CN101103114B - 蛋白分离和纯化 - Google Patents

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Abstract

公开了纯化重组融合蛋白的方法，所述蛋白在宿主细胞中作为重组蛋白体样组装体(RPBLA)表达，在所述方法中提供以具有预定密度的RPBLA表达融合蛋白的转化宿主细胞的水性匀浆。形成所述匀浆的不同密度的区域，以提供含有浓度相对提高的RPBLA的区域和含有浓度相对匮乏的RPBLA的区域。从RPBLA浓度相对提高的区域中分离RPBLA匮乏的区域，从而纯化所述融合蛋白。然后可以根据需要收集所述RPBLA浓度相对提高的区域。

Description

蛋白分离和纯化
技术领域
本发明提供纯化在重组蛋白体样组装体(RPBLA)中积聚的重组蛋白的方法。更具体地，本发明提供分离重组蛋白体样组装体中的重组融合蛋白，所述重组蛋白体样组装体能够根据密度的不同允许从其它宿主细胞细胞器中进行分离，其中目的重组蛋白能够被浓缩、与其它细胞成分分离且容易回收。
背景技术
蛋白体(PB)是专用于蛋白质积聚的亚细胞细胞器(或较大的小泡，直径约1-3微米，被膜包围)。它们在诸如种子的某些特定植物组织中天然形成，并且作为用于萌发和幼苗生长的氨基酸的主要来源。
贮藏蛋白通过信号肽共翻译地插入内质网(ER)的内腔中，以便被包装在ER中或进入液泡中(Galili et al.，1993Trends Cell Biol.3：437-443)并且在这些亚细胞区室中装配成多体单元，发育成被称为(ER)-衍生蛋白体(PB)或蛋白贮藏液泡(PSV)的特定细胞器(Okita andRogers，1996Annu.Rev.Plant Physiol Mol.Biol.47：327-350；Hermanand Larkins，1999 Plant Cell 11：601-613；Sanderfoot and Raikel，1999Plant Cell 11：629-642)。
双子叶植物中的贮藏蛋白主要是可溶性蛋白，例如7S球蛋白或豌豆球蛋白型、11S球蛋白或豆球蛋白型蛋白，并且与其它蛋白(即蛋白酶抑制剂、蛋白水解酶类、凝集素等等)、糖和盐一起被隔离在PSV中。
与PSV相反，PB(1-3微米)主要隔离谷醇溶蛋白且缺乏其它辅助蛋白，谷醇溶蛋白是谷类的高度疏水的贮藏蛋白(例如玉米的玉米醇溶蛋白和小麦的麦醇溶蛋白)(Herman and Larkins，1999 Plant Cell11：601-613)。
目前，除ER体外，尚未在除植物种子之外的组织中发现PB。ER体的大小较小(0.2-0.4微米)，并且只有在创伤和被昆虫咬食时才在拟南芥的叶子中形成而不在正常条件下发生(Matsushima et al.，2003Plant J.33：493-502)。
已使用遗传工程方法来研究植物PB的形成、贮藏蛋白的装配和靶向。已经显示当重组蛋白，主要是植物贮藏蛋白，在拟南芥和烟草中表达和包装时，本来不含有PB的植物组织(例如营养组织)“从头”产生出这些细胞器(Bagga et al.，1997 Plant Cell 9：1683-1696；Bagga etal.，1995 Plant Physiol.107：13-23；美国专利第5,990,384号、第5,215,912号和第5,589,616号；以及Geli et al.，1994 Plant Cell6：1911-1922)。
当在转基因烟草植株中表达时，叶细胞中玉米的β-玉米醇溶蛋白被正确地靶向在新形成的ER-衍生的PB中(Bagga et al.，1995 PlantPhysiol.107：13-23)。在拟南芥植株中表达的玉米γ-玉米醇溶蛋白和截短的γ-玉米醇溶蛋白cDNA也积蓄在叶子中新的ER-衍生的PB中(Geliet al.，1994 Plant Cell 6：1911-1922)。在玉米胚乳中表达的富含赖氨酸的γ-玉米醇溶蛋白(Torrent et al.1997 Plant Mol.Biol.34(1)：139-149)积蓄在玉米PB中并且与内源玉米醇溶蛋白共定位。表达α-玉米醇溶蛋白基因的转基因烟草植株证明α-玉米醇溶蛋白不能形成PB。然而，当α-玉米醇溶蛋白和γ-玉米醇溶蛋白共表达时，α-玉米醇溶蛋白的稳定性提高并且两种蛋白共定位在ER-衍生的蛋白体中(Coleman et al.，1996 Plant Cell 8：2335-2345)。在用富含蛋氨酸的10kDaδ-玉米醇溶蛋白转化的转基因大豆中也描述了新PB的形成(Bagga et al.，2000 PlantSci.150：21-28)。
重组贮藏蛋白也在诸如非洲爪蟾卵母细胞和酵母的非植物宿主系统的PB样细胞器中装配。Rosenberg等人，1993 Plant Physiol 102：61-69中报道了小麦γ-麦醇溶蛋白在酵母中的表达。该基因被正确表达且蛋白在ER-衍生的PB中积蓄。在非洲爪蟾卵母细胞中，Torrent等人，1994Planta 192：512-518证明当编码γ-玉米醇溶蛋白的转录本被显微注射进卵母细胞中时，该蛋白也在PB样细胞器中积蓄。Hurkman等人，1981J.Cell Biol.87：292-299使用α-玉米醇溶蛋白以及Altschuler等人，1993Plant Cell 5：443-450使用γ-麦醇溶蛋白在非洲爪蟾卵母细胞中得到了类似的结果。
生物技术(遗传工程)领域的一项基本成就是遗传地操作生物以生产用于治疗、营养或工业用途的蛋白质的能力。提供用于从细菌、酵母、作物植物和哺乳动物细胞培养的发酵培养液中生产和回收重组蛋白的方法。已经描述了在宿主细胞中表达蛋白的不同方法。
这些方法的基本目标是：蛋白表达水平、蛋白稳定性和蛋白回收(Menkhaus et al.，2004 Biotechnol.Prog.20：1001-1014；Evangelista etal.，1998 Biotechnol.Prog.14：607-614)。
可以解决蛋白回收问题的一种策略是分泌。然而，分泌有时涉及较差的表达水平和产物的不稳定。另一策略是在细胞中最有益的位置积蓄重组蛋白。通过工程化四肽(HDEL/KDEL)的C-末端延伸将重组蛋白导向ER使得这一策略被广泛使用(Conrad and Fiedler，1998 PlantMol.Biol.38：101-109)。
含有植物贮藏蛋白或与异源蛋白融合的贮藏蛋白结构域的融合蛋白是将重组蛋白导向ER的另一方法(WO 2004003207)。一个有趣的融合策略是产生与油质蛋白融合的重组蛋白，油质蛋白是植物油体的组成型蛋白。油体的特定特征有益于使用二相系统容易地回收蛋白(vanRooijen and Moloney，1995Bio/Technology13：72-77)。
在植物细胞中已经成功地表达了异源蛋白(综述在Horn et al.，2004 Plant CellRep.22：711-720；Twyman et al.，2003，Trends inBiotechnology 21：570-578；Ma et al.，1995，Science 268：716-719；Richteret al.，2000Nat.Biotechnol.18：1167-1171)，并且在某些情况中，重组蛋白的表达被导向ER-衍生的PB或PSV(PSV)。Yang等人，2003 Planta216：597-603使用麦谷蛋白和球蛋白贮藏蛋白的种子特异性启动子在大米种子中表达了人溶菌酶。免疫细胞化学结果表明该重组蛋白位于ER-PB中并且与内源大米球蛋白和麦谷蛋白一起积蓄。已经使用大米的麦谷蛋白启动子进行了在转基因烟草植株中表达人巨细胞病毒的糖蛋白B。Tackaberry et al.，1999 Vaccine 17：3020-3029。最近，Arcalis etal.，2004 Plant Physiology 136：1-10在大米种子中表达具有C-末端延伸(KDEL)的人血清白蛋白(HSA)。重组HAS与内源大米贮藏蛋白一起积蓄在PSV中。
使用植物作为生物工厂的一个障碍是需要关于下游处理的更多研究。由于植物系统的复杂性，从植物纯化蛋白是艰难的任务。提取物的植物固体较大、密实并且相对较高(9-20％重量比)(参见综述Menkhaus et al.，2004 Biotechnol.Prog.20：1001-1014)。目前，重组蛋白纯化技术包括提取物的澄清、使用溶剂处理以除去脂质和色素以及通过若干离子交换和凝胶过滤层析柱进行蛋白质或肽的纯化。现有的实验方案依赖于对每一植物-宿主系统和重组蛋白使用特定的溶剂或水溶液。本领域需要从转化宿主中回收重组蛋白的有效和通用的方法。在必须分离在植物宿主中产生的重组蛋白的情况下，此需要是特别相关的。宿主和蛋白的多样性以及它们之间不同的物理化学特性需要浓缩和回收重组产物的有效方法。下文公开的发明提供使从诸如真菌等非高等植物生物和哺乳动物细胞中回收重组表达的蛋白变得容易并且提高所述回收的一种方法。
