JP2007510420A - トランスジェニック植物におけるアポリポタンパク質の産生法 - Google Patents
トランスジェニック植物におけるアポリポタンパク質の産生法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007510420A JP2007510420A JP2006538622A JP2006538622A JP2007510420A JP 2007510420 A JP2007510420 A JP 2007510420A JP 2006538622 A JP2006538622 A JP 2006538622A JP 2006538622 A JP2006538622 A JP 2006538622A JP 2007510420 A JP2007510420 A JP 2007510420A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plant
- apo
- nucleic acid
- apolipoprotein
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
Abstract
Description
本発明は、植物の遺伝子工学的方法、およびアポリポタンパク質の産生に関する。具体的には本発明は、トランスジェニック植物における組換えアポリポタンパク質の産生法に関する。
健康な人の体では、コレステロールの輸送と除去は均衡している。低密度リポタンパク質(LDL)が高レベルとなって高密度リポタンパク質(HDL)が低レベルとなって均衡が崩れると、動脈では、除去されるコレステロールより多くのコレステロールが蓄積することになる(van Dam, M.J. et al. 2002, Lancet 359: 37-42)。動脈が狭窄または閉鎖するアテローム動脈硬化症は、プラークと呼ばれるコレステロールの反復的な蓄積の結果である(Major, A.S. et al. 2001, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21: 1790-1795)。
本発明は、植物におけるアポリポタンパク質の産生法に関する。特に本発明は、植物の種子におけるアポリポタンパク質の産生法に関する。
(a)使用可能に連結された成分として5'→3'の転写方向に(i)植物細胞における発現を制御可能である核酸配列;および(ii)アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする核酸配列を含むキメラ核酸コンストラクトを提供する段階;
(b)キメラ核酸コンストラクトを植物細胞に導入する段階;ならびに
(c)植物細胞を、アポリポタンパク質を発現可能な成熟植物体に成長させる段階。
(a)使用可能に連結された成分として5'→3'の転写方向に(i)植物の種子の細胞における発現を制御可能である核酸配列;および(ii)アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする核酸配列を含むキメラ核酸コンストラクトを提供する段階;
(b)キメラ核酸コンストラクトを植物細胞に導入する段階;ならびに
(c)植物細胞を、アポリポタンパク質を発現する種子をつけることが可能な成熟植物体に成長させる段階。
(a)使用可能に連結された成分として5'→3'の転写方向に(i)植物の組織の細胞における発現を制御可能である核酸配列;および(ii)アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする核酸配列を含むキメラ核酸コンストラクトを提供する段階;
(b)キメラ核酸コンストラクトを植物細胞に導入する段階;
(c)植物細胞を、種子をつけることが可能な成熟植物体に成長させる段階;ならびに
(d)植物体から、アポリポタンパク質を含む種子を得る段階。
(a)(b)に使用可能に連結された、植物細胞における発現を制御可能な第1の核酸配列;
(b)アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする第2の核酸配列(細胞はアポリポタンパク質を含む)。
(a)(b)に使用可能に連結された、植物細胞における発現を制御可能な第1の核酸配列;
(b)アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする第2の核酸配列。
既に述べたように、本発明は、トランスジェニック植物におけるアポリポタンパク質の作製法に関する。本発明者らは意外にも、植物におけるアポリポタンパク質の産生が容易なだけでなく、従来の方法を超える実質的な利点をももたらすことを見出した。植物ベースの産生用の原材料は安定しているが、これは特に、タンパク質が植物の種子で、さらには細菌のエンドトキシンを含まない状態で産生されるためである。したがって本発明は、アポリポタンパク質を作製するための安全な供給源材料を提供する。アポリポタンパク質の組換え的発現が、アポリポタンパク質の商業規模の作製を可能とするレベルで、程度の差はあるものの純粋な状態の天然のアポリポタンパク質をもたらす場合があることも明らかにされた。したがって本発明では、植物における、アポリポタンパク質をコードする核酸配列の発現法は、以下の段階を含む方法で提供される:
(a)使用可能に連結された成分として5'→3'の転写方向に(i)植物細胞における発現を制御可能である核酸配列;および(ii)アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする核酸配列を含むキメラ核酸コンストラクトを提供する段階;
(b)キメラ核酸コンストラクトを植物細胞に導入する段階;ならびに
(c)植物細胞を、アポリポタンパク質を発現する成熟植物体に成長させる段階。
(a)使用可能に連結された成分として5'→3'の転写方向に(i)植物の種子の細胞における発現を制御可能である核酸配列;および(ii)アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする核酸配列を含むキメラ核酸コンストラクトを提供する段階;
(b)キメラ核酸コンストラクトを植物細胞に導入する段階;ならびに
(c)植物細胞を、アポリポタンパク質を発現する種子をつけることが可能な成熟植物体に成長させる段階。
特に明記しない限り、本明細書で用いられる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される用語と同じ意味をもつ。可能であれば、本明細書で言及されたGenBank、SwissPro、および他のデータベースに登録された核酸およびポリペプチドの配列を含む全ての特許、特許出願、公開された特許出願、および他の出版物は、参照により全体が本明細書に組み入れられる。
本発明の方法および組成物で使用可能なアポリポタンパク質をコードする核酸配列は、任意のプロアポリポタンパク質およびプレプロアポリポタンパク質を含むアポリポタンパク質のポリペプチドをコードする任意の核酸配列である場合がある。
本発明に従って、キメラ核酸配列を植物細胞に導入し、細胞を、アポリポタンパク質のポリペプチドを発現する成熟植物体に成長させる。
(a)使用可能に連結された成分として5'→3'の転写方向に(i)植物の種子の細胞における発現を制御可能である核酸配列;および(ii)アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする核酸配列を含むキメラ核酸コンストラクトを提供する段階;
(b)キメラ核酸コンストラクトを植物細胞に導入する段階;
(c)植物細胞を成熟植物体に成長させる段階;ならびに
(d)植物体から、アポリポタンパク質を含む種子を得る段階。
(a)使用可能に連結された成分として5'→3'の転写方向に(i)植物の種子の細胞における発現を制御可能である核酸配列;および(ii)アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする核酸配列を含むキメラ核酸コンストラクトを提供する段階;
(b)キメラ核酸コンストラクトを植物細胞に導入する段階;
(c)植物細胞を成熟植物体に成長させ;かつ植物体からアポリポタンパク質を含む種子を得る段階;ならびに
(e)アポリポタンパク質を植物の種子成分から分離して、実質的に純粋なアポリポタンパク質を得る段階。
以下の実施例を説明目的で、制限する意図無く提供する。
アポリポタンパク質A-Iクローンの構築
Apo10
Apo10(SEQ ID NO:144)は、図3(A)、図3(B)、および図3(C)の手順で構築される、種子特異的に発現するように設計されたクローンである。図2に示すように、Apo10クローンは、成熟型Apo AIとGFPの融合タンパク質(SEQ ID NO:145)の発現を誘導する種子特異的なプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1186
でGFPの開始部位からNcoI切断部位を除去した(ベクターpVS-GFPに由来するテンプレート)。リバースプライマー1187
で停止コドンの後方にPstI、XbaI、およびHindIIIの切断部位を加える。PCR断片をTopoクローニングベクター(Invitrogen)のEcoRI切断部位に連結してプラスミドG1を得た(図3(A))。フォワードプライマー1190
でApo AIの成熟配列を増幅し、また遺伝子の開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1189
は、同じフレームにおけるGFPとの翻訳融合体(プラスミドG1)の作製を支援するために、遺伝子の停止コドンを除去してBamHI切断部位を加える。これらのプライマーのテンプレートは、ヒトのApo AI遺伝子のコード配列全体を含むpKS+ベースのベクター(Strategene)とした。PCR断片をTopoクローニングベクター(Invitrogen)のEcoRI切断部位に連結してプラスミドM2を得た。Apo AIの成熟配列を含むプラスミドM2を制限酵素NcoIおよびBamHIで切断した。GFPのコード配列を含むプラスミドG'1をBamHIおよびXbaIで切断した(図3(B)参照)。M2およびG'1の断片を、プラスミドSBS2090(図3(B)参照)のNcoIおよびXbaI切断部位にまとめて連結してプラスミド2M4を得た。プラスミド2M4をNcoIおよびHindIIIで切断してApo AI-GFP融合カセットを除去し、次に同断片を、バイナリベクターpSBS4006のNcoI/HindIII切断部位にクローン化するために使用した(図3(C)参照)。このプラスミドが、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)、およびアグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)を含むことに注目されたい。
Apo11(SEQ ID NO:150)は、図3(A)、図3(B)、および図3(C)の手順で構築された、種子特異的に発現するように設計されたクローンである。図2に示すように、Apo11クローンは、pro-Apo AIとGFPの融合タンパク質(SEQ ID NO:151)の発現を誘導する種子特異的なプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1186
でGFPの開始部位からNcoI切断部位を除去した(ベクターpVS-GFPに由来するテンプレート)。リバースプライマー1187
で、停止コドンの後方にPstI、XbaIおよびHindIIIの切断部位を加えた。PCR断片をTopoクローニングベクター(Invitrogen)のEcoRI切断部位に連結してプラスミドG1を得た(図3(A))。フォワードプライマー1191
でApo AIのプロ配列を増幅し、また遺伝子の開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1189
は、GFPとの翻訳融合体(プラスミドG1)の作製を支援するために、遺伝子の停止コドンを除去してBamHI切断部位を加える。これらのプライマーのテンプレートは、ヒトのApo AI遺伝子のコード配列全体を含むpKS+ベースのベクター(Strategene)とした。PCR断片をそれぞれ個別にTopoクローニングベクター(Invitrogen)のEcoRI切断部位に連結してプラスミドP2を得た。pro-Apo AI配列を含むプラスミドP2を制限酵素NcoIおよびBamHIで切断した。GFPのコード配列を含むプラスミドG'1をBamHIおよびXbaIで切断した(図3(B)参照)。P2およびG'1の断片を、プラスミドSBS2090のNcoIおよびXbaI切断部位(図3(B)参照)にまとめて連結してプラスミド2P5を得た。プラスミド2P5をNcoIおよびHindIIIで切断してpro-Apo AI-GFP融合カセットを除去し、次に同断片をバイナリベクターpSBS4006のNocI/HindIII切断部位にクローン化するために使用した(図3(C)参照)。このプラスミドが、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)、およびアグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)を含むことに注目されたい。
Apo12(SEQ ID NO:153)は、図3(A)、図3(B)、および図3(C)の手順で構築された、種子特異的に発現するように設計されたクローンである。図2に示すように、Apo12クローンは、オレオシン(van Rooijen, G.J., et al. Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179 (1992)、成熟型Apo AI、およびGFPの融合タンパク質(SEQ ID NO:154)の発現を誘導する種子特異的なプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1186
でGFPの開始部位からNcoI切断部位を除去した(ベクターpVS-GFPに由来するテンプレート)。リバースプライマー1187
で停止コドンの後方にPstI、XbaIおよびHindIII切断部位を加えた。PCR断片をTopoクローニングベクター(Invitrogen)のEcoRI切断部位に連結してプラスミドG1を得た(図3(A))。フォワードプライマー1190
でApo AIの成熟配列を増幅し、遺伝子の開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1189
は、同じフレームにおけるGFPとの翻訳融合体(プラスミドG1)の作製を支援するために、遺伝子の停止コドンを除去してBamHI切断部位を加える。これらのプライマーのテンプレートは、ヒトのApo AI遺伝子のコード配列全体を含むpKS+ベースのベクター(Strategene)とした。PCR断片をTopoクローニングベクター(Invitrogen)のEcoRI切断部位に連結してプラスミドM2を得た。Apo AIの成熟配列を含むプラスミドM2を制限酵素NcoIおよびBamHIで切断した。GFPのコード配列を含むプラスミドG'1をBamHIおよびXbaIで切断した(図3(B)参照)。M2およびG'1の断片を、プラスミドSBS2090(図3(B)参照)のNcoIおよびXbaI切断部位にまとめて連結してプラスミド2M4を得た。プラスミド2M4をNcoIおよびHindIIIで切断してApo AI-GFP融合カセットを除去し、次に同断片を、バイナリベクターpSBS4008のNcoI/HindIII切断部位にクローン化するために使用した(図3(C)参照))。このプラスミドが、Apo AI/GFP融合体の融合のために、シロイヌナズナのオレオシン遺伝子(van Rooijen G.J. et al. 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。
Apo13(SEQ ID NO:155)は、図3(A)、図3(B)、および図3(C)の手順で構築された、種子特異的に発現するように設計されたクローンである。図2に示すように、Apo13クローンは、オレオシン、pro-Apo AI、およびGFPの融合タンパク質(SEQ ID NO:156)の発現を誘導する種子特異的なプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1186
でGFPの開始部位からNcoI切断部位を除去した(ベクターpVS-GFPに由来するテンプレート)。リバースプライマー1187
で停止コドンの後方にPstI、XbaI、およびHindIIIの切断部位を加えた。PCR断片をTopoクローニングベクター(Invitrogen)のEcoRI切断部位に連結してプラスミドG1を得た(図3(A))。フォワードプライマー1191
でApo AIのプロ配列を増幅し、また遺伝子の開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1189
は、GFPとの翻訳融合体(プラスミドG1)の作製を支援するために、遺伝子の停止コドンを除去してBamHI切断部位を加える。これらのプライマーのテンプレートは、ヒトのApo AI遺伝子のコード配列全体を含むpKS+ベースのベクター(Strategene)とした。PCR断片をTopoクローニングベクター(Invitrogen)のEcoRI切断部位に個別に連結してプラスミドP2を得た。pro-Apo AI配列を含むプラスミドP2を制限酵素NcoIおよびBamHIで切断した。GFPのコード配列を含むプラスミドG'1をBamHIおよびXbaIで切断した(図3(B)参照)。P2およびG'1の断片を、プラスミドSBS2090のNcoIおよびXbaI切断部位にまとめて連結してプラスミド2P5を得た(図3(B)参照)。プラスミド2P5をNcoIおよびHindIIIで切断してpro-Apo AI-GFP融合カセットを除去し、次に同断片を、バイナリベクターpSBS4008のNocI/HindIII切断部位にクローン化するために使用した(図3(C)参照))。このプラスミドが、Apo AI/GFP融合体の融合のために、シロイヌナズナのオレオシン遺伝子(van Rooijen G.J. et al. 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。
Apo15(SEQ ID NO:157)は、図3(A)、図3(B)、および図3(D)の手順で構築された、種子特異的に発現するように設計されたクローンである。図2に示すように、Apo15クローンは、成熟型のApo AIとGFPの融合タンパク質(SEQ ID NO:158)の発現を誘導する種子特異的なプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。この融合タンパク質は、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチドを用いることで、分泌経路を介した発現が標的とされた(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1186
でGFPの開始部位からNcoI切断部位を除去した(ベクターpVS-GFPに由来するテンプレート)。リバースプライマー1187
で停止コドンの後方にPstI、XbaI、およびHindIIIの切断部位を加えた。PCR断片をTopoクローニングベクター(Invitrogen)のEcoRI切断部位に連結してプラスミドG1を得た(図3(A))。フォワードプライマー1190
でApo AIの成熟配列を増幅し、また遺伝子の開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1189
は、同じフレームにおけるGFPとの翻訳融合体(プラスミドG1)の作製を支援するために、遺伝子の停止コドンを除去してBamHI切断部位を加える。これらのプライマーのテンプレートは、ヒトのApo AI遺伝子のコード配列全体を含むpKS+ベースのベクター(Strategene)とした。PCR断片をTopoクローニングベクター(Invitrogen)のEcoRI切断部位に連結してプラスミドM2を得た。Apo AIの成熟配列を含むプラスミドM2を制限酵素NcoIおよびBamHIで切断した。GFPのコード配列を含むプラスミドG'1をBamHIおよびXbaIで切断した(図3(B)参照)。M2およびG'1の断片を、プラスミドSBS2090(図3(B)参照)のNcoIおよびXbaI切断部位に連結してプラスミド2M4を得た。プラスミド2M4をNcoIおよびHindIIIで切断してApo AI-GFP融合カセットを除去し、次に同断片を、バイナリベクターpSBS4011のNcoI/HindIII切断部位にクローン化するために使用した(図3(D)参照)。このプラスミドが、PRSシグナルペプチドと融合された、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。
Apo16(SEQ ID NO:159)は、図3(A)、図3(B)、および図3(D)の手順で構築された、種子特異的に発現されるように設計されたクローンである。図2に示すように、Apo16クローンは、pro-Apo AIとGFPの融合タンパク質(SEQ ID NO:160)の発現を誘導する種子特異的なプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。この融合タンパク質は、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチドを用いることで、分泌経路を介した発現が標的とされた(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1186
でGFPの開始部位からNcoI切断部位を除去した(ベクターpVS-GFPに由来するテンプレート)。リバースプライマー1187
で停止コドンの後方にPstI、XbaI、およびHindIII切断部位を加えた。PCR断片をTopoクローニングベクター(Invitrogen)のEcoRI切断部位に連結してプラスミドG1を得た(図3(A))。フォワードプライマー1191
でApo AIのプロ配列を増幅し、また遺伝子の開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1189
は、GFPとの翻訳融合体(プラスミドG1)の作製を支援するために、遺伝子の停止コドンを除去してBamHI切断部位を加える。これらのプライマーのテンプレートは、ヒトのApo AI遺伝子のコード配列全体を含むpKS+ベースのベクター(Strategene)とした。PCR断片をTopoクローニングベクター(Invitrogen)のEcoRI切断部位に個別に連結してプラスミドP2を得た。pro-Apo AI配列を含むプラスミドP2を制限酵素NcoIおよびBamHIで切断した。GFPのコード配列を含むプラスミドG'1をBamHIおよびXbaIで切断した(図3(B)参照)。P2およびG'1の断片を、プラスミドSBS2090(図3(B)参照)のNcoIおよびXbaI切断部位に連結してプラスミド2P5を得た。プラスミド2P5をNcoIおよびHindIIIで切断してpro-Apo AI-GFP融合カセットを除去し、次に同断片を、バイナリベクターpSBS4011のNcoI/HindIII切断部位にクローン化するために使用した(図3(D)参照)。このプラスミドが、PRSシグナルペプチドと融合されたインゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。
