JP5499408B2 - 新規選択マーカー遺伝子およびその利用 - Google Patents
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Description
〔1〕植物は育成段階で遺伝子が水平伝播する可能性があるので、薬剤耐性遺伝子を有する植物を野外にて育成するには制限がある。
〔2〕所望の形質転換体を選抜する際に薬剤処理を行う必要があるので、選抜用の薬剤含有培地を別途調製する必要がある。
〔3〕薬剤耐性遺伝子を有している植物であっても、薬剤処理によりダメージを受ける。
〔4〕薬剤含有培地において生存し得ないレベルの形質転換体を得ることが困難である。
本発明は、新規選択マーカー遺伝子として利用可能なDNA構築物を提供する。本発明に係るDNA構築物は、種子タンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を含んでおり、該遺伝子が種子特異的プロモータに作動可能に連結されていることを特徴としている。
本発明はまた、上記DNA構築物が導入された形質転換体植物を提供する。本発明に係る形質転換体植物は、種子特異的プロモータに作動可能に連結された、種子タンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることを特徴としている。
(1)種子特異的プロモータに作動可能に連結された、種子タンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を含むDNA構築物を作製する;
(2)工程(1)において作製したDNA構築物から切り出した上記遺伝子を挿入した植物発現ベクターを、各々アグロバクテリウムに導入する;
(3)工程(2)で得られた各アグロバクテリウムを花芽に塗布すること(floral−dip法)により、植物体に感染させる;
(4)工程(3)で得られたアグロバクロテリウムに感染した植物体の各個体より、T1種子を回収する;
(5)工程(4)において回収した各T1種子において上記蛍光タンパク質由来の蛍光を検出し、蛍光が観察された植物を形質転換植物として選抜する;
(6)工程(5)において選抜した各形質転換体を生育し、T2種子を回収して種子ライブラリーを構築する;
(7)工程(6)において回収した各T2種子において上記蛍光タンパク質由来の蛍光を検出し、蛍光が観察された種子を選抜する。なお、工程(5)および(7)は、各T1種子(またはT2種子)の抽出物または各T1種子(またはT2種子)を成育した植物体からの抽出物から、上記融合タンパク質をコードする遺伝子または上記蛍光タンパク質をコードする遺伝子を検出する工程であってもよい。このように、本実施形態に係る形質転換体の作製方法は、DNA構築物を含むアグロバクテリウムを花芽または茎頂分裂組織に塗布する工程を包含すればよいともいえる。
本発明に係るDNA構築物を用いれば、目的のタンパク質が発現している種子を容易に選抜し得る。すなわち、本発明はまた、形質転換体植物を選抜する方法を提供する。本発明に係る形質転換体植物を選抜する方法は、種子特異的プロモータに作動可能に連結された、種子タンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子が種子中に存在していることを検出する工程を包含することを特徴としている。1つの局面において、本発明に係る形質転換体植物を選抜する方法は、形質転換体植物を作製する方法の工程として包含され得、例えば、上記形質転換体植物を作製する方法における工程(5)〜(7)であり得る。すなわち、本方法において、上記検出する工程は、上記蛍光タンパク質による蛍光を種子から検出することを含んでも、上記融合タンパク質をコードする遺伝子または上記蛍光タンパク質をコードする遺伝子を種子抽出物から検出することを含んでもよい。
本発明はさらに、タンパク質生産方法を提供する。本発明に係るタンパク質生産方法は、形質転換体植物内にてタンパク質を生産する方法であって、種子特異的プロモータに作動可能に連結された、種子タンパク質と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする第1の遺伝子を含んでいるDNA構築物に、目的のタンパク質をコードする第2の遺伝子を挿入する工程;および得られたDNA構築物を植物体に導入する工程を包含することを特徴としている。本方法において、第2の遺伝子は、種子特異的プロモータに作動可能に連結されていても、第2の遺伝子によってコードされるタンパク質を目的の組織にて発現させるための第2のプロモータに作動可能に連結されていてもよい。