发明的简要描述
本发明提供用于从转化宿主中回收重组蛋白的有效和通用的操作和方法。本文提出的解决方案基于以下发现：通过基于密度的技术、特别是通过密度垫层或密度梯度离心技术从其它宿主细胞细胞器蛋白中有效分离重组蛋白体样组装体(RPBLA)，并能够达到意想不到的良好收率。
更具体地，本发明涉及用于纯化在宿主细胞中作为RPBLA表达的重组融合蛋白的方法。根据涉及的方法，提供以RPBLA表达融合蛋白的转化宿主细胞的水性匀浆。这些RPBLA具有预定密度，所述密度可以在不同的融合蛋白中不同，但对于欲分离的特定融合蛋白来说是已知的。RPBLA的预定密度通常大于匀浆中基本上所有内源宿主细胞蛋白的密度，并且通常为约1.1g/ml至约1.35g/ml。形成匀浆的不同密度的区域以提供含有浓度相对提高的RPBLA的区域和含有浓度相对匮乏的RPBLA的区域。从RPBLA浓度相对提高的区域中分离RPBLA匮乏的区域，由此纯化所述融合蛋白。然后可以收集RPBLA浓度相对提高的区域，或者使用一种或多种试剂处理该区域，或者在分离RPBLA或其中的融合蛋白之前先使该区域经历一个或多个操作。
在优选实践中，融合蛋白含有两个连接在一起的多肽序列，其中一个序列是蛋白体诱导序列(PBIS)的序列，而另一个是目的产物的序列，所述产物例如药物分子、酶等等。优选的蛋白体诱导序列是谷醇溶蛋白化合物的那些序列，所述谷醇溶蛋白化合物例如γ-玉米醇溶蛋白、α-玉米醇溶蛋白或大米谷醇溶蛋白。
此处的宿主细胞是真核细胞，例如高等植物、真菌和酵母的细胞、诸如哺乳动物细胞的动物细胞以及藻类细胞。那些细胞可以是新鲜的，例如从新鲜生物质直接得到的，或者可以是干燥的，例如从干燥生物质得到的；应当理解生物质指从活生物体或细胞得到的物质，例如培养基或活生物体，例如植物叶子。
附图的简要说明
在构成本公开内容一部分的附图中：
图1是在烟草植株的瞬时转化(农杆菌渗入)和稳定转化中使用的双元载体的示意图，在该图的上部显示。在该图的中部显示在酵母转化中使用的两个载体。在下部显示在哺乳动物细胞培养物的瞬时转染中使用的载体。RX3，27kDγ-玉米醇溶蛋白的N-末端结构域；22aZ，22kD的α-玉米醇溶蛋白；22aZt，22kDα-玉米醇溶蛋白的N-末端结构域；rP13，13kD谷醇溶蛋白；以及CS，切割位点。
图2有四个部分：图2A-2D。图2A显示RX3-T20和RX3-EGF融合蛋白在转基因烟草植株的叶子中积蓄。从野生型(wt)和转基因烟草植株的叶子中提取可溶蛋白(泳道2和泳道4)，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分析，并且转移到硝化纤维素膜上，然后使用γ-玉米醇溶蛋白抗血清进行免疫印迹分析。分子量在左侧标明。箭头指示RX3衍生融合的单体(M)和二聚体(D)。
图2B显示密度梯度部分中的RX3-T20和RX3-EGF融合蛋白的免疫印迹分析。转化烟草的湿(新鲜)叶子的澄清匀浆被上样到分级蔗糖梯度上(42％-49％-56％-65％w/w)。通过使用γ-玉米醇溶蛋白抗体的免疫印迹来分析积蓄在匀浆、上清液、界面和沉淀部分的RX3-EGF和RX3-T20融合蛋白。每条泳道对应等体积的所有部分。H，匀浆；S，上清液；F42，42-49％w/w界面；F49，49-56％w/w界面；F56，56-65％％w/w界面；F65，65％蔗糖之下的沉淀。分子量在左侧标明。箭头指示RX3衍生融合的单体(M)和二聚体(D)。
图2C显示密度梯度部分中的RX3-EGF融合蛋白的SDS-PAGE和银染分析，该RX3-EGF融合蛋白由p19RX3EGF在转化烟草的叶子中表达。烟草湿(新鲜)叶子在缓冲液PBP中的澄清匀浆被上样到分级蔗糖梯度上(42％-49％-56％-65％w/w)。通过15％的SDS-PAGE且用银染显色来分析积蓄在匀浆、上清液、界面和沉淀部分的RX3-EGF融合蛋白。每条泳道对应等体积的所有部分。箭头指示RX3-EGF蛋白。H，匀浆；S，上清液；F42，42-49％w/w界面；F49，49-56％w/w界面；F56，56-65％％w/w界面；F65，65％蔗糖之下的沉淀。分子量在左侧标明。
图2D显示积蓄在湿和干的烟草叶子中的RX3-T20和RX3-EGF的SDS-PAGE和免疫印迹结果。将烟草叶子在37℃下干燥1周并且在干燥容器中储存5个月。从等量的湿的(W)和干的(D)转化烟草叶子中提取可溶蛋白，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶和使用γ-玉米醇溶蛋白抗血清的免疫印迹来分析(泳道1和泳道2)。通过将干燥叶子的匀浆在蔗糖梯度(20％-30％-42％-56％w/w)中分级来分析RX3-EGF和RX3-T20在干燥样品的密实结构中的积蓄。通过使用γ-玉米醇溶蛋白抗体的免疫印迹来分析积蓄在上清液、界面和沉淀部分的RX3-EGF和RX3-T20融合蛋白。加入等量的每一部分。S，上清液；F20，20-30％w/w蔗糖界面；F30，30-42％w/w蔗糖界面；F42，42-56％w/w蔗糖界面；F56，56％蔗糖之下的沉淀。
图3有两部分，图3A和3B。图3A显示RX3-EGF和RX3-T20在农杆菌渗入的烟草小植株中的积蓄。通过SDS-PAGE和使用γ-玉米醇溶蛋白抗血清的免疫印迹来分析总可溶蛋白。Wt＝野生型对照烟草小植株；分子量在左侧标明。箭头指示RX3衍生融合的单体(M)、二聚体(D)和三聚体(T)。
图3B显示农杆菌渗入的烟草小植株的亚细胞部分。澄清的小植株匀浆被上样到分级蔗糖梯度上(20％-30％-42％-56％w/w)。通过使用γ-玉米醇溶蛋白抗体的免疫印迹来分析RX3-T20和RX3-hGH融合蛋白在上清液、界面和沉淀部分的积蓄。向每条泳道中加入等量的每一部分。S，上清液；F20，20-30％w/w蔗糖界面；F30，30-42％w/w蔗糖界面；F42，42-56％w/w蔗糖界面；F56，56％蔗糖之下的沉淀。分子量在左侧标明。箭头指示RX3衍生融合的单体(M)和二聚体(D)。
图4有三部分，图4A、4B和4C。图4A显示通过蔗糖垫层离心之后RX3-T20和RX3-EGF蛋白的浓度。将转基因烟草叶子的澄清匀浆上样到蔗糖垫层上(42％w/w)。离心后，通过使用γ-玉米醇溶蛋白抗体的免疫印迹来分析RX3-EGF和RX3-T20融合蛋白在上清液和沉淀中的积蓄。每条泳道对应等量的部分。H，匀浆；S，上清液；P，沉淀垫层。分子量在左侧标明。箭头指示RX3衍生融合的单体(M)和二聚体(D)。
图4B显示通过蔗糖垫层离心之后RX3-EGF蛋白的纯化。将转基因烟草叶子的澄清匀浆上样到蔗糖垫层上(42％w/w)。离心后，通过15％的SDS-PAGE和银染来分析匀浆、上清液和沉淀部分的蛋白模式。每条泳道对应等量的部分。箭头指示RX3-EGF的单体(M)和二聚体(D)。H，匀浆；S，上清液；P，沉淀垫层。分子量在左侧标明。
图4C显示低速离心(LSC)后RX3-EGF蛋白的浓度和纯化。将表达RX3-EGF的烟草叶子的澄清匀浆在1000x g离心10分钟，并且通过凝胶电泳和使用γ-玉米醇溶蛋白抗体的免疫印迹来分析沉淀(P1，泳道2)和上清液(S，泳道1)。用缓冲的、含有5％TritonX-100的培养基洗涤低速离心(LSC)沉淀P1，并且在第二次离心后，通过15％的SDS-PAGE和银染来分析等量的LSC P1沉淀(泳道7)、洗涤后的上清液(W，泳道8)和最终沉淀P2(泳道9)。这些样品与来自沉淀P1(泳道3)的相等样品(泳道3-5)进行比较，沉淀P1是在一次蔗糖垫层离心后获得的且经过了与LSC沉淀相同的洗涤过程。箭头指示RX3-EGF的单体(M)和二聚体(D)。
图5有两部分：图5A和5B。图5A显示积蓄在转染哺乳动物细胞中的RX3-Ct、RX3-EGF和RX3-hGH重组融合蛋白的亚细胞分布。将转染细胞匀浆上样到分级蔗糖梯度上(20％-30％-42％-56％w/w)。通过使用γ-玉米醇溶蛋白抗体的免疫印迹来分析离心后RX3-Ct、RX3-EGF和RX3-hGH融合蛋白在上清液、界面和沉淀部分的积蓄。经质粒pECFP-N1(Clontech)转染的、表达ECGP的细胞被用作对照并且使用抗GFP抗血清来免疫检测ECGP，ECGP是GFP的青色荧光变体。H，匀浆；S，上清液；F20，20-30％w/w蔗糖界面；F30，30-42％w/w蔗糖界面；F42，42-56％w/w蔗糖界面；F56，56％蔗糖之下的沉淀。
图5B显示低速离心后由CHO表达的RX3-EGF蛋白浓度。将表达RX3-EGF的CHO细胞匀浆在2500xg离心10分钟，并且通过凝胶电泳和使用γ-玉米醇溶蛋白抗体的免疫印迹来分析沉淀(P，泳道2)和上清液(S，泳道1)。分子量在左侧标明。