Apo17(SEQ ID NO:161)は、図4(A)の手順で構築された、構成的に発現されるように設計されたクローンである。図2に示すように、Apo17クローンは、Apo AIとGFPの融合タンパク質(SEQ ID NO:162)の発現を誘導する構成的なプロモーターおよびターミネーター(ユビキチン)を含む。このクローンを構築するために、プラスミド2M4(図3(B)参照)をNcoIおよびPstIで切断してApo AI-GFP融合カセットを除去し、同断片をプラスミドpKUO3'のNcoIおよびPstI切断部位に連結してプラスミドKU2M4を得た。pKUO3'プラスミドは、アブラナのオレオシン遺伝子を含む。この遺伝子は、ベクターをNcoIおよびPstIで切断すると除去されて、パセリのユビキチンプロモーターおよびユビキチンターミネーター(Kawalleck, P. et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 673-684)の制御を受けるApo AI/GFP融合コンストラクトが得られる。KU2M4プラスミドをKpnIで切断し、バイナリベクターSBS3000のKpnI切断部位に連結した(図4)。このプラスミドが、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)を含むことに注目されたい。Apo17クローンは成熟型Apo AI-GFP翻訳融合体を含み、細胞質に標的化される。
Apo18a(SEQ ID NO:163)は、図4の手順で構築された、構成的に発現されるように設計されたクローンである。図2に示すように、Apo18aクローンは、pro-Apo AIとGFPの融合タンパク質(SEQ ID NO:164)の発現を誘導する構成的なプロモーターおよびターミネーター(ユビキチン)を含む。このクローンを構築するために、プラスミド2P5(図3(B)参照)をNcoIおよびPstIで切断してpro-Apo AI-GFP融合カセットを除去し、同断片をプラスミドpKUO3'のNcoIおよびPstI切断部位に連結してプラスミドKU2P5を得た。pKUO3'プラスミドは、ベクターがNcoIおよびPstIで切断されると除去されて、パセリのユビキチンプロモーターおよびユビキチンターミネーター(Kawalleck, P. et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 673-684)の制御を受けるpro-Apo AI/GFP融合コンストラクトを生じるアブラナのオレオシン遺伝子を含む。KU2P5プラスミドをKpnIで切断し、バイナリベクターSBS3000のKpnI切断部位に連結した(図4)。このプラスミドが、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)を含むことに注目されたい。Apo18aクローンはpro-Apo AI-GFP翻訳融合体を含み、細胞質に標的化される。
Apo18b(SEQ ID NO:163)は、図4(B)の手順で構築された、構成的に発現されるように設計されたクローンである。図2に示すように、Apo18bクローンは、pro-Apo AIとGFPの融合タンパク質(SEQ ID NO:164)の発現を誘導する構成的なプロモーターおよびターミネーター(ユビキチン)を含む。クローンApo18aおよびApo18bのいずれもが、pro-Apo AIとGFPの融合タンパク質(SEQ ID NO:164)の発現を誘導する構成的プロモーター(ユビキチン)を有することに注目されたい。2つのクローンの差は、Apo18aが、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)を含むバイナリベクターpSBS3000のKpnI切断部位に挿入されているために生じる。これとは対照的にApo18bは、マンノースを含む選択用培地における正の選択を可能とするホスホマンノースイソメラーゼ(phosphomannnose isomerase)をコードするpmi遺伝子(Miles et al., 1984, Gene 21: 41-48)を含むバイナリベクターpSBS5001のKpnI切断部位に挿入される。pmi遺伝子は、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21: 673-684)の制御下にある。このクローンを構築するために、Apo18aバイナリベクターをKpnIで切断してpro-Apo AI-GFP融合カセットを除去し、同断片を、アグロバクテリウムで発現させるために、プラスミドSBS5001のKpnI切断部位に連結した。Apo18bクローンはpro-Apo AI-GFP翻訳融合体を含み、細胞質に標的化される。
Apo19(SEQ ID NO:165)は、図5(A)および図5(B)の手順で構築された、構成的に発現されるように設計されたクローンである。図2に示すように、Apo19クローンは、Apo AIとGFPの融合タンパク質(SEQ ID NO:166)の発現を誘導する構成的なプロモーターおよびターミネーター(ユビキチン)を含む。この融合タンパク質は、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチドを用いることで、分泌経路を介した発現が標的とされた(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)。このクローンを構築するために、Apo15をテンプレートとして使用する。フォワードプライマー1177
は、開始コドンにBspHI切断部位を含む植物のプレ配列(PRS)の開始部位を増幅する。リバースプライマー1178
は、GFPと同じフレームにおける翻訳融合体の作製を支援するために、遺伝子の停止コドンを除去してBamHI切断部位を加える。制限酵素による切断を容易にするために、両プライマーの末端に余分な塩基を残した。G1プラスミド(図3(A)参照)を、パセリのユビキチンプロモーターおよびターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21: 673-684)を含むpubiP+iS3'に連結させるためにBamHIおよびPstIで切断した。PRS-Apo AIのPCR断片をBspHIおよびBamHIで切断し、G1断片とともにプラスミドpubiP+iS3'に連結してプラスミド19-6を得た。プラスミド19-6をEcoRIで切断して発現カセットを除去し、次に同カセットをプラスミドpKUO3'KのEcoRI切断部位に連結して(既存のカセットを除去して)(図4(A))、プラスミドKU19-6を得た。KU19-6をKpnIで切断し、断片をプラスミドSBS3000のKpnI切断部位に連結した(図5(B))。このプラスミドが、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)を含むことに注目されたい。Apo19クローンは、成熟型Apo AI-GFP翻訳融合体を含み、それぞれ分泌経路に標的化される。
Apo20(SEQ ID NO:169)は、図5(A)および図5(B)の手順で構築された、構成的に発現されるように設計されたクローンである。図2に示すように、Apo20クローンは、pro-Apo AIとGFPの融合タンパク質(SEQ ID NO:170)の発現を誘導する構成的なプロモーターおよびターミネーター(ユビキチン)を含む。融合タンパク質の発現は、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、分泌系を介するように標的とされた。このクローンを構築するために、Apo16をテンプレートとして使用する。フォワードプライマー1177
は、開始コドンにBspHI切断部位を含む植物のプレ配列(PRS)の開始部位を増幅する。リバースプライマー1178
は、GFPと同じフレームにおける翻訳融合体の作製を支援するために、遺伝子の停止コドンを除去してBamHI切断部位を加える。制限酵素による切断を容易にするために、両プライマーの末端に余分な塩基を残した。G1プラスミド(図3(A)参照)を、パセリのユビキチンプロモーターおよびターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)を含むpubiP+iS3'に連結させるためにBamHIおよびPstIで切断した。PRS-pro-Apo AI PCR断片をBspHIおよびBamHIで切断し、G1断片とともにプラスミドpubiP+iS3'に連結してプラスミド20-11を得た。プラスミド20-11をEcoRIで切断して発現カセットを除去し、次に同カセットをプラスミドpKUO3'KのEcoRI切断部位に連結して(既存のカセットを除去して)(図4(A))、プラスミドKU20-11を得た。KU20-11をKpnIで切断し、断片をプラスミドSBS3000のKpnI切断部位に連結した(図5(B))。このプラスミドが、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)を含むことに注目されたい。Apo20クローンは、pro-Apo AI-GFP翻訳融合体を含み、それぞれ分泌経路に標的化される。
Apo21(SEQ ID NO:171)は、図6の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo21クローンは、Apo AI(SEQ ID NO:172)の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1203
で、成熟型Apo AIの開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1206
で停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。両プライマーとも、制限酵素による切断を容易にするために5'端に余分な塩基を含む。PCR断片をNcoIおよびHindIIIで切断し、プラスミドSBS2090に連結してプラスミド5-3を得た(図6)。プラスミド5-3をNcoIおよびHindIIIで切断し、Apo AI断片をSBS4006のNcoI/HindIII切断部位に連結した(図3(C))。SBS4006は、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)、およびアグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)を含む。Apo21は、Apo AIを種子特異的に細胞質に標的化するクローンである。
Apo22(SEQ ID NO:175)は、図7の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo22クローンは、pro-Apo AI(SEQ ID NO:176)の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1201
で、pro-Apo AIの開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1206
で停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。両プライマーとも、制限酵素による切断を容易にするために5'端に余分な塩基を含む。PCR断片をNcoIおよびHindIIIで切断し、プラスミドSBS2090(図3(B))に連結してプラスミド4-2を得た(図7)。プラスミド4-2をNcoIおよびHindIIIで切断し、pro-Apo AI断片をSBS4006のNcoI/HindIII切断部位に連結した(図3(C))。SBS4006は、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)、およびアグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)を含む。Apo22は、pro-Apo AIを種子特異的に細胞質に標的化するクローンである。
Apo23(SEQ ID NO:178)は、図6の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo23クローンは、oleosin/Apo AI(SEQ ID NO:179)の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1203
で、成熟型Apo AIの開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1206
で停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。両プライマーとも、制限酵素による切断を容易にするために5'端に余分な塩基を含む。PCR断片をNcoIおよびHindIIIで切断し、プラスミドSBS2090に連結してプラスミド5-3を得た(図6)。プラスミド5-3をNcoIおよびHindIIIで切断し、Apo AI断片をSBS4008のNcoI/HindIII切断部位に連結した(図3(C))。SBS4008は、シロイヌナズナのオレオシン遺伝子(van Rooijen G.J. et al. 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)、およびアグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)を含む。Apo23は、oleosin/Apo AIを種子特異的に油体に標的化するクローンである。
Apo24(SEQ ID NO:180)は、図7の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo24クローンは、oleosin/pro-Apo AI(SEQ ID NO:181)の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1201
で、pro-Apo AIの開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1206
で停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。両プライマーとも、制限酵素による切断を容易にするために5'端に余分な塩基を含む。PCR断片をNcoIおよびHindIIIで切断し、プラスミドSBS2090に連結してプラスミド4-2を得た(図7)。プラスミド4-2をNcoIおよびHindIIIで切断し、pro-Apo AI断片をSBS4008のNcoI/HindIII切断部位に連結した(図3(C))。SBS4008は、シロイヌナズナのオレオシン遺伝子(van Rooijen G.J. et al. 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al.、1983、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1897-1901)、およびアグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)を含む。Apo24は、oleosin/pro-Apo AIを種子特異的に油体に標的化するクローンである。
Apo25(SEQ ID NO:182)は、図6の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo25クローンは、oleosin/klip8/met/Apo AI(SEQ ID NO:183)の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。このコンストラクトは、キモシンによる融合タンパク質の切断を容易にするklip8切断配列(SEQ ID NO:143)を有する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1203
で、成熟型Apo AIの開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1206
で停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。両プライマーとも、制限酵素による切断を容易にするために5'端に余分な塩基を含む。PCR断片をNcoIおよびHindIIIで切断し、プラスミドSBS2090(図3(B))に連結してプラスミド5-3を得た(図6)。プラスミド5-3をNcoIおよびHindIIIで切断し、Apo AI断片をSBS4010のNcoI/HindIII切断部位に連結した(図7)。SBS4010は、シロイヌナズナのオレオシン遺伝子(van Rooijen G.J. et al. 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1897-1901)、およびklip8切断部位を含む。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo25は、oleosin/klip8/met/Apo AIを種子特異的に油体に標的化し、またklip8切断配列による精製を可能とするクローンである。
Apo26(SEQ ID NO:184)は、図7の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo26クローンは、oleosin/klip8/met/pro-Apo AI(SEQ ID NO:185)の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。このコンストラクトは、キモシンによる融合タンパク質の切断を容易にするklip8切断配列(SEQ ID NO:143)を有する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1201
で、pro-Apo AIの開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1206
で停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。両プライマーとも、制限酵素による切断を容易にするために5'端に余分な塩基を含む。PCR断片をNcoIおよびHindIIIで切断し、プラスミドSBS2090(図3(B))に連結してプラスミド4-2を得た(図7)。プラスミド4-2をNcoIおよびHindIIIで切断し、pro-met-Apo AI断片をSBS4010のBspHI/HindIII切断部位に連結した(図7)。SBS4010は、シロイヌナズナのオレオシン遺伝子(van Rooijen G.J. et al. 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1897-1901)、およびklip8切断部位を含む。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo26は、oleosin/klip8/met/pro-Apo AIを種子特異的に油体に標的化し、またklip8切断配列による精製を可能とするクローンである。
Apo27(SEQ ID NO:186)は、図8(A)の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo27クローンは、oleosin/klip8/Apo AI(SEQ ID NO:187)の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。Apo27は、シロイヌナズナのオレオシン配列(van Rooijen G.J. et al. 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)を用いることで、その発現が、油体を標的とされており、またキモシンによる融合タンパク質の切断を容易にするklip8切断配列(SEQ ID NO:143)を有する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1200
で、XhoI切断部位および追加のヌクレオチドを加え、pro-Apo AIの開始部位へのklip8切断配列(SEQ ID NO:143)の同じフレームでのクローニングを容易にする。リバースプライマー1206
で停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。これらのプライマーのテンプレートは、内部にXhoI切断部位を含まず、Met残基が追加された、プロ型のApo AIを含むApo33プラスミドとした。PCR断片をXhoIで切断し、pKS+のXhoI/EcoRV切断部位に連結してプラスミド6-3を得た。プラスミド6-3をXhoIおよびHindIIIで切断し、バイナリベクターSBS4010のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図7)。SBS4010が、シロイヌナズナのオレオシン遺伝子(van Rooijen G.J. et al. 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)、およびklip8切断部位を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo27は、Apo AIを種子特異的に油体に標的化し、またklip8切断配列による精製用を可能とするクローンである。
Apo27M(SEQ ID NO:189)は、図8(B)の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo27Mクローンは、oleosin/klip8/met/Apo AI-M(SEQ ID NO:190)の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。このコンストラクトは、キモシンによる融合タンパク質の切断を容易にするklip8切断配列(SEQ ID NO:143)を有する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1202
でXhoI切断部位および追加のヌクレオチドを加え、mat-Apo AIの開始部位におけるklip8切断配列と同じフレームにおけるクローニングを容易にした。フォワードプライマー1225
は、Arg残基をCys残基に代えるためにC→Tの塩基対変異を導入する平滑末端のプライマーである。リバースプライマー1206