試薬は特に記述しない場合は、ナカライテスクもしくは和光純薬工業から購入したものを用いた。
植物材料としてシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のエコタイプCol-0を用いた。Murashige and Skoog Plant Salt Mixtureを、アガロースと混合して調整した固形培地(MS培地)を用いた。アガロースは最終濃度が0.9%(w/w)になるように用いた。また、ショ糖を最終濃度0−1%になるように適宜加えた。種子表面を滅菌するために、70%エタノールで10分間処理した後、99%エタノールで1回洗浄した。培地上に種子を無菌的に播種し、3日間4℃で暗所にて低温吸水処理を適宜行った。その後、22℃で連続明条件下にて育成した。育成には人工気象機(サンヨーグロースチャンバーMLR−350)および白色蛍光灯(FL40SS・W/37、40形、37ワット)を使用した。
CLO3について、他のタンパク質と相同性の低い、特異的なアミノ酸配列を有している部分を、Peptide Synthesizer model 431 A (Applied Biosystems)を用いて化学合成した。
CLO3:CVTSQRKVRNDLEETL(配列番号11)
3-maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester (Sigma-Aldrich)により、合成したペプチドを、BSAと架橋した。BSAと架橋したペプチドを、免疫助成剤である完全フロイントアジュバントとともにウサギに皮下注射した。免疫開始の3週間後から1週間おきに4回、不完全フロイントアジュバントとともに追加接種を行った。最後の追加接種から1週間後にウサギより採取した血液から抗体を精製した。
SDS−PAGEを、Laemmli et al. J. Mol. Biol. 47, 69-85 (1970)の方法に準じて行った。タンパク質試料をSDSサンプル緩衝液(4重量%SDS、100mM Tris−HCl、10重量% 2−メルカプトエタノール、20重量% グリセロール、0.1% BPB(それぞれ試料溶解液中の最終濃度を示す。))に懸濁し、95℃で5分間加熱した。その後、7.5−15% アクリルアミドグラディエントゲル(BIO CRAFT)に、加熱したタンパク質試料をアプライした。電気泳動後のゲルを、CBB染色液(0.25重量% Coomassie blue R250,45%メタノール、10%酢酸)を用いて1時間染色した。その後、脱染色液A(45%メタノール、10%酢酸)中で1時間、脱染色液B(5%メタノール、7%酢酸)中で12時間、ゲルの脱染色を行い、タンパク質のバンドを検出した。
15%アクリルアミドゲルを用いて、上記の方法と同様にSDS−PAGEを行った。電気泳動後、ゲルを転写用液(100mM Tris−glycine(pH6.8)、20%メタノール)に浸し、5分間振盪した後、同じ溶液を用いて前処理したナイロン膜とろ紙との間に配置した。セミドライブロッター装置(Bio Craft)を用いて、2mA/cm2の条件下で、ゲル内のタンパク質をナイロン膜 (Immunobilon-P,MILLIPORE) に電気的に転写した。
〔2〕OLE1GFPマーカーを有しているCLO3過剰発現形質転換植物の作出
カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモータ(35Sプロモータと略す。)の制御下にてCLO3を過剰発現する形質転換植物の作出を試みた。植物用の形質転換選択マーカーとしてOLE1およびGFPの融合遺伝子マーカー(OLE1GFPマーカー)を用いた。コンストラクトの作製にはGateway Technology (Invitrogen) の方法を用いた。
デスティネーションベクターpBGWFS7(Plant System Biology)は、ゲートウェイ・マルチクローニングサイトの下流にGFP-GUS融合タンパク質のコード領域を有している。pBGWFS7を制限酵素Nru1で処理することにより、ベクター内のGUSコード領域を取り除いた改変デスティネーションベクターpBGWF7を作製した。