图6显示积蓄在转化酵母细胞中的RX3-EGF和RX3-hGH重组融合蛋白的亚细胞分布。将来自转化酵母的溶胞球浆体上样到分级蔗糖梯度上(20％-30％-42％-56％w/w)。离心后，通过使用γ-玉米醇溶蛋白抗体的免疫印迹来分析RX3-EGF和RX3-hGH融合蛋白在上清液、界面和沉淀部分的积蓄。H，溶胞球浆体匀浆；S，上清液；F20，20-30％w/w蔗糖界面；F30，30-42％w/w蔗糖界面；F42，42-56％w/w蔗糖界面；F56，56％蔗糖之下的沉淀。分子量在左侧标明。
图7A显示积蓄在农杆菌渗入的烟草小植株中的重组融合蛋白的亚细胞分布。将澄清的小植株匀浆上样到分级蔗糖梯度上(20％-30％-42％-56％w/w)。通过使用抗降钙素、抗EGF和抗hGH抗体的免疫印迹来分析rP13-Ct、rP13-EGF和rP13-hGH融合蛋白在上清液、界面和沉淀梯度部分的积蓄。使用两个版本的α-玉米醇溶蛋白基因进行等效研究。降钙素(Ct)和EGF与α-玉米醇溶蛋白(22aZt)的N-末端结构域融合，并且hGH与完整α-玉米醇溶蛋白基因(22aZ)融合。向每条泳道中上样等量的每一部分。S，上清液；F20，20-30％w/w蔗糖界面；F30，30-42％w/w蔗糖界面；F42，42-56％w/w蔗糖界面；F56，56％蔗糖之下的沉淀。
图7B显示使用来自转基因烟草株的澄清的叶匀浆上样到分级蔗糖梯度(10％-42％-56％-62％w/w)上的结果。使用抗EGF抗体的免疫印迹显示等量的rP13-EGF和22aZt-EGF在每一部分中的分布。S，上清液；F10，10-42％w/w蔗糖界面；F42，42-56％w/w蔗糖界面；F56，56-62％w/w蔗糖界面；F62，62％蔗糖之下的沉淀。
图8显示从RPBLA中回收RX3-T20和RX3-EGF融合蛋白。在还原剂的存在下重新悬浮从密度垫层或分级梯度得到的RPBLA部分。通过使用γ-玉米醇溶蛋白抗血清的免疫印迹来分析可溶(S)和不可溶(P)蛋白。分子量在左侧标明。箭头指示RX-3衍生融合单体(M)、双体(D)和三体(T)。
本发明具有若干长处和优点。
一项长处是本发明的使用使得能够根据表达产物与其余可溶细胞物质在密度上的不同相对简单和快速地纯化被表达的蛋白，。
因此，本发明的优点是其提供从宿主生物体和细胞培养物中除去内源化合物(或非重组产物)的方法。
本发明的另一长处是其提供从新鲜或干燥的生物质(宿主生物体)中纯化重组肽或蛋白的可靠和可重复的方法。
优选实施方案的详细描述
本发明总体涉及从转化生物体或细胞培养物中分离和纯化目的重组蛋白和肽的下游过程。更特别地，本发明涉及用于纯化在宿主细胞中表达并作为重组蛋白体样组装体(RPBLA)积蓄的重组融合蛋白的方法。RPBLA是由在细胞内形成高密度堆积的贮藏蛋白结构域诱导的重组蛋白体样组装体。这些密实堆积可以在胞浆、细胞器的内网系统、线粒体、质体中积蓄或者可以被分泌。根据涉及的方法，提供以RPBLA表达的融合蛋白的转化宿主细胞的水性匀浆。优选使用澄清匀浆。形成匀浆的不同密度的区域以提供含有浓度相对提高的RPBLA的区域和含有浓度相对匮乏的RPBLA的区域。从RPBLA浓度相对提高的区域中分离RPBLA匮乏的区域，由此纯化所述融合蛋白。然后可以收集RPBLA浓度相对提高的区域，或者使用一种或多种试剂处理该区域，或者在分离RPBLA或其中的融合蛋白之前先使该区域经历一个或多个操作。
在优选实践中，融合蛋白含有两个连接在一起的多肽序列，其中一个序列是蛋白体诱导序列(PBIS)的序列，而另一个是目的多肽产物的序列，所述多肽产物例如药物分子、酶等等。优选的PBIS是谷醇溶蛋白化合物的那些序列，所述谷醇溶蛋白化合物例如γ-玉米醇溶蛋白、α-玉米醇溶蛋白或大米谷醇溶蛋白。
本方法一方面包括提供宿主生物体或细胞培养物的水性匀浆或其它适当的提取物(本文中总称为匀浆)，所述宿主生物体或细胞表达且以重组蛋白体样组装体(RPBLA)积蓄期望的融合蛋白。通常在使用前预先澄清(澄清)匀浆以例如通过过滤除去细胞碎片。将含有含有融合蛋白的蛋白体样结构(RPBLA)、脂质、可溶蛋白、细胞器、糖类、色素和类碱的匀浆直接上样到分级密度梯度上，并且所述匀浆根据其成分的密度被分开，例如通过离心。离心期间形成匀浆的不同密度的区域，以提供含有浓度相对提高的RPBLA的区域和含有浓度相对匮乏的RPBLA的区域。可以在特定密度界面处收集含有期望融合蛋白的RPBLA。此方法使得能够以超过约80％的纯度回收超过约90％的表达的重组融合蛋白。
本发明的另一方面涉及了从优选澄清的匀浆中通过一级密度垫层分离RPBLA的方法。这时，将优选澄清的匀浆上样到特定的密度垫层上使得内源污染化合物通不过密度垫层且被离心分离，使得密实RPBLA通过垫层且能够被收集。形成匀浆的前述的不同密度区，以提供含有浓度相对提高的RPBLA的区域(垫层之下的区域)和含有浓度相对匮乏的RPBLA的区域(垫层之上的区域)。因此，重组蛋白体样组装体的密度高于所述垫层的密度。
在另一实施方案中，在没有蔗糖或其它加入的提供密度的溶质存在下直接离心分离优选澄清的匀浆。并且，所述离心能够形成匀浆的不同密度的区域，以提供含有浓度相对提高的RPBLA的区域(沉淀)和含有浓度相对匮乏的RPBLA的区域(上清液)。此后RPBLA能够被分离，以提供RPBLA的纯化并且由此提供纯化蛋白。
本发明提供回收在RPBLA中表达的重组肽或蛋白的方法，RPBLA为在转化宿主细胞中形成的细胞器。此处的宿主细胞是真核细胞，例如高等植物的细胞、酵母和真菌、诸如培养的哺乳动物细胞等动物细胞、来自转基因动物的细胞、动物卵细胞等等以及藻类细胞。这些细胞可以是新鲜的，例如从培养基或诸如植物叶子或动物等活生物体直接得到的，或者可以是干燥的。
重组蛋白体样组装体具有预定的密度，该密度在不同的融合蛋白中可能不同，但是对于将要分离的特定融合蛋白是已知的。该RPBLA的预定密度通常大于匀浆中存在的基本上所有内源宿主细胞蛋白的密度，并且通常为约1.1g/ml至约1.35g/ml。新RPBLA的高密度是由于重组融合蛋白通常具有组装为多体和积蓄的能力。
在真核细胞中表达涉及的RPBLA，并且该RPBLA如上所述地通常被它们的密度所表征。当在高等植物细胞和动物细胞中表达时，RPBLA的形状通常为球状，直径约为1微米(μ)并且有包围的膜。
融合蛋白根据它们的密度被分开，所述密度趋向于大于转染细胞中存在的任何其它蛋白的密度。通常通过使用离心机来进行根据密度的该分离，因为其在全世界的生化实验室中普遍存在。示例性的可商购离心机是Beckman Coulter AvantiTM型号J-25，此后在本文中用于单一垫层离心和直接离心。Beckman Coulter OptimaTM型号XL-100K超离心机(转子SW41Ti)被用于梯度研究。经常在加入的提供差异密度溶质的存在下进行离心，所述溶质例如诸如氯化铯的盐或诸如蔗糖的糖。混合匀浆和提供差异密度的溶质以形成匀浆-溶质混合物。
在一特定实施方案中，重组融合蛋白包含结合到感兴趣的(目的)产物(例如肽或蛋白)的肽连接的蛋白体诱导序列(PBIS)，或者所述重组融合蛋白优选由上述蛋白体诱导序列组成。PBIS是介导蛋白进入和/或在RPBLA中积蓄的蛋白或氨基酸序列。说明性地，PBIS的非限制性例子包括贮藏蛋白或修饰的贮藏蛋白，例如谷醇溶蛋白或修饰的谷醇溶蛋白或谷醇溶蛋白结构域。Shewry et al.，2002J.Exp.Bot.53(570)：947-958综述了谷醇溶蛋白。
γ-玉米醇溶蛋白是玉米贮藏蛋白，下文显示了其DNA和氨基酸残基序列，其为四种玉米谷醇溶蛋白之一且占玉米胚乳中总蛋白的10-15％。如同其它谷类谷醇溶蛋白，α-玉米醇溶蛋白和β-玉米醇溶蛋白是在位于粗糙ER的细胞质侧的膜结合多核糖体中生物合成的，在内腔中组装且然后被隔离到ER衍生的PB中(Herman et al.，1999 PlantCell 11：601-613；Ludevid et al.，1984 Plant Mol.Biol.3：277-234；Torrentet al.，1986 Plant Mol.Biol.7：93-403)。
γ-玉米醇溶蛋白由四个特征结构域组成i)具有19个氨基酸的肽信号，ii)含有8个6肽单元PPPVHL(SEQ ID NO：1)的重复结构域(53aa)，iii)ProX结构域，其中脯氨酸残基与其它氨基酸交替(29aa)，以及iv)疏水的富含半胱氨酸的C-末端结构域(111aa)。
γ-玉米醇溶蛋白在ER-衍生的蛋白体(PB)在中组装的能力不限于种子。实际上，当γ-玉米醇溶蛋白基因在转基因拟南芥植株中组成型表达时，该贮藏蛋白积蓄在叶肉细胞的ER-衍生重组PB中(Geli et al.，1994 Plant Cell 6：1911-1922)。通过寻找负责γ-玉米醇溶蛋白向ER-衍生PB中沉积的信号(谷醇溶蛋白没有KDEL信号)，已经证明了包含串连重复结构域的富含脯氨酸的N-末端结构域对于ER保留是必需的，并且C-末端结构域涉及PB形成。然而，这些结构域促进PB组装的机理依然未知。既然只有在种子中蛋白体的称谓才是合适的，那么在其它植物器官和非高等植物中产生的类似结构通常被称为重组蛋白体样组装体(RPBLA)。