は、停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。両プライマーとも、制限酵素による切断を容易にするために、5'端に余分な塩基を含むようにした。これらのプライマーのテンプレートは、XhoI切断部位に既に変異が導入されたプラスミドP-10とした。2本鎖のテンプレートはDpnIで切断して除去した。PCR断片をXhoIおよびHindIIIで切断し、プラスミドpKS+のXhoI/HindIII切断部位に連結してプラスミドApoMを得た。ApoMをXhoIおよびHindIIIで切断し、断片をプラスミドSBS4010のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図7)。SBS4010は、シロイヌナズナのオレオシン遺伝子(van Rooijen G.J. et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)、およびklip8切断部位を含む。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo27Mは、oleosin/klip8/met/Apo AI-Mを種子特異的に油体に標的化し、またklip8切断配列による精製を可能とするクローンである。
Apo28(SEQ ID NO:193)は、図9の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo28クローンは、oleosin/klip8/pro-Apo AI(SEQ ID NO:194)の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1200
でXhoI切断部位および追加のヌクレオチドを加え、klip8切断配列とpro-Apo AIの開始部位との同じフレームにおけるクローニングを容易にした。フォワードプライマー1205
は、第1のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える平滑末端のプライマーである。リバースプライマー1206
は、停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。両プライマーとも、制限酵素による切断を容易にするために5'端に余分な塩基を含むようにした。これらのプライマーのテンプレートは、ヒトのApo AI遺伝子のコード配列全体を含むpKS+ベースのベクター(Stratagene)とした。2本鎖のテンプレートはDpnIで切断して除去した。PCR断片をXhoIおよびHindIIIで切断し、プラスミドpKS+のXhoI/HindIII切断部位に連結してプラスミドP-10を得た。P-10をXhoIおよびHindIIIで切断し、断片をプラスミドSBS4010のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図7)。SBS4010が、シロイヌナズナのオレオシン遺伝子(van Rooijen G.J. et al. 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)、およびklip8切断部位を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo28は、油体に標的化され、またklip8配列で切断されうるpro-Apo AIクローンである。
Apo29(SEQ ID NO:196)は、図6の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo29クローンは、PRS-Apo AI(SEQ ID NO:197)の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。Apo29は、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされた。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1203
で、成熟型Apo AIの開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1206
は、停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。両プライマーとも、制限酵素による切断を容易にするために5'端に余分な塩基を含むようにした。PCR断片をNcoIおよびHindIIIで切断し、プラスミドSBS2090に連結してプラスミド5-3を得た(図6)。プラスミド5-3をNcoIおよびHindIIIで切断し、Apo AI断片をSBS4011のNcoI/HindIII切断部位に連結した(図3D)。SBS4011は、シロイヌナズナのオレオシン遺伝子(van Rooijen G.J. et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター、およびPRSシグナルペプチド(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1897-1901)を含む。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo29は、Apo AIを種子特異的に分泌経路に標的化するクローンである。
Apo30(SEQ ID NO:198)は、図7の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo30クローンは、PRS-pro-Apo AI(SEQ ID NO:199)の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。pro-Apo AIは、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされた。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1201
で、pro-Apo AIの開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1206
は、停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。両プライマーとも、制限酵素による切断を容易にするために、5'端に余分な塩基を含むようにした。PCR断片をNcoIおよびHindIIIで切断し、プラスミドSBS2090に連結してプラスミド4-2を得た(図7)。プラスミド4-2をNcoIおよびHindIIIで切断し、Apo AI断片をpSBS4011のNcoI/HindIII切断部位に連結した(図3D)。SBS4011は、シロイヌナズナのオレオシン遺伝子(van Rooijen G.J. et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179)の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター、およびPRSシグナルペプチド(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)を含む。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo30は、pro-Apo AIを種子特異的に分泌経路に標的化するクローンである。
Apo31(SEQ ID NO:200)は、図8(A)の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo28クローンは、PRS/D9 scFV/Apo AI(SEQ ID NO:201)融合タンパク質の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。D9 ScFV/Apo AIは、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされた。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1200
で、pro-Apo AIの開始部位にXhoI切断部位を加える。リバースプライマー1206
は、停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。これらのプライマーのテンプレートは、内部にXhoI切断部位が無く、追加のMet残基を含む、プロ型のApo AIを含むApo33プラスミドとした。PCR断片をXhoIで切断し、pKS+のXhoI/EcoRV切断部位に連結してプラスミド6-3を得た。プラスミド6-3をXhoIおよびHindIIIで切断し、バイナリベクターSBS4055のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図9)。SBS4055が、D9 scFV/Apo AI挿入部分と同じフレームで融合したPRSシグナル配列の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo31は、Apo AIを種子特異的に分泌経路に標的化し、またオレオシンD9 scFV抗体による精製を可能とするクローンである。
Apo32(SEQ ID NO:202)は、図9の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo32クローンは、D9 scFV/pro-Apo AI(SEQ ID NO:203)の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1200
で、pro-Apo AIの開始部位にXhoI切断部位を加える。フォワードプライマー1205
は、第1のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える平滑末端のプライマーである。リバースプライマー1206
は、停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。両プライマーとも、制限酵素による切断を容易にするために、5'端に余分な塩基を含むようにした。これらのプライマーのテンプレートは、ヒトのApo AI遺伝子のコード配列全体を含むpKS+ベースのベクター(Stratagene)とした。2本鎖のテンプレートはDpnIで切断して除去した。PCR断片をXhoIおよびHindIIIで切断し、プラスミドpKS+のXhoI/HindIII切断部位に連結してプラスミドP-10を得た。P-10をXhoIおよびHindIIIで切断し、断片をプラスミドSBS4055のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図9)。SBS4055が、D9 scFV抗体と同じフレームで融合したPRSシグナル配列の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo32は、pro-Apo AIを分泌経路に標的化するクローンであり、精製を容易にするために、オレオシン抗体D9と同じフレームで融合されている。
Apo33(SEQ ID NO:204)は、図10の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo33クローンは、PRS/D9 scFV/met/Apo AI/(SEQ ID NO:205)融合タンパク質の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。D9 ScFV/met/Apo AIは、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされた。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1203
で、成熟型Apo AIの開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1206
は、停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。両プライマーとも、制限酵素による切断を容易にするために、5'端に余分な塩基を含むようにした。これらのプライマーのテンプレートは、内部にXhoI切断部位を含まないプロ型のApo AIを含むP-10プラスミドとした(図9)。PCR断片をNcoIおよびHindIIIで切断し、pSBS2090のNcoI/HindIII切断部位に連結してプラスミド20-2を得た。このプラスミドをNcoIおよびHindIIIで切断し、断片をpSBS4010ベクターのBspHI/HindIII切断部位に連結してプラスミド4010+20-2を得た。このプラスミドをXhoIおよびHindIIIで切断し、断片をバイナリベクターSBS4055のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図10)。SBS4055が、D9 scFV抗体と同じフレームで融合したPRSシグナル配列の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo33は、Apo AIを分泌経路に標的化し、また精製を容易にするために、オレオシン抗体D9と同じフレームで融合された種子特異的なクローンである。
Apo34(SEQ ID NO:206)は、図10の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo34クローンは、PRS/D9 scFV/met/pro-Apo AI/(SEQ ID NO:207)融合タンパク質の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。D9 ScFV/met/pro-Apo AIは、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされた。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1201
で、pro-Apo AIの開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1206
は、停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。両プライマーとも、制限酵素による切断を容易にするために、5'端に余分な塩基を含むようにした。これらのプライマーのテンプレートは、内部にXhoI切断部位を含まないプロ型のApo AIを含むP-10プラスミドとした(図9)。PCR断片をNcoIおよびHindIIIで切断し、SBS2090のNcoI/HindIII切断部位に連結してプラスミド19-2を得た(図3(B))。このプラスミドをNcoIおよびHindIIIで切断し、断片をSBS4010ベクターのBspHI/HindIII切断部位に連結してプラスミド4010+19-2を得た。このプラスミドをXhoIおよびHindIIIで切断し、断片をバイナリベクターSBS4055のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図10)。SBS4055が、D9 scFV抗体と同じフレームで融合したPRSシグナル配列の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo34は、met/pro-Apo AIを分泌経路に標的化し、また精製を容易にするために、オレオシン抗体D9と同じフレームで融合された種子特異的なクローンである。
Apo35(SEQ ID NO:208)は、図8の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo35クローンは、PRS/D9 scFV/Apo AI/KDEL(SEQ ID NO:209)融合タンパク質の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。D9 ScFV/Apo AIは、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされ、またポリペプチドをERに保持するためにKDEL保持シグナル(Munro and Pelham, 1987, Cell 48: 899-907)を使用する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1200
で、pro-Apo AIの開始部位にXhoI切断部位を加える。リバースプライマー1208
は、停止コドンの前方にKDEL配列を加え、また停止コドンの後方にHindIII切断部位を加える。これらのプライマーのテンプレートは、内部にXhoI切断部位を含まず、Met残基が追加された、プロ型のApo AIを含むApo33プラスミドとした。PCR断片をXhoIで切断し、pKS+のXhoI/EcoRV切断部位に連結してプラスミド8-5を得た。プラスミド8-5をXhoIおよびHindIIIで切断し、バイナリベクターSBS4055のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図9)。SBS4055が、D9 scFV挿入配列と同じフレームで融合したPRSシグナル配列の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo35は、Apo AIを種子特異的に分泌経路に標的化してERにとどまらせ、またオレオシンD9 scFV抗体による精製を可能とするクローンである。
Apo36(SEQ ID NO:211)は、図11の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo36クローンは、PRS/D9 scFV/pro-Apo AI/KDEL(SEQ ID NO:212)融合タンパク質の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。D9 ScFV/pro-Apo AIは、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされ、またポリペプチドをERに保持するためにKDEL保持シグナル(Munro and Pelham, 1987, Cell 48: 899-907)を使用する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1200
で、klip8切断配列への同じフレームにおけるクローニングを容易にするために、pro-Apo AIの開始部位にXhoI切断部位および追加のヌクレオチドを加える。リバースプライマー1208
は、停止コドンの前方にKDEL配列を加え、また停止コドンの後方にHindIII切断部位を加える。これらのプライマーのテンプレートは、内部にXhoI切断部位を含まないプロ型のApo AIを含むP-10プラスミドとした(図9)。PCR断片をXhoIおよびHindIIIで切断し、pKS+のXhoI/HindIII切断部位に連結してプラスミド7-12を得た。プラスミド7-12をXhoIおよびHindIIIで切断し、バイナリベクターSBS4055のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図9)。SBS4055が、D9 scFV挿入配列と同じフレームで融合したPRSシグナル配列の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo36は、分泌経路に標的化されるpro-Apo AIを種子特異的に発現させるクローンであり、オレオシン抗体D9と同じフレームで融合されており、またKDELシグナルペプチドのために小胞体に蓄積する。
Apo37(SEQ ID NO:213)は、図12の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo37クローンは、PRS/D9 scFV/met/Apo AI/KDEL(SEQ ID NO:214)融合タンパク質の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。D9 ScFV/met/Apo AIは、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされ、またポリペプチドをERに保持するためにKDEL保持シグナル(Munro and Pelham, 1987, Cell 48: 899-907)を使用する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1203
で、成熟型Apo AIの開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1208
は、停止コドンの前方にKDEL配列を加え、また停止コドンの後方にHindIII切断部位を加える。これらのプライマーのテンプレートは、内部にXhoI切断部位を含まないプロ型のApo AIを含むP-10プラスミドとした(図9)。PCR断片をpKS+プラスミドのEcoRV切断部位に連結してプラスミド10-2を得た。このプラスミドをNcoIおよびHindIIIで切断し、断片をSBS4010ベクターのBspHI/HindIII切断部位に連結してプラスミド4010+10-2を得た。このプラスミドをXhoIおよびHindIIIで切断し、断片をバイナリベクターSBS4055のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図9)。SBS4055が、D9 scFV挿入配列と同じフレームで融合したPRSシグナル配列の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo37は、met/Apo AIを分泌経路に標的化するクローンであり、オレオシン抗体D9と同じフレームで融合されており、またKDELシグナルペプチドのために小胞体に蓄積する。
Apo38(SEQ ID NO:215)は、図12の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo38クローンは、PRS/D9 scFV/met/pro-Apo AI/KDEL(SEQ ID NO:216)融合タンパク質の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。D9 ScFV/met/pro-Apo AIは、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされ、またポリペプチドをERに保持するためにKDEL保持シグナル(Munro and Pelham, 1987, Cell 48: 899-907)を使用する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1201
で、成熟型Apo AIの開始部位にNcoI切断部位を加える。リバースプライマー1208
は、停止コドンの前方にKDEL配列を加え、また停止コドンの後方にHindIII切断部位を加える。これらのプライマーのテンプレートは、内部にXhoI切断部位を含まないプロ型のApo AIを含むP-10プラスミドとした(図9)。PCR断片をpKS+プラスミドのEcoRV切断部位に連結してプラスミド9-2を得た。このプラスミドをNcoIおよびHindIIIで切断し、断片をSBS4010ベクターのBspHI/HindIII切断部位に連結してプラスミド4010+9-2を得た。このプラスミドをXhoIおよびHindIIIで切断し、断片をバイナリベクターSBS4055のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図9)。SBS4055が、D9 scFV挿入配列と同じフレームで融合したPRSシグナル配列の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo38は、met/pro-Apo AIを分泌経路に標的化するクローンであり、オレオシン抗体D9と同じフレームで融合されており、またKDELシグナルペプチドのために小胞体に蓄積する。