OLE1のC末端にGFPを融合させたタンパク質(OLE1GFP)を発現させるために、OLE1遺伝子について、タンパク質のコード領域の上流約2kbをプロモータ領域として用いた。GFPをOLE1タンパク質のC末端側に融合させるため、OLE1コード領域の終止コドンを除去し、フレームシフトを防ぐために、リバース側のプライマーに1塩基グアニンを付加した。Col-0のゲノムを鋳型にしてTOYOBO KOD-plus- PolymeraseによってOLE1遺伝子を増幅し、pENTER/D-TOPO (Invitrogen) にサブクローニングし、エントリーベクターpOLE1を作製した。エントリーベクターpOLE1についてABI BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用いて塩基配列を確認した。
OLE1_Fwd,5’−CACCCTACTTAGATCAACACATAAA−3’(配列番号12)
OLE1_Rev,5’−GAGTAGTGTGCTGGCCACCACG−3’(配列番号13)。
Gateway Technologyの方法に従い、改変デスティネーションベクターpBGWD7とエントリーベクターpOLE1との間でLR反応を行い、発現ベクターpB−OLE1GFPコンストラクトを作製した。
デスティネーションベクターpH2GW7(Plant System Biology)を制限酵素Aat2で処理し、35Sプロモータ、ゲートウェイ・マルチクローニングサイト、35Sターミネータを含む3kDaのDNA断片を得た。発現ベクターpB−OLE1GFPについても同じくAat2で処理し、さらに分子内結合を防ぐためにアルカリフォスファターゼで処理したDNA断片を得た。2つの断片をライゲーションすることで、改変デスティネーションベクターpB−OLE1GFP−2GW7を作製した(図1上図)。
改変デスティネーションベクターpB−OLE1GFP−2GW7に組み込む遺伝子として、オイルボディタンパク質の一つであるカレオシンのアイソフォームの一つであるCLO3を用いた(Chen et al. Plant Cell Physiol. 40, 1079-1086 (1999), Naested et al. Plant Mol. Biol. 44, 463-476 (2000), Frandsen et al. Physiol. Plant 112, 301-307 (2001), Hanano et al. J. Biol. Chem. 281, 33140-33151 (2006))。CLO3 mRNAは乾燥ストレス、塩ストレス、アブシジン酸処理を行うことによって栄養器官にて誘導される(Takahashi et al. Plant Cell Physiol. 41, 898-903 (2000))。CLO3タンパク質の蓄積を調べたところ、7日目の実生では蓄積が見られない(図4(a))。
CLO3_Fwd;5’−CACCATGGCAGGAGAGGCAGAGGCTT−3’(配列番号14)
CLO3_Rev;5’−TTAGTCTTGTTTGCGAGAATTGGCCC−3’(配列番号15)。
Gateway Technologyの方法に従い、エントリーベクターpCLO3とpB−OLE1GFP−2GW7の間でLR反応を行い、発現ベクターpB−OLE1GFP−35S−CLO3コンストラクトを作製した(図1下図)。pB−OLE1GFP−2GW7は35Sプロモータの下流にクローニングサイトが存在し、LR反応により目的遺伝子を35Sプロモータにより過剰発現させることができる。
作製したOLE1GFP融合遺伝子を含む改変デスティネーションベクターとして、35S過剰発現用ベクター(pB−OLE1GFP−2GW7)以外に、汎用ベクター(pH−OLE1GFP−GW)、RNAi用ベクター(pH−OLE1GFP−7GWIWG2(I))、およびプロモータ解析用ベクター(pK−OLE1GFP−GWFS7)をさらに作製した(図7)。
OLE1GFP−Apa1_Fwd;5’−CACCGGGCCCTACTTAGATCAACACATAAA−3’(配列番号16)、OLE1GFP−Apa1_Rev;5’−GGGCCCTCGCATGCCTGCAGGTCACTGGAT−3’(配列番号17)、OLE1GFP−Spe1_Fwd;5’−CACCACTAGTTAGTAAGTGAAGAACCACAA−3’(配列番号18)、OLE1GFP−Spe1_Rev;5’−ACTAGTCGCATGCCTGCAGGTCACTGGAT−3’(配列番号19)。