下表显示了示例性的其它有用的谷醇溶蛋白型序列以及它们的GenBank号。
 
蛋白名称 GenBank ID
α-玉米醇溶蛋白(22kD) M86591
白蛋白(32kD) X70153
β-玉米醇溶蛋白(14kD) M13507
 
γ-玉米醇溶蛋白(27kD) X53514
γ-玉米醇溶蛋白(50kD) AF371263
δ-玉米醇溶蛋白(18kD) AF371265
δ-玉米醇溶蛋白(10kD) U25674
7S球蛋白或豌豆球蛋白型 NM113163
11S球蛋白或豆球蛋白型 DQ256294
谷醇溶蛋白13kD AB016504
谷醇溶蛋白16kD AY427574
谷醇溶蛋白10kD AF294580
其它有用的序列是通过如Altschul et al.，1997 Nucleic Acids Res.25：3389-3402所述对所有无重复GenBank CDS翻译+PDB+SwissProt+PIR+PRF(不包括环境样品)数据库进行BLAST检索得到的，所述检索使用的查询例如SEQ ID NO：2(RX3蛋白序列)、SEQ ID NO：3(α-玉米醇溶蛋白蛋白序列)、SEQ ID NO：4(大米谷醇溶蛋白蛋白序列)。
示例性的修饰的谷醇溶蛋白包括(a)信号肽序列，(b)蛋白γ-玉米醇溶蛋白的重复结构域6肽PPPVHL(SEQ ID NO：1)的一个或多个拷贝的序列，以及(c)γ-玉米醇溶蛋白的全部或部分ProX结构域的序列。示例性的修饰谷醇溶蛋白包括下文称为R3、RX3和P4的多肽，其DNA和氨基酸残基序列也在下文显示。
特别优选的谷醇溶蛋白包括公开的申请WO2004003207中描述的γ-玉米醇溶蛋白及其组成部分，大米rP13蛋白和玉米α-玉米醇溶蛋白的22kDa的N-末端片段。γ-玉米醇溶蛋白(27kD)、大米和α-玉米醇溶蛋白的DNA和氨基酸残基序列在以下显示：SEQ ID NO：5(DNA序列)和SEQ ID NO：6(蛋白序列)；SEQ ID NO：7(RX3DNA序列)和SEQID NO：8(蛋白序列)；SEQ ID NO：9(R3DNA序列)和SEQ ID NO：10(蛋白序列)；SEQ ID NO：11(P4DNA序列)和SEQ ID NO 12(蛋白序列)；SEQ ID NO：13(X10DNA序列)和SEQ ID NO：14(蛋白序列)。
rP13-(蛋白序列SEQ ID NO：15和DNA序列SEQ ID NO：16)，与克隆-(GenBank AB016504)同源的13kD的大米谷醇溶蛋白，Sha et al.，1996 Biosci.Biotechnol.Biochem.60(2)：335-337；Wen et al.，1993 PlantPhysiol.101(3)：1115-1116；Kawagoe et al.，2005 Plant Cell17(4)p：1141-1153；Mullins et al.，2004 J.Agric.Food Chem.52(8)p：2242-2246；Mitsukawa et al.，1999 Biosci.Biotechnol.Biochem.63(11)：1851-1858。
22aZt(蛋白序列SEQ ID NO：17和DNA序列SEQ ID NO：18)，22kD的玉米α-玉米醇溶蛋白的N-末端片段-(GenBank V01475)，Kim etal.，2002 Plant Cell 14(3)：655-672；Woo et al.，2001 Plant Cell13(10)：2297-2317；Matsushima et al.，1997 Biochim.Biophys.Acta1339(1)：14-22；Thompson et al.，1992 Plant Mol.Biol.18(4)：827-833。
目的蛋白的例子包括具有治疗、营养或工业用途的任何蛋白，例如单克隆抗体(如IgG、IgM、IgA等的mAbs)及其片段、用于疫苗的抗原(人免疫缺陷病毒，HIV；乙型肝炎前表面抗原、表面抗原和核心抗原、胃肠炎冠状病毒等等)、激素(降钙素、生长激素等)、蛋白酶抑制剂、抗生素、胶原、人乳铁蛋白、细胞因子、工业酶(水解酶、糖苷酶、氧化-还原酶等等)。提供了示例性目的蛋白的示例性DNA和氨基酸残基序列(蛋白序列SEQ ID NO：19和DNA序列SEQ ID NO：20)鲑鱼降钙素Genbank BAC57417
hEGF-(蛋白序列SEQ ID NO：21和DNA序列SEQ ID NO：22)基于GenBank AAF85790构建，无信号肽
hGH-基于P01241构建，无信号肽(蛋白序列SEQ ID NO：23和DNA序列，使用植物偏爱密码子SEQ ID NO：24和使用天然密码子SEQ ID NO：25)。
在另一实施方案中，除PBIS和目的产物的序列之外，重组任何蛋白还包含间隔氨基酸序列。该间隔氨基酸序列可以是能够被酶或化学方法切割的氨基酸序列，或是不可切割的氨基酸序列。在特定实施方案中，间隔氨基酸序列被置于所述PBIS和目的产物之间。示例性氨基酸序列可以被蛋白酶切割，所述蛋白酶例如肠激酶、Arg-C内切蛋白酶、Glu-C内切蛋白酶、Lys-C内切蛋白酶、Xa因子等等。或者，编码氨基酸序列可以被化学试剂特异切割，例如，在蛋氨酸残基处切割的溴化氰。
在其它实施方案中，用于转化目的的核酸序列如同在共同转让的专利申请WO2004003207所公开的，包括位于PBIS和目的多肽之间的可切割氨基酸残基序列。此外，在另一实施方案中，所述核酸序列如同专利申请WO2004003207所公开的，但是缺失编码可切割氨基酸序列的核酸序列。
在优选实施方案中，依照包含用核酸转化宿主细胞系统的方法来制备融合蛋白，所述宿主细胞系统例如动物、动物细胞培养物、植物、植物细胞培养物、真菌或藻类，所述核酸包含(i)同框中可操作地连接的编码PBIS的第一核酸，(ii)包含编码目的产物的核苷酸序列的第二核酸序列；也就是，编码PBIS的核酸序列与编码目的多肽的序列化学结合，使得两个多肽均按其正确的阅读框表达。经过表达，得到的融合蛋白以高密度重组蛋白体样组装体在转化宿主系统中积蓄。在一实施方案中，第一核酸序列(i)的3’末端与第二核酸序列(ii)的5’末端连接(结合)。在另一实施方案中，第一核酸序列(i)的5’末端与第二核酸序列(ii)的3’末端连接(结合)。在另一实施方案中，PBIS包含贮藏蛋白或修饰的贮藏蛋白，其片段或修饰的片段。
在另一特定实施方案中，依照包含用核酸转化宿主细胞系统的方法来制备融合蛋白，所述宿主细胞系统例如动物、动物细胞培养物、植物、植物细胞培养物、真菌或藻类，所述核酸除前述的核酸序列(i)和(ii)之外还包含同框编码间隔氨基酸序列的核酸序列(iii)。如前所述，该间隔氨基酸序列可以是被酶或化学方法切割的或不能切割的氨基酸序列。在一特定实施方案中，核酸序列(iii)被置于所述核酸序列(i)和(ii)之间，例如，第三核酸序列(iii)的3’末端与第二核酸序列(ii)的5’末端连接。另一实施方案中，第三核酸序列(iii)的5’末端与第二核酸序列(ii)的3’末端连接。
如本文中所用，术语植物宿主细胞包括植物，包括单子叶植物和双子叶植物，并且，具体地，谷物(例如，玉米、大米、燕麦等等)、豆类(例如大豆等等)、十字花科植物(例如，拟南芥、油菜等等)和茄科植物(例如，马铃薯、番茄、烟草等等)。
植物宿主系统还包括植物细胞。植物细胞包括悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉、种子和小孢子。植物宿主细胞可以处于不同的成熟阶段且能够在液体或固体培养基中、或者在花盆中的土壤或适合培养基中、在温室中或田间生长。植物宿主细胞系统中的表达可以是瞬时的或永久的。植物宿主细胞系统还指这些植物的任何克隆、种子、自交或杂交后代、有性或无性地产生的繁殖体，以及这些中任何一个的后代，例如插条或种子。
使用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化植物细胞通常最好在双子叶植物中进行。单子叶植物通常最容易被称为原生质体的直接基因传递所转化。直接基因传递通常通过电穿孔法、聚乙二醇介导的传递或通过用携带有所需DNA的微粒轰击细胞来进行。这些转染方法为本领域公知且无需在此进一步讨论。还应当注意到至少大米和玉米可以被农杆菌(Agrobacterium)转化。从转染细胞和原生质体再生完整植物的方法以及从植物组织中获得希望蛋白的技术也为本领域公知。还参见，美国专利第5,618,988号和第5,679,880号及其中的引用文献。
