JP4570327B2 - 多量体タンパク質の生産のための方法、および関連組成物 - Google Patents
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米国成文法第35編119条(e)項(35 U.S.C.§119(e))に基づき、van Rooijenらに対する「METHODS FOR THE PRODUCTION OF REDOX PROTEINS」と題する2001年7月5日に提出された米国特許仮出願第60/302,885号に対する優先権の利益を請求する。本出願は、van Rooijenらに対する「METHODS FOR THE PRODUCTION OF REDOX PROTEINS」と題する2001年12月4日に提出された米国実用特許出願第10/006,038号(これは、Heifetzらに対する「METHOD OF PRODUCTION AND DELIVERY OF THIOREDOXIN」と題する2000年12月19日に提出された米国実用特許出願第09/742,900号の一部継続出願である)の一部継続出願でもある。本出願は、米国実用特許出願第09/742,900号の一部継続出願でもある。これらの仮出願および実用出願のそれぞれの内容は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
本発明は、多量体タンパク質複合体、酸化還元タンパク質および組換えポリペプチド;ならびにそれらの生産のための改良された方法に関する。
多量体タンパク質(すなわち、多数のポリペプチド鎖を含むタンパク質)は、生物的および商業的に重要な種類のタンパク質である。例えば、抗体は広範囲にわたる疾病状態の治療に用いられる多量体タンパク質である。しかし、その複雑さのため、多量体タンパク質の製造はかなり困難なことが多い。
本発明は、第1および/もしくは第2の組換えポリペプチド、多量体タンパク質複合体、ヘテロ多量体タンパク質複合体、多量体融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、免疫グロブリンポリペプチド鎖、免疫グロブリン、酸化還元融合ポリペプチド、ならびに/またはチオレドキシン関連タンパク質を、油体(oil-body)と会合した状態で生産する、新規かつ改良された方法に関する。すなわち、本明細書に提供するのは、組換え多量体タンパク質複合体を生産する方法であって、(a)油体を含む細胞において第1の組換えポリペプチドおよび第2の組換えポリペプチドを産生させる段階であって、前記第1の組換えポリペプチドは前記第2の組換えポリペプチドと会合して前記多量体タンパク質複合体を形成することができる段階;ならびに(b)前記油体および前記第1の組換えポリペプチドと会合しうる油体標的指向性タンパク質(oil-body-targeting-protein)を介して、前記多量体タンパク質複合体を油体と会合させる段階、を含む方法である。
(a)(i)前記細胞における転写を調節しうる第1の核酸配列であって、次のものと機能的に結合したもの;
(ii)第1の組換えポリペプチドをコードする第2の核酸配列
を含む第1のキメラ核酸配列を細胞に導入する段階;
(b)(i)前記細胞における転写を調節しうる第3の核酸配列であって、次のものと機能的に結合したもの;
(ii)第2の組換えポリペプチドをコードする第4の核酸配列
を含む第2のキメラ核酸配列を前記細胞に導入する段階;
(c)油体を含む子孫細胞における前記第1および第2の組換えポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記細胞を増殖させる段階であって、前記第1の組換えポリペプチドおよび前記第2の組換えポリペプチドは多量体タンパク質複合体を形成することができる段階;ならびに
(d)前記油体および前記第1の組換えポリペプチドと会合しうる油体標的指向性タンパク質を介して、前記第1の組換えポリペプチドを油体と会合させる段階、を含む方法である。本方法はさらに、子孫細胞から、多量体タンパク質複合体を含む油体を単離することも考えている。第2の組換えポリペプチドを、油体および第2の組換えポリペプチドと会合しうる第2の油体標的指向性タンパク質と会合させることができる。前記油体標的指向性タンパク質のそれぞれは油体タンパク質または免疫グロブリンであってよい。油体標的指向性タンパク質はオレオシンまたはカレオシンであってよい。油体標的指向性タンパク質がオレオシンまたはカレオシンでありうる場合、第1の組換えポリペプチドを前記オレオシンまたはカレオシンと融合させることができる。同様に、第2の組換えポリペプチドを、油体と会合しうる第2のオレオシンまたは第2のカレオシンと融合させることができる。第1および第2の組換えポリペプチドを前記第1および第2のポリペプチドを含む多量体融合タンパク質として産生させ、多量体タンパク質複合体を形成させることができる。多量体タンパク質複合体はヘテロ多量体タンパク質複合体であってよく、ヘテロ多量体タンパク質複合体は酵素活性のある酸化還元複合体または免疫グロブリンであってよい。