作製した発現ベクターpB−OLE1GFP−35S−CLO3をエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens GV3101株)に導入し、floral−dip法を用いて野生型Col-0を形質転換した(Daimon et al. 改訂3版 モデル植物の実験プロトコール.秀潤社, 149-154 (2005))。OLE1GFPマーカーを指標にして、形質転換体を選抜した。この形質転換体植物を35S:CLO3(OLE1GFP)と称する。
前述の発現ベクターpB−OLE1GFPコンストラクトをエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens GV3101株)に導入し、floral−dip法によって野生型Col-0を形質転換した。OLE1GFPマーカーを指標にして、形質転換体を選抜した。導入遺伝子に対して1遺伝子座として分離する系統を単離し、導入遺伝子をホモに有している系統を得た。それぞれのホモ系統の種子に対して、イムノブロットによりそれぞれのタンパク質の発現を確認した。
種子集団を蛍光顕微鏡下で観察し、GFP蛍光を示す種子の存在や、その分離比を確認した。GFP蛍光を示す種子を選抜するときは、先を少し湿らせた爪楊枝を用いて種子を集団から選抜した。蛍光強度を測定する場合は、写真撮影し、画像をPhotoshop Elements 5.0を用いて蛍光の強さを測定した。種子はMS培地に播種した。また、必要に応じて、Glufosinate-ammonium (10mg/L)を含む培地に播種した。
植物用の形質転換選択マーカーとして、OLE1とTagRFP(Evrogen JSC, Moscow, Russia) (Merzlyak et al., Bright monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime, Nat. Methods, vol.4, 555-7, 2007)との融合遺伝子マーカー(OLE1TagRFPマーカー)を持つ改変デスティネーションベクターを作製した。OLE1TagRFPマーカーは、OLE1プロモータ、OLE1−TagRFP融合遺伝子およびNOSターミネーターから構成される。
OLE1のC末端にTagRFPを融合させたタンパク質(OLE1TagRFP)を発現させるために、OLE1遺伝子について、タンパク質のコード領域の上流約2kbをプロモータ領域として用いた。TagRFPをOLE1タンパク質のC末端側に融合させるため、OLE1コード領域の終止コドンを除去した。pB-OLE1GFPを鋳型にしてTOYOBO KOD-plus- Polymeraseによって約2.2kbのOLE1遺伝子を増幅した.またTOYOBO KOD-plus- Polymeraseによって約0.7kbのTagRFPの断片と,約0.2kbのNOSターミネーターの断片を増幅した。
OLE1_Fwd2,5´−CACCACTAGTGTATGTAGGTATAGTAACAT−3´(配列番号20)
OLE1_Rev2,5´−CAGCTCGCTCATAGTAGTGTGCTGGCCACC−3´(配列番号21)
TagRFP_Fwd,5´−CAGCACACTACTATGAGCGAGCTGATTAAG−3´(配列番号22)
TagRFP_Rev,5´−TGTTTGAACGATTCACTTGTGCCCCAGTTT−3’(配列番号23)
NOST_Fwd,5´−GGGCACAAGTGAATCGTTCAAACATTTGGC−3’(配列番号24)
NOST_Rev,5´−ACTAGTGATCTAGTAACATAGATGACACC−3’(配列番号25)
〔3−2〕OLE1TagRFPマーカーの作製