涉及的方法还包括重组融合蛋白的回收和稳定化。因此，例如，从分级密度梯度或一级密度垫层收集的RPBLA被悬浮在含有还原剂的缓冲溶液中并离心。弃去沉淀并且根据需要进一步纯化从上清液回收的重组蛋白，所述纯化例如通过标准层析方法。
无需更多的细节，相信本领域技术人员能够通过使用上文的描述和下文的实施例来实践本发明的全部内容。因此，下文的优选特定实施例应被理解为仅仅是示例说明性的，并且不以任何方式限制其它的公开内容。
实验操作
实施例1：构建用于植物转化的质粒
合成地获得T20和人表皮生长因子(hEGF)的编码序列并修饰以最优化其密码子使用以在植物中表达。
通过化学寡核苷酸合成得到编码T20的36个氨基酸的cDNA序列的第一条链，并且向该序列的5’末端加入对应Xa因子特异切割位点和酶限制位点的序列。通过聚丙烯酰胺变性凝胶来纯化此合成的构建体(SEQ ID NO：26)。
通过使用特异T20引物的PCR得到双链cDNA，该引物含有用于进一步克隆的限制位点。
引物：
V20正向(SEQ ID NO：27)
V20反向(SEQ ID NO：28)
通过引物重叠延伸PCR方法得到编码活性hEGF的53个氨基酸的合成基因，该方法使用4个约60个碱基的寡核苷酸，有20个碱基的重叠。合成的hEGF cDNA包括对应Xa因子特异切割位点的5’接头序列。通过聚丙烯酰胺变性凝胶纯化所述寡核苷酸。
EGF1(SEQ ID NO：29)
EGF2(SEQ ID NO：30)
EGF3(SEQ ID NO：31)
EGF4(SEQ ID NO：32)
通过引物重叠延伸PCR方法得到编码活性hGH的191个氨基酸的合成基因，该方法使用15个约60个碱基的寡核苷酸，有20个碱基的重叠。合成的hGH cDNA包括对应肠激酶特异切割位点的5’接头序列。通过聚丙烯酰胺变性凝胶纯化所述寡核苷酸。
hGH1(SEQ ID NO：33)
hGH2(SEQ ID NO：34)
hGH3(SEQ ID NO：35)
hGH4(SEQ ID NO：36)
hGH5(SEQ ID NO：37)
hGH6(SEQ ID NO：38)
hGH7(SEQ ID NO：39)
hGH8(SEQ ID NO：40)
hGH9(SEQ ID NO：41)
hGH10(SEQ ID NO：42)
hGH11(SEQ ID NO：43)
hGH12(SEQ ID NO：44)
hGH13(SEQ ID NO：45)
hGH14(SEQ ID NO：46)
hGH15(SEQ ID NO：47)
从琼脂糖凝胶(Amersham)纯化合成的T20和hEGF cDNA并且克隆到pGEM载体中(Promega)。含有BspHI和NcoI的粘性末端的RX3cDNA片段(编码γ-玉米醇溶蛋白的N-末端结构域)被插入到事先用NcoI消化的载体pCKGFPS65C中(Reichel et al.，1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：5888-5893)(如专利申请WO2004003207中所述)。编码T20和EGF的序列被同框融合到RX3序列中。通过用GFP编码序列代替T20和EGF合成基因制备构建体RX3-T20和RX3-EGF。
被命名为pCRX3T20和pCRX3EGF的得到的构建体含有例如增强的35S启动子(SED ID NO：1)的指导蛋白转录的核酸序列，例如烟草蚀刻病毒(TEV)的翻译增强子，T20和EGF编码序列基因以及来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的3’聚腺苷酸化序列。通过将HindIII/HindIII表达盒插入到双元载体pBin19(Bevan，1984 Nucleic Acids Research12：8711-8721)中最终得到有效的植物转化载体p19RX3T20和p19RX3EGF。
编码hGH的cDNA被融合到RX3N-末端γ-玉米醇溶蛋白编码序列中(专利WO2004003207)并且插入到含有增强的CaMV 35S启动子和3’ocs终止子的pUC18衍生质粒中。来自pUC18衍生质粒的表达盒被命名为pUC18RX3hGH，其含有相应的RX3-hGH序列，将其引入到pBin19二元载体(Bevan，1984 Nucliec Acids Research 12：8711-8721)中。
分别从玉米W64A和Senia大米品种的cDNA文库通过RT-PCR扩增编码22kD的α-玉米醇溶蛋白(22aZ)和13kD的大米谷醇溶蛋白(rP13)的cDNA。PCR反应中使用的寡核苷酸是：
22aZ-5′(SEQ ID NO：48)
22aZ-3′(SEQ ID NO：49)
Rice13Prol-5′(SEQ ID NO：50)
Rice13Prol-3′(SEQ ID NO：51)
相应的PCR片段被克隆到pCRII载体(Invitrogen)中，测序并且克隆到含有增强的CaMV35S启动子，TEV序列和3’ocs终止子的pUC18载体中。用SalI和NcoI消化pCRII-rP13，并且克隆到用相同的酶消化的pUC18RX3Ct、pUC18RX3hGH和pUC18RX3EGF质粒中以分别得到：pUC18rP13Ct、pUC18rP13hGH和pUC18rP13EGF。用SalI/NcoI消化pCRII-22aZ并且克隆到用相同的酶消化的pUC18RX3Ct和pUC18RX3EGF质粒中以分别得到pUC1822aZtCt和pUC1822aZtEGF。还使用SalI/RcaI消化pCRII-22aZ并且克隆到用SalI/NcoI消化的pUC18RX3hGH质粒中以得到克隆pUC1822aZhGH。最后，通过HindIII/EcoRI将所有这些pUC18衍生载体克隆到pCambia5300中。
实施例2：构建用于动物和酵母细胞转化的质粒
动物细胞
对应成熟降钙素序列(Ct，WO2004003207)和EGF序列的合成基因以及编码hGH的cDNA被融合到RX3N-末端γ-玉米醇溶蛋白编码序列(专利WO2004003207)中，并被引入载体pUC18。将含有相应融合蛋白RX3-Ct、RX3-EGF和RX3-hGH序列、来自pUC18衍生质粒pUC18RX3Ct、pUC18RX3EGF和pUC18RX3hGH的SalI-BamHI限制酶切片段引入用Xho I-Bam HI限制酶切的载体pcDNA3.1-(Invitrogen)中。在得到的被命名为p3.1RX3CT、p3.1RX3EGF和p3.1RX3hGH的构建体中，融合蛋白序列处于CMV启动子和pA BGH终止子下。
酵母细胞
将含有相应融合蛋白RX3-EGF和RX3-hGH序列、来自上述pUC18衍生质粒的SalI(平末端化的)-BamHI限制酶切片段引入用EcoRI(平末端化的)-Bam HI限制酶切的载体pYX243(R&D Systems)中。在得到的被分别命名为c117和c118的构建体中，所述融合蛋白序列处于可诱导的GAL启动子下。
实施例3：宿主转化
酵母
通过LiAc方法(Ito et al.1983，J.Bacteriol.153：163-168)使用质粒构建体c117和c118转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)株leu2，并且在Leu-平板上挑选转化体。通过在含有半乳糖的培养基中培养转化体进行表达分析。
植物材料
烟草(Nicotiana tabacum var.Wisconsin)植株被种植在24-26℃的有16小时光周期的体外生长箱中。成体植株被种植在温室中，温度为18-28℃，湿度保持在55％至65％，平均光周期为16小时。
从种子种植用于农杆菌渗入(Vaquero et al.，1999 Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 96(20)：11128-11133；Kapila et al.，1997 Plant Sci.122：101-108)方法的小植株，在上述的体外条件下生长4-6周。
烟草稳定转化
双元载体被转入农杆菌(A.tumefaciens)株LBA4404中。如Draper和Hamil1988.In：Plant Genetic Transformation and Gene Expression.A Laboratory Manual(植物遗传转化和基因表达。实验手册)(Eds.Draper，J.，Scott，R.，Armitage，P.and Walden，R.)，Blackwell ScientificPublications所述转化烟草(Nicotiana tobaccum，W38)叶盘。在含有200mg/L卡那霉素的培养基中挑选再生的植株并转移到温室中。栽培具有最高转基因产物水平的转基因烟草植株以得到T1和T2代。
通过免疫印迹检测重组蛋白水平。通过Bradford测定定量从烟草叶提取的总蛋白，在15％SDS-PAGE上分离并且使用Mini Trans-BlotElectrophoretic Transfer Cell(Bio Rad)将其转移到硝化纤维素膜上。将膜与γ-玉米醇溶蛋白抗血清(1/7000稀释)(Ludevid et al.1985，PlantScience41：41-48)一起孵育，然后与结合有辣根过氧化物酶的抗体(1/10000稀释，Amersham Pharmacia)一起孵育。通过增强的化学发光(ECL Western印迹系统，Amersham Pharmacia)检测免疫反应性条带。烟草农杆菌渗入
在24-26℃的有16小时光周期的体外生长箱中从种子种植用于农杆菌渗入方法的小植株。
在补充有卡那霉素(50mg/l)和利福平(100mg/l)的LB培养基(胰胨10g/l、酵母提取物5g/l、NaCl10g/l)上、在28℃下利用振荡器(250rpm)培养含有希望构建体的农杆菌(A.tumefaciens)株LB4404过夜(约18小时)。然后将农杆菌接种到也补充有卡那霉素(50mg/l)和利福平(100mg/l)的30ml LB培养基中。在28℃下培养过夜(约18小时)后，在3000xg离心10分钟收集农杆菌细胞，并且重新悬浮在10ml液体MS培养基中，该MS培养基含有MES(Sigma Chemical)4.9g/l和蔗糖30g/l且pH5.8。将细菌培养物调整为终OD600为0.1用于农杆菌渗入。然后，向细胞培养物中补充终浓度为0.2mM的乙酰丁香酮并且在28℃下孵育90分钟。
关于农杆菌渗入，将所述小植株完全浸入悬浮物中并施加真空(100KPa)5-6秒。移除悬浮物并且在24-26℃、16小时光周期的生长箱中放置4天。回收小植株材料并且通过使用抗γ-玉米醇溶蛋白的抗体的免疫印迹分析总蛋白提取物。
动物细胞转化
通过基于lipofectamine(脂质转染胺试剂)的转染方法(Invitrogen)将构建体p3.1RX3.EGF和p3.1RX3.hGH引入293T、Cosl或CHO的培养哺乳动物细胞。将使用质粒pECFP-N1(Clontech)转染的细胞用作对照，该质粒含有增强蓝色荧光修饰GFP的基因序列。
实施例4：从烟草叶中提取蛋白质
新鲜植物材料
在液氮中研磨植物材料(湿或干的烟草叶或小植株)并且用提取缓冲液T匀浆，该提取缓冲液T含有Tris-HCl50mM pH8、200mM二硫苏糖醇(DTT)和蛋白酶抑制剂[10μM抑酶肽、1μM胃酶抑制剂、100μM亮抑蛋白酶肽、100μM苯甲基磺酰氟(PMSF)和100μM E64(Sigma Chemical)]。将匀浆在4℃下在10000xg离心30分钟以除去不溶物质。使用Bradford蛋白质测定(BioRad)定量总可溶蛋白(TSP)。
干烟草叶和蛋白质提取
将成体转基因烟草叶子和野生型烟草叶子在37℃房间中在滤纸上干燥2周。2周后，切割叶子并将其在室温下贮藏5个月。使用和新鲜材料一样的方法提取干燥材料的总可溶蛋白并且通过Western印迹分析。
实施例5：RPBLA制备
匀浆
在0℃下使用研钵和杵在PBP提取缓冲液中研磨新鲜和干燥的转基因烟草叶子以及农杆菌渗入的烟草小植株(瞬时转化)，该PBP提取缓冲液含有Tris 100 mM pH 8、KCl 50 mM、MgCl2 6mM、EDTA 10 mM并补充有10％的蔗糖和蛋白酶抑制剂(PMSF、亮抑蛋白酶肽、抑酶肽、E-64)。使用带有小转子(直径7.5mm)的polytron(IKA T25 Basic，24,000rpm)在冰上进一步研磨该匀浆，每次3-4秒，约10次。过滤通过4层Miracloth(22-24微米)(Calbiochem)除去固体物质以除去未破裂的组织和细胞。
实施例6：来自动物细胞的蛋白
通过刮取从培养板上回收转染的细胞，并且将它们悬浮在匀浆B介质中(10mM Tris-HCl pH 8.0、0.9％NaCl、5mM EDTA以及蛋白酶抑制剂)。将悬浮物吸入配有23号(gauge)针头的5ml注射器中并推出约30次。通过相差显微镜监测细胞破裂。如同在烟草叶子匀浆中所描述的，将匀浆上样到分级蔗糖梯度并离心。
通过Western印迹分析瞬时转染细胞中融合蛋白的积蓄，该Western印迹使用由γ-玉米醇溶蛋白产生的γ-玉米醇溶蛋白抗体。转染后48小时后，使用缓冲液A(100mM Tris-HCl pH8.0、150mMNaCl、5mM EDTA、0.5％SDS、0.5％Triton X-100、2％2-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂)提取总可溶细胞蛋白。沉淀等份的细胞孵育培养基并保存在-20℃。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离从等量的转染细胞和培养基中提取的蛋白质，并且转移到硝化纤维素片上用于免疫检测。
实施例7：通过不连续梯度的分离
将匀浆在4℃下在50xg离心5分钟以得到澄清提取物。关于不连续蔗糖梯度，将此澄清的匀浆(上清液)置于分级梯度上，该分级梯度由2.5ml的蔗糖PBP缓冲液溶液组成，其中蔗糖浓度为20％-30％-42％-56％(w/w)或42％-49％-56％-65％(w/w)，并且在4℃下、在吊桶式转子(SW41Ti)中、在80,000xg不间断离心120分钟(BeckmanCoulter OptimaTM XL-100K超离心机)。
收集上清液、界面和沉淀部分。用15％TCA沉淀等量的上清液、界面部分和沉淀并且通过SDS-PAGE和使用抗融合表达蛋白的特异抗体的免疫印迹进行分析。通过使用γ-玉米醇溶蛋白抗体的Western印迹检测蛋白RX3-EGF、RX3-T20、RX3-Ct和RX3-INF。使用根据Morrissey et al.，1981Anal.Biochem.117:307-310的银染分析电泳凝胶以评价PB中重组蛋白对污染蛋白的富集。
实施例8：通过一级垫层的分离
在4℃下，将如上所述制备的匀浆在8ml的42％(w/w)蔗糖垫层(1.18g/cm3)上在24,000g离心120分钟。回收上清液、界面和沉淀部分。RPBLA沉积在垫层的底部。关于蛋白质分析，在15％TCA中沉淀这些部分的等量样品并且在15％SDS-PAGE上分离样品并用银染分析。通过使用γ-玉米醇溶蛋白抗体的免疫印迹检测PB部分中存在的重组蛋白。
实施例9：从分离的RPBLA中回收重组蛋白
在PBP缓冲液中洗涤从分级蔗糖梯度的42％-56％(w/w)界面分离的RPBLA或通过蔗糖的42％(w/w)的密度垫层分离的RPBLA，并且通过在16000xg短暂离心5分钟来回收所述RPBLA。将积蓄在RPBLA中的重组蛋白溶于1体积的含有12.5mM硼酸钠pH8、0.1％SDS和2％2-巯基乙醇的SB缓冲液中。在37℃孵育该溶液过夜(约18小时)。在室温下将一份样品在16000xg离心10分钟，并且通过SDS-PAGE和Western印迹分析上清液和沉淀以评价完全蛋白溶解。
实施例10：来自转染酵母细胞的蛋白
沉淀表达重组融合蛋白的酿酒酵母(S.cerevisiae)。沉淀等份的相应孵育培养基且存放在-20℃以待分析。细胞沉淀物也被冷冻并且在解冻后，通过使用玻璃珠和培养基Y(50mM HCl-Tris pH8.0、150mMNaCl、5mM EDTA、200mM DTT和蛋白酶抑制剂)的标准方法破碎细胞。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析等量的细胞和培养基，所述免疫印迹使用抗重组表达蛋白的特异抗体。
用来从转化酵母细胞中分离细胞器的破裂方法基于Zinser et al.，1995Yeast，11：493-536中描述的球浆体的温和溶解。沉淀30mL的培养的转化酵母细胞(DO600约0.5)，用1M山梨糖醇洗涤并且悬浮在1mL的含有100单位/ml酶解酶的球浆体化缓冲液(1M山梨糖醇、50mM磷酸钾pH7.5、14mM2-巯基乙醇)中。在30℃下进行20-30分钟并偶尔温和搅动来使球浆体形成。在1000g沉积6分钟后，用不含2-巯基乙醇的球浆体化缓冲液洗涤球浆体，并重新悬浮在0.5mL的冰冷却的溶解缓冲液(0.3M山梨糖醇、10mM三乙醇胺、1mM EDTA和蛋白酶抑制剂)中。在冰上放置20分钟并偶尔温和搅动后，溶胞产物被调整为1.0M山梨糖醇的终浓度。如同烟草叶匀浆中所述，将溶胞产物上样到分级蔗糖梯度上并离心。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析部分。
结果
