RU2420585C2 - Выделение и очистка белка - Google Patents
Выделение и очистка белка Download PDFInfo
- Publication number
- RU2420585C2 RU2420585C2 RU2007124377/10A RU2007124377A RU2420585C2 RU 2420585 C2 RU2420585 C2 RU 2420585C2 RU 2007124377/10 A RU2007124377/10 A RU 2007124377/10A RU 2007124377 A RU2007124377 A RU 2007124377A RU 2420585 C2 RU2420585 C2 RU 2420585C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- density
- rpbla
- proteins
- cells
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 141
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 134
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 16
- 238000011084 recovery Methods 0.000 title description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 73
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 61
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 98
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 87
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 87
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 87
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 claims description 72
- 239000005019 zein Substances 0.000 claims description 67
- 229940093612 zein Drugs 0.000 claims description 67
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 32
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 32
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 21
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 21
- 108060006613 prolamin Proteins 0.000 claims description 21
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 21
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N Pyrrolidine Chemical group C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 13
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 9
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 7
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 claims description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 5
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 122
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 58
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 58
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 58
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 52
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 52
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 43
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 32
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 29
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 24
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 23
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 23
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 21
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 20
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 20
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 108010055615 Zein Proteins 0.000 description 16
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 14
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 14
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 14
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 14
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 14
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 13
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 13
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- XXRYFVCIMARHRS-UHFFFAOYSA-N propan-2-yl n-dimethoxyphosphorylcarbamate Chemical compound COP(=O)(OC)NC(=O)OC(C)C XXRYFVCIMARHRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 10
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 9
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 8
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 7
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 6
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 6
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 6
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- -1 gamma-zein Chemical class 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 4
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102100039806 G patch domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 101001034116 Homo sapiens G patch domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 206010021033 Hypomenorrhoea Diseases 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 3
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 3
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 3
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- HZWWPUTXBJEENE-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-[[1-[5-amino-2-[[1-[2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C1CCC(C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O)N1C(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 HZWWPUTXBJEENE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- LTLYEAJONXGNFG-DCAQKATOSA-N E64 Chemical compound NC(=N)NCCCCNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1O[C@@H]1C(O)=O LTLYEAJONXGNFG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 2
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 2
- 108010061711 Gliadin Proteins 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 101710094902 Legumin Proteins 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 2
- 101710196023 Vicilin Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- NEKNNCABDXGBEN-UHFFFAOYSA-L disodium;4-(4-chloro-2-methylphenoxy)butanoate;4-(2,4-dichlorophenoxy)butanoate Chemical compound [Na+].[Na+].CC1=CC(Cl)=CC=C1OCCCC([O-])=O.[O-]C(=O)CCCOC1=CC=C(Cl)C=C1Cl NEKNNCABDXGBEN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 2
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 description 2
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 2
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 2
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241001503987 Clematis vitalba Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 101150084418 EGF gene Proteins 0.000 description 1
- 102100039371 ER lumen protein-retaining receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100037642 Elongation factor G, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 101710087459 Gamma-gliadin Proteins 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102220533703 Histone-lysine N-methyltransferase SUV39H1_W64A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000812437 Homo sapiens ER lumen protein-retaining receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000880344 Homo sapiens Elongation factor G, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000798114 Homo sapiens Lactotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 101001018100 Homo sapiens Lysozyme C Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101710138460 Leaf protein Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 229910009891 LiAc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029389 Simplexvirus glycoprotein B Proteins 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 240000002307 Solanum ptychanthum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 101100226845 Strongylocentrotus purpuratus EGF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100226846 Strongylocentrotus purpuratus EGF3 gene Proteins 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001164 bioregulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003773 calcitonin (salmon synthetic) Drugs 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000050459 human LTF Human genes 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000000473 mesophyll cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010773 plant oil Substances 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 108010068072 salmon calcitonin Proteins 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000004895 subcellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
- C07K14/425—Zeins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/585—Calcitonins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8221—Transit peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Botany (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу выделения рекомбинантных белков из трансформированных хозяев. Данные рекомбинантные белки содержат индуцирующую белковые тельца последовательность, слитую с последовательностью представляющего интерес продукта. При осуществлении способа получают водный гомогенат трансформированных клеток-хозяев, которые экспрессируют слитый белок в виде рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплений (RPBLA), обладающих плотностью приблизительно от 1,1 до 1,35 г/мл. Гомогенат центрифугируют с образованием фракций с различной плотностью, либо в отсутствие дополнительного обеспечивающего плотность раствора, либо с помощью слоя с определенной плотностью, которая меньше чем плотность RPBLA. В результате образуются фракции, которые содержат относительно сниженную концентрацию RPBLA, и фракция, которая содержит относительно повышенную концентрацию RPBLA. Фракцию со сниженной концентрацией RPBLA отделяют от фракций с относительно повышенной концентрацией RPBLA. Затем очищают указанный слитый белок. Изобретение обеспечивает простоту осуществления, быстроту и эффективную очистку рекомбинантных белков. 14 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу очистки рекомбинантных белков, накапливающихся в рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплениях (RPBLA). Более конкретно это изобретение относится к выделению рекомбинантных слитых белков в рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплениях, которые позволяют отделять их от других органелл клетки-хозяина вследствие различий в плотности, где требуемый рекомбинантный белок можно концентрировать, отделять от других компонентов клетки и легко выделять.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Белковые тельца (PB) представляют собой субклеточные органеллы (или крупные везикулы, окруженные мембраной, с диаметром приблизительно 1-3 микрон), которые специализируются на запасании белка. В природе они образуются в некоторых определенных тканях растений, таких как семена, и служат в качестве основного источника аминокислот для проращивания и роста проростка.
Запасные белки котрансляционно встраиваются в просвет эндоплазматической сети (ER) с помощью сигнального пептида для упаковки либо в ER, либо в вакуоли (Galili et al., 1993 Trends Cell Biol. 3:437-443) и собираются в мультимерные структуры внутри этих субклеточных компартментов, образуя определенные органеллы, называемые происходящими из (ER) белковыми тельцами (PB) или вакуолями запасных белков (PSV) (Okita and Rogers, 1996 Annu. Rev. Plant Physiol Mol. Biol. 47:327-350; Herman and Larkins, 1999 Plant Cell 11:601-613; Sanderfoot and Raikel, 1999 Plant Cell 11:629-642).
Запасные белки двудольных растений представляют собой, главным образом, растворимые белки, такие как белки глобулина или вицилина типа 7S, глобулина или легумина типа 11S, и они депонируются в PSV совместно с другими белками (т.е. ингибиторами протеаз, протеолитическими ферментами, лектинами и т.п.), сахарами и солями.
В противоположность PSV, PB (1-3 микрон) депонируют, главным образом, проламины, которые представляют собой высокогидрофобные запасные белки зерновых (такие как зеины маиса и глиадины пшеницы), и в них отсутствуют другие вспомогательные белки (Herman and Larkins, 1999 Plant Cell 11:601-613).
К настоящему времени в тканях, отличных от семян растений, PB не выявлены, за исключением телец ER. Тельца ER обладают небольшим размером (0,2-0,4 микрометров) и они образуются в листьях Arabidopsis только при повреждении и разжевывании насекомыми, однако они не образуются в нормальных условиях (Matsushima et al., 2003 Plant J. 33:493-502).
Подходы генетической инженерии применяли для исследования образования растительных PB, сборки и направления запасных белков. Было показано, что в случае, когда рекомбинантные белки, главным образом, растительные запасные белки, экспрессируются и упаковываются в Arabidopsis и табаке, ткани растений, которые не содержат PB (такие как вегетативные ткани), производят эти органеллы "de novo" (Bagga et al., 1997 Plant Cell 9:1683-1696 and Bagga et al., 1995 Plant Physiol. 107:13-23, и патенты США No. 5990384, No. 5215912 и No. 5589616; и Geli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922).
Бета-зеин маиса при экспрессии в трансгенных растениях табака точно направлялся в новые образующиеся происходящие из ER PB в клетках листьев (Bagga et al., 1995 Plant Physiol. 107:13-23). кДНК гамма-зеина маиса и укороченная кДНК гамма-зеина, экспрессируемая в растениях Arabidopsis, также накапливаются в новых происходящих из ER PB в листьях (Geli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922). Богатые лизином гамма-зеины, экспрессируемые в эндосперме маиса (Torrent et al. 1997 Plant Mol. Biol. 34(1):139-149), накапливаются в PB маиса и колокализуются с эндогенными зеинами. На трансгенных растениях табака, экспрессирующих ген альфа-зеина, было показано, что альфа-зеин не способен образовывать PB. Однако, когда альфа- и гамма-зеин коэкспрессировались, стабильность альфа-зеина повышалась, и оба белка колокализовались в происходящих из ER белковых тельцах (Coleman et al., 1996 Plant Cell 8:2335-2345). Также было описано образование новых PB в трансгенных бобах сои, трансформированных богатым метионином дельта-зеином массой 10 кДа (Bagga et al., 2000 Plant Sci. 150:21-28).
Рекомбинантные запасные белки также накапливаются в подобных PB органеллах в нерастительных системах-хозяевах, таких как ооциты Xenopus, и в дрожжах. Rosenberg et al., 1993 Plant Physiol 102:61-69 описали экспрессию гамма-глиадина пшеницы в дрожжах. Ген экспрессировался правильно, и белок накапливался в происходящих из ER PB. Torrent et al., 1994 Planta 192:512-518 показали, что в ооцитах Xenopus гамма-зеин также запасается в подобных PB органеллах после микроинъекции транскриптов, кодирующих белок, в ооциты. Hurkman et al., 1981 J. Cell Biol. 87:292-299, для альфа-зеинов и Altschuler et al., 1993 Plant Cell 5:443-450, для гамма-глиадинов в ооцитах Xenopus получили сходные результаты.
Одним из фундаментальных достижений в области биотехнологии (генетической инженерии) является возможность генетически воздействовать на организм для получения белка для терапевтического, нутрицевтического или промышленного применения. Получены способы продукции и выделения рекомбинантных белков из бульона для культивирования клеточных культур бактерий, дрожжей, из культур клеток сельскохозяйственных растений и млекопитающих. Описаны различные подходы для экспрессии белка в клетках-хозяевах. Основными целями этих подходов являлись: уровень экспрессии белка, стабильность белка и выделение белка (Menkhaus et al., 2004 Biotechnol. Prog. 20:1001-1014; Evangelista et al., 1998 Biotechnol. Prog. 14:607-614).
Одна стратегия, которая может решить проблему выделения белка, представляет собой секрецию. Однако секреция предполагает иногда низкие уровни экспрессии и нестабильность продукта. Другой стратегией является накопление рекомбинантного белка в наиболее подходящем отделе клетки. Эту стратегию широко использовали посредством направления рекомбинантных белков в ER с помощью конструирования C-концевого удлинения из тетрапептида (HDEL/KDEL) (Conrad and Fiedler, 1998 Plant Mol. Biol. 38:101-109).
Слитые белки, содержащие растительный запасной белок или домены запасного белка, слитые с гетерологичным белком, представляют собой альтернативный подход для направления рекомбинантных белков в ER (WO 2004003207). Одной интересной стратегией слияния является продукция рекомбинантных белков, слитых с олеозинами, составными белками масляных телец растений. Определенные свойства масляных телец дают преимущество в отношении легкого выделения белков с использованием двухфазной системы (van Rooijen and Moloney, 1995 Bio/Technology 13:72-77).
Гетерологичные белки были успешно экспрессированы в растительных клетках (обзоры Horn et al., 2004 Plant Cell Rep. 22:711-720; Twyman et al., 2003, Trends in Biotechnology 21:570-578; Ma et al., 1995, Science 268:716-719; Richter et al., 2000 Nat. Biotechnol. 18:1167-1171) и в некоторых из них, экспрессия рекомбинантного белка была направлена в происходящие из ER PB или PSV (PSV). Yang et al., 2003 Planta 216:597-603 экспрессировали лизоцим человека в семенах риса с использованием специфичных для семян промоторов запасных белков глутелина и глобулина. Результаты иммуноцитохимии показали, что рекомбинантный белок был локализован в ER-PB и что он запасался с эндогенными глобулинами и глутелинами риса. Экспрессию гликопротеина B цитомегаловируса человека (hCMV) в трансгенных растениях табака осуществляли с использованием промотора глутелина риса. Tackaberry et al., 1999 Vaccine 17:3020-3029. Недавно Arcalis et al., 2004 Plant Physiology 136:1-10 экспрессировали сывороточный альбумин человека (HSA) с C-концевым удлинением (KDEL) в семенах риса. Рекомбинантный HSA запасался в PSV с эндогенными запасными белками риса.
Одним препятствием для применения растений в качестве биофабрик является необходимость в проведении большего количества исследований, касающихся последующей переработки. Очистка белка из растений является трудной задачей вследствие сложности растительной системы. Растительные твердые вещества в экстракте являются крупными, плотными и их количество является относительно высоким (9-20 процентов по массе) (см. обзор Menkhaus et al., 2004 Biotechnol. Prog. 20:1001-1014). В настоящее время, способы очистки рекомбинантных белков включают в себя очистку экстрактов, обработку растворителями для удаления липидов и пигментов и очистку белков или пептидов с помощью нескольких колонок для ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Существующие протоколы основаны на применении определенных растворителей или водных растворов как для систем растений-хозяев, так и для рекомбинантного белка. В данной области существует необходимость в эффективных и универсальных способах выделения рекомбинантного белка из трансформированных хозяев. Эта необходимость особенно актуальна в случаях, когда необходимо выделить рекомбинантные белки, продуцируемые в хозяевах-растениях. Разнообразие хозяев и белков и их различные физико-химические характеристики требуют эффективного способа концентрирования и выделения рекомбинантных продуктов. Настоящее изобретение, описанное в настоящем документе, представляет собой один способ упрощения и повышения выделения рекомбинантно экспрессируемых белков из организмов, не относящихся к высшим растениям, таким как грибы и клетки млекопитающих.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к эффективному или универсальному процессу или способу выделения рекомбинантного белка из трансформированных хозяев. Представленная в настоящем описании разработка основана на открытии того факта, что отделение рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплений (RPBLA) от белков других органелл клеток-хозяев можно осуществлять с неожиданно хорошим выходом с помощью способа на основе плотности, в частности, с помощью способов центрифугирования со слоем с определенной плотностью или с градиентом плотности.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу очистки рекомбинантного слитого белка, который экспрессируется в качестве RPBLA клеток-хозяев. В соответствии с рассматриваемым способом получают водный гомогенат трансформированных клеток-хозяев, которые экспрессируют слитый белок в качестве RPBLA. Эти RPBLA обладают заранее определенной плотностью, которая может отличаться среди различных слитых белков, но является известной для конкретного слитого белка, подлежащего выделению. Заранее определенная плотность RPBLA, как правило, является более высокой, чем плотность по существу всех эндогенных белков клетки-хозяина, находящихся в гомогенате, и, как правило, составляет от приблизительно 1,1 до приблизительно 1,35 г/мл. В гомогенате образуют части различной плотности с получением части, которая содержит относительно повышенную концентрацию RPBLA, и части, которая содержит относительно сниженную концентрацию RPBLA. Часть со сниженной концентрацией RPBLA отделяют от части с относительно повышенной концентрацией RPBLA, таким образом, очищая указанный слитый белок. Часть с относительно повышенной концентрацией RPBLA можно собирать или обрабатывать одним или несколькими реагентами или подвергать одной или нескольким обработкам перед выделением RPBLA или слитого белка, находящегося в нем.
В предпочтительном варианте, слитый белок содержит две связанные друг с другом полипептидные последовательности, в которых одна последовательность представляет собой индуцирующую белковые тельца последовательность (PBIS), в то время как другая последовательность представляет собой последовательность представляющего интерес продукта, такого как молекула лекарственного средства и фермент или сходные с ними. Предпочтительные индуцирующие белковые тельца последовательности представляют собой последовательности соединений проламина, таких как гамма-зеин, альфа-зеин или проламин риса.
В настоящем описании клетки-хозяева представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки высших растений, грибов и дрожжей, клетки животных, такие как клетки млекопитающих и клетки водорослей. Эти клетки могут быть свежими, которые получают непосредственно из свежей биомассы, или они могут быть высушенными, которые получают из высушенной биомассы; под биомассой понимают массу, получаемую из живых организмов или клеток, таких как культуральная среда или живой организм, например, такой как лист растения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На чертежах, являющихся частью этого описания, на фиг.1 представлено схематическое изображение бинарных векторов, используемых для временной (агроинфильтрация) и стабильной трансформации растений табака, представленны в верхней части фигуры. Два вектора, используемые для трансформации дрожжей, представлены в середине фигуры. Векторы, используемые для временной трансфекции культур клеток млекопитающих, представлены в нижней части. RX3, N-концевой домен гамма-зеина массой 27 кДа, 22aZ, альфа-зеин массой 22 кДа, 22aZt, N-концевой домен альфа-зеина массой 22 кДа, rP13, проламин риса массой 13 кДа и CS участок расщепления.
Фиг.2 представлена в четырех частях, фиг.2,A-D. На фиг.2,A представлено запасание слитых белков RX3-T20 и RX3-EGF в листьях трансгенных растений табака. Растворимые белки экстрагировали из листьев табака дикого типа (wt) и трансгенного табака (дорожки 2 и 4), анализировали в SDS-полиакриламидных гелях и переносили на нитроцеллюлозные мембраны, с последующим иммуноблот-анализом с использованием антисыворотки против гамма-зеина. Молекулярные массы указаны слева. Полученные из RX3 мономер (M) и димеры (D) слитых белков указаны стрелками.
На фиг.2,B представлен иммуноблот-анализ слитых белков RX3-T20 и RX3-EGF во фракциях градиента плотности. Очищенные гомогенаты влажных (свежих) листьев трансформированного табака помещали в ступенчатый градиент сахарозы (42%-49%-56%-65% масс./масс.). Накопление слитых белков RX3-EGF и RX3-T20 в гомогенате, супернатанте, интерфазе и фракции осадка анализировали с помощью иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина. Каждая дорожка соответствует эквивалентным объемам всех фракций. H, гомогенат; S, супернатант; F42, интерфаза 42-49% масс./масс.; F49, интерфаза 49-56% масс./масс.; F56, интерфаза 56-65% масс./масс.; F65, осадок при 65% сахарозе. Молекулярные массы указаны слева. Полученные из RX3 мономер (M) и димеры (D) слитых белков указаны стрелками.
На фиг.2,C представлен анализ SDS-PAGE и анализ окрашиванием серебром слитого белка RX3-EGF, экспрессируемого pl9RX3EGF в трансформированных листьях табака, во фракциях градиента плотности. Очищенные гомогенаты влажных (свежих) листьев табака в буфере PBP помещали в ступенчатый градиент сахарозы (42%-49%-56%-65% масс./масс.). Накопление слитого белка RX3-EGF в фракциях гомогената, супернатанта, интерфазы и осадка анализировали посредством 15% SDS-PAGE и проявляли окрашиванием серебром. Каждая дорожка соответствует эквивалентным объемам всех фракций. Стрелкой указан белок RX3-EGF. H, гомогенат; S, супернатант; F42, интерфаза с 42-49% масс./масс. сахарозой; F49, интерфаза 49-56% масс./масс.; F56, интерфаза 56-65% масс./масс.; F65, осадок при 65% сахарозе. Молекулярные массы указаны слева.
На фиг.2,D представлены результаты SDS-PAGE и иммуноблотинга в отношении накопления RX3-T20 и RX3-EGF в влажных и сухих листьях табака. Листья табака высушивали при 37°C в течение одной недели и хранили в течение пяти месяцев в контейнере, не содержащем влаги. Растворимые белки, экстрагированные из эквивалентных количеств влажных (W) и сухих (D) трансформированных листьев табака, анализировали с помощью SDS-полиакриламидных гелей и иммуноблота с использованием антисыворотки против гамма-зеина (дорожки 1 и 2). Накопление RX3-EGF и RX3-T20 в плотных структурах в высушенных образцах анализировали фракционированием гомогенатов сухих листьев в градиентах сахарозы (20%-30%-42%-56% масс./масс.). Накопление слитых белков RX3-EGF и RX3-T20 в фракциях супернатанта, интерфазы и осадка анализировали с помощью иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина. Наносили эквивалентные количества каждой фракции. S, супернатант; F20, интерфаза с 20%-30% масс./масс. сахарозой; F30, интерфаза с 30%-42% масс./масс. сахарозой; F42, интерфаза с 42%-56% масс./масс. сахарозой; F56, осадок при 56% сахарозе.
Фиг.3 представлена в двух частях, фиг.3,A и B. На фиг.3,A представлено накопление RX3-EGF и RX3-T20 в агроинфильтрированных проростках табака. Все растворимые белки анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблота с использованием антисыворотки против гамма-зеина. Wt = контрольные проростки дикого типа; молекулярные массы указаны слева. Полученные из RX3 мономер (M), димеры (D) и тримеры (T) слитых белков указаны стрелками. На фиг.3,B представлено субклеточное фракционирование агроинфильтрированных проростков табака. Очищенные гомогенаты проростков помещали в ступенчатые градиенты сахарозы (20%-30%-42%-56% масс./масс.). Накопление слитых белков RX3-T20 и RX3-hGH во фракциях супернатанта, интерфазы и осадка анализировали с помощью иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина. В каждую дорожку наносили эквивалентные количества каждой фракции. S, супернатант; F20, интерфаза с 20%-30% масс./масс. сахарозой; F30, интерфаза с 30%-42% масс./масс. сахарозой; F42, интерфаза с 42%-56% масс./масс. сахарозой; F56, осадок при 56% сахарозе. Молекулярные массы указаны слева. Полученные из RX3 мономер (M) и димеры (D) слитых белков указаны стрелками.
Фиг.4 представлена в трех частях в виде фиг.4,A, B и C. На фиг.4,A представлена концентрация белков RX3-T20 и RX3-EGF после центрифугирования через слой с сахарозой. Очищенные гомогенаты трансгенных листьев табака помещали в слой с сахарозой (42% масс./масс.). После центрифугирования накопление слитых белков RX3-EGF и RX3-T20 в супернатанте и осадке анализировали с помощью иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина. Каждая дорожка соответствует эквивалентным количествам фракций. H, гомогенат; S, супернатант; P, слой осадка. Молекулярные массы указаны слева. Полученные из RX3 мономер (M) и димеры (D) слитых белков указаны стрелками.
На фиг.4,B представлена очистка белка RX3-EGF после центрифугирования через слой сахарозы. Очищенные гомогенаты трансгенных листьев табака помещали в слой сахарозы (42% масс./масс.). После центрифугирования образцы белков фракций гомогената, супернатанта и осадка анализировали с помощью 15% SDS-PAGE и окрашивания серебром. Каждая дорожка соответствует эквивалентным количествам фракций. Мономер (M) и димеры (D) RX3-EGF указаны стрелками. H, гомогенат; S, супернатант; P, слой осадка. Молекулярные массы указаны слева.
На фиг.4,C представлена концентрация белка RX3-EGF и очистка после центрифугирования при низкой скорости (LSC). Очищенные гомогенаты экспрессирующих RX3-EGF листьев табака центрифугировали при 1000 × g в течение 10 минут, и осадок (P1, дорожка 2) и супернатант (S, дорожка 1) анализировали с помощью гель-электрофореза и иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина. Осадок P1 после центрифугирования на низкой скорости (LSC) промывали в буферной содержащей 5% TritonX-100 среде и, после второго центрифугирования, эквивалентные количества осадка P1 после LSC (дорожка 7), супернатант после промывания (W, дорожка 8) и конечный осадок P2 (дорожка 9) анализировали с помощью 15% SDS-PAGE и окрашивания серебром. Эти образцы сравнивали с эквивалентными образцами (дорожки 3-5) из осадка P1 (дорожка 3), полученного после одного центрифугирования в слое сахарозы и подвергнутого такому же процессу промывания, что и осадок LSC. Мономер (M) и димеры (D) RX3-EGF указаны стрелками.
Фиг.5 представлена в двух частях в виде фиг.5,A и B. На фиг.5,A представлено субклеточное распределение рекомбинантных слитых белков RX3-Ct, RX3-EGF и RX3-hGH, накопленных в трансфицированных клетках млекопитающих. Гомогенаты трансфицированных клеток помещали в ступенчатые градиенты сахарозы (20%-30%-42%-56% масс./масс.). После центрифугирования накопление слитых белков RX3-Ct, RX3-EGF и RX3-hGH во фракциях супернатанта, интерфазы и осадка анализировали с помощью иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина. Клетки, трансфицированные плазмидой pECFP-N1 (Clontech), экспрессирующей ECGP, вариант GFP с голубой флуоресценцией, использовали в качестве контроля, и ECGP выявляли иммунологическим анализом с использованием антисыворотки против GFP. H, гомогенат; S, супернатант; F20, интерфаза с 20%-30% масс./масс. сахарозой; F30, интерфаза с 30%-42% масс./масс. сахарозой; F42, интерфаза с 42%-56% масс./масс. сахарозой; F56, осадок с 56% сахарозой.
На фиг.5,B представлена концентрация белка RX3-EGF, экспрессируемого CHO, после центрифугирования при низкой скорости. Гомогенаты из экспрессирующих RX3-EGF клеток CHO центрифугировали при 2500 × g в течение 10 минут, и осадок (P, дорожка 2) и супернатант (S, дорожка 1) анализировали с помощью гель-электрофореза и иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина. Молекулярные массы указаны слева.
На фиг.6 представлено субклеточное распределение рекомбинантных слитых белков RX3-EGF и RX3-hGH, запасаемых в трансформированных клетках дрожжей. Лизированные сферопласты из трансформированных дрожжей помещали в ступенчатые градиенты сахарозы (20%-30%-42%-56% масс./масс.). После центрифугирования накопление слитых белков RX3-EGF и RX3-hGH во фракциях супернатанта, интерфазы и осадка анализировали с помощью иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина. H, гомогенат лизированных сферопластов; S, супернатант; F20, интерфаза с 20%-30% масс./масс. сахарозой; F30, интерфаза с 30%-42% масс./масс. сахарозой; F42, интерфаза с 42%-56% масс./масс. сахарозой; F56, осадок в 56% сахарозе. Молекулярные массы указаны слева.
На фиг.7,A представлено субклеточное распределение рекомбинантных слитых белков, запасаемых в агроинфильтрированных растениях табака. Очищенные гомогенаты проростков помещали в ступенчатые градиенты сахарозы (20%-30%-42%-56% масс./масс.). Накопление слитых белков rP13-Ct, rP13-EGF и rP13-hGH во фракциях градиента супернатанта, интерфазы и осадка анализировали с помощью иммуноблота с использованием антител против кальцитонина, EGF и hGH. Эквивалентное исследование проводили с использованием двух вариантов гена альфа-зеина. Проводили слияние кальцитонина (Ct) и EGF с N-концевым доменом альфа-зеина (22aZt) и проводили слияние hGH с полным геном альфа-зеина (22aZ). В каждую дорожку помещали эквивалентные количества каждой фракции. S, супернатант; F20, интерфаза с 20%-30% масс./масс. сахарозой; F30, интерфаза с 30%-42% масс./масс. сахарозой; F42, интерфаза с 42%-56% масс./масс. сахарозой; F56, осадок в 56% сахарозе.
На фиг.7,B представлены результаты применения очищенных гомогенатов листьев из трансгенных линий табака, помещенных в ступенчатые градиенты сахарозы (10%-42%-56%-62% масс./масс.). Посредством иммуноблота с использованием антител против EGF было показано распределение rP13-EGF и 22aZt-EGF в эквивалентных количествах в каждой фракции. S, супернатант; F10, интерфаза с 10%-42% масс./масс. сахарозой; F42, интерфаза с 42%-56% масс./масс. сахарозой; F56, интерфаза с 56%-62% масс./масс. сахарозой; F62, осадок в 62% сахарозе.
На фиг.8 представлено выделение слитого белка RX3-T20 и RX3-EGF из RPBLA. Фракции RPBLA, полученные из слоя с определенной плотностью или ступенчатого градиента, ресуспендировали в присутствии восстанавливающих веществ. Растворенные (S) и нерастворенные белки (P) анализировали с помощью иммуноблота с использованием антисыворотки против гамма-зеина. Молекулярные массы указаны слева. Полученные из RX3 мономер (M), димеры (D) и тримеры (T) слитых белков указаны стрелками.
Настоящее изобретение обладает рядом преимуществ и положительных эффектов.
Одним преимуществом является то, что его применение обеспечивает возможность относительно простой быстрой очистки экспрессируемых белков на основе отличия в плотности экспрессируемого продукта от остальных растворимых веществ клетки.
Таким образом, преимущество этого изобретения состоит в том, что оно обеспечивает способ удаления эндогенных соединений (или нерекомбинантных продуктов) из организма хозяина и культур клеток.
Другим преимуществом этого изобретения является то, что оно обеспечивает надежный и воспроизводимый способ очистки рекомбинантных пептидов или белков из свежей или высушенной биомассы (организм-хозяин).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Настоящее изобретение, главным образом, относится к последовательной обработке для выделения и очистки представляющих интерес рекомбинантных белков и пептидов из трансформированных организмов или культур клеток. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу очистки рекомбинантного слитого белка, который экспрессируется и запасается в клетках-хозяевах в качестве рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплениях (RPBLA). RPBLA представляют собой скопления рекомбинантного слитого белка, индуцируемые доменами запасных белков, которые образуют внутри клеток отложения с высокой плотностью. Эти плотные отложения могут накапливаться в цитозоле, органеллах системы эндомембран, митохондриях, пластидах, или могут секретироваться. В соответствии с рассматриваемым способом, получают водный гомогенат трансформированных клеток-хозяев, которые экспрессируют слитый белок в качестве RPBLA. Для применения гомогенат предпочтительно является очищенным. В гомогенате образуются части с различной плотностью с получением части, которая содержит относительно повышенную концентрацию RPBLA, и части, которая содержит относительно сниженную концентрацию RPBLA. Часть со сниженной концентрацией RPBLA отделяют от части с относительно повышенной концентрацией RPBLA, таким образом, очищая слитый белок. Часть с относительно повышенной концентрацией RPBLA можно, таким образом, собирать или обрабатывать одним или несколькими реагентами или подвергать одному или нескольким процессам перед выделением RPBLA или слитого белка, находящегося в них.
В предпочтительном варианте, слитый белок содержит две связанные друг с другом полипептидные последовательности, в которых одна последовательность представляет собой индуцирующую белковые тельца последовательность (PBIS), в то время как другая последовательность представляет собой последовательность представляющего интерес продукта, такого как молекула лекарственного средства, и фермент или сходные с ними. Предпочтительные PBIS представляют собой последовательности соединений проламина, таких как гамма-зеин, альфа-зеин или проламин риса.
Один аспект настоящего способа включает получение водного гомогената или другого пригодного экстракта (в собирательном значении обозначаемого в настоящем описании как гомогенат) из организма-хозяина или культуры клеток, которая экспрессирует и накапливает требуемый слитый белок в виде рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплений (RPBLA). Гомогенат, как правило, предварительно очищают (очищают) перед применением для удаления клеточного дербиса, например, посредством фильтрации. Гомогенат, содержащий подобные белковым тельцам структуры, содержащие слитый белок, (RPBLA), липиды, растворимые белки, органеллы клеток, сахара, пигменты и алкалоиды непосредственно помещают в ступенчатый градиент плотности, и гомогенат разделяют на основе плотности его составляющих, например, посредством центрифугирования. В процессе центрифугирования в гомогенате образуются части с различной плотностью с образованием части, которая содержит относительно повышенную концентрацию RPBLA, и части, которая содержит относительно сниженную концентрацию RPBLA. Требуемые содержащие слитый белок RPBLA можно собирать в интерфазе с определенной плотностью. Этот способ дает возможность выделения более приблизительно 90 процентов экспрессируемого рекомбинантного слитого белка с более чем приблизительно 80 процентной чистотой.
Другой аспект этого изобретения относится к способу выделения RPBLA из предпочтительно очищенного гомогената с помощью слоя с однородной плотностью. Здесь, предпочтительно очищенный гомогенат помещают в слой с определенной плотностью так, чтобы эндогенные примеси не проходили через слой, и разделяют центрифугированием так, чтобы плотные RPBLA проходили через слой и их можно было собирать. В гомогенате образуются описанные ранее части с различной плотностью с образованием части, которая содержит относительно повышенную концентрацию RPBLA (часть под слоем), и части, которая содержит относительно сниженную концентрацию RPBLA (часть над слоем). Таким образом, плотность рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплений выше, чем плотность слоя.
В другом варианте осуществления предпочтительно очищенный гомогенат разделяют непосредственно центрифугированием и в отсутствие сахарозы, или другого дополнительного обеспечивающего плотность раствора. Снова центрифугирование приводит к формированию частей различной плотности, образующихся в гомогенате, с образованием части, которая содержит относительно повышенную концентрацию RPBLA (осадок), и части, которая содержит относительно сниженную концентрацию RPBLA (супернатант). Затем для осуществления очистки RPBLA и, таким образом, слитого белка RPBLA можно разделять.
Настоящее изобретение относится к способу выделения рекомбинантных пептидов или белка, экспрессируемых в RPBLA, органеллах, образующихся в трансформированных клетках-хозяевах. В настоящем описании клетки-хозяева представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки высших растений, дрожжей и грибов, клетки животных, таких как культивируемые клетки млекопитающих, клетки из трансгенных животных, яйцеклетки животных и сходные с ними, и клетки водорослей. Эти клетки могут быть свежими, которые получают непосредственно из культуральной среды или живого организма, такого как лист растений или животное, или могут быть высушенными.
Рекомбинантные подобные белковым тельцам скопления обладают заранее определенной плотностью, которая может отличаться для различных слитых белков, но которая известна для конкретного слитого белка, подлежащего выделению. Эта заранее определенная плотность RPBLA, как правило, выше, чем плотность по существу всех эндогенных белков клетки-хозяина, находящихся в гомогенате, и, как правило, составляет от приблизительно 1,1 до приблизительно 1,35 г/мл. Высокая плотность новых RPBLA является следствием универсальной способности рекомбинантных слитых белков собираться в мультимеры и запасаться.
Рассматриваемые RPBLA экспрессируются у эукариот и, как правило, характеризуются их плотностями, как указано выше. При экспрессии в клетках высших растений и животных RPBLA, как правило, обладают сферической формой, имеют диаметры приблизительно 1 микрон (мк) и окружены мембраной.
Слитые белки разделяют по их плотностям, которые обычно бывают выше, чем плотность любого другого белка, находящегося в трансфицированной клетке. Это разделение на основе плотности, как правило, проводят с использованием центрифуги, как широко распространено в биохимических лабораториях по всему миру. Иллюстративная коммерчески доступная центрифуга представляет собой Beckman Coulter AvantiTM, модель J-25, которую используют здесь для пропускания через один слой и прямого центрифугирования. Ультрацентрифугу Beckman Coulter OptimaTM XL-100K (ротор SW41Ti) использовали для исследований с градиентом. Центрифугирование часто проводят в присутствии дополнительных обеспечивающих неравномерную плотность растворенных веществ, таких как соль, такая как хлорид цезия, или сахар, такой как сахароза. Объединение гомогената и обеспечивающих неравномерную плотность растворенных веществ приводит к образованию смеси гомогенат-раствор.
В конкретном варианте осуществления рекомбинантные слитые белки содержат, или предпочтительно получены из них, индуцирующие белковые тельца последовательности (PBIS), связанные пептидной связью с представляющими интерес продуктами (мишенями) (например, пептиды или белки). PBIS представляют собой белок или аминокислотные последовательности, которые обеспечивает проникновение и/или накопление белка в RPBLA. Иллюстративные неограничивающие примеры PBIS включают запасные белки или модифицированные запасные белки, такие как, например, проламины, или модифицированные проламины, или домены проламина. Проламины рассмотрены в Shewry et al., 2002 J. Exp. Bot. 53(370):947-958.
Гамма-зеин, запасной белок маиса, последовательности ДНК и аминокислотных остатков которого указаны ниже, представляет собой один из четырех проламинов маиса и составляет 10-15 процентов от общего количества белка в эндосперме маиса. Как и другие проламины злаков, альфа- и гамма-зеины биологически синтезируются в мембраносвязанных полисомах с цитоплазматической стороны шероховатого ER, собираются в просвете, а затем депонируются в происходящих из ER PB (Herman et al., 1999 Plant Cell 11:601-613; Ludevid et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:277-234; Torrent et al., 1986 Plant Mol. Biol. 7:93-403).
Гамма-зеин состоит из четырех типичных доменов i) сигнального пептида из 19 аминокислот, ii) домена с повторами, содержащего восемь единиц гексапептида PPPVHL (SEQ ID NO: 1) (53 aa), iii) домена ProX, в котором остатки пролина чередуются с другими аминокислотами (29 aa) и iv) гидрофобного богатого цистеином C-концевого домена (111 aa).