〔3−1〕で増幅したOLE1遺伝子の断片、TagRFPの断片およびNOSターミネーターの断片を用い、TOYOBO KOD-plus- Polymeraseによって、OLE1プロモータ、OLE1−TagRFP融合遺伝子およびNOSターミネーターからなる約3.5kbのOLE1TagRFPマーカー断片を増幅した。この際、プライマーに制限酵素Spe1、Hind3またはApa1の認識配列を付加し、OLE1TagRFPマーカー断片の前後に,Spe1、Hind3またはApa1の認識配列を付加した。得られた断片のそれぞれを、pENTER/D−TOPO(Invitrogen)にサブクローニングし、エントリーベクターpOLE1TagRFP−Spe1、pOLE1TagRFP−Hind3およびpOLE1TagRFP−Apa1を作製した。エントリーベクターpOLE1TagRFP−Spe1、pOLE1TagRFP−Hind3およびpOLE1TagRFP−Apa1について、ABI BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用いて塩基配列を確認した。
FAST−R_Spe1Fwd,5’−CACCACTAGTGTATGTAGGTATAGTAACAT−3’(配列番号26)
FAST−R_Spe1Rev,5’−ACTAGTGATCTAGTAACATAGATGACACC−3’(配列番号27)
FAST−R_Hind3Fwd,5’−CACCAAGCTTCAAGTGTATGTAGGTATAGT−3’(配列番号28)
FAST−R_Hind3Rev,5’−AAGCTTGATCTAGTAACATAGATGACACC−3’(配列番号29)
FAST−R_Apa1Fwd,5’−CACCGGGCCCTTCAAGTGTATGTAGGTATA−3’(配列番号30)
FAST−R_Apa1Rev,5’−GGGCCCATCTAGTAACATAGATGACACC−3’(配列番号31)
〔3−3〕改変デスティネーションベクターpHGWF7の作製
デスティネーションベクターpHGWFS7(Plant System Biology)は、ゲートウェイ・マルチクローニングサイトの下流にGFP-GUS融合タンパク質のコード領域を有している。pHGWFS7を制限酵素Nru1で処理することにより、ベクター内のGUSコード領域を取り除いた改変デスティネーションベクターpHGWF7を作製した。
デスティネーションベクターpHGWを制限酵素Spe1で処理し、得られたDNA断片を、分子内結合を防ぐためにアルカリフォスファターゼで処理した。エントリーベクターpOLE1TagRFP−Spe1についても同様に制限酵素Spe1で処理し、OLE1−TagRFP融合遺伝子,NOSターミネーターを含む3.5kDaのDNA断片を精製した。これら2つの断片をライゲーションして、汎用ベクターである改変デスティネーションベクターpFAST−R01を作製した(図8)。
デスティネーションベクターpBGWFS7(Plant System Biology)を制限酵素Apa1で処理し、得られたDNA断片を、分子内結合を防ぐためにアルカリフォスファターゼで処理した。エントリーベクターpOLE1TagRFP−Apa1についても同様に制限酵素Apa1で処理し、OLE1−TagRFP融合遺伝子,NOSターミネーターを含む3.5kDaのDNA断片を精製した。これら2つの断片をライゲーションして、35S過剰発現用ベクターである改変デスティネーションベクターpFAST−R02を作製した(図8)。
デスティネーションベクターpH7GWIWG2(I)を制限酵素Apa1で処理し、得られたDNA断片を、分子内結合を防ぐためにアルカリフォスファターゼで処理した。エントリーベクターpOLE1TagRFP−Apa1についても同様に制限酵素Apa1で処理し、OLE1−TagRFP融合遺伝子とNOSターミネーターとを含む3.5kDaのDNA断片を精製した。これら2つの断片をライゲーションして、RNAi(ノックダウン)用ベクターである改変デスティネーションベクターpFAST−R03を作製した(図8)。
デスティネーションベクターpGWB405 (Nakagawa et al.,Development of series of gateway binary vectors, pGWBs, for realizing efficient construction of fusion genes for plant transformation, J. Biosci. Bioeng., 2007, vol. 104, 34-41)を制限酵素Hind3で処理し、得られたDNA断片を、分子内結合を防ぐためにアルカリフォスファターゼで処理した。エントリーベクターpOLE1TagRFP−Hind3についても同様に制限酵素Hind3で処理し、OLE1−TagRFP融合遺伝子とNOSターミネーターとを含む3.5kDaのDNA断片を精製した。これら2つの断片をライゲーションして、C末端にGFPを融合させた目的タンパク質を発現させるための、改変デスティネーションベクターpFAST−R05を作製した(図8)。
デスティネーションベクターpGWB406 (Nakagawa et al., J. Biosci. Bioeng., 2007, vol. 104, 34-41)を制限酵素Hind3で処理し、得られたDNA断片を、分子内結合を防ぐためにアルカリフォスファターゼで処理した。エントリーベクターpOLE1TagRFP−Hind3についても同様に制限酵素Hind3で処理し、OLE1−TagRFP融合遺伝子,NOSターミネーターを含む3.5kDaのDNA断片を精製した。これら2つの断片をライゲーションして、N末端にGFPを融合させた目的タンパク質を発現させるための、改変デスティネーションベクターpFAST−R06を作製した(図8)。
デスティネーションベクターpHGWF7を制限酵素Spe1で処理し、得られたDNA断片を、分子内結合を防ぐためにアルカリフォスファターゼで処理した。エントリーベクターpOLE1TagRFP−Spe1についても同様に制限酵素Spe1で処理し、OLE1−TagRFP融合遺伝子,NOSターミネーターを含む3.5kDaのDNA断片を精製した。これら2つの断片をライゲーションして、C末端にGFPを融合させた目的タンパク質を発現させるための、改変デスティネーションベクターpFAST−R07を作製した(図8)。
Gateway Technologyの方法に従い、エントリーベクターpCLO3とpFAST−R02の間でLR反応を行い、発現ベクターpB−35S−CLO3−OLE1TagRFPコンストラクトを作製した。pFAST−R02は、35Sプロモータの下流にクローニングサイトが存在し、LR反応により目的遺伝子を35Sプロモータにより過剰発現させることができる。
作製した発現ベクターpB−35S−CLO3−OLE1TagRFPをエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens GV3101株)に導入し、floral−dip法を用いて野生型Col-0を形質転換した(Daimon et al. 改訂3版 モデル植物の実験プロトコール.秀潤社, 149-154 (2005))。OLE1TagRFPマーカーを指標にして、形質転換体を選抜した。結果は図9に示した。
Gateway Technologyの方法に従い、エントリーベクターpCLO3とpFAST−R06との間でLR反応を行い、発現ベクターpB−OLE1TagRFP−35S−GFPCLO3コンストラクトを作製した。pFAST−R06は35Sプロモータの下流にGFP遺伝子とクローニングサイトが存在し、LR反応により、GFP遺伝子および目的遺伝子由来の融合タンパク質を35Sプロモータにより過剰発現させることができる。
作製した発現ベクターpB−OLE1TagRFP−35S−GFPCLO3をエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens GV3101株)に導入し、floral−dip法を用いて野生型Col-0を形質転換した(Daimon et al. 改訂3版 モデル植物の実験プロトコール.秀潤社, 149-154 (2005))。OLE1TagRFPマーカーを指標にして、形質転換体を選抜した。この形質転換体植物を35S::GFP−CLO3(FAST−R06)と称する。導入遺伝子に対して1遺伝子座として分離する系統を単離し、導入遺伝子をホモに有している系統を得た。
〔4〕結果および考察
本発明に係るDNA構築物の構造を、図1に示す。図1の上図は、CaMV35Sプロモータによる、目的遺伝子が過剰発現する植物体を作製するためのベクター(pB−OLEGFP−2GW7)であり、図1の下図は、一実施形態としてCLO3を過剰発現させるためのベクター(pB−OLE1GFP−35S::CLO3)を示す。図中、LBはLeft Borderを示し、RBはRight Borderを示し、BarはBasta遺伝子を示し、p35sはCaMV35Sプロモータを示し、t35sはCaMV35Sターミネータを示し、CmRはクロラムフェニコール耐性遺伝子を示し、ccdBは大腸菌ジャイレース阻害タンパク質を示す。
Claims (15)
- OLE1と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を含んでいるDNA構築物であって、該遺伝子が配列番号6に示される塩基配列からなるオレオシンプロモータに作動可能に連結されていることを特徴とするDNA構築物。
- さらに、目的のタンパク質をコードする第2の遺伝子と、第2の蛍光タンパク質をコードする遺伝子とが上記配列番号6に示される塩基配列からなるオレオシンプロモータに作動可能に連結されており、
該第2の蛍光タンパク質は、上記OLE1と蛍光タンパク質との融合タンパク質を構成する蛍光タンパク質とは異なる色の蛍光を発するタンパク質であることを特徴とする請求項1に記載のDNA構築物。 - 目的のタンパク質を目的の組織にて発現させるための第2のプロモータをさらに含んでいることを特徴とする請求項1に記載のDNA構築物。
- 上記第2のプロモータには、目的のタンパク質をコードする第2の遺伝子と、第2の蛍光タンパク質をコードする遺伝子とが作動可能に連結されており、
該第2の蛍光タンパク質は、上記OLE1と蛍光タンパク質との融合タンパク質を構成する蛍光タンパク質とは異なる色の蛍光を発するタンパク質であることを特徴とする請求項3に記載のDNA構築物。 - 請求項1〜4のいずれか1項に記載のDNA構築物を含んでいることを特徴とする選択マーカー。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のDNA構築物を備えていることを特徴とする選択マーカーキット。
- 配列番号6に示される塩基配列からなるオレオシンプロモータに作動可能に連結された、OLE1と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする形質転換体植物。
- 配列番号6に示される塩基配列からなるオレオシンプロモータに作動可能に連結された、OLE1と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子が種子中に存在していることを検出する工程を包含することを特徴とする形質転換体植物を選抜する方法。
- 上記検出する工程が、上記蛍光タンパク質による蛍光を種子から検出することを含む、請求項8に記載の方法。
- 上記検出する工程が、上記融合タンパク質をコードする遺伝子または上記蛍光タンパク質をコードする遺伝子を種子抽出物から検出することを含む、請求項8に記載の方法。
- さらに、上記配列番号6に示される塩基配列からなるオレオシンプロモータに作動可能に連結された、第2の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が種子中に存在していることを検出する工程を包含し、該第2の蛍光タンパク質は、上記OLE1と蛍光タンパク質との融合タンパク質を構成する蛍光タンパク質とは異なる色の蛍光を発するタンパク質である、請求項8に記載の方法。
- さらに、第2のプロモータに作動可能に連結された、第2の蛍光タンパク質をコードする遺伝子が目的の組織に存在していることを検出する工程を包含し、該第2の蛍光タンパク質は、上記OLE1と蛍光タンパク質との融合タンパク質を構成する蛍光タンパク質とは異なる色の蛍光を発するタンパク質である、請求項8に記載の方法。
- 植物体内でタンパク質を生産する方法であって、
配列番号6に示される塩基配列からなるオレオシンプロモータに作動可能に連結された、OLE1と蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする遺伝子を含んでいるDNA構築物に、目的のタンパク質をコードする第2の遺伝子を挿入する工程;および
得られたDNA構築物を植物体に導入する工程
を包含することを特徴とする生産方法。 - 上記DNA構築物が、目的のタンパク質を目的の組織にて発現させるための第2のプロモータをさらに含んでおり、上記挿入する工程が、第2の遺伝子が第2のプロモータに作動可能に連結することを含む、請求項13に記載の生産方法。
- 上記導入する工程が、floral−dip法またはvacuum−infiltration法を行うことを含む、請求項13または14に記載の生産方法。
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