实施例A：通过密度梯度从转基因植物营养组织分离(纯化)RPBLA
通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)将编码γ-玉米醇溶蛋白衍生的融合蛋白RX3-EGF和RX3-T20的基因引入烟草植株。通过免疫印迹分析转化的植株以确定具有较高重组蛋白表达的那些植株。图2A显示RX3EGF和RX3T20蛋白的模式。应当注意到两种重组蛋白看来均在所有的转基因株中正确积蓄。主要的较低条带对应融合蛋白的单体形式，较高条带对应双体。融合蛋白通常以多聚体积蓄，并且在免疫印迹中检测到的单体和寡聚体的含量依赖于二硫键还原水平。
将烟草叶提取物上样到密度分级梯度上并且通过免疫印迹分析重组蛋白在不同部分中的积蓄(图2B)。图2B显示的结果表明RX3-EGF出现在对应密实RPBLA的部分中。大部分细胞器显示高于1.2632的密度(F56，泳道6)并且它们中的相当一部分显示高于1.3163g/cm3的密度(F65，泳道7)。RX3-T20融合蛋白存在于49％-56％蔗糖界面中(泳道12)，表明含有RX3-T20的RPBLA具有高于1.2241g/cm3的密度、它们中相当一部分的密度大于1.2632并且显著比例具有大于1.2632的密度(泳道13)。
这些在烟草叶中形成的新RPBLA显示天然玉米蛋白体的密度范围(Ludevid et al.，1984 Plant Mol.Biol.3：227-234；Lending et al.，1989Plant Cell 1：1011-1023)或者更高。应当注意到RX3-T20 PB比RX3-EGFPB的密度要低(略低)，这归因于目的蛋白的某些特定特征。因此，尽管RPBLA积蓄重组融合蛋白具有比通常存在于可溶细胞部分高的密度，与RX3结构域融合的蛋白的特征能够确定这种密度的变化。
估计超过90％的两种重组蛋白是在密实RPBLA部分和沉淀中回收的(参见图2B)。因此，通过密度分离RPBLA看来是纯化(浓缩)融合蛋白的有用系统。
为了评价通过RPBLA分离的重组蛋白RX3-EGF的纯化，通过银染分析不同密度部分(图2C)。如从银染中可见，超过90％的烟草内源蛋白位于梯度的可溶部分(S)和界面部分(F422和F49)，在这些部分中，RX3-EGF蛋白不存在或几乎无法检测到(参见图2B)。因此，通过选择一个或两个梯度部分(F56和F65)可以弃去可溶蛋白和在较低密度细胞器中存在的大量蛋白。
关于融合蛋白在RPBLA部分(F56和F65)中的纯化程度，估计RX3-EGF代表在含有PBLS的部分中检测到的蛋白的约80％。此结果表明，使用RPBLA分离方法，能够仅在纯化的一个步骤中实现融合蛋白的主要富集。
实施例B：从分离自干燥植物组织的RPBLA中回收重组蛋白
分子农场中的重要一点是存在贮藏植物生物质的简单方法。在此情况下，干燥能够提供减少贮藏体积和保存产品的方便方法。尽管如此，干燥经常促进目的蛋白的降解。使用干贮植物分离含有重组蛋白的RPBLA对于工业目的有很大意义。
如上所述的积蓄RX3-EGF和RX3-T20融合蛋白的转化烟草叶被如上所述地干燥。干燥贮藏5个月后，分析重组蛋白的稳定性。通过免疫印迹分析从等量的湿(新鲜)(W，泳道1)和干燥(D，泳道2)叶组织中提取的蛋白(图2D)。如图中所示，RX3-EGF在干贮的转化植物中稳定，在湿和干植物中回收的量相似(比较泳道W和D)。
通过免疫印迹分析来自干叶的匀浆的融合蛋白(RX3EGF和RX3T20)在分级密度梯度中的分布(图2D，泳道3-7)。有趣地，两种融合蛋白均主要在密度高于1.1868g/cm3(F42部分)和1.2632g/cm3(F56部分)的密实结构中回收。
因此，能够从干燥组织中通过分离RPBLA纯化重组蛋白，由此说明转基因植物的收集和重组蛋白的提取和纯化能够在时间上独立。与这些结果一致，γ-玉米醇溶蛋白也在大米种子中的RPBLA中积蓄。
实施例C：通过从瞬时转化烟草小植株中分离RPBLA来回收重组蛋 白
瞬时表达系统能够作为在短时期内测试重组蛋白积蓄行为的方便工具。因此，重组蛋白RX3-EGF和RX3-T20也在通过农杆菌渗入的瞬时转化烟草小植株中表达和积蓄。对来自转化小植株的蛋白提取物进行免疫印迹分析(图3A)显示在稳定转化植物中观察到的特征复合体电泳模式(比较图3A，泳道4和图2A，泳道4)，表明使用此种转化方法所述融合蛋白正确组装。
还在瞬时转化烟草中分析了较高分子量的融合蛋白RX3-hGH的表达(图3A，泳道4)。在密度梯度上进行亚细胞分级分离后，融合蛋白RX3-T20和RX3-hGH均在对应RPBLA部分的密实部分中回收(图3B，泳道4，5和9，10)，所述部分的密度高于1.1868g/cm3(F42)和1.2632g/cm3(F56)。因此瞬时表达能够被用于在短时期内测试含有期望重组蛋白的PB的特定密度性质。
实施例D：通过低速和中速离心回收重组蛋白
为了简化用来通过密实重组蛋白体样组装体纯化重组蛋白的操作，进行两种另外的替代方法：i)只将澄清的匀浆离心通过单一密度的蔗糖垫层(图4A，图4B)和ii)将澄清的匀浆简单地在低速离心下离心(即1000-2500xg离心10分钟)。
与前述结果一致，RX3-EGF和RX3-T20均以高收率(超过90％)在离心通过1.1868g/cm3蔗糖垫层后得到的沉淀中回收(图4A，泳道4和6)。此外，如能够在图4B的银染凝胶中观察到的，RX3-EGF蛋白的纯化非常高，而在相应的沉淀中几乎不能检测到杂质烟草内源蛋白(泳道4)。
与分级密度梯度相比，此方法的主要优点在于其容易规模化以用于工业生产重组蛋白。应当理解，为了最优化重组蛋白的回收和纯化，可以在每一情况中调节垫层密度以及其它特性，例如其粘度和渗量。
此外，还使用低速离心(LSC)浓缩和纯化含有融合蛋白的蛋白体样结构(图4C，LSC)。结果表明，在1000xg离心10分钟后，在沉淀中回收了几乎所有的RX3-EGF融合蛋白(图4C，泳道2)。但是对此沉淀中的蛋白进行染色显示与离心通过1.1868g/cm3蔗糖垫层得到的相比，融合蛋白的纯度不是很高(图4C，比较泳道3和7)。
然后，使用含有5％Triton X-100的缓冲液洗涤通过低速离心得到的第一沉淀。洗涤后，在12,000xg离心样品5分钟，有趣的是，大量P1沉淀中存在的污染蛋白在洗涤和离心后被除去，并且新沉淀(P2，图4C，泳道9)含有高度富集的RX3-EGF蛋白。注意到泳道9中蛋白的含量以及模式与经含有Triton X-100的缓冲液洗涤沉淀后得到的类似，该沉淀是离心通过蔗糖垫层后得到的(图4C，泳道5)。所述低速离心的可选方法基于含有融合蛋白的结构的高密度并且可以在规模化前为每一目标优化离心条件。
实施例E：通过分离来自转染动物细胞的RPBLA回收重组蛋白
进行了研究以确定贮藏蛋白衍生融合蛋白是否在转染动物细胞中也诱导密实重组PB样组装体的形成。使用分级密度梯度分析来自匀浆的转染哺乳动物细胞的细胞器的亚细胞分布。使用编码三种不同融合蛋白的cDNA转染三种不同的细胞培养类型，所述三种不同融合蛋白为RX3-Ct、RX3-EGF和RX3-hGH，所述三种细胞培养物类型为293T(来自人)、Cosl(来自猴)和CHO(来自仓鼠)。使用pECFP-N1(Clontech)转染的Cosl细胞作为对照。如前所述收集梯度部分并通过免疫印迹分析(Fig.5A)。
使用γ-玉米醇溶蛋白抗血清检测在转染细胞中表达的重组RX3衍生蛋白。使用兔中产生的抗-GFP抗血清检测不同收集部分中的对照ECGP。
如预期的，可溶ECGP蛋白在上清液部分中回收(S，图5A，泳道2)，并且在颗粒状细胞部分沉淀的界面和沉淀部分中未检测到该蛋白的痕迹。相反，RX3CT、RX3EGF和RX3hGH主要存在于密实部分F30、F42和F56中(图5A)，表明能够从这些密实部分(密度为1.1270g/cm3至1.2632g/cm3)中回收γ-玉米醇溶蛋白衍生融合蛋白。这些结果与通过免疫细胞化学得到的结果一致，其中融合蛋白位于ER和直径约1至约1.4微米的重组蛋白体样组装体中。
从来自RX3-Ct和RX3-hGH转染细胞的梯度的可溶部分中回收了显著量的重组蛋白。这可能是由于匀浆期间过度的细胞破裂，使得ER中含有的尚未组装的融合蛋白变得可溶。
还使用来自表达RX3-EGF的CHO细胞的匀浆分析低速离心(LSC，图5B)。如图5B所示，大量融合蛋白被从2500xg沉淀中回收(泳道2)，证实在动物细胞中融合蛋白积蓄在密实蛋白体样结构中，能够通过基于密度的方法回收。
实施例F：通过密度梯度从转化酵母中回收重组蛋白
还通过分级密度梯度分析含有融合蛋白的密实结构在转化酵母中的形成。使用标准操作通过酵母转化载体将编码RX3-EGF和RX3-hGH融合蛋白的cDNA引入酿酒酵母(Sacharomyces cerevisiae)。为分离细胞器使用的破碎方法基于方法部分中描述的球浆体的温和溶解。将溶胞产物上样到分级蔗糖梯度上并如哺乳动物细胞或烟草叶匀浆中所述的离心。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析各部分。
图6显示了分级分离结果，可以看到大部分RX3-EGF和RX3-hGH蛋白位于梯度的界面F30中(图6，泳道4)。该部分含有密度在1.1270g/cm3和1.1868g/cm3之间的亚细胞结构。在上清液和F20部分中未检测到显著量的融合蛋白，表明融合蛋白在酵母细胞中组装。有可能酵母细胞的较小尺寸(最大3微米)只允许小RPBLA的形成，其密度小于在植物和动物细胞中观察到的那些。在任何情况下，都能够通过离心将它们从大多数其它细胞蛋白中分离并纯化。
实施例G：通过密度梯度从不同贮藏蛋白区域中回收融合蛋白
γ-玉米醇溶蛋白衍生融合蛋白通过其密度性质的纯化可以延伸到衍生自其它贮藏蛋白的融合蛋白。此处我们显示衍生自大米13kD谷醇溶蛋白(rP13)和衍生自22kDα-玉米醇溶蛋白(22aZt)的融合蛋白如何在分级蔗糖梯度中对应RPBLA的密实部分中积蓄(图7)。选择大米13kD谷醇溶蛋白(rP13)和22kDα-玉米醇溶蛋白[全长(22aZ)或N-末端结构域(22aZt)]是因为它们之间以及与RX3结构域之间缺乏同源性。出乎意料的是，两种贮藏蛋白均产生高密度RPBLA，当使用分级密度梯度时，该RPBLA在较高密度界面中被回收(图7A)。
降钙素序列与rP13和22aZt同框融合并处于CaMV35S启动子的控制之下，将其引入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。瞬时转化烟草小植株并且对叶的匀浆实施分级密度梯度。使用SDS-PAGE和免疫印迹分析收集的部分，该免疫印迹使用在兔中产生的抗降钙素抗血清。
如图7A所示(泳道4-5和9-10)，较大量的rP13Ct和22aZtCt融合蛋白位于F42和F56部分中，表明了密度大于1.1868g/cm3的重组PB样组装体的存在，该组装体可以被分离用于融合蛋白纯化。所述结果还表明含有融合蛋白的重组PB样组装体的密度可以根据包括在融合中的贮藏蛋白而变化。
使用与大米谷醇溶蛋白融合的hGH(rP13-hGH)和与全长α-玉米醇溶蛋白融合的hGH(22aZ-hGH)进行农杆菌渗入研究。再一次，观察到大部分RPBLA存在于F42和F56部分中(图7A，泳道4-5和9-10)，但有趣的是，这一次在上清液和低密度界面中还观察到一些未组装融合蛋白(泳道1-2和6-7)。hGH对rP13和22aZ的部分可溶化作用可以解释此效果。
通过农杆菌(Agrobacterium tumefasciens)转化产生表达融合蛋白rP13-EGF和22aZ-EGF的转基因烟草植株。通过使用抗EGF抗体的免疫印迹确定最好的表达体，并且使用这些细胞株与用相同构建体农杆菌渗入的烟草小植株进行比较分析。如图7所示(图7A，泳道4和9；图7B，泳道3)，在所有的情况下，RPBLA均在独特界面(F12)中被回收，表明RPBLA的密度非常大且均一。
纵观全部结果，清楚显示谷醇溶蛋白能够诱导高密度RPBLA，甚至当它们与其它蛋白融合时。这是出乎意料的结果，主要是当它们之间几乎没有观察到同源性时。此外，有一些数据表明谷醇溶蛋白相互作用以稳定蛋白体，并且当单独在营养组织中表达时，它们中的某些不稳定，例如α-玉米醇溶蛋白(Coleman et al.，1996Plant Cell8：2335-2345)。
实施例H：从分离的PBLS中提取重组蛋白
已经证明分离密实重组PB样组装体是从转基因生物体中以高收率和高纯化水平回收重组蛋白的有利方法。此处显示能够从该贮藏细胞器中提取这些重组蛋白。尽管重组PBLA可以直接用于某些应用(即口服疫苗制备)，在某些其它情况下，对纯化重组蛋白的处理可能是必需的。
在37℃下在含有还原剂的缓冲液(含有四硼酸钠12.5mM pH8、0.1％SDS和2％2-巯基乙醇的SB缓冲液；处理)中孵育PB部分过夜后(约18小时)，RX3-EGF和RX3-T20蛋白被稳定。如图8中对应RX3-EGF的泳道1-4和对应RX3-T20的泳道6-7中所示，两种提取蛋白均以它们的可溶形式被回收(S)。之后，根据它们的应用，可以进一步纯化所述提取蛋白或作为部分纯化提取物使用。
以参考的方式引入本文中引用的每一篇专利或文献。冠词“a”或“an”的使用意图包括一个或多个。
前文的描述和实施例意图作为示例性的且不应理解为限制。在本发明的精神和范围内还可能有其它变化，并且这些变化对本领域技术人员是显而易见的。
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Claims (16)

1.纯化在宿主细胞中以重组蛋白体样组装体表达的重组融合蛋白的方法，其中所述融合蛋白含有两个连接在一起的序列，其中一个序列是蛋白体诱导序列而另一个是目的产物的序列，所述蛋白体诱导序列包含谷醇溶蛋白或修饰的谷醇溶蛋白，
所述方法包括步骤：
(a)提供以重组蛋白体样组装体表达融合蛋白的转化宿主细胞的水性匀浆，所述重组蛋白体样组装体具有1.1g/ml至1.35g/ml的密度，其中一个序列是蛋白体诱导序列而另一个是目的产物的序列，所述蛋白体诱导序列包含谷醇溶蛋白或修饰的谷醇溶蛋白；
(b)在没有加入的提供密度的溶质存在下或借助密度小于所述重组蛋白体样组装体密度的密度垫层离心所述匀浆，形成所述匀浆的不同密度的区域，以提供含有浓度相对提高的重组蛋白体样组装体的区域和含有浓度相对匮乏的重组蛋白体样组装体的区域；以及
(c)将所述含有浓度相对匮乏的重组蛋白体样组装体的区域与所述含有浓度相对提高的重组蛋白体样组装体的区域分离，由此纯化所述融合蛋白；
其中所述修饰的谷醇溶蛋白包括：(a)蛋白γ-玉米醇溶蛋白的重复结构域6肽PPPVHL(SEQ ID NO：1)的一个或多个拷贝的序列，和(b)γ-玉米醇溶蛋白的全部或部分ProX结构域的序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述不同密度区域是通过以密度垫层离心来提供的，所述密度垫层的密度小于所述重组蛋白体样组装体的密度。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述不同密度区域是通过低速离心匀浆后得到的上清液和沉淀来提供的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是高等植物细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是真菌细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述真菌宿主细胞是酵母细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是藻类细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是动物细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述动物宿主细胞是哺乳动物细胞。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述融合蛋白还包括位于蛋白体诱导序列和目的产物的序列之间的接头序列。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述谷醇溶蛋白序列是γ-玉米醇溶蛋白、α-玉米醇溶蛋白或大米谷醇溶蛋白。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述匀浆是从新鲜生物质制备的。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述匀浆是从干燥生物质制备的。
14.根据权利要求1所述的方法，其还包括回收重组蛋白体样组装体的步骤。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其还包括洗涤重组蛋白体样组装体的步骤。
16.权利要求1-15任一项所述的方法获得的纯化的重组蛋白体样组装体，其中所述重组蛋白体样组装体的纯度超过80％，并且其中所述融合蛋白含有两个连接在一起的序列，其中一个序列是蛋白体诱导序列而另一个是目的产物的序列，所述蛋白体诱导序列包含谷醇溶蛋白或修饰的谷醇溶蛋白，并且其中所述修饰的谷醇溶蛋白包括：(a)蛋白γ-玉米醇溶蛋白的重复结构域6肽PPPVHL(SEQ ID NO：1)的一个或多个拷贝的序列，和(b)γ-玉米醇溶蛋白的全部或部分ProX结构域的序列。
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