1つの態様において、第1の組換えポリペプチドおよび前記第2の組換えポリペプチドは前記子孫細胞内で多量体タンパク質複合体を形成することができる。もう1つの態様において、第1の組換えポリペプチドはチオレドキシンであってよく、第2の組換えポリペプチドはチオレドキシンレダクターゼであってよい。特定の態様において、チオレドキシンは配列番号:38、42、46、50および配列番号:52〜194からなる群より選択することができ、チオレドキシンレダクターゼは配列番号:8、9、10、40、44、48、50および配列番号:195〜313に示されたものからなる群より選択することができる。もう1つの態様において、第1の組換えポリペプチドは免疫グロブリンポリペプチド鎖であってよい。例えば、第1の組換えポリペプチドは免疫グロブリン軽鎖または免疫活性のあるその一部であってよく、第2の組換えポリペプチドは免疫グロブリン重鎖または免疫活性のあるその一部であってよい。本態様において、油体標的指向性タンパク質はプロテインA、プロテインLまたはプロテインGを含みうる。細胞はベニバナ細胞などの植物細胞であってよい。
(a)油体および第1の組換えポリペプチドを含む細胞を含む第1の植物を調製する段階であって、前記第1の組換えポリペプチドは油体標的指向性タンパク質を介して前記油体と会合することができる段階;
(b)油体および第2の組換えポリペプチドを含む細胞を含む第2の植物を調製する段階;ならびに
(c)油体を含む細胞を含む子孫植物を作製するために前記第1の植物を前記第2の植物と性的に交配させる段階であって、前記油体は前記第1の組換えポリペプチドと会合することができ、前記第1の組換えポリペプチドは前記第2の組換えポリペプチドと会合して前記組換え多量体タンパク質複合体を形成することができる、を含む方法である。第2の組換えポリペプチドは、第1の植物において第2の油体標的指向性タンパク質を介して油体と会合しうる。油体は、前記多量体タンパク質複合体を含む子孫植物から単離しうる。油体標的指向性タンパク質は油体タンパク質または免疫グロブリンから選択することができ、この際、油体タンパク質はオレオシンまたはカレオシンであってよい。第1の組換えポリペプチドをオレオシンまたはカレオシンと融合させることができ、第2の組換えポリペプチドを、油体と会合しうる第2のオレオシンまたは第2のカレオシンと融合させることができる。第1および第2の組換えポリペプチドはヘテロ多量体タンパク質複合体などの多量体タンパク質複合体を形成することができ、この際、ヘテロ多量体タンパク質複合体は酵素活性のある酸化還元複合体または免疫グロブリンであってよい。1つの特定の態様において、第1の組換えポリペプチドはチオレドキシンであり、第1の組換えポリペプチドはチオレドキシンレダクターゼである。チオレドキシンは配列番号:38、42、46、50および配列番号:52〜194からなる群より選択することができ、チオレドキシンレダクターゼは配列番号:8、9、10、40、44、48、50および配列番号:195〜313に示されたものからなる群より選択することができる。もう1つの態様において、第1の組換えポリペプチドは免疫グロブリンポリペプチド鎖であってよい。例えば、第1の組換えポリペプチドは免疫グロブリン軽鎖または免疫活性のあるその一部であってよく、第2の組換えポリペプチドは免疫グロブリン重鎖または免疫活性のあるその一部であってよい。本態様において、油体標的指向性タンパク質はプロテインA、プロテインLまたはプロテインGを含みうる。植物はベニバナ(safflower plant)であってよい。
(a)油体標的指向性タンパク質をコードする第1の核酸配列であって、次のものとリーディングフレーム内で機能的に結合したもの;
(b)第1の組換えポリペプチドをコードする第2の核酸配列であって、次のものとリーディングフレーム内で結合したもの;
(c)第2の組換えポリペプチドをコードする第3の核酸配列、この際、前記第1および第2の組換えポリペプチドは多量体タンパク質複合体を形成することができる、を含む核酸である。油体標的指向性タンパク質は油体タンパク質または免疫グロブリンから選択しうる。油体タンパク質オレオシンまたはカレオシンであってよい。多量体タンパク質複合体はヘテロ多量体タンパク質複合体であってよく、第1および第2の組換えポリペプチドは酵素活性のあるヘテロ多量体酸化還元複合体または免疫グロブリンを形成しうる。1つの特定の態様において、第1の組換えポリペプチドはチオレドキシンであり、第2の組換えポリペプチドはチオレドキシンレダクターゼである。チオレドキシンは配列番号:38、42、46、50および配列番号:52〜194から選択することができ、チオレドキシンレダクターゼは配列番号:8、9、10、40、44、48、50および配列番号:195〜313に示されたものからなる群より選択することができる。もう1つの態様において、第1の組換えポリペプチドは免疫グロブリンポリペプチド鎖であってよい。例えば、第1の組換えポリペプチドは免疫グロブリン軽鎖または免疫活性のあるその一部であってよく、第2の組換えポリペプチドは免疫グロブリン重鎖または免疫活性のあるその一部であってよい。本態様において、油体標的指向性タンパク質はプロテインA、プロテインLまたはプロテインGを含みうる。さらにもう1つの態様において、油体標的指向性タンパク質をコードする核酸配列と第1の組換えポリペプチドをコードする核酸配列との間に位置するものは、油体表面回避性(oil-body-surface-avoiding)リンカーアミノ酸配列をコードするリンカー核酸配列であってよい。油体表面回避性リンカーアミノ酸配列は実質的に負に荷電しているもの、または分子量が少なくとも35kdであるものでよい。選択的には、遺伝子融合物はさらに、酵素または化学物質によって特異的に切断されうるアミノ酸配列をコードするリンカー核酸配列を含み、このリンカー配列は非タンパク質分解性(non-proteolytic)リンカーでもある油体表面回避性リンカーアミノ酸の配列と第1の組換えポリペプチドをコードする前記配列との間に位置する。
a)第1の酸化還元タンパク質が第2の酸化還元タンパク質と結合したものを含む酸化還元融合ポリペプチドを細胞内で産生させる段階;
b)前記酸化還元融合ポリペプチドおよび前記油体と会合しうる油体標的指向性タンパク質を介して、前記酸化還元融合ポリペプチドを油体と会合させる段階;ならびに
c)前記酸化還元融合ポリペプチドと会合した前記油体を単離する段階、
を含む方法である。第1の酸化還元タンパク質はチオレドキシンであってよく、第1の酸化還元タンパク質はチオレドキシンレダクターゼであってよい。
a)細胞に以下を含むキメラ核酸配列を導入する段階;
1)前記細胞における転写を調節しうる第1の核酸配列であって、次のものと機能的に結合したもの;
2)(i)前記組換え融合ポリペプチドの油体に対する標的指向性を得るのに十分な油体タンパク質の部分をコードする核酸配列であって、次のものと結合したもの;(ii)第1の酸化還元タンパク質が第2の酸化還元タンパク質と融合したものを含む酸化還元融合ポリペプチドをコードする核酸配列、または第1の免疫グロブリンポリペプチド鎖が第2の免疫グロブリンポリペプチド鎖と結合したものを含む免疫グロブリンをコードする核酸配列、を含む組換え融合ポリペプチドをコードする第2の核酸配列であって、次のものと機能的に結合したもの;
3)前記細胞における転写を終結させうる第3の核酸配列
b)前記細胞を、油体を含む子孫細胞における前記酸化還元融合ポリペプチドまたは免疫グロブリンの発現を可能にする条件下で培養する段階;ならびに
c)前記子孫細胞から、前記酸化還元融合ポリペプチドまたは免疫グロブリンを含む前記油体を単離する段階、を含む方法である。ある特定の態様において、油体タンパク質の十分な部分をコードする前記核酸配列と酸化還元融合ポリペプチドまたは免疫グロブリンをコードする前記核酸配列との間に位置するものは、油体表面回避性リンカーアミノ酸配列をコードするリンカー核酸配列であってよい。油体表面回避性リンカーアミノ酸配列は実質的に負に荷電しているもの、または分子量が少なくとも35kdであるものでよい。選択的には、遺伝子融合物はさらに、酵素または化学物質によって特異的に切断されうるアミノ酸配列をコードするリンカー核酸配列を含み、このリンカー配列は油体表面回避性リンカーアミノ酸の配列と酸化還元融合ポリペプチドをコードする前記核酸配列との間に位置する。この選択的な態様では、前記酸化還元融合ポリペプチドを前記油体から切断する酵素または化学物質を導入し、それによって単離された酸化還元融合ポリペプチドを入手することも考えている。第1の酸化還元タンパク質はチオレドキシンであってよく、前記第2の酸化還元タンパク質はチオレドキシンレダクターゼであってよい。1つの態様において、チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼはアラビドプシス(Arabidopsis)から入手可能である。もう1つの態様において、第1の酸化還元タンパク質は、酸化還元融合ポリペプチドとして産生させた場合に、第2の酸化還元タンパク質を伴わない第1の酸化還元タンパク質の産生物と比べて活性が少なくとも5倍の高さである。
1)宿主細胞における転写を調節しうる第1の核酸配列であって、次のものと機能的に結合したもの;
2)(i)前記組換え融合ポリペプチドの油体に対する標的指向性を得るのに十分な油体タンパク質の部分をコードする核酸配列であって、次のものと結合したもの;(ii)第1の酸化還元タンパク質が第2の酸化還元タンパク質と融合したものを含む酸化還元融合ポリペプチドをコードする核酸配列、を含む組換え融合ポリペプチドをコードする第2の核酸配列であって、次のものと機能的に結合したもの;
3)前記細胞における転写を終結させうる第3の核酸配列。
油体タンパク質はオレオシンまたはカレオシンであってよく、第1の酸化還元タンパク質はチオレドキシンであってよく、前記第2の酸化還元タンパク質はチオレドