KR20060124633A - 트랜스제닉 식물에서 아포지질단백질의 제조방법 - Google Patents

트랜스제닉 식물에서 아포지질단백질의 제조방법 Download PDF

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Abstract

식물에서 아포지질단백질의 생산하기 위한 방법을 기술되었다. 한 양태로서, 본 발명은 식물에서
(a) 작동가능하게 연결된 성분으로 5'에서 3' 방향의 전사에서 다음을 포함하는 키메릭 핵산 구조물을 제공하고,
(i) 식물세포에서 발현을 조절하는 것이 가능한 핵산 서열 및
(ii) 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열;
(b) 식물세포에 상기 키메릭 핵산 구조물을 삽입하여 아포지질단배질의 발현을 위한: 및 아포지질단백질을 발현하는 종자인 종자를 세팅 가능한 성숙한 식물 내에서 식물세포를 키우는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
아포지질단백질, 트랜스제닉, 형질전환 식물,

Description

트랜스제닉 식물에서 아포지질단백질의 제조방법{METHODS FOR THE PRODUCTION OF APOLIPOPROTEINS IN TRANSGENIC PLANTS}
본 발명은 식물 유전공학적 방법 및 아포지질단백질의 생산에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 트랜스제닉 식물에서 재조합 아포지질단백질의 제조방법에 관한 것이다.
건강한 사람의 신체에서, 콜레스테롤의 전달 및 제거 사이에는 균형이 존재한다. 사람들이 고농도의 저밀도 지질단백질(low density lipoprotein (LDL)) 및 저농도의 고밀도 지질단백질(high-density lipoprotein (HDL))을 가질 때, 이러한 불균형은 제거된 콜레스테롤보다 동맥 내에 더 많은 콜레스테롤을 축적시킨다(van Dam, M. J. 등의 2002, Lancet 359: 37-0042). 동맥이 좁아지는 또는 막히는 죽상경화증(Atherosclerosis)은 플라크(plaque)라 부르는, 콜레스테롤의 반복적 침전의 결과이다(Major, A. S. 등의 2001, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21:1790-1795)).
지질단백질은 동맥경화유발성(atherogenetic) 및 혈액보호성(vasoprotective) 지질단백질로 나뉜다. 동맥경화유발성의 지질당단백질은 일반적으로 초저밀도 지질단백질(VLDL), 중간체(intermediate (IDL)), 저밀도 지질단백 질(LDL) 또는 지질단백질(Lp(a))과 같은 모든 아포지질단백질(Apo) B-포함 지질단백질인 반면, 혈액보호 지질단백질은 Apo AI을 포함하고 있다.
HDL의 주요 단백질 구성성분인, Apo AI는 콜레스테롤 항상성에서 중요한 역할을 한다. 임상 및 개체군에 기초한(population-based) 연구에서 심혈관질환과 혈장 HDL 수준 사이에 주목할만한 역-상관관계가 입증되어, Apo AI 및 HDL 가 동맥경화에 대한 보호작용을 돕는 것으로 나타났다(Rubins, H. B. 등의 1993, Am. J. Cartiol. 71: 45-52)). 동맥경화에 민감한 트랜스제닉 마우스 및(Rubin, E. M. 등의 1991, Nature 353: 265-267)) 및 토끼(Duverger, N. 등의 1996, Circulation 94: 713- 717)에 대한 연구는 인간의 Apo AI의 발현이 동맥경화의 발달을 저해함을 보여준다. 이 효과는 "역 콜레스테롤 수송(reverse cholesterol transport (RCT))" 과정의 첫 번째 단계인 (Glomset, J. A. 1968, J Lipid Res. 9: 155-167)) 세포로부터 콜레스테롤 유입의 효과적인 촉진과 연관된 것일 수 있다(Castro, G. 등의 1997, Biochemistry 36: 2243-2249)). Apo AI는 세포성 콜레스테롤의 선호적인 수용체로 존재하면((Rothblat, G. H. 등의 1999, J Lipid Res. 40: 781-796), HDL과 연관된 콜레스테롤의 레시틴 콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제(lecithin- cholesterol-acyl-transferase (LCAT)) 에스테르화의 활성을 증가시키고(Jonas, A. 1991, Biochim. Biophys. Acta 1084: 205-220; Mahley, R. W. 등의 1984, J Lipid Res. 25: 1277-1294)), 및 간으로 LCAT-유래의 콜레스테롤 에스테르를 수송함으로서 (Morrison, J. R. 등의 1992, J Biol. Chem. 267: 13205-13209) 이 과정을 조절한다.
콜레스테롤 합성을 저해하여 신체에 지질수준을 낮게 하도록 하는 LIPITOR® (아토바스타틴 칼슘(atorvastatin calcium))(Alaupovic, P. 등의 1997, Atherosclerosis 133: 123-133)와 같은 합성 항고지질제(antihyperlipidemics)와는 달리, 정제된 Apo AI의 융합은 조직에서 혈장으로 콜레스테롤 유입을 자극한다 (Navab, M. 등의 2002, Circulation 105: 290-292). 이것은 Apo AI가 동맥벽의 포말세포(foam cells)로부터 콜레스테롤 유출을 자극할 수 있고, 죽상판 경화 혈전의 감소를 유도하여, 효과적으로 동맥을 "청소하는(cleaning out)"것을 나타낸다.
인간에서, Apo AI은 비글리코실화 프리-프로-단백질(non- glycosylated pre-pro-protein)로서 간 및 소장세포에서 합성된다(Gordon, J. I. 등의 1983, J. Biol Chem. 258: 4037-4044). 성숙한 243 아미노산 단백질이 방출될 때, 18 개의 아미노산 프리-새그먼트(pre-segment)는 단백질이 세포에서 방출되기 전에 제거되며 6개의 아미노산 프로-새그먼트는 혈장의 잘 알려져 있지 않은 단백질 분해효소에 의해 분비 후에 잘려진다(Saku, K. 등의 1999, Eur. J. Clin. Invest. 29: 196- 203).
아포지질단백질 A-IMilano(Apo AI-M)는 최초로 설명된 사람의 Apo AI의 분자적 변이체이다(Franceschini, G. 등의 1980, J. Clin. Invest. 66: 892-900)). 이것은 아르기닌(Arg) 173이 시스테인(Cys)으로 치환된 것으로 특징화된다(Weisgraber, K. H. 등의 1983, J. Biol. Chem. 258: 2508-2513). 돌연변이 아포지질단백질은 상동염색체 우성형질로 전달되며 보인자(carrier) 8 세대가 확인되었다(Gerli, G. C. 등의 1984, Hum. Hered. 34: 133-140).
Apo AI-M 보인자(carrier) 개체의 상태는 HDL-콜레스테롤 수준의 주목할 만큼 감소로 특징화된다. 그럼에도 불구하고, 영향받은 대상은 동맥질환에서 어떤 증가된 위험이 뚜렷하게 보이지 않는데; 실제, 계통수의 조사에 의해서 상기 대상들은죽상판경화증으로부터 "보호될" 수 있는 것으로 나타났다.
보인자에서 Apo AI-M의 가능한 보호효과의 기작은 하나의 알파-나선의 로스(loss) 및 소수성 잔기의 증가된 노출로 돌연변이 아포지질단백질의 구조에서 변형되어 링크된 것으로 보인다(Franceschini, G. 등의 1985, J. Biol. Chem. 260: 16321 16325). 더 쉽게 지질과 결합하는 정상적인 A-I와 비교하여, 다중 알파-나선의 견고한 구조의 손실은 분자의 향상된 유연성을 유도한다. 더군다나, 아포지질단백질/지질 복합체는 변성에 더욱 민감하고, 따라서 지질 송달이 또한 돌연변이의 경우에서 향상되는 것으로 나타났다.
Apo AI 및 Apo AI-M 돌연변이의 치료 용도는 상기 아포지질단백질를 충분한 양과 적당한 형태로 만드는 방법의 부족으로 현재 제한된다. 특히, Apo AI의 재조합생산은 이것의 양수성, 자동축적 및 분해로 인해 매우 것으로 나타났다(Schmidt, H. H. 등의 1997, Protein Expr. Purif. 10: 226-236). 본 발명시에, 재조합 인간 Apo AI는 두가지 진핵 시스템, 즉 바큘로바이러스로 형질삽입된 스포도프테라프루기페다(Spodopterafrugiperda (Sf9)) 세포(Sorci-Thomas, M. G. 등의 1996, J. Lipid Res. 37: 673-683) 및 안정하게 형질삽입시킨 중국 햄스터 난세포(hamster ovary(CHO) cell)(Forte, T. M. 등의 1990, Biochim. Biophys. Acta 1047: 11-18; Mallory, J. B. 등의 1987, J. Biol. Chem. 262: 4241-4247)에서 발현되었다. 바큘로바이러스 시스템에서, 일단 세포가 성공적으로 형질삽입되면, 정확한 구성를 가진 세포가 발현을 위해 사용될수 있기전에 철저한 스트리닝 과정이 있다. 유사하게, CHO 세포 집단은 안정하게 형질삽입되어 높은 발현률을 가진 집단을 찾아내기 위하여 스크리닝 과정을 거쳐야 한다. 또한, 이 두종류의 세포는 모두 상당한 발현이 수행되고 박테리아보다 아주 높은 수준의 유지되기 전까지 상대적으로 긴 시간이 필요하다.
박테리아의 재조합 발현 단백질은 일반적으로 대량의 정제된 단백질을 빠르고 경제적으로 생산할 수 있기 때문에 매력적이다. 형질전환된 대장균(Escherichia cold (E. coli))에서 Apo AI 발현의 몇몇 보고가 있다; 그러나, 최근 일부 발현수준에서 진보된 성과를 보였고(Ryan, R. O. 등의 2003, Protein Expr. Purif. 27: 98-103), 이 방법들은 상대적으로 낮은 수준 또는 바람직하지 않은 외래 친화성 택(tag) 또는 분비 신호가 존재한다(Bergeron, J. 등의 1997, Biochim. Biophys. Acta 1344: 139-152; Li, H. H. 등의 2001, J. Lipid Res. 42: 2084-2091; McGuire, K. A. 등의 1996, J. Lipid Res. 37: 1519-1528). 또한, 대장균 내독성은 특별히 아포지질단백질과 복합체를 형성한다고 알려져 있다( Emancipator 등의 (1992) Infect. Immun. 60: 596-601). 아포지질단백질의 의약 조제품에서 대장균 내독성과 관련된 독성의 감소와 제거는 아주 바람직하다. 기술적으로 작동가능한 이 내독성의 제거는 인간의 건강 위험성을 완전히 제거함 없이, 복합체 및 값비싼 비용의 단백질 정제 방법(미합중국 특허 제6,506,879호)이 포함 된다.
재조합 단백질의 대량 생산을 위해서 생물반응기로 식물의 사용은 잘 알려져 있고, 사람의 치료 단백질을 포함하는 수많은 단백질이 생산되었다. 예를 들어, 미국 특허 제 4,956,282호, 제 5,550,038호 및 제 5,629,175호는 식물에서 감마인터페론의 생산에 대해서 공개한 것이고;미국 특허 제 5,650,307호, 제 5,716,802호 및 제 5,763,748호는 식물에서 사람 혈청 알부민의 생산을 기술한 것이고, 미국특허 제5, 202,422호, 제 5,639,947호 및 제 5,959,177호는 식물에서의 항체의 생산에 관련한 것이다. 식물에 기초한 재조합 단백질 생산 시스템에 의해 제공된 중요한 이점 중에 하나는 식물의 성장의 면적을 향상시킴으로서, 단백질 생산에서 대량의 단백질을 제공하도록 경제적으로 증대시킬 수 있다. 대조적으로, 값 비싼 생산 증대를 제공하기 위해서, 발효 및 세포 배양 시스템은 넓은 공간, 장비 및 에너지 요구조건을 가진다. 그러나, 생물반응기로서 식물의 사용이 충분히 논의되고, 상기에서 논의된 아포지질단백질의 치료적 응용에도 불구하고, 기존 기술은 식물에서 아포지질단백질의 생산을 위한 어떤 방법도 제공하지 않았다.
발효 및 세포배양 시스템의 실질적인 대안을 제공하기 위하여, 식물이 왕성하게 남고 아포지질단백질이 식물에 상당한 수준으로 축적된다는 것이 중요하다. 아포지질단백질 지질과 결합하려는 본래의 특성에서, 재조합에 의해 발현된 아포지질단백질은 내생적인 식물 지질과 결합할 수 있고 그것에 의하여 식물의 지질대사를 방해한다. 따라서 재조합 발현 아포지질단백질은 식물의 건강에 영향을 미칠 것이다. 대신에, 재조합 발현 아포지질단백질은 분해로 인한 방어기작으로서, 아 포지질단백질을 효과적인 수준으로 축적하는데 실패할 수 있다. 이것은 식물에서의 합성능력이 어떻게 식물의 아포지질단백질의 상업상 생산을 성취하도록 활용될 수 있는지는 명확하지 않다.
따라서 아포지질단백질의 재조합 생산을 위한 방법과 관련한 선행기술의 단점에서, 아포지질단백질의 생산을 향상시키는 방법적 기술이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 식물에서 아포지질단백질을 생산하는 위한 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 식물종자에서 아포지질단백질을 생산하는 위한 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은
(a) 작동가능하게 연결된 성분으로서 5'에서 3'의 전사 방향으로 다음을 포함하는 키메릭 핵산 구조물을 제공하고,
(i) 식물세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열, 및
(ii) 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열,
(b) 식물세포 내로 키메릭 핵산 구조물을 삽입하는 방법: 및
(c) 아포지질단백질을 발현할 수 있는 성숙한 식물에서 상기 식물세포를 성장시키는 것을 포함하는 식물에서 아포지질단백질을 발현하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 식물종자는 아포지질단백질을 생산하는데 특별히 적합한 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명은
(a) 작동 가능하게 연결된 성분으로서 5'에서 3'의 전사 방향으로 다음을 포함하는 키메릭 핵산 구조물을 제공하고
(i) 식물종자세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열, 및
(ii) 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열;
(b) 식물세포 내로 키메릭 핵산구조물을 삽입하여;
(c) 종자형성이 가능한 성숙한 식물내에서 식물세포를 성장시켜 식물종자에서 아포지질단백질을 발현하는 방법을 제공한다.
더욱 바람직한 양태에서 식물종자세포에서 발현이 조절할 수 있는 핵산 서열은 파세리온(phaseolin) 프로모터와 같은 종자-선호적인 프로모터이다. 바람직한 양태에서, 최소 전체 종자 단백질의 0.25%가 아포지질단백질이다.
본 발명의 바람직한 양태에서 키메릭 핵산 서열은, 추가로 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열에 대한 리딩프레임(reading frame)에 링크된 안정화된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 바람직하게 안정화된 폴리펩타이드는 아포지질단백질의 부재에서 식물세포에서 발현되고 안정하게 축적될 수 있는 폴리펩타이드이다. 안정화된 단백질은 식물 특이적 또는 비식물 특이적일 수 있다. 본발명에 따라 사용될 수 있는 식물 특이적인 안정화 단백질은 오일 바디(oil body) 단백질 및 티오레독신(thioredoxins)을 포함한다. 이것에 덧붙여 본 발명에 따라 사용될 수 있는 비식물 특이적인 안정화 폴리펩타이드는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein (GFP)) 및 단일 사슬 항체 또는 그것의 단편을 포함한다. 식물 특이적인 또는 비식물 특이적인 특이 안정화 폴리펩타이드는 그의 자 유 야생형으로 아포지질단백질을 방출하기 위해 절단될 수 있는 링커를 통해 아포지질단백질에 연결될 수 있다.
키메릭 핵산 서열은 더욱 바람직하게는 아포지질단백질 폴리펩타이드가 식물세포 내 오일 바디인, 소포체(endoplasmic reticulum (ER))에 축적되거나 소포체 유래의 저장낭에 연결되어있는 방식의 표적화 신호를 포함한다. 따라서, 키메릭 핵산 구조물은 추가적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 ER에 또는 ER 유래의 저장낭에 아포지질단백질 폴리펩타이드를 표적화 할 수 있는 능력을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. ER에 대한 아포지질단백질을 표적화에 사용될 수 있는 핵산 서열은 예를 들어 KDEL, HDEL, SDEL 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 올레신(oleosins)처럼, 아포지질단백질을 오일 바디로 표적하기 위해 사용될 수 있는 핵산 서열은 오일 바디 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 그러나, 본 발명에 따라 추가적으로, 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열이 아포지질단백질 프로-펩타이드를 포함하는 것이 제공되기 때문에 아포지질단백질은 표적화 신호를 포함하지 않는 방식으로 아포지질단백질을 발현하여 오일 바디에 표적될 수 있다.
다른 바람직한 양태에서, 키메릭 핵산은 아포지질단백질으 아포플라스트(apoplast)에 축적하는 것과 같은 방법으로 표적신호를 포함한다. 따라서, 이 같은 양태에서, 키메릭 핵산 추가 구조물은 바람직하게는, 아포플라스트에 아포지질단백질 폴리펩타이드를 표적화 할수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
또 하나의 더 바람직한 양태에서는, 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열은 아포지질단백질이 세포질에 축적되는 그러한 방식으로 발현된다. 일부의 양태에서, 핵산 서열은 표적화 신호를 포함하지 않는다.
더 바람직한 양태에서, 키메릭 핵산 구조물은 핵의 게놈 병합 조건하에서 식물세포 내로 삽입된다. 이러한 조건하에서, 키메릭 핵산 서열은 식물의 게놈에 안정하게 융합된다.
또 하나의 더욱 바람직한 양태에서, 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열은 식물 코돈 활용을 위해 최적화된다. 본 발명에 따라 사용된 바람직한 핵산 서열은 사람, 소, 또는 돼지의 아포지질단백질 A-I 및 프로 아포지질단백질 A-I을 암호한다.
다른 구현 예에서, 본 발명은 아포지질단백질을 포함하는 식물 종자를 얻는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따르면,
(a) 작동가능하게 연결된 조성으로서 5'에서 3'의 전사 방향을 다음을 포함하는 키메릭 핵산 구조물을 제공하고,
(i) 식물 조직세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열, 및
(ii) 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열 ;
(b) 식물세포에 상기 키메릭 핵산 구조물을 삽입하고;
(c) 종자형성이 가능한 성숙한 식물에 상기 식물세포를 자라게 하여; 및
(d) 종자가 아포지질단백질을 포함하는 상기 식물로부터 종자를 얻는 것을 포함하는 식물종자를 얻는 방법을 제공한다.
종자는 아포지질단백질을 발현하는 다수의 종자를 각각 포함하는 자손 식물 개체군을 얻기 위하여 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 아포지질단백질을 발현하는 종자를 형성할 수 있는 식물을 제공한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 종자 생산 능력이 있는 식물에서 5'에서 3'의 전사 방향에서 다음을 포함하는 키메릭 핵산 서열을 포함한다:
(a) 작동가능하게 연결된 식물에서 발현이 조절할 수 있는 첫번째 핵산 서열
(b) 세포가 아포지질 단백질을 포함하는 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 두번째 핵산 서열,
바람직한 양태에서, 키메릭 핵산 서열이 식물의 핵 게놈에 융합된다.
본 발명의 더 바람직한 양태에서,식물은 아라비돕시스(Arabidopsis) 식물이고 특히 바람직한 양태에서 식물은 잇꽃(safflower) 식물이다.
또 하나의 다른 구현 예로서, 본 발명은 아포지질단백질을 발현하는 식물종자를 제공한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 식물종자는 5'에서 3'의 전사방향에서 다음을 포함하는 키메릭 핵산 서열을 포함한다:
(a) 작동가능하게 연결된 식물에서 발현이 조절할 수 있는 첫번째 핵산 서열
(b) 아포지질단백질을 포함하는 세포의 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 두번째 핵산 서열,
종자는 종자세포에 의해 합성된 목적하는 아포지질단백질 폴리펩타이드를 다소 정제된 형태로 추출 또는 얻을 수 있는 공급원이다. 아포지질단백질은 혈관질환 을 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 특색 및 이점은 하기의 세부 설명으로부터 쉽게 명백화 될 것이다. 그러나, 발명의 범위에서 다양한 변경 및 변형이 이 상세 기술된 설명으로부터 숙련된 기술에 대해 쉽게 명확히 될 수 있기 때문에, 이것은 발명의 바람직한 양태가 지적하는 세부설명 및 명확한 실시예가 제공된 도만으로 이해될 수 있을 것이다.
본 발명을 도면과 관련하여 설명하면 다음과 같다.
도 1. (A) 호모사피언스 아포지질단백질 A-I(Apo AI)의 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:1) 및 유래 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)(Kindly provided by Dr. Norman Wong, 알베르타 캘거리), (기탁 번호 NM_000039). 볼드체 부분은 신호펩타이드의 전-서열을 표시하고, 밑줄 부분은 후-서열을 나타낸다. (B) 천연 변종 Apo AIMilano(R173C)의 뉴클레오타이드(SEQ ID NO:3) 및 관련 아미노산 서열(SEQ ID NO:4). 볼드체/이탤릭체 부분은 돌연변이된 아미노산을 나타낸다. (C) 천연변종 Apo AI 파리(R151C)의 뉴클레오타이드(SEQ ID NO:5) 및 관련 아미노산 서열(SEQ ID NO:6). 볼드체/이탤릭체 부분은 돌연변이된 아미노산을 나타낸다.
도 2. 아라비돕시스 트랜스제닉 식물에서 아포지질단백질 Apo AI의 발현에서 생성된 모든 이중 구조물을 도식화. (A) 식물세포에서 세포질에 표적화된 구조물. (B) 식물세포에서 오일 바디에 표적화된 구조물. (C-E) 분비경로에 표적화된 구조물. (D & E) 구조물은 소포체에 남게 되는 추가적인 KDEL 서열을 포함할 수 있다. (D) Apo AI 성숙한 Apo AI의 프로-서열을 포함하는 구조물. (E) 프로-Apo AI 또는 성숙한 Apo AI의 방출을 위한 잘려질 수 있는 서열을 포함하는 구조물. 범례는 프로모터의 종류, 신호 펩타이드 및 각 구조물에서 포함된 암호화 서열을 설명한다.
도 3(A). Apo AI-GFP 번역 융합 구조물에서 사용되는 GFP 암호화 부위에 대한 방법을 클로닝하기 위한 그림을 도식화.
도 3(B). Apo AI 및 종자 특이적인 Apo AI-GFP 번역 융합 구조물의 프로- 및 성숙한 암호화 부위를 위한 클로닝 전략 도해.
도 3(C). Apo AI-GFP의 표적화에 기초하여 종자 특이적인 세포질 및 오일 바디에 기초한 표적화를 위하여 아그로박테리움(Agrobacterium) EHA101 세포를 형질전환하는데 사용되는 양성 벡터의 생산을 위한 클로닝 전략 도해. 각각 세포질에 표적되는 성숙한 및 프로-Apo AI-GFP를 포함한 Apo10 및 Apo11. 각각 오일 바디에 표적되는 성숙한 및 프로-Apo AI-GFP를 포함한 Apo12 및 Apo13.
도 3(D). Apo AI- GFP의 종자 특이적인 분비경로을 표적화를 위해 아그로박테리움(Agrobacterium) EHA101 세포를 형질전환하는데 사용되는 양성 벡터의 생산을 위한 클로닝 전략 도해. 각각 분비경로에 표적되는, 성숙한 및 프로-Apo AI-GFP를 포함한 Apo15 및 Apo16.
도 4(A). Apo AI- GFP의 구조물 세포질의 표적화를 위한 아그로박테리움 EHA10의 형질전환에 사용된 양성 벡터의 생성을 위한 클로닝 전략 도해. 각각 세 포질에 표적되는, 성숙한 및 프로-Apo AI-GFP 번역 융합를 포함하는 Apo17 및 Apo18.
도 4(B). Apo AI- GFP의 구조물 세포질의 표적화를 위한 클로닝 전략 도해. 세포질에 표적화하는 프로 Apo AI-GFP를 포함하는 Apo18b.
도 5(A). Apo AI의 프로- 및 성숙한 암호화 부위 및 Apo AI-GFP 번역 융합 단백질의 구성 발현을 위한 클로닝 전략 도해.
도 5(B). Apo AI- GFP의 구조물 분비경로의 표적화를 위한 아그로박테리움 EHA10의 형질전환에 사용된 양성 벡터의 생성을 위한 클로닝 전략 도해. 각각 분비경로을 표적, 성숙한 및 프로-Apo AI-GFP 번역 융합를 포함하는 Apo19 및 Apo20.
도 6. Apo AI의 암호화부위의 게 암호화 부위의 성숙한형태를 위한 클로닝 전략 도해. 세포질에 종자 특이적인 표적화를 위한 Apo22, 오일 바디에 종자 특이적인 표적화를 위한 Apo24, 분비경로에 대한 종자 특이적인 표적화 를 위한 Apo30 및 오일 바디 및 절단 서열 klip8로 정제한 종자 특이적인 표적화를 위한 Apo26.
도 7. Apo AI의 암호화 부위의 프로-형태를 위한 클로닝 전략 도해. 세포질에 종자 특이적인 표적화를 위한 Apo21, 오일 바디에 종자 특이적인 표적화를 위한 Apo23, 오일 바디 및 절단 서열 klip8로 정제한 종자 특이적인 표적화를 위한 Apo25 및 분비경로에 대한 종자 특이적인 표적화.
도 8(A). 내부 XhoI 자리의 제거 및 KDEL 신호 펩타이드가 포함된 Apo AI의 암호화 부위의 프로형의 암호화 클로닝 전략 도해. 올레오신 인프레임 융합으로 오일 바디에 종자 특이적인 표적화를 위한 Apo27. 올레오신 항체 D9로 인프레임 융합된 Apo31 및 Apo35는 둘 다 분비경로에 대한 표적화 및 KDEL 신호펩타이등에 기인한 소포체에 축적된 Apo35.
도 8(B). Apo AIMilano의 암호화 부위에 프로 형의 클로닝 전략 도해. 올레오신과 인프레임 융합된 오일 바디에 대한 Apo AIMilano에 대한 종자 특이적인 표적화를 위한 Apo27M.
도 9. 내부 XhoI 자리가 제거된 Apo AI의 암호화 부위의 프로 형의 클로닝 전략 도해. 오일 바디에 표적화되고 kilp8서열에서 절단될 수 있는 Apo28, 올레오신 항체 D9에 인프레임 융합된 분비경로에 대해 Apo AI를 표적하는 Apo32.
도 10. 내부 XhoI 자리가 제거되고 암호화시작점에서 메티오닌(MET)이 추가된 Apo AI의 암호화 부위의 프로 및 성숙한 형태의 클로닝 전략 도해. 분비경로에 표적화 및 올레오신 항체 D9와 인프레임 융합된 Apo34 (프로 Apo AI) 및 Apo33 (성숙한 Apo AI).
도 11. KDEL 신호 펩타이드를 포함하는 내부 XhoI 자리를 가지는 Apo AI의 암호화 부위의 프로 및 성숙한 형태의 클로닝 전략 도해. 분비경로에 표적화되고 올레오신 항체 D9와 인프레임 융합되고, KDEL 신호펩타이드에 기인한 소포체에 축적되는 Apo36.
도 12. 암호화부위 시작점에서 추가의 메티오닌(MET) 잔기와 KDEL 신호 펩티드를 포함하는 내부 XhoI 자리가 제거된 Apo AI의 암호화 부위의 프로 및 성숙한 형태의 클로닝 전략 도해. 분비경로에 표적화 되고 올레오신 항체 D9와 인프레임 융합되고 KDEL 신호펩타이드에 기인한 소포체를 축적하는 Apo38 및 Apo37.
도 13. Apo AI 및 단백질분해효소 절단 자리의 암호화 부위의 프로 및 성숙한 형태의 클로닝 방법을 그림으로 도식화. Apo43, Apo44, Apo39 및 Apo40은, 올레오신 항체 D9과 인프레임 융합된 분비 기작에 표적화. Apo43 및 Apo44는 KDEL 신호 펩타이드에 기인한 소포체에 축적될 것이다.
도 14. 암호화 부위의 시작에 추가적인 메티오닌 잔기 및 단백질 분해효소 절단자리를 포함하는, Apo AI 암호화 부위의 프로 및 성숙한 형태의 클로닝 방법을 그림으로 도식화. Apo42, Apo46, Apo41 및 Apo45은, 올레오신 항체 D9과 인프레임 융합된 분비 기작에 표적화. Apo46 및 Apo45는 KDEL 신호 펩타이드에 기인한 소포체에 축적될 것이다.
도 15. 암호화 부위의 시작에 추가적인 Met 잔기 및 단백질 분해효소 절단자리를 포함하는, Apo AI 암호화 부위의 성숙한 형태의 클로닝 방법을 그림으로 도식화. Apo47은 오일 바디를 표적하는 옥수수 올레오신과 인프레임 융합되었다.
도 16. 총 잎 단백질(A)(25 ug) 및 총 종자 단백질(B)(50 ug)을 다클론항체 Apo AI로 웨스턴. Apol7은 ubi- mat-Apo AI-GFP 구조물이다. c24 잎 (25 ug) 및 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug 의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용했다.
도 17. 총 잎 단백질(A)(25 ug) 및 총 종자 단백질(B)(50 ug)을 다클론항체 Apo AI로 웨스턴. Apol8a은 ubi- pro- Apo AI-GFP 구조물이다. c24 잎 (25 ug) 및 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug 의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용했다.
도 18. 총 잎 단백질(A)(25 ug) 및 총 종자 단백질(B)(50 ug)을 다클론항체 Apo AI로 웨스턴. Apol9는 ubi- PRS-mat- Apo AI-GFP 구조물이다. c24 잎(25 ug) 및 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug 의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용했다.
도 19. 총 잎 단백질(A)(25 ug) 및 총 종자 단백질(B)(50 ug)을 다클론항체 Apo AI로 웨스턴. Apo20은 ubi- PRS-pro- Apo AI-GFP 구조물이다. c24 잎 (25 ug) 및 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug 의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용했다.
도 20. 총 종자 단백질(50 ug)을 다클론항체 GFP로 웨스턴. (A)Apo10은 pha-mat-Apo AI-GFP 구조물이다. (B) Apoll은 pha- pro- Apo AI-GFP 구조물이다. c24 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 200 ng의 정제된 GFP는 양성 대조군으로 사용했다.
도 21. 총 종자 단백질(50 ug)을 다클론항체 GFP로 웨스턴. (A)Apol2은 pha-oleosin-mat-Apo AI-GFP 구조물이다. (B)Apol3는 pha-oleosin-pro-Apo AI-GFP 구조물이다. c24 및 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 200 ng의 정제된 GFP는 양성 대조군으로 사용했다.
도 22. 총 종자 단백질(50 ug)을 다클론항체 GFP로 웨스턴. (A) Apol5는 pha-PRS-mat-Apo AI-GFP 구조물이다. (B) Apol6은 pha- PRS-pro-Apo AI-GFP 구조물이다. c24 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 200 ng의 정제 된 GFP는 양성 대조군으로 사용했다.
도 23. 총 종자 단백질(50 ug)을 다클론항체 GFP로 웨스턴. (A) Apo21는 pha-matApo AI이다. (B) Apo22 는 pha-pro-Apo AI이다. c24 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용했다.
도 24. 총 종자 단백질(50 ug)을 다클론항체 Apo AI로 웨스턴. (A) Apo23은 pha-oleo-matApo AI이다. (B) Apo24는 pha-oleo-- pro-Apo AI이다. c24 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용했다.
도 25. 총 종자 단백질(50 ug)을 다클론항체 Apo AI로 웨스턴. (A) Apo25는 pha-oleo-klip8-matApo AI(+Met)이다. (B) Apo26은 pha- oleo-klip8-pro-Apo AI(+Met)이다. c24 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용했다.
도 26. 총 종자 단백질(50 ug)을 다클론항체 Apo AI로 웨스턴. (A) Apo28는 pha-oleo-klip8-pro-Apo AI이다. (B) Apo29는 pha- PRS- mat-Apo AI이다. c24 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용했다.
도 27. 총 종자 단백질(50 ug)을 다클론항체 Apo AI로 웨스턴. (A) Apo30은 pha-PRS-pro-Apo AI이다. c24 leaf (25 ug) 및 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용했다.
도 28. 총 종자 단백질(50 ug)을 다클론항체 Apo AI로 웨스턴. (A) Apo32 는 pha-PRS-D9 scFv-pro-Apo AI이다. (B) Apo33은 pha-PRS- D9 scFv-mat-Apo AI(+met)이다. c24 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용했다.
도 29. 총 종자 단백질(50 ug)을 다클론항체 Apo AI로 웨스턴. (A) Apo34 는 pha-PRS-D9 scFv-pro-Apo AI(+met)이다. (B) Apo35는 pha- PRS-D9 scFv-mat-Apo AI-KDEL이다. c24 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용했다.
도 30. 총 종자 단백질(50 ug)을 다클론항체 Apo AI로 웨스턴. (A) Apo36 는 pha-PRS-D9 scFv-pro-Apo AI-KDEL이다. (B) Apo37은 pha- PRS-D9 scFv-mat-Apo AI(+met)-KDEL이다. c24 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용했다.
도 31. 총 종자 단백질(50 ug)을 다클론항체 Apo AI로 웨스턴. (A) Apo38 is pha-PRS-D9 scFv-pro-Apo AI(+met)-KDEL이다. c24 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용했다. (B) Apo 29는 pha-PRS- D9 scFv KLIP8-Apo AI이다. 야생형 종자는 음성 대조군으로 사용되T고 정상적인 사람 혈장으로부터(US Biologicals) 3 ug의 사람 Apo AI는 양성대조군으로 사용되었다.
도 32. 총 종자 단백질(50 ug)을 다클론항체 Apo AI로 웨스턴. (A) Apo40 은 a-PRS-D9 scFv-klip8-pro-Apo AI이다. (B) Apo41은a- PRS-D9 scFv-klip8-mat- Apo AI(+met)이다. c24 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용되었다.
도 33. 총 종자 단백질(50 ug)을 다클론항체 Apo AI로 웨스턴. (A) Apo42 는 pha-PRS-D9 scFv-klip8-pro-Apo AI(+met)이다. c24 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용되었다.
도 34. 총 종자 단백질(50 ug)을 다클론항체 Apo AI로 웨스턴. (A) Apo44 는 pha-PRS-D9 scFv-klip8-pro-Apo AI-KDEL이다. (B) Apo45는 pha-PRS-D9 scFv-klip8-mat-Apo AI(+met)이다. c24 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용되었다.
도 35. 총 종자 단백질(50 ug)을 다클론항체 Apo AI로 웨스턴. (A) Apo46 은 pha-PRS-D9 scFv-klip8-pro-Apo AI(+met)-KDEL이다. (B) Apo45는 pha-PRS-D9 scFv-klip8-mat-Apo AI(+met)이다. c24 종자 단백질(50 ug)은 음성 대조군으로서 사용되었고 0.5 ug의 사람 혈청은 양성 대조군으로 사용되었다.
도 36. 비표적화된 및 오일 바디 표적화된 Apo AI- GFP와 종자의 특수 세포성 프랙션과의 결합을 조사. 다클론항체 Apo AI 및 성숙한 종자로부터 수용성 프렉션(AQ), 오일 바디(각각 PO 및UO, 사용된 총 오일 바디 약 20 ug )의 인산(PW), 우레아(UW) 세척액 및 마이크로소말(ER) 프렉션으로부터 분리된, 거의 동량의 총 단백질(50 ug)를 이용한 웨스턴 블랏. 면역 블랏의 폰세우-에스(Ponceau-S) 염색은 겔에 로딩된 관련 단백질 양을 보여준다(상위패널). 사람 혈청(0.5 ㎍)은 Apo AI 발현을 위한 양성 대조군으로 사용되었다. (A) ApolO 은 Apo AI-GFP이다. Apoll은 pro-Apo AI-GFP이다. (B) Apol2는 oleosin-Apo AI-GFP이고 Apol3은 올레오신-프로-Apo AI-GFP이다.
도 37. 분비된 프로- 및 성숙한 Apo AI- GFP와 종자의 특수 세포성 프랙션과의 결합을 조사. 다클론항체 Apo AI 및 성숙한 종자로부터 수용성 프렉션(AQ), 오일 바디(각각 PO 및UO, 사용된 총 오일 바디 약 20 ug )의 인산(PW), 우레아(UW) 세척액 및 마이크로소말(ER) 프렉션으로부터 분리된, 거의 동량의 총 단백질(50 ug)를 이용한 웨스턴 블랏. 면역 블랏의 폰세우-에스(Ponceau-S) 염색은 겔에 로딩된 관련 단백질 양을 보여준다(상위패널). 사람 혈청(0.5 g)은 Apo AI 발현을 위한 양성 대조군으로 사용되었다. Apol5는 PRS-Apo AI-GFP이다. Apol6은 PRS-pro-Apo AI- GFP이다.
도 38. 잎에서 Apo AI-GFP 번역성 융합 구조물의 구성 발현. 항-GFP 항체와 잎에서 분리한 거의 동량의 총 단백질(50 ug)을 이용한 웨스턴 블랏. 면역 블랏의 폰세우-에스(Ponceau-S) 염색은 겔에 로딩된 관련 단백질 양을 보여준다(상위패널). 야생형(c24) 식물은 GFP 발현을 위한 음성 대조구로 사용되었다. 정제된 GFP 단백질(200 ng)은 GFP를 위한 양성 대조군으로 사용되었다. UG-14 및 UR2 은 잎에서 GFP 단백질 축적을 위한 양성 대조군으로 포함된다. 예상되는 분자량은 다음과 같다: Apol7 = 55.4 kDa; Apol8 = 56.4 kDa; Apol9 = 58.3 kDa; Apo20 = 59.3 kDa; UG-14 = 26.8 kDa; UR2 = 50 kDa.
도 39. 비표적화 및 분비된 종자 Apo AI의 종자-특이적인 발현. 항-Apo AI 항체와 성숙한 종자로 분리한 거의 동량의 총 단백질(50 ug)을 이용한 웨스턴 블 랏. 면역 블랏의 폰세우-에스(Ponceau-S) 염색은 겔에 로딩된 관련 단백질 양을 보여준다(상위패널). 야생형(c24) 식물은 Apo AI 발현을 위한 음성 대조구로 사용되었다. 사람혈청(0.5 ㎍)은 Apo AI를 위한 양성 대조군으로 사용되었다. 예상되는 분자량은 다음과 같다: Apo21= 28.3 kDa; Apo22= 29.32 kDa; Apo23= 46.9 kDa; Apo24= 47.8 kDa; Apo25= 51.5 kDa; Apo26= 52.5 kDa; Apo27= 51.3 kDa; Apo28= 52.3 kDa; Apo29= 31.3 kDa; Apo30= 32.2 kDa.
도 40. Apo22-3( 비표적화된 프로- APO AI) T3 세대 종자의 아세포성 프랙션의 조사. 항- Apo AI 항체 및 성숙한 종자로부터 수용성 프렉션(AQ), 오일 바디(각각 PO 및UO, 사용된 총 오일 바디 약 20 ug )의 인산(PW), 우레아(UW) 세척액 및 마이크로소말(ER) 프렉션으로부터 분리된, 거의 동량의 총 단백질(50 ug)를 이용한 웨스턴 블랏. 면역 블랏의 폰세우-에스(Ponceau-S) 염색은 겔에 로딩된 관련 단백질 양을 보여준다(상위패널). 사람 혈청(0.5 ㎍)은 Apo AI 발현을 위한 양성 대조군으로 사용되었다. 분자량크기는 왼쪽에 표시되었다.
도 41. 나일 레드로 염색된 늦은 떡잎기 배 세포에서 발현된 Apo AI-GFP 종자-특이적인 구조물의 공초점 현미경 사진. (A- C) ApolO은 GFP에 융합된 비표적화된 성숙한 Apo AI. (D-F) Apoll은 GFP에 융합된 프로 Apo AI. (G-I) Apol2는 올레오신을 이용한 오일 바디에 표적하는 GFP에 융합된 성숙한 Apo AI. (Column 1) 녹색 채널. (Column 2) 붉은색 채널. (Column 3) 혼합 채널. Bar = 5 ㎛.
도 42. 나일 레드로 염색된 늦은 떡잎기 배 세포에서 발현된 Apo AI-GFP 종자-특이적인 구조물의 공초점 현미경 사진. (A- C) Apol3은 올레오신을 이용한 오 일 바디에 표적하는 GFP에 융합된 프로 Apo AI이다. (D-F) Apol5는 분비 기작을 표적하는 GFP에 융합하는 성숙한 Apo AI이다. (G-I) Apol6는 분비 기작을 표적하는 GFP에 융합하는 성숙한 Apo AI이다. (Column 1) 녹색 채널. (Column 2) 붉은색 채널. (Column 3) 혼합 채널. Bar = 5 ㎛.
도 42. 나일 레드로 염색된 늦은 떡잎기 배 세포에서 발현된 Apo AI-GFP 종자-특이적인 구조물의 공초점 현미경 사진. (A- C) Apol3은 올레오신을 이용한 오일 바디에 표적하는 GFP에 융합된 프로 Apo AI이다. (D-F) Apol5는 분비 기작을 표적하는 GFP에 융합하는 성숙한 Apo AI이다. (G-I) Apol6는 분비 기작을 표적하는 GFP에 융합하는 성숙한 Apo AI이다. (Column 1) 녹색 채널. (Column 2) 붉은색 채널. (Column 3) 혼합 채널. Bar = 5 ㎛.
도 43. 나일 레드로 염색된 늦은 떡잎기 배 세포에서 발현된 비표적화된 및 분비된 Apo AI-GFP 융합 단백질의 공초점 현미경 사진. (A- C) Apol7은 GFP에 융합된 비표적화된 프로 Apo AI이다. (D-H) Apol9는 분비 기작을 표적하는 GFP에 융합하는 성숙한 Apo AI이다. (J-L) Apo20은 분비 기작을 표적하는 GFP에 융합하는 프로 Apo AI이다. (Column 1) 녹색 채널. (Column 2) 붉은색 채널. (Column 3) 혼합 채널. Bar = 5 ㎛.
도 44. 잎 상피세포에서 발현되는 Apo AI-GFP 구성적 구성의 공초점 현미경 사진. (A-C) Apol7은 GFP에 융합된 비표적화된 성숙 Apo AI이다. (D-H) Apol9는 분비 기작을 표적하는 GFP에 융합하는 성숙한 Apo AI이다. (J-L) Apo20은 분비 기작을 표적하는 GFP에 융합하는 프로 Apo AI이다. (Column 1) 녹색 채널. (Column 2) 붉은색 채널. (Column 3) 혼합 채널. Bar = 5 ㎛.
도 45. 역상 크로마토 그래피에 의한 Apo25, Apo26 및 Apo28의 정제. (A) ApoAI 표준의 HPLC 결과 (B) Apo25의 HPLC 결과 (C) Apo26의 HPLC 결과 (D) Apo28의 HPLC 결과. 각 파장은 214, 254, 280 및 326 nm를 포함한다.
상기에서 진술한 것처럼, 본 발명은 트랜스제닉 식물에서 아포지질단백질을 생산하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 발명자들은 식물에서 아포지질단백질을 생산하는 것이 실현 가능할 뿐만 아니라, 종래의 방법보다 실질적인 이점을 제공한다는 것을 발견하였다. 식물에 기초한 생산을 위한 원료는, 특히 단백질이 식물종자에서 생산될 때 원료물질은 더 안정적이며, 또한 미생물 내독성이 없다. 따라서, 본 발명은 아포지질단백질의 제조를 위한 안전한 원료 물질을 제공한다. 또한, 아포지질단백질의 재조합 발현은 아포지질단백질을 상업적 규모로 제조하는 수준에서 다소 순수한 형태의 천연 아포지질단백질을 수득할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명에 따르는 식물에서 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 발현을 위한 방법은 하기를 포함하는 방법에서 제공된다:
(a) 작동가능하게 연결된 조성물로서 5'에서 3'의 전사 방향으로 다음을 포함하는 키메릭 핵산 구조물을 제공하고
(i) 식물세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열, 및
(ii) 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열,
(b) 식물세포 내로 키메릭 핵산 구조물을 삽입하는 방법: 및
(c) 아포지질단백질을 발현하는 성숙한 식물에 식물세포를 자라게 하는 방법
본 발명은 아포지질단백질 발현이 식물종자에서 재조합 단백질의 발현에 의해 수행될 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 하기를 포함하는 식물종자에서 아포지질단백질을 발현하기 위한 방법을 제공한다;
(a) 작동가능하게 연결된 성분으로 5'에서 3'의 전사 방향으로 다음을 포함하는 키메릭 핵산 구조물을 제공하는
(i) 식물세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열, 및
(ii) 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열,
(b) 식물세포 내로 키메릭 핵산구조물을 삽입하는 방법; 및
(c) 아포지질단백질을 발현하는 성숙한 식물에 식물세포를 자라게 하는 방법을 제공한다.
용어 및 정의
만약 다른 정의가 없다면, 본 발명에서 사용된 모든 기술용어 및 과학용어는 본 발명에 속하는 기술에 숙련된 기술자에 의해 일반적으로 이해할 수 있는 것과 같은 의미를 가질 것이다. 진뱅크(GenBank), 스위스프로(SwissPro) 및 설명서에 언급된 다른 데이터베이스로부터 핵산 및 폴리펩타이드를 포함하는 모든 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 출판물은 참조로 연관지어있다.
본 발명에서 사용된 용어, "핵산 서열"은 자연적으로 발생하는 염, 당, 및 인터슈거(골격) 결합으로 구성된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 단량체의 서열을 말한다. 용어는 또한 인공적으로 발생한 단량체 또는 그의 부분을 포함하는 변형된 또는 치환된 서열을 포함한다. 본 발명에서 핵산 서열은 데옥기리보뉴클레익산 서열(DNA) 또는 리보뉴클레익산(RNA)이 될 수 있으며, 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘 및 우라실을 포함하는 자연계에서 발생하는 염을 포함할 수 있다. 그러한 변형된 염기의 예는 아자 및 디아자 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘 및 우라실; 및 산틴 하이포산틴이 포함된다.
본 발명에서 교체하여 사용할 수 있는 용어 "아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열(nucleic acid sequence encoding apolipoprotein)" 및 "아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열(nucleic acid sequence encoding an apolipoprotein polypeptide)"은 일부 동물 아포지질 폴리펩타이드 및 프로-아포지질단백질 및 프리-프로-아포지질단백질을 암호하는 일부 핵산 서열을 포함하는 아포지질 폴리펩타이드를 암호화하는 일부 및 모든 핵산 서열을 말한다. 본 발명에서 사용된 "프로 아포지질단백질(pro apolipoprotein)"은 번역 후 잘려진 폴리펩타이드를 포함하는 아포지질단백질을 말한다. 천연 사람 아포지질단백질에서 프로-펩타이드는 6개의 아미노산 잔기 폴리펩타이드이다. 용어 "프리-프로-아포지질단백질(pre-pro-apolipoprotein)"은 폴리펩타이드 사슬의 세포 내 수송을 촉진하는 N-말단 신호서열을 추가로 포함하는 프로-아포지질단백질 분자를 말한다. 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 (i) 이의 앞쪽에 구성된 아포지질단백질 폴리펩타이드 서열에 실제로 동일한 폴리펩타이드를 암호하거나, (ii) 최소 적절하게 엄격한 혼성결합 조건하에서 이의 앞쪽에 구성된 일부 아포지질단백질 핵산 서열에 혼성결합하거나 또는 그의 최소 적절히 엄격한 조건이나 유사 코돈의 사용을 위한 조건하에서 혼성결합할 수 있는 어떤 및 모든 핵산 서열을 더 포함한다.
용어 "실질적으로 동일한(substantially identical)"은, 두 폴리펩타이드 서열이 바람직하게는 적어도 70% 이상 동일한, 더 바람직하게는 최고 85% 동일한 및 가장 바람직하게는 최소 95% 이상, 예로서 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 것을 의미한다. 두 폴리펩타이드 서열 사이의 동일성에 대한 백분률를 결정하기 위하여 그러한 두 서열의 아미노산 서열은 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunsch)의 정렬방법(J. Mol. Biol., 1970, 48: 443)의 실시예를 이용하여, 두 서열 사이에 얻어지고 높은 일치성 및 두 서열 사이에 결정된 동일한 아미노산 수를 스미스(Smith) 및 워터만(Waterman)에 의해 개정된 방법으로(Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482) 정렬시켰다. 두 아미노산 서열 사이에 동일성에 대한 백분율을 측정하기 위한 방법은 일반적으로 알려진 기술이며 예로서 카를로(Carillo) 및 립톤(Lipton)에 의해 기술된 방법(SIAM J. Applied Math., 1988, 48:1073) 및 컴퓨터 분자생물학(Computational Molecular Biology), 1988년, 뉴욕, 옥스포드 대학, 리스크 편집, 바이오컴퓨팅: 정보학 및 게놈프로젝트에서 기술된 방법을 포함한다. 일반적으로, 컴퓨터 프로그램은 그러한 계산을 할 것이다. 컴퓨터 프로그램은 GCG (Devereux 등의 Nucleic Acids Res., 1984, 12: 387) BLASTP, BLASTN 및 FASTA (Altschul 등의 J. Molec. Biol., 1990: 215: 403)를 포함하여 사용할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다. 두 서열 사이의 퍼센트 동일성을 결정하기 위한 특히 바람직한 방법은 클루스탈 W 알고리즘(Clustal W algorithm) (Thompson, JD, Higgines, DG 및 Gibson TJ, 1994, Nucleic Acid Res 22(22): 4673-4680) 및 ;본 발명에서 두 서열 중 하나의 전체 길이의 최소 50%에서 두 서열 사이에서 얻은 가장 높은 명령 일치가 정렬에 포함되기 때문에 갭 오픈닝 벌점 10점 및 갭 연장 벌점 0.1을 사용하는 블라슴(BLOSUM) 62 스코어링 매트릭스(Henikoff S & Henikoff, JG, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919)를 포함한다.
"최소한 적절히 엄격한 혼성결합 조건(at least moderately stringent hybridization conditions)"에 의해서, 용액 내에서 두 상보적인 핵산분자 간의 선택적인 혼성결합을 촉진하는 조건이 선택되는 것을 의미한다. 혼성결합은 모든 또는 부분적인 핵산 서열 분자에서 발생할 수 있다. 혼성 결합화 부분은 길이에서 전형적으로 적어도 15(예로서 20, 30, 40, 또는 50) 뉴클레오타이드이다. 이 숙련된 기술은 핵산 이중화 또는 혼성의 안정성이 나트륨이 포함된 완충용액에서 녹는점 온도는 나트륨 이온 농도 및 온도의 기능(Tm = 81.5℃ - 16.6 (Log10[Na+]) + 0.41(%(G+C) - 600/1), 또는 유사 방정식)인 녹는점 온도에 의해 결정됨을 알 수 있다. 따라서, 혼성 안정성을 결정하는 세척 조건의 파라메터는 나트륨 이온 농도 및 온도이다. 유사하나 동일하지 않은 분자를 정의하기 위하여, 알려진 핵산분자에 대하여 1% 불일치는 Tm에서 약 1℃ 감소의 결과를 추정할 수 있는데, 예를 들면 만약에 핵산 분자가 95% 이상의 동일성을 가진다고 조사되었다면, 마지막 세척온도는 약 5℃가 감소될 것이다. 이것에 기초를 두고, 이 숙련된 기술은 쉽게 적절한 혼성결합온도를 선택할 수 있을 것이다. 바람직한 양태에서 다음의 조건은 엄격한 혼성결합을 수행하기 위해 사용될 수 있다: 5x염화나트륨/시트릭산 나트륨 (SSC) /5 x 덴하르트 용액(Denhardt's solution)/1.0% SDS, Tm (상기 방정식을 기초로 하여) - 5℃에서 혼성결합, 다음으로 60℃에서 0.2 x SSC/0.1% SDS로 세척. 적절히 엄격한 혼성결합 조건은 42℃에서 3 x SSC로 세척하는 단계를 포함한다. 그러나 동일한 엄격성은 교체된 완충용액, 염 및 온도를 사용하여 수행될 수 있다고 이해된다. 혼성결합조건의 관점에서 추가적인 내용은 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1. - 6.3.6 및 Sambrook 등의 Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol.3.에서 확인할 수 있다.
본 발명에서 사용된 바와 같이 용어, "아포지질단백질(apolipoprotein)"과 "아포지질단백질 폴리펩타이드(apolipidprotein polypeptide)"는 모든 동물 아포지질단백질 폴리펩타이드와 아미노산 잔기 서열을 포함하는 폴리펩타이드 등의 아포지질단백질의 모든 폴리펩타이드 서열을 말하는 것으로, 여기에서 상기 아미노산 잔기 서열은 (i) 열거된 아포지질단백질 폴리펩타이드를 구성하는 아미노산 서열과 실제로 동일하거나 또는 (ii) 최소한 적절하게 엄격한 조건 하에서 열거된 아포지질단백질을 암호화하는 일부 핵산 서열에 대하여 최소한 적절히 엄격한 조건하에서 이의 혼성 결합할 수 있는 또는 구성 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열에 혼성화 할 수 있거나 또는 동등한 코돈을 사용하지만 최소한 적절하게 엄격한 조건 하에서 열겨된 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열에 혼성화 할 수 있는 핵산 서열에 의해 암호화된다. 바람직한 양태에서 이 아포지질단백질은 아포지질단백질 A-I(Apolipoprotein A-I (Apo AI)), 아포지질단백질 A-IV(Apo AIV), 아포지질단백질 A-V(Apo AV) 및 아포지질단백질 E(Apo E)을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
핵산 서열의 내용에서 사용된 용어, "키메릭(chimeric)"은 자연적으로 결합되지 않은 적어도 두 개의 결합된 핵산 서열을 말한다. 키메릭 핵산 서열은 자연적 기원이 다른 연결된 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어 사람 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열에 연결된 식물 프로모터를 구성하는 핵산 서열은 키메릭이라 고려될 수 있다. 키메릭 핵산 서열은 또한 자연적으로 연결된 것은 아니나 자연적 기원이 같은 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 특별한 세포타입으로부터 얻어진 프로모터로 구성된 핵산 서열은 같은 세포타입으로부터 얻어진 그러나 프로모터를 구성하는 핵산 서열에 정상적으로 연결되지 않은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 연결될 수 있다. 키메릭 핵산 서열은 또한 어떤 인공적으로 발생하는 핵산 서열에 연결된 어떤 자연적으로 발생하는 핵산 서열로 구성된 핵산 서열을 포함한다.
식물에서 발현을 조절할 수 있는 아포지질단백질 및 핵산 서열을 암호화하는 키메릭 핵산 서열로 구성된 재조합 발현 벡터의 제조
본 발명에서 제공된 방법 및 조성에 적합하게 사용될 수 있는 아포지질단백질을 암호화하는 핵산은 어떤 프로-아포지질단백질 및 프리-아포지질단백질을 포함하는 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화한 핵산 서열이 될 수 있다.
사람의 혈장에서 발견되는 수많은 다양한 아포지질단백질이 있으며, 그들은 신호로서 작용할 수 있는데, 그 신호는 지직단백질이 어떤 조직에서 작용하게 하거나 또는 상기한 지질단백질에 작용하는 효소를 활성화 시킨다(Lehninger, A. 등의 Principles of Biochemistry, second edition, New York, Worth Publishers, 1993). 이들 단백질은 아포지질단백질 A-I(Apo AI)의 대립유전자 및 이소형(isoforms)(Sharpe CR 등의 Nucleic Acids Res. 12 (9), 3917-3932 (1984)), Apo AIV (Elshourbagy NA 등의 J. Biol. Chem. 261 (5), 1998-2002 (1986)), Apo AV (Hubacek 등의 Physiol. Res. 2004. 53:225-228), Apo B-100 (Law SW 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83 (21), 8142-8146 (1986)), Apo B-48 (Powell LM 등의 Cell 50 (6), 831-840 (1987)) Apo C-II (Sharpe CR 등의 Nucleic Acids Res. 12 (9), 3917 3932 (1984)), Apo C-III (Sharpe CR 등의 Nucleic Acids Res. 12 (9), 3917-3932 (1984)), ApoC-IV (Allan CM 등의 Genomics 28 (2), 291-300 (1995)), Apo D (Drayna D 등의 J. Biol. Chem. 261 (35), 16535 16539 (1986)), Apo E (Brewslow JL 등의 J. Biol. Chem. 257 (24), 14639-14641 (1982)), Apo F (Day JR 등의 Biochem. Biophys. Res. Commun. 203 (2), 1146-1151 (1994)), Apo H (Mehdi,H. 등의 Gene 108 (2), 293-298 (1991) 및 Apo L (Duchatea=,P.N. 등의 J. Biol. Chem. 272 (41), 25576-25582 (1997))을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 아포지질단백질을 코딩하는 전형적인 핵산 서열은 기술에서 잘 알려져 있고 일반적으로 사람(상기), 돼지(Trieu VN 등의 Gene - 25 134 (2), 267-270 (1993)), 소( Yang,Y.W. 등의 J. Mol. Evol. 32.(6), 469-475 (1991)), 양(Robertson, J.A. 등의 J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 67 (4), 285-292 (1998)) 등을 포함하는 다양한 동물 기원으로부터 쉽게 활용 가능하다. 사용될 수 있는 사람 아포지질단백질을 암호화하는 서열로는 SEQ ID NO:1, 7 및 8 로서 앞쪽에 구성된 이 암호화 펩타이드 사슬 등이 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 비-사람 아포지질단백질 암호화서열은 SEQ ID NO: 9-55 및 241-251의 앞쪽에 지시되어있다. 아포지질단백질 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 각각 상응하는 핵산 서열은 표 1에 제공된 식별명으로 쉽게 확인할 수 있다. 이 핵산 서열을 사용하여, 추가로 새로운 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열이 기술에서 숙련된 잘 알려진 테크닉을 이용하여 쉽게 확인할 수 있다. 예를 들어 발현 라이브러리(libraries), cDNA 및 게놈 라이브러리 같은 라이브러리는 스크리닝 될 수 있고, 서열화 프로젝트로부터 서열정보를 포함하는 데이타베이스는 유사 서열을 검색할 수 있다. 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 분리하기 위한 다른 방법이 사용될 수 있고, 본 발명에 따라 새로운 서열이 발견되고 사용될 수 있다. 바람직한 양태로 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열은 사람, 돼지 및 소 아포지질단백질이다.
수많은 아포지질단백질의 유사체가 이전 기술에서 잘 알려져 있으며(Cheung MC 등의 Biochim Biophys Acta. 1988 May 2;960(1):73-82 및 Strobl W 등의 Pediatr Res. 1988 Aug;24(2):222-8) 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 여기서 사용된 유사체는 사람 아포지질단백질 분자를 포함하며, 여기에서 점 돌연변이, 결손돌연변이, 프레임쉬프트 돌연변이 및 화학 변이를 포함하는 다양한 천연 및 합성 돌연변이된 변이가 발견되고 있으나, 이로 제한되지 않는다. 본 발명에 따라 바람직한 양태에서, Apo AI-M으로 알려진 천연변이가 사용된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 돌연변이 및 변이의 예로서 표 2에 기재되어 있으나, 이로 제한되지 않는다.
바람직한 양태로, 사용된 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열은 프로-아포지질단백질이다.
아포지질단백질 유사체를 제조하기 위한 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열에 대한 변이는 부위 지향성 돌연변이(site dirested mutagenesis), 표적 돌연변이 생성(targeted mutagenesis), 랜덤 돌연변이생성(random mutagenesis), 유기용매첨가(the addition of organic solvents), 유전자 셔플링(gene shuffling) 또는 이분야의 기술자들에게 알려진 다른 기술을을 혼합하는 등, 이분야에서 숙련된 사람들에게 잘 알려진 다양한 핵산 변성기술을 이용하여 가능하다. 포함하여(Shraishi 등의, 1988, Arch. Biochem. Biophys, 358: 104-115; Galkin 등의, 1997, Protein Eng. TO: 687-690; Carugo 등의, 1997, Proteins 28: 10-28; Hurley 등의, 1996, Biochem, 35: 5670-5678; Holmberg 등의, 1999, Protein Eng. 12: 851 856) 숙련된 기술에서 잘 알려진 다양한 핵산 변이 테크닉을 이용하여 만들어질 수 있다.
이에 덧붙여 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열은 식물세포에서 아포지질단백질의 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열에 연결되어있다. 따라서, 본 발명은 또한 식물세포에서 발현을 조절하는 프로모터에 연결되어 있는 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 식물세포에서 발현을 조절하는 핵산 서열은 식물에서 폴리펩타이드의 발현을 조절하는 것이 가능한 어떤 식물유래의 프로모터를 포함한다. 일반적으로, 단자엽 식물 프로모터는 단자엽 식물 종이 선별되었을 때 사용되어 질 수 있는 것으로, 쌍자엽 식물 종으로부터 얻어진 프로모터는 쌍자엽 식물이 선별될 때 사용될 수 있다. 하나의 양태에서, 프로모터는 사용가능한 구성 프로모터는, 예를 들면 35S 콜리플라워 모자이크 바이러스 (cauliflower mosaic virus) (CaMV) 프로모터(Rothstein 등의 1987, Gene 53 153-161), 쌀 액틴 프로모터(rice actin promoter)(McElroy 등의 1990, Plant Cell 2:163-171; US Patent 6,429,357), 옥수수(corn) 유비퀴틴 프로모터(US Patents 5,879,903; 5,273,894)및 파슬리 유비퀴틴 프로모터(ICawalleck, P. 등의, 1993, Plant Mol. Biol. 21:673-684)와 같은 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터 등이 있다.
본 발명의 특히 더 바람직한 양태로, 아포지질단백질은 식물 종자에서 생산된다. 식물 종자에서 생산은 아포지질 단백질이 저장된 종자로부터 추출이 그의 화성이 남아있기 때문에, 원료물질로서 아포지질단백질의 저장과 선적에서 유연성을 제공한다. 더군다나, 추출을 목적으로 하는 필요한 많은 바이오메스(biomass)가 식물종자에서 현재 낮은 수분함량에 기인하여 제한된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태에서 식물세포는 종자세포이고 식물은 종자를 형성할 수 있는 가능한 성숙한 식물에서 자라게 하며, 이에 종자는 아포지질단백질을 발현한다. 더 바람직한 양태로 식물세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열은 파세올린(phaseolin) 프로모터와 같은 종자-선호적인 프로모터이다. 일부 양태에서 종자조직에서 아포지질 단백질의 바람직한 발현에서 결과되는 프로모터가 사용된다. 이에 관련하여, 바람직하게 성숙한 식물에서 총 재조합 단백질의 최소 80%가 종자에 존재하기 때문에, "종자 우선프로모터(Seed-preferred promoters)"는 재조합 단백질(즉 아포지질단백질)을 발현을 조절하는 프로모터이다. 더욱 바람직하게는 성숙한 식물에서 총 재조합 단백질의 최소 90% 이상의 종자에 존재한다. 가장 바람직하게는 성숙한 식물에서 총 재조합 단백질의 최소 95%가 종자에 존재한다. 이 점에서 사용되어 질 수 있는 종자-선호적인 프로모터는, 예를 들어 콩 파세올린 프로모터(Sengupta- Gopalan 등의 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3320- 3324); 아라비돕시스(Arabidopsis) 18 kDa 올레신(oleosin) 프로모터 (미국 특허 제 5,792,922호) 또는 아마(flax) 올레오신 프로모터 (국제특허 WO 01/16340); 아마 2S 레구민(legumin) 유사 종자 저장 단백질(리닌(linin)) 프로모터 (국제특허 WO 01/16340); 아마 저장 단백질 프로모터 (국제특허 WO 01/16340); Amy32b 프로모터(Rogers and Milliman, J. Biol. Chem., 1984, 259: 12234- 12240), Amy6-4 프로모터(Kursheed and Rogers, J. Biol. Chem., 1988, 263: 18953-18960) 또는 알루레인(Aleurain) 프로모터(Whittier 등의, 1987, Nucleic Acids Res., 15: 2515-2535)과 같은 내배유 우선 프로모터 또는 콩 알셀린(arcelin) 프로모터(Jaeger GD, 등의 , 2002, Nat. Biotechnol Dec;20:1265-8)를 포함한다. 다양한 식물에서 유용가능한 새로운 프로모터는 끊임없이 발견된다. 수많은 식물 프로모터의 예가 오하무라(Ohamuro)(Biochem. of Pints., 1989, 15: 1- 82) 등에서 발견될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서 키메릭 핵산 서열은 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열에 대한 리딩 프레임에 연결된 안정화된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 더 포함한다. 안정화된 폴리펩타이드는 단백질 폴딩을 촉진하기 위해 및/또는 식물 세포에서 아포지질단백질의 안정한 축적을 증가시키기 위해 사용된다. 추가로 안정화 폴리펩타이드는 식물 세포 내 바람직하게 위치된 아포지질 단백질을 표적화 및/또는 아포지질단백질의 정제를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게 아포지질단백질의 부재에서 폴리펩타이드인 안정화 폴리펩타이드는 트랜스제닉 식물에 쉽게 발현될 수 있고, 안정하게 축적된다. 안정화 폴리펩타이드는 식물 특이적이거나 비-식물 특이적인 폴리펩타이드 일 수 있다. 본 발명에 따라 사용되어 질 수 있는 식물 특이적인 폴리펩타이드는 오일 바디 단백질 및 티오레독신 예로서 SEQ ID NO:56 에서 보여준 티오레독신을 포함한다. 그에 따라 사용 가능한 비-식물 특이적인 안정화 폴리펩타이드는 초록색 형광물질(green fluorescent protein (GFP)(Davis and Vierstra, 1996, Weeds World 3(2):43-48) (SEQ ID NO:57) 및 단일사슬항생제 또는 그의 단편을 포함한다. 바람직하게 비-식물특이적 폴리펩타이드는 식물에서 적절한 발현을 코돈 최적화된 것이다.
본 발명에 바람직하게 사용되는 사용된 단일 사슬 항체 또는 항체는 아포지질단백질의 정제를 촉진하는 단일 사슬 항체 및 그의 단편을 포함한다. 이에 따라서, 예로서 오일 바디 또는 오일 바디 단백질과 특이하게 결합 가능한 단일 사슬 항체 또는 그의 단편이 사용될 수 있는데, 그리하여 식물종자로부터 쉽게 얻을 수 있는 오일 바디 프랙션(fraction)과 아포지질단백질을 함께 정제할 수 있다. 단일 사슬 항체는 아포지질단백질이 발현되는 종자로부터 얻을 수 있는 오일 바디 단백질과 결합가능한데, 즉 아라비돕시스 식물 세포가 사용된 발명의 양태에서, 단일사슬항체 또는 그의 단편은 아라비돕시스 오일 바디 단백질과 결합 가능한 것이 선택된다. 더 바람직한 양태로, 단일사슬항체는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis taliana)(D9scFv)로 부터 18 kDa의 올레오신과 특이하게 결합가능한 단일사슬 FV 항체이다. 가장 바람직한 양태로, 단일사슬항체는 SEQ ID NO:240에서 보여진다. 본 발명에서 사용된 용어 "단일 사슬 항체 단편(single chain antibody fragment)"(scFv) 또는 "항체단편(antibody fragment)"은 VH-L-VL로 표시되는 펩타이드 링커(L)에 의해 중쇄 가변영역(VH)에 연결된 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. VL 및 VH 도메인의 순서는 폴리펩타이드를 얻기 위해 뒤바껴 질 수 있다. "도메인"은 항원 결합부위 또는 항원 인식부위처럼 기능적 분리가 추정되는 단백질의 단편이다. 본 발명에서 단일사슬 항체 단편은 어떤 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변부위로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 경쇄 및 중쇄 가변부위가 같은 항원에 대해 특이적이다. 가장 바람직하게는 항원이 오일 바디 단백질이다. 다원자가의 단일사슬 항체로부터 결합된 각각의 항체 단편은 같은 항원에 대해 지시될 수 있거나 다른 항원에 대해 지시되어 질 수 있다. 단일사슬 항체를 생산하는 방법은 공지기술에 잘 알려져 있다. 예로서, 단일사슬 항체는 단일사슬(scFV) 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝에 의해 생성될 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 단일사슬항체를 생산하는 방법은 공지기술에 잘 알려져 있다. 맥카티(McCarrerty) 등(Nature 348: 552-554)은 항체의 단편이 파지의 표면에서 단일사슬 항체의 발현을 허락하는 fd 파지 벡터와 융합 단백질로서 발현되는 항체 단편에서 파지-디스플레이 시스템의 사용을 입증하였다. 단일사슬 항체 디스플레이 라이브러리의 생산은 예를 들어, 아머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences) 및 캠브리지 안티바디 테크놀로지(Cambridge Antibody Technology)에 의해 개발된 재조합 파지 항체 시스템을 사용하여 수행될 수 있다. 세부 실험 방법은 생쥐 scFV 분자, 발현모듈 및 검출모듈을 포함하는 3' 부분으로 판매되는, 아머샴 바이오사이언스로부터 활용가능하다. 간단하게. 단일사슬 항체의 생산을 위한 프로토콜은 하기에 따른다. 메신저(messenger) RNA는 흥미있는 항원으로 면역화시킨 생쥐로부터 생쥐 하이브리도마 또는 생쥐 비장세포 둘 모두에서 얻어질 수 있다. 생쥐 하이브리도마는 단일 항체 경쇄 및 중쇄를 발현되지만 면역화된 생쥐의 비장 세포를 이용하여 클론될 있으며 클론된 항체 유전자의 가장 풍부한 공급원이다. mRNA는 역전사효소 및 램덤 6-머(hexamer) 프라이머를 사용하여 cDNA로 전환된다. 랜덤 6-머를사용하여 중쇄 및 경쇄의 가변부위를 클론하기 위한 충분한 길이인 cDNA 분자를 얻게된다. cDNA 분자가 생성된 후에, 1차 PCR 반응은 중쇄와 경쇄의 각각의 가변부위를 증폭시키기 위해 수행된다. 프라이머는 사슬의 반대편 끝에 혼성결합에 의해 중쇄 또는 경쇄 가변부위를 증폭하기 위해 고안되었다. 일단 가변부위가 증폭이 되면, PCR 반응은 아가로스 겔 전기영동에 걸고 겔은 프라이머와 PCR 반응 산물 외의 물질을 제거하기 위해 정제되었다. 일단 중쇄와 경쇄의 가변 부위가 정제되면, 링커를 이용하여 단일 유전자로 결집시켰다. 링커 부위는 정확한 리딩프레임이 중쇄와 경쇄 사이에 유지되도록 고안되었다. 예를 들면, 중쇄 가변(VH) 및 경쇄 가변(VL)은 약 750 염기쌍 길이의 단일 사슬 항체 단편(scFv)을 얻기 위해(Gly4Ser)3 링커를 이용하여 연결할 수 있다. 한번 중쇄 및 경쇄가 링커로 연결되면 2차 PCR 반응은 병합된 scFv DNA 단편을 증폭하기 위해 수행된다. 프라이머는 페이지미드 발현벡터 내로 클로닝 하기 위한 제한효소 자리를 삽입하기 위해 고안될 수 있다. 예를 들면, pCANTAB 5 E 벡터(아머샴 바이오사이언스) 내에 클로닝하기 위해 이 scFv 유전자의 5' 및 3'말단에 Sfi I 및 Not I 자리를 추가할 수 있다. 한번 PCR이 완성되면, DNA 단편은 병합하지 않은 프라이머와 dNTPs를 제거하기 위해 정제될 수 있다. 이것은 스핀 컬럼에 의한 정제를 이용하여 수행될 수 있다. 한번 DNA 단편이 정제되고 정량되면, 단편은 적절한 발현벡터에 클로닝하기 위해 적절한 제한효소로 절단했다. DNA 단편은 그후에 발현벡터 예를 들어, pCANTAB 5E (아머샴 바이오 사이언스)에 라이게이션 시켰고, 컴피턴트(competent) 대장균(E. coli) 세포에 삽입시켰다. 이 세포는 발현벡터를 포함하는 세포만 자라게 하는 적절한 배지(즉, 특이한 탄소원 및 항생제 선택성)에 자라게 할 수 있다. 한번 대장균이 자라게 되면, 페이지미드-포함 콜로니는 scFv 단편을 디스플레이하는 재조합 페이지를 수득하기 위해 M13 헬퍼(helper) 페이지(phage)(i.e. KO7 - 아머샴 바이오사이언스)에 감염시켰다. M13 페이지(phage)는 페이지 복제를 시작할 것이고 그들의 표면에 scFv를 발현하는 완벽한 페이지 입자는 세포로부터 생산될 것이다. 정확한 scFv 항체를 나타내는 페이지는 특이 항원을 사용하여 패닝(panning)으로 정의된다. 비-특이적인 페이지를 제거하기 위하여, 재조합 페이지 배양은 항원-코팅된 지지대(즉, 플라스크 또는 튜브)에 옮겨지고, 세척된다. 정확한 scFv를 나타내는 페이지만 지지대에 결합될 것이다. 대장균의 민감한 종은 결국 항원-코팅된 지지대에 결합된 페이지와 결합하였다. 페이지는 헬퍼 페이지와 리스큐잉 및 다수 배의 항원에 대한 패닝(panning)에 의해 대량배양될 수 있거나 더 이상의 배양 없이 고체배양액에 직접적으로 플레이팅 될 수 있다. 적절한 항원에 대하여 선택된 페이지로 감염된 대장균을 플레이팅하고 각 콜로니를 선택한다. 각 콜로니로부터 얻은 페이지는 예로서 ELISA 어쎄이(enzyme-linked immunosorbent assay)를 사용하여 어쎄이된다. ELISA 어쎄이를 사용하여 양성인 페이지 항체는 그때 수용성 항체의 생산을 위하여 대장균 HB2151 세포에 감염시켜 사용한다. 한번 적절한 클론이 선택되면 scFv 항체 유전자의 서열이 정의 되고, 본 발명에 사용된다.
안정화 단백질은 아포지질단백질을 자유 천연형태로 방출시키기 위하여 절단될 수 있는 링커를 통하여 아포지질단백질에 연결될 수 있다. 이 점에서 포함될 수 있는 링커는 펙터(Factor) Xa, IgA 단백질분해효소(protease), 또는 엔테로키나아제(enterokinase)에 의해 인식되는 펩타이드 서열을 포함한다. 특히 바람직한 양태에서 링커는 국제 특허 출원 WO98/49326에서 제시된 성숙한 카이모신으로 절단할 수 있는 카이모신 프로-서열을 암호화한다.
바람직한 양태에서 키메릭 핵산 서열은 "표적 신호"를 더 포함한다. 본 발명에서 사용된 표적신호는 아포지질단백질 펩타이드가 발현되었을 때 식물 내에서 바람직한 위치로 지시하는 것이 가능한 어떤 아미노산 서열을 의미한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 적합한 표적화 신호는 소포체로 아포지질단백질 표적화가 가능한, 또는 오일 바디 및 아포플라스트와 같은 소포체로부터 유래한 저장낭을 포함한다.
소포체 또는 소포체 유래의 저장낭에 아포지질단백질의 축적을 수행하기 위하여, 아포지질단백질을 암호화하는 폴리펩타이드는 아포지질단백질을 소포체 또는 소포체 유래의 저장낭에 보유할 수 있는 표적신호에 연결되어있다. 본 발명의 바람직한 예로, 소포체에 아포지질단백질을 남도록 할 수 있는 표적신호는 C-말단 소포체 리텐션(retension)-모티프를 포함한다. 그러한 C-말단 소포체 보유-모티프의 예로 KDEL, HDEL, DDEL, ADEL 및 SDEL 서열을 포함한다. 다른 예로 HDEF (Lehmann 등의 2001, Plant Physiol. 127(2): 436-439), 또는 위치 2 및 3, 3 및 4 또는 4 및 5에 위치한 N-말단에 근접한 두 개의 아르기닌 잔기 (Plant Biology 2001 Program, ASPB, July 2001, Providence, Rhode Island, USA의 요약)를 포함한다. C-말단 모티프를 암호화한 핵산 서열은 바람직하게 소포체에 아포지질단백질을 보유하는 폴리펩타이드가 아포지질단백질 폴리펩타이드의 C-말단에 연결된 방식으로 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열과 연결되어있다.
아포지질단백질이 소포체에 남겨지는 본 발명의 바람직한 양태에서 키메릭 핵산 서열은 추가적으로 내막 시스템("신호 펩타이드")에 핵산 서열을 표적화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 아포지질단백질 폴리펩타이드가 KDEL, FIDEL 또는 SDEL 폴레펩타이드와 같은 서열을 이용하여 소포체에 남겨지는 본 발명의 바람직한 양태에서, 신호펩타이드를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 것이 특히 바람직하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 신호펩타이드의 예로는 담배(tobacco) 질병 관련 단백질(pathogenesis related protein (PR-S)) 신호서열(SEQ.ID. NO:58) (Sijmons 등의 1990, Bio/technology, 8:217-221), 렉틴 신호서열(BoeLn 등의 2000, Transgenic Res, 9(6):477-86), 파세로스 불가리스(Phaseolus vulgaris) 하이드록시프롤린이 풍부한 당단백질의 신호 서열(Yen 등의 1997, Plant Phyiol. 115(3):915-24 및 Corbin 등의 1987, Mol Cell Biol 7(12):4337-44), 감자 파타틴신호서열(Iturriaga, G 등의 1989, Plant Cell 1:381-390 및 Bevan 등의 1986, Nuc. Acids Res. 41:4625-4638.) 및 보리의 알파 아밀라아제 신호 서열(Rasmussen and Johansson, 1992, Plant Mol. Biol.18(2):423-7)등이 있다. 본 발명의 실시예 3은 소포체에서 아포지질 단백질의 축적을 보여준다.
더 바람직한 양태에서, 아포지질단백질은 폴리펩타이드는 소포체-유래의 저장낭에 아포지질단백질 폴리펩타이드를 보유할 수 있는 폴리펩타이드에 연결된다. 바람직한 양태에서, 소포체 유래의 저장낭은 오일 바디이며 아포지질단백질은 오일 바디 단백질과 연결된다. 이 점에서 사용될 수 있는 오일 바디 단백질은 오일 바디와 자연적으로 연결된 어떤 단백질을 포함한다(표 3의 SEQ ID NOs:59-137 참조). 오일 바디 단백질 폴리펩타이드사슬을 암호화하는 각각의 대응 핵산 서열은 표 3에 제공된 기탁 번호에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 이들 핵산 서열을 사용하여, 추가의 신규한 오일 바디 단백질 암호화 핵산서열은 공지기술에서 알려진 테크닉을 이용하여 쉽게 확인될 수 있다. 예를 들어, 발현 라이브러리, cDNA 및 게놈 라이브러리와 같은 라이브러리는 스크린 될 수 있으며 서열 프로젝트로부터 서열정보를 포함하는 데이터베이스는 유사 서열을 검색할 수 있다. 오일 바디 단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 추가적인 핵산 서열을 분리하기 위한 다른 방법이 사용될 수 있고, 본 발명에 따라 새로운 서열은 발견되고 사용된다. 가장 바람직한 오일 바디 단백질은 올레오신이며, 예로서, 옥수수 올레오신(Bowman- Vance 등의 1987, J. Biol. Chem. 262: 11275 11279; Qu 등의 1990, J. Biol. Chem. 265: 2238-2243 또는 Brassica (Lee 등의, 1991, Plant Physiol. 96: 1395-1397), 칼레오신(caleosin)(Genbank 취득번호 AF067857) 및 스테롤레오신(steroleosins) (Lin 등의 2002 Plant Physiol. 128(4):1200- 11)이 있다. 더 바람직한 양태에서, 오일 바디 단백질은 식물 올레오신이고 아라비돕시스 탈리아나로부터 분리된 올레오신 처럼 다른 식물 올레오신과 서열 유사성을 공유한다. 다른 양태에서, 오일 바디 단백질은 식물, 곰팡이 또는 다른 공급원으로부터의 칼레오신 또는 칼슘 결합 단백질이며, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(SEQ ID NO:140 and SEQ ID NO:141)로부터 분리한 칼레오신 등의 식물 칼레오신과 서열 유사성을 공유한다. 다른 하나의 양태에서, 오일 바디 단백질은 스테롤레오신(SEQ ID NO:142), 스테롤 결합 탈가수분해효소(sterol binding dehydrogenase) (Lin L-J 등의 (2002) Plant Physiol 128: 1200-1211)이다. 본 발명의 이 양태는 실시예 3에 설명되어 있다.
추가로, 본 발명에 따르면, 아포지질 단백질은 또한 아포지질 단백질이 표적화 신호를 포함하지 않는 방식으로, 그러나 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열이 아포지질단백질 프로-펩타이드를 포함할 때, 아포지질단백질을 발현에 의한 오일 바디에 대해 표적화 될 수 있다. 본 발명의 양태는 실시예 3에 설명되었다.
소포체 또는 소포체 유래의 저장낭 내에 아포지질 단백질을 보유할 수 있는 폴리펩타이드는 일반적으로 절단되지 않고 아포지질단백질이 융합 단백질의 형태로 축적될 수 있는데, 이는 예를 들면 KDEL 보유 신호가 소포체 내 단백질을 남기게 하기 위하여 사용되거나 오일 바디 단백질이 오일 바디의 폴리펩타이드로 남겨지도록 사용되는 전형적인 경우다.
본 발명의 다른 양태에서 아포지질단백질 폴리펩타이드는 아포플라스트에 폴리펩타이드가 축적되는 방식으로 발현된다. 그러한 축적을 수행하기 위하여 키메릭 핵산 서열은 바람직하게는 소포체에 아포지질단백질 폴리펩타이드("신호 펩타이드")를 지시할 수 있는 표적서열을 포함한다.
본 발명에서 언급한 신호 펩타이드는 상기에 언급한 담배 병리학 관련 단백질(pathogenesis related protein (PR-S)) 신호서열(SEQ.ID.NO:58) (Sijmons 등의 1990, Bio/technology, 8:217-221), 렉틴 신호 서열(Boehn 등의 2000, Transgenic Res, 9(6):477-86), 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)의 하이드록시프롤린이 풍부한 당단백질의 신호서열(Yan 등의 1997, Plant Phyiol. 115(3):915-24 및 Corbin 등의 1987, Mol Cell Biol 7(12):4337-44), 감자 파타틴(patatin) 신호서열(Iturriaga, G 등의 1989, Plant Cell 1:381-390 및 Bevan 등의 1986, Nuc. Acids Res. 41:4625-4638) 및 보리 알파 아밀라아제 신호 서열(Rasmussen 및 Johansson, 1992, Plant Mol. Biol. 18(2):423-7) 등을 포함한다. 그러한 표적 서열은 생체내에서 아포지질 단백질 폴리펩타이드로부터 절단될 수 있는데, 예를 들어 이는 담배 병리학 관련 단백질 S (PR-S) 신호 서열(Sijmons 등의 1990, Bio/technology, 8:217-221)등의 아포플라스트 표적화 신호가 사용된 전형적인 경우이다. 다른 신호 펩타이드는 다른 생물의 아미노산 서열에서 신호 펩타이드 절단부위의 존재 및 위치를 예견되는 시그널 피 월드 와이드 웹 서버(SignalP World Wide Web server) (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)을 사용하여 예견될 수 있다. 비록 일반적인 물리화학적 성질이 일부 범위에 보존되어 있다 할지라도 일반적으로 초기 아미노산 서열의 보존이 거의 없다. 신호펩타이드의 특유의 구조는 3 부위를 가지며, 짧은 아미노-말단 "n-부위"는 양성 전자의 잔기를 포함하며, 중심부 소수성 "h-부위"는 7에서 15의 아미노산의 크기 범위이며 카복시-말단 "c-말단"은 극성 아미노산 및 막-연결된 신호 펩티다아제 효소로 인식되는 절단자리를 포함한다(Nakai K., 2000, Advances in Protein Chem 54:277-344). 이에 따라 사용될 수 있는 표적 신호는 천연 아포지질단백질 신호서열(사람 서열의 경우 18 아미노산 길이)을 포함한다. 이의 바람직한 양태로 상기 언급한 담배 PR-S 서열과 같은 N-말단에 위치한 아포플라스트 표적 서열은 KDEL 서열과 같은 C-말단에 위치한 소포체 보유 서열과 병합 사용된다.
더 바람직한 양태에서, 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열은 아포지질단백질이 세포질에 축적되는 방식으로 발현된다. 이런 양태에서, 핵산 서열은 표적신호를 포함하지 않는다. 바람직하게 이런 양태에서, 아포지질단백질은 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein (GFP))과 같은 더 안정화된 폴리펩타이드를 포함한다.
키메릭 핵산 서열은 또한 N- 및/또는 C- 말단 폴리펩타이드 연장을 포함할 수 있다. 그러한 연장은 아포지질단백질 폴리펩타이드 사슬 폴딩에서 안정화 및/또는 어시스트를 포함할 수 있거나 오일 바디 같은 세포내 구성성분의 표적화를 촉진할 수 있다. 본 발명에서 사용된 폴리펩타이드 연장은 예로서 단일 사슬 항체를 암호화하는 핵산 서열 또는 녹색 형광단백질을 암호화하는 핵산 서열(Davis and Vierstra, 1996, Weeds World 3(2):43-48) 또는 그 폴리펩타이드의 병합을 포함한다. 특별히 바람직한 단일사슬항체 연장은 오일 바디 프랙션과 연결된 아포지질단백질의 정제를 촉진하기 위하여 오일 바디와 아포지질단백질의 결합하는 것을 포함한다. 그러한 연장은 아포지질단백질은 식물 종자에서 발현되고 종자세포 내 소포체로 또는 아포플라스트 내에 표적되는 본 발명의 양태에서 바람직하게 포함된다.
다른 양태에서, 아포지질단백질 A-I이 융합 파트너로부터 절단되고 그 분리된 아포지질단백질 A-I를 분리하기 위해, 절단 자리는 아포지질단백질 A-I 펩타이드의 N-말단의 상위 또는 C-말단의 하위방향에 존재할 수 있다. 이러한 절단자리의 자리의 예는 국제특허 출원 제 WO98/49326호(융합 단백질의 절단 방법)과 관련 출원 및 라발리(LaVallie) 등(1994)의 Enzynmatic and chemical cleavage of fusion proteins In Current Protocols in Molecular Biology pp 16.4.5-16.4.17 John Wiley and Sons, Inc., New York NY)에 자세히 수록되었다. 바람직한 양태에서 절단자리는 키모신을 포함하는 아스파라틱 절단효소에 의해 절단될 수 있는 KLIP 8이다(SEQ ID NO:143). 다른 양태에서 여분의 메티오닌 잔기는 APO AI 폴리펩타이드 및 프로-APO AI 폴리펩타이드의 N-말단에 추가된다.
본 발명은 오일 바디 프랙션을 세분화하고 이종 단백질-오일 바디 단백질 융합의 특이적 분해에 의해 이종 단백질을 방출하여 숙주세포 성분으로부터 이종단백질을 분리하는 방법을 제공한다. 부가적으로, 절단자리는 융합 폴리펩타이드가 그의 조성 펩타이드 내 층 분리에 의해 잘려지고 분리되는 것을 허락하기 위하여, 이형 폴리펩타이드 N-말단의 상위 및 C-말단의 하위방향에 존재할 수 있다.
아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열은 발현수준을 향상시키기 위하여 교체될 수 있는데, 그 예로서, 아포지질단백질 폴리펩타이드의 발현을 위해 선택된 특수한 식물세포타입의 바람직한 양이온 사용으로 이에 따르는 핵산 서열을 적정화(PCT Patent Application 97/02352 참조) 하는 방법 또는 mRNA를 불안정하게 하는 것으로 잘 알려져 있는 모티프의 교체에 의해 향상될 수 있다. 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 식물타입의 코돈 사용과 핵산의 코돈 사용의 비교는 변화가능한 양이온의 증명할 수 있을 것이다. 양이온 사용 교체에 의한 합성 유전자의 구성은 PCT 특허 발명 93/07278의 예에서 설명된다.
바람직한 양태에서, 사용되는 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열은 SEQ.ID.NO 1, SEQ.ID.NO. 3 또는 SEQ.ID.NO.5로 나타내었다.
아포지질 폴리펩타이드의 발현을 증진시키는 일부 유전적 요소가 본 발명에 사용될 수 있다. 이 요소는 번역되지 않는 일부바이러스의 리더 서열(leader sequences), 예를 들면 AMV 지도서열(Jobling 및 Gehrke, 1987, Nature, 325: 622-625) 및 옥수수 유비퀴틴 프로모터와 연결된 인트론이 포함된다(미국 특허 제 5,504,200호). 일반적으로 키메릭 핵산 서열은 발현을 향상시킬 수 있는 유전적 요소가 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 5'에 존재하게 제조될 수 있다.
본 발명에 따르면 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산서열에 연결된 식물에서 발현을 조절할 수 있는 프로모터를 포함하는 키메릭 핵산 서열은 세포내 양호한 발현을 보증하는 재조합 발현 벡터 내로 삽입시킬 수 있다. 따라서 본 발명은 적절히 연결된 조성으로서 5'에서 3'의 전사 방향으로 다음을 포함하는 재조합 발현벡터를 포함한다:
(i) 식물세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산 서열; 및
(ii) 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열;
상기에서 발현벡터는 식물세포의 발현에 적합한 것이다. 용어 "식물세포에 발현되기 적합한"은 재조합 발현벡터가 식물세포에서 발현될 때 요구되는 유전적 요소와 연결된 본 발명의 키메릭 핵산 서열을 의미한다. 이 점에서 발현벡터에 포함되어질 수 있는 유전적 요소는 전사종결부위, 하나 이상의 마커 유전자를 암호화하는 핵산 서열, 하나 이상의 복제원점 등을 포함한다. 바람직한 양태에서 발현벡터는 벡터 또는 식물세포의 핵산 게놈의 일부 예로서, 아그로박테리움을 이용하여 식물세포를 형질전화시킨 본 발명의 양태에서 식물의 핵의 게놈에 삽입을 촉진하는 T-DNA의 왼쪽 및 오른쪽 경계 서열에 삽입하기 위해 요구되는 유전적 요소를 더 포함한다. 더 바람직한 양태에서 식물세포는 식물종자세포이다.
상기에서 언급한, 재조합 발현벡터는 일반적으로 전사종결을 위한 신호로서 작용하는 이외에 mRNA 반감기를 연장하는 방어요소로 작용할 수 있는 전사 종결자를 포함한다(Guarneros 등의 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 238-242). 전사 종결자는 일반적으로 약 200 뉴클레오타이드에서 1000 뉴클레오타이드이며 발현벡터에 전사종결자는 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열의 3'에 존재한다. 여기서 사용할 수 있는 종결서열은 예를 들면, 노팔린(nopalin) 종결 부위(Bevan 등의, 1983, Nucl. Acids. Res., 11: 369-385), 파세올린(phaseolin) 종결자(van der Geest 등의 1994, Plant J. 6: 413-423), 알세린(arcelin) 종결자(Jaeger GD, 등의 2002, Nat. Biotechnol. 20:1265-8), 아그로벡테리움 투메파시엔 의 옥토핀(octopine) 합성 유전자의 종결자 또는 다른 유사 기능의 요소를 포함한다. 전사종결은 An에 의해 기술된 방법으로 얻을 수 있다(An, 1987, Methods in Enzym. 153: 292).
본 발명에 따르면 발현벡터는 또한 마커유전자를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용된 마커 유전자는 선택적 및 스크리닝 마커 유전자를 포함하는, 비-형질전환 세포로부터 형질전환 세포를 구별하는 모든 유전자를 포함한다. 마커 유전자는 항생제 저항성 마커와 같은 저항성 마커일 수 있으며, 항생제의 예를 들면, 정상적인 식물독소의 당 만노스(Negrotto 등의 2000, Plant Cell Rep. 19: 798- 803)와 같은 화학적 요인에 대한 저항성 마커 또는 화학적 값에 의한 특징의 선택을 허락하는 가나마이신(US Patent 6,174,724), 암피실린, G418, 블레오마이신(bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin)이 있다. 여기서 사용할 수 있는 다른 손쉬운 마커는 글리포사이트(US Patents 4,940,935; 5, 188,642), 포스피노트리신(phosphinothricin)(US Patent 5,879,903) 또는 술포닐우레아(sulphonyl ureas)(US Patent 5,633,437) 와 같은 제초제에 대해 저항성 있는 마커를 포함한다. 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에 매우 근접하여 연결되었을 때, 저항성 마커는 식물세포의 개체군 또는 아포지질단백질 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 잃어버리지 않은 식물에 선택 압력을 유지하기 위해 사용될 수 있다. 비쥬얼 조사를 통하여 형질전환체를 정의할 수 있는 스크리닝 마커는 글루쿠로니데이즈(glucuronidase (GUS)) (US Patents 5,268,463 및 5,599,670) 및 녹색 형광 단백질(GFP)(Niedz 등의, 1995, Plant Cell Rep., 14: 403).
식물 내에 핵산 서열의 삽입을 위해 적합한 재조합 벡터는 Ti 및 Ri 플라스미드와 같은 아그로박테리움(Agrobacterium) 및 리조비움(Rhizobium)에 기초한 벡터가 있으며, 그 예로는 pBIN19 (Bevan, Nucl.Acid. Res., 1984, 22: 8711-8721), pGKB5 (Bouchez 등의 1993, C R Acad. Sci. Paris, Life Sciences, 316:1188-1193), 양성 벡터의 pCGN 시리즈(McBride and Summerfelt, 1990, Plant Mol. Biol., 14:269- 276) 및 다른 양성 벡터(예로서, 미국 특허 4,940,838)가 포함된다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 분자생물학적 숙련된 기술에서 잘 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 그러한 제조는 전형적으로 인터미디어리 클로닝 호스트로서 박테리아 종인 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)기 포함될 것이다. 콜라이(대장균) 벡터의 제조에서처럼 식물의 형질전환 벡터 제조도 제한 효소, 라이게이션, 겔 전기영동, DNA 서열화, PCR 및 다른 방법과 같은 일반적인 공지 기술로 수행할 수 있다. 클로닝 벡터의 무수한 다양성은 재조합 발현벡터를 제조를 위한 필요한 단계에서 활용가능하다. 이 콜라이의 기능적인 복제 시스템을 가진 벡터들 사이에 pBR322, pUC 시리즈 벡터, M13mp 시리즈 벡터, pBluescript 등과 같은 벡터가 있다. 전형적으로, 이 클로닝 벡터들은 형질전환 세포를 선택할 수 있는 마커를 포함한다. 핵산 서열은 이 벡터들에 삽입되고, 벡터들은 적당한 배지에서 자란 이 콜라이에 삽입될 것이다. 재조합 발현벡터는 세포의 수확 및 용해에 의해 쉽게 세포로부터 회수가능하다. 더군다나, 재조합벡터의 제조에 대한 일반적인 가이드는 삼부르크의(Sambrook) Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol.3.에 잘 예시되어 있다.
아포지질단백질을 발현할 수 있는 종자를 포함하는 식물의 제조
본 발명에 따르면 키메릭 핵산 서열은 식물세포에 삽입되고 성숙한 식물 내에 자라게 했으며, 본 발명에서 식물은 아포지질단백질을 발현한다.
이에 따라, 일부 식물종 또는 식물세포가 선택된다. 특히 본 발명에서 사용된 세포는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 브라질넛(Betholettia excelsa); 카스토 빈(Riccinus communis); 코코넛(coconut (Cocus nucifera)); 코리안더(coriander (Coriadrum sativam)); 코튼(cotton (Gossypium spp.)); groundnut (Arachis Hypogaea); 조조바(jojoba (Simmondsia chinensis));인시드( linseed/flax (Linum usitatissimum)); 메이즈(maize (Zea mays)); 머스타드(mustard (Brassica spp . 및 Sinapis alba)); 오일 팜(oil palm (Elaeis guineeis)); 올리브(olive (Olea eurpaea)) ; 레이프시드(rapeseed (Brassica spp.)); 쌀(rice (Oryza sativa)); 잇꽃(safflower (Carthamus tinctorius)); 콩(soybean (Glycine max)); 호박(squash (Cucurbita maxima)); 보리(barley (Hordeum vulgare)); 밀(wheat (Traeticum aestivam)); 덕위드(duckweed (Lemnaceae sp .)) 및 해바라기(sunflower (Helianthus annuns))를 포함한다.
여기에 따르는 바람직한 양태에서 오일종자 식물로부터 식물 종 및 식물세포가 사용되었다. 본 발명에서 사용된 오일종자식물은 땅콩(peanut (Arachis hypogaea)); 머스타드(mustard (Brassica spp . 및 Sinapis alba)); 유채씨 (rapeseed (Brassica spp .)); 병아리콩(chickpea (Cicer arietinum)); 소이빈(soybean (Glycine max)); 면화(cotton (Gossypium hirsutum)); 해바라기(sunflower (Helianthus annuus)); (Lentil Lens culinaris); 아마인(linseed/ flax (Linum usitatissimurn)); 흰클로바(white clover (Trifolium repens)); 올리브(olive (Olea eurpaea)); 야자(oil palm (Elaeis guineeis)); 잇꽃(safflower (Cart1Vamus tinctorius)) 및 나본콩(narbon bean (Vicia narbonesis))을 포함한다.
여기에 따르는 가장 바람직한 양태에서 아라비돕시스(Arabidopsis), 플랙스(flax)) 또는 잇꽃(safflower)이 사용되었다.
식물 발현벡터를 식물세포에 삽입하는 방법은, 또한 기술에서 잘 알려진 "형질전환"으로 본 발명에서 언급되며, 전형적으로 선택된 식물세포에 다양하게 의존적이다. 세포에 발현벡터를 삽입하는 일반적인 테크닉은 일렉트로포레이션(electroporation); 화학적으로 관련있는 테크닉, 예로서 CaCl2 매개되는 핵산 업테이크; 입자 충격(biolistics); 과아그로박테리움이나 리조비움 유래의 서열, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol (PEG)) 매개의 핵산 업테이크, 미세주입(microinjection) 및 실리콘 카비드 위스커스(silicone carbide whiskers) 사용이 포함된다.
바람직한 양태에서, 형질전환 방법은 식물세포 게놈, 바람직하게 세포 핵 게놈에 키메릭 핵산 서열의 병합되는 것이 선택된다. 이에 따라, 키메릭 핵산 서열을 자손식물에 유성생식으로 전달시키는 결과를 초래하는 방법의 사용이 가장 바람직하게 고려된다.
쌍자엽 식물 종을 위한 형질전환 방법은 잘 알려져 있다. 일반적으로, 아그로박테리움 매개의 형질전환은 높은 효율뿐만 아니라 일반적인 민감성 때문에 모두는 아니지만 많은 쌍자엽 식물 세포에서 사용된다. 아그로박테리움 형질전환은 일반적으로 본 발명에서 언급한 것 중 하나로 양성 벡터의 전달을 포함하며, 본 발명의 키메릭 핵산 서열을 이 콜라이로부터 적절한 아그로박테리움 종(예로서, EHA101 및 LBA4404)에, 예를 들면 재조합 양성벡터를 가진 이 콜라이 종의 3-부모의 교잡 및 아그로박테리움 종을 표적하는 양성 벡터 능이 있는 헬퍼 플라스미드, 또는 아그로박테리아 종의 DNA 형질전환(Hofgen 등의, Nucl. Acids. Res., 1988, 16:9877)에 의해 벡터를 전달한다. 쌍자엽 식물세포로 형질전환하기 위해 사용될 수 있는 다른 테크닉은 바이오리스틱(Sanford, 1988, Trends in Biotechn. 6:299-302); 일렉트로포레틱(electroporation)(Fromm 등의 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82:5824-5828); PEG 매개된 DNA 업테이크 (Potrykus 등의 1985, Mol. Gen. Genetics, 199:169-177); 미세주입(microinjection (Reich 등의 Bio/Techn., 1986, 4:1001-1004)); 및 실리콘 카비드 윗스커(silicone carbide whiskers (Kaeppler 등의, 1990, Plant Cell Rep., 9:415-418)) 또는 식물에서 형질전환으로 사용한, 예로서 꽃 디핑 방법 (slough and Bent, 1998, Plant J., 16:735-743)을 포함한다.
단자엽 식물 종은 입자 대량 살포 (Christou 등의 1991, Biotechn. 9:957-962; Weeks 등의, Plant Physiol., 1993, 102:1077-1084; Gordon-Kamm 등의 Plant Cell, 1990, 2:5603-618); PEG 매개된 DNA 업테이크(European Patents 0292 435; 0392 225) 또는 아그로박테리움 메개의 형질전환(Goto-Fumiyuki 등의, 1999, Nature-Biotech. 17:282-286)의 다양한 방법을 사용하여 형질전환될 수 있다.
정확한 식물 형질전환 방법은 형질전환을 위해 세포표적을 선택된 식물 종에 및 식물 세포 타입(예를 들어, 배축(hypocotyls) 세포타입에서 유래된 묘목 및 자엽 또는 배아조직과 같은 배 유래의 세포타입)에 의존하여 다소 다양할 수 있다. 상기에서 언급한 대로 발명의 가장 바람직한 양태로서 잇꽃이 사용되었다. 잇꽃 형질전환체를 얻기 위한 방법은 Baker 및 Dyer (Plant Cell Rep., 1996, 16:106-110)에 의해 활용가능하다. 추가적인 식물 종의 특별한 형질전환 프로토콜은 Biotechnology in Agriculture and Forestry 46: Transgenic Crops I (Y.P.S. Bajaj ed.), Springer-Verlag, New York (1999), 및 Biotechnology in Agriculture and Forestry 47: Transgenic Crops II; (Y.P.S. Bajaj ed.), Springer-Verlag, New York (2001)에서 확인할 수 있다.
형질전환 다음으로, 식물세포는 어린싹 및 뿌리, 성숙한 식물이 재생된 것와 같이 발달하고 있는 조직에 자라게 한다. 식물의 재생을 위한 방법은 일반적으로 식물종 및 실물타입이고 이는 공지기술에 잘 알려져 있다. 식물 배양에 대한 추가적인 안내는 'Plant Cell and Tissue Culture'(1994, Vasil 및 Thorpe E as., Kluwer Academic Publishers); 및 'Plant Cell Culture Protocols' (Methods in Molecular Biology 111)(1999, Hall Eds, Humana Press)에서 확인할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명은 아포지질단백질을 포함하는 식물종자를 얻는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 다음을 포함하는 아포지질단백질을 포함하는 식물종자를 얻는 방법을 제공한다:
(a) 작동가능하게 연결된 성분으로 5'에서 3'의 방향의 구조물을 제공하고
(i) 식물세포에서 발현을 조절하는 것이 가능한 핵산 서열 및
(ii) 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열;
(b) 식물세포에 상기 키메릭 핵산 구조물을 삽입하고; 및
(c) 식물을 성숙한 식물 내에서 상기 식물세포를 자라게 하고
(d) 아포지질단백질을 포함하는 종자인 식물로부터 종자를 얻어서 상기식물이 아포지질단백질을 발현하는 것을 포함하는 식물에서 식물종자를 획득하는 방법.
종자는 아포지질단백질을 발현하는 종자를 대다수 포함하는 각각의 자손 식물을 얻기 위해 사용될 있다. 바람직한 양태로서 최소한 전체 종자 단백질의 약 0.25%가 아포지질 단백질이다. 더욱 바람직한 양태로서, 최소한 전체 종자 단백질의 약 0.5%가 아포지질 단백질이다. 가장 바람직한 양태로서, 최소한 전체 종자 단백질의 약 1.0%가 아포지질 단백질이다.
바람직한 양태에서, 대다수의 형질전환된 식물은, 대다수의 형질전환체가 식물의 제초제에 대한 직접적인 응용으로 제초제 저항성 마커가 있는 선택적인 배양액에서 자라는지의 상황에서 얻어지고, 배양되고, 원하는 키메릭 핵산 서열이 존재하는지를 서던 블랏팅으로 스크리닝한다. 만약 키메릭 핵산이 검출되어 진다면, 형질전환된 식물은 자손 및 최종적으로는 원하는 핵산 서열을 포함하는 대다수의 종자를 포함하는 성숙한 세포을 생산하게 선택할 수 있다. 그러한 종자는 아포지질 단백질을 분리하기 위해 사용될 수 있고, 또는 둘 이상의 연속적인 세대를 생산할 수 있다. 그것은 일반적으로 아포지질단백질을 암호화하는 키메릭 핵산 서열을 포함하는 각 종자를 포함하는 대다수의 트랜스제닉 종자 식물에 바람직할 것이다. 더군다나, 이것은 일반적으로 재조합 폴리펩타이드의 지속적인 유전성을 확실하게 하기 위한 동형 식물에 적합할 것이다. 선택적인 동형 식물은 그 기술에 숙련된 자에게 잘 알려져 있다. 사용될 수 있는 동형 식물을 얻는 방법은, 콜키친 또는 다른 미세튜블을 깨는 약품으로 처리하여 이배체의 식물을 전환 및 반수체로 재생성하는 방법의 반수성 세포 또는 조직의 제조 및 형질전환을 포함한다. 그 밖에 식물은 일반적인 농학 실습지에서 키울 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 아포지질단백질을 발현하는 종자를 형성하는 식물을 제공한다. 본 발명의 바람직한 양태로서, 종자를 형성하는 식물은 5'에서 3'의 전사 방향에서 다음을 포함하는 키메릭 핵산을 포함한다:
(a) 작동가능하게 연결된 식물종자세포에 발현을 조절하는 능력이 있는 첫 번째 핵산 서열
(b) 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 두 번째 핵산 서열, 본 발명에서 종자는 아포지질단백질을 포함한다.
바람직한 양태에서 키메릭 핵산 서열은 식물의 핵 게놈에 안정하게 병합되어있다.
다른 양태에서, 본 발명은 식물종자가 아포지질단백질을 발현한다. 본 발명의 바람직한 양태로, 식물종자는 다음의 키메릭 핵산 서열을 포함한다:
(a) 작동가능하게 연결된 식물작동가능하게 종자세포에 발현을 조절하는 능력이 있는 첫번째 핵산 서열;
(b) 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 두 번째 핵산 서열.
아포지질단백질 폴리펩타이드는 다른 타입의 다양한 배축 및 배 중심을 포함하는 종자세포, 예로서 배의 씨앗 및 배의 잎을 포함하는 곡물 및 옥수수를 포함하는 내배유 조직에 사용된 단자엽 식물 종이 있는 존재할 수 있다
일단 식물을 획득하면 아포지질단백질은 다소 정제된 형태로 식물로부터 추출되고 얻을 수 있다.
따라서, 본 발명은 정제된 아포지질단백질을 실질적으로 제조하는 방법을 제공하는 것을 포함한다;
(a) 작동 가능하게 연결된 성분으로서 5'에서 3'의 전사 방향에서 다음을 포함하는 키메릭 핵산 조성을 제공하고:
(i) 식물종자에서 발현을 조절하는 핵산 서열; 및
(ii) 아포지질단백질 폴리펩나이드를 암호화하는 핵산 서열;
(b) 식물세포에 키메릭핵산을 삽입하고,
(c) 식물세포를 성숙한세포에 자라게 하여; 및
(d) 아포지질단백질을 포함하는 식물로부터 종자를 얻고.
(e) 식물 종자 구조물로부터 실질적으로 정제 아포지질단백질을 얻기위해 아포지질단백질을 분리하는 방법
종자 구조물로부터 아포지질단백질을 분리하기 위하여, 식물종자는 종자 세포막 및 벽을 깨는 어떤 일반적인 과정으로 빻아서 갈 수 있다. 건조 및 젖은 ㄱ갈아진 상태 (US Patent 3,971,856; Lawhon 등의 1977, J. Am. Oil Chem. Soc., 63:533-534) 둘다 사용될 수 있다. 이에 따르는 적당한 제분장치는 콜로이드제분기(colloid mills), 디스크 제분기(disc mills), 아케이메이제분기(IKA mills), 상업적 크기인 호모게나이저 등을 포함한다. 제분기의 선택은 종자의 종류 및 요구되는 원료처리에 의존될 것이다. 종자 껍질, 섬유질, 불용성 탄수화물, 단백질 및 다른 불용성 오염물 같은 종자 오염은 필터링 또는 원심분리를 기본으로 하는 중력장치와 같은 크기-제거를 기본으로 하는 방법을 사용하여 종자 프랙션으로부터 제거되어 질 수 있다. 가장 바람직한 양태에서, 일반적으로 핵산과 같은 오일 추출에 사용하는 유기용매의 사용은 용매가 아포지질단백질 폴리펩타이드를 손상할 수 있기 때문에 피했다. 상기에서 언급한 본 발명의 바람직한 양태에서 아포지질단백질은 종자의 오일 바디와 아포지질단백질 폴리펩타이드의 결합을 허락하는 방식으로 제조했다. 따라서, 아포지질단백질을 포함하는 종자 오일 바디는 미국특허 제 6,146,645호에서 세부적으로 기술한 예시 방법을 사용하여 빻아진 종자를 제조할 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 식물종자로부터 얻어진 아포지질단백질을 포함하는 실질적인 정제 오일 바디를 포함한다. 오일 바디는 아포지질단백질을 더 정제하기 위하여 정제된 종자씨 프랙션으로 사용될 수 있다. 실질적인 정제 아포지질단백질은 원심분리 기본 기술; 막을 이용한 울트라 필터법(membrane ultrafiltration), 크로스플로우 울트라필터법(crossflow ultrafiltration을 포함하는 크기-제외하는 기본 방법; 이온 교환 크로마토그라피, 크기 제외 크로마토그라피(size exclusion chromatography), 친화성 크로마토그라피(affinity chromatography), 하이 퍼포먼스 수용성 크로마토그라피(high performance liquid chromatography (HPLC)), 패스트 단백질 수용성 크로마토그라피(fast protein liquid chromatography (FPLC))소수성 상호작용 크로마토그라피(hydrophobic interaction chromatography) 등을 포함하는 크로마토그래피법과 같이 다양한 추가적인 정제 방법을 이용하여 종자로부터 회수할 수 있다. 일반적으로, 그러한 기술의 혼합병행이 정제된 아포지질단백질을 얻기 위해 사용될 수 있다. 실질적으로 트랜스제닉 종자로부터 그것의 천연형의 정제된 아포지질단백질을 얻기 위한 바람직한 방법은 본 실시예 6에 자세히 기술되어 있다. 따라서 본 발명은 또한 식물로부터 얻어진 상당히 정제된 아포지질단백질을 포함한다.
제약학적인 아포지질단백질 제형은 정제된 아포지질단백질로부터 제조되어 질 수 있으며 그러한 형태는 혈관질환을 치료하는데 사용할 수 있다. 일반적으로 정제된 아포지질단백질은 제약학적으로 가능한 담체 또는 환자에 치료시 바람직하지 않은 부작용을 배제한 치료학적으로 유용한 효과를 발휘하도록 충분한 양으로 희석하여 혼합할 수 있다. 아포지질단백질 조성을 형성하기 위해서, 아포지질단백질의 무게 프랙션은 수용화시키거나, 혼탁하거나, 나누어 분배하거나 다른 선택적인 담체와 혼합하거나 치료적 상태가 개선되도록 하는 효과적인 농도로 희석한다. 제약학적 아포지질단백질 제형 바람직하게 단회 투약용법으로 제형된다.
사람 아포지질단백질의 비경구 송달을 위한 치료학적 유효량은 기술에서 잘 알려져 있다. 아포지질단백질 유사체가 사용되든 다른 송달 모드가 사용되든, 치료학적 유효량은 잘 알려진 시험 프로토콜을 사용하여 생체 내에서 또는 실험실에서 테스트 결과를 예측하여 기술에서 숙련된 자에 의해 쉽게 경험적으로 결정할 수 있다. 그러나 고통을 완화하는 상태의 심각성에 따라 농도와 사용량이 다양화될 수 있음을 양해된다. 어떤 특별한 목적을 위하여 특수한 용법관리가 관리자 또는 간호감독의 개인적인 판단에 따라 오버타임이 정해질 수 있다.
제약학적 용액이나 혼합물은 물, 유당, 자당, 인산 2-칼슘 또는 카복시메틸 셀룰로오스등와 같은 희석제를 포함할 수 있다. 여기서 사용된 담체는 이 용액 및 혼합액을 형성하기 위하여 물, 식염수, 수용성 포도당, 글리세롤, 에탄올 등을 포함한다. 바람직한 제약적 조성이 또한 습식제와 같은 비독성 보조물질; 유화제; 수용성제; 벤질 알콜 및 메틸파라벤과 같은 항균제 ;아스코빈산 및 소듐바이설페이트와 같은 항산화제; ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 같은 킬레이팅제 ; 아세테이트, 시트레이트, 포스메이트 또는 완충용액과 같은 완충용액; 및 이의 혼합제를 포함할 수 있다.
아포지질단백질 준배의 마지막 형태는 일반적으로 아포지질단백질의 송달 형태에 의존할 것이다. 그러나, 본 발명에 따라 제조된 아포지질단백질은 비경구, 경구 및 비강의 어떤 바람직한 방식으로 송달될 수 있다. 비경구의 경우 봉해진 앰플, 일회용 주사기, 단 회 또는 수회의 양을 유리, 플라스틱 또는 다른 안전한 물질로 된 병에 제조할 수 있다.
다음의 실시예는 설명을 위해 제공되는 것으로 이에 제한되지 않는다.
실시예1
아포지질단백질 -I 클론의 구성
ApolO
ApolO (SEQ ID NO:144)는 도 3(A), 3(B) 및 3(C)에서 고안된 종자 특이한 방식으로 발현되도록 고안된 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이 ApolO 클론은 성숙한 APO AI 및 GFP 사이의 융합 단백질(SEQ ID - 47 NO:145)의 발현을 조절하는 종자-특이적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성되어있다. 이 클론의 정방향 프라이머 1186(SEQ ID NO:146 (5'-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3')을 고안하기 위하여 GFP(pVS-GFP 벡터로부터 유래한 주형)의 시작점에서 NcoI 자리를 제거하였다. 역방향 프라이머 1187 (SEQ ID. NO:147 (5'- AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAGTTC-3')은 종결코돈 뒤에 PstI, XbaI 및 HindIII 자리를 추가하였다. PCR 단편은 플라스미드 G1(도3(A))을 만들기 위하여 클로닝 벡터 Topo (Invitrogen)의 EcoRI 클로닝 자리에 라이게이션 시켰다. 정방향 프라이머 1190 (SEQ ID NO:148) (5'-CCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3')는 APO AI의 성숙한 서열을 증폭하고 유전자의 시작점에 NcoI 자리를 추가하였다. 역방향 프라이머 1189 (SEQ ID NO:149) (5'-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3')는 (Plasmid G1)로 융합된 인프레임 번역의 생산을 조장하기 위하여 유전자의 종결코돈을 제거하고 BamHI을 추가하였다. 이 프라이머의 주형은 사람 APO AI 유전자의 완전한 암호화서열을 포함하는 기본 벡터 pKS+ (Strategene)이다. PCR 단편은 플라스미드 M2를 생산하기 위하여 Topo 클로닝 벡터(Invitrogen)의 EcoRI 자리에 라이게이션 시켰다. Apo AI의 성숙한 서열을 포함하는 플라스미드 M2는 제한효소 NcoI 및 BamHI으로 잘린다. 플라스미드 G'1은 GFP 암호화 서열을 가지며 BamHI 및 XbaI(도 3(B)참조)으로 잘랐다. M2 및 G'1 단편은 플라스미드 2M4를 만들기 위하여 플라스미드 SBS2090 (도3(B)참조)의 NcoI 및 XbaI 자리에 함께 라이게이션 시켰다. 플라스미드 2M4는 Apo AI-GFP 융합 카세트를 제거하기 위하여 NcoI 및 HindIII로 잘랐고 단편들은 양성벡터 pSBS4006의 NcoI/HindIII 자리에 클론하여 사용하였다(도 3(C)참조). 이 플라스미드는 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 B- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다 것을 명심하여야 한다.
Apoll
Apoll (SEQ ID NO:150)는 도 3(A), 3(B) 및 3(C)에서 고안된 종자 특이한 방식으로 발현되도록 고안된 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이 Apol1 클론은 성숙한 APO AI 및 GFP 사이의 융합 단백질(SEQ ID NO:151)의 발현을 조절하는 종자-특이적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성되어있다. 이 클론의 정방향 프라이머 1186(SEQ ID NO:146 (5'-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3'))을 고안하기 위하여 GFP(pVS-GFP 벡터로부터 유래한 주형)의 시작점에서 NcoI 자리를 제거하였다. 역방향 프라이머 1187 (SEQ ID. NO:147 (5'-AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAGTTC-3')은 종결코돈 뒤에 PstI, XbaI 및 HindIII 자리를 추가하였다. PCR 단편은 플라스미드 G1(도3(A))을 만들기 위하여 클로닝 벡터 Topo (Invitrogen)의 EcoRI 클로닝 자리에 라이게이션 시켰다. 정방향 프라이머 1191 (SEQ ID NO:152) (5' CCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3')는 Apo AI의 프로-서열을 증폭시키고 유전자의 시작점에 NcoI 자리를 추가하였다. 역방향 프라이머 역방향 프라이머 1189 (SEQ ID NO:149) (5'-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3')는 GFP (Plasmid G1)로 융합된 인프레임 번역의 생산을 조장하기 위하여 유전자의 종결코돈을 제거하고 BamHI을 추가하였다. 이 프라이머의 주형은 사람 APO AI 유전자의 완전한 암호화서열을 포함하는 기본 벡터 pKS+ (Strategene)이다. PCR 단편은 플라스미드 P2를 생산하기 위하여 Topo 클로닝 벡터(Invitrogen)의 EcoRI 자리에 라이게이션 시켰다. Apo AI의 성숙한 서열을 포함하는 플라스미드 P2는 제한효소 NcoI 및 BamHI으로 잘려진다. 플라스미드 G'1은 GFP 암호화 서열을 가지며 BamHI 및 XbaI(도 3(B)참조)으로 잘랐다. P2 및 G'1 단편은 플라스미드 2P5를 만들기 위하여 플라스미드 SBS2090 (도3(B)참조)의 NcoI 및 XbaI 자리에 함께 라이게이션 시켰다. 플라스미드 2P4는 Apo AI-GFP 융합 카세트를 제거하기 위하여 NcoI 및 HindIII로 잘랐고 단편들은 양성벡터 pSBS4006의 NcoI/HindIII 자리에 클론하여 사용하였다(도 3(C)참조). 이 플라스미드는 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 B- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성이 있는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함하는 것을 명심하여야 한다.
Apol2
Apol2 (SEQ ID NO:153) 도 3(A), 3(B) 및 3(C)에서 고안된 종자 특이한 방식으로 발현되도록 고안된 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이 Apol2 클론은 성숙한 APO AI 및 GFP 사이의 융합 단백질(SEQ ID NO:154)의 발현을 조절하는 종자-특이적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성되어있다. 이 클론의 정방향 프라이머 1186(SEQ ID NO:146 (5'-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3'))을 고안하기 위하여 GFP(pVS-GFP 벡터로부터 유래한 주형)의 시작점에서 NcoI 자리를 제거하였다. 역방향 프라이머 1187 (SEQ ID. NO:147 (5'-AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAGTTC-3')은 종결코돈 뒤에 PstI, XbaI 및 HindIII 자리를 추가하였다. PCR 단편은 플라스미드 G1(도3(A))을 만들기 위하여 클로닝 벡터 Topo (Invitrogen)의 EcoRI 클로닝 자 리에 라이게이션 시켰다. 정방향 프라이머 1190 (SEQ ID NO:148) (5'- CCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3')는 APO AI의 성숙한 서열을 증폭하고 유전자의 시작점에 NcoI 자리를 추가하였다. 역방향 프라이머 역방향 프라이머 1189 (SEQ ID NO:149) (5'-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3')는 GFP (Plasmid G1)로 융합된 인프레임 번역의 생산을 조장하기 위하여 유전자의 종결코돈을 제거하고 BamHI을 추가하였다. 이 프라이머의 주형은 사람 APO AI 유전자의 완전한 암호화서열을 포함하는 기본 벡터 pKS+ (Strategene)이다. PCR 단편은 플라스미드 M2를 생산하기 위하여 Topo 클로닝 벡터(Invitrogen)의 EcoRI 자리에 라이게이션 시켰다. Apo AI의 성숙한 서열을 포함하는 플라스미드 M2는 제한효소 NcoI 및 BamHI으로 잘려진다. 플라스미드 G'1은 GFP 암호화 서열을 가지며 BamHI 및 XbaI(도 3(B)참조)으로 잘랐다. M2 및 G'1 단편은 플라스미드 2M4를 만들기 위하여 플라스미드 SBS2090 (도3(B)참조)의 NcoI 및 XbaI 자리에 함께 라이게이션 시켰다. 플라스미드 2P4는 Apo AI-GFP 융합 카세트를 제거하기 위하여 NcoI 및 HindIII로 잘랐고 단편들은 양성벡터 pSBS4008의 NcoI/HindIII 자리에 클론하여 사용하였다(도 3(C)참조). 이 플라스미드는 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 B- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다는 것을 명심하여야 한다.
Apol3
Apol3 (SEQ ID NO:155)은 도 3(A), 3(B) 및 3(C)에서 고안된 종자 특이한 방식으로 발현되도록 고안된 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이 Apol3 클론은 성숙한 APO AI 및 GFP 사이의 융합 단백질(SEQ ID NO:156)의 발현을 조절하는 종자-특이적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성되어있다. 이 클론의 정방향 프라이머 1186(SEQ ID NO:146 (5'-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3'))을 고안하기 위하여 GFP(pVS-GFP 벡터로부터 유래한 주형)의 시작점에서 NcoI 자리를 제거하였다. 역방향 프라이머 1187 (SEQ ID. NO:147 (5'-AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAGTTC-3'))은 종결코돈 뒤에 PstI, XbaI 및 HindIII 자리를 추가하였다. PCR 단편은 플라스미드 G1(도3(A))을 만들기 위하여 클로닝 벡터 Topo (Invitrogen)의 EcoRI 클로닝 자리에 라이게이션 시켰다. 정방향 프라이머 1191 (SEQ ID NO:152) (5' CCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3')는 Apo AI의 프로-서열을 증폭시키고 유전자의 시작점에 NcoI 자리를 추가하였다. 역방향 프라이머 역방향 프라이머 1189 (SEQ ID NO:149) (5'-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3')는 GFP (Plasmid G1)로 융합된 인프레임 번역의 생산을 조장하기 위하여 유전자의 종결코돈을 제거하고 BamHI을 추가하였다. 이 프라이머의 주형은 사람 APO AI 유전자의 완전한 암호화서열을 포함하는 기본 벡터 pKS+ (Strategene)이다. PCR 단편은 플라스미드 P2를 생산하기 위하여 Topo 클로닝 벡터(Invitrogen)의 EcoRI 자리에 라이게이션 시켰다. Apo AI의 성숙한 서열을 포함하는 플라스미드 M2는 제한효소 NcoI 및 BamHI으로 잘려진다. 플라스미드 G'1은 GFP 암호화 서열을 가지며 BamHI 및 XbaI(도 3(B)참조)으로 잘랐다. P2 및 G'1 단편은 플라스미드 2P5를 만들기 위하여 플라스미드 SBS2090 (도3(B)참조)의 NcoI 및 XbaI 자리에 함께 라이게이션 시켰다. 플라스미드 2P4는 Apo AI-GFP 융합 카세트를 제거하기 위하여 NcoI 및 HindIII로 잘랐고 단편들은 양성벡터 pSBS4008의 NcoI/HindIII 자리에 클론하여 사용하였다(도 3(C)참조). 이 플라스미드의 특징은 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 B- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다는 것을 명심하여야 한다.
Apol5
Apol5 (SEQ ID NO:157)는 도 3(A), 3(B) 및 3(D)에서 고안된 종자 특이한 방식으로 발현되도록 고안된 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이 Apol3 클론은 성숙한 APO AI 및 GFP 사이의 융합 단백질(SEQ ID NO:158)의 발현을 조절하는 종자-특이적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성되어있다. 융합 단백질은 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드를 사용하여 분비 기작을 통한 발현을 위하여 표적 되어졌다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론의 정방향 프라이머 1186(SEQ ID NO:146 (5'-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3'))을 고안하기 위하여 GFP(pVS-GFP 벡터로부터 유래한 주형)의 시작점에서 NcoI 자리를 제거하였다. 역방향 프라이머 1187 (SEQ ID. NO:147 (5'- I AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAGTTC-3'))은 종결코돈 뒤에 PstI, XbaI 및 HindIII 자리를 추가하였다. PCR 단편은 플라스미드 G1(도3(A))을 만들기 위하여 클로닝 벡터 Topo (Invitrogen)의 EcoRI 클로닝 자리에 라이게이션 시켰다. 정방향 프라이머 1191 (SEQ ID NO:152) (5' CCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3')는 Apo AI의 프로-서열을 증폭시키고 유전자의 시작점에 NcoI 자리를 추가하였다. 역방향 프라이머 역방향 프라이머 1189 (SEQ ID NO:149) (5'- GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3')는 GFP (Plasmid G1)로 융합된 인프레임 번역의 생산을 조장하기 위하여 유전자의 종결코돈을 제거하고 BamHI을 추가하였다. 이 프라이머의 주형은 사람 APO AI 유전자의 완전한 암호화서열을 포함하는 기본 벡터 pKS+ (Strategene)이다. PCR 단편은 플라스미드 M2를 생산하기 위하여 Topo 클로닝 벡터(Invitrogen)의 EcoRI 자리에 라이게이션 시켰다. Apo AI의 성숙한 서열을 포함하는 플라스미드 M2는 제한효소 NcoI 및 BamHI으로 잘려진다. 플라스미드 G'1은 GFP 암호화 서열을 가지며 BamHI 및 XbaI(도 3(B)참조)으로 잘랐다. M2 및 G'1 단편은 플라스미드 2M4를 만들기 위하여 플라스미드 SBS2090 (도3(B)참조)의 NcoI 및 XbaI 자리에 함께 라이게이션 시켰다. 플라스미드 2M4는 Apo AI-GFP 융합 카세트를 제거하기 위하여 NcoI 및 HindIII로 잘랐고 단편들은 양성벡터 pSBS4011의 NcoI/HindIII 자리에 클론하여 사용하였다(도 3(C)참조). 이 플라스미드의 특징은 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 B- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다는 것을 명심하여야 한다.
Apol6
Apol6 (SEQ ID NO:159)은 도 3(A), 3(B) 및 3(D)에서 각각 구성된 구성방식에서 발현되도록 고안된 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이 Apol6 클론은 성숙한 APO AI 및 GFP 사이의 융합 단백질(SEQ ID NO:160)의 발현을 조절하는 종자-특이적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성되어있다. 융합 단백질은 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드를 사용하여 분비 기작을 통한 발현을 위하여 표적되어졌다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론의 정방향 프라이머 1186(SEQ ID NO:146 (5'-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3'))을 고안하기 위하여 GFP(pVS-GFP 벡터로부터 유래한 주형)의 시작점에서 NcoI 자리를 제거하였다. 역방향 프라이머 1187 (SEQ ID. NO:147 (5'-AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAGTTC-3'))은 종결코돈 뒤에 PstI, XbaI 및 HindIII 자리를 추가하였다. PCR 단편은 플라스미드 G1(도3(A))을 만들기 위하여 클로닝 벡터 Topo (Invitrogen)의 EcoRI 클로닝 자 리에 라이게이션 시켰다. 정방향 프라이머 1191 (SEQ ID NO:152) (5'- CCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3')는 Apo AI의 프로-서열을 증폭시키고 유전자의 시작점에 NcoI 자리를 추가하였다. 역방향 프라이머 역방향 프라이머 1189 (SEQ ID NO:149) (5'-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3')는 GFP (Plasmid G1)로 융합된 인프레임 번역의 생산을 조장하기 위하여 유전자의 종결코돈을 제거하고 BamHI을 추가하였다. 이 프라이머의 주형은 사람 APO AI 유전자의 완전한 암호화서열을 포함하는 기본 벡터 pKS+ (Strategene)이다. PCR 단편은 플라스미드 M2를 생산하기 위하여 Topo 클로닝 벡터(Invitrogen)의 EcoRI 자리에 라이게이션 시켰다. Apo AI의 성숙한 서열을 포함하는 플라스미드 P2는 제한효소 NcoI 및 BamHI으로 잘려진다. 플라스미드 G'1은 GFP 암호화 서열을 가지며 BamHI 및 XbaI(도 3(B)참조)으로 잘랐다. P2 및 G'1 단편은 플라스미드 2P5를 만들기 위하여 플라스미드 SBS2090 (도3(B)참조)의 NcoI 및 XbaI 자리에 함께 라이게이션 시켰다. 플라스미드 2P5는 Apo AI-GFP 융합 카세트를 제거하기 위하여 NcoI 및 HindIII로 잘랐고 단편들은 양성벡터 pSBS4011의 NcoI/HindIII 자리에 클론하여 사용하였다(도 3(C)참조). 이 플라스미드의 특징은 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 B- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다는 것을 명심하여야 한다.
Apol7
Apol7(SEQ ID NO:161)는 도 4(A)에서 각 구성된 구성방식에서 발현되도록 고안된 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이 Apol7 클론은 성숙한 APO AI 및 GFP 사이의 융합 단백질(SEQ ID NO:162)의 발현을 조절하는 구성 프로모터 및 종결자(유비퀴틴)로 구성되어있다. 이 클론을 구성하기 위해서 플라스미드 M2는 APO AI-GFP를 제거하기 위하여 제한효소 NcoI 및 PstI으로 잘랐고(도3(B)참조), 플라스미드 KU2M4를 만들기 위하여 플라스미드 pKUO3'의 NcoI 및 PstI 자리에 단편을 라이게이션 시켰다. 플라스미드 pKUO3'는 파슬리 유비퀴틴 프로모터 및 유비퀴틴 종결자(Kawalleck, P 등의 1993, Plant Mol. Biol. 21:673-684)의 조절 하에 APO AI/GFP 융합 구조물에서 NcoI 및 PstI으로 잘랐을 때 제거되는 브라시카 나푸스( Brassica napus) 올레오신 유전자를 포함한다. 플라스미드 KU2M4는 KpnI으로 잘랐고 양성벡터 SBS3000의 KpnI 자리에 클론하여 라이게이션 시켰다(도 4참조). 이 플라스미드는 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 B- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다는 것을 명심하여야 한다. Apo17 클론은 성숙한 Apo Ai-GFP 번역 융합을 포함하며 세포질에 표적된다.
Apol8a
Apol8a(SEQ ID NO:163)는 도 4에서 각 구성된 구성방식에서 발현되도록 고안된 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이 Apol8a 클론은 성숙한 APO AI 및 GFP 사이의 융합 단백질(SEQ ID NO:164)의 발현을 조절하는 구성 프로모터 및 종결자(유비퀴틴)로 구성되어있다. 이 클론을 구성하기 위해서 플라스미드 2P5는 APO AI-GFP를 제거하기 위하여 제한효소 NcoI 및 PstI으로 잘랐고(도3(B)참조), 플라스미드 KU2P5를 만들기 위하여 플라스미드 pKUO3'의 NcoI 및 PstI 자리에 단편을 라이게이션 시켰다. 플라스미드 pKUO3'는 파슬리 유비퀴틴 프로모터 및 유비퀴틴 종결자(Kawalleck, P 등의 1993, Plant Mol. Biol. 21:673-684)의 조절 하에 APO AI/GFP 융합 구조물에서 NcoI 및 PstI으로 잘랐을 때 제거되는 브라시카 나푸스( Brassica napus) 올레오신 유전자를 포함한다. 플라스미드 KU2P5는 KpnI으로 잘랐고 양성벡터 SBS3000의 KpnI 자리에 클론하여 라이게이션 시켰다(도 4참조). 이 플라스미드의 특징은 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 B- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo18a 클론은 성숙한 Apo Ai-GFP 번역 융합을 포함하며 세포질에 표적된다.
Apol8b
Apol8b(SEQ ID NO:163)는 도 4(B)에서 각 구성된 구성방식에서 발현되도록 고안된 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이 Apol8a 클론은 성숙한 APO AI 및 GFP 사이의 융합 단백질(SEQ ID NO:164)의 발현을 조절하는 구성 프로모터 및 종결자(유비퀴틴)로 구성되어있다. 2 클론의 차이는 Apo18a는 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한 것이다. 대조적으로 Apo18b는 만노스를 포함하는 선택배지에서 양성 선택을 허락하는 포스포만노오스아이소머레이즈를 암호화하는 양성 벡터 pSBS5001(pmi 유전자(Miles 등의, 1984, Gene 21:41-48)를 가지고 있는)의 KpnI 자리에 삽입되었다. pmi 유전자는 유비퀴틴 프로모터 및 유비퀴틴 종결자(Kawalleck, P 등의 1993, Plant Mol. Biol. 21:673-684)의 조절 하에 있다. 이 클론을 구성하기 위하여 Apo18b 양성 벡터는 프로-Apo AI-GFP 융하ㅈㅂ 카세트를 제거하기 위하여 KpnI으로 잘랐고 단편은 아그로박테리움에서 발현을 위하여 플라스미드 SBS5001의 KpnI 자리에 라이게이션 시켰다. po18b 클론은 프로 Apo Ai-GFP 번역 융합을 포함하며 세포질에 표적된다.
Apol9
Apol9 (SEQ ID NO:165)는 도 5(A) 및 5(B)에서 각각 구성된 구성방식에서 발 현되도록 고안된 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이 Apol9 클론은 성숙한 APO AI 및 GFP 사이의 융합 단백질(SEQ ID NO:166)의 발현을 조절하는 구성 프로모터 및 종결자(유비퀴틴)로 구성되어있다. 융합 단백질은 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드를 사용하여 분비 기작을 통한 발현을 위하여 표적되어졌다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론을 구성하기 위해서, Apo 15는 주형의로 사용되었다. 정방향 프라이머 1177 (SEQ ID NO:167) (5'- GCAGCATTCATGAACTTCCTTAAGTCTTTCC-3')은 시작 코돈의 BspHI자리를 포함하는 식물의 프리-서열(presequence)(PRS)의 시작을 증폭한다. 역방향 프라이머 1178 (SEQ ID NO:168) (5' GGTGGTGGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3')은 GFP와 인프레임 번역융합의 생성을 돕기 위해서 종결코돈을 제거하고 BamHI 자리에 추가된다. 그외 몇몇의 염기는 제한효소를 촉진하기 위하여 두 프라이머 끝의 왼쪽에 두었다. G1 플라스미드 (도 3(A) 참조))는 Petroselirum crispum (Kawalleck 등의, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터와 종결자를 포함한 pubiP+iS3' 내에 라이게이션 시키기 위하여 BamHI 및 PstI로 잘랐다. PRS-Apo AI PCR 단편은 BspHI 및 BamHI 로 잘랐고, 플라스미드 19-6을 만들기 위하여 플라스미드 pubiP+iS3' 내의 G1 단편과 라이게이션 시켰다. 플라스미드 19-6는 발현카세트를 제거하기 위하여 EcoRI으로 절단시켰고 그리고 나서 카세트는 플라스미드KU19-6를 형성하기 위하여 플라스미드 pKUO3'K의 내 EcoRI자리(존재하는 카세트를 제거한) 사이에 라이게이션 시켰다(Figure 4(A)). KU19-6는 KpnI으로 절단하였고 단편은 플라스미드 SBS3000의 KpnI 자리에 라이게이션 시켰다(도 5(B)참조). 이 플라스미 드는 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 B- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다는 것을 명심하여야 한다. Apo19 클론은 각 분비 기작에 표적화된 성숙한-Apo AI-GFP 번역 융합을 포함한다.
Apo20
Apo20 (SEQ ID NO:169)은 도 5(A) 및 5(B)에서 각각 구성된 구성방식에서 발현하기위해 고안된 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이 Apo20 클론은 프로- APO AI 및 GFP 사이의 융합 단백질(SEQ ID NO:166)의 발현을 조절하는 구성 프로모터 및 종결자(유비퀴틴)로 구성된다. 융합 단백질은 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드를 사용하여 분비 기작을 통한 발현을 위하여 표적되어졌다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론을 구성하기 위해서, Apo 16는 주형으로 사용되었다. 정방향 프라이머 1177 (SEQ ID NO:167) (5'- GCAGCATTCATGAACTTCCTTAAGTCTTTCC-3')은 시작 코돈의 BspHI자리를 포함하는 식물의 프리-서열(presequence)(PRS)의 시작을 증폭한다. 역방향 프라이머 1178 (SEQ ID NO:168) (5' GGTGGTGGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3')은 GFP와 인프레임 번역융합의 생성을 돕기 위해서 종결코돈을 제거하고 BamHI 자리에 추가된다. 그외 몇몇 의 염기는 제한효소 분해를 촉진하기 위하여 두 프라이머 끝의 왼쪽에 두었다. G1 플라스미드 (도 3(A) 참조))는 페트로셀리움 크리스품(Petroselirum crispum) (Kawalleck 등의, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터와 종결자를 포함한 pubiP+iS3' 내에 라이게이션 시키기 위하여 BamHI 및 PstI로 잘랐다. PRS-Apo AI PCR 단편은 BspHI 및 BamHI 로 잘랐고, 플라스미드 20-11을 만들기 위하여 플라스미드 pubiP+iS3' 내의 G1 단편과 라이게이션 시켰다. 플라스미드 20-11은 발현카세트를 제거하기 위하여 EcoRI으로 절단시켰고 그리고 나서 카세트는 플라스미드 KU20-11을 형성하기 위하여 플라스미드 pKUO3'K의 내 EcoRI자리(존재하는 카세트를 제거한) 사이에 라이게이션 시켰다(Figure 4(A)). KU19-6는 KpnI으로 절단하였고 단편은 플라스미드 SBS3000의 KpnI 자리에 라이게이션 시켰다(도 5(B)참조). 이 플라스미드는 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 B- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다는 것을 명심하여야 한다. Apo19 클론은 각 분비 기작에 표적화된 프로-Apo AI-GFP 번역 융합을 포함한다.
Apo21
Apo21 (SEQ ID NO:171)은 도 6으로 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에 서 확인할 수 있듯이 Apo21 클론은 APO AI(SEQ ID NO:172)의 발현을 조절하는 종자- 선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. 이 클론의 정방향 프라이머 1203 (SEQ ID NO:173) (5'-GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3')을 고안하기 위하여 Apo AI의 시작점에서 NcoI 자리를 추가하였다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이를 추가한다. 두 프라이머는 모두 제한효소 분해를 촉진하기 위하여 5' 말단에 여유 염기를 ㅍ포함한다. PCR 단편은 플라스미드 5-3(도 6)을 생성하기위하여 NcoI 및 HindIII로 절단시켰고, 플라스미드 SBS2090에 라이게이션 시켰다. 플라스미드 5-3은 NcoI 및 HindIII로 절단 시켰고 Apo AI 단편은 SBS4006의 NcoI/HindIII 자리에 라이게이션시켰다(도3(C)). SBS4006는 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo21은 세포질의 Apo AI을 종자 특이적인 표적화를 위한 클론이다.
Apo22
Apo22 (SEQ ID NO:175)은 도 7로 구성된 종자-선호적인 클론이다 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo22 클론은 프로-APO AI(SEQ ID NO:172)의 발현을 조절하는 종자- 선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. 이 클론의 정방향 프라이머 1201 ( S E Q I D N O: 1 7 7) ( 5 ' GCAGCACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3')을 고안하기 위하여 프로-Apo AI의 시작점에서 NcoI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이를 추가한다. 두 프라이머는 모두 제한효소 분해를 촉진하기 위하여 5' 말단에 여유 염기를 포함한다. PCR 단편은 플라스미드 5-3(도 6)을 생성하기 위하여 NcoI 및 HindIII로 절단시켰고, 플라스미드 SBS2090에 라이게이션 시켰다. 플라스미드 5-3는 NcoI 및 HindIII로 절단 시켰고 프로-Apo AI 단편은 SBS4006의 NcoI/HindIII 자리에 라이게이션시켰다(도3(C)). SBS4006는 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo22은 세포질의 Apo AI을 종자 특이적인 표적화를 위한 클론이다.
Apo23
Apo23 (SEQ ID NO:178)은 도 7로 구성된 종자-선호적인 클론이다 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo23 클론은 프로-APO AI(SEQ ID NO:172)의 발현을 조절하는 종자- 선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. 이 클론의 정방향 프라이머 1203 (SEQ ID NO:173) (5'-GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3')을 고안하기 위하여 Apo AI의 시작점에서 NcoI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이를 추가한다. 두 프라이머는 모두 제한효소 분해를 촉진하기 위하여 5' 말단에 여유 염기를 포함한다. PCR 단편은 플라스미드 5-3(도 6)을 생성하기 위하여 NcoI 및 HindIII로 절단시켰고, 플라스미드 SBS2090에 라이게이션 시켰다. 플라스미드 5-3는 NcoI 및 HindIII로 절단 시켰고 프로-Apo AI 단편은 SBS4008의 NcoI/HindIII 자리에 라이게이션시켰다(도3(C)). SBS4008는 아라비돕시스 올레인(Arabidopsis oleosin) 유전자 (van Rooijen G. J. 등의 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo23은 오일 바디의 오레오신/Apo AI의 종자 특이적인 표적화를 위한 클론이다.
Apo24
Apo24 (SEQ ID NO:180)은 도 7로 구성된 종자-선호적인 클론이다 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo24 클론은 올레오신/프로-APO AI(SEQ ID NO:172)의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. 이 클론의 정방향 프라이머 1201 ( S E Q I D N O: 1 7 7) ( 5 ' GCAGCACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3')을 고안하기 위하여 프로-Apo AI의 시작점에서 NcoI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이를 추가한다. 두 프라이머는 모두 제한효소 분해를 촉진하기 위하여 5' 말단에 여유 염기를 포함한다. PCR 단편은 플라스미드 4-2(도 7)을 생성하기 위하여 NcoI 및 HindIII로 절단시켰고, 플라스미드 SBS2090에 라이게이션 시켰다. 플라스미드 4-2는 NcoI 및 HindIII로 절단 시켰고 프로-Apo AI 단편은 SBS4008의 NcoI/HindIII 자리에 라이게이션시켰다(도3(C)). SBS4008는 아라비돕시스 올레인(Arabidopsis oleosin) 유전자 (van Rooijen G. J. 등의 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673- 684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo24은 오일 바디의 오레오신/프로-Apo AI의 종자 특이적인 표적화를 위한 클론이다.
Apo25
Apo25 (SEQ ID NO:182)는 도 6으로 구성된 종자-선호적인 클론이다 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo25 클론은 올레오신/프로-APO AI(SEQ ID NO:183)의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. 이 클론의 정방향 프라이머 1203 (SEQ ID NO:173) (5'-GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3')을 고안하기 위하여 성숙한 Apo AI의 시작점에서 NcoI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이를 추가한다. 두 프라이머는 모두 제한효소 분해를 촉진하기 위하여 5' 말단에 여유 염기를 포함한다. PCR 단편은 플라스미드 5-3(도 6)을 생성하기 위하여 NcoI 및 HindIII로 절단시켰고, 플라스미드 SBS2090에 라이게이션 시켰다. 플라스미드 5-3는 NcoI 및 HindIII로 절단 시켰고 프로-Apo AI 단편은 SBS4010의 NcoI/HindIII 자리에 라이게이션시켰다(도 7). SBS4010는 아라비돕시스 올레인(Arabidopsis oleosin) 유전자 (van Rooijen G. J. 등의 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo25은 오일 바디에 대한 오레오신/kilp8/met/Apo AI의 종자 특이적인 표적화 및 kilp8절단 서열을 사용한 정제를 위한 클론이다.
Apo26
Apo26 (SEQ ID NO:184)은 도 7로 구성된 종자-선호적인 클론이다 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo26 클론은 올레오신/kilp8/met/프로-APO AI(SEQ ID NO:185)의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. 이 구성은 카이모신와 융합단백질의 절단을 촉진하기위하여 klip3 절단서열(SEQ ID NO:143)을 갖는다. 이 클론의 정방향 프라이머 1201 (SEQ ID NO:177) (5'-GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3')을 고안하기 위하여 프로-Apo AI의 시작점에서 NcoI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이를 추가한다. 두 프라이머는 모두 제한효소 분해를 촉진하기 위하여 5' 말단에 여유 염기를 포함한다. PCR 단편은 플라스미드 4-2(도 7)을 생성하기 위하여 NcoI 및 HindIII로 절단시켰고, 플라스미드 SBS2090(도 3(B))에 라이게이션 시켰다. 플라스미드 4-2는 NcoI 및 HindIII로 절단시켰고 프로-Apo AI 단편은 SBS4010의 NcoI/HindIII 자리에 라이게이션시켰다(도 7). SBS4010는 아라비돕시스 올레인(Arabidopsis oleosin) 유전자 (van Rooijen G. J. 등의 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo26은 오일 바디에 대한 오레오신/kilp8/met/Apo AI의 종자 특이적인 표적화 및 kilp8절단 서열을 사용한 정제를 위한 클론이다.
Apo27
Apo27 (SEQ ID NO:186)은 도 8(A)로 구성된 종자-선호적인 클론이다 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo27 클론은 올레오신/kilp8/met/프로-APO AI(SEQ ID NO:187)의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. Apo27은 아라비돕시스 올레인(Arabidopsis oleosin) 서열(van Rooijen G. J. 등의 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)을 사용하여 오일 바디의 발현을 위하여 표적화되고 카이모신와 융합단백질의 절단을 촉진하기 위하여 klip3 절단서 열(SEQ ID NO:143)을 갖는다. 이 클론의 정방향 프라이머 1200 (SEQ ID NO:188) (5'- GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA-3')을 고안하기 위하여 프로-Apo AI의 시작에 대한 klip8(SEQ ID NO:143) 절단서열에 인프레임 클로닝을 촉진하기 위하여 NcoI 자리 및 몇몇의 뉴클레오타이드를 추가한다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이를 추가한다. 이 프라이머의 주형은 내부 XhoI 자리 및 Met 잔기 없는 Apo AI의 프리-형태의 Apo33플라스미드였다. PCR 단편은 플라스미드 6-3을 생성하기 위하여 XhoI으로 절단시켰고 pKS+의 XhoI/EcoRI 자리에 라이게이션 시켰다. 플라스미드 6-3은 NcoI 및 HindIII로 절단시켰고 양성 벡터 SBS4010(e도 7)의 XhoI/HindIII 자리에 라이게이션 시켰다. 프로-Apo AI 단편은 SBS4010의 NcoI/HindIII 자리에 라이게이션시켰다(도 7). SBS4010는 아라비돕시스 올레인(Arabidopsis oleosin) 유전자 (van Rooijen G. J. 등의 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo27은 오일 바디에 대한 Apo AI의 종자-특이적인 표적화 및 kilp8절단 서열을 사용한 정제를 위한 클론이다.
Apo27M
Apo27M (SEQ ID NO:189)은 도 8(B)로 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo27M 클론은 올레오신/kilp8/met/프로-APO AI(SEQ ID NO:190)의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. 이 구성은 카이모신와 융합 단백질의 절단을 촉진하기 위하여 klip3 절단서열(SEQ ID NO:143)을 갖는다. 이 클론을 구성하기 위하여, 정방향 프라이머 1202 (5'-GCAGCACTCGAGcaagttcGATGAACCCCCCCAGAGCCC-3') (SEQ ID NO:191)는 met-Apo AI의 시작점에 대한 klip8 절단서열에 인프레임 클로닝을 촉진하기 위하여 XhoI 자리 및 몇몇의 뉴클레오타이드를 추가한다. 역방향 프라이머 1225 (5'-CGCCAGtGCTTGGCCGCGCGCCTTG-3') (SEQ ID NO:192)는 아르기닌 잔기를 시스테인 잔기로 바꾸기위하여 C를 T로 염기쌍을 돌연변이 시킨 블런트 말단의 프라이머이다. 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이 시켰다. 두 프라이머 모두 제한효소분해를 촉진시키 위하여 5' 말단에 여유 뉴클레오타이드를 추가하였다. 이 프라이머를 위한 주형은 이미 XhoI 자리가 돌연변이된 플라스미드 p-10이였다. 이중 가닥 주형은 DpnI 분해에 의해 제거되었다. PCR 단편은 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 ApoM을 만들기 위하여 pKS+의 XhoI/HidIII 자리에 라이게이션 시켰다. 플라스미드 ApoM은 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 SBS4010(e도 7)의 XhoI/HindIII 자리에 라이게이션 시켰다. SBS4010는 아라비돕시스 올레인(Arabidopsis oleosin) 유전자 (van Rooijen G. J. 등의 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo27M은 오일 바디에 대한 오레오신/kilp8/met/Apo AI의 종자 특이적인 표적화 및 kilp8 절단 서열을 사용한 정제를 위한 클론이다.
Apo28
Apo28 (SEQ ID NO:193)은 도 9에서 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo28 클론은 올레오신/kilp8/met/프로-APO AI(SEQ ID NO:194)의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. 이 클론을 구성하기 위하여, 정방향 프라이머 1200 (SEQ ID NO:188) (5'- GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA-3')은 프로-Apo AI의 시작에 대한 klip8(SEQ ID NO:143) 절단서열에 인프레임 클로닝을 촉진하기 위하여 NcoI 자리 및 몇몇의 뉴클레오타이드를 추가한다. 정방향 프라이머 1205 (SEQ ID NO:195) (5'-CCAAGCCCGCGCTaGAGGACCTCCG-3')는 첫번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이를 추가한 블런트(blunt) 말단 프라이머이다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이 시켰다. 두 프라이머 모두 제한효소분해를 촉진시키 위하여 5' 말단에 몇몇의 뉴클레오타이드를 추가하였다. 이 프라이머를 위한 주형은 사람의 완전한 Apo AI 암호화 서열을 가진 플라스미드 pSK+ 기본의 벡터(스트라타진(Stratagene))였다. 이중 가닥 주형은 DpnI 분해에 의해 제거되었다. PCR 단편은 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 P-10을 만들기 위하여 pKS+의 XhoI/HidIII 자리에 라이게이션 시켰다. 플라스미드 P-10은 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 SBS4010(도 7)의 XhoI/HindIII 자리에 라이게이션 시켰다. SBS4010는 아라비돕시스 올레인(Arabidopsis oleosin) 유전자 (van Rooijen G. J. 등의 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo28은 오일 바디를 표적화하는 프로-Apo AI 클론이며 kilp8 서열에서 잘려질 수 있다.
Apo29
Apo29 (SEQ ID NO:196)은 도 6에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo29 클론은 PRS-APO AI(SEQ ID NO:197)의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. Apo29는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드를 사용하여 분비 기작을 통한 발현을 위하여 표적되어졌다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론을 구성하기 위하여, 정방향 프라이머 1203 (SEQ ID NO:173) (5' GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3')는 성숙한-Apo AI의 시작점에 NcoI자리가 추가된다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이 시켰다. 두 프라이머 모두 제한효소분해를 촉진시키 위하여 5' 말단에 몇몇의 뉴클레오타이드를 추가하였다. PCR 단편은 NcoI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 5-3(도 6)을 만들기 위하여 플라스미드 SBS2090의 NcoI 및 HidIII 자리에 라이게이션 시켰다. 플라스미드 5-3은 NcoI 및 HindIII로 절단시켰고 Apo AI 단편은 SBS4011(도 7)의 NcoI/HindIII 자리에 라이게이션 시켰다. SBS4011은 아라비돕시스 올레인(Arabidopsis oleosin) 유전자 (van Rooijen G. J. 등의 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리 스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo29는 분비경로에 대한 Apo AI의 종자 특이적인 표적화를 위한 클론이다.
Apo30
Apo30 (SEQ ID NO:198)은 도 7에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo30 클론은 PRS-프로-APO AI(SEQ ID NO:197)의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. PRS-프로-APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드를 사용하여 분비 기작을 통한 발현을 위하여 표적되어졌다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론을 구성하기 위하여, 정방향 프라이머 1201 (SEQ ID NO:177) (5'-GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3')을 고안하기 위하여 프로-Apo AI의 시작점에서 NcoI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이 시켰다. 두 프라이머 모두 제한효소분해를 촉진시키 위하여 5' 말단에 몇몇의 뉴클레 오타이드를 추가하였다. PCR 단편은 NcoI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 5-3(도 6)을 만들기 위하여 플라스미드 SBS2090의 NcoI 및 HidIII 자리에 라이게이션 시켰다. PCR 단편은 NcoI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 4-2(도 7)를 생성하기 위하여 플라스미드 SBS2090에 라이게이션 시켰다(도 7). 플라스미드 4-2는 NcoI 및 HindIII로 절단시켰고 Apo AI 단편을 은 pSBS4011(도 3D)의 NcoI/HindIII에 라이게이션 시켰다. pSBS4011은 아라비돕시스 올레인(Arabidopsis oleosin) 유전자 (van Rooijen G. J. 등의 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo30은 분비경로에 대한 프로-Apo AI의 종자 특이적인 표적화를 위한 클론이다.
Apo31
Apo31 (SEQ ID NO:200)은 도 8(A)에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo31 클론은 PRS/D9 scFV/APO AI(SEQ ID NO:201) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. PRS-프로-APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드를 사용하여 분비 기작 을 통한 발현을 위하여 표적되어졌다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론을 구성하기 위하여, 정방향 프라이머 1200 (SEQ ID NO:188) (5'- GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA-3')은 프로-Apo AI의 시작에 대한 klip8(SEQ ID NO:143) 절단서열에 인프레임 클로닝을 촉진하기 위하여 NcoI 자리 및 몇몇의 뉴클레오타이드를 추가한다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이 시켰다. 이들 프라이머 주형은 내부 XhoI자리 없이 추가적인 Met 잔기의 Apo AI의 프로-형을 가지는 Apo33 플라스미드였다. PCR 단편은 XhoI로 절단시켰고 플라스미드 6-3을 만들기 위해서 플라스미드 pSK+ XhoI/EcoRI에 라이게이션 시켰다. 플라스미드 6-3은 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 SBS4055의 XhoI/HindIII에 라이게이션 시켰다(도 9). pSBS4055는 D9 scFv 항체의 인 프레임에 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo31은 분비경로에 대한 ApoAI의 종자-특이적인 표적화 및 오레오신 항체 D9로 정제하기 위한 클론이다.
Apo32
Apo32 (SEQ ID NO:202)은 도 8(A)에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo32 클론은 D9 scFV/Pro-APO AI(SEQ ID NO:203) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. PRS-프로-APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드를 사용하여 분비 기작을 통한 발현을 위하여 표적되어졌다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론을 구성하기 위하여, 정방향 프라이머 1200 (SEQ ID NO:188) (5'- GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA-3')은 프로-Apo AI의 시작에 대한 klip8(SEQ ID NO:143) 절단서열에 인프레임 클로닝을 촉진하기 위하여 NcoI 자리 및 몇몇의 뉴클레오타이드를 추가한다. 정방향 프라이머 1205 (SEQ ID NO:195) (5'-CCAAGCCCGCGCTaGAGGACCTCCG-3')는 첫번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이를 추가한 블런트(blunt) 말단 프라이머이다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이 시켰다. 이 프라이머 모두 제한효소분해를 촉진시키 위하여 5' 말단에 몇몇의 뉴클레오타이드를 추가하였다. 이들 프라이머 주형은 사람의 완전한 Apo AI 유전자를 암호화하는 서열을 포함한 pSK+ 기본의 벡터(스트라타진)였다. 두가갇의 주형은 DpnI 분해에 의해 제거되었다. PCR 단편은 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 P-10을 만들기 위해서 플라스미드 pSK+ XhoI/HindIII에 라이 게이션 시켰다. P-10은 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 SBS4055의 XhoI/HindIII에 라이게이션 시켰다(도 9). pSBS4055는 D9 scFv 항체의 인 프레임에 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo32는 정제를 돕기 위한 오레오신 항체 D9의 인프레임에 융합된 신호기작에 대한 프로-Apo-AI을 표적화하는 클론이다.
Apo33
Apo33 (SEQ ID NO:204)은 도 10에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo33 클론은 PRS/D9 scFV/met/APO AI(SEQ ID NO:205) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. D9 ScFV/met/APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드를 사용하여 분비 기작을 통한 발현을 위하여 표적되어졌다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론을 구성하기 위하여, 정방향 프라이머 1203 (SEQ ID NO:173) (5' GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3')는 성숙한-Apo AI의 시작점에 NcoI자리가 추가된다. 정방향 프라이머 1205 (SEQ ID NO:195) (5'- CCAAGCCCGCGCTaGAGGACCTCCG-3')는 첫번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이를 추가한 블런트(blunt) 말단 프라이머이다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이 시켰다. 이 프라이머 모두 제한효소분해를 촉진시키 위하여 5' 말단에 몇몇의 뉴클레오타이드를 추가하였다. 이들 프라이머 주형은 내부 XhoI 자리 없이 Apo AI의 프로형태를 포함하는 P-10 플라스미드(도 9)였다. PCR 단편은 NcoI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 20-2를 만들기 위해서 플라스미드 pSBS2090의 NcoI/HindIII에 라이게이션 시켰다. 플라스미드는 플라스미드 4010+20-2를 생성하기 위하여 NcoI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 SBS4010의 BspHI/HindIII에 라이게이션 시켰다. 플라스미드는 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 양성벡터 SBS4055의 XhoI/HindIII에 라이게이션 시켰다(도 10). pSBS4055는 D9 scFv 항체의 인 프레임에 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo33은 분비경로에 대한 Apo AI를 표적 하는 종자-특이적인 클론이고 정제를 돕기 위해서 오레오신 항체 D9의 인프레임에 융합되었다
Apo34
Apo34 (SEQ ID NO:206)은 도 10에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo34 클론은 PRS/D9 scFV/met/프로-APO AI(SEQ ID NO:207) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. D9 ScFV/met/프로-APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드를 사용하여 분비 기작을 통한 발현을 위하여 표적되어졌다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론을 구성하기 위하여, 정방향 프라이머 1201 (SEQ ID NO:177) (5'-GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3')을 고안하기 위하여 프로-Apo AI의 시작점에서 NcoI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이 시켰다. 이 프라이머 모두 제한효소분해를 촉진시키기 위하여 5' 말단에 몇몇의 뉴클레오타이드를 추가하였다. 이들 프라이머 주형은 내부 XhoI 자리 없이 Apo AI의 프로형태를 포함하는 P-10 플라스미드(도 9)였다. PCR 단편은 NcoI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 19-2를 만들기 위해서 플라스미드 pSBS2090(도 3(B))의 NcoI/HindIII에 라이게이션 시켰다. 플라스미드는 플라스미드 4010+19-2를 생성하기 위하여 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 SBS4055의 XhoI/HindIII에 라이게이션 시켰다. 플라스미드는 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 양성벡터 SBS4055의 XhoI/HindIII에 라이게이션 시켰다(도 10). pSBS4055는 D9 scFv 항체의 인 프레임에 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo34은 분비경로에 대한 met/프로-Apo AI를 표적하는 종자-특이적인 클론이고 정제를 돕기 위해서 오레오신 항체 D9의 인프레임에 융합되었다
Apo35
Apo35 (SEQ ID NO:208)은 도 10에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo35 클론은 PRS/D9 scFV/프로-APO AI/KDEL(SEQ ID NO:209) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. D9 ScFV/APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드 및 소포체에 폴리펩타이드를 보존하기 위해 사용된 KDEL 리텐션 신호를 사용하여 분비 기작을 통한 발현에 대해 표적화 하였다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론을 구성하기 위하여, 정방향 프라이머 1200 (SEQ ID NO:188) (5'- GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA-3')은 프로-Apo AI의 시작에 대한 XhoI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1208 (SEQ ID NO:210) (5' AAGCTTTCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3)' 는 종결코돈 전에 KDEL 서열은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가한다. 이들 프라이머 주형은 내부 XhoI자리 없이 추가적인 Met 잔기의 Apo AI의 프로-형을 가지는 Apo33 플라스미드였다. PCR 단편은 XhoI으로 절단시켰고 플라스미드 8-5를 만들기 위해서 플라스미드 pSK+의 XhoI/EcoRV에 라이게이션 시켰다. 플라스미드 8-5는 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 양성벡터 SBS4055(도 9)의 XhoHI/HindIII에 라이게이션 시켰다. pSBS4055는 D9 scFv 항체의 인 프레임에 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo35은 소포체에 보존하기 위한 분비 기작에 대한 Apo AI 종자-특이적인 표적화 및 오레오신 D9 scFV 항체에 의한 정제에 대한 클론이다.
Apo36
Apo36 (SEQ ID NO:211)는 도 11에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo36 클론은 PRS/D9 scFV/프로-APO AI/KDEL(SEQ ID NO:212) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. D9 ScFV/프로-APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드 및 소포체에 폴리펩타이드를 보존하기 위해 사용된 KDEL 리텐션 신호를 사용하여 분비 기작을 통한 발현에 대해 표적되었다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론을 구성하기 위하여, 정방향 프라이머 1200 (SEQ ID NO:188) (5'- GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA-3')은 프로-Apo AI의 시작에 대한 XhoI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1208 (SEQ ID NO:210) (5' AAGCTTTCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3)' 는 종결코돈 전에 KDEL 서열은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가한다. 이들 프라이머 주형은 내부 XhoI자리 없이 Apo AI의 프로-형을 포함하는 P-10 플라스미드였다(도 9). PCR 단편은 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 7-12를 만들기 위해서 플라스미드 pSK+의 XhoI/HindIII에 라이게이션 시켰다. 플라스미드 7-12는 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 양성벡터 SBS4055(도 9)의 XhoHI/HindIII에 라이게이션 시켰다. pSBS4055는 D9 scFv 항체의 인 프레임에 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전 자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo36은 분비 기작에 표적된 프로-Apo AI의 종자-특이적인 발현에 대한 클론이고, 올레오신 항체 D9과 인프레임에 융합되고, KDEL 신호 펩타이드에 의한 소포체에 축적된다.
Apo37
Apo37 (SEQ ID NO:213)는 도 12에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo37 클론은 PRS/D9 scFV/met/프로-APO AI/KDEL(SEQ ID NO:214) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. D9 ScFV/프로-APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드 및 소포체에 폴리펩타이드를 보존하기위해 사용된 KDEL 리텐션 신호를 사용하여 분비 기작을 통한 발현에 대해 표적되었다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론을 구성하기 위하여, 정방향 프라이머 1203 (SEQ ID NO:173) (5' GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3')는 성숙한-Apo AI의 시작점에 NcoI자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1208 (SEQ ID NO:210) (5' AAGCTTTCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3)' 는 종결코돈 전에 KDEL 서열은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가한다. 이들 프라이머 주형은 내부 XhoI자리 없이 Apo AI의 프로-형을 포함하는 P-10 플라스미드였다(도 9). PCR 단편은 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 10-2를 만들기 위해서 플라스미드 pSK+의 XhoI/HindIII에 라이게이션 시켰다. 그 플라스미드는 플라스미드 4010+10-2를 생성하기 위하여, NcoI 및HindIII로 절단하였고, SBS4010 벡터 BspHI/HindIII 자리에 라이게이션 시켰다. 플라스미드는 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 양성벡터 SBS4055(도 9)의 XhoHI/HindIII에 라이게이션 시켰다. SBS4055는 인프레임 D9 scFv 삽입의 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo37은 분비 기작에 대한 met/Apo AI를 표적하는 클론이고, 올레오신 항체 D9과 인프레임에 융합되어지고, KDEL 신호 펩타이드에 기인하는 소포체서 축적된다.
Apo38
Apo38 (SEQ ID NO:215)는 도 11에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo36 클론은 PRS/D9 scFV/프로-APO AI/KDEL(SEQ ID NO:212) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. D9 ScFV/프로-APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드 및 소포체에 폴리펩타이드를 보존하기 위해 사용된 KDEL 리텐션 신호를 사용하여 분비 기작을 통한 발현에 대해 표적되었다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론을 구성하기 위하여, 정방향 프라이머 1201 (SEQ ID NO:177) (5'-GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3')을 고안하기 위하여 프로-Apo AI의 시 작점에서 NcoI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1208 (SEQ ID NO:210) (5' AAGCTTTCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3)'는 종결코돈 전에 KDEL 서열은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가한다. 이들 프라이머 주형은 내부 XhoI 자리 없이 Apo AI의 프로-형을 포함하는 P-10 플라스미드였다(도 9). PCR 단편은 EcoRV로 절단시켰고 플라스미드 9-2를 만들기 위해서 플라스미드 pSK+의 EcoRV에 라이게이션 시켰다. 플라스미드는 플라스미드 4010+9-2를 형성하기 위하여 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 양성벡터 SBS4055(도 9)의 XhoHI/HindIII에 라이게이션 시켰다. pSBS4055는 D9 scFv 항체의 인 프레임에 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo36은 분비 기작에 표적된 프로-Apo AI의 종자-특이적인 발현에 대한 클론이고, 올레오신 항체 D9과 인프레임에 융합되고, KDEL 신호 펩타이드에 의한 소포체에 축적된다.
Apo37
Apo37 (SEQ ID NO:213)는 도 12에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에 서 확인할 수 있듯이, Apo37 클론은 PRS/D9 scFV/met/APO AI/KDEL(SEQ ID NO:214) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. D9 ScFV/met/APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드 및 소포체에 폴리펩타이드를 보존하기 위해 사용된 KDEL 리텐션 신호를 사용하여 분비 기작을 통한 발현에 대해 표적되었다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론을 구성하기 위하여, 정방향 프라이머 1203 (SEQ ID NO:173) (5' GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3')는 성숙한-Apo AI의 시작점에 NcoI자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1208 (SEQ ID NO:210) (5' AAGCTTTCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3)' 는 종결코돈 전에 KDEL 서열은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가한다. 이들 프라이머 주형은 내부 XhoI자리 없이 Apo AI의 프로-형을 포함하는 P-10 플라스미드였다(도 9). PCR 단편은 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 10-2를 만들기 위해서 플라스미드 pSK+의 XhoI/HindIII에 라이게이션 시켰다. 그 플라스미드는 플라스미드 4010+10-2를 생성하기 위하여, NcoI 및HindIII로 절단하였고, SBS4010 벡터 BspHI/HindIII 자리에 라이게이션 시켰다. 플라스미드는 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 양성벡터 SBS4055(도 9)의 XhoHI/HindIII에 라이게이션 시켰다. SBS4055는 인프레임 D9 scFv 삽입의 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo37은 분비 기작에 대한 met/Apo AI를 표적하는 클론이고, 올레오신 항체 D9과 인프레임에 융합되어지고, KDEL 신호 펩타이드에 기인하는 소포체에서 축적된다.
Apo38
Apo38 (SEQ ID NO:215)는 도 13에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo38 클론은 PRS/D9 scFV/klip8/APO AI/KDEL(SEQ ID NO:216) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. D9 ScFV/klip8/APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드 및 소포체에 폴리펩타이드를 보존하기 위해 사용된 KDEL 리텐션 신호를 사용하여 분비 기작을 통한 발현에 대해 표적되었다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론을 구성하기 위하여, 정방향 프라이머 1203 (SEQ ID NO:173) (5' GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3')는 성숙한-Apo AI의 시작점에 NcoI자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1208 (SEQ ID NO:210) (5' AAGCTTTCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3)'는 종결코돈 전에 KDEL 서열은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가한다. 이들 프라이머 주형은 내부 XhoI자리 없이 Apo AI의 프로-형을 포함하는 P-10 플라스미드였다(도 9). PCR 단편은 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 10-2를 만들기 위해서 플라스미드 pSK+의 XhoI/HindIII에 라이게이션 시켰다. 그 플라스미드는 플라스미드 4010+10-2를 생성하기 위하여, NcoI 및HindIII로 절단하였고, SBS4010 벡터 BspHI/HindIII 자리에 라이게이션 시켰다. 플라스미드는 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 양성벡터 SBS4055(도 9)의 XhoHI/HindIII에 라이게이션 시켰다. SBS4055는 인프레임 D9 scFv 삽입의 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo38은 분비 기작에 대한 met/프로-Apo AI를 표적하는 클론이고, 올레오신 항체 D9과 인프레임에 융합되어지고, KDEL 신호 펩타이드에 기인하는 소포체에서 축적된다.
Apo39
Apo39 (SEQ ID NO:217)는 도 12에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo39 클론은 PRS/D9 scFV/kilp8/Apo AI/KDEL(SEQ ID NO:218) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. D9 ScFV/klip8/APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드 및 소포체에 폴리펩타이드를 보존하기 위해 사용된 KDEL 리텐션 신호를 사용하여 분비 기작 을 통한 발현에 대해 표적되었다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론은 카이모신으로 융합 단백질의 절단을 촉진하기 위한 klip8 절단서열(SEQ ID NO:413)을 갖는다. 이 클론을 구성하기 위하여, 정방향 프라이머 1207(SEQ ID NO:219) 5' GCAGCAGTCGACtATGGCTGAGATCACCCGCATTC-3')서열은 시작 코돈에 SalI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이를 추가한다. PCR 반응의 주형은 플라스미드 Apo27이였다(도 8(A)). PCR 단편은 SalI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 13-1를 만들기 위해서 플라스미드 pSK+에 라이게이션 시켰다. 그 플라스미드는 SalI 및 HindIII로 절단하였고, SBS4010 벡터 BspHI/HindIII 자리에 라이게이션 시켰다. 플라스미드는 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 양성벡터 SBS4055(도 9)의 XhoHI/HindIII에 라이게이션 시켰다. SBS4055는 인프레임 D9 scFv 삽입의 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo39은 분비 기작에 대한 klip8/Apo AI의 종자-선호적인 발현을 위한 클론이다. Apo AI의 정제는 오일 바디의 올레오신에 친화성이 있는 D9 scFV 항체를 사용하여 수행되었다. 그 단백질은 klip8 자리를 절단할 수 있는 카이모신을 사용하여 절단할 수 있다.
Apo40
Apo40 (SEQ ID NO:220)는 도 13에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo40 클론은 PRS/D9 scFV/kilp8/프로-Apo AI/(SEQ ID NO:221) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. D9 ScFV/klip8/프로-APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드를 사용하여 분비 기작에 대한 발현을 위하여 표적되었다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론은 카이모신으로 융합 단백질의 절단을 촉진하기 위한 klip8 절단서열(SEQ ID NO:413)을 갖는다. 이 클론을 구성하기 위한 정방향 프라이머 1207(SEQ ID NO:219) 5' GCAGCAGTCGACtATGGCTGAGATCACCCGCATTC-3')서열은 시작 코돈에 SalI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이를 추가한다. PCR 반응의 주형은 플라스미드 Apo27이였다(도 8(A)). PCR 단편은 SalI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 14-5를 만들기 위해서 플라스미드 pSK+에 라이게이션 시켰다. 그 플라스미드는 SalI 및 HindIII로 절단하였고, SBS4010 벡터에 라이게이션 시켰다. 플라스미드는 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 양성벡터 SBS4055(도 9)의 XhoHI/HindIII에 라이게이션 시켰다. SBS4055는 인프레임 D9 scFv 삽입의 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo40은 분비 기작에 표적화된 D9 scFV/klip8/Apo AI의 종자-선호적인 발현을 위한 클론이다. Apo AI의 정제는 오일 바디의 올레오신에 친화성이 있는 D9 scFV 항체를 사용하여 수행되었다. 그 단백질은 klip8 자리를 절단할 수 있는 카이모신을 사용하여 절단할 수 있다.
Apo 41
Apo41 (SEQ ID NO:222)는 도 14에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo41 클론은 PRS/D9 scFV/kilp8/Apo AI/(SEQ ID NO:221) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. D9 ScFV/klip8/APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드를 사용하여 분비 기작을 통한 발현을 위해 표적되었다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론은 카이모신으로 융합 단백질의 절단을 촉진하기 위한 klip8 절단서열(SEQ ID NO:413)을 갖는다. 이 클론을 구성하기 위한 정 방향 프라이머 1207(SEQ ID NO:219) 5' GCAGCAGTCGACtATGGCTGAGATCACCCGCATTC-3')서열은 시작 코돈에 SalI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이를 추가한다. PCR 반응의 주형은 플라스미드 Apo25이였다(도 6). PCR 생산물은 SalI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 11-1를 만들기 위해서 플라스미드 pSK+에 라이게이션 시켰다. 그 플라스미드는 SalI 및 HindIII로 절단하였고, SBS4010 벡터에 라이게이션 시켰다. 플라스미드는 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 양성벡터 SBS4055(도 9)의 XhoHI/HindIII에 라이게이션 시켰다. SBS4055는 인프레임 D9 scFv 삽입의 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo41은 분비 기작에 표적화 된 D9 scFV/klip8/met/Apo AI의 종자-선호적인 발현을 위한 클론이다. met/Apo AI의 정제는 오일 바디의 올레오신에 친화성이 있는 D9 scFV 항체를 사용하여 수행되었다. 그 단백질은 klip8 자리를 절단할 수 있는 카이모신을 사용하여 절단할 수 있다.
Apo42
Apo42 (SEQ ID NO:224)는 도 14에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo42 클론은 PRS/D9 scFV/kilp8/met/프로-Apo AI/(SEQ ID NO:225) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. D9 ScFV/klip8/met/프로-APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드를 사용하여 분비 기작을 통한 발현을 위해 표적되었다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론은 카이모신으로 융합 단백질의 절단을 촉진하기 위한 klip8 절단서열(SEQ ID NO:413)을 갖는다. 이 클론을 구성하기 위한 정방향 프라이머 1207(SEQ ID NO:219) 5' GCAGCAGTCGACtATGGCTGAGATCACCCGCATTC-3')는 klip8 서열의 시작을 증폭하고 시작 코돈에 SalI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1206 (SEQ ID NO: 1 7 4) ( 5 ' GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGA GCG- 3')은 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하고 두 번째 XhoI자리를 제거하기 위하여 침묵 돌연변이를 추가한다. PCR 반응을 위한 주형은 플라스미드 Apo26이였다(도 7). PCR 생산물은 SalI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 12-1를 만들기 위해서 플라스미드 pSK+에 라이게이션 시켰다. 그 플라스미드는 SalI 및 HindIII로 절단하였고, SBS4010 벡터에 라이게이션 시켰다. 플라스미드는 XhoI 및 HindIII로 절단시켰고 양성벡터 SBS4055(도 9)의 XhoHI/HindIII에 라이게이션 시켰다. SBS4055는 인프레임 D9 scFv 삽입의 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결 자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo42는 분비 기작에 표적화 된 D9 scFV/klip8/met/프로-Apo AI의 종자-선호적인 발현을 위한 클론이다. met/Apo AI의 정제는 오일 바디의 올레오신에 친화성이 있는 D9 scFV 항체를 사용하여 수행되었다. 그 단백질은 klip8 자리를 절단할 수 있는 카이모신을 사용하여 절단할 수 있다.
Apo43
Apo43 (SEQ ID NO:226)는 도 13에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo43 클론은 PRS/D9 scFV/kilp8/Apo AI/KDEL(SEQ ID NO:225) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. D9 ScFV/klip8/APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드 및 소포체에 폴리펩타이드를 보존하기 위해 사용된 KDEL 리텐션 신호를 사용하여 분비 기작에 대한 발현을 위해 표적되었다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론은 카이모신으로 융합 단백질의 절단을 촉진하기 위한 klip8 절단서열(SEQ ID NO:413)을 갖는다. 이 클론을 구성하기 위한 정방향 프라이머 1207(SEQ ID NO:219) 5' GCAGCAGTCGACtATGGCTGAGATCACCCGCATTC-3') 서열은 시작 코 돈에 SalI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1208 (SEQ ID NO:210) (5' AAGCTTTCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3)'은 종결코돈 전에 KDEL 서열 및 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가한다. PCR 반응을 위한 주형은 플라스미드 Apo27(도 8(A))이였다. PCR 생산물은 SalI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 17-1를 만들기 위해서 플라스미드 pSK+에 라이게이션 시켰다. 그 플라스미드는 SalI 및 HindIII로 절단하였고, SBS4055 벡터의 XhoI/HindIII 자리에 라이게이션 시켰다(도 9). SBS4055는 인프레임 D9 scFv 삽입의 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo43은 KDEL 신호 펩타이드에 기인하여 소포체에 축적될 것이다. Apo AI의 정제는 오일 바디의 올레오신에 친화성이 있는 D9 scFV 항체를 사용하여 수행되었다. 그 단백질은 klip8 자리를 절단할 수 있는 카이모신을 사용하여 절단할 수 있다.
Apo44
Apo44 (SEQ ID NO:228)는 도 13에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo44 클론은 PRS/D9 scFV/kilp8/프로-Apo AI/KDEL(SEQ ID NO:229) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. D9 ScFV/klip8/프로-APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드 및 소포체에 폴리펩타이드를 보존하기 위해 사용된 KDEL 리텐션 신호를 사용하여 분비 기작에 대한 발현을 위해 표적되었다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론은 카이모신으로 융합 단백질의 절단을 촉진하기 위한 klip8 절단서열(SEQ ID NO:413)을 갖는다. 이 클론을 구성하기 위한 정방향 프라이머 1207(SEQ ID NO:219) 5' GCAGCAGTCGACtATGGCTGAGATCACCCGCATTC-3') 서열은 시작 코돈에 SalI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1208 (SEQ ID NO:210) (5' AAGCTTTCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3)'은 종결코돈 전에 KDEL 서열 및 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가한다. PCR 반응을 위한 주형은 플라스미드 Apo28(도 9)이였다. PCR 생산물은 SalI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 18-2를 만들기 위해서 플라스미드 pSK+에 라이게이션 시켰다. 그 플라스미드는 XhoI 및 HindIII로 절단하였고, SBS4055 벡터의 XhoI/HindIII 자리에 라이게이션 시켰다(도 9). SBS4055는 인프레임 D9 scFv 삽입의 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저 항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo44은 KDEL 신호 펩타이드에 기인하여 소포체에 축적될 것이다. 프로-Apo AI의 정제는 오일 바디의 올레오신에 친화성이 있는 D9 scFV 항체를 사용하여 수행되었다. 그 단백질은 klip8 자리를 절단할 수 있는 카이모신을 사용하여 절단할 수 있다.
Apo45
Apo45 (SEQ ID NO:230)는 도 14에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo45 클론은 PRS/D9 scFV/kilp8/met/Apo AI/KDEL(SEQ ID NO:231) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. D9 ScFV/klip8/met/APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드 및 소포체에 폴리펩타이드를 보존하기 위해 사용된 KDEL 리텐션 신호를 사용하여 분비 기작에 대한 발현을 위해 표적되었다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론은 카이모신으로 융합 단백질의 절단을 촉진하기 위한 klip8 절단서열(SEQ ID NO:413)을 갖는다. 이 클론을 구성하기 위한 정방향 프라이머 1207(SEQ ID NO:219) 5' GCAGCAGTCGACtATGGCTGAGATCACCCGCATTC-3') 서열은 시작 코돈에 SalI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1208 (SEQ ID NO:210) (5' AAGCTTTCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3)'은 종결코돈 전에 KDEL 서열 및 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가한다. PCR 반응을 위한 주형은 플라스미드 Apo25(도 6)이였다. PCR 생산물은 SalI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 15-1를 만들기 위해서 플라스미드 pSK+에 라이게이션 시켰다. 그 플라스미드는 SalI 및 HindIII로 절단하였고, SBS4055 벡터의 XhoI/HindIII 자리에 라이게 이션 시켰다(도 9). SBS4055는 인프레임 D9 scFv 삽입의 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo45은 KDEL 신호 펩타이드에 기인하여 소포체에 축적될 것이다. Apo AI의 정제는 오일 바디의 올레오신에 친화성이 있는 D9 scFV 항체를 사용하여 수행되었다. 그 단백질은 klip8 자리를 절단할 수 있는 카이모신을 사용하여 절단할 수 있다.
Apo46
Apo46 (SEQ ID NO:232)는 도 14에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo46 클론은 PRS/D9 scFV/kilp8/met/프로-Apo AI/KDEL(SEQ ID NO:233) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(파세올린)로 구성된다. D9 ScFV/klip8/met/프로-APO AI는 담배 독소 관련 서열(PRS)신호 펩타이드 및 소포체에 폴리펩타이드를 보존하기 위해 사용된 KDEL 리텐션 신호를 사용하여 분비 기작에 대한 발현을 위해 표적되었다(Sijmons 등의, 1990, Bio/technology, 8:217-221). 이 클론은 카이모신으로 융합 단백질의 절단을 촉진하기 위한 klip8 절단서열(SEQ ID NO:413)을 갖는다. 이 클론을 구성하기 위한 정 방향 프라이머 1207(SEQ ID NO:219) 5' GCAGCAGTCGACtATGGCTGAGATCACCCGCATTC-3') 서열은 시작 코돈에 SalI 자리를 추가한다. 역방향 프라이머 1208 (SEQ ID NO:210) (5' AAGCTTTCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3)'은 종결코돈 전에 KDEL 서열 및 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가한다. PCR 반응을 위한 주형은 플라스미드 Apo26(도 7)이였다. PCR 생산물은 SalI 및 HindIII로 절단시켰고 플라스미드 15-1를 만들기 위해서 플라스미드 pSK+에 라이게이션 시켰다. 그 플라스미드는 SalI 및 HindIII로 절단하였고, SBS4055 벡터의 XhoI/HindIII 자리에 라이게이션 시켰다(도 9). SBS4055는 인프레임 D9 scFv 삽입의 융합된 PRS 신호서열의 발현을 조절하기 위하여 파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)로 부터 β- 파세올린(phaseolin) 프로모터/종결자(Slightom 등의 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80:1897-1901) 및 klip8 절단자리를 포함한다. 이 플라스미드는 또한 아그로박테리움으로 형질전환하기 위해 페트오셀이눔 크리품(Petroselinum crispum ) (Kawalleck 등의 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684)으로부터 유비퀴틴 프로모터/종결자에 의해 조절되는 호스트 식물의 포스프이노트리신(phosphinothricine) 저항성을 주는 pat 유전자(Wohlleben 등의 1988, Gene 70:25-37)를 포함한다. Apo46은 분비경로에 표적되어진 D9 scFV/klip/met/프로-Apo AI의 종자 선호적인 발현을 위한 클론이다. Apo AI의 정제는 오일 바디의 올레오신에 친화성이 있는 D9 scFV 항체를 사용하여 수행되었다. 그 단백질은 klip8 자리를 절단할 수 있는 카이모신을 사용하여 절단할 수 있다.
Apo47
Apo47 (SEQ ID NO:234)는 도 15에 구성된 종자-선호적인 클론이다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, Apo47 클론은 옥수수 올레오신/klip8/met/Apo AI/(SEQ ID NO:235) 융합 단백질의 발현을 조절하는 종자-선호적인 프로모터 및 종결자(리닌(linin))로 구성된다. 이 구성은 카이모신으로 융합 단백질의 절단을 촉진하기 위한 klip8 절단서열(SEQ ID NO:413)을 갖는다. 이 클론을 구성하기 위한 정방향 프라이머 1226 (5'- GCAGCACCATGGCTGATCACCACCG-3') (SEQ ID NO: 236)은 pSBS2377 로부터 옥수수 올레오신의 암호화 서열을 증폭하기 위하여 사용되었고, klip8/met/Apo AI으로 인프레임 번역 융합의 생산을 돕기 위해서 유전자의 종결코돈을 제거하고 HindIII 자리를 추가한 역방향 프라이머 1227 (5'- GTGGTGAAGCTTAGACCCCTGCGCC-3') (SEQ ID NO:237)과 혼합에서 유전자의 시작에 NcoI자리를 추가한다. Apo25로 부터 klip8/met/Apo AI 암호화 서열은 유전자의 시작에 서열을 증폭하고 HindIII 자리를 추가한 정방향 프라이머 1228 (5'- GCAGCAAAGCTTATGGCTGAGATCAC-3') (SEQ ID NO:238)을 이용하여 증폭시켰다. 옥수수 cDNA 및 klip/met/Apo AI를 포함하는 PCR 단편은 Topo 클로닝 벡터(인비트로젠사( Invitrogen))의 EcoRI 자리에 라이게이션 시켰다. 플라스미드 MzOleo는 제한효소 NcoI 및 HindIII 으로 절단하였다. 플라스미드 klip8/met/Apo AI는 HidIII 및 BamHI으로 절단하였다. MzOleo 및 klip8/met/Apo AI 단편은 플라스미드 Apo47을 만들기 위해 플라스미드 SBS5709의 NcoI 및 BamHI 자리에 라이게이션 시켰다. pSBS5709은 다수의 클로닝 자리를 배치하기 위하여 WO 01/16340로 부터 리닌 프로모터/종결자를 포함한다. pSBS5709은 또한 만노스 포함 선택배지에서 양성 선택을 허락하는 포스포만노어스 아이소머라아제의 암호화하는 pmi 유전자(Miles 등의, 1984, Gene 21:41-48)를 포함한다. pmi 유전자는 아그로벡테리움으로 형질전환하기 위해 페트로셀리움 크리스품(Petroselinum crispum) (Kawalleck 등의' 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684))의 유비퀴틴 프로모터/종결자의 조절하에 있다. Apo47은 분비경로에 표적 되어진 D9 scFV/klip/met/프로-Apo AI의 종자 선호적인 발현을 위한 클론이다. Apo AI은 오일 바디의 옥수수 올레오신/klip8/met/Apo AI의 종자-우선적 암호화하고 klip8 자리를 절단할 수 있는 카이모신을 사용하여 정제하기 위한 클론이다.
Example 2
아그로벡테리움 ( Agrobacterium ) 및 아라비돕시스 ( Arabidopsis ) 형질전환
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 대 컬럼비아(Columbia(C24))는 모든 실험에서 사용되었다. 종자들은 4인치의 화분에 혼합토양(2/3 레디-얼스(Redi-earth) 및 1/3 퍼라이트(perlite), pH = 6.7)에 심거나 레흘 종자(Lehle Seeds)가 충전된 아라비돕시스 혼합토양(퍼라이트(perlite), 버미큘라이트(vermiculite), 이탄, 테라녹색(terra-green), pH = 5.5)에 심었다. 묘목은 직경 약 2.5 cm의 6 내지 3개의 잎이 로제트 형으로 자라게 두었다. 이 묘목은 망 안에 1 cm 직경의 잘려진 ; 각 구석에 하나씩 및 중앙에 하나의 다섯 개의 구멍을 가진 창 스크린으로 둘러싸인, 상기 혼합토양이 포함된 4 인치 화분에 이식하였다. 화분은 4일 동안 4℃의 돔안에 두어 냉처리를 하고 24℃, 150μE의 일정한 빛 및 50% 습도를 가진 성장 방으로 옮겼다. 식물은 2 내지 3일 간격으로 물을 주었고 매주 1% 20-20-20의 페테르스에 비료를 주었다. 각 화분은 다섯 식물을 포함한다. 식물이 높이 l2cm가 되면 첫번째 볼트(식물에서 처음 올라오는 눈, 싹을 가진 봉우리)는 두번째 세번째의 성장을 촉진하기 위해서 잘랐다. 첫번째 볼트를 자르고 4 내지 5일 후에, 식물은 아그로박테리움에 감염시킬 제조를 했다. 플라스미드는 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 아그로박테리움 EHA101에 형질전환시켰다. 아라비돕시스 식물이 있는 화분은 뒤집어서 20초 동안 흥미있는 식물 형질전환 벡터를 포함한 500ml의 아그로박테리움 배지에 밤새 매달아 감염시켰다. 5%의 자당 및 0.05%의 계면 활성제 Silwet L-77(Lehle Seeds)를 포함하는 아그로박테리움 배양은 중요하다. 화분은 그 뒤에 투명한 플라스틱 돔으로 덮고 24시간동안 높은 tmv도를 유지하였다. 식물은 성숙한기로 자라게 두어 종자(형질전환되지 않거나 형질전화된)를 수확하였다. 트랜스제닉 주를 선택하기 위하여 형질전환으로 추정되는 종자는 70% 에탄올의 퀵 세척으로 멸균하고 그리고 나서 20% 상업적인 표백제에 15분 동안 둔 후 증류수에 최소 4시간 동안 헹궜다. 약 1000개의 멸균된 종자는 0.6% 탑 아가(0.6%)로 혼합하였고 0.5% 슈크로즈 및 제초제 포스피노트리신(phosphinothricin (PPT)) DL의 EM이 포함된 반고체 MS 플레이트(Murashige 및 Skoog, 1962, Physiologia Plantarum 15: 473-497)에 고르게 뿌렸다. 그리고나서 플레이트는 8시간 어둠 및 16시간 빛이 제공되는 라이트 주기가 제공되는 성장방에 두었다. 7 내지 10일 후에, 트랜스제닉으로 추정되는 묘목은 푸르게 자라고 형질전환되지 않은 묘목은 하얗게 되었다. 뿌리가 정착된 후에 트랜스제닉으로 추정되는 묘목은 각각 화분(각각의 화분은 3일 간격으로 물을 주었고 5일 간격으로 1% 의 20-20-20 페테르스로 비옥하게 하였다)으로 이동시키고 성숙한기까지 자라게 두었다. 화분은 민감한 묘목을 보호하기위해 3일 동안 투명한 돔으로 덮었다. 7일 후에 묘목은 흩어져서 잃어버리는 것을 방지하기 위해 레흘 씨드(Lehle Seeds) 위에 종자 컬렉터로 덮었다. 이 트랜스 제닉 식물은 각각 수확하였고 분석을 위한 제조를 하였다.
총 잎 추출물 제조
아라비돕시스 잎은 액체 질소로 얼리고 드릴을 사용하여 1.5 ml 미세튜브 내에서 갈았다. 200- 250 μl의 0.5M Tris-HCl, pH 7.5 를 첨가하였고 시료는 얼음 위에 두었다. 20% SDS는 최종 2% 농도로 첨가하였다. 시료 디바스(divas)는 5분동안 끓이고 추출물은 최대 속도로 5분 동안 돌렸다. 용액은 다른 마이크로퓨즈 튜브로 옮기고 -20℃에 보관하였다. 수용성 단백질은 BCA 단백질 어쎄이(피어스 사(Pierce))로 정량하고 15% SDS-전기영동 및 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 항체 Apo AI 또는 항체 GFP 토끼 항혈청은 1차 항체로 사용하였다; 그리고 항-토끼-IgG"H+L'-AP 컨쥬게이트(바이오-라드 사)는 2차 항체로 사용하였다.
총 종자 추출물 제조
약 40 아라비돕시스 종자는(T 종자) Stir-Pak 실험실 믹서기를 이용하여 마이크로튜브 내 50 uL 완충용액(50 mM Tris pH 7.5) 안에서 갈았다. 20% SDS는 순차적으로 최종 농도 2%로 시료에 첨가하고 시료는 5분동안 끓인다음 5분 동안 최대속도로 원심분리하였다. SDS-전기영동 겔에 로딩하기 위해 SDS PAGE 2X 로딩 완충용액(100 mM Tris pH 6.8, 20% glycerol, 4% SDS, 2 mg/mL bromophenol blue, 200 mM DTT) 및 1M DTT를 시료에 첨가하고 5분동안 끓이고 2분동안 최대속도로 원심분리하였다.
실시예 3
아포지질단백질 발현을 위한 웨스턴 블랏 분석
구성요소(항상 발현되는 요소)의 발현
Apol7
실시예 1에서 보여지듯이, Apo17(SEQ ID NO:27)은 성숙한 Apo AI 및 GFP 사이의 융합 단백질이다. 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터 및 종결자는 구조물의 구성성분 발현을 위하여 사용되어진다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석( 도16(A))은 12 클론 중 9개에서 총 잎 단백질 중 아주 작은 수준(총 잎 단백질의 0.1% 미만)의 약 55kDa의 분자량의 Apo-AI/GFP 융합 단백질을 검출했다. 그러나, 총 종자 추출물( 도 17(B))에서는 테스트한 12개 클론 중 11개에서 약 55kDa의 Apol7 융합 단백질의 상당한 발현(총 종자 단백질의 최소 1%)은 )이 검출되었다.
Apol8a
실시예 1에서 보여지듯이, Apol8 (SEQ ID NO:29)은 성숙한 Apo AI 및 GFP 사이의 융합 단백질이다. 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터 및 종결자는 구조물의 구성성분 발현을 위하여 사용되어진다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석( 도17(A))은 12 클론 중 3개에서 총 잎 단백질 중 아주 작은 수준(총 잎 단백질의 0.1% 미만)의 약 56kDa의 분자량의 Apo-AI/GFP 융합 단백질을 검출했다. 그러나, 총 종자 추출물( 도 16(B))에서는 테스트한 모든 클론에서 약 56kDa의 Apol8 융합 단백질의 상당한 발현(총 종자 단백질의 최소 1%)은 )이 검출되었다.
Apol9
실시예 1에서 보여지듯이, Apol9 (SEQ ID NO:31)는 성숙한 Apo AI 및 GFP 사이의 융합 단백질이다. 구조물 및 PRS 신호 펩타이드의 발현을 위해 사용된 프로모터 및 종결자의 발현은 소포체에서 웅합단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어진다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석( 도18(A))은 12 클론 중 10개에서 총 잎 단백질 중 아주 작은 수준(총 잎 단백질의 0.1% 미만)의 약 58kDa의 분자량의 Apo-AI/GFP 융합 단백질을 검출했다. 그러나, 총 종자 추출물( 도 18(B))에서는 테스트한 18개 클론 중 17개에서 약 58kDa의 Apol9 융합 단백질의 상당한 발현(총 종자 단백질의 최소 1%)은 )이 검출되었다.
Apo20
실시예 1에서 보여지듯이, Apo20 (SEQ ID NO:35)은 성숙한 Apo AI 및 GFP 사이의 융합 단백질이다. 구조물 및 PRS 신호 펩타이드의 발현을 위해 사용된 프로모터 및 종결자의 발현은 소포체에서 웅합단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어진다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석( 도 19(A))은 12 클론 중 3개에서 총 잎 단백질 중 아주 작은 수준(총 잎 단백질의 0.1% 미만)의 약 59kDa의 분자량의 Apo-AI/GFP 융합 단백질을 검출했다. Apo 20 융합단백질은 총 종자 추출물( 도 19(B))에서 테스트한 18개 클론 중 16개에서 약 59kDa에서 검출되었다.
종자-특이적인 발현
ApolO
실시예 1에서 보여지듯이, ApolO (SEQ ID NO:10)은 성숙한 Apo AI 및 GFP 사이의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모너 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었다. 다클론항체 GFP를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 20(A))은 10 클론 중 7개에서 총 잎 단백질 중 약 55kDa의 분자량의 Apo-AI/GFP 융합 단백질을 검출했다.
Apol1
실시예 1에서 보여지듯이, Apoll (SEQ ID NO:16)은 프로-Apo AI 및 GFP 사이의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었다. 다클론항체 GFP를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 20(B))은 14 클론 중 10개에서 총 잎 단백질 중 약 56kDa의 분자량의 Apo-AI/GFP 융합 단백질을 검출했다.
Apol2
실시예 1에서 보여지듯이, Apol2 (SEQ ID NO:19)는 올레오신, 성숙한-Apo AI 및 GFP 사이의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었다. 다클론항체 GFP를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 21(A))은 테스트한 17 클론 모두에서 총 잎 단백질 중 약 74kDa의 분자량의 Apo-AI/GFP 융합 단백질을 검출했다.
Apol3
실시예 1에서 보여지듯이, Apol3 (SEQ ID NO:21)는 올레오신, 프로-Apo AI 및 GFP 사이의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자- 특이적인 발현을 위해 사용되었다. 다클론항체 GFP를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 21(B))은 테스트한 18 클론 모두에서 총 잎 단백질 중 약 75kDa의 분자량의 Apo-AI/GFP 융합 단백질을 검출했다.
Apol5
실시예 1에서 보여지듯이, Apol5 (SEQ ID NO:23)는 올레오신, 프로-Apo AI 및 GFP 사이의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호 펩타이드는 분비 시스템에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어졌ㄷ. 다클론항체 GFP를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 22(B))은 테스트한 10 클론 중9 클론에서 총 잎 단백질 중 약 88kDa의 분자량의 Apo-AI/GFP 융합 단백질을 검출했다.
Apo21
실시예 1에서 보여지듯이, Apo21 (SEQ ID NO:37)은 프로-Apo AI 및 GFP 사이의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 23(A))은 총종자 추출물에서 Apo AI를 검출하기위해 사용되었다. 예상되는 분자량은 약 28kDa 였다. 12 클론의 테스트에서, 수많은 다른 단백질은 25 kDa에서 55 kDa 이상까지 정렬된 Apo AI로 검출되었다.
Apo21
실시예 1에서 보여지듯이, Apo22 (SEQ ID NO:41)는 프로-Apo AI 이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었다. 다 클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 23(B))은 총 종자 추출물에서 Apo AI를 검출하기 위해 사용되었다. 예상되는 분자량은 약 29kDa 였다. 6 클론의 테스트에서, 수많은 다른 단백질은 25 kDa에서 55 kDa 이상까지 정렬된 Apo AI로 검출되었다. 클론 22 내지 3은 적절한 분자량을 가지는 단백질이다. 프로-Apo AI의 발현이 다소 Apo21, Apo29 및 Apo30 대 Apo23 구조물을 발현하는 식물의 건강과 비교하였을 때 중간 표현형을 가진 건강한 식물에 해를 입혔다.
Apo21
실시예 1에서 보여지듯이, Apo24 (SEQ ID NO:46)은 올레오신 및 프로-Apo AI 및 GFP 사이의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 24(B))은 총 종자 추출물에서 올레오신/Apo AI 융합 단백질를 검출하기 위해 사용되었다. 예상되는 분자량은 약 28kDa 였다. 테스트된 7 클론 모두에서 약 48 kDa의 분자량이 검출되었다.
Apo25
실시예 1에서 보여지듯이, Apo25 (SEQ ID NO:48)는 올레오신 및 두 개의 조성을 분리하는 klip8 절단 서열을 가진 Apo AI(+Met) 사이의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 25(A))은 테스트된 4 클론 모두에서 약 51 kDa의 분자량의 총 종자 추출물에서 올레오신-klip8-Apo AI(+Met) 융합 단백질를 검출하기 위해 사용되었다.
Apo26
실시예 1에서 보여지듯이, Apo26 (SEQ ID NO:51)는 올레오신 및 두 개의 조성을 분리하는 klip8 절단 서열을 가진 Apo AI(+Met) 사이의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 25(B))은 테스트된 11 클론 모두에서 약 52 kDa의 분자량의 총 종자 추출물에서 올레오신-klip8-프로Apo AI(+Met) 융합 단백질를 검출하기 위해 사용되었다.
Apo28
실시예 1에서 보여지듯이, Apo28 (SEQ ID NO:60)은 올레오신 및 두 개의 조성을 분리하는 klip8 절단 서열을 가진 프로-Apo AI 사이의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 25(B))은 테스트된 7 클론 모두에서 약 52 kDa의 분자량의 총 종자 추출물에서 올레오신-klip8-프로Apo AI(+Met) 융합 단백질를 검출하기 위해 사용되었다.
Apo29
실시예 1에서 보여지듯이, Apo29 (SEQ ID NO:63)는 Apo AI이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호 는 분비 기작에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어졌다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 26(B))은 총 잎 단백질에서의 Apo-AI 단백질을 검출하기 위해서 사용되어졌다. 예상되는 분자량은 31 kDa였다. 10개의 클론의 테스트에서, 단 1 클론에서 단백질이 검출되었으며, 분자량은 37 kDa 범위였다. Apo AI의 발현이 식물의 건강을 위해 하였음을 알 수 있었다( 즉, 성장이 멈춘 식물 및 종자 소실).
Apo30
실시예 1에서 보여지듯이, Apo30 (SEQ ID NO:65)는 프로-Apo AI이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호는 분비 기작에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어졌다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 27))은 총 잎 단백질에서의 Apo-AI 단백질을 검출하기 위해서 사용되어졌다. 예상되는 분자량은 32 kDa였다. 13개의 클론의 테스트에서, 수많은 다양한 단백질들이 분자량은 25 kDa 내지 55 kDa 이상의 범위에 정렬되어 Apo AI 항체에 검출되었다 이것은 Apo AI의 발현이 식물의 건강을 위해 하였음을 알 수 있었다(즉, 성장이 멈춘 식물 및 종자 소실).
Apo32
실시예 1에서 보여지듯이, Apo32 (SEQ ID NO:69)는 D9 scFV 및 프로-Apo AI의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호는 분비 기작에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어졌다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 28(A))은 총 종자 추출물에서 테스트 한 5 클론 모두에서 약 59kDa의 분자량의 Apo-AI/GFP 융합 단백질을 검출했다.
Apo32
실시예 1에서 보여지듯이, Apo32 (SEQ ID NO:69)는 D9 scFV 및 프로-Apo AI의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호는 분비 기작에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어졌다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 28(A))은 총 종자 추출물에서 테스트 한 5 클론 모두에서 약 59kDa의 분자량의 Apo-AI/GFP 융합 단백질을 검출했다.
Apo33
실시예 1에서 보여지듯이, Apo33 (SEQ ID NO:71)는 D9 scFV 및 Apo AI(+met)의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호는 분비 기작에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어졌다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 28(B))은 총 종자 추출물에서 테스트 한 8 클론 모두에서 약 59kDa의 분자량의 Apo-AI/GFP 융합 단백질을 검출했다.
Apo34
실시예 1에서 보여지듯이, Apo34 (SEQ ID NO:73)는 D9 scFV 및 pro-Apo AI(+met)의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호는 분비 기작에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어졌다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 29)은 총 종자 추출물에서 테스트 한 7 클론 중 6 에서 약 59kDa의 분자량의 D9 scFV-프로-Apo AI(+) 융합 단백질을 검출했다.
Apo36
실시예 1에서 보여지듯이, Apo36 (SEQ ID NO:78)는 D9 scFV 및 pro-Apo AI 의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호는 분비 기작에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어졌고 KDEL 보유 신호는 소포체에 폴리 펩타이드를 잡아두기 위해 사용되어졌다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 30)은 총 종자 추출물에서 테스트 한 13 클론 모두에서 약 60kDa의 분자량의 D9 scFV-프로-Apo- AI-KDEL 융합 단백질을 검출했다.
Apo37
실시예 1에서 보여지듯이, Apo37 (SEQ ID NO:80)는 D9 scFV 및 Apo AI(met) 의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호는 분비 기작에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어졌고 KDEL 보유 신호는 소포체에 폴리 펩타이드를 잡아두기 위해 사용되어졌다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 30(B))은 총 종자 추출물에서 테스트 한 15 클론 모두에서 약 59kDa의 분자량의 D9 scFV-Apo AI(+met)-KDEL 융합 단백질이 검출되었다.
Apo38
실시예 1에서 보여지듯이, Apo38 (SEQ ID NO:82)는 D9 scFV 및 Apo AI(met) 의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호는 분비 기작에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현 을 위해 사용되어졌고 KDEL 보유 신호는 소포체에 폴리 펩타이드를 잡아두기 위해 사용되어졌다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 31(A))은 총 종자 추출물에서 테스트 한 11 클론 중 9에서 약 60kDa의 분자량의 D9 scFV-프로-Apo AI(+met)-KDEL 융합 단백질이 검출되었다.
Apo39
실시예 1에서 보여지듯이, Apo39 (SEQ ID NO:83)는 D9 scFV, KLIP8 및 Apo AI의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호는 분비 기작에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어졌고 Klip8은 절단가능한 링커로 사용되었다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 31(B))은 총 종자 추출물에서 테스트 한 12 클론 모두에서 약 55 kDa의 분자량의 D9 scFV-klip8-Apo AI 융합 단백질이 검출되었다.
Apo40
실시예 1에서 보여지듯이, Apo40 (SEQ ID NO:87)는 D9 scFV 항체 및 두 조성을 분리하는 klip8 절단 서열을 가진 프로-Apo-AI 사이의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호는 분비 기작에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어졌다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 32(A))은 총 종자 추출물에서 테스트 한 13 클론 중12 클론에서 약 63 kDa의 분자량의 D9 scFV-klip8-프로-Apo AI 융합 단백질이 검출되었다.
Apo41
실시예 1에서 보여지듯이, Apo41 (SEQ ID NO:89)은 D9 scFV 항체 및 두 조성을 분리하는 klip8 절단 서열을 가진 Apo-AI(+met) 사이의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호는 분비 기작에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어졌다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 32(B))은 총 종자 추출물에서 테스트 한 9 클론 중 8 클론에서 약 63 kDa의 분자량의 D9 scFV-klip8-Apo AI(+met) 융합 단백질이 검출되었다.
Apo42
실시예 1에서 보여지듯이, Apo42 (SEQ ID NO:91)은 D9 scFV 항체 및 두 조성을 분리하는 klip8 절단 서열을 가진 프로-Apo-AI(+met) 사이의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호는 분비 기작에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어졌다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 33(A))은 총 종자 추출물에서 테스트 한 13클론 모두에서 약 64 kDa의 분자량의 D9 scFV-klip8-프로-Apo AI(+met) 융합 단백질이 검출되었다.
Apo44
실시예 1에서 보여지듯이, Apo44 (SEQ ID NO:95)는 D9 scFV 항체 및 프로-Apo-AI 사이의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호는 분비 기작에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어졌고 KDEL 보존 신호는 소포체에 폴리펩타이드를 남아 있게 하기위해 사용되었다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 34(A))은 총 종자 추출물에서 테스트 한 15 클론 중 4 에서 약 64 kDa의 분자량의 D9 scFV-klip8-프로-Apo AI(+met) 융합 단백질이 검출되었다.
Apo45
실시예 1에서 보여지듯이, Apo45 (SEQ ID NO:97) 는 D9 scFV 항체 및 프로-Apo-AI 사이의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호는 분비 기작에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어졌고 KDEL 보존 신호는 소포체에 폴리펩타이드를 남아있게 하기위해 사용되었다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 34(B))은 총 종자 추출물에서 테스트 한 12 클론 모두에서 약 64 kDa의 분자량의 D9 scFV-klip8-Apo AI(+met)-KDEL 융합 단백질이 검출되었다.
Apo46
실시예 1에서 보여지듯이, Apo46 (SEQ ID NO:99)는 D9 scFV 항체 및 Apo-AI (+met)사이의 융합 단백질이다. 파세올린 프로모터 및 종결자는 구조물의 종자-특이적인 발현을 위해 사용되었고 PRS 신호는 분비 기작에 대한 융합 단백질의 표적화된 발현을 위해 사용되어졌고 KDEL 보존 신호는 소포체에 폴리펩타이드를 남아있게 하기위해 사용되었다. 다클론항체 Apo AI를 이용한 웨스턴 블랏 분석(도 345(A))은 총 종자 추출물에서 테스트 한 11 클론 모두에서 약 64 kDa의 분자량의 D9 scFV-klip8-프로-Apo AI(+met)-KDEL 융합 단백질이 검출되었다.
실시예 4
아포지질단백질 위치화를 위한 웨스턴 블랏 분석.
오일 바디의 분리는 이미 기술된 다음의 변형 방법으로 수행하였다. 간단하게, 건조 성숙한 종자 250 mg은 70% 에탄올로 표면을 멸균하였고, 증류슈로 두 번 , 인산 완충용액으로 한번 세척하였다(0.5M NaCl 함유된 100 mM phosphate buffer, pH 8 ). 세척 후에 종자는 분석을 위하여 인산 완충용액으로 재현탁하였고 그리고 나서 멸균된 막자사발과 절구공이를 이용하여 갈았다. 갈고난 다음, 시료는 원심분리 병으로 옮기고 실온에서 10,000g로 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리한 다음, 오일 바디가 포함된 지방층은 수용액 층(AQ)에서부터 수거하여 1.5 mL 마이크로퓨즈 튜브에 옮겼다. 오일 바디는 낮은 강도(stringecy)의 인산완충용액(0.5M NaC를 함유한 pH 8의 100 mM phosphate buffer)에 재현탁하였다. 시료는 4에서 10,000g로 15분 동안 원심분리하여 언더네이턴트(undertatant)를 제거하였다. 언더네이턴트(undernatant (PW)) 및 인산-세척 오일 바디(PO)는 아포지질단백질의 존재하에서 테스트되었다. 오일 바디는 높은 강도(stringency)의 우레아 완충용액(8M Urea in 100 mM 나트륨 카보네이트 완충용액 pH 8)에 재현탁하였다. 시료는 4에서 10,000g로 15분 동안 원심분리하여 언더네이턴트(undertatant)를 제거하였다. 언더 네이턴트(UW) 및 우레아-세척 오이바디(UO)는 아포지질단백질의 존재하에서 테스트 되었다. 오일 바디가 낮거나 높은 스트린젠시로 세척되는 것은 오일 바디로 연관된 단백질을 제거하기 위해서 세척하는 것임을 유의하라. 올레오신은 높은 스트린젠시 세척에 저항적이고 오일 바디 프랙션 내에 남는다. 마이크로소말 프랙션(ER)은 막자사발과 절구공이 내에 4 mL의 마이크로솜 글렌딩(grinding) 완충 용액(0.5M Sucrose, 0.2M Hepes-NaOH 완충용액, pH 7.4)에 약 건조 종자 250mg을 갈아서 얻었다. 그 슬러리는 4에서 30분 동안 10,000으로 원심분리하였다. 상등액은 그리고 나서 스윙 버켓 로터의 울트라 원심분리기에서 4℃에서 10,000g로 30분 동안 원심분리하였다. 펠렛은 마이크로솜 그렌딩 완충용액으로 세척하고 10,000g에서 빠르게 원심분리한 다음 마이크로솜 글렌딩 완충용액 10 내지 15uL에 재현탁해서 -20℃에 보관했다.
비표적화된 구조물
도 36A에서 보여지듯이, 추가적인 표적화 신호없이, 프로-(Apoll) 및 성숙한 (ApolO) Apo AI-GFP 융합은 다른 프랙션에서 조사되었다. ApolO는 성숙한 Apo AI-GFP 융합 단백질이 모든 세포성 프랙션에서 탐색되는 동안, 인산완충용액으로 세척및 우레아 세척 프랙션의 오일 바디로 많은 단백질이 축적됨이 보였다. 이는 ApolO 가 오일 바디에 대한 조금의 친화성을 가지는 동안, 높은 스트린젠시의 세척이 오일 바디의 표면으로 부터 이것을 제거하기에 충분하다는 것을 주장한다. Apoll는, Apo-AI의 천연형 프로-서열의 존재는 프로-펩타이드가 잃어버렸을 때보다 오일 바디 프랙션에 더 많은 양에 대해 Apo AI- GFP 융합 단백질을 표적한다는 것을 보여주며, 심지어 높은 스트리젠시 세척이 사용되었을 때 단백질이 오일 바디에 결합함을 보여준다. 이것은 프로-Apo AI 펩타이드가 오일 바디의 표면에 pro-Apo AI를 잡아두기 위한 '앵커링(anchoring)' 서열로서 작용함을 보여준다. 생산물이 분해될 수 있어 다수의 낮은 분자량 밴드가 이 프랙션에서 검출되어 질 수 있다.
오일 바디를 표적화하는 구조물
오일 바디와 Apo AI- GFP 융합 단백질의 견고한 결합 패턴은 또한 오일 바디 표적화된 구조물에서 보여질 수 있다(도 36B). 프로-(Apol3) 및 성숙한 (Apol2) Apo AI- GFP 융합은 올레오신 C-말단에 인프레임에 융합되었고, 이는 오일 바디에 표적화 신호로서 작용한다. 비표적화된 프로-Apo AI-GFP 융합을 위해 이전에 보여주었듯이, 단백질은 우선적으로 인산 및 우레아-세척된 오일 바디 프랙션과 결합한다. 가능한 분해산물의 축적을 유도하는 오일 바디-결합 프랙션에 대한 어떤 독특한 것이 있다는 예시로서 다수의 낮은 분자량의 밴드는 또한 이 프랙션에서 검출된다.
분비 시스템을 표적화한 구조물
분비 시스템에 대한 단백질을 표적하는 PRS 신호 펩타이드(Sijmons 등의 1990, Bio/technology, 8:217-221)는 프로-(Apol6) 및 성숙한 (Apol5) 형태의 Apo AI-GFP에 대한 인프레임 번역 융합으로서 추가되어진다(도 37). 정상적으로, 이것은 식물세포의 세포 외부의 공간(아포플라스트)에 융합 단백질의 분비되는 결과이다. 그러나, 두가지 구조물의 세포 프랙션이 조사되었을 때, Apo AI-GFP 융합 단백질은 오일 바디 프랙션에서 조사될 수 있는 더 많은 단백질로 모든 프랙션에서 검출되었다. 재조합 융합 단백질의 밴드 크기는 또한 폰세우-에스(Ponceau-S)로 염색된 면역블랏이 시험될 때 오일 바디 프랙션에서 관찰되었다( 도 37, 상위 패널). 천연형 프로-서열의 Apo AI의 존재는 특이한 세포성 프랙션과 분비된 융합 단백질의 결합을 변화시키기 위해서 나타나지 않는다. 식물의 인식 신호 펩타이드 프리서열(presequence recognition signal (PRS) peptide)은 pro-Apo AI 펩타이드의 '앵커링(anchoring)' 특성을 방해하기 위하여 나타난다.
잎에서 Apo AI - GFP 의 구성성분 발현
비표적화된 및 분비된 프로- 및 성숙한형의 Apo AI-GFP를 구성요소로 발현하는 잎 조직은 Apo AI-GFP 유합단백질이 오일을 생산하지 않는 조직에서 축적할 있는지를 결정하기 위해 조사되었다. 잎 조직은(실시예 2에서 서술되었듯이) 비표적화된 프로- (Apol8)와 성숙한(Apol7) 및 분비된 프로- (Apo20)와 성숙한 (Apol9) 형태의 Apo AI-GFP 및 면역블랏에 사용된 구성요소로 발현되는 트랜스제닉 식물 주로부터 호모게나이즈 되었다. 잎 물질은 또한 음성 대조구로서 야생형 식물(c24)로 부터 및 잎 발현을 위한양성 대조구로 UR2(유비퀴틴-유래의 올레오신-GFP) 식물 및 UG-14(유비퀴틴 유래의 GFP) 식물로부터 시료화 하였다. 동량의 단백질은 SDS-PAGE로 분리하였고 Apo AI-GFP 융합 단백질은 항-GFP 항체(도 38 하위 패널)와 면역블랏으로 검출하였다.
희미한 밴드는 비-형질전환된 주에서 검출되었으며, 반면에 유비퀴틴-우래의 GEP(UG-14) 및 올레오신-GFP (UR2)융합은 쉽게 항-GFP 항체와 면역 블랏으로 검출 하였다. 그러나, 동량의 잎 단백질이 면역 블랏에 로딩된 막의 폰세우-에스(Ponceau-S) 염색(도 38의 상위 패널)에 의해 보여질 수 있으며, 어떤 밴드도 어떤 Apo AI-GFP 융합 단백질 구조물을 위한 검출로 사용될 수 없다. 면역 블랏의 배경에서 검출된 희미한 밴드는 잎조직에서 발견되는 대부분 우세한 단백질인 루비스코(Rubisco)(Spreitzer RJ 및 Salvucci ME (2002) 루비스코(Rubisco): 구조, 조 조절작용 및 좋은 효소로서 가능성. Annu Rev Plant Biol 53: 449-475.)와 상호 반응성에 기인한 것 일 수 있으며, 이 루비스코는 면역블랏의 폰세우-에스 염색된 패널에서 분자량 마커에 따르는 크기(55 kDa)를 확인할 수 있다.
종자에서 비표적화되 및 분비된 Apo AI 의 종자 특이적인 발현
하나의 트랜스제닉 주는 총 종자 추출물에서 프로- 또는 성숙한 Apo AI 단백질 모두의 일부 축적을 보여주는 Apo AI 트랜스제닉 식물의 T2 세대의 각각으로 부터 선택되어진다. 추정되는 트랜스제닉인 식물의 주의, 다음의 오직 하나의 주만 어떤 단백질 발현을 보여준다:Apo21 (비표적화된 성숙한 Apo AI), Apo22 (비표적화된 프로-Apo AI), 및 Apo29 ( 분비된 성숙한 Apo AI); 두 주는 Apo30 (분비된 프로-Apo AI)에 대해 발견되었다. Apo23 및 Apo24 구조물이 포함된 모든 트랜스제닉 식물주는 올레오신-Apo-AI 융합 단백질을 발현하고 축적하기 위하여 나타났다. 동량의 단백질은 SDS- PAGE로 분리하고 Apo AI 단백질은 항-Apo AI 항체 (도 39)로 면역 블랏하여 검출할 수 있다. 대조군는 형질전환되지 않은 식물(c24)의 유사한 단백질을 제조하여 면역블랏하는 것을 포함시켰다. Apo AI이 단독으로 발현된 밴드의 정확한 크기(28.3 kDa의 분자량으로 예상되는 성숙한 Apo AI 및 29.3 kDa로 예상되는 프로-Apo AI)는 Apo22-3 (비표적화된 프로-Apo AI)주에서만 관찰되었다. Apo21-11(비표적화된 성숙한-Apo AI)에서 검출되는 유력한 밴드는 정확하지 않은 크기이고, 오직 마이너 밴드가 Apo29-11 (분비된 성숙한 Apo AI) 및 Apo30-14 (분비된 프로-Apo AI)에서 검출되는 동안 어떤 것도 정확한 크기가 없다. 그러나, Apo23-11 (올레오신 성숙한-Apo AI) 및 Apo24-6 (올레오신 프로-Apo AI)의 올레오 신 모든 융합을 위하여, a significant amount of Apo AI 융합 단백질의 유의할 만한 양이 항- Apo AI 항체에 의해 검출되어지고 폰세우-에스로 염색된 면역블랏(상위 패널)에서 또한 검출될 수 있다.
비표적화된 Apo AI ( Apo22 ) T3 종자의 세포성 위치화( localization )
비표적화된 Apo AI 단백질(Apo22)의 프로-형의 종자 특이적인 발현 및 그의 특이적인 세포 프랙션의 결합은 성숙한 종자에서 조사되었다(도 40). 종자는 위에 설명되어진 대로 호모게나이즈 elh고 처리되었고, 세포성 프랙션은 Apo AI에 대해 항체로 면역블랏하였다. Apo22-3은, 천연형 Apo-AI의 프로-서열의 존재가 오일 바디 프랙션에 Apo AI 단백질을 표적하는 것 및 단백질이 오일 바디로 부터 단백질을 제거하기 위하여 높은 스트린젠시의 세척을 요구하는 것을 보여준다. 일부 단백질은 또한 반드시 프로-Apo AI가 오일 바디로 결합되는 것만은 아닌 것을 보여주는 수용층에서 검출된다.
실시예 5
아포지질단백질의 위치화를 위한 공초점 현미경
미성숙한 배는 페트리 디쉬에서 포셉 및 해부용 현미경을 사용하여 멸균수로 Apo AI-GFP 실리크(siliques)를 해부했다 배는 유리로된 현미경 슬라이드 커버로 미성숙한 종자를 부드럽게 눌러 종자 껍질을 제거하였다. 배는 1.5mL 마이크로 큐브에서 최종 부피 1mL로 되게 수분을 가하여 파이펫으로 옮겼다. 나일 레드(Nile Red (Molecular Probes))는 최종 1 ㎍/㎕ 의 농도를 사용하였다. 희석된 나일레드의 배는 상온에서 15분 동안 암실레 두어 반응시켰다. 배는 멸균수로 3번 세척하였 고 현미경을 위한 유리 슬라이드위레 물로 마운트하였다. 잎 상피세포는 외과용 메스로 작은 조각(0.5 cm2)으로 간단하게 잘르고 현미경 슬라이드 위의 물 위에 커버슬립으로 마운팅하여 제조하였다. 잎 섹션은 아래 상피가 위쪽 면에 되게 두었다(오토-형광 클로로플라스트로 보다 적게 간섭).
모든 GFP-의존적 형광성은 아라비돕시스 배로부터 분석되었고 잎의 상피세포 는 현미경 관찰을 위하여 물로 마운팅 하고 제이스(Zeiss) LSM 510 리이저 스캐닝공초점 현미경(Edmonton, AB)로 조사하였다. GFP와 나일 레드(Nile Red)를 동시에 조사하기위하여 AOTF-조절의 488 nm로 여기 및 543 nm의 발산으로 라인-순서상의 단일 트래킹 모드는 각각 20% 및 100%로 세팅하였다. 플랜(Plan)- 아포크로맷(Appochromat) 63x/1.4 Oil DIC 대물대는 5X 스캔 줌으로 사용하였다. 핀홀(pinhole)은 94㎛의 채널 2(초록색) 및 106㎛의 채널 1(붉은색)에 맞추었다.
마이크로 그래프의 결과는 도 42 내지 45에서 보여질 수 있다. Colocalization (indicated in yellow) between 비표적화된 프로-Apo AI- GFP ㅇ유융합(Apoll) 및 나일레드(Nile red) 염색된 오일 바디의 코-로칼리제이션(함께 위치)는 도 41(D-F)에서 뚜렷이 드러난다. Apol2 즉, 올레오신을 이용하여 GFP 표적화된 오일 바디에 융합된 성숙한 Apo AI(도 41의 G-I) 및 Apol3 즉, 올레오신을 이용하여 GFP 표적화된 오일 바디에 융합된 pro-Apo AI 사이의 코-로칼리제이션(노란색 을 표시된) 또한 있다. 비표적화된 프로-Apo AI-GFP 융합 (Apol8) 및 나일 레드 염색된 오일 바디 사이의 코-로칼리제이션(노란색으로 표시된)은 뚜렷이 나타난 다(도 43의 D-F). Apo AI-GFP 융합 단백질 (Apol9) 및 오일 바디 사이의 코-로칼리제이션은 관찰되지 않는다.(도 43의 G-H). 도 44에서, 잎에서는 코-로칼리제이션이 나타나지 않는다. 결론적으로, 오일 바디 표적(즉 올레오신)의 부재에서, Apo AI의 로칼리제이션은 배에서만(중성 지방의 존재에서) 및 Apo AI의 프로-펩타이드가 세포질에 발현될 때(즉, 분비될 때가 아닌) 만 관찰된다.
실시예 6
Apo 25, 26 및 28를 발현하는 아라비돕시스 종자의 절단 및 HPLC 분석
Apo25 , Apo26 및 Apo28 재조합 단백질의 절단
오일 바디의 분리는 이미 기술된(van Rooijen & Moloney, 1995) 다음을 따르는 변형방법으로 수행하였다. 간단하게, 건조 성숙한 종자 250 mg은 70% 에탄올로 표면을 멸균하였고, 증류슈로 두 번 , 인산 완충용액으로 한번 세척하였다(0.5M NaCl 함유된 100 mM phosphate buffer, pH 8). 세척 후에 종자는 분석을 위하여 인산 완충용액으로 재현탁하였고 그리고 나서 멸균된 막자사발과 절구공이를 이용하여 갈았다. 갈고난 다음, 시료는 원심분리 병으로 옮기고 실온에서 10,000g로 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후에, 오일 바디가 포함된 지방층은 1.5 mL 마이크로퓨즈 튜브에 옮기고 우레아 완충용액(100mM 나트륨-카보네이트 완충용액 내의 8M 우레아, pH 8)으로 재현탁하였다. 시료는 4℃에서 10,000g로 15분 동안 원심분리하여 언더네이턴트(undertatant)를 제거하였다. 지방층은 멸균 증류수로 현탁하고 4℃에서 10,000g로 15분 동안 원심분리하여 언더네이턴트(undertatant)를 제거하였다. 오일 바디는 50㎕의 멸균 증류수에 재현탁하고 4℃ 암실에 보관하였다. 절단 반응은 100mM 인산완충 용액 pH4.5가 포함된 20㎕의 반응용액에서, 오일 바디 단백질에 대한 단백질 분해효소가 최종 1:100의 비율로, 37℃에서 2시간 동안 수행하였다. 시료반응은 다음을 따를 수 있다: 20㎍의 정제된 Apo25, Apo26 또는 Apo28는 2 ㎕의 1M 인산염 완충용액, pH 4.5 (final concentration 100mM), 멸균증류수에 녹여진 2 ㎕의 카이모신( chymosin)으로 최종 20㎕으로 맞추어 혼합하였다. 2시간 후에, 절단 반응은 15분 동안 원심분리하였고, 언더네턴트(undernatent)는 지방층으로부터 제거되고 각 층은 재조합 단백질로 분석되었다.
역상 크로마토그라피에 의한 Apo25 , Apo26 및 Apo28 의 정제
약, 1000 ㎍의 Apo25, Apo26 또한 Apo28는 37℃에서 2시간 동안 카이모신으로 반응시켰다. 절단 반응이 완벽하게 된 후에, 반응은 4℃, 10,000 g에서 15분 동안 원심분리시키고 언더네턴트는 회수하였다(undernatent) 지방층(fat pad)은 우레아 완충용액(100mM 나트륨-카보네이트 완충용액 내의 8M 우레아, pH 8)으로 재현탁하고 15분 동안 원심분리시켰다. 언더네턴트 및 세척은 회수되었고, 세척은 추가적으로 세 번 반복하고, 언더네턴트는 각 시간에 회수하였고 15ml 팔콘 튜브에 두었다. 우레아 세척을 확실히 한 후에, 세척물은 1.5ml의 마이크로 튜브에 나누어 분주하였고 오일 바디 잔기를 포함하는 어떤 오염물을 제거하기 위하여 15분 동안 원심분리하였다. 언더네이턴트(undernatents)는 회수되고 0.2 마이크론 필터를 이용하여 새로운 15ml 팔콘 튜브로 필터하였다. VYDAC 214TP54 C4 실리카 5 마이크론(Grace Vydac, Anaheim, CA) 역상 크로마토 그라피 컬럼 (0. 24 X 25 cm)은 완충용액 A (10% 아세토 니트릴(acetonitrile) 및 0.1% 트리플로로아세트산)으로 2 mL/min의 속도로 평형화 시켰다. 모아진 카이모신으로-절단된 Apo25, Apo26 또는 Apo28 우레아 언더네이턴트는 컬럼에 로딩하였다. 직선 농도 기울기는 Apo AI의 용출을 위하여 컬럼에서 0 내지 60%의 완충용액 B(95% 아세토니트릴(acetonitrile), 0.1% 트리플로로 아세트산)를 적용시켰다. Apo AI (US Biological, 카달로그 번호 A2299-10)는 Apo25, Apo26 및 Apo28의 절단 생산물과 비교하기 위한 기준으로 사용하였다. 프랙션 19.6' 내지 20.8' (0.2' = 0.4 mL 각각)가 모아졌다. 214, 254, 280 & 326 nm의 관련된 세기를 비교하는 것은 대부분 Apo AI 폴리펩타이드로 표시되는 19.5-21.0'존의 물질의 용출을 지시한다(도 45). 이 피크들은 또한 같은 시료에서 0.020ml의 확실한 주입에 비교되는 강도에서 ㄸ또한 증가했다. Apo 25(oleosin- klip8-Apo AI(met+))로부터 절단 생산물을 정제하기 위하여, 카이모신 처리된 프랙션은 각각 7 내지 25'로 부터 1ml씩 모았다. 주요 폴리펩타이드 피크는 20.5'에 있고(도 45B), 이는 예상되는 인간 hApo AI 기준보다 0.2' 뒤이다. Apo26 (oleosin-klip8-pro-Apo AI(met+))의 절단 산물을 정제하기 위하여, 프랙션은 각각 1ml에 7 내지 25'까지 모았다. 주요 폴리펩타이드 피크는 18'에 있고(도 45B), 이는 예상되는 인간 hApo AI 기준보다 2.4' 앞이다(도 45 C). Apo28 (oleosin-klip8-pro- Apo AI)의 절단 산물을 정제하기 위하여, 프랙션은 각각 1ml에 7 내지 25'까지 모았다. 주요 폴리펩타이드 피크는 18'에 있고(도 45B), 이는 예상되는 인간 hApo AI 기준보다 2.4' 앞이고(도 45 C) Apo 26의 진행과 유사하다.
질량 분석기
질량 스펙트라는 Applied Biosystems Voyager-DE STR 기질 어시스티드 레이저 흡수 이온화 시간의 (MALDI-TOF) 질량 분석계 (Applied Biosystems, Foster City, CA)의 Doug Olson (National Research Council of Canada, Plant Biotechnology Institute BioAnalytical Spectroscopy Group, Saskatoon, SK)로 수행하였다. 시료는 OPI-TOF LC MALDI 주입부에(Applied Biosystems, Foster City, CA) 시나픽산이 포화된 30% 아세토니트릴/70% 물/0.1% TEA 기질을 이용하여 점 찍었다. 이온은 +20 kV에서 가속화되고 질량은 외부 조절자로 사용한 말 심장 미오글로빈을 사용하여 직선 모드로 검출하였다. 정제된 재조합 성숙한 Apo25 단백질의 일랙트로스프레이(Electrospray) 이온화 질량분석기는 28,325 Da의 분자질량을 주었는데, 이는 계산된 분자량 28,319 Da보다 6Da 만큼 크다. 예상되는 값으로부터 관찰된 값이 다른 것은 감소하는 노이즈 비율 및 감소하는 정확성을 인도하는 제한된 시료의 경우에 기인할 수 있다. 성숙한 Apo AI의 예상 값은 28,187 Da이나, 추가적인 메티오닌 잔기의 존재에 기인하며, 절단된 재조합 성숙한 Apo AI 단백질은 증가된 분자량을 가진다. 정제된 표준 hApo AI 단백질은 또한 질량분석기로 분석되었고, 25,969 Da 및 22,815 Da의 enor의 다른 피크를 얻었다. 이 관찰된 두 값 모두 28,187 Da인 예상 값보다 상당히 낮았다; 그러나 이 두 주된 낮은 분자량은 이미 면역 블랏에서 관찰되었다. 이 분자량에서의 감소는 RP-HPLC에서 보여지듯이 사람 및 재조합 단백질의 경미하게 다른 용출 양상의 결과인 것 같다.
실시예 7
사플라워의 형질전환
이 형질전환의 프로토콜은 오르릴콕스카 T.K 등((1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 40: 85-91)에 의한 아웃트라인과 유사하나, S-317를 형질전환하느 것 및 선택 마커로 포스피노트리신을 사용하는 것의 변형 및 진보를 가진다. S-317 캘리포니아 사플라워로부터 오염되지 않은 종자, 손상, 상처 또는 질병이 없는 것을 0.1% 염산에 12분 동안 처리하고, 멸균수로 4 내지 5번 헹구었다. 암실에서 1% 자당 및 0.25% 젤라이트를 포함하는 MS 배지(Murashige T. & Skoog F (1962) Physiol. Plant. 15: 473-497) 에서 발아하는 멸균 종자를 발아시켜라. 얼려진 글라이세롤 스탁으로부터 선택적 항생제가 든 5ml의 AB 최소 배지에 아그로박테리움의 배양을 시작하고 28 에서 48시간 동안 키워라. 형질전환을 위한 5ml의 선택 LB 배지에서 밤새 배양액을 키워라. 6 내지 8 ml의 AB 배지로 박테리아 세포를 두 번 세척하라 그리고 최종 0.4 내지 0.5의 밀도(OD600)로 만들어라.
발아한 묘목으로부터 2 일된 떡잎을 제거하라, 제조된 아그로박테리움 세포에 담구고 3% 자당, 4 μM의 N6-benzyladenine (BA) 및 0.8μM의 나프탈렌 아세트산(naphthaleneacetic acid (NAA))이 포함된 MS 배지에 플레이트 하라. 암실하의 21에서 플레이트를 배양하라. 3일 후에, 300 mg/L 티멘틴(timentin)이 포함된 같은 배지에 옮겨라. 추가적인 4일 후에, 모든 배양은 빛이 있는 곳으로 옮겨라. 3일 후에, 0.5mg/L의 포스피노트리신이 첨가된 선택배지에 키워라. 계속적으로 싹이 자라게 하기 위하여, 파이토호르몬이 없으나 KNOB 두 배량의 MS 배지에 매주 배양을 옮겨라. Excise shoots that had elongated to greater than 10 mm from the 초기 배양으로 부터 10mm보다 크게 자라게 하고 각각을 선택배지에 키워라. 뿌리 를 내리고, 푸른 잎이 자라게 하고, 예상되는 트랜스제닉 조직으로 표현되게 하기 위하여 2% 자당, 10uM 인돌뷰티릭산 (indolebutyric acid) 및 0.5 1M NAA이 포함된 MS 배지에서 키워라. 뿌리내린 슈트(shoots)는 배수가 잘되는 토양이 적은 혼합토양에 옮기고 높은 습도와 12시간 빛이 있는 사에서 키워라
실시예 8
플랙스 ( Flax ) 형질전화 프로토콜
이 형질전환 과정은 Dong J. 및 McHughen A. (Plant Cell Reports (1991) 10:555-560), Dong J. 및 McHughen A. (Plant Sciences (1993) 88:61- 71) 및 Mlynarova 등(Plant Cell Reports (1994) 13: 282-285)에 의해 아웃트라인 된 것과 유사하다. 플랙스 종자는, 손상, 깨짐, 또는 질병 없는 것을 70% 에탄올 용액에 5 내지 7분 동안, 다음으로 Tween 20이 포함된(100ml 당 3 내지 4 방울) 계속 스터링한 50% 표백제용액으로 25분 동안 소독하라. 멸균 증류수로 5 내지 7 회 종자를 헹구어라. 소독된 종자를 마젠타 발효기에 2% 자당 및 0.3% 젤라이트(Gelrite)가 포함된 MS 배지(Murashige T. 및 Skoog F (1962) Physiol. Plant. 15: 473-497)에서 빛을 주어 발아시켜라. 형질전환을 위해서, AB 브로스(broth)에 선별을 위한 적당한 항생제를 첨가하여 아그로박테이룸 배양을 하라. 밤새 키운 세포의 6 내지 8ml를 두번 세척하고, 5ml의 AB 브로스로 현탁하라; 98ml의 유도배지(3% 자당, 5uM 6-벤질아민퓨린(BA) 및 0.25uM 알파-나프탈렌 아세트산(NAA)이 포함된 MS 배지)에 세포 현탁액 2ml을 첨가하고 최종 OD600에서 1.0으로 맞추어라.
배축 체외 배양을 절개하고 제조된 아그로박테리움 세포 용액을 약 4시간 동 안 접종하라(이 시기 동안 1 내지 2회 부드럽게 플레이트를 혼합하라. 감염시기 후에, 수용액 접종 배지로부터 체외배양을 제거하고 멸균 필터 종이에 블랏하라. 15 내지 20 체외 배양 이식체는 조직 배양 플레이트의 0.7% 아가-고체화 유도 배지에 플레이트 하라. 플라스틱 랩으로 봉하고, 48시간 동안 빛이 있는 조건에서 외식편을 공동 배양하라. 2일 후에, 녹색의 분열조직 배양체를 300 mg/L 티멘틴(Timentin)(프리-선별 배지)이 포함된 같은 배양액에 옮기고, 플라스틱 랩으로 싸라. 3일 후에, 10 mg/L DL PPT (선별 1)이 포함된 상기 배양액으로 배양체를 옮겨라. 파라필름으로 플레이트를 싸고 빛이 있는 조건에서 24℃에서 배양하라. 배양체는 매 2주마다 옮기고 한달 동안 이 배지는 보관하라. 슈트(shoot) 생장을 위하여, 마젠타 발효기의 선별배지 II(2% 자당, 500mg/L MES 완충용액, 300mg/L 티멘틴 및 10mg/L DL PPT)에 매 2주 마다 배양체를 옮겨라. 선별에서 살아남은, 형질전환체로 예상되는 슈트는 진한 녹색이고 선별 II 배지에서 개별적으로 키웠을 때 7 내지 10일에 활발한 뿌리를 형성한다. 작은 화분에 멸균된 온실용 혼합토양에 뿌리내린 슈트를 옮겨라 그리고 풍토순화를 위해서 께끗한 플라스틱 컵으로 묘목을 덮어라. 성숙한을 위해서, 활발하게 자라는 식물체를 배수가 잘 되는 혼합토양을 넣은 1 갈론 화분에 옮겨라. 그리고 온실조건에서 키워라.
본 발명이 바람직한 실시예로 현재 고려외어야할 어떤 참고로서 기술되어질 동안, 발명은 개발된 실시예에 제한되지 않음을 이해한다. 반대로, 발명은 정신 및 첨가된 청구항 내에 포함되는 다양한 변형과 적절한 배열이 커버될 수 있다.
모든 출판, 특허, 실용 모두 본 발명에서 각 개인적인 출판으로 같은 것이 존재하는 것에 대한 전부 참조에 의해 병합되며, 특허 실용신안은 특수하고 개별적으로 전부 참조로서 병합되어짐을 말한다.
서열 요약
SEQ ID NO:1 및 2 는 사람 프로-Apo AI 단백질의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:3 및 4 는 사람 Apo AI Milano 단백질의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:5 및 6 은 사람 Apo AI Paris 단백질의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:1, 7 및 8 은 표 1에서 기술한 사람 아포지질단백질 서열로 잘 알려져 있다.
SEQ ID NO:9-24 는 표 1에서 기술한 사람 아포지질단백질 A-I 서열로 잘 알려져 있다.
SEQ ID NO:25-34 는 표 1에서 기술한 사람 아포지질단백질 A-IV 서열로 잘 알려져 있다.
SEQ ID NO:35-55 는 표 1에서 기술한 사람 아포지질단백질 E 서열로 잘 알려져 있다.
SEQ ID NO:56 는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 티오레독신(thioredoxin)의 핵산 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:57 는 수용성 녹색 형광 단백질의 핵산 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:58 PRS 신호 서열의 아미노산 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:59-116 는 표 3에서 기술한 올레오신 오일 바디 단백질로 잘 알려져 있다.
SEQ ID NO:117-129 는 표 3에서 기술한 칼레오신 오일 바디 단백질로 잘 알려져 있다.
SEQ ID NO:130-137 은 표 3에서 기술한 스테로레오신 오일 바디 단백질로 잘 알려져 있다.
SEQ ID NO:138 는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 올레오신으로 알려진 오일 바디의 단백질 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:139 는 브라시카 나푸스 (Brassica napus) 올레오신으로 잘 알려진 오일 바디 단백질 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:140 은 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis tizaliana) 칼레오신(caleosin)으로 알려진 오일 바디 단백질 핵산 서열의 앞쪽에 있다.
SEQ ID NO:141 은 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis tizaliana) 칼레오신(caleosin)으로 알려진 오일 바디 단백질 핵산 서열의 앞쪽에 있다.
SEQ ID NO:142 는 스테레올레오신로 알려진 오일 바디 단백질 핵산 서열의 앞쪽에 있다.
SEQ ID NO:143 은 klip8 절단서열을 위한 뉴클레오타이드 서열의 앞쪽에 있다.
SEQ ID NO:144 및 145 는 Apo 10 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:146 은 GFP의 5' 부위에 상보적이고 NcoI 자리를 제거하기 위해 고안된 정방향 프라이머 1186의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:147 은 GFP의 3' 부위에 상보적이고 종결코돈 뒤에 PstI, XbaI 및 HindIII 자리를 추가하기 위해 고안된 역방향 프라이머 1187의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:148 은 성숙한 Apo AI의 5' 부위에 상보적이고 유전자의 시작자리에 NcoI 자리를 추가하기 위해 고안된 정방향 프라이머 1190의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:149 는 성숙한 Apo AI의 5' 부위에 상보적이고 유전자의 종결자리를 제거하고 GFP와 인프레임 번역 융합을 형성하는데 도와주기 위한 BamHIdmf 추가하기 위해 고안된 역방향 프라이머 1189의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:150 및 151 은 Apo 11 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:152 는 프로-Apo AI의 5' 부위에 상보적이고 유전자의 시작자리에 NcoI 자리를 추가하기 위해 고안된 정방향 프라이머 1191의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:153 및 154 는 Apo 12 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:155 및 l56 는 Apo 13 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:157 및 158 는 Apo 15 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:159 및 160 는 Apo 16 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:161 및 162 는 Apo 17 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:163 및 164 는 Apo 18 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:165 및 166 는 Apo 19 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:167 는 PRS/Apo AI의 5' 부위에 상보적이고 유전자의 시작자리에 BspHI 자리가 포함된 식물 프리-서열(plant presequence (PRS))의 시작점을 증폭하기 위해 고안된 정방향 프라이머 1177의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:168 은 Apo AI의 3' 부위에 상보적이고 유전자의 종결코돈을 제거하고 GFP와 인프레임 융합을 형성을 도와주기 위한 BamHI의 추가를 위해 고안된 역방향 프라이머 1178의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:169 및 170 는 Apo 20 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:171 및 172 는 Apo 21 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:173 은 Apo AI의 5' 부위에 상보적이고 성숙한 Apo AI유전자의 시작에 NcoI 자리를 추가하기 위하여 고안된 정방향 프라이머 1203의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:174 는 Apo AI의 3' 부위에 상보적이고 성숙한 Apo AI유전자의 종겨코돈에 NcoI 자리를 추가하기 위하여 고안된 역방향 프라이머 1206의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:175 및 176 는 Apo 22 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:177 은 프로 AI의 5' 부위에 상보적이고 프로 Apo AI 유전자의 시작에 NcoI 자리를 추가하기 위하여 고안된 정방향 프라이머 1201의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:178 및 179 는 Apo 23 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:180 및 181 은 Apo 24 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:182 및 183 은 Apo 25 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:184 및 185 은 Apo 26 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:186 및 187 은 Apo 27 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:188 은 프로 AI의 5' 부위에 상보적이고 프로 Apo AI 유전자의 시작에 XhoI 자리 및 klip8 절단서열 안에 인프레임 클로닝을 촉진하기 위한 여유 뉴클레오타이드를 추가하기 위하여 고안된 정방향 프라이머 1200의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:189 및 190 은 Apo 27M 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:l91 은 사람 Apo AI의 5' 부위에 상보적이고 사람 Apo AI 서열을 증폭하기 위한, mat-Apo AI의 시작에 klip8 절단서열 내에 인프레임 클로닝을 촉진하기 위하여 XhoI 자리 및 여유의 뉴클레오타이드를 추가하기 위하여 고안된 정방향 프라이머 1202의 뉴클레오타이드를 제시한다.
SEQ ID NO:192 은 Apo-Milano 돌연변이를 생성하기 위하여 C를 T로 염기 쌍 돌연변이 시켜 아르기닌이 시스테인 잔기로 변화된 블런트 말단 프라이머인 정방향 프라이머 1225의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:193 및 194 은 Apo 28 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:195 은 프로 AII의 5' 부위에 상보적이고 첫번째 XhoI 자리를 제거하기 위한 침묵 돌연변이를 추가한 블런트 말단의 프라이머를 만들기 위해 고안 된 정방향 프라이머 1205의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:196 및 197 은 Apo 29 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:198 및 199 는 Apo 30 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:200 및 201 은 Apo 31 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:202 및 203 은 Apo 32 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:204 및 205 는 Apo 33 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:206 및 207 은 Apo 34 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:208 및 209 는 Apo 31 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:210 은 프로 APO AI의 3' 부위에 상보적이고 종결코돈 앞에 KDEL 서열 및 종결코돈 뒤에 HindIII 자리를 추가하기 위해 고안된 역방향 프라이머 1208의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:211 및 212 는 Apo 36 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:213 및 214 는 Apo 37 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:215 및 216 은 Apo 38 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:217 및 218 은 Apo 39 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:219 는 klip8 절단 서열의 5' 부위에 상보적이고 klip8 절단 서열을 시작을 증폭시키기 위해 및 시작코돈에 SalI 자리를 추가시키기 위해 고안된 정방향 프라이머 1207의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다. s
SEQ ID NO:220 및 221 은 Apo 40 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:222 및 223 은 Apo 41 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:224 및 225 는 Apo 42 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:226 및 227 은 Apo 43 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:228 및 229 는 Apo 44 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:230 및 231 은 Apo 45 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:232 및 233 은 Apo 46 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:234 및 235 는 Apo 47 클론의 뉴클레오타이드 및 관련 아미노산 서열을 각각 제시한다.
SEQ ID NO:236 은 옥수수 올레오신 서열의 5'부위에 상보적이며 시작코돈에 옥수수 올레오신 서열을 증폭시키고 NcoI 자리를 추가하기 위해 고안된 정방향 프라이머 1226의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:237 은 옥수수 올레오신 서열의 3'부위에 상보적이며 klip8/mat-Apo AI 와 인프레임 번역 융합을 생성에서 옥수수 올레오신 서열을 증폭시키고, 유전자의 종결코돈을 제거시키고, HindIII 자리를 추가하기 위해 고안된 역방향 프라이머 1227의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:238 은 Apo25의 5'부위에 상보적이며 Apo25 서열을 증폭시키고 시작코돈에 SalI 자리를 추가시키기 위해 고안된 정방향 프라이머 1228의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:239 는 Apo25의 3'부위에 상보적이며 Apo25 서열을 증폭시키고 시작코돈에 BamHI 자리를 추가시키기 위해 고안된 역방향 프라이머 1229의 뉴클레오타이드 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:240 은 단일사슬 항체 D9 scFV의 아미노산 서열을 제시한다.
SEQ ID NO:241 내지 251 은 표 1에서 기술한 아포지질단백질 AV 서열로 잘 알려져 있다.
표 1: 아포지질단백질 서열로 알려진 예
Figure 112006041740365-PCT00001
Figure 112006041740365-PCT00002
표 2: 아포지질단백질 돌연변이 및 변형으로 알려진 예
Figure 112006041740365-PCT00003
Figure 112006041740365-PCT00004
Figure 112006041740365-PCT00005
표 3: 오일 바디 단백질로 알려진 예
Figure 112006041740365-PCT00006
Figure 112006041740365-PCT00007
Figure 112006041740365-PCT00008
<110> SEMBIOSYS GENETICS INC. Reid, Alexandra SEMBIOSYS GENETICS INC <120> METHODS FOR THE PRODUCTION OF APOLIPOPROTEINS IN TRANSGENIC PLANTS <130> IPA9604-271 <150> US60519606 <151> 2003-11-14 <150> US60579733 <151> 2004-06-16 <160> 251 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 804 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgaaagctg cggtgctgac cttggccgtg ctcttcctga cggggagcca ggctcggcat 60 ttctggcagc aagatgaacc cccccagagc ccctgggatc gagtgaagga cctggccact 120 gtgtacgtgg atgtgctcaa agacagcggc agagactatg tgtcccagtt tgaaggctcc 180 gccttgggaa aacagctaaa cctaaagctc cttgacaact gggacagcgt gacctccacc 240 ttcagcaagc tgcgcgaaca gctcggccct gtgacccagg agttctggga taacctggaa 300 aaggagacag agggcctgag gcaggagatg agcaaggatc tggaggaggt gaaggccaag 360 gtgcagccct acctggacga cttccagaag aagtggcagg aggagatgga gctctaccgc 420 cagaaggtgg agccgctgcg cgcagagctc caagagggcg cgcgccagaa gctgcacgag 480 ctgcaagaga agctgagccc actgggcgag gagatgcgcg accgcgcgcg cgcccatgtg 540 gacgcgctgc gcacgcatct ggccccctac agcgacgagc tgcgccagcg cttggccgcg 600 cgccttgagg ctctcaagga gaacggcggc gccagactgg ccgagtacca cgccaaggcc 660 accgagcatc tgagcacgct cagcgagaag gccaagcccg cgctcgagga cctccgccaa 720 ggcctgctgc ccgtgctgga gagcttcaag gtcagcttcc tgagcgctct cgaggagtac 780 actaagaagc tcaacaccca gtga 804 <210> 2 <211> 267 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp 20 25 30 Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp 35 40 45 Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys 50 55 60 Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr 65 70 75 80 Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp 85 90 95 Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys 100 105 110 Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe 115 120 125 Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu 130 135 140 Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu 145 150 155 160 Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala 165 170 175 Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp 180 185 190 Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn 195 200 205 Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu 210 215 220 Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln 225 230 235 240 Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala 245 250 255 Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln 260 265 <210> 3 <211> 731 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gatgaacccc cccagagccc ctgggatcga gtgaaggacc tggccactgt gtacgtggat 60 gtgctcaaag acagcggcag agactatgtg tcccagtttg aaggctccgc cttgggaaaa 120 cagctaaacc taaagctcct tgacaactgg gacagcgtga cctccacctt cagcaagctg 180 cgcgaacagc tcggccctgt gacccaggag ttctgggata acctggaaaa ggagacagag 240 ggcctgaggc aggagatgag caaggatctg gaggaggtga aggccaaggt gcagccctac 300 ctggacgact tccagaagaa gtggcaggag gagatggagc tctaccgcca gaaggtggag 360 ccgctgcgcg cagagctcca agagggcgcg cgccagaagc tgcacgagct gcaagagaag 420 ctgagcccac tgggcgagga gatgcgcgac gcgcgcgcgc ccatgtggac gcgctgcgca 480 cgcatctggc cccctacagc gacgagctgc gccagtgctt ggccgcgcgc cttgaggctc 540 tcaaggagaa cggcggcgcc agactggccg agtaccacgc caaggccacc gagcatctga 600 gcacgctcag cgagaaggcc aagcccgcgc tcgaggacct ccgccaaggc ctgctgcccg 660 tgctggagag cttcaaggtc agcttcctga gcgctctcga ggagtacact aagaagctca 720 acacccagtg a 731 <210> 4 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr 1 5 10 15 Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln 20 25 30 Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp 35 40 45 Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu 50 55 60 Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu 65 70 75 80 Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys 85 90 95 Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met 100 105 110 Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu 115 120 125 Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu 130 135 140 Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg 145 150 155 160 Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Cys Leu Ala Ala 165 170 175 Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr 180 185 190 His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys 195 200 205 Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser 210 215 220 Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu 225 230 235 240 Asn Thr Gln <210> 5 <211> 731 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gatgaacccc cccagagccc ctgggatcga gtgaaggacc tggccactgt gtacgtggat 60 gtgctcaaag acagcggcag agactatgtg tcccagtttg aaggctccgc cttgggaaaa 120 cagctaaacc taaagctcct tgacaactgg gacagcgtga cctccacctt cagcaagctg 180 cgcgaacagc tcggccctgt gacccaggag ttctgggata acctggaaaa ggagacagag 240 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Cyprinus carpio <400> 15 Leu Gly Gln Ser Val Asp Asn Leu His Gly Tyr Phe Gln Asn Gly Phe 1 5 10 15 Gln Ala Ile Thr Pro Ile Gly Asp Gln Val Leu Glu Ala Thr Lys Asp 20 25 30 Thr Arg Glu Lys Leu Val Lys Asp Val Glu Glu Leu Arg Lys Lys Ile 35 40 45 Glu Pro Met Arg Ala Glu Leu Arg Gln Val Leu Glu Lys His Leu Gln 50 55 60 Glu Tyr Arg Asp Glu Leu Lys Pro Phe Val Glu Glu Tyr Leu Thr Lys 65 70 75 80 His Gln Lys Phe Leu Glu Glu Met Arg Ile Lys Leu Glu Pro Val Val 85 90 95 Lys Ser Leu Arg Glu Lys Phe Gly Pro Asn Trp Glu Glu Thr Lys Ser 100 105 110 Lys Leu Met Pro Ile Leu Glu Ala Val Arg Glu Lys Val Ala Glu His 115 120 125 Leu Gln Asp Leu Lys Lys Leu Leu Glu Pro Tyr Met Gln Asp Tyr Arg 130 135 140 Glu Gln Met Glu Lys Gly Ala Gln Glu Phe Arg Gln Ser Val Lys Ser 145 150 155 160 Gly Glu Leu Arg Lys Lys Met Asn Glu Leu Gly Arg Arg Arg 165 170 <210> 16 <211> 264 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 16 Met Arg Gly Val Leu Val Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Thr 1 5 10 15 Gln Ala Arg Ser Phe Trp Gln 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attagatggt gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg 120 aaggtgatgc aacatacgga aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac 180 ctgttccatg gccaacactt gtcactactt tctcttatgg tgttcaatgc ttttcaagat 240 acccagatca tatgaagcgg cacgacttct tcaagagcgc catgcctgag ggatacgtgc 300 aggagaggac catctctttc aaggacgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt 360 ttgagggaga caccctcgtc aacaggatcg agcttaaggg aatcgatttc aaggaggacg 420 gaaacatcct cggccacaag ttggaataca actacaactc ccacaacgta tacatcacgg 480 cagacaaaca aaagaatgga atcaaagcta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg 540 gaagcgttca actagcagac cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc 600 ttttaccaga caaccattac ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa 660 agagagacca catggtcctt cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg 720 atgaactata caaataagag ctc 743 <210> 58 <211> 25 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 58 Met Asn Phe Leu Lys Ser Phe Pro Phe Tyr Ala Phe Leu Cys Phe Gly 1 5 10 15 Gln Tyr Phe Val Ala Val Thr His Ala 20 25 <210> 59 <211> 174 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 59 Met Val Ser Leu Leu Lys Leu Gln Lys Gln His Arg Thr Leu Asn Pro 1 5 10 15 Tyr Ser Leu Arg Lys Arg Lys Lys Glu Met Ala Asp His Gln Gln His 20 25 30 Gln Gln Gln Gln Gln Pro Ile Met Arg Ser Leu His Glu Ser Ser Pro 35 40 45 Ser Thr Arg Gln Ile Val Arg Phe Val Thr Ala Ala Thr Ile Gly Leu 50 55 60 Ser Leu Leu Val Leu Ser Gly Leu Thr Leu Thr Gly Thr Val Ile Gly 65 70 75 80 Leu Ile Val Ala Thr Pro Leu Met Val Leu Phe Ser Pro Val Leu Val 85 90 95 Pro Ala Val Ile Thr Ile Gly Leu Leu Thr Met Gly Phe Leu Phe Ser 100 105 110 Gly Gly Cys Gly Val Ala Ala Ala Thr Ala Leu Thr Trp Ile Tyr Lys 115 120 125 Tyr Val Thr Gly Lys His Pro Met Gly Ala Asp Lys Val Asp Tyr Ala 130 135 140 Arg Met Arg Ile Ala Glu Lys Ala Lys Glu Leu Gly His Tyr Thr His 145 150 155 160 Ser Gln Pro Gln Gln Thr His Gln Thr Thr Thr Thr Thr His 165 170 <210> 60 <211> 199 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 60 Met Ala Asp Thr His Arg Val Asp Arg Thr Asp Arg His Phe Gln Phe 1 5 10 15 Gln Ser Pro Tyr 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thaliana <400> 84 Met Ala Asn Val Asp Arg Asp Arg Arg Val His Val Asp Arg Thr Asp 1 5 10 15 Lys Arg Val His Gln Pro Asn Tyr Glu Asp Asp Val Gly Phe Gly Gly 20 25 30 Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Ser Asp Tyr Lys Ser Arg Gly Pro Ser 35 40 45 Thr Asn Gln Ile Leu Ala Leu Ile Ala Gly Val Pro Ile Gly Gly Thr 50 55 60 Leu Leu Thr Leu Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Ser Val Ile Gly Leu 65 70 75 80 Leu Val Ser Ile Pro Leu Phe Leu Leu Phe Ser Pro Val Ile Val Pro 85 90 95 Ala Ala Leu Thr Ile Gly Leu Ala Val Thr Gly Ile Leu Ala Ser Gly 100 105 110 Leu Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Val Ser Trp Val Leu Asn Tyr 115 120 125 Leu Arg Gly Thr Ser Asp Thr Val Pro Glu Gln Leu Asp Tyr Ala Lys 130 135 140 Arg Arg Met Ala Asp Ala Val Gly Tyr Ala Gly Met Lys Gly Lys Glu 145 150 155 160 Met Gly Gln Tyr Val Gln Asp Lys Ala His Glu Ala Arg Glu Thr Glu 165 170 175 Phe Met Thr Glu Thr His Glu Pro Gly Lys Ala Arg Arg Gly Ser 180 185 190 <210> 85 <211> 141 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 85 Met Ala Asp Gln Thr 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Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 108 Asn Lys Phe Thr Leu Ser Asn Leu Ile Ser Val Asp Phe Met Ala Met 1 5 10 15 Tyr Gln Ser Pro Gln Phe Thr Arg His His Asp Ala Leu Gln Pro Ala 20 25 30 Ala Leu Asn Ser Ser Gly Gln Gly His His Ser Ser His His Arg Arg 35 40 45 Ser Val Met Leu Leu Ser Xaa Leu Thr Leu Val Ala Thr Val Ile Gly 50 55 60 Leu Val Ile Ala Thr Pro Val Met Val Ile Phe Ser Pro Val Leu Val 65 70 75 80 Pro Ala Gly Leu Pro Ala Ala Pro Ala Arg Arg Val Ser His Gly Gly 85 90 95 Gly Ala Gly Gly His Arg Ala Phe Val Leu Phe Trp Met Tyr Arg Tyr 100 105 110 Thr Ala Gly Lys His Pro Ile Gly Ala Asn Gln Leu Asp Phe Ala Ala 115 120 125 Thr Arg Leu Arg Met Arg Lys Glu Lys Gly Xaa Ile Trp Gly Met Ser 130 135 140 Arg Phe Arg Leu Phe Arg Gly Val Glu Glu Val Val Arg Arg Xaa Gly 145 150 155 160 Asn Asp Glu Gly Phe Leu Ala Val 165 <210> 109 <211> 187 <212> PRT <213> Zea mays <400> 109 Met Ala Asp Arg Asp Arg Ser Gly Ile Tyr Gly Gly Ala His Ala Thr 1 5 10 15 Tyr Gly Gln Gln Gln Gln Gln 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tatgggagat 540 gacagaagga aaccgtgacg cttgggacat ttttggatgg atcgcaggca aaatagagtg 600 gggactgttg tacttgctag caagggatga agaagggttt ttgtcaaaag aagctattag 660 gcggtgtttc gatggaagct tgttcgagta ctgtgccaaa atctacgctg gtatcagtga 720 agacaagaca gcatactacg ccatggat 748 <210> 141 <211> 738 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 141 atggggtcaa agacggagat gatggagaga gacgcaatgg ctacggtggc tccctatgcg 60 ccggtcactt accaccgccg tgctcgtgtt gacttggatg atagacttcc taaaccttat 120 atgccaagag cattgcaagc accagacaga gaacacccgt acggaactcc aggccataag 180 aattacggac ttagtgttct tcaacagcat gtctccttct tcgatatcga tgataatggc 240 atcatttacc cttgggagac ctactctgga ctgcgaatgc ttggtttcaa tatcattggg 300 tcgcttataa tagccgctgt tatcaacctg acccttagct atgccactct tccggggtgg 360 ttaccttcac ctttcttccc tatatacata cacaacatac acaagtcaaa gcatggaagt 420 gattcaaaaa catatgacaa tgaaggaagg tttatgccgg tgaatcttga gttgatattt 480 agcaaatatg cgaaaacctt gccagacaag ttgagtcttg gagaactatg ggagatgaca 540 gaaggaaacc gtgacgcttg ggacattttt ggatggatcg caggcaaaat agagtgggga 600 ctgttgtact tgctagcaag ggatgaagaa gggtttttgt caaaagaagc tattaggcgg 660 tgtttcgatg gaagcttgtt cgagtactgt gccaaaatct acgctggtat cagtgaagac 720 aagacagcat actactaa 738 <210> 142 <211> 1047 <212> DNA <213> Sesamum indicum <400> 142 atggatctaa tccacacttt cctcaactta atagctcccc ctttcacctt cttcttcctt 60 ctctttttct tgccaccctt ccagattttc aagttcttcc tttcaatctt gggcaccctt 120 ttcagcgagg atgtcgctgg aaaagtcgtc gtcatcaccg gcgcctcctc cggcatcggc 180 gaaagtcttg cttacgagta tgctaagaga ggggcgtgct tggtgcttgc tgcaagaagg 240 gaaaggagtc ttcaagaagt ggccgaaagg gcgcgcgatt tggggtcgcc ggacgtcgtg 300 gtggtccggg ccgatgtttc gaaggcggag gactgcagga aggttgttga tcagactatg 360 aatcgctttg gaagattgga tcacctggtc aataacgctg gaattatgtc agtttcaatg 420 ctggaagaag ttgaagatat tactggttac agagaaacta tggatatcaa cttctggggc 480 tatgtgtata tgacccgatt tgccgcccca taccttagga atagcagagg ccgaattgtt 540 gtactttctt catccagttc ttggatgcct actccgagga tgagttttta caatgcaagc 600 aaagcggcga tttcacaatt ttttgagaca ctgcgggtgg 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tatttgttaa acattttcaa accgcataaa attttatgaa gtcccgtcta 240 tctttaatga gtctaacatt ttcatattga aatatataat ttacttaatt ttagcgttgg 300 tagaaagcat aaagatttat tcttattctt cttcatataa atgtttaata tacaatataa 360 acaaattctt taccttaaga aggatttccc attttatatt ttaaaaatat atttatcaaa 420 tatttttcaa ccacgtaaat ctcataatat aagttgtttc aaaagtaata aaatttaact 480 ccataatttt tttattcgac tgatcttaaa gcaacaccca gtgacacaac tagccatttt 540 tttctttgaa taaaaaaatc caattatcat tgtatttttt ttatacaatg aaaatttcac 600 caaacaatca tttgtggtat ttctgaagca agtcatgtta tgcaaaatct ataattccca 660 tttgacacta cggaagtaac tgaagatctg cttttacatg cgagacacat cttctaaagt 720 aattttaata atagttacta tattcaagat ttcatatatc aaatactcaa tattacttct 780 aaaaaattaa ttagatataa ttaaaatatt acttttttaa ttttaagttt aattgttgaa 840 tttgtgctat tgatttatta ttctactatg tttaaattgt tttatagata gtttaaagta 900 aatataagta atgtagtaga gtgttagagt gttaccctaa accataaact ataacattta 960 tggtggacta attttcatat atttcttatt gcttttacct tttcttggta tgtaagtccg 1020 taactagaat tacagtgggt tgccagacac tctgtggtct tttggttcat gcatgggtct 1080 tgcgcaagaa aaagacaaag aacaaagaaa aaagacaaaa cagagagaca aaacgcaatc 1140 acacaccaac tcaaattagt cactggctga tcaagatcgc cgcgtccatg tatgtctaaa 1200 tgccatgcaa agcaacacgt gcttaacatg cactttaaat ggctcaccca tctcaaccca 1260 cacacaaaca cattgccttt ttcttcatca tcaccacaac cacctgtata tattcattct 1320 cttccgccac ctcaatttct tcacttcaac acacgtcaac ctgcatatgc gtgtcatccc 1380 atgcccaaat ctccatgcat gttccaacca ccttctctct tatataatac ctataaatac 1440 ctcaatatca ctcacttctt tcatcatcca tccatccaga gtactactac tctactacta 1500 taatacccca acccaactca tattcaatac tactctacca tggatgaacc cccccagagc 1560 ccctgggatc gagtgaagga cctggccact gtgtacgtgg atgtgctcaa agacagcggc 1620 agagactatg tgtcccagtt tgaggctccg ccttgggaaa acagctaaac ctaaagctcc 1680 ttgacaactg ggacagcgtg acctccacct tcagcaagct gcgcgaacag ctcggccctg 1740 tacccaggag ttctgggata acctggaaaa ggagacagag ggcctgaggc aggagatgag 1800 caaggatctg gaggaggtga aggccaaggt gcagccctac tggacgactt ccagaagaag 1860 tggcaggagg agatggagct ctaccgccag aaggtggagc cgctgcgcgc agagctccaa 1920 gagggcgcgc gccagaagcg cacgagctgc aagagaagct gagcccactg ggcgaggaga 1980 tgcgcgaccg cgcgcgcgcc catgtggacg cgctgcgcac gcatctggcc ccctacagga 2040 cgagctgcgc cagcgcttgg ccgcgcgcct tgaggctctc aaggagaacg gcggcgccag 2100 actggccgag taccacgcca aggccaccga gcatctggca cgctcagcga gaaggccaag 2160 cccgcgctcg aggacctccg ccaaggcctg ctgcccgtgc tggagagctt caaggtcagc 2220 ttcctgagcg ctctcgggag tacactaaga agctcaacac ccaggggatc cccttggcta 2280 gtaaaggaga agaacttttc actggagttg tcccaattct tgttgaatta gatgggatgt 2340 taatgggcac aaattttctg tcagtggaga gggtgaaggt gatgctacat acggaaagct 2400 tacccttaaa tttatttgca ctactggaaa actactgttc cttggccaac acttgtcact 2460 actttctctt atggtgttca atgcttttca agatacccag atcatatgaa gcggcacgac 2520 ttcttcaaga gcgcatgcct gagggatacg tgcaggagag gaccatctct ttcaaggacg 2580 acgggaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaggg agacaccctc gtaacaggat 2640 cgagcttaag ggaatcgatt tcaaggagga cggaaacatc ctcggccaca agttggaata 2700 caactacaac tcccacaacg 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720 aagtaatttt aataatagtt actatattca agatttcata tatcaaatac tcaatattac 780 ttctaaaaaa ttaattagat ataattaaaa tattactttt ttaattttaa gtttaattgt 840 tgaatttgtg actattgatt tattattcta ctatgtttaa attgttttat agatagttta 900 aagtaaatat aagtaatgta gtagagtgtt agagtgttac cctaaaccat aaactataac 960 atttatggtg gactaatttt catatatttc ttattgcttt taccttttct tggtatgtaa 1020 gtccgtaact agaattacag tgggttgcca tgacactctg tggtcttttg gttcatgcat 1080 gggtcttgcg caagaaaaag acaaagaaca aagaaaaaag acaaaacaga gagacaaaac 1140 gcaatcacac aaccaactca aattagtcac tggctgatca agatcgccgc gtccatgtat 1200 gtctaaatgc catgcaaagc aacacgtgct taacatgcac tttaaatggc tcacccatct 1260 caacccacac acaaacacat tgcctttttc ttcatcatca ccacaaccac ctgtatatat 1320 tcattctctt ccgccacctc aatttcttca cttcaacaca cgtcaacctg catatgcgtg 1380 tcatcccatg cccaaatctc catgcatgtt ccaaccacct tctctcttat ataataccta 1440 taaatacctc taatatcact cacttctttc atcatccatc catccagagt actactactc 1500 tactactata ataccccaac ccaactcata ttcaatacta ctctaccatg aacttcctta 1560 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caagaaaaag acaaagaaca aagaaaaaag acaaaacaga gagacaaaac 1140 gcaatcacac aaccaactca aattagtcac tggctgatca agatcgccgc gtccatgtat 1200 gtctaaatgc catgcaaagc aacacgtgct taacatgcac tttaaatggc tcacccatct 1260 caacccacac acaaacacat tgcctttttc ttcatcatca ccacaaccac ctgtatatat 1320 tcattctctt ccgccacctc aatttcttca cttcaacaca cgtcaacctg catatgcgtg 1380 tcatcccatg cccaaatctc catgcatgtt ccaaccacct tctctcttat ataataccta 1440 taaatacctc taatatcact cacttctttc atcatccatc catccagagt actactactc 1500 tactactata ataccccaac ccaactcata ttcaatacta ctctaccatg gatgaacccc 1560 cccagagccc ctgggatcga gtgaaggacc tggccactgt gtacgtggat gtgctcaaag 1620 acagcggcag agactatgtg tcccagtttg aaggctccgc cttgggaaaa cagctaaacc 1680 taaagctcct tgacaactgg gacagcgtga cctccacctt cagcaagctg cgcgaacagc 1740 tcggccctgt gacccaggag ttctgggata acctggaaaa ggagacagag ggcctgaggc 1800 aggagatgag caaggatctg gaggaggtga aggccaaggt gcagccctac ctggacgact 1860 tccagaagaa gtggcaggag gagatggagc tctaccgcca gaaggtggag ccgctgcgcg 1920 cagagctcca 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ttaatgtctt tataaggttt gatccatgat atttctaata ttttagttga 2820 tatgtatatg aaaaggtact atttgaactc tcttactctg tataaaggtt ggatcatcct 2880 taaagtgggt ctatttaatt ttattgcttc ttacagataa aaaaaaaatt atgagttggt 2940 ttgataaaat attgaaggat ttaaaataat aataaataat aaataacata taatatatgt 3000 atataaattt attataatat aacatttatc tataaaaaag taaatattgt cataaatcta 3060 tacaatcgtt tagccttgct ggaacgaatc tcaattattt aaacgagagt aaacatattt 3120 gactttttgg ttatttaaca aattattatt taacactata tgaaattttt tttttttatc 3180 agcaaagaaa taaaattaaa ttaagaagga caatggtgtg tcccaatcct tatacaacca 3240 acttccacaa gaaagtcaag tcagagacaa caaaaaaaca agcaaaggaa attttttaat 3300 ttgagttgtc ttgtttgctg cataatttat gcagtaaaac actacacata acccttttag 3360 cagtagagca atggttgacc gtgtgcttag cttcttttat tttatttttt tatcagcaaa 3420 gaataaataa aataaaatga gacacttcag ggatgtttca acccttatac aaaaccccaa 3480 aaacaagttt cctagcaccc taccaactaa 3510 <210> 172 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apo21 <400> 172 Met Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp 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catatgcgtg 1380 tcatcccatg cccaaatctc catgcatgtt ccaaccacct tctctcttat ataataccta 1440 taaatacctc taatatcact cacttctttc atcatccatc catccagagt actactactc 1500 tactactata ataccccaac ccaactcata ttcaatacta ctctactatg gcggatacag 1560 ctagaggaac ccatcacgat atcatcggca gagaccagta cccgatgatg ggccgagacc 1620 gagaccagta ccagatgtcc ggacgaggat ctgactactc caagtctagg cagattgcta 1680 aagctgcaac tgctgtcaca gctggtggtt ccctccttgt tctctccagc cttacccttg 1740 ttggaactgt catagctttg actgttgcaa cacctctgct cgttatcttc agcccaatcc 1800 ttgtcccggc tctcatcaca gttgcactcc tcatcaccgg ttttctttcc tctggagggt 1860 ttggcattgc cgctataacc gttttctctt ggatttacaa gtaagcacac atttatcatc 1920 ttacttcata attttgtgca atatgtgcat gcatgtgttg agccagtagc tttggatcaa 1980 tttttttggt agaataacaa atgtaacaat aagaaattgc aaattctagg gaacatttgg 2040 ttaactaaat acgaaatttg acctagctag cttgaatgtg tctgtgtata tcatctatat 2100 aggtaaaatg cttggtatga tacctattga ttgtgaatag gtacgcaacg ggagagcacc 2160 cacagggatc agacaagttg gacagtgcaa ggatgaagtt gggaagcaaa 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aatttcttca cttcaacaca cgtcaacctg catatgcgtg 1380 tcatcccatg cccaaatctc catgcatgtt ccaaccacct tctctcttat ataataccta 1440 taaatacctc taatatcact cacttctttc atcatccatc catccagagt actactactc 1500 tactactata ataccccaac ccaactcata ttcaatacta ctctaccatg aacttcctta 1560 agtctttccc tttctacgct ttcctttgtt tcggtcaata cttcgttgct gttacgcatg 1620 ctgacattgt gatgacacag tctccatcct ccctggctat gtcagtggga cagcgggtca 1680 ctatgcgctg caagtccagt cagagccttt taaaaagtac caatcaaaag aactatttgg 1740 cctggtacca gcagaaacca ggacagtctc ctaaacttct ggtatacttt gcatccacta 1800 gggaatctgg ggtccctgat cgcttcatag gcagtggatc tgggacagat ttcactctta 1860 ccatcagcag tgtgcaggct gaagacctgg cagattactt ctgtcagcaa cattataaca 1920 ctcctcccac gttcggtgct gggaccaagc tggagcttaa gcggtctccg aacggtgctt 1980 ctcatagcgg ttctgcacca ggcactagct ctgcatctgg atctcaggtg cacctgcagc 2040 agtctggagc tgagctgatg aagcctgggg cctcaatgaa gatatcctgc aaggctactg 2100 gctacacatt cagtagctac tggatagagt gggtaaagca gaggcctgga catggccttg 2160 agtggattgg agagatttta 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tatctataaa aaagtaaata ttgtcataaa tctatacaat 3900 cgtttagcct tgctggaacg aatctcaatt atttaaacga gagtaaacat atttgacttt 3960 ttggttattt aacaaattat tatttaacac tatatgaaat tttttttttt tatcagcaaa 4020 gaaataaaat taaattaaga aggacaatgg tgtgtcccaa tccttataca accaacttcc 4080 acaagaaagt caagtcagag acaacaaaaa aacaagcaaa ggaaattttt taatttgagt 4140 tgtcttgttt gctgcataat ttatgcagta aaacactaca cataaccctt ttagcagtag 4200 agcaatggtt gaccgtgtgc ttagcttctt ttattttatt tttttatcag caaagaataa 4260 ataaaataaa atgagacact tcagggatgt ttcaaccctt atacaaaacc ccaaaaacaa 4320 gtttcctagc accctaccaa ctaa 4344 <210> 209 <211> 522 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Apo35 <400> 209 Met Asn Phe Leu Lys Ser Phe Pro Phe Tyr Ala Phe Leu Cys Phe Gly 1 5 10 15 Gln Tyr Phe Val Ala Val Thr His Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser 20 25 30 Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly Gln Arg Val Thr Met Arg Cys 35 40 45 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 50 55 60 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 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Ala Arg Leu Asp Asp Leu Trp Glu Asp Ile Thr His Ser Leu 340 345 350 His Asp Gln Gly His Ser His Leu Gly Asp Pro 355 360 <210> 249 <211> 363 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 249 Met Ala Ala Val Leu Thr Trp Ala Leu Ala Leu Leu Ser Ala Phe Ser 1 5 10 15 Ala Thr Gln Ala Arg Lys Gly Phe Trp Asp Tyr Phe Ser Gln Thr Ser 20 25 30 Gly Asp Lys Gly Arg Val Glu Gln Ile His Gln Gln Lys Met Ala Arg 35 40 45 Glu Pro Ala Thr Leu Lys Asp Ser Leu Glu Gln Asp Leu Asn Asn Met 50 55 60 Asn Lys Phe Leu Glu Lys Leu Arg Pro Leu Ser Gly Ser Glu Ala Pro 65 70 75 80 Arg Leu Pro Gln Asp Pro Val Gly Met Arg Arg Gln Leu Gln Glu Glu 85 90 95 Leu Glu Glu Val Lys Ala Arg Leu Gln Pro Tyr Met Ala Glu Ala His 100 105 110 Glu Leu Val Gly Trp Asn Leu Glu Gly Leu Arg Gln Gln Leu Lys Pro 115 120 125 Tyr Thr Met Asp Leu Met Glu Gln Val Ala Leu Arg Val Gln Glu Leu 130 135 140 Gln Glu Gln Leu Arg Val Val Gly Glu Asp Thr Lys Ala Gln Leu Leu 145 150 155 160 Gly Gly Val Asp Glu Ala Trp Ala Leu Leu Gln Gly Leu Gln Ser Arg 165 170 175 Val Val His His Thr Gly Arg Phe Lys Glu Leu Phe His Pro Tyr Ala 180 185 190 Glu Ser Leu Val Ser Gly Ile Gly Arg His Val Gln Glu Leu His Arg 195 200 205 Ser Val Ala Pro His Ala Pro Ala Ser Pro Ala Arg Leu Ser Arg Cys 210 215 220 Val Gln Val Leu Ser Arg Lys Leu Thr Leu Lys Ala Lys Ala Leu His 225 230 235 240 Ala Arg Ile Gln Gln Asn Leu Asp Gln Leu Arg Glu Glu Leu Ser Arg 245 250 255 Ala Phe Ala Gly Thr Gly Thr Glu Glu Gly Ala Gly Pro Asp Pro Gln 260 265 270 Met Leu Ser Glu Glu Val Arg Gln Arg Leu Gln Ala Phe Arg Gln Asp 275 280 285 Thr Tyr Leu Gln Ile Ala Ala Phe Thr Arg Ala Ile Asp Gln Glu Thr 290 295 300 Glu Glu Val Gln Gln Gln Leu Ala Pro Pro Pro Pro Gly His Ser Ala 305 310 315 320 Phe Ala Pro Glu Phe Gln Gln Thr Asp Ser Gly Lys Val Leu Ser Lys 325 330 335 Leu Gln Ala Arg Leu Asp Asp Leu Trp Glu Asp Ile Thr His Ser Leu 340 345 350 His Asp Gln Gly His Ser His Leu Gly Asp Pro 355 360 <210> 250 <211> 367 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 250 Met Ala Ala Val Ile Thr Trp Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Gln Ala Arg Lys Ser Phe Trp Glu Tyr Phe Gly Gln Asn Ser 20 25 30 Gln Gly Lys Gly Met Met Gly Gln Gln Gln Lys Leu Ala Gln Glu Ser 35 40 45 Leu Lys Gly Ser Leu Glu Gln Asp Leu Tyr Asn Met Asn Asn Phe Leu 50 55 60 Glu Lys Leu Gly Pro Leu Arg Glu Pro Gly Lys Glu Pro Pro Arg Leu 65 70 75 80 Ala Gln Asp Pro Glu Gly Ile Arg Lys Gln Leu Gln Gln Glu Leu Glu 85 90 95 Glu Val Ser Thr Arg Leu Glu Pro Tyr Met Ala Ala Lys His Gln Gln 100 105 110 Val Gly Trp Asn Leu Glu Gly Leu Arg Gln Gln Leu Lys Pro Tyr Thr 115 120 125 Val Glu Leu Met Glu Gln Val Gly Leu Ser Val Gln Asp Leu Gln Glu 130 135 140 Gln Leu Arg Met Val Gly Lys Gly Thr Lys Ala Gln Leu Leu Gly Gly 145 150 155 160 Val Asp Glu Ala Met Ser Leu Leu Gln Asp Met Gln Ser Arg Val Leu 165 170 175 His His Thr Asp Arg Val Lys Glu Leu Phe His Pro Tyr Ala Glu Arg 180 185 190 Leu Val Thr Gly Ile Gly His His Val Gln Glu Leu His Arg Ser Val 195 200 205 Ala Pro His Ala Val Ala Ser Pro Ala Arg Leu Ser Arg Cys Val Gln 210 215 220 Thr Leu Ser His Lys Leu Thr Arg Lys Ala Lys Asp Leu His Thr Ser 225 230 235 240 Ile Gln Arg Asn Leu Asp Gln Leu Arg Asp Glu Leu Ser Thr Phe Ile 245 250 255 Arg Val Ser Thr Asp Gly Ala Asp Asn Arg Asp Ser Leu Asp Pro Gln 260 265 270 Ala Leu Ser Asp Glu Val Arg Gln Arg Leu Gln Ala Phe Arg His Asp 275 280 285 Thr Tyr Leu Gln Ile Ala Ala Phe Thr Gln Ala Ile Asp Gln Glu Thr 290 295 300 Glu Glu Ile Gln His Gln Leu Ala Pro Pro Pro Pro Ser His Ser Ala 305 310 315 320 Phe Ala Pro Glu Leu Gly His Ser Asp Ser Asn Lys Ala Leu Ser Arg 325 330 335 Leu Gln Ser Arg Leu Asp Asp Leu Trp Glu Asp Ile Ala Tyr Gly Leu 340 345 350 His Asp Gln Gly His Ser Gln Asn Asn Pro Glu Gly His Ser Gly 355 360 365 <210> 251 <211> 367 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 251 Met Ala Ala Val Ile Thr Trp Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Gln Ala Arg Lys Ser Phe Trp Glu Tyr Phe Gly Gln Asn Ser 20 25 30 Gln Gly Lys Gly Met Met Gly Gln Gln Gln Lys Leu Ala Gln Glu Ser 35 40 45 Leu Lys Gly Ser Leu Glu Gln Asp Leu Tyr Asn Met Asn Asn Phe Leu 50 55 60 Glu Lys Leu Gly Pro Leu Arg Glu Pro Gly Lys Glu Pro Pro Arg Leu 65 70 75 80 Ala Gln Asp Pro Glu Gly Ile Arg Lys Gln Leu Gln Gln Glu Leu Glu 85 90 95 Glu Val Ser Thr Arg Leu Glu Pro Tyr Met Ala Ala Lys His Gln Gln 100 105 110 Val Gly Trp Asn Leu Glu Gly Leu Arg Gln Gln Leu Lys Pro Tyr Thr 115 120 125 Val Glu Leu Met Glu Gln Val Gly Leu Ser Val Gln Asp Leu Gln Glu 130 135 140 Gln Leu Arg Met Val Gly Lys Gly Thr Lys Ala Gln Leu Leu Gly Gly 145 150 155 160 Val Asp Glu Ala Met Ser Leu Leu Gln Asp Met Gln Ser Arg Val Leu 165 170 175 His His Thr Asp Arg Val Lys Glu Leu Phe His Pro Tyr Ala Glu Arg 180 185 190 Leu Val Thr Gly Ile Gly His His Val Gln Glu Leu His Arg Ser Val 195 200 205 Ala Pro His Ala Val Ala Ser Pro Ala Arg Leu Ser Arg Cys Val Gln 210 215 220 Thr Leu Ser His Lys Leu Thr Arg Lys Ala Lys Asp Leu His Thr Ser 225 230 235 240 Ile Gln Arg Asn Leu Asp Gln Leu Arg Asp Glu Leu Ser Thr Phe Ile 245 250 255 Arg Val Ser Thr Asp Gly Ala Asp Asn Arg Asp Ser Leu Asp Pro Gln 260 265 270 Ala Leu Ser Asp Glu Val Arg Gln Arg Leu Gln Ala Phe Arg His Asp 275 280 285 Thr Tyr Leu Gln Ile Ala Ala Phe Thr Gln Ala Ile Asp Gln Glu Thr 290 295 300 Glu Glu Ile Gln His Gln Leu Ala Pro Pro Pro Pro Ser His Ser Ala 305 310 315 320 Phe Ala Pro Glu Leu Gly His Ser Asp Ser Asn Lys Ala Leu Ser Arg 325 330 335 Leu Gln Ser Arg Leu Asp Asp Leu Trp Glu Asp Ile Ala Tyr Gly Leu 340 345 350 His Asp Gln Gly His Ser Gln Asn Asn Pro Glu Gly His Ser Gly 355 360 365

Claims (49)

  1. (a) 작동가능하게 연결된 성분으로 5'에서 3' 방향의 전사에서 다음을 포함하는 키메릭 핵산 구조물을 제공하고,
    (i) 식물세포에서 발현을 조절하는 것이 가능한 핵산 서열 및
    (ii) 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열;
    (b) 식물세포에 상기 키메릭 핵산 구조물을 삽입하고; 및
    (c) 식물을 성숙한 식물 내에서 상기 식물세포를 자라게 하여 상기식물이 아포지질단백질을 발현하는 것을 포함하는 식물에서 아포지질단백질의 발현 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 키메릭 핵산 서열이 핵의 게놈 융합 조건 하에서 식물세포 내로 삽입되는 것인 방법.
  3. 제 1항 또는 2 항에 있어서, 상기 식물세포는 종자세포인 것인 방법.
  4. 제 1항, 제 2항 또는 제 3 항에 있어서, 식물세포에서 발현을 조절 가능한 상기 핵산 서열이 종자 선호적인 프로모터인 것인 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 종자 선호적인 프로모터는 파세올린(phaseolin) 프로모터인 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항 있어서, 식물세포에서 발현을 조절 가능한 상기 핵산 서열은 구성 프로모터인 것인 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 구성 프로모터는 유비퀴틴 프로모터인 것인 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 키메릭 핵산구조물이 리딩프레임에서 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열에 결합된 안정화 폴레펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 안정화 폴리펩타이드는 식물에 특이적인 것인 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 안정화 폴리펩타이드는 식물에 비특이적인 것인 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 식물-특이적인 안정화 폴리펩타이드는 오일 바디 단백질 또는 티오레독신(thioredoxin) 또는 그의 단편인 것인 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 오일바디 단백질은 올레오신, 칼레오신 및 스테롤레오신으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 올레오신, 칼레오신 및 스테롤레오신은 아라비돕시스 탈리아나(Arabidosis tlalania)로 부터 유래되는 것인 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 티오레독신(thioredoxin)은 SEQ ID NO:56인 것인 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 비-식물 특이적인 안정화 폴리펩타이드는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein) 또는 단일 사슬 항체 또는 그의 단편인 것인 방법.
  16. 제 10 항에 있어서, 상기 비-식물 특이적인 안정화 폴리펩타이드는 식물에서 최적의 발현을 위하여 최적화된 코돈인 것인 방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 상기 녹색 형광 단백질은 SEQ ID NO:57인 것인 방법.
  18. 제 15 항에 있어서, 상기 단일-사슬 항체는 종자에서 발현되는 아포지질단백질의 전제를 촉진할 수 있는 것인 방법.
  19. 제 15 항에 있어서, 상기 단일 사슬 항체는 오일바디 단백질과 특이적으로 결합 가능한 것인 방법.
  20. 제 15 항에 있어서, 상기 단일 사슬 항체는 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)(D9scFv)의 18 kDa 올레오신과 특이적으로 결합할수 있는 단일-사슬 Fv 항체인 것인 방법.
  21. 제 15 항에 있어서, 상기 단일 사슬 항체는 SEQ ID NO:240인 것인 방법.
  22. 제 8 항에 있어서, 상기 안정화 폴리펩타이드는 절단 가능한 링커를 통해 아포지질단백질에 연결되는 것인 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 카이모신(chymosin) 프로(pro)서열인 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 카이모신(chymosin) 프로서열은 SEQ ID NO:143인 것인 방법.
  25. 제 1 항에 있어서, 상기 키메릭 핵산 서열은 소포체 또는 소포체 유래의 저장낭에 아포지질단백질을 표적화 할 수 있는 표적 신호를 추가로 포함하는 것인 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 소포체 유래의 저장낭은 오일 바디이며 상기 표적 서열은 오일 바디 단백질을 암호하는 것인 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 상기 표적신호는 C-말단 소포체-보유 모티브를 포함하는 것인 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 C-말단 소포체-보유 모티브는 KDEL인 것인 방법.
  29. 제 1 항에 있어서, 상기 키메릭 핵산 구조물은 아포플라스트에 아포지질단백질 폴리펩타이드를 표적 시킬 수 있는 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 신호펩타이드는 담배 질병에 관련된 단백질 신호 서열(PR-S)인 것인 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 PR-S 신호서열은 SEQ ID NO:58인 것인 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열은 사람 아포지질단백질, 사람 프로-아포지질단백질, 돼지 아포 지질단백질, 돼지 프로-아포지질단백질, 소 아포지질단백질 및 소 프로-아포지질단백질을 포함하는 핵산 서열 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  33. 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열은 식물 코돈 용도에 최적화되는 것인 방법.
  34. (a) 작동가능하게 연결된 성분으로 5'에서 3'의 전사 방향에서 다음을 포함하는 키메릭핵산의 구조물을 제공하고;
    (i) 식물세포에서 발현을 조절하는 것이 가능한 핵산 서열 및
    (ii) 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열;
    (b) 식물세포에 상기 키메릭 핵산 구조물을 삽입하고;
    (c) 식물을 성숙한 식물 내에서 상기 식물세포를 성숙하게 하고, 종자가 아로지질단백질을 포함하는 상기 식물에서 조직을 얻고,
    (d) 아포지질단백질을 포함하는 종자가 있는 식물로부터 종자를 얻는 것을 포함하는, 아포지질단백질을 포함하는 식물종자를 획득하는 방법.
  35. 5'에서 3'의 전사 방향에서
    (a) 작동가능하게 연결된 식물에서 발현을 조절할 수 있는 첫 번째 핵산 서열; 및
    (b) 아포지질단백질을 포함하는, 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 두 번째 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 서열을 포함하는 식물.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 키메릭 핵산 서열은 식물의 핵 게놈에 융합되는 것인 방법.
  37. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 사용된 식물은 아라비돕시스(Arabidopsis) 또는 잇꽃(safflower) 식물인 것인 방법.
  38. 5'에서 3'의 전사 방향에서
    (a) 작동가능하게 연결된 식물종자에서 발현을 조절할 수 있는 첫 번째 핵산 서열;
    (b) 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 두 번째 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 서열을 포함하는 키메릭 핵산 서열을 포함하는 식물 종자.
  39. 식물로부터 획득된 아포지질단백질을 포함하는 실질적으로 순수한 오일 바디를 포함하는 조성물.
  40. 식물세포에서 발현을 조절할 수 있는 핵산을 포함하는 핵산 서열에 연결된 아포지질단백질을 암호화하는 핵산 서열.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 식물세포는 종자세포인 것인 핵산 서열.
  42. 제 41 항에 있어서, 식물세포에서 발현을 조절할 수 있는 상기 핵산 서열은 종자-선호성 프로모터인 것인 핵산 서열.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 종자-선호성 파세올린 프로모터인 것인 핵산 서열.
  44. 제 43 항에 있어서, 식물에서 발현을 조절할 수 있는 상기 핵산 서열은 구성 프로모터인 것인 핵산 서열.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 프로모터는 유비퀴틴 프로모터인 것인 핵산 서열.
  46. 제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 하나의 항에 따른 핵산서열을 포함하는 식물세포에서의 발현에 적합한 재조합 발현벡터.
  47. (a) 작동가능하게 연결된 성분으로 5'에서 3' 방향의 전사에서 다음을 포함하는 키메릭 핵산 구조물을 제공하고,
    (i) 식물종자세포에서 발현을 조절하는 것이 가능한 핵산 서열 및
    (ii) 아포지질단백질 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열;
    (b) 식물세포에 상기 키메릭 핵산 구조물을 삽입하고;
    (c) 성숙한 식물 내에서 상기 식물세포를 자라게 하고;
    (d) 아포지질단백질을 포함하는 종자를 가지는 식물로부터 종자를 얻고;
    (e) 식물 종자 구성성분으로부터 아포지질단백질을 분리하여 실질적으로 순수한 아포지질단백질을 얻는 것을 포함하는 실질적으로 순수한 아포지질단백질의 제조방법.
  48. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 따라 제조된 고순도의 아포지질단백질을 얻기 위한 용도.
  49. 식물로부터 얻어진 실질적으로 순수한 아포지질단백질을 포함하는 조성물.
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