Apo39(SEQ ID NO:217)は、図13の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo39クローンは、PRS/D9 scFV/klip8/Apo AI(SEQ ID NO:218)融合タンパク質の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。D9 ScFV/klip8/Apo AIは、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされ、またERに保持するためにKDEL保持シグナル(Munro and Pelham, 1987, Cell 48: 899-907)を、ポリペプチドを使用する。このクローンは、キモシンによる融合タンパク質の切断を容易にするためにklip8切断配列(SEQ ID NO:143)を有する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1207
で、開始コドンにSalI切断部位を加える。リバースプライマー1206
は、停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える(klip8の開始部位を増幅する)。PCR反応のテンプレートはプラスミドApo27とした(図8(A))。PCR産物をSalIおよびHindIIIで切断し、pKS+に連結してプラスミド13-1を得た。このプラスミドをSalIおよびHindIIIで切断し、プラスミドSBS4055のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図9)。SBS4055が、D9 scFV挿入配列と同じフレームで融合したPRSシグナル配列の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo39は、分泌経路に標的化されるD9 scFV/klip8/Apo AIの種子に好ましい発現を可能とするクローンである。Apo AIの精製は、油体表面のオレオシンに対する親和性を有するD9 scFV抗体を用いて達成される。このタンパク質は、klip8切断部位を切断するキモシンで切断される。
Apo40(SEQ ID NO:220)は、図13の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo40クローンは、PRS/D9 scFV/klip8/pro-Apo AI(SEQ ID NO:221)融合タンパク質の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。D9 ScFV/klip8/pro-Apo AIは、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされた。このクローンは、キモシンによる融合タンパク質の切断を容易にするためにklip8切断配列(SEQ ID NO:143)を有する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1207
で、開始コドンにSalI切断部位を加える。リバースプライマー1206
は、停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。PCR反応のテンプレートはプラスミドApo27とした(図8(A))。PCR産物をSalIおよびHindIIIで切断し、pKS+に連結してプラスミド14-5を得た。このプラスミドをSalIおよびHindIIIで切断し、プラスミドSBS4055のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図9)。SBS4055が、D9 scFV挿入配列と同じフレームで融合したPRSシグナル配列の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo40は、分泌経路に標的化されるD9 scFV/klip8/pro-Apo AIの種子に好ましい発現を可能とするクローンである。pro-Apo AIの精製は、油体表面のオレオシンに対する親和性を有するD9 scFV抗体を用いて達成される。このタンパク質は、klip8切断部位を切断するキモシンで切断される。
Apo41(SEQ ID NO:222)は、図14の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo41クローンは、PRS/D9 scFV/klip8/met/Apo AI(SEQ ID NO:223)融合タンパク質の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。D9 ScFV/klip8/met/Apo AIは、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされた。このクローンは、キモシンによる融合タンパク質の切断を容易にするためにklip8切断配列(SEQ ID NO:143)を有する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1207
でklip8配列の開始部位を増幅し、開始コドンにSalI切断部位を加える。リバースプライマー1206
は、停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。PCR反応のテンプレートはプラスミドApo25とした(図6)。PCR産物をSalIおよびHindIIIで切断し、pKS+に連結してプラスミド11-1を得た。このプラスミドをSalIおよびHindIIIで切断し、バイナリベクターSBS4055のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図9)。SBS4055が、D9 scFV挿入配列と同じフレームで融合したPRSシグナル配列の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo41は、分泌経路に標的化されるD9 scFV/klip8/met/Apo AIの種子に好ましい発現を可能とするクローンである。met/Apo AIの精製は、油体表面のオレオシンに対する親和性を有するD9 scFV抗体を用いて達成される。このタンパク質は、klip8切断部位を切断するキモシンで切断される。
Apo42(SEQ ID NO:224)は、図14の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo42クローンは、PRS/D9 scFV/klip8/met/pro-Apo AI(SEQ ID NO:225)融合タンパク質の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。D9 ScFV/klip8/met/pro-Apo AIは、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされた。このクローンは、キモシンによる融合タンパク質の切断を容易にするためにklip8切断配列(SEQ ID NO:143)を有する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1207
でklip8配列の開始部位を増幅し、開始コドンにSalI切断部位を加える。リバースプライマー1206
は、停止コドンの後方にHindIII切断部位を加え、また第2のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える。PCR反応のテンプレートはプラスミドApo26とした(図7)。PCR産物をSalIおよびHindIIIで切断し、pKS+に連結してプラスミド12-1を得た。このプラスミドをSalIおよびHindIIIで切断し、バイナリベクターSBS4055のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図9)。SBS4055が、D9 scFV挿入配列と同じフレームで融合したPRSシグナル配列の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo42は、分泌経路に標的化されるD9 scFV/klip8/met/pro-Apo AIの種子に好ましい発現を可能とするクローンである。met/Apo AIの精製は、油体表面のオレオシンに対する親和性を有するD9 scFV抗体を用いて達成される。このタンパク質は、klip8切断部位を切断するキモシンで切断される。
Apo43(SEQ ID NO:226)は、図13の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo43クローンは、PRS/D9 scFV/klip8/Apo AI/KDEL(SEQ ID NO:227)融合タンパク質の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。D9 ScFV/klip8/Apo AIは、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされ、またポリペプチドをERに保持するためにKDEL保持シグナル(Munro and Pelham, 1987, Cell 48: 899-907)を使用する。このクローンは、キモシンによる融合タンパク質の切断を容易にするklip8切断配列(SEQ ID NO:143)を有する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1207
で、開始コドンにSalI切断部位を加える。リバースプライマー1208
は、停止コドンの前方にKDEL配列を加え、また停止コドンの後方にHindIII切断部位を加える。PCR反応のテンプレートはプラスミドApo27とした(図8(A))。PCR産物をSalIおよびHindIIIで切断し、pKS+に連結してプラスミド17-1を得た。このプラスミドをSalIおよびHindIIIで切断し、プラスミドSBS4055のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図9)。SBS4055が、D9 scFV挿入配列が同じフレームで融合したPRSシグナル配列の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo43は、分泌経路に標的化されるD9 scFV/klip8/Apo AI/KDELの種子に好ましい発現を可能とするクローンである。Apo43は、KDELシグナルペプチドのためにERに蓄積する。Apo AIの精製は、油体表面のオレオシンに対する親和性を有するD9 scFV抗体を用いて達成される。このタンパク質は、klip8切断部位を切断するキモシンで切断される。
Apo44(SEQ ID NO:228)は、図13の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo44クローンは、PRS/D9 scFV/klip8/pro-Apo AI/KDEL(SEQ ID NO:229)融合タンパク質の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。D9 ScFV/klip8/pro-Apo AI/KDELは、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされ、またポリペプチドをERに保持するためにKDEL保持シグナル(Munro and Pelham, 1987, Cell 48: 899-907)を使用する。このクローンは、キモシンによる融合タンパク質の切断を容易にするklip8切断配列(SEQ ID NO:143)を有する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1207
配列で、開始コドンにSalI切断部位を加える。リバースプライマー1208
は、停止コドンの前方にKDEL配列を加え、また停止コドンの後方にHindIII切断部位を加える。PCR反応のテンプレートはプラスミドApo28とした(図9)。PCR産物をSalIおよびHindIIIで切断し、pKS+に連結してプラスミド18-2を得た。このプラスミドをSalIおよびHindIIIで切断し、プラスミドSBS4055のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図9)。SBS4055が、D9 scFV挿入配列が同じフレームで融合したPRSシグナル配列の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo44は、分泌経路に標的化されるD9 scFV/klip8/pro-Apo AI/KDELの種子に好ましい発現を可能とするクローンである。Apo44は、KDELシグナルペプチドのためにERに蓄積する。pro-Apo AIの精製は、油体表面のオレオシンに対する親和性を有するD9 scFV抗体を用いて達成される。このタンパク質は、klip8切断部位を切断するキモシンで切断される。
Apo45(SEQ ID NO:230)は、図14の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo45クローンは、PRS/D9 scFV/klip8/met/Apo AI/KDEL(SEQ ID NO:231)融合タンパク質の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。D9 ScFV/klip8/met/Apo AIは、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされ、またポリペプチドをERに保持するためにKDEL保持シグナル(Munro and Pelham, 1987, Cell 48: 899-907)を使用する。このクローンは、キモシンによる融合タンパク質の切断を容易にするklip8切断配列(SEQ ID NO:143)を有する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1207
でklip8配列の開始部位を増幅し、開始コドンにSalI切断部位を加える。リバースプライマー1208
は、停止コドンの前方にKDEL配列を加え、また停止コドンの後方にHindIII切断部位を加える。PCR反応のテンプレートはプラスミドApo25とした(図6)。PCR産物をSalIおよびHindIIIで切断し、pKS+に連結してプラスミド15-1を得た。このプラスミドをSalIおよびHindIIIで切断し、バイナリベクターSBS4055のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図9)。SBS4055が、D9 scFV挿入配列が同じフレームで融合したPRSシグナル配列の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sc. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo45は、分泌経路に標的化されるD9 scFV/klip8/met/Apo AI/KDELの種子に好ましい発現を可能とするクローンである。Apo45は、KDELシグナルペプチドのためにERに蓄積する。Apo AIの精製は、油体表面のオレオシンに対する親和性を有するD9 scFV抗体を用いて達成される。このタンパク質は、klip8切断部位を切断するキモシンで切断される。
Apo46(SEQ ID NO:232)は、図14の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo46クローンは、PRS/D9 scFV/klip8/met/pro-Apo AI/KDEL(SEQ ID NO:233)融合タンパク質の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(ファゼオリン)を含む。D9 ScFV/klip8/met/pro-Apo AIは、タバコの感染特異的配列(PRS)のシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を用いることで、その発現が分泌経路を標的とされ、またKDEL保持シグナル(Munro and Pelham, 1987, Cell 48: 899-907)を、ポリペプチドをERに保持するために使用する。このクローンは、キモシンによる融合タンパク質の切断を容易にするklip8切断配列(SEQ ID NO:143)を有する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1207
でklip8配列の開始部位を増幅し、開始コドンにSalI切断部位を加える。リバースプライマー1208
は、停止コドンの前方にKDEL配列を加え、また停止コドンの後方にHindIII切断部位を加える。PCR反応のテンプレートはプラスミドApo26とした(図7)。PCR産物をSalIおよびHindIIIで切断し、pKS+に連結してプラスミド16-4を得た。このプラスミドをSalIおよびHindIIIで切断し、バイナリベクターSBS4055のXhoI/HindIII切断部位に連結した(図9)。SBS4055が、D9 scFV挿入配列が同じフレームで融合したPRSシグナル配列の発現を制御する、インゲンマメのβ-ファゼオリンプロモーター/ターミネーター(Slightom et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1897-1901)を含むことに注目されたい。このプラスミドはまた、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684)によって誘導される、宿主植物にホスフィノトリシン耐性をもたらすpat遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70: 25-37)も含む。Apo46は、分泌経路に標的化されてERに保持されるD9 scFV/klip8/met/pro-Apo AIの種子に好ましい発現を可能とするクローンである。Apo AIの精製は、油体表面のオレオシンに対する親和性を有するD9 scFV抗体を用いて達成される。このタンパク質は、klip8切断部位を切断するキモシンを用いて切断される。
Apo47(SEQ ID NO:234)は、図15の手順で構築される、種子に好ましいクローンである。図2に示すように、Apo47クローンは、トウモロコシのoleosin/klip8/met/Apo AI(SEQ ID NO:235)の発現を誘導する、種子に好ましいプロモーターおよびターミネーター(リニン)を含む。このコンストラクトは、キモシンによる融合タンパク質の切断を容易にするklip8切断配列(SEQ ID NO:143)を有する。このクローンを構築するために、フォワードプライマー1226
で、klip8/met/Apo AIとの同じフレームの翻訳融合体の作製を支援するために、遺伝子の停止コドンを除去してHindIII切断部位を加えるリバースプライマー1227
と組み合わせて、pSBS2377に由来するトウモロコシのオレオシンのコード配列を増幅し、遺伝子の開始部位にNcoI切断部位を加える。Apo25のklip8/met/Apo AIのコード配列を、配列を増幅して遺伝子の開始部位にHindIII切断部位を加えるフォワードプライマー1228
で増幅する。リバースプライマー1229
は、停止コドンの後方にBamHI切断部位を加える。トウモロコシのオレオシンのcDNAおよびklip8/met/Apo AIを含むPCR断片を、Topoクローニングベクター(Invitrogen)のEcoRI切断部位に連結した。プラスミドMzOleoを制限酵素NcoIおよびHindIIIで切断した。プラスミドklip8/met/Apo AIをHindIIIおよびBamHIで切断した。MzOleoおよびklip8/met/Apo AIの断片をプラスミドSBS5709のNcoIおよびBamHI切断部位に連結してプラスミドApo47を得た。pSBS5709は、WO 01/16340に記載されたリニンプロモーター/ターミネーターをマルチクローニングサイトの内部に含む。pSBS5709はまた、マンノースを含む選択用培地における正の選択を可能とするホスホマンノースイソメラーゼをコードするpmi遺伝子(Miles et al., 1984, Gene 21: 41-48)も含む。pmi遺伝子は、アグロバクテリウムによる形質転換用に、パセリのユビキチンプロモーター/ターミネーター(Kawalleck et al., 1993, Plant Mol. Biol., 21: 673-684)の制御下にある。Apo47は、トウモロコシのoleosin/klip8/met/Apo AIを種子特異的に油体に標的化し、またklip8切断配列による精製を可能とするクローンである。
アグロバクテリウムおよびシロイヌナズナによる形質転換
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana cv. Columbia(C24))を全ての実験に使用する。種子を4インチのポット内の土壌混合物(3分の2がRedi-earthで3分の1がパーライト、pH=6.7)、またはLehle Seeds社から入手したシロイヌナズナ用の土壌混合物(パーライト、バーミュキュライト、ピート、terra-green、pH=5.5)の表面に撒く。実生を、ロゼット期の6〜8枚の葉の直径が約2.5 cmとなるまで成長させる。これらの実生を、上記の土壌混合物を含む4インチのポットに移し、メッシュに直径1 cmの5個の孔(四隅に各1個と中心に1個)を開けた窓網戸材で覆う。このポットを4℃で4日間、ドーム内に静置して冷処理を行った後に、約150μEの定常光を照射して相対湿度が50%の成長室(設定温度24℃)に移す。植物体に水を2〜3日間隔で与え、肥料(1%のPeters20-20-20)を週に1回与える。個々のポットに5つの植物体が植えられる。植物体が高さ約2 cmに達したら、一次花茎(bolt)を切って二次花茎および三次花茎の成長を促す。一次花茎を切った4〜5日後に、植物体にアグロバクテリウムを感染させる準備が整う。プラスミドは、電気的にコンピテントなアグロバクテリウムEHA101に導入した。シロイヌナズナ植物を植えたポットを逆さにし、対象となる植物形質用転換ベクターを含むアグロバクテリウムの一晩培養物の500 mLの再懸濁物に20秒間感染させる。アグロバクテリウム培養物が5%のショ糖および0.05%の界面活性剤Silwet L-77(Lehle Seeds)を含むことが極めて重要である。次にポットを、透明なプラスチック製のドームで24時間覆い、高湿度条件で維持する。植物体を成熟するまで成長させ、種子(非形質転換のものと、形質転換したもの)を回収する。トランスジェニック系列の選択に関しては、推定形質転換種子を70%エタノールで速やかに洗浄して滅菌した後に、20%の市販の漂白剤で15分間処理し、さらにddH2Oで少なくとも4回洗浄する。約1000個の滅菌済み種子を0.6%のトップアガーと混合し、0.5%のショ糖と80μMの除草剤フォスフィノスリシン(PPT)DLを含む半強度のMSプレート(Murashige and Skoog, 1962, Physiologia Plantarum 15: 473-497)に均一に拡散させる。次にプレートを光照射条件が暗8時間と明16時間の成長室(24℃)に静置する。7〜10日後に、推定トランスジェニック実生は緑色を呈していて成長途上であるが、非形質転換実生は漂白されている。根が確立した後に、推定トランスジェニック実生を個別にポットに移して(個々の植物体に3日間隔で水を与え、肥料として1%のPeters 20-20-20を5日間隔で与える)、成熟するまで成長させる。ポットを透明なプラスチック製ドームで3日間覆い、感受性のある実生を保護する。7日後に実生を、Lehle Seeds社製の種子収集機で覆い、散乱による種子の喪失を避ける。これらのトランスジェニック植物から得られた種子を個別に回収し、解析の準備が整う。
シロイヌナズナの葉を液体窒素で凍結し、1.5 ml容の微量遠心用チューブ内でドリルを用いて破砕した。200〜250μlの0.5 M Tris-HCl(pH 7.5)を添加し、試料を氷上に置いた。20% SDSを最終濃度が2%となるように添加した。試料を5分間煮沸し、抽出物を遠心器で、その最大速度で5分間、遠心した。液体を別の微量遠心用チューブに移し、-20℃で保存した。可溶性のタンパク質を、BCAタンパク質アッセイ法(Pierce)で定量し、15% SDS-PAGEと、続くウェスタンブロッティングで解析した。抗Apo AIまたは抗GFPのウサギ抗血清を一次抗体として使用し、また抗ウサギ-IgG[H+L]-APコンジュゲート(Bio-Rad)を二次抗体として使用した。
シロイヌナズナの約40個の種子(T2種子)を、微量遠心用チューブ内で50 μLの緩衝液(50 mM Tris、pH 7.5)中でStir-Pak実験用ミキサーを用いて破砕した。次に20% SDSを試料に、最終濃度が2%となるように添加し、試料を5分間煮沸し、最大速度で5分間遠心した。SDS-PAGEゲルへのローディングの際には、SDS-PAGE用の2Xローディング緩衝液(100 mM Tris pH 6.8、20%グリセロール、4% SDS、2 mg/mLブロモフェノールブルー、200 mM DTT)、および1 M DTTを試料に添加し、5分間煮沸し、最大速度で2分間遠心した。
アポリポタンパク質の発現のウェスタンブロット解析
構成的発現
Apo17
実施例1に示すように、Apo17(SEQ ID NO:27)は成熟型Apo AIとGFPの融合タンパク質である。このコンストラクトの構成的発現には、ユビキチンプロモーターおよびターミネーターを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図16(A))では、12クローン中9クローンについて、総葉抽出物中に極めて少量(総葉タンパク質の0.1%未満)のApo-AI/GFP融合タンパク質が、分子量が約55 kDaの位置に検出された。しかし、検討した12クローン中11クローンについて、総種子抽出物中にApo17融合タンパク質の実質的な発現(総種子タンパク質の少なくとも1%)が、約55 kDaの位置に検出された(図16(B))。
実施例1に示すように、Apo18(SEQ ID NO:29)はpro-Apo AIとGFPの融合タンパク質である。このコンストラクトの発現には、ユビキチンプロモーターおよびターミネーターを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図17(A))では、検討した12クローン中3クローンについて、総葉抽出物中に極めて少量(総葉タンパク質の0.1%未満)のpro-Apo AI/GFP融合タンパク質が、分子量が約56 kDaの位置に検出された。しかし、検討した全クローンについて、総種子抽出物中にApo18融合タンパク質の実質的な発現(総種子タンパク質の少なくとも1%)が、約56 kDaの位置に検出された(図17(B))。
実施例1に示すように、Apo19(SEQ ID NO:31)はApo AIとGFPの融合タンパク質である。このコンストラクトの発現には、ユビキチンプロモーターおよびターミネーターを使用し、また融合タンパク質のERにおける標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図18(A))では、検討した12クローン中10クローンについて、総葉抽出物中にApo AI/GFP融合タンパク質の極めて低レベルの発現(総葉タンパク質の0.1%未満)が、分子量が約58 kDaの位置に認められた。しかし、検討した18クローン中17クローンについて、総種子抽出物中にApo19融合タンパク質の実質的な発現(総種子タンパク質の少なくとも1%)が、約58 kDaの位置に検出された(図18(B))。
実施例1に示すように、Apo20(SEQ ID NO:35)はpro-Apo AIとGFPの融合タンパク質である。このコンストラクトの発現には、ユビキチンプロモーターおよびターミネーターを使用し、また融合タンパク質のERにおける標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図19(A))では、検討した12クローン中3クローンについて、総葉抽出物中にpro-Apo AI/GFP融合タンパク質の極めて低レベル(総葉タンパク質の0.1%未満)が、分子量が約59 kDaの位置に検出された。しかし、検討した18クローン中16クローンについて、総種子抽出物中にApo20融合タンパク質の実質的な発現(総種子タンパク質の少なくとも1%)が、約59 kDaの位置に検出された(図19(B))。
Apo10
実施例1に示すように、Apo10(SEQ ID NO:10)は成熟型Apo AIとGFPの融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用する。ポリクローナルGFP抗体によるウェスタンブロット解析(図20(A))では、検討した10クローン中7クローンについて、総種子抽出物中にApo AI/GFP融合タンパク質が、分子量が約55 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo11(SEQ ID NO:16)はpro-Apo AIとGFPの融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用する。ポリクローナルGFP抗体によるウェスタンブロット解析(図20(B))では、検討した14クローン中10クローンについて、総種子抽出物中にpro-Apo AI/GFP融合タンパク質が、分子量が約56 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo12(SEQ ID NO:19)は、オレオシン、成熟型Apo AI、およびGFPの融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用する。ポリクローナルGFP抗体によるウェスタンブロット解析(図21(A))では、検討した17クローンの全てについて、総種子抽出物中にApo AI/GFP融合タンパク質が、分子量が約74 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo13(SEQ ID NO:21)は、オレオシン、pro-Apo AI、およびGFPの融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用する。ポリクローナルGFP抗体によるウェスタンブロット解析(図21(B))では、検討した18クローンの全てについて、総種子抽出物中にoleosin/pro-Apo AI/GFP融合タンパク質が、分子量が約75 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo15(SEQ ID NO:23)は、成熟型Apo AIとGFPの融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、また融合タンパク質の分泌系における標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用する。ポリクローナルGFP抗体によるウェスタンブロット解析(図22(A))では、検討した10クローン中9クローンについて、総種子抽出物中にApo AI/GFP融合タンパク質が、分子量が約58 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo16(SEQ ID NO:25)は、pro-Apo AIとGFPの融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、また融合タンパク質の分泌経路への標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用する。ポリクローナルGFP抗体によるウェスタンブロット解析(図22(B))では、検討した13クローン中10クローンについて、総種子抽出物中にpro-Apo AI/GFP融合タンパク質が、分子量が約59 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo21(SEQ ID NO:37)はApo AIである。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図23(A))では、総種子抽出物中にApo AIタンパク質が検出された。推定分子量は約28 kDaであった。検討した12個のクローンについて、約25 kDa〜55 kDaの様々な多くのタンパク質がApo AI抗体によって検出された。Apo AIの発現が、植物の健康状態に有害に作用すること(矮性の長角果(stunted silique)および種無し)は注目すべきである。
実施例1に示すように、Apo22(SEQ ID NO:41)はpro-Apo AIである。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図23(B))では、総種子抽出物中にApo AIタンパク質が検出された。推定分子量は約29 kDaであった。検討した6個のクローンについて、約25 kDa〜55 kDaの様々な多くのタンパク質がApo AI抗体によって検出された。クローン22-3は、適切な分子量のタンパク質を有する。pro-Apo AIの発現が、Apo23に対してコンストラクトApo21、Apo29、およびApo30を発現する植物体の健康状態と比較すると中程度の表現型を示す植物の健康状態はいくぶん好ましくないことは注目すべきである。
実施例1に示すように、Apo23(SEQ ID NO:44)は、オレオシンとApo AIの融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図24(A))では、検討した5クローン中4クローンについて、総種子抽出物中にoleosin/Apo AI融合タンパクが、分子量が約47 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo24(SEQ ID NO:46)は、オレオシとpro-Apo AIの融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図24(B))では、検討した7クローンの全てについて、総種子抽出物中にoleosin/Apo AI融合タンパク質が、分子量が約48 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo25(SEQ ID NO:48)は、オレオシンとApo AI(+Met)の融合タンパク質である(klip8切断配列が2つの成分を隔てている)。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図25(A))では、検討した4クローンの全てについて、総種子抽出物中にoleosin-klip8-Apo AI(+Met)融合タンパク質が、分子量が約51 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo26(SEQ ID NO:51)は、オレオシンとpro-Apo AI(+Met)の融合タンパク質である(klip8切断配列が2つの成分を隔てている)。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図25(B))では、検討した全11クローンについて、総種子抽出物中にoleosin-klip8-pro-Apo AI(+Met)融合タンパク質が、分子量が約52 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo28(SEQ ID NO:60)は、オレオシンとpro-Apo AIの融合タンパク質である(klip8切断配列が2つの成分を隔てている)。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図26(A))では、検討した全7クローンについて、総種子抽出物中にoleosin-klip8-pro-Apo AI融合タンパク質が、分子量が約52 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo29(SEQ ID NO:63)はApo AIである。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、またタンパク質の分泌経路への標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図26(B))では、総種子抽出物中にApo AIタンパク質が検出された。推定分子量は約31 kDaであった。検討した10個のクローンのうち1クローンのみについてタンパク質が検出されたが、分子量は37 kDaの範囲であった。Apo AIの発現が、植物の健康状態に有害に作用すること(矮性の長角果および種無し)は注目すべきである。
実施例1に示すように、Apo30(SEQ ID NO:65)はpro-Apo AIである。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、また融合タンパク質の分泌経路への標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図27)では、総種子抽出物中にApo AIタンパク質が検出された。推定分子量は約32 kDaであった。検討した13個のクローンについて、約25 kDa〜55 kDaの様々な多くタンパク質がApo AI抗体によって検出された。pro-Apo AIの発現が、植物の健康状態に有害に作用すること(矮性の長角果および種無し)は注目すべきである。
実施例1に示すように、Apo32(SEQ ID NO:69)は、D9 scFV抗体とpro-Apo AIの融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、また融合タンパク質の分泌経路への標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図28(A))では、検討した全5クローンについて、総種子抽出物中にD9 scFv-pro-Apo AI融合タンパク質が、分子量が約59 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo33(SEQ ID NO:71)は、D9 scFV抗体とApo AI(+met)の融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、また融合タンパク質の分泌経路への標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図28(B))では、検討した8クローン中1クローンについて、総種子抽出物中にD9 scFV-Apo AI(+met)融合タンパク質が、分子量が約59 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo34(SEQ ID NO:73)は、D9 scFV抗体とpro-Apo AI(+met)の融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、また融合タンパク質の分泌経路への標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図29)では、検討した7クローン中6クローンについて、総種子抽出物中にD9 scFv-pro-Apo AI(+met)融合タンパク質が、分子量が約59 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo36(SEQ ID NO:78)は、D9 scFV抗体とpro-Apo AIの融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、融合タンパク質の分泌経路への標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用し、またポリペプチドをERに保持するためにKDEL保持シグナルを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図30(A))では、検討した全13クローンについて、総種子抽出物中にD9 scFv-pro-Apo AI-KDEL融合タンパク質が、分子量が約60 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo37(SEQ ID NO:80)は、D9 scFV抗体とApo AI(+met)の融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、融合タンパク質の分泌経路への標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用し、またポリペプチドをERに保持するためにKDEL保持シグナルを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図30(B))では、検討した全15クローンについて、総種子抽出物中にD9 scFV-Apo AI(+met)-KDEL融合タンパク質が、分子量が約59 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo38(SEQ ID NO:82)は、D9 scFV抗体とpro-Apo AI(+met)の融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、融合タンパク質の分泌経路への標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用し、またポリペプチドをERに保持するためにKDEL保持シグナルを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図31A)では、検討した11クローン中9クローンについて、総種子抽出物中にD9 scFv-pro-Apo AI(+met)-KDEL融合タンパク質が、分子量が約60 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo39(SEQ ID NO:83)は、D9 scFV抗体、KLIP8、およびApo AIの融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、融合タンパク質の分泌経路への標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用し、また切断可能なリンカーとしてKLIP8を使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図31B)では、検討した全12クローンについて、総種子抽出物中にD9 scFV-KLIP8-Apo AI融合タンパク質が、分子量が約55 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo40(SEQ ID NO:87)は、D9 scFV抗体とpro-Apo AIの融合タンパク質である(klip8切断配列が2つの成分を隔てている)。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、また融合タンパク質の分泌経路への標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図32(A))では、検討した13クローン中12クローンについて、総種子抽出物中にD9 scFV-klip8-pro-Apo AI融合タンパク質が、分子量が約63 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo41(SEQ ID NO:89)は、D9 scFV抗体とApo AI(+met)の融合タンパク質である(klip8切断配列が2つの成分を隔てている)。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、また融合タンパク質の分泌経路への標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図32(B))では、検討した9クローン中8クローンについて、総種子抽出物中にD9 scFV-klip8-Apo AI(+met)融合タンパク質が、分子量が約63 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo42(SEQ ID NO:91)は、D9 scFV抗体とpro-Apo AI(+met)の融合タンパク質である(klip8切断配列が2つの成分を隔てている)。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、また融合タンパク質の分泌経路への標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図33(A))では、検討した全13クローンについて、総種子抽出物中にD9 scFV-klip8-pro-Apo AI(+met)融合タンパク質が、分子量が約64 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo44(SEQ ID NO:95)は、D9 scFV抗体とpro-Apo AIの融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、融合タンパク質の分泌経路への標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用し、またポリペプチドをERに保持するためにKDEL保持シグナルを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図34(A))では、検討した15クローン中4クローンについて、総種子抽出物中にD9 scFv-pro-Apo AI-KDEL融合タンパク質が、分子量が約64 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo45(SEQ ID NO:97)は、D9 scFV抗体とApo AI(+met)の融合タンパク質である。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、融合タンパク質の分泌経路への標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用し、またポリペプチドをERに保持するためにKDEL保持シグナルを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図34(B))では、検討した全12クローンについて、総種子抽出物中にD9 scFV-Apo AI(+met)-KDEL融合タンパク質が、分子量が約63 kDaの位置に検出された。
実施例1に示すように、Apo46(SEQ ID NO:99)は、D9 scFV抗体とpro-Apo AI(+met)の融合タンパク質である(klip8切断配列が2つの成分を隔てている)。このコンストラクトの種子特異的な発現には、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターを使用し、融合タンパク質の分泌経路への標的発現には、PRSシグナルペプチドを使用し、またポリペプチドをERに保持するためにKDEL保持シグナルを使用する。ポリクローナルApo AI抗体によるウェスタンブロット解析(図35(A))では、検討した11クローン中10クローンについて、総種子抽出物中にD9 scPV-klip8-pro-Apo AI(+met)KDEL融合タンパク質が、分子量が約64 kDaの位置に検出された。
アポリポタンパク質の局在を調べるウェスタンブロット解析
油体の単離を、文献(van Rooijen & Moloney, 1995)に記載された手順を以下のように改変して実施した。簡単に説明すると、250 mgの乾燥成熟種子の表面を70%エタノールで滅菌処理し、滅菌水で2回洗浄し、リン酸緩衝液(100 mMリン酸緩衝液、pH 8、および0.5 M NaCl)で1回洗浄した。洗浄後に、解析目的で種子をリン酸緩衝液に再懸濁し、次に滅菌済みの乳鉢と乳棒を用いて破砕した。破砕後、試料を遠心用ボトルに移して遠心した(15分、10,000 g、RT)。遠心後に、油体を含む脂肪体を水相(AQ)から除去し、1.5 mL容の微量遠心用チューブに移した。油体を低ストリンジェンシーのリン酸緩衝液(100 mMリン酸緩衝液、pH 8、および0.5 M NaCl)に再懸濁した。試料を遠心し(15分、10,000 g、4℃)、下層を除去した。下層(PW)、およびリン酸洗浄油体(PO)を対象に、アポリポタンパク質の存在を調べた。次に油体を、高ストリンジェンシーの尿素緩衝液(8 M尿素、溶媒は100 mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH 8)に再懸濁した。試料を遠心し(15分、10,000 g、4℃)、下層を除去した。下層(UW)、および尿素洗浄油体(UO)を対象に、アポリポタンパク質の存在を調べた。油体と結合するタンパク質を除去するために、油体を低ストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーの洗浄液で処理することに注目されたい。オレオシンは高ストリンジェンシーの洗浄に耐性を示し、油体画分とともに残存する。約250 mgの乾燥種子を、4 mLのミクロソーム破砕用緩衝液(0.5 Mショ糖、0.2 M Hepes-NaOH緩衝液、pH 7.4)中で、乳鉢と乳棒を用いて破砕することでミクロソーム画分(ER)をスラリー状として得た。このスラリーを遠心した(10,000 g、30分、4℃)。上清を新しいチューブに移し、再び遠心して(10,000 g、さらに30分、4℃)、油体を完全に除去した。次に上清を、スイング型のバケツローターを用いた超遠心器で遠心した(2時間、100,000 g、4℃)。ペレットをミクロソーム破砕用緩衝液で洗浄し、速やかに遠心し(5分、10,000 g)、10〜15μLのミクロソーム破砕用緩衝液に再懸濁して-20℃で保存した。
図36Aに示すように、さまざまな画分中におけるプロ型のApo AI-GFP融合体(Apo11)および成熟型のApo AI-GFP融合体(Apo10)(追加的な標的化シグナルは含まない)を調べた。Apo10により、成熟型Apo AI-GFP融合タンパク質が全細胞画分に検出される一方で、リン酸緩衝液と洗浄した油体および尿素洗浄画分についてより多いタンパク質の蓄積が見られることが示される。この結果は、Apo10が、油体に対するある程度の親和性をもつ一方で、高ストリンジェンシーの洗浄が、油体表面からApo10を除去するのに十分であることを示唆している。Apo11により、天然のApo AIのプロ配列の存在が、Apo AI-GFP融合タンパク質を、プロペプチドが喪失する場合より多く油体画分を標的化すること、およびタンパク質が高ストリンジェンシーの洗浄を用いる場合であっても油体に結合した状態のままであることが示される。pro-Apo AIペプチドは、pro-Apo AIを油体表面に保持するために「アンカー形成(anchoring)」配列として作用すると考えられる。これらの画分には、分解産物である可能性がある多数の低分子量バンドを検出することができる。
Apo AI-GFP融合タンパク質と油体の、このパターンの強い結合は、油体を標的とするコンストラクトにも見られる場合がある(図36B)。プロ型Apo AI-GFP融合体(Apo13)および成熟型Apo AI-GFP融合体(Apo12)を、油体への標的化シグナルとして作用するオレオシンのC末端と、同じフレームで融合する。非標的型のpro-Apo AI-GFP融合体について既に述べたように、タンパク質は主に、リン酸および尿素で洗浄された油体画分と結合する。これらの画分には、多数の低分子量バンドも検出されることから、油体結合画分には、分解産物の蓄積につながる何らかの固有の性質があることがわかる。
タンパク質を分泌経路に標的化するPRSシグナルペプチド(Sijmons et al., 1990, Bio/technology, 8: 217-221)を、プロ型Apo AI-GFP(Apo16)および成熟型のApo AI-GFP(Apo15)の翻訳融合体に同じフレームで加えた(図37)。この操作は通常、融合タンパク質の、植物細胞の細胞外空間(アポプラスト)への分泌につながる。しかし、2つのコンストラクトの細胞画分を調べたところ、Apo AI-GFP融合タンパク質は全画分に検出され、また、より多くのタンパク質が油体画分に検出された。組換え融合タンパク質のバンドのサイズも、ポンソーS(Ponceau-S)染色されたイムノブロットを調べると油体画分中に観察可能である(図37、上のパネル)。Apo AIの天然のプロ配列の存在は、分泌型の融合タンパク質と特異的な細胞画分との結合を変化させないようであった。植物のプレ配列認識シグナル(PRS)ペプチドは、pro-Apo AIペプチドの「アンカー形成」特性に干渉するようである。
非標的型および分泌型のプロ型および成熟型のApo AI-GFPを構成的に発現する葉の組織を調べ、Apo AI-GFP融合タンパク質が非油脂産生組織に蓄積可能か否かを判定した。非標的型のプロ型(Apo18)および成熟型(Apo17)のApo AI-GFP、ならびに分泌型のプロ型(Apo20)および成熟型(Apo19)のApo AI-GFPを構成的に発現するトランスジェニック植物系列から、葉の組織を(実施例2に記載された手順で)ホモジナイズし、イムノブロットに使用した。葉の材料は、葉における発現の負の対照として野生型の植物体(c24)から、また葉における発現の正の対照としてUR2(ユビキチン誘導oleosin-GFP)植物体およびUG-14(ユビキチン誘導GFP)植物体からも採取した。同等量のタンパク質をSDS-PAGEで分離し、Apo AI-GFP融合タンパク質を、抗GFP抗体によるイムノブロッティングで検出した(図38の下のパネル)。
総種子抽出物中にプロ型または成熟型のApoAIタンパク質のいずれかについて、ある程度の蓄積が見られた個々のT2世代のApo AIトランスジェニック植物体から、1つのトランスジェニック系列を選択した。推定トランスジェニック体の植物体の系列のうち、以下の1系列のみにタンパク質の発現が認められた:Apo21(非標的型の成熟型Apo AI)、Apo22(非標的型のプロ型Apo AI)、およびApo29(分泌型の成熟型Apo AI);2系列についてはApo30(分泌型のプロ型Apo AI)。コンストラクトApo23およびApo24を含む、全てのトランスジェニック植物体の系列は、oleosin-Apo AI融合タンパク質を発現して蓄積するようであった。同等量のタンパク質をSDS-PAGEで分離したところ、Apo AIタンパク質が抗Apo AI抗体によるイムノブロッティングで検出された(図39)。イムノブロットには、非形質転換植物体(c24)に由来する類似のタンパク質抽出物を調製することで、負の対照を含めた。単独で発現されたApo AIの正しいサイズのバンド(推定分子量は、成熟型Apo AIが28.3 kDa、またプロ型Apo AIが29.3 kDa)は、系列Apo22-3(非標的型のプロ型Apo AI)についてのみ認められた。Apo21-11(非標的型の成熟型Apo AI)について検出された主要なバンドは不正な大きさであり、またApo29-11(分泌型の成熟型Apo AI)とApo30-14(分泌型のプロ型Apo AI)についてはマイナーなバンドだけが検出されるが、正しいサイズのものは認められなかった。しかし、Apo23-11(oleosin-成熟型Apo AI)とApo24-6(oleosin-pro-Apo AI)の両方のオレオシン融合体に関しては、有意な量のApo AI融合タンパク質が抗Apo AI抗体によって検出され、またポンソーSで染色されたイムノブロットでも検出可能である(上のパネル)。
非標的型のApo AIタンパク質(Apo22)のプロ型の種子特異的な発現、および成熟種子における特異的な細胞画分との結合について調べた(図40)。種子をホモジナイズし、上述の手順で処理し、細胞画分を対象に、Apo AIに対する抗体によるイムノブロッティングを行った。Apo22-3については、天然のApo AIのプロ配列の存在が、Apo AIタンパク質を油体画分に標的化すること、またタンパク質を油体から除去するために、同タンパク質を高ストリンジェンシーで洗浄する必要があることがわかる。一部のタンパク質は、水相中にも検出されることから、必ずしも全てのpro-Apo AIタンパク質が油体と結合するわけではないことがわかる。これらの画分には、分解産物である可能性のある多数の低分子量バンドが検出可能である。
アポリポタンパク質の局在の共焦点顕微鏡による観察
ピンセットと解剖顕微鏡を用いて、滅菌水中でApo AI-GFPの長角果から未成熟の胚を切除してペトリ皿で受けた。ガラス製の顕微鏡用スライドカバーを用いて、未成熟の種子に緩やかに圧力を加えて種皮から胚を取り出した。胚をピペットで1.5 mL容の微量遠心用チューブに移し、水を加えて最終容量を1 mLとした。ナイルレッド(Nile Red; Molecular Probes)を最終濃度が1μg/μLとなるように使用した。希釈済みのナイルレッド中の胚をそのまま15分間、暗条件で室温でインキュベートした。胚を滅菌水で3回洗浄し、ガラススライド上の水中にマウントして顕微鏡で観察した。葉の表皮細胞を、小さな葉片(0.5cm2)となるようにメスで簡単に切断して調製し、カバースリップを用いて顕微鏡用スライド上の水中にマウントした。葉の切片は、表皮下層が上向きになるように配した(自己蛍光性のクロロプラストによる干渉を抑えるため)。
Apo 25、26、および28を発現するシロイヌナズナ種子の切断およびHPLC解析
Apo25、Apo26、およびApo28組換えタンパク質の切断
油体の単離を、以下の改変を加えた文献(van Rooijen & Moloney, 1995)記載の手順で実施した。簡単に説明すると、250 mgの乾燥成熟種子の表面を70%エタノールで滅菌し、滅菌水で2回洗浄し、リン酸緩衝液(100 mMリン酸緩衝液、pH 8+0.5 M NaCl)で1回洗浄した。洗浄後に種子をリン酸緩衝液に再懸濁して解析用とし、続いて滅菌済みの乳鉢と乳棒を用いて破砕した。破砕後、試料を遠心用ボトルに移して遠心した(15分、10,000 g、RT)。遠心後に、油体を含む脂肪体を1.5 mL容の微量遠心用チューブに移し、尿素緩衝液(8 M尿素、溶媒は100 mM炭酸ナトリウム緩衝液 pH 8)に再懸濁した。試料を遠心し(15分、10,000 g、4℃)、下層を除去した。脂肪体を滅菌済みのddH2Oに再懸濁し、遠心し(15分、10,000 g、4℃)、下層を除去した。油体を50μLの滅菌済みのddH2Oに再懸濁し、暗条件で4℃で保存した。100 mMリン酸緩衝液(pH 4.5)を含む20μLの反応溶液中で、プロテアーゼ:油体タンパク質の最終比が1:100となるように37℃で2時間の切断反応を行った。試料反応は以下の通りとする:20μgの精製Apo25、Apo26、またはApo28を、2μLの1 Mリン酸緩衝液(pH 4.5;最終濃度100 mM)、2μLのキモシン(0.1_g/_l)と混合し、滅菌済みのddH2Oを添加して最終容量を20μLとした。2時間後に切断反応物を15分間遠心し、脂肪体から下層を除去し、各相を組換えタンパク質に関して解析した。
約1000μgのApo25、Apo26、またはApo28をキモシンで37℃で2時間かけて切断した。切断反応の完了後、反応物を遠心し(15分、10,000 g、4℃)、下層を回収した。脂肪体を尿素緩衝液(8 M尿素、溶媒は0.1 mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH 8)に再懸濁し、再び15分間、遠心した。下層または洗浄液を回収し、洗浄をさらに3回繰り返し、下層をそのつど回収して15 mL容のFalconチューブにプールした。尿素による洗浄の終了後に、洗浄液のアリコートを1.5 mL容の微量遠心用チューブに移し、15分間、遠心して、混入性の油体残渣を除去した。下層を回収し、0.2ミクロンのフィルターを用いて新しい15 mL容のFalconチューブ中に濾過した。VYDAC 214TP54 C4シリカ5ミクロン(Grace Vydac, Anaheim, CA)を使用した逆相クロマトグラフィー用カラム(0.24×25 cm)を緩衝液A(10%アセトニトリルおよび0.1%トリフルオロ酢酸)で2 mL/分の流速で平衡化した。プールしたキモシン切断済みのApo25、Apo26、またはApo28の尿素処理下層をカラムにロードした。Apo AIの溶出には、0〜60%の緩衝液B(95%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸)の線形勾配をカラムにアプライした。Apo AI(US Biological、カタログ番号A2299-10)を、Apo25、Apo26、およびApo28の切断産物を比較する際の標準として使用した。画分19.6'〜20.8'(0.2'=各0.4 mL)を回収した。214 nm、254 nm、280 nm、および326 nmにおけるDADトレースの相対強度の比較から、19.5〜21.0'のゾーンに溶出された材料が、Apo AIポリペプチドである可能性が極めて高いことがわかる(図45A)。これらのピークは、0.020 mLの同じ試料の過去の注入と比較しても強度が大きかった。Apo25(oleosin-klip8-Apo AI(met+))に由来する切断産物を精製するために、7〜25(各1 mL)からキモシン処理画分を回収した。主要なポリペプチドピークは20.5'に認められ(図45B)、これは推定されるhApo AI標準よりちょうど0.2'遅い。Apo26(oleosin-klip8-pro-Apo AI(met+))の切断産物を精製するために、7〜25'(各1 mL)から画分を回収した。主要ポリペプチドピークは18'に認められ(図45C)、これは推定されるhApo AI標準より2.4'早い。Apo28(oleosin-klip8-pro-Apo AI)の切断産物を精製するために、7〜25'(各1 mL)から画分を回収した。主要なポリペプチドピークは18'に認められる(図45D)。これは、推定されるhApo AI標準より2.4'早いが、Apo26の場合と同等である。
質量スペクトルは、Applied Biosystems社製のVoyager-DE STRマトリックス支援レーザー脱離イオン化時間飛行型(MALDI-TOF)質量分析装置で、Doug Olson(National Research Council of Canada, Plant Biotechnology Institute BioAnalytical Spectroscopy Group, Saskatoon, SK)によって得られた。試料をOPI-TOF LC MALDI Insert(Applied Biosystems, Foster City, CA)に、30%アセトニトリル/70%水/0.1% TFAに飽和したシナピン酸のマトリックスを用いてスポットした。イオンを+20 kVに加速し、質量をリニアモードで、ウマ心臓ミオグロブリンを外部校正用標準(external calibrant)として用いて検出した。精製済みの組換え成熟型Apo25タンパク質を対象とした電気スプレーイオン化質量分析では、計算された分子量(28,319 Da)より6 Da大きい28,325 Daの分子量が得られた。この観察値と推定値の差は、試料が限られていて、ノイズに対するシグナルの比の低下、および精度の低下につながったことが理由である可能性がある。成熟型Apo AIの推定分子量は28,187 Daであるが、追加Met残基の存在のために、切断後の組換え成熟型Apo AIタンパク質は分子量が増えている。精製後の標準hApo AIタンパク質も質量分析で解析し、2本の異なるピークが25,969 Daと22,815 Daに認められた。これらの観察値はいずれも、推定値(28,187 Da)より有意に小さい。しかし、この2つの主要な分子量の低さは、イムノブロットで過去に観察されている。この分子量の減少は、RP-HPLCで認められた、ヒトの、また組換えタンパク質の溶出プロファイルのわずかな差をもたらす可能性が高い。
ベニバナの形質転換
この形質転換プロトコルは、文献(Orlilcowska T.K. et al. (1995)Plant Cell, Tissue and Organ Culture 40: 85-91)に記載されたプロトコルと同等であるが、S-317の形質転換段階に関して、また選択マーカーとしてフォスフィノスリシンを使用する点に関して改変および改善が施されている。破損しておらず、クラックが入っておらず、または病気ではないベニバナのS-317 California種に由来する種子を、0.1% HCl2で12分間かけて除洗した後に、滅菌済みの蒸留水による4〜5回の洗浄を行う。1%ショ糖および0.25% Gelriteを添加したMS培地(Murashige T. & Skoog F (1962)Physiol. Plant. 15: 473-497)で、滅菌済みの種子を暗所で発芽させる。アグロバクテリウムの培養を、5 mlのAB最小液体培地中の凍結グリセロールストックから抗生物質選択により開始し、28℃で48時間、成長させる。この培養物の一部のアリコートを、形質転換体の選択用に5 mLのルリアブロス中で一晩、成長させる。6〜8 mLの細菌細胞をAB培地で2回洗浄し、最終細胞濃度を0.4〜0.5(OD600)に合わせる。
アマの形質転換プロトコル
この形質転換の手順は、3つの文献(Dong J. and McHughen A. Plant Cell Reports (1991) 10: 555-560、Dong J. and McHughen A. Plant Sciences (1993) 88: 61-71、およびMlynarova et al. Plant Cell Reports (1994) 13: 282-285)に記載された方法とほぼ同じである。破損しておらず、クラックが入っておらず、または病気ではないアマの種子を70%エタノール溶液で5〜7分間、除洗した後に、25分間、Tween 20(3〜4滴/100 ml)を添加した50%漂白液で連続的に攪拌しながら洗浄する。種子を滅菌済みの蒸留水で5〜7回洗浄する。除洗済みの種子を明条件で、マジェンタ瓶内の2%ショ糖および0.3% Gelrite(登録商標)を添加したMS培地(Murashige T. & Skoog F (1962) Physiol. Plant. 15: 473-497)上で発芽させる。形質転換に関しては、アグロバクテリウム培養物を一晩、選択用の適切な抗生物質を添加したABブロス中で成長させる。6〜8 mLの一晩培養細胞をABブロスで2回洗浄し、5 mlのABブロスに再懸濁する。このストック(2 mL)を98 mLの誘導用培地(3%ショ糖、5 μM 6-ベンジルアミノプリン(BA)、および0.25μMアルファ-ナフタレン酢酸(NAA)を添加したMS基礎培地)に添加し、最終OD600値を1.0に調整する。
SEQ ID NO:1および2はそれぞれ、ヒトのpro-Apo AIタンパク質のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:3および4はそれぞれ、ヒトのApo AI Milanoタンパク質のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:5および6はそれぞれ、ヒトのApo AI Parisタンパク質のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:1、7、および8は、表1に記載された既知のヒトのアポリポタンパク質の配列である。
SEQ ID NO:9〜24は、表1に記載された既知のアポリポタンパク質A-Iの配列である。
SEQ ID NO:25〜34は、表1に記載された既知のアポリポタンパク質A-IVの配列である。
SEQ ID NO:35〜55は、表1に記載された既知のアポリポタンパク質Eの配列である。
SEQ ID NO:56は、シロイヌナズナのチオレドキシンの核酸配列を示す。
SEQ ID NO:57は、可溶性の緑色蛍光タンパク質の核酸配列を示す。
SEQ ID NO:58は、PRSシグナル配列のアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:59〜116は、表3に記載された既知のオレオシン油体タンパク質の配列である。
SEQ ID NO:117〜129は、表3に記載された既知のカレオシン油体タンパク質の配列である。
SEQ ID NO:130〜137は、表3に記載された既知のステロレオシン油体タンパク質の配列である。
SEQ ID NO:138は、既知のシロイヌナズナのオレオシン油体タンパク質の配列を示す。
SEQ ID NO:139は、既知のアブラナのオレオシン油体タンパク質の配列を示す。
SEQ ID NO:140は、既知のシロイヌナズナのカレオシン油体タンパク質の核酸配列を示す。
SEQ ID NO:141は、既知のシロイヌナズナのカレオシン油体タンパク質の核酸配列を示す。
SEQ ID NO:142は、既知のステロレオシン油体タンパク質の核酸配列を示す。
SEQ ID NO:143は、klip8切断配列のヌクレオチド配列を示す。
SEQ ID NO:144および145はそれぞれ、Apo10クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:146は、フォワードプライマー1186のヌクレオチド配列を示す。この配列は、GFPの5'領域に相補的で、NcoI切断部位を除去するように設計されている。
SEQ ID NO:147は、リバースプライマー1187のヌクレオチド配列を示す。この配列は、GFPの3'領域に相補的で、停止コドンの後方にPstI、XbaIおよびHindIII切断部位を加えるように設計されている。
SEQ ID NO:148は、フォワードプライマー1190のヌクレオチド配列を示す。この配列は、成熟型Apo AIの5'領域に相補的で、遺伝子の開始部位にNcoI切断部位を加えるように設計されている。
SEQ ID NO:149は、リバースプライマー1189のヌクレオチド配列を示す。この配列は、成熟型Apo AIの5'領域に相補的で、GFPとの同じフレームでの翻訳融合体の作製を支援するために、遺伝子の停止コドンを除去してBamHI切断部位を加えるように設計されている。
SEQ ID NO:150および151はそれぞれ、Apo11クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:152は、フォワードプライマー1191のヌクレオチド配列を示す。この配列は、pro-Apo AIの5'領域に相補的で、遺伝子の開始部位にNcoI切断部位を加えるように設計されている。
SEQ ID NO:153および154はそれぞれ、Apo12クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:155および156はそれぞれ、Apo13クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:157および158はそれぞれ、Apo15クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:159および160はそれぞれ、Apo16クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:161および162はそれぞれ、Apo17クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:163および164はそれぞれ、Apo18クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:165および166はそれぞれ、Apo19クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:167は、フォワードプライマー1177のヌクレオチド配列を示す。この配列は、PRS/Apo AI(クローンApo15)の5'領域に相補的で、開始コドンにBspHI切断部位を含む植物のプレ配列(PRS)の開始部位を増幅するように設計されている。
SEQ ID NO:168は、リバースプライマー1178のヌクレオチド配列を示す。この配列、Apo AIの3'領域に相補的で、GFPとの同じフレームでの翻訳融合体の作製を支援するために、遺伝子の停止コドンを除去してBamHI切断部位を加えるように設計されている。
SEQ ID NO:169および170はそれぞれ、Apo20クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:171および172はそれぞれ、Apo21クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:173は、フォワードプライマー1203のヌクレオチド配列を示す。この配列は、Apo AIの5'領域に相補的で、成熟型Apo AIの開始部位にNcoI切断部位を加えるように設計されている。
SEQ ID NO:174は、リバースプライマー1206のヌクレオチド配列を示す。この配列は、Apo AIの3'領域に相補的で、停止コドンの後方にHindIII切断部位を加えるように設計されている。
SEQ ID NO:175および176はそれぞれ、Apo22クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:177は、フォワードプライマー1201のヌクレオチド配列を示す。この配列は、pro AIの5'領域に相補的で、pro-Apo AIの開始部位にNcoI切断部位を加えるように設計されている。
SEQ ID NO:178および179はそれぞれ、Apo23クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:180および181はそれぞれ、Apo24クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:182および183はそれぞれ、Apo25クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:184および185はそれぞれ、Apo26クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:186および187はそれぞれ、Apo27クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:188は、フォワードプライマー1200のヌクレオチド配列を示す。この配列は、成熟型Apo AIの5'領域に相補的で、klip8切断配列への同じフレームでのクローニングを容易にするために、pro-Apo AIの開始部位にXhoI切断部位および追加のヌクレオチドを加えるように設計されている。
SEQ ID NO:189および190はそれぞれ、Apo27Mクローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:191は、フォワードプライマー1202のヌクレオチド配列を示す。この配列は、ヒトApo AIの5'領域に相補的で、ヒトApo AI配列を増幅し、klip8切断配列との同じフレームでのクローニングを容易にするために、mat-Apo AIの開始部位にXhoI切断部位および追加のヌクレオチドを加えるように設計されている。
SEQ ID NO:192は、Arg残基をCys残基に変えることでApo-Milano変異を作製するためにC→Tの塩基対変異を導入する平滑末端のプライマーである、フォワードプライマー1225のヌクレオチド配列を示す。
SEQ ID NO:193および194はそれぞれ、Apo28クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:195は、フォワードプライマー1205のヌクレオチド配列を示す。この配列は、pro-Apo AIIの5'領域に相補的で、第1のXhoI切断部位を除去するためにサイレント変異を加える平滑末端のプライマーとなるように設計されている。
SEQ ID NO:196および197はそれぞれ、Apo29クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:198および199はそれぞれ、Apo30クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:200および201はそれぞれ、Apo31クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:202および203はそれぞれ、Apo32クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:204および205はそれぞれ、Apo33クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:206および207はそれぞれ、Apo34クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:208および209はそれぞれ、Apo35クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:210は、リバースプライマー1208のヌクレオチド配列を示す。この配列は、pro-Apo AIの3'領域に相補的で、停止コドンの前方にKDEL配列を、また停止コドンの後方にHindIII切断部位を加えるように設計されている。
SEQ ID NO:211および212はそれぞれ、Apo36クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:213および214はそれぞれ、Apo37クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:215および216はそれぞれ、Apo38クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:217および218はそれぞれ、Apo39クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:219は、フォワードプライマー1207のヌクレオチド配列を示す。この配列は、klip8切断配列の5'領域に相補的で、klip8配列の開始部位を増幅して開始コドンにSalI切断部位を加えるように設計されている。
SEQ ID NO:220および221はそれぞれ、Apo40クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:222および223はそれぞれ、Apo41クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:224および225はそれぞれ、Apo42クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:226および227はそれぞれ、Apo43クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:228および229はそれぞれ、Apo44クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:230および231はそれぞれ、Apo45クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:232および233はそれぞれ、Apo46クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:234および235はそれぞれ、Apo47クローンのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:236は、フォワードプライマー1226のヌクレオチド配列を示す。この配列は、トウモロコシのオレオシンの配列の5'領域に相補的で、トウモロコシのオレオシンの配列を増幅して、開始コドンにNcoI切断部位を加えるように設計されている
SEQ ID NO:237は、フォワードプライマー1227のヌクレオチド配列を示す。この配列は、トウモロコシのオレオシンの配列の3'領域に相補的で、klip8/matApo AIとの同じフレームでの翻訳融合体の作製を支援するために、トウモロコシのオレオシンを増幅し、遺伝子の停止コドンを除去してHindIII切断部位を加えるように設計されている
SEQ ID NO:238は、フォワードプライマー1228のヌクレオチド配列を示す。この配列は、Apo25クローンの5'領域に相補的で、Apo25の配列を増幅して開始コドンにSalI切断部位を加えるように設計されている。
SEQ ID NO:239は、リバースプライマー1229のヌクレオチド配列を示す。この配列は、Apo25クローンの3'領域に相補的で、Apo25の配列を増幅して停止コドンの後方にBamHI切断部位を加えるように設計されている。
SEQ ID NO:240は、1本鎖抗体D9scFvのアミノ酸配列を示す。
SEQ ID NO:241〜251は、表1に記載された既知のアポリポタンパク質AVの配列である。
Claims (49)
- 以下の段階を含む、植物におけるアポリポタンパク質の発現法:
(a)使用可能に連結された成分として5'→3'の転写方向に(i)植物細胞における発現を制御可能である核酸配列;および(ii)アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする核酸配列を含むキメラ核酸コンストラクトを提供する段階;
(b)キメラ核酸コンストラクトを植物細胞に導入する段階;ならびに
(c)植物細胞を、アポリポタンパク質を発現する成熟植物体に成長させる段階。 - 核ゲノムへの組込み条件でキメラ核酸配列を植物細胞に導入する、請求項1記載の方法。
- 植物細胞が種子の細胞である、請求項1または2記載の方法。
- 植物細胞における発現を制御可能である核酸配列が、種子に好ましいプロモーターである、請求項1、2、または3のいずれか一項記載の方法。
- 種子に好ましいプロモーターがファゼオリンプロモーターである、請求項4記載の方法。
- 植物細胞における発現を制御可能である核酸配列が構成的プロモーターである、請求項1または2記載の方法。
- 構成的プロモーターがユビキチンプロモーターである、請求項6記載の方法。
- キメラ核酸コンストラクトが、アポリポタンパク質をコードする核酸配列と読み枠で連結された安定化ポリペプチドをコードする核酸配列を追加的に含む、請求項1記載の方法。
- 安定化ポリペプチドが植物に特異的である、請求項8記載の方法。
- 安定化ポリペプチドが植物に特異的でない、請求項8記載の方法。
- 植物に特異的な安定化ポリペプチドが、油体タンパク質、またはチオレドキシンもしくはこの断片である、請求項9記載の方法。
- 油体タンパク質が、オレオシン、カレオシン(caleosin)、およびステロレオシン(steroleosin)からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
- オレオシン、カレオシン、およびステロレオシンがシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)に由来する、請求項12記載の方法。
- チオレドキシンがSEQ ID NO:56である、請求項11記載の方法。
- 植物に特異的でない安定化ポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質、または1本鎖抗体もしくはこの断片である、請求項10記載の方法。
- 植物に特異的でない安定化ポリペプチドが、植物における最適な発現に最適化されたコドンである、請求項10記載の方法。
- 緑色蛍光タンパク質がSEQ ID NO:57である、請求項15記載の方法。
- 1本鎖抗体が、種子で発現されるアポリポタンパク質の精製を促進可能である、請求項15記載の方法。
- 1本鎖抗体が油体タンパク質と特異的に結合可能である、請求項15記載の方法。
- 1本鎖抗体が、シロイヌナズナの18 kDaオレオシンと特異的に結合可能な1本鎖Fv抗体(D9scFv)である、請求項15記載の方法。
- 1本鎖抗体がSEQ ID NO:240である、請求項15記載の方法。
- 安定化ポリペプチドが、切断可能なリンカーを介してアポリポタンパク質に連結されている、請求項8記載の方法。
- 切断可能なリンカーが、キモシンのプロ配列である、請求項22記載の方法。
- キモシンのプロ配列がSEQ ID NO:143である、請求項23記載の方法。
- キメラ核酸配列が、アポリポタンパク質の、ERまたはER由来の貯蔵小胞への標的化可能とする標的化シグナルをさらに含む、請求項1記載の方法。
- ER由来の貯蔵小胞が油体であり、かつ標的化配列が油体タンパク質をコードする、請求項25記載の方法。
- 標的化シグナルが、C末端にER保持モチーフを含む、請求項25記載の方法。
- C末端のER保持モチーフがKDELである、請求項27記載の方法。
- キメラ核酸コンストラクトが、アポリポタンパク質のポリペプチドのアポプラストへの標的化を可能とするシグナルペプチドをコードする核酸配列を追加的に含む、請求項1記載の方法。
- シグナルペプチドがタバコの感染特異的タンパク質(PR-S)のシグナル配列である、請求項29記載の方法。
- PR-Sのシグナル配列がSEQ ID NO:58である、請求項30記載の方法。
- アポリポタンパク質をコードする核酸配列が、ヒトのアポリポタンパク質、ヒトのプロアポリポタンパク質、ブタのアポリポタンパク質、ブタのプロアポリポタンパク質、ウシのアポリポタンパク質、およびウシのプロアポリポタンパク質からなる核酸配列の群より選択される、請求項1〜31のいずれか一項記載の方法。
- アポリポタンパク質をコードする核酸配列が、植物のコドン使用に最適化されている、請求項1〜32のいずれか一項記載の方法。
- 以下の段階を含む、アポリポタンパク質を含む植物の種子を得る方法:
(a)使用可能に連結された成分として5'→3'の転写方向に(i)植物の種子の細胞における発現を制御可能である核酸配列;および(ii)アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする核酸配列を含むキメラ核酸コンストラクトを提供する段階;
(b)キメラ核酸コンストラクトを植物細胞に導入する段階;
(c)植物細胞を成熟植物体に成長させ;かつ種子がアポリポタンパク質を含む植物体から組織を得る段階;ならびに
(d)植物体から、アポリポタンパク質を含む種子を得る段階。 - 5'→3'の転写方向に以下を含むキメラ核酸配列を含む植物体:
(a)(b)に使用可能に連結された、植物における発現を制御可能な第1の核酸配列;
(b)亜ポリ歩タンパク質を含むアポリポタンパク質のポリペプチドをコードする第2の核酸配列。 - キメラ核酸配列が植物の核ゲノムに組込まれている、請求項35記載の植物体。
- 使用する植物体がシロイヌナズナまたはベニバナの植物体である、請求項1〜36のいずれか一項記載の植物体。
- 5'→3'の転写方向に以下を含むキメラ核酸配列を含む植物の種子:
(a)(b)に使用可能に連結された、植物の種子における発現を制御可能な第1の核酸配列;
(b)アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする第2の核酸配列。 - 植物から得られるアポリポタンパク質を含む実質的に純粋な油体を含む組成物。
- 植物細胞における発現を制御可能な核酸を含む核酸配列に連結された、アポリポタンパク質をコードする核酸配列。
- 植物細胞が種子の細胞である、請求項40記載の核酸配列。
- 植物細胞における発現を制御可能である核酸配列が、種子に好ましいプロモーターである、請求項41記載の核酸配列。
- 種子に好ましいプロモーターがファゼオリンプロモーターである、請求項43記載の核酸。
- 植物の種子における発現を制御可能である核酸配列が構成的プロモーターである、請求項43記載の核酸配列。
- プロモーターがユビキチンプロモーターである、請求項44記載の核酸配列。
- 請求項1〜45のいずれか一項記載の核酸配列を含む、植物細胞における発現に適切な組換え発現ベクター。
- 以下の段階を含む、実質的に純粋なアポリポタンパク質を調製する方法:
(a)使用可能に連結された成分として5'→3'の転写方向に(i)植物の種子の細胞における発現を制御可能である核酸配列;および(ii)アポリポタンパク質のポリペプチドをコードする核酸配列を含むキメラ核酸コンストラクトを提供する段階;
(b)キメラ核酸コンストラクトを植物細胞に導入する段階;
(c)植物細胞を成熟植物体に成長させる段階;および
(d)アポリポタンパク質を含む種子を植物体から得る段階;ならびに
(e)実質的に純粋なアポリポタンパク質を得るために、アポリポタンパク質を植物の種子の成分から分離する段階。 - 本質的に純粋なアポリポタンパク質を得るために、請求項1〜38のいずれか一項記載の調製された植物の使用。
- 植物体から得られる実質的に純粋なアポリポタンパク質を含む組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US51960603P | 2003-11-14 | 2003-11-14 | |
US57973304P | 2004-06-16 | 2004-06-16 | |
PCT/CA2004/001960 WO2005047455A2 (en) | 2003-11-14 | 2004-11-15 | Methods for the production of apolipoproteins in transgenic plants |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007510420A true JP2007510420A (ja) | 2007-04-26 |
Family
ID=34594972
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006538622A Pending JP2007510420A (ja) | 2003-11-14 | 2004-11-15 | トランスジェニック植物におけるアポリポタンパク質の産生法 |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7786352B2 (ja) |
EP (1) | EP1682664A4 (ja) |
JP (1) | JP2007510420A (ja) |
KR (1) | KR20060124633A (ja) |
CN (1) | CN1906296B (ja) |
AR (1) | AR047769A1 (ja) |
AU (1) | AU2004289720B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0416589A (ja) |
CA (1) | CA2544239A1 (ja) |
EA (1) | EA015167B1 (ja) |
IL (1) | IL175248A0 (ja) |
MX (1) | MXPA06005363A (ja) |
NO (1) | NO20062480L (ja) |
NZ (1) | NZ547024A (ja) |
TW (1) | TW200526778A (ja) |
WO (1) | WO2005047455A2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009107820A1 (ja) * | 2008-02-28 | 2009-09-03 | トヨタ自動車株式会社 | 種子中の油脂量の評価方法及び油脂含量が変化した植物体のスクリーニング方法 |
