전환에 의해 제조되었다. EGF 에 대한 항체를 사용하는 면역 블롯에 의해 결정된 최상의 발현자들 및 그러한 세포주들을 사용하여, 동일한 구축물들을 아그로박테리움 이용 주입된 담배 모종들과, 비교 분석하는데 사용하였다. 도 7 (A, 래인 4 및 9; B 래인 3)에서 알 수 있는 것과 같이, 모든 경우들에서, 특정 계면 (F12)에서 회수된 RPBLAs 는 그 RPBLAs 가 매우 밀집하고 균질하다는 것을 나타낸다.
이들 결과들을 모두 종합하면, 프롤라민류는, 이들이 다른 단백질들에 융합된 경우에도, 고밀도 RPBLAs를 유도할 수 있음이 명백하다. 이는, 주로 그들 간에 상동성이 거의 관찰되지 않는 경우에, 예측되지 않는 결과이다. 또한, 프롤라민류가 상호작용하여 단백질체들을 안정화시킨다는 사실 및 이들 중 일부는 생장 조직, 예로서 알파-제인에서 단독으로 발현된 경우 안정하지 못하다는 사실을 나타내는 일부 데이타들이 있다 (Coleman 등, 1996 Plant Cell 8:2335-2345).
실시예 H: 단리된 PBLS 로부터의 재조합 단백질들의 추출
밀집한 재조합 PB-유사 조립체들의 단리는, 재조합 단백질을 유전자 전이된 유기체들로부터 고수율 및 높은 정제 수준으로 회수하기에 유리한 방법이라는 것이 증명되어 왔다. 여기에서는, 이들 재조합 단백질들이 저장 세포 소기관들로부터 추출될 수 있다는 것을 보여준다. 재조합 PBLAs 는 일부 적용들에 직접적으로 사용될 수 있지만 (즉, 구강 백신 제조), 일부 다른 경우들에서는, 정제된 재조합 단백질들의 처리가 필요할 수 있다.
하룻밤 동안 (약 18 시간 동안) PB 분획물들을 37 ℃에서, 환원제를 함유하는 버퍼 (나트륨 보레이트 12.5 mM pH 8, 0.1% SDS 및 2% 2-머캡토에탄올을 함유한 SB 버퍼; 처리) 중에서 인큐베이션한 후, RX3-EGF 및 RX3-T20 단백질들을 가용화하였다. 도 8의, RX3-EGF 에 대한 래인 1-4 및 RX3-T20에 대한 래인 6-7 모두에서 알 수 있는 바와 같이, 추출된 융합 단백질들 모두 그들의 가용성 형태들 (S)로 회수되었다. 그 후, 그들의 적용의 함수로서, 상기 추출된 단백질들은 추가의 정제에 투입될 수 있거나 또는 부분적으로 정제된 추출물들로서 사용될 수 있다.
여기 언급된 특허들 및 논문들은 각각 참조로서 포함된다. 단수 (관사 "a" 또는 "an")의 사용은 하나 또는 그 이상을 포함하고자 하는 의도이다.
상기 기재 및 실시예들은 예시적인 것으로 의도된 것이지, 제한적인 것으로 받아들여져서는 안된다. 본 발명의 기술 사상 및 범주에 속하는 여전히 다른 변경들이 가능하며, 당업자들에게는 그러한 변경들이 쉽게 제시될 수 있을 것이다.
<110> ERA BIOTECH, S.A. <120> PROTEIN ISOLATION AND PURIFICATION <130> F07-5449-ES <150> 0426161.6 <151> 2004-11-29 <160> 51 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> part of Promoter 2xCaMV35s <400> 1 Pro Pro Pro Val His Leu 1 5 <210> 2 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RX3 query aa sequence <400> 2 Pro Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro 1 5 10 15 Val His Leu Pro Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val His Leu Pro 20 25 30 Pro Pro Val His Leu Pro Pro Pro Val His Val Pro Pro Pro Val His 35 40 45 Leu Pro Pro Pro 50 <210> 3 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha zein aa sequence <400> 3 Gln Gln Gln Gln Gln Phe Leu Pro Ala Leu Ser Gln Leu Asp Val Val 1 5 10 15 Asn Pro Val Ala Tyr Leu Gln Gln Gln Leu Leu Ala Ser Asn Pro Leu 20 25 30 Ala Leu Ala Asn Val Ala Ala Tyr Gln Gln Gln Gln Gln Leu Gln Gln 35 40 45 Phe Leu Pro Ala Leu Ser Gln Leu Ala Met Val Asn Pro Ala Ala Tyr 50 55 60 Leu 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Claims (20)

  1. 하기 단계들을 포함하는, 숙주 세포들 중에서 재조합 단백질체-유사 조립체들 (recombinant protein body-like assemblies: RPBLAs)로서 발현된 재조합 융합 단백질의 정제 방법:
    (a) 융합 단백질을 재조합 단백질체-유사 조립체들로서 발현하는 형질 전환된 숙주 세포들의 수성 균질물을 제공하는 단계로, 상기 RPBLAs 는 예정된 밀도를 가지고;
    (b) 상기 균질물 중에서 상이한 밀도의 영역들을 형성하여, 상대적으로 증가된 농도의 RPBLAs 를 함유하는 영역 및 상대적으로 고갈된 농도의 RPBLAs 를 함유하는 영역을 제공하는 단계;
    (c) 상대적으로 증가된 농도의 RPBLAs 를 함유하는 영역으로부터 상기 RPBLAs-고갈된 영역을 분리하여, 상기 융합 단백질을 정제하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, RPBLAs 의 예정된 밀도가 균질물 중에 존재하는 실질적으로 모든 내생의 숙주 세포 단백질들의 밀도보다 큰 정제 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 융합 단백질이 함께 연결된 두 개의 서열들을 함유하고, 여기에서 하나의 서열은 단백질체-유도 서열이고, 다른 하나는 관심 대상의 생성물의 서열인 정제 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 균질물 중에서 상이한 밀도의 영역들이, 밀도차 제공 용질의 존재 하에서 균질물을 원심분리함에 의해 제공되는 정제 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 밀도의 영역들이 밀도 구배 (gradient)에 의해 제공되는 정제 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 밀도의 영역들이, RPBLAs 들의 밀도보다 작은 밀도를 갖는 밀도 쿠션(cushion)에 의해 제공되는 정제 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 밀도의 영역들이, 균질물의 저속 원심분리 후 수득되는 상등액 및 펠렛에 의해 제공되는 정제 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포들이 고등 식물 세포들인 정제 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포들이 진균성 세포들인 정제 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 진균성 숙주 세포들이 효모 세포들인 정제 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포들이 조류(algal) 세포들인 정제 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포들이 동물 세포들인 정제 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 동물 숙주 세포들이 포유류 세포들인 정제 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 단백질체-유도 서열 및 관심 대상의 생성물의 서열 사이에 링커(linker) 서열을 더 포함하는 정제 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질체-유도 서열이 프롤라민(prolamin) 또는 개질 프롤라민을 함유하는 정제 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 프롤라민 서열이 감마-제인, 알파-제인 또는 쌀 프롤라민인 정제 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, RPBLAs 가 약 1.1 내지 약 1.35 g/ml 의 밀도를 갖는 정제 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 균질물이 신선한 생물 자원(fresh biomass)으로부터 제조되는 정제 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 균질물이 건조된 생물 자원으로부터 제조되는 정제 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, RPBLAs 를 회수하는 추가의 단계를 포함하는 정제 방법.
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