Способность гамма-зеина собираться в происходящие из ER белковые тельца (PB) не ограничивается семенами. Действительно, когда ген гамма-зеина был конститутивно экспрессирован в трансгенных растениях Arabidopsis, запасной белок накапливался в происходящих из ER рекомбинантных PB в клетках мезофилла листьев (Geli et al., 1994 Plant Cell 6:1911-1922). При поиске сигнала, ответственного за накопление гамма-зеина в происходящих из ER PB (проламины не обладают сигналом KDEL), было показано, что богатый пролином N-концевой домен, включающий домен с тандемным повтором, был необходим для поддержания ER и что C-концевой домен был вовлечен в образование PB. Однако механизмы, посредством которых эти домены обеспечивают сборку PB, остаются неизвестными. Поскольку белковые тельца называют так соответственно только в семенах, аналогичные структуры, продуцируемые в других органах растений и в невысших растениях, называются, главным образом, рекомбинантными подобными белковым тельцам скоплениями (RPBLA).
Другие иллюстративные пригодные последовательности, подобные проламину, представлены ниже в таблице, совместно с их номером доступа в GenBank.
НАЗВАНИЕ БЕЛКА | GENBANK ID |
α-Зеин (22 кДа) | M86591 |
Альбумин (32 кДа) | X70153 |
β-Зеин (14 кДа) | M13507 |
γ-Зеин (27 кДа) | X53514 |
γ-Зеин (50 кДа) | AF371263 |
δ-Зеин (18 кДа) | AF371265 |
δ-Зеин (10 кДа) | U25674 |
Глобулин или вицилин типа 7S | NM113163 |
Глобулин или легумин типа 11S | DQ256294 |
Проламин 13 кДа | AB016504 |
Проламин 16 кДа | AY427574 |
Проламин 10 кДа | AF294580 |
Кроме того, пригодные последовательности получают, проводя поиск посредством BLAST во всех неизбыточных базах данных CDS в GenBank translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF (за исключением образцов из окружающей среды), как описано в Altschul et al., 1997 Nucleic acids Res. 25:3389-3402, с использованием запроса, такого как SEQ ID NO: 2 (белковая последовательность RX3), SEQ ID NO: 3 (белковая последовательность альфа-зеина), SEQ ID NO: 4 (белковая последовательность проламина риса).
Иллюстративный модифицированный проламин включает (a) последовательность сигнального пептида, (b) последовательность одной или нескольких копий гексапептида PPPVHL (SEQ ID NO: 1) домена с повторами белка гамма-зеина, полный домен, содержащий восемь элементов гексапептида; и (c) последовательность всего или фрагмента домена ProX гамма-зеина. Иллюстративные конкретные модифицированные проламины включают полипептиды, определенные ниже как R3, RX3 и P4, последовательности ДНК и аминокислотных остатков которых также представлены ниже.
Особенно предпочтительные проламины включают гамма-зеин и составляющие его компоненты, как описано в опубликованной заявке WO2004003207, белок rP13 риса и N-концевой фрагмент альфа-зеина маиса массой 22 кДа. Последовательности ДНК и аминокислотных остатков гамма-зеина (27 кДа), белков риса и альфа-зеина представлены в SEQ ID NO: 5 (последовательность ДНК) и SEQ ID NO: 6 (белковая последовательность); SEQ ID NO: 7 (последовательность ДНК RX3) и SEQ ID NO: 8 (белковая последовательность); SEQ ID NO: 9 (последовательность ДНК R3) и SEQ ID NO: 10 (белковая последовательность); SEQ ID NO: 11 (последовательность ДНК P4) и SEQ ID NO 12 (белковая последовательность); SEQ ID NO: 13 (последовательность ДНК X10) и SEQ ID NO: 14 (белковая последовательность).
rP13 - (белковая последовательность SEQ ID NO: 15 и последовательность ДНК SEQ ID NO: 16) проламин риса массой 13 кДа, гомологичный клону - (GenBank AB016504), Sha et al., 1996 Biosci. Biotechnol. Biochem. 60(2):335-337; Wen et al., 1993 Plant Physiol. 101(3):1115-1116; Kawagoe et al., 2005 Plant Cell 17(4):1141-1153; Mullins et al., 2004 J. Agric. Food Chem. 52 (8):2242-2246; Mitsukawa et al., 1999 Biosci. Biotechnol. Biochem. 63(11):1851-1858.
22aZt - (белковая последовательность SEQ ID NO: 17 и последовательность ДНК SEQ ID NO: 18) N-концевой фрагмент альфа-зеина маиса массой 22 кДа - (GenBank V01475), Kim et al., 2002 Plant Cell 14(3):655-672; Woo et al., 2001 Plant Cell 13(10):2297-2317; Matsushima et al., 1997 Biochim. Biophys. Acta 1339(1):14-22; Thompson et al., 1992 Plant Mol. Biol. 18(4):827-833.
Примеры представляющих интерес белков включают любой белок, обладающий терапевтическим, нутрицевтическим, биорегулирующим и промышленным применением, например, такой как моноклональные антитела (mAb, такие как IgG, IgM, IgA, и т.д.) и их фрагменты, антигены для вакцин (вирус иммунодефицита человека, HIV; антигены предповерхности, поверхности и сердцевины гепатита B, коронавирус гастроэнтерита, и т.д.), гормоны (кальцитонин, гормон роста, и т.д.), ингибиторы протеаз, антибиотики, коллаген, лактоферрин человека, цитокины, промышленные ферменты (гидролазы, гликозидазы, оксидоредуктазы и т.п.). Представлены иллюстративные последовательности ДНК и аминокислотных остатков представляющих интерес иллюстративных белков (белковая последовательность SEQ ID NO: 19 и последовательность ДНК SEQ ID NO: 20), кальцитонин лосося Genbank BAC57417.
hEGF - (белковая последовательность SEQ ID NO: 21 и последовательность ДНК SEQ ID NO: 22) конструкция, в основе которой лежит GenBank AAF85790 без сигнального пептида.
hGH - конструкция, в основе которой лежит P01241 без сигнального пептида (белковая последовательность SEQ ID NO: 23 и последовательность ДНК с использованием предпочтительных для растений кодонов SEQ ID NO: 24 и с использованием природных кодонов SEQ ID NO: 25).
Кроме того, в другом варианте осуществления рекомбинантный слитый белок в дополнение к последовательностям PBIS и представляющего интерес продукта содержит спейсерную аминокислотную последовательность. Спейсерная аминокислотная последовательность может представлять собой аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментативными или химическими способами, или не расщепляемую. В конкретном варианте осуществления спейсерная аминокислотная последовательность помещена между указанным PBIS и представляющим интерес продуктом. Иллюстративная аминокислотная последовательность поддается расщеплению протеазой, такой как энтерокиназа, эндопротеаза Arg-C, эндопротеаза Glu-C, эндопротеаза Lys-C, фактор Xa и сходные с ними. Альтернативно, кодируется аминокислотная последовательность, которая поддается специфичному расщеплению химическим реагентом, например, таким как бромид цианогена, который расщепляет по остаткам метионина.
В дополнительном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, используемой для трансформации, представляет собой последовательность, как описано в соответствии с совместно поданной патентной заявкой WO 2004003207, которая включает поддающуюся расщеплению последовательность аминокислотных остатков между PBIS и представляющим интерес полипептидом. Кроме того, в другом варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность, как описано в соответствии с патентной заявкой WO 2004003207, однако последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая поддающуюся расщеплению аминокислотную последовательность, отсутствует.
В предпочтительном варианте осуществления слитые белки получают в соответствии со способом, который включает трансформацию системы клеток-хозяев, такой как животное, культура клеток животных, растение, культура клеток растений, грибы или водоросли, последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей (i) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую PBIS, которая функционально связана в рамке считывания со (ii) второй последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую представляющий интерес продукт; а именно последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует PBIS, химически связана с последовательностью, которая кодирует представляющий интерес полипептид, так чтобы оба полипептида экспрессировались из соответствующих им рамок считывания. При экспрессии полученный слитый белок запасается в трансформированной системе-хозяине в виде рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплений с высокой плотностью. В одном варианте осуществления 3'-конец первой последовательности нуклеиновой кислоты (i) соединен (связан) с 5'-концом второй последовательности нуклеиновой кислоты (ii). В другом варианте осуществления 5'-конец первой последовательности нуклеиновой кислоты (i) соединен (связан) с 3'-концом второй последовательности нуклеиновой кислоты (ii). В другом варианте осуществления PBIS содержит запасной белок или модифицированный запасной белок, его фрагмент или модифицированный фрагмент.
В другом конкретном варианте осуществления слитый белок получают в соответствии со способом, который включает трансформацию системы клеток-хозяев, такой как животное, культура клеток животных, растение, культура клеток растений, грибы или водоросли, с последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей, в дополнение к упомянутым ранее последовательностям нуклеиновых кислот (i) и (ii), последовательность нуклеиновой кислоты (iii), находящуюся в рамке считывания, которая кодирует спейсерную аминокислотную последовательность. Спейсерная аминокислотная последовательность может представлять собой аминокислотную последовательность, поддающуюся расщеплению ферментативными или химическими способами, или не поддающуюся расщеплению, как указано выше. В одном конкретном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты (iii) помещают между указанными последовательностями нуклеиновых кислот (i) и (ii), например, 3'-конец третьей последовательности нуклеиновой кислоты (iii) связан с 5'-концом второй последовательности нуклеиновой кислоты (ii). В другом варианте осуществления, 5'-конец третьей последовательности нуклеиновой кислоты (iii) связывают с 3'-концом второй последовательности нуклеиновой кислоты (ii).
Как используют в настоящем описании, термин "растительная клетка-хозяин" включает растения, включая как однодольные, так и двудольные, и, особенно, злаковые (например, маис, рис, овес и т.п.), бобовые (например, сою и т.п.), крестоцветные растения (например, Arabidopsis thaliana, кользу и т.п.) и пасленовые растения (например, картофель, томат, табак и т.п.).
Растительная система-хозяин также включает клетки растений. Клетки растений включают суспензионные культуры, зародыши, области меристемы, ткани каллюса, листья, корни, побеги, гаметофиты, спорофиты, пыльцу, семена и микроспоры. Растительная система клеток-хозяев может находиться на различных стадиях созревания и может быть выращена в жидкой или твердой культуре, или в почве, или в пригодной среде в горшках, теплицах или на полях. Экспрессия в растительных системах клеток-хозяев может быть временной или постоянной. Растительная система клеток-хозяев также относится к любому клону такого растения, семени, собственному или гибридному потомку, побегу, полученному либо половым, либо бесполым способом, и потомству любого из них, такому как побеги или семена.
Трансформацию клеток растений с использованием Agrobacterium tumefaciens, как правило, лучше всего проводить на двудольных растениях. Однодольные растения, как правило, легче трансформировать посредством так называемого генного переноса протопластов. Прямой генный перенос, как правило, проводят посредством электропорации, посредством опосредуемого полиэтиленгликолем переноса или бомбардировки клеток микроснарядами, несущими требуемую ДНК. Эти способы трансфекции хорошо известны в данной области и не требуют дополнительного обсуждения в рамках настоящего описания. Также показано, что по меньшей мере рис и маис можно трансформировать с помощью Agrobacterium. Способы регенерации целого растения из трансфицированных клеток и протопластов также хорошо известны, такими способами являются способы получения требуемого белка из тканей растений. См. также, патенты США No. 5618988 и No. 5679880 и ссылки в них.
Рассматриваемый способ также может включать выделение и растворение рекомбинантного слитого белка. Таким образом, например, RPBLA, выделенные из ступенчатого градиента плотности или слоя с однородной плотностью, суспендируют в буферном растворе, содержащем восстанавливающее вещество, и центрифугируют. Осадок удаляют, и рекомбинантный белок выделяют из супернатанта для дальнейшей очистки, если требуется, способами, такими как классические хроматографические способы.
Без дальнейшего уточнения, авторы полагают, что специалист в данной области может с использованием представленного выше описания и подробных примеров, представленных ниже, применять настоящее изобретение в его полном объеме. Следующие предпочтительные конкретные варианты осуществления, таким образом, следует толковать только как иллюстративные и не ограничивающие в любом случае остальной части описания.
Экспериментальный протокол
Пример 1: Конструирование плазмиды для трансформации растений
Кодирующие последовательности T20 и эпидермального фактора роста человека (hEGF) получали синтетически и модифицировали в целях оптимизации использования их кодонов для экспрессии в растениях.
Первую цепь последовательности кДНК, кодирующей 36 аминокислот T20, получали химическим синтезом олигонуклеотидов, и последовательность, соответствующую участку специфичного расщепления для фактора Xa и участку для фермента рестрикции, присоединяли к 5'-концу последовательности. Эту синтетическую конструкцию (SEQ ID NO: 26) очищали с помощью полиакриламидного денатурирующего геля.
Двухцепочечную кДНК получали посредством ПЦР с использованием специфичных для T20 праймеров, содержащих участки рестрикции для дальнейшего клонирования.
Праймеры:
V20 Прямой (SEQ ID NO: 27)
V20 Обратный (SEQ ID NO: 28)
Синтетический ген, кодирующий 53 аминокислоты активного hEGF получали с помощью способа ПЦР с перекрывающимся удлинением праймеров с использованием 4 олигонуклеотидов из приблизительно 60 оснований с 20 перекрывающимися основаниями. кДНК синтетического hEGF включала 5'-линкерную последовательность, соответствующую участку для специфичного расщепления фактором Xa. Олигонуклеотиды очищали с помощью полиакриламидного денатурирующего геля.
EGF1 (SEQ ID NO: 29)
EGF2 (SEQ ID NO: 30)
EGF3 (SEQ ID NO: 31)
EGF4 (SEQ ID NO: 32)
Синтетический ген, кодирующий 191 аминокислоту активного hGH получали с помощью способа ПЦР с перекрывающимся удлинением праймеров с использованием 15 олигонуклеотидов из приблизительно 60 оснований с 20 перекрывающимися основаниями. кДНК синтетического hGH включала 5'-линкерную последовательность, соответствующую специфичному для энтерокиназы участку расщепления. Олигонуклеотиды очищали с помощью полиакриламидного денатурирующего геля.
hGH1 (SEQ ID NO: 33)
hGH2 (SEQ ID NO: 34)
hGH3 (SEQ ID NO: 35)
hGH4 (SEQ ID NO: 36)
hGH5 (SEQ ID NO: 37)
hGH6 (SEQ ID NO: 38)
hGH7 (SEQ ID NO: 39)
hGH8 (SEQ ID NO: 40)
hGH9 (SEQ ID N0: 41)
hGH10 (SEQ ID NO: 42)
hGH11 (SEQ ID NO: 43)
hGH12 (SEQ ID NO: 44)
hGH13 (SEQ ID NO: 45)
hGH14 (SEQ ID NO: 46)
hGH15 (SEQ ID NO: 47)
кДНК синтетических T20 и hEGF очищали из агарозного геля (Amersham) и клонировали в вектор pGEM (Promega). Фрагмент кДНК RX3 (кодирующий N-концевой домен гамма-зеина), содержащий "липкие концы" BspHI и NcoI, встраивали в вектор pCKGFPS65C (Reichel et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sd. USA 93:5888-5893), предварительно расщепленный NcoI (как описано в патентной заявке WO2004003207). Проводили слияние последовательностей, кодирующих T20 и EGF, в рамке считывания с последовательностью RX3. Конструкции RX3-T20 и RX3-EGF получали посредством замены кодирующей GFP последовательности синтетическим геном T20 и EGF.
Полученные в результате конструкции, обозначенные pCRX3T20 и pCRX3EGF, содержали последовательность нуклеиновой кислоты, которая направляет транскрипцию белка, такую как усиленный промотор 35S (SED ID NO: 1), энхансер трансляции, такой как вирус гравировки табака (TEV), кодирующие T20 и EGF последовательности и 3'-последовательности для полиаденилирования из вируса мозаики цветной капусты (CaMV). В результате посредством встраивания экспрессирующих кассет HindIII/HindIII в бинарный вектор pBin19 получали эффективные векторы для трансформации растений pl9RX3T20 и pl9RX3EGF (Bevan, 1984 Nucleic acids Research 12:8711-8721).
Проводили слияние кДНК, кодирующей hGH с N-концевой кодирующей гамма-зеин последовательностью RX3 (патент WO2004003207), и ее встраивали в полученную из pUC18 плазмиду, содержащую усиленный промотор CaMV 35S и 3'-терминатор ocs. Экспрессирующую кассету из полученной из pUC18 плазмиды, названной pUC18RX3hGH, которая содержала последовательность соответствующего слитого белка RX3-hGH, встраивали в бинарный вектор pBin19 (Bevan, 1984 Nucleic acids Research 12:8711-8721).
кДНК, кодирующую альфа-зеин массой 22 кДа (22aZ) и проламин риса массой 13 кДа (rP13), амплифицировали посредством ОТ-ПЦР из библиотеки кДНК из маиса W64A и риса сорта Senia соответственно. Используемые в реакции ПЦР олигонуклеотиды представляли собой:
22aZ-5' (SEQ ID NO: 48)
22aZ-3' (SEQ ID NO: 49)
Rice13Prol-5' (SEQ ID NO: 50)
Rice13Prol-3' (SEQ ID NO: 51)
Соответствующие фрагменты ПЦР клонировали в вектор pCRII вектор (Invitrogen), секвенировали и клонировали в векторы pUC18, содержащие усиленный промотор CaMV 35S, последовательность TEV и 3'-терминатор ocs. pCRII-rP13 расщепляли посредством SalI и NcoI и клонировали в плазмиды pUC18RX3Ct, pUC18RX3hGH и pUC18RX3EGF, расщепленные указанными ферментами с получением соответственно: pUC18rP13Ct, pUC18rP13hGH и pUC18rPl3EGF. pCRII-22aZ расщепляли посредством SalI/NcoI и клонировали в плазмиды pUC18RX3Ct и pUC18RX3EGF, расщепленные указанными ферментами с получением pUC1822aZtCt и pUC1822aZtEGF соответственно. pCRII-22aZ также расщепляли посредством SalI/RcaI и клонировали в плазмиду pUC18RX3hGH, расщепленную посредством SalI/NcoI с получением клона pUC1822aZhGH. Наконец, все эти полученные из pUC18 векторы клонировали в pCambia 5300 посредством HindIII/EcoRI.
Пример 2: Конструирование плазмиды для трансформации клеток животных и дрожжей
Клетки животных
Проводили слияние синтетического гена, соответствующего последовательности зрелого кальцитонина (Ct, WO2004003207) и последовательностям EGF, а также кДНК, кодирующей hGH, с N-концевой кодирующей последовательностью гамма-зеина RX3 (патент WO2004003207) и его встраивали в вектор pUC18. Рестрикционные фрагменты SalI-BamHI из полученных из pUC18 плазмид pUC18RX3Ct, pUC18RX3EGF и pUC18RX3hGH, содержащих последовательности соответствующих слитых белков RX3-Ct, RX3-EGF и RX3-hGH, встраивали в вектор pсДНК3.1-(Invitrogen), расщепленный XhoI-BamHI. В полученных конструкциях, названных p3.1RX3CT, p3.1RX3EGF и p3.1RX3hGH, последовательности слитого белка находились под действием промотора CMV и терминатора pA BGH.
Клетки дрожжей
Рестрикционные фрагменты SalI (тупые концы)-BamHI из полученных из pUC18 плазмид, описанных выше, содержащие последовательности соответствующих слитых белков RX3-EGF и RX3-hGH, встраивали в вектор pYX243 (R&D Systems), расщепленный EcoRI (тупые концы)-BamHI. В полученных конструкциях, обозначенных c117 и c118 соответственно, последовательности слитых белков находились под действием индуцибельного промотора GAL.
Пример 3: Трансформация хозяина
Дрожжи
Штамм leu2 Saccharomyces cerevisiae трансформировали плазмидными конструкциями c117 и c118 способом LiAc (Ito et al. 1983, J. Bacteriol. 153:163-168) и трансформанты отбирали на чашках Leu-. Анализ экспрессии проводили посредством выращивания трансформантов в содержащей галактозу среде.
Растительный материал
Растения табака (Nicotiana tabacum var. Wisconsin) выращивали в камере для выращивания in vitro при 24-26°C с 16-часовым световым периодом. Взрослые растения выращивали в теплице между 18-28°C, влажность поддерживали между 55 и 65% со средним световым периодом 16 часов.
Проростки для способа агроинфильтрации (Vaquero et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 96 (20): 11128-11133; Kapila et al., 1997 Plant Sci. 122:101-108) выращивали из семян в течение 4-6 недель в условиях in vitro, описанных выше.
Стабильная трансформация табака
Бинарные векторы переносили в штамм LBA4404 A. tumefaciens. Пластины листьев табака (Nicotiana tobaccum, W38) трансформировали, как описано Draper and Hamil 1988. В: Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual (Eds. Draper, J., Scott, R., Armitage, P. and Walden, R.), Blackwell Scientific Publications. Регенерированные растения отбирали на среде, содержащей 200 мг/л канамицина, и переносили в теплицу. Трансгенные растения табака, обладающие наивысшими уровнями трансгенного продукта, культивировали с получением поколений T1 и T2.
Уровень рекомбинантного белка определяли с помощью иммуноблота. Общие экстракты белков из листьев табака количественно определяли посредством анализа Брэдфорда, разделяли на 15% SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозные мембраны с использованием Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (Bio Rad). Мембраны инкубировали с антисывороткой против гамма-зеина (разведение 1/7000) (Ludevid et al. 1985, Plant Science 41:41-48), а затем инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена антителами (разведение 1/10000, Amersham Pharmacia). Иммунореактивные полосы определяли по повышенной хемилюминесценции (система для вестерн-блоттинга ECL, Amersham Pharmacia).
Агроинфильтрация табака
Проростки для способа агроинфильтрации выращивали из семян в течение 4-6 недель в камере для выращивания in vitro при 24-26°C со световым периодом 16 часов.
Штамм LB4404 A. tumefaciens, содержащий требуемую конструкцию, выращивали на среде LB (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl), дополненной канамицином (50 мг/л) и рифампицином (100 мг/л) при 28°C с помощью устройства для встряхивания (250 об/мин) в течение ночи (приблизительно 18 часов). Затем агробактерии инокулировали в 30 мл LB, также дополненную канамицином (50 мг/л) и рифампицином (100 мг/л). После культивирования в течение ночи при 28°C (приблизительно 18 часов), клетки агробактерий собирали посредством центрифугирования в течение 10 минут при 3000 × g и ресуспендировали в 10 мл жидкой среды MS с 4,9 г/л MES (Sigma Chemical) и 30 г/л сахарозы при pH 5,8. Для агроинфильтрации бактериальную культуру доводили до конечной OD600, составляющей 0,1. Затем культуру клеток дополняли ацетосирингоном до конечной концентрации, составляющей 0,2 мМ, и инкубировали в течение 90 минут при 28°C.
Для агроинфильтрации проростки полностью покрывали суспензией и применяли вакуум (100 кПа) в течение 5-6 секунд. Суспензию удаляли и поддерживали в камере для выращивания при 24-26°C со световым периодом 16 часов в течение четырех суток. Материал проростков выделяли, и общий экстракт белков анализировали с помощью иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина.
Трансформация клеток животных
Конструкции p3.1RX3.EGF и p3.1RX3.hGH встраивали в культивируемые клетки млекопитающих 293T, Cos1 или CHO посредством способа трансфекции на основе липофектамина (Invitrogen). Клетки, трансфицированные плазмидой pECFP-N1 (Clontech), содержащей последовательность гена усиленного модифицированного GFP с голубой флуоресценцией, использовали в качестве контроля.
Пример 4: Экстракция белка из листьев табака
Свежий растительный материал
Растительный материал (влажные или сухие листья табака или проростки) погружали в жидкий азот и гомогенизировали с помощью буфера для экстракции T, содержащего 50 мМ Трис-HCl, pH 8, 200 мМ дитиотреитол (DTT) и ингибиторы протеаз [10 мкМ апротинин, 1 мкМ пепстатин, 100 мкМ леупептин, 100 мкМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF) и 100 мкМ E64 (Sigma Chemical)]. Гомогенаты центрифугировали при 10000 × g в течение 30 минут при 4°C для удаления нерастворимых веществ. Все растворимые белки (TSP) количественно определяли с использованием анализа белков Бредфорда (BioRad).
Сухие листья табака и экстракция белка
Взрослые трансгенные листья табака и взрослые листья табака дикого типа высушивали в помещении при температуре 37°C в течение двух недель на фильтровальной бумаге. Через две недели листья разрезали и хранили при комнатной температуре в течение 5 месяцев. Все растворимые белки сухого материала экстрагировали, как описано для свежего материала, и анализировали с помощью вестерн-блота.
Пример 5: Получение RPBLA
Гомогенизация
Свежие и высушенные трансгенные листья табака и агроинфильтрированные проростки табака (временная трансформация) помещали в ступку и растирали при 0°C в буфере для экстракции PBP, содержащем 100 мМ Трис, pH 8, 50 мМ KCl, 6 мМ MgCl2, 10 мМ ЭДТА, дополненном 10% сахарозой и ингибиторами протеаз (PMSF, леупептин, апротинин, E-64). Гомогенат дополнительно помещали в лед с использованием политрона (IKA T25 Basic, 24,000 об/мин) с небольшим ротором (диаметр 7,5 мМ), приблизительно десять раз в течение 3-4 секунд. Твердое вещество удаляли фильтрованием через четыре слоя Miracloth (22-24 микрометра) (Calbiochem) для удаления неразрушенной ткани и клеток.
Пример 6: Белки из клеток животных
Трансфицированные клетки выделяли из культуральных планшетов соскабливанием и их суспендировали в среде для гомогенизации B (10 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 0,9% NaCl, 5 мМ ЭДТА с ингибиторами протеаз). Суспензию отбирали в 5 мл шприц, с установленной иглой калибра 23, и ее выталкивали приблизительно 30 раз. Разрушение клеток контролировали с помощью фазово-контрастного микроскопа. Гомогенат помещали в ступенчатый градиент сахарозы и центрифугировали, как описано для гомогенатов листьев табака.
Накопление слитых белков во временно трансфицированных клетках анализировали с помощью вестерн-блота с использованием антител против гамма-зеина, индуцированных против гамма-зеина. Через 48 часов трансфекции все растворимые белки клеток экстрагировали с помощью буфера A (100 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 0,5% SDS, 0,5% Triton X-100, 2% 2-меркаптоэтанол и ингибиторы протеаз). Аликвоты среды для инкубации осаждали и хранили при -20°C. Белки, экстрагированные из эквивалентных количеств трансфицированных клеток и среды, разделяли посредством SDS-гель-электрофореза в полиакриламидном геле и переносили на нитроцеллюлозные пластинки для иммунодетекции.
Пример 7: Разделение с помощью прерывистого градиента
Гомогенат центрифугировали при 50 × g в течение 5 минут при 4°C с получением очищенного экстракта. В случае прерывистого градиента сахарозы, этот очищенный гомогенат (супернатант) наслаивали на ступенчатый градиент, состоящий из 2,5 мл 20%-30%-42%-56% (масс./масс.) или 42%-49%-56%-65% (масс./масс.) сахарозы в буфере PBP и его центрифугировали (ультрацентрифуга Beckman Coulter OptimaTM XL-100K) при 80000 × g в роторе с качающейся емкостью (SW41Ti) при 4°C в течение 120 минут без торможения.
Отбирали фракции супернатанта, интерфаз и осадка. Эквивалентные аликвоты фракций супернатанта, интерфазы и осадка осаждали посредством 15% TCA и анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблота с использованием специфичных антител против экспрессируемых слитых белков. Белки RX3-EGF, RX3-T20, RX3-Ct и RX3-INF определяли с помощью вестерн-блота с использованием антител против гамма-зеина. Электрофоретические гели анализировали посредством окрашивания серебром в соответствии с Morrissey et al., 1981 Anal. Biochem. 117:307-310, для оценки повышения содержания рекомбинантного белка относительно нежелательных белков внутри PB.
Пример 8: Разделение посредством однородного слоя
Гомогенат, полученный как описано выше, центрифугировали в 42% (масс./масс.) слое сахарозы объемом 8 мл (1,18 г/см3) в течение 120 минут при 24000 g при 4°C. Выделяли фракции супернатанта, интерфазы и осадка. RPBLA осаждаются на в нижней части слоя. Для анализа белка эквивалентные аликвоты этих фракций осаждали в 15% TCA, и образцы разделяли в 15% SDS-PAGE и анализировали окрашиванием серебром. Рекомбинантные белки, находящиеся во фракции PB, определяли с помощью иммуноблота с использованием антител против гамма-зеина.
Пример 9: Выделение рекомбинантного белка из выделенных RPBLA
RPBLA, выделенные из 42%-56% (масс./масс.) интерфазы ступенчатых градиентов сахарозы или выделенные посредством слоя с определенной плотностью с 42% (масс./масс.) сахарозой, промывали в буфере PBP и выделяли с помощью кратковременного центрифугирования в течение 5 минут при 16000 × g. Рекомбинантные белки, накопившиеся внутри RPBLA, растворяли в одном объеме буфера SB, содержащего 12,5 мМ борат натрия, pH 8, 0,1% SDS и 2% 2-меркаптоэтанол. Раствор инкубировали в течение ночи (приблизительно 18 часов) при 37°C. Одну аликвоту центрифугировали 10 минут при 16000 × g при комнатной температуре, и супернатант и осадок анализировали посредством SDS-PAGE и вестерн-блота для оценки полного растворения белка.
Пример 10: Белки из трансфицированных клеток дрожжей
Осаждали S. cerevisiae, экспрессирующие рекомбинантные слитые белки. Аликвоты соответствующей среды для инкубации осаждали и хранили при -20°C для анализа. Осадки клеток также замораживали, и после размораживания клетки разбивали стандартными способами с использованием стеклянных гранул и среды Y (50 мМ HCl-Tris pH 8,0, 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 200 мМ DTT и ингибиторы протеаз). Эквивалентные количества и клеток, и среды анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблота с использованием специфичных антител против рекомбинантных экспрессируемых белков.
Способ разрушения, применяемый для выделения органелл из трансформированных клеток дрожжей, основан на мягком лизисе сферопластов, описанном в Zinser et al., 1995 Yeast, 11:493-536. Тридцать мл культивируемых трансформированных клеток дрожжей (DO600 приблизительно 0,5) осаждали, промывали 1 M сорбитом и суспендировали в 1 мл буфере для сферопластов (1 M сорбит, 50 мМ фосфат калия, pH 7,5, 14 мМ 2-меркаптоэтанол), содержащем 100 единиц/мл зимолазы. В течение 20-30 минут при 30°C при периодическом осторожном перемешивании давали возможность образоваться сферопластам. После осаждения при 1000 g в течение 6 минут сферопласты промывали буфером для сферопластов без 2-меркаптоэтанола и ресуспендировали в 0,5 мл ледяном буфере для лизиса (0,3 M сорбит, 10 мМ триэтаноламин, 1 мМ ЭДТА и ингибиторы протеаз). После 20 минут во льду при периодическом осторожном перемешивании, лизаты доводили до конечной концентрации 1,0 M сорбита. Лизаты помещали на ступенчатый градиент сахарозы и центрифугировали, как описано для гомогенатов листьев табака. Фракции анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблота.
Результаты
Пример A: Выделение (очистка) RPBLA с помощью градиента плотности из вегетативных тканей трансгенных растений
Гены, кодирующие полученные на основе гамма-зеина слитые белки RX3-EGF и RX3-T20, встраивали в растения табака посредством Agrobacterium tumefaciens. Для определения тех растений, у которых экспрессия рекомбинантного белка была более высокой, трансформированные растения анализировали с помощью иммуноблота. На фиг.2,A представлен образец обоих белков RX3EGF и RX3T20. Следует отметить, что оба рекомбинантных белка представлены в виде правильно запасаемых белков во всех линиях трансгенных растений. Преобладающие нижние полосы соответствуют мономерным формам слитых белков, и более высокие полосы соответствуют димерам. Слитые белки, как правило, запасаются в виде мультимеров, и количество мономеров и олигомеров, определяемых в иммуноблотах, зависит от степени восстановления дисульфидных связей.
Экстракты листьев табака помещали в ступенчатые градиенты плотности, и накопление рекомбинантных белков в различных фракциях анализировали с помощью иммуноблота (фиг.2,B). Результаты, представленные на фиг.2,B, показывают, что RX3-EGF был представлен во фракциях, соответствующих плотным RPBLA. Большинство из этих органелл обладали плотностями выше 1,2632 (F56, дорожка 6), и для значительной части из них показана плотность выше 1,3163 г/см3; (F65, дорожка 7). Слитый белок RX3-T20 находился в интерфазе 49%-56% сахарозы (дорожка 12), указывая на то, что RPBLA, содержащие RX3-T20, обладают плотностью выше 1,2241 г/см3, где значительная часть из них обладает плотностью выше 1,2632, и значительная часть обладает плотностями выше 1,2632 (дорожка 13).
Эти новые RPBLA, сформированные в листьях табака, обладают плотностями, находящимися в диапазоне плотностей природных белковых телец маиса (Ludevid et al., 1984 Plant Mol. Biol. 3:227-234; Lending et al., 1989 Plant Cell 1:1011-1023), или являются еще более плотными. Следует отметить, что PB RX3-T20 являются в некоторой степени (немного) менее плотными, чем PB RX3-EGF, это объясняется некоторыми конкретными свойствами представляющего интерес белка. Таким образом, несмотря на то что RPBLA, накапливающие рекомбинантные слитые белки, обладают высокими плотностями относительно обычно представленных растворимых компонентов клеток, свойства белка, слитого с доменом RX3, могут определять изменения такой плотности.
Было установлено, что более 90 процентов обоих рекомбинантных белков были выделены из фракций плотных RPBLA и осадка (см. фиг.2,B). Таким образом, выделение RPBLA на основе плотности, по-видимому, является пригодной системой для очистки (концентрации) слитых белков.
Для оценки очистки рекомбинантного белка RX3-EGF посредством выделения RPBLA, фракции с различной плотностью анализировали посредством окрашивания серебром (фиг.2,C). Как можно видеть на окрашенном геле, более 90 процентов эндогенных белков табака были локализованы в растворимой (S) фракции и фракции интерфазы (F422 и F49) градиента, во фракциях, в которых белок RX3-EGF отсутствовал или слабо определялся (см. фиг.2,B). Таким образом, растворимые белки и основной объем белков, представленных в менее плотных органеллах, можно удалить, отбирая одну или две фракции (F56 и F65) градиента.
В отношении степени очистки слитых белков во фракциях RPBLA (F56 и F65) было установлено, что белок RX3-EGF составляет приблизительно 80 процентов белков, определяемых в содержащих PBLS фракциях. Этот результат показывает, что с использованием процесса выделения RPBLA можно добиться существенного увеличения содержания слитых белков всего за одну стадию очистки.
Пример B: Выделение рекомбинантных белков в RPBLA, выделенных из сухих тканей растений
Важным моментом молекулярного культивирования является наличие простых способов хранения растительной биомассы. В связи с этим, высушивание может представлять собой удобный способ снижения объема для хранения и сохранения продукта. Тем не менее, высушивание часто приводит к деградации представляющих интерес белков. Применение высушенных растений для выделения RPBLA, содержащих рекомбинантные белки, представляло бы большой интерес для промышленных целей.
Трансформированные листья табака, запасающие слитые белки RX3-EGF и RX3-T20, как описано выше, высушивали, как также описано выше. Через 5 месяцев хранения в сухом виде, анализировали стабильность рекомбинантных белков. Экстракты белков из эквивалентных количеств влажной (свежей) (W, дорожка 1) и сухой (D, дорожка 2) ткани листьев анализировали с помощью иммуноблота (фиг.2,D). Как можно видеть на фигуре, белок RX3-EGF был стабильным в высушенных трансформированных растениях, где количества, выделенные из влажных и сухих растений, оказались сходными (для сравнения дорожки W и D).
Распределение ступенчатых градиентов плотности слитых белков (RX3EGF и RX3T20) из гомогенатов высушенных листьев анализировали с помощью иммуноблота (фиг.2,D, дорожки 3-7). Интересно, что оба слитых белка, главным образом, выделяли из плотных структур, обладающих плотностями выше 1,1868 г/см3 (фракция F42) и 1,2632 г/см3 (фракция F56).
Таким образом, рекомбинантные белки можно очищать из высушенных тканей посредством выделения RPBLA, что говорит о том, что сбор трансгенных растений и экстракция и очистка рекомбинантного белка, таким образом, могут быть независимы по времени. В соответствии с этими результатами слитые белки гамма-зеина также накапливались в RPBLA в семенах риса.
Пример C: Выделение рекомбинантного белка посредством выделения RPBLA из временно трансформированных проростков табака
Системы с временной экспрессией могут представлять собой удобный инструмент для исследования характера накопления рекомбинантных белков в короткий период времени. Так рекомбинантные белки RX3-EGF и RX3-T20 также экспрессировались и накапливались во временно трансформированных посредством агроинфильтрации проростках табака. Для экстрактов белков из трансформированных проростков, проанализированных с помощью иммуноблота (фиг.3,A), показана характерная сложная электрофоретическая картина, которую наблюдали для стабильно трансформированных растений (для сравнения фиг.3,A, дорожка 4 и фиг.2,A, дорожка 4), указывая на то, что слитые белки запасаются правильно при использовании этого способа трансформации.
Экспрессию слитого белка RX3-hGH с более высокой молекулярной массой также анализировали во временно трансформированном табаке (фиг.3,A, дорожка 4). После субклеточного фракционирования в градиентах плотности оба слитых белка RX3-T20 и RX3-hGH были выделены в плотных фракциях, соответствующих фракциям RPBLA (фиг.3,B, дорожки 4, 5 и 9, 10), демонстрируя плотности выше 1,1868 г/см3 (F42) и 1,2632 г/см3 (F56). Временную экспрессию, таким образом, можно использовать для анализа в течение короткого периода времени конкретных свойств, касающихся плотности, PB, содержащих требуемый рекомбинантный белок.
Пример D: Выделение рекомбинантных белков посредством центрифугирования при низкой и средней скорости
Для упрощения процесса, используемого для очистки рекомбинантных белков посредством плотных рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплений, проводили два дополнительных альтернативных способа: i) очищенные гомогенаты центрифугировали только через один плотный слой сахарозы (фиг.4,A, B), и ii) очищенные гомогенаты просто центрифугировали посредством центрифугирования при низкой скорости (т.е. 1000-2500 × g в течение 10 минут).
В соответствии с ранее описанными результатами, оба белка RX3-EGF и RX3-T20 были выделены с высоким выходом (более 90%) в осадках, полученных после центрифугирования через слой сахарозы с плотностью 1,1868 г/см3 (фиг.4,A, дорожки 4 и 6). Кроме того, степень очистки белка RX3-EGF была очень высокой, как можно видеть на окрашенном серебром геле на фиг.4,B, где нежелательные эндогенные белки табака слабо определялись в соответствующем осадке (дорожка 4).
Принципиальное преимущество этого способа по сравнению со ступенчатыми градиентами плотности основано на его простой расширяемости для промышленного производства рекомбинантных белков. Следует отметить, что слой с определенной плотностью, а также другие свойства, такие как вязкость и осмолярность, можно подбирать в каждом случае в целях оптимизации выделения и очистки рекомбинантных белков.
Кроме того, для концентрирования и очистки содержащих слитый белок подобных белковым тельцам структур также анализировали центрифугирование при низкой скорости (LSC) (фиг.4,C, LSC). Результаты показали, что после 1000 × g в течение 10 минут практически весь слитый белок RX3-EGF был выделен из осадка (фиг.4,C дорожка 2). Однако окрашивание белков, находящихся в этом осадке, выявило, что слитый белок не был высоко чистым по сравнению с белком, полученным после центрифугирования через слой сахарозы с плотностью 1,1868 г/см3 (фиг.4,C, для сравнения дорожки 3 и 7).
Соответственно, первый осадок, полученный посредством центрифугирования при низкой скорости, промывали с использованием буфера, содержащего 5% Triton X-100. После промывания образец центрифугировали при 12000 × g в течение 5 минут и, что интересно, большое количество нежелательных белков, находящихся в осадке P1, удалялось после промывания и центрифугирования, и новый осадок (P2, фиг.4,C, дорожка 9) содержал значительно увеличенное содержание белка RX3-EGF. Следует отметить, что количество, а также картина для белков на дорожке 9, являются сходными с количеством и картиной для белков, полученных после промывания осадка, полученного после центрифугирования через слой сахарозы в содержащем Triton X-100 буфере (фиг.4,C, дорожка 5). В основе варианта с центрифугированием при низкой скорости лежит высокая плотность структур, содержащих слитые белки, и условия центрифугирования можно оптимизировать для каждой мишени перед масштабированием.
Пример E: Выделение рекомбинантного белка посредством выделения RPBLA из трансфицированных клеток животных
Были проведены исследования для определения того, индуцируют ли происходящие из запасных белков слитые белки образование плотных рекомбинантных подобных PB скоплений также в трансфицированных клетках животных. Субклеточное распределение органелл из гомогенизированных трансфицированных клеток млекопитающих анализировали посредством применения ступенчатых градиентов плотности. Три различных типа культур клеток, 293T (из человека), Cos1 (из обезьяны) и CHO (из хомяка), трансфицировали с использованием кДНК, кодирующей три различных слитых белка, RX3-Ct, RX3-EGF и RX3-hGH. Клетки Cos1, трансфицированные pECFP-N1 (Clontech), использовали в качестве контроля. Фракции градиента собирали, как описано ранее, и анализировали с помощью иммуноблота (фиг.5,A).
Рекомбинантные полученные из RX3 белки, экспрессированные в трансфицированных клетках, определяли с использованием антисыворотки против гамма-зеина. Определения контрольного ECGP в различных собранных фракциях проводили с использованием антисыворотки против GFP, индуцированной у кроликов.
Как ожидалось, растворимый белок ECGP выделяли из фракции супернатанта (S, фиг.5,A, дорожка 2), и никаких следов этого белка не было выявлено во фракциях интерфазы и осадка, где осаждались дисперсные фракции клеток. Напротив, RX3CT, RX3EGF и RX3hGH, главным образом, находились в плотных фракциях F30, F42 и F56 (фиг.5,A), что говорит о том, что полученные из гамма-зеина слитые белки можно выделять из этих плотных фракций (плотности от 1,1270 до 1,2632 г/см3). Эти результаты согласуются с результатами, полученными посредством иммуноцитохимии, где слитые белки были локализованы в ER и в рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплениях с диаметром от приблизительно 1 до приблизительно 1,4 микрон.
Значительное количество рекомбинантного белка было выделено из растворимой фракции градиентов из трансфицированных RX3-Ct и RX3-hGH клеток. Это, возможно, является следствием избыточного разрушения клеток в процессе гомогенизации, которое приводит к растворению еще не собранных слитых белков, находящихся в ER.
Центрифугирование при низкой скорости (LSC, фиг.5,B) также оценивали с использованием гомогенатов из экспрессирующих RX3-EGF клеток CHO. Как можно видеть на фиг.5,B, большое количество слитого белка было выделено из осадка после 2500 × g (дорожка 2), что подтверждает то, что слитые белки накапливаются в плотных подобных белковым тельцам структурах в клетках животных, которые можно выделять способами на основе плотности.
Пример F: Выделение рекомбинантных белков из трансформированных дрожжей с помощью градиентов плотности
Образование плотных структур, содержащих слитые белки, в трансформированных дрожжах также анализировали посредством ступенчатых градиентов плотности. кДНК, кодирующие слитые белки RX3-EGF и RX3-hGH, встраивали посредством вектора для трансформации дрожжей в Sacharomyces cerevisiae с использованием стандартных способов. Способ разрушения, примененный для выделения органелл, был основан на мягком лизисе сферопластов, как описано в способах. Лизаты помещали на ступенчатый градиент сахарозы и центрифугировали, как описано для клеток млекопитающих или гомогенатов листьев табака. Фракции анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблота.
Результаты фракционирования представлены на фиг.6, где можно видеть, что большая часть обоих белков RX3-EGF и RX3-hGH была локализована в интерфазе F30 (фиг.6, дорожка 4) градиентов. Эта фракция содержит субклеточные структуры с плотностями между 1,1270 и 1,1868 г/см3. Значительных количеств слитых белков в супернатанте и фракции F20 выявлено не было, что указывает на то, что слитые белки накапливаются в дрожжевых клетках. Возможно, что только небольшой размер клеток дрожжей (вплоть до 3 микрон) обеспечивает образование небольших RPBLA, которые обладают меньшей плотностью, чем RPBLA, выявляемые в растениях и клетках. В любом случае, их можно выделять и очищать от других клеточных белков посредством центрифугирования.
Пример G: Отделение слитых белков от различных доменов запасных белков посредством градиентов плотности
Способ очистки полученных из гамма-зеина слитых белков на основе их свойств, касающихся плотности, можно применять для слитых белков, полученных из других запасных белков. Здесь авторы настоящего изобретения показывают, каким образом слитые белки, полученные из проламина риса массой 13 кДа (rP13) и из альфа-зеина массой 22 кДа (22aZt), накапливаются в плотных фракциях, соответствующих RPBLA на ступенчатых градиентах сахарозы (фиг.7). Выбор проламина риса массой 13 кДа (rP13) и альфа-зеина массой 22 кДа [в полноразмерном варианте (22aZ) или N-концевого домена (22aZt)] был основан на отсутствии гомологии между ними и относительно домена RX3. Неожиданно, оба запасных белка образовывали RPBLA, которые были выделены в более плотных интерфазах, после того, как их подвергали ступенчатому градиенту плотности (фиг.7,A).
Проводили слияние последовательности кальцитонина в рамке считывания с последовательностями rP13 и 22aZt под действием промотора CaMV35S и осуществляли встраивание в Agrobacterium tumefaciens. Проростки табака временно трансформировали, и гомогенаты листьев подвергали ступенчатым градиентам плотности. Собранные фракции анализировали с помощью SDS-PAGE и иммуноблота с использованием антисыворотки против кальцитонина, индуцированной у кроликов.
Как можно видеть на фиг.7,A (дорожки 4-5, и 9-10), большие количества обоих слитых белков rP13Ct и 22aZtCt были локализованы во фракциях F42 и F56, указывая на наличие рекомбинантных подобных PB скоплений с плотностями, превышающими 1,1868 г/см3, которые можно выделять для очистки слитого белка. Результаты также указывают на то, что плотность рекомбинантных подобных PB скоплений, содержащих слитые белки, может варьировать в зависимости от запасного белка, участвующего в слиянии.
Исследования по агроинфильтрации проводили с hGH, слитым с проламином риса (rP13-hGH) и полноразмерным альфа-зеином (22aZ-hGH). Снова, большая часть RPBLA наблюдалась во фракциях F42 и F56, 7,A (дорожка 4-5 и дорожки 9-10), однако интересно, что в то же время не образовавший скоплений слитый белок также был выявлен в супернатанте и интерфазах с низкой плотностью (дорожки 1-2 и 6-7). Этот эффект можно объяснить частичным эффектом растворения hGH на rP13 и 22aZ.
Трансгенные растения табака, экспрессирующие слитые белки rP13-EGF и 22aZ-EGF, получали посредством трансформации с помощью Agrobacterium tumefasciens. Растения с наивысшей экспрессией определяли с помощью иммуноблота с использованием антитела против EGF, и эти клеточные линии использовали в сравнительном анализе с проростками табака, агроинфильтрированными теми же конструкциями. Как можно видеть на фиг.7 (A, дорожки 4 и 9; B, дорожка 3) во всех случаях, RPBLA были выделены в определенной интерфазе (F12), что подразумевает, что RPBLA являются высоко плотными и гомогенными.
Все эти результаты, взятые вместе, позволяют понять, что проламины способны индуцировать RPBLA с высокой плотностью, даже когда они являются слитыми с другими белками. Это представляет собой неожиданный результат, главным образом, в связи с тем, что почти никакой гомологии между ними не выявлено. Более того, существуют некоторые данные, позволяющие предположить, что проламины взаимодействуют для стабилизации белковых телец и что некоторые из них не являются стабильными при экспрессии в вегетативной ткани по отдельности, например, такие как альфа-зеин (Coleman et al., 1996 Plant Cell 8:2335-2345).
Пример H: Экстракция рекомбинантных белков из выделенных PBLS
Было показано, что выделение плотных рекомбинантных подобных PB скоплений является преимущественным способом для выделения рекомбинантных белков с высоким выходом и высоким уровнем очистки из трансгенных организмов. Здесь было показано, что эти рекомбинантные белки можно экстрагировать из запасающих органелл. Несмотря на то что рекомбинантные PBLA можно непосредственно использовать в некоторых способах применения (т.е. получение пероральной вакцины), в некоторых других случаях может быть необходимым использование очищенных рекомбинантных белков.
После инкубации в течение ночи (приблизительно 18 часов) фракций PB при 37°C в буфере, содержащем восстановители (обработка буфером SB, который содержит 12,5 мМ борат натрия, pH 8, 0,1% SDS и 2% 2-меркаптоэтанол), белки RX3-EGF и RX3-T20 растворялись. Как можно видеть на фиг.8, дорожки 1-4 для RX3-EGF и дорожки 6-7 для RX3-T20, оба экстрагированных слитых белка были выделены в их растворимых формах (S). Впоследствии, в зависимости от способа их применения, экстрагированные белки можно подвергать дальнейшей очистке или использовать в качестве частично очищенных экстрактов.
Все патенты и статьи, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок. Использование неопределенного артикля подразумевает, что он включает один или несколько.
Приведенное выше описание и примеры представлены в качестве иллюстративных и их не следует толковать как ограничивающие. Возможны другие варианты в пределах сущности и объема этого изобретения, и они будут легко доступны специалистам в данной области.
Claims (15)
1. Способ очистки рекомбинантного слитого белка, экспрессированного в качестве рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплений (RPBLA) в клетках-хозяевах, который включает стадии:
(a) получения водного гомогената, полученного путем гомогенизации в буфере трансформированных клеток-хозяев, которые продуцируют слитый белок в виде рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплений (RPBLA), где указанные RPBLA обладают заранее определенной плотностью, где указанные RPBLA обладают плотностью, составляющей от приблизительно 1,1 до приблизительно 1,35 г/мл, и где указанный слитый белок содержит две последовательности, связанные друг с другом, в которых одна последовательность представляет собой индуцирующую белковые тельца последовательность, и другая представляет собой последовательность представляющего интерес продукта, где индуцирующая белковые тельца последовательность содержит проламин или модифицированный проламин;
(b) образования фракций с различной плотностью в гомогенате путем центрифугирования гомогената в отсутствие дополнительного обеспечивающего плотность раствора или с помощью слоя с определенной плотностью, обладающего плотностью меньшей, чем плотность указанных RPBLA, с получением фракции, которая содержит относительно повышенную концентрацию RPBLA, и фракции, которая содержит относительно сниженную концентрацию RPBLA;
(c) отделения указанной фракции, содержащей относительно сниженную концентрацию RPBLA, от указанной фракции с относительно повышенной концентрацией RPBLA и отбора фракции с относительно повышенной концентрацией RPBLA; и
(d) очищения указанного слитого белка.
(a) получения водного гомогената, полученного путем гомогенизации в буфере трансформированных клеток-хозяев, которые продуцируют слитый белок в виде рекомбинантных подобных белковым тельцам скоплений (RPBLA), где указанные RPBLA обладают заранее определенной плотностью, где указанные RPBLA обладают плотностью, составляющей от приблизительно 1,1 до приблизительно 1,35 г/мл, и где указанный слитый белок содержит две последовательности, связанные друг с другом, в которых одна последовательность представляет собой индуцирующую белковые тельца последовательность, и другая представляет собой последовательность представляющего интерес продукта, где индуцирующая белковые тельца последовательность содержит проламин или модифицированный проламин;
(b) образования фракций с различной плотностью в гомогенате путем центрифугирования гомогената в отсутствие дополнительного обеспечивающего плотность раствора или с помощью слоя с определенной плотностью, обладающего плотностью меньшей, чем плотность указанных RPBLA, с получением фракции, которая содержит относительно повышенную концентрацию RPBLA, и фракции, которая содержит относительно сниженную концентрацию RPBLA;
(c) отделения указанной фракции, содержащей относительно сниженную концентрацию RPBLA, от указанной фракции с относительно повышенной концентрацией RPBLA и отбора фракции с относительно повышенной концентрацией RPBLA; и
(d) очищения указанного слитого белка.
2. Способ по п.1, в котором указанная заранее определенная плотность RPBLA является большей, чем плотность, по существу, всех эндогенных белков клетки-хозяина, находящихся в гомогенате.
3. Способ по п.1 или 2, в котором указанные фракции с различной плотностью получают с помощью слоя с определенной плотностью, обладающего плотностью меньшей, чем плотность указанных RPBLA.
4. Способ по п.1 или 2, в котором указанные фракции с различной плотностью получают с помощью супернатанта и осадка, полученных после центрифугирования гомогената при низкой скорости.
5. Способ по п.1, в котором указанные клетки-хозяева представляют собой клетки высших растений.
6. Способ по п.1, в котором указанные клетки-хозяева представляют собой клетки грибов.
7. Способ по п.6, в котором указанные клетки-хозяева грибов представляют собой клетки дрожжей.
8. Способ по п.1, в котором указанные клетки-хозяева представляют собой клетки водорослей.
9. Способ по п.1, в котором указанные клетки-хозяева представляют собой клетки животных.
10. Способ по п.9, в котором указанные клетки-хозяева животных представляют собой клетки млекопитающих.
11. Способ по п.1 или 2, в котором указанный слитый белок дополнительно включает линкерную последовательность между индуцирующей белковые тельца последовательностью и последовательностью представляющего интерес продукта.
12. Способ по п.1 или 2, в котором последовательность проламина представляет собой гамма-зеин, альфа-зеин или проламин риса.
13. Способ по п.1 или 2, в котором гомогенат получают из свежей биомассы.
14. Способ по п.1 или 2, в котором гомогенат получают из высушенной биомассы.
15. Способ по п.1 или 2, включающий дополнительную стадию выделения RPBLA.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB0426161.6A GB0426161D0 (en) | 2004-11-29 | 2004-11-29 | Protein isolation and purification |
GB0426161.6 | 2004-11-29 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2007124377A RU2007124377A (ru) | 2009-01-10 |
RU2420585C2 true RU2420585C2 (ru) | 2011-06-10 |
Family
ID=33561507
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2007124377/10A RU2420585C2 (ru) | 2004-11-29 | 2005-11-29 | Выделение и очистка белка |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20060123509A1 (ru) |
EP (1) | EP1819820A1 (ru) |
JP (1) | JP2008521767A (ru) |
KR (1) | KR20070091157A (ru) |
CN (1) | CN101103114B (ru) |
AR (1) | AR051517A1 (ru) |
AU (1) | AU2005308922B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0517120A (ru) |
CA (1) | CA2589158A1 (ru) |
GB (1) | GB0426161D0 (ru) |
RU (1) | RU2420585C2 (ru) |
WO (1) | WO2006056484A1 (ru) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2224792B1 (es) * | 2002-06-28 | 2007-02-16 | Era Plantech, S.L. | Produccion de peptidos y proteinas por acumulacion de cuerpos proteicos derivados de reticulos endoplasmico en plantas. |
GB0426160D0 (en) * | 2004-11-29 | 2004-12-29 | Era Plantech S L | Production of proteins |
US8163880B2 (en) | 2006-02-23 | 2012-04-24 | Era Biotech S.A. | Production of biologically active proteins |
KR20110084906A (ko) | 2008-10-10 | 2011-07-26 | 에라 바이오테크, 에스.에이. | 면역원-특이적 면역보강제로서의 재조합 단백질체들 |
US8889395B2 (en) | 2010-03-30 | 2014-11-18 | Novozymes A/S | Crystal metabolite recovery |
EP2418284A1 (en) | 2010-08-13 | 2012-02-15 | ERA Biotech, S.A. | Protein body-inducing polypeptide sequences |
EP2468870A1 (en) * | 2010-12-23 | 2012-06-27 | Philip Morris Products S.A. | Method for expressing desxoyribonuclease in plants |
EP2468871A1 (en) * | 2010-12-23 | 2012-06-27 | Philip Morris Products S.A. | Method for producing apolipoprotein in plants |
JP6037395B2 (ja) | 2011-01-17 | 2016-12-07 | フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム | 植物におけるタンパク質発現 |
US20140059718A1 (en) | 2011-01-17 | 2014-02-27 | Philip Morris Products S.A. | Vectors for nucleic acid expression in plants |
DE102015107846A1 (de) | 2015-05-19 | 2016-11-24 | Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt | Synthetische Organellen in Hefe |
CN105285314A (zh) * | 2015-09-14 | 2016-02-03 | 哈尔滨工业大学 | 一种13KDa大米醇溶蛋白的提取方法 |
CN108503686A (zh) * | 2018-05-07 | 2018-09-07 | 江苏省中国科学院植物研究所 | 一种植物总蛋白的提取方法及其专用提取液 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4215040A (en) | 1978-12-22 | 1980-07-29 | The Procter & Gamble Company | Density separation process |
FR2500937B1 (ru) | 1981-02-27 | 1983-04-15 | Thomson Csf | |
US5948682A (en) * | 1991-02-22 | 1999-09-07 | Sembiosys Genetics Inc. | Preparation of heterologous proteins on oil bodies |
WO1999016890A2 (en) | 1997-09-30 | 1999-04-08 | The Regents Of The University Of California | Production of proteins in plant seeds |
ES2343061T3 (es) * | 2002-05-24 | 2010-07-22 | Medtronic, Inc. | Metodos y constructos de dna para produccion de polipeptidos con rendimiento alto. |
ES2224792B1 (es) * | 2002-06-28 | 2007-02-16 | Era Plantech, S.L. | Produccion de peptidos y proteinas por acumulacion de cuerpos proteicos derivados de reticulos endoplasmico en plantas. |
GB0426160D0 (en) * | 2004-11-29 | 2004-12-29 | Era Plantech S L | Production of proteins |
US8163880B2 (en) * | 2006-02-23 | 2012-04-24 | Era Biotech S.A. | Production of biologically active proteins |
KR20110084906A (ko) * | 2008-10-10 | 2011-07-26 | 에라 바이오테크, 에스.에이. | 면역원-특이적 면역보강제로서의 재조합 단백질체들 |
EP2418284A1 (en) * | 2010-08-13 | 2012-02-15 | ERA Biotech, S.A. | Protein body-inducing polypeptide sequences |
-
2004
- 2004-11-29 GB GBGB0426161.6A patent/GB0426161D0/en not_active Ceased
-
2005
- 2005-11-29 AR ARP050104994A patent/AR051517A1/es not_active Application Discontinuation
- 2005-11-29 KR KR1020077014383A patent/KR20070091157A/ko not_active Application Discontinuation
- 2005-11-29 RU RU2007124377/10A patent/RU2420585C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-11-29 CA CA002589158A patent/CA2589158A1/en not_active Abandoned
- 2005-11-29 AU AU2005308922A patent/AU2005308922B2/en not_active Ceased
- 2005-11-29 EP EP05816137A patent/EP1819820A1/en not_active Withdrawn
- 2005-11-29 CN CN2005800470330A patent/CN101103114B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-11-29 BR BRPI0517120-2A patent/BRPI0517120A/pt not_active Application Discontinuation
- 2005-11-29 WO PCT/EP2005/012878 patent/WO2006056484A1/en active Application Filing
- 2005-11-29 US US11/289,264 patent/US20060123509A1/en not_active Abandoned
- 2005-11-29 JP JP2007541878A patent/JP2008521767A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2008521767A (ja) | 2008-06-26 |
EP1819820A1 (en) | 2007-08-22 |
US20060123509A1 (en) | 2006-06-08 |
BRPI0517120A (pt) | 2008-09-30 |
AU2005308922A1 (en) | 2006-06-01 |
KR20070091157A (ko) | 2007-09-07 |
AR051517A1 (es) | 2007-01-17 |
CN101103114A (zh) | 2008-01-09 |
GB0426161D0 (en) | 2004-12-29 |
WO2006056484A1 (en) | 2006-06-01 |
CN101103114B (zh) | 2013-01-02 |
AU2005308922B2 (en) | 2011-07-28 |
CA2589158A1 (en) | 2006-06-01 |
RU2007124377A (ru) | 2009-01-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2420585C2 (ru) | Выделение и очистка белка | |
RU2381275C2 (ru) | Получение пептидов и белков путем аккумулирования в эндоплазматическом ретикулуме растений | |
JP5517309B2 (ja) | コラーゲン生産植物及びその作成方法及びその使用 | |
KR20060124633A (ko) | 트랜스제닉 식물에서 아포지질단백질의 제조방법 | |
AU2729597A (en) | Transgenic plants with enhanced sulfur amino acid content | |
JP5497353B2 (ja) | 外来タンパク質の分泌方法 | |
US20080010697A1 (en) | Methods of Expressing Heterologous Protein in Plant Seeds Using Monocot Non Seed-Storage Protein Promoters | |
US20040117874A1 (en) | Methods for accumulating translocated proteins | |
Christou et al. | Monocot expression systems for molecular farming | |
MX2007006333A (en) | Protein isolation and purification | |
Mavituna | Production of recombinant human serum albumin in transgenic plants and plant cells | |
RU2201449C2 (ru) | Слитый полипептид, способный к целенаправленному переносу к масляному телу, химерная днк-контрукция, экспрессирующая кассета | |
KR20050092591A (ko) | 재조합 단백질의 제조 및 분리 방법 | |
KR20050027838A (ko) | 식물체에서 발현된 재조합 인간 성장호르몬 | |
MXPA98009091A (es) | Plantas transgenicas con contenido aumentado deaminoacidos de azufre | |
WO2010011679A2 (en) | Improved protein production in a host | |
KR20050027839A (ko) | 식물체에서 발현된 인간 과립구 대식세포 집락 촉진인자 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20131130 |