WO2009145180A1 (ja) * | 2008-05-28 | 2009-12-03 | 国立大学法人京都大学 | 新規選択マーカー遺伝子およびその利用 |
JP2014502498A (ja) * | 2010-12-23 | 2014-02-03 | フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム | 植物においてアポリポプロテインを製造する方法 |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2002232819B2 (en) * | 2000-12-19 | 2008-01-03 | Sembiosys Genetics Inc. | Methods for the production of multimeric proteins, and related compositions |
WO2012047930A2 (en) * | 2010-10-04 | 2012-04-12 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for treatment of gynecologic cancers |
CN101213302B (zh) * | 2005-07-01 | 2012-09-05 | 康乃尔研究基金会 | 咖啡油质蛋白基因和启动子 |
US9637753B2 (en) * | 2006-08-10 | 2017-05-02 | Plantechno S.R.L. | In-plant production of oligomeric (comprising three or more units) forms of human Apo A-1 protein muteins |
ATE497008T1 (de) | 2006-08-31 | 2011-02-15 | Monsanto Technology Llc | Verfahren zur herstellung transgener pflanzen |
ES2627063T3 (es) | 2009-10-13 | 2017-07-26 | Nanostring Technologies, Inc | Detección de proteína a través de nanoinformadores |
US9745362B2 (en) | 2009-12-09 | 2017-08-29 | Shengjun An | Seed-specific expression vector and its construction methods and applications |
CN105724726A (zh) | 2011-07-12 | 2016-07-06 | 非凡食品有限公司 | 用于消费品的方法和组合物 |
CN110742128A (zh) | 2011-07-12 | 2020-02-04 | 非凡食品有限公司 | 用于消费品的方法和组合物 |
US20140220217A1 (en) | 2011-07-12 | 2014-08-07 | Maraxi, Inc. | Method and compositions for consumables |
WO2014110532A2 (en) | 2013-01-11 | 2014-07-17 | Maraxi, Inc. | Methods and compositions for affecting the flavor and aroma profile of consumables |
US10039306B2 (en) | 2012-03-16 | 2018-08-07 | Impossible Foods Inc. | Methods and compositions for consumables |
US9539300B2 (en) * | 2012-03-31 | 2017-01-10 | The Regents Of The University Of California | Modulating disease through genetic engineering of plants |
EP3513664A1 (en) | 2013-01-11 | 2019-07-24 | Impossible Foods Inc. | Method of producing a flavoured cultured non-dairy product |
KR20160140790A (ko) | 2014-03-31 | 2016-12-07 | 임파서블 푸즈 인크. | 분쇄 고기 모조물 |
WO2015173633A2 (en) | 2014-05-02 | 2015-11-19 | Cerenis Therapeutics Holding Sa | Hdl therapy markers |
CA2967649A1 (en) * | 2014-11-21 | 2016-05-26 | The University Of Chicago | Synthetic peptides |
US20160208274A1 (en) * | 2015-01-21 | 2016-07-21 | Northeastern State University | Blood clot-dissolving proteins produced in seeds |
EP3088414A1 (de) * | 2015-04-30 | 2016-11-02 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG | Verbesserter nachweis von nussallergien |
IT201600081193A1 (it) * | 2016-08-02 | 2018-02-02 | Grg Gene Tech Sa | COMPOSIZIONI PER SOMMINISTRAZIONE DI ApoA1 E DOSAGGI |
US20210032663A1 (en) * | 2018-03-25 | 2021-02-04 | Emendobio Inc. | Differential knockout of an allele of a heterozygous apolipoprotein a1 (apo1a) gene |
CN114990134B (zh) * | 2022-05-30 | 2023-07-25 | 扬州大学 | 一种水稻油体蛋白基因OsOle6及其编码蛋白与应用 |
CN115290776A (zh) * | 2022-07-26 | 2022-11-04 | 云南大学 | 瘤牛锥虫病抗性蛋白的应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002050289A1 (en) * | 2000-12-19 | 2002-06-27 | Sembiosys Genetics, Inc. | Methods for the production of multimeric proteins, and related compositions |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3971856A (en) | 1975-03-03 | 1976-07-27 | Archer Daniels Midland Company | Process for preparing soy protein concentrate |
US4956282A (en) | 1985-07-29 | 1990-09-11 | Calgene, Inc. | Mammalian peptide expression in plant cells |
NL8901932A (nl) | 1989-07-26 | 1991-02-18 | Mogen Int | Produktie van heterologe eiwitten in planten of plantecellen. |
US5959177A (en) | 1989-10-27 | 1999-09-28 | The Scripps Research Institute | Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies |
US5202422A (en) | 1989-10-27 | 1993-04-13 | The Scripps Research Institute | Compositions containing plant-produced glycopolypeptide multimers, multimeric proteins and method of their use |
US6288304B1 (en) | 1991-02-22 | 2001-09-11 | Sembiosys Genetics Inc. | Expression of somatotropin in plant seeds |
US5948682A (en) | 1991-02-22 | 1999-09-07 | Sembiosys Genetics Inc. | Preparation of heterologous proteins on oil bodies |
US6753167B2 (en) | 1991-02-22 | 2004-06-22 | Sembiosys Genetics Inc. | Preparation of heterologous proteins on oil bodies |
US5650554A (en) | 1991-02-22 | 1997-07-22 | Sembiosys Genetics Inc. | Oil-body proteins as carriers of high-value peptides in plants |
US6750046B2 (en) * | 1991-02-22 | 2004-06-15 | Sembiosys Genetics, Inc. | Preparation of thioredoxin and thioredoxin reductase proteins on oil bodies |
SE9500778D0 (sv) | 1995-03-03 | 1995-03-03 | Pharmacia Ab | Process for producing a protein |
GB9926084D0 (en) * | 1999-11-03 | 2000-01-12 | King S College London | Recombinant fusion molecules |
US20040253586A1 (en) * | 1999-12-08 | 2004-12-16 | Siva Reddy | Plastid transformation |
GB2364705A (en) * | 2000-07-14 | 2002-02-06 | Icgeb | Fusion protein expression in plastids |
AU2004247762B2 (en) * | 2003-06-17 | 2010-05-27 | Sembiosys Genetics Inc. | Methods for the production of insulin in plants |
-
2004
- 2004-11-12 TW TW093134564A patent/TW200526778A/zh unknown
- 2004-11-15 WO PCT/CA2004/001960 patent/WO2005047455A2/en active Application Filing
- 2004-11-15 MX MXPA06005363 patent/MXPA06005363A/es active IP Right Grant
- 2004-11-15 AU AU2004289720A patent/AU2004289720B2/en not_active Ceased
- 2004-11-15 AR ARP040104214A patent/AR047769A1/es not_active Application Discontinuation
- 2004-11-15 CA CA002544239A patent/CA2544239A1/en not_active Abandoned
- 2004-11-15 CN CN2004800404508A patent/CN1906296B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-11-15 JP JP2006538622A patent/JP2007510420A/ja active Pending
- 2004-11-15 EA EA200600946A patent/EA015167B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-11-15 KR KR1020067011765A patent/KR20060124633A/ko not_active Application Discontinuation
- 2004-11-15 EP EP04797212A patent/EP1682664A4/en not_active Withdrawn
- 2004-11-15 NZ NZ547024A patent/NZ547024A/en not_active IP Right Cessation
- 2004-11-15 BR BRPI0416589-6A patent/BRPI0416589A/pt not_active IP Right Cessation
- 2004-11-15 US US10/987,454 patent/US7786352B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-04-27 IL IL175248A patent/IL175248A0/en unknown
- 2006-05-30 NO NO20062480A patent/NO20062480L/no not_active Application Discontinuation
-
2010
- 2010-06-18 US US12/819,068 patent/US20120059150A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002050289A1 (en) * | 2000-12-19 | 2002-06-27 | Sembiosys Genetics, Inc. | Methods for the production of multimeric proteins, and related compositions |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009107820A1 (ja) * | 2008-02-28 | 2009-09-03 | トヨタ自動車株式会社 | 種子中の油脂量の評価方法及び油脂含量が変化した植物体のスクリーニング方法 |
JP2009201435A (ja) * | 2008-02-28 | 2009-09-10 | Toyota Motor Corp | 種子中の油脂量の評価方法及び油脂含量が変化した植物体のスクリーニング方法 |
US8173435B2 (en) | 2008-02-28 | 2012-05-08 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Method for evaluating oil-and-fat amount in seed and method for screening for plant exhibiting varied level of oil-and-fat content |
WO2009145180A1 (ja) * | 2008-05-28 | 2009-12-03 | 国立大学法人京都大学 | 新規選択マーカー遺伝子およびその利用 |
JP5499408B2 (ja) * | 2008-05-28 | 2014-05-21 | 国立大学法人京都大学 | 新規選択マーカー遺伝子およびその利用 |
JP2014502498A (ja) * | 2010-12-23 | 2014-02-03 | フィリップ・モーリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム | 植物においてアポリポプロテインを製造する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2004289720B2 (en) | 2011-02-03 |
EP1682664A2 (en) | 2006-07-26 |
NZ547024A (en) | 2009-09-25 |
US20120059150A1 (en) | 2012-03-08 |
CN1906296A (zh) | 2007-01-31 |
CA2544239A1 (en) | 2005-05-26 |
MXPA06005363A (es) | 2006-07-19 |
WO2005047455A2 (en) | 2005-05-26 |
US7786352B2 (en) | 2010-08-31 |
KR20060124633A (ko) | 2006-12-05 |
EA200600946A1 (ru) | 2006-12-29 |
US20050172359A1 (en) | 2005-08-04 |
WO2005047455A3 (en) | 2005-07-21 |
BRPI0416589A (pt) | 2007-01-30 |
EP1682664A4 (en) | 2008-04-02 |
AU2004289720A1 (en) | 2005-05-26 |
TW200526778A (en) | 2005-08-16 |
NO20062480L (no) | 2006-08-09 |
EA015167B1 (ru) | 2011-06-30 |
AR047769A1 (es) | 2006-02-22 |
CN1906296B (zh) | 2013-09-11 |
IL175248A0 (en) | 2006-09-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20120059150A1 (en) | Methods for the production of apolipoproteins in transgenic plants | |
JP4864701B2 (ja) | 植物におけるインスリンの製造方法 | |
RU2381275C2 (ru) | Получение пептидов и белков путем аккумулирования в эндоплазматическом ретикулуме растений | |
JP4570327B2 (ja) | 多量体タンパク質の生産のための方法、および関連組成物 | |
JP2019533436A (ja) | 腺毛状突起(glandular trichome)におけるカンナビノイドおよび他の化合物のマニピュレーションのための毛状突起特異的プロモーター | |
JP2008521767A (ja) | タンパク質の単離および精製 | |
US20080104725A1 (en) | Methods For The Modulation of Oleosin Expression In Plants | |
WO2002029022A2 (en) | Chlorophyllases | |
KR101957550B1 (ko) | 항진균성 식물 단백질, 펩티드 및 사용 방법 | |
US7098383B2 (en) | Methods for the production of multimeric immunoglobulins, and related compositions | |
ZA200604806B (en) | Methods for the production of apolipoproteins in transgenic plants | |
JP2002527070A (ja) | 植物において気孔の特徴を調節する手段および方法 | |
Reggi et al. | Seed-Specific Expression of Apolipoprotein AI Milano Dimer in Rice (Oryza Sativa L.) Transgenic Lines | |
US20100278775A1 (en) | Plant Bioreactor For The Production Of Interleukin-24 Cytokine | |
US20040158893A1 (en) | Final segregation of male meiotic products in plants | |
UA46689C2 (uk) | Спосіб експресії рекомбінантного поліпептиду рослинною або бактеріальною клітиною-хазяїном, спосіб одержання та вивільнення рекомбінантного поліпептиду з рекомбінантного злитого поліпептиду, спосіб виготовлення їжі на основі модифікованого насіння, спосіб одержання ферменту, зв'язаного з масляним тілом, спосіб експресії рекомбінантного поліпептиду, зв`язаного з масляним тілом, химерна днк, експресуюча касета, спосіб одержання трансгенної рослини, культура рослинних клітин |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20070305 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070305 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20071105 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101108 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110207 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110215 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110502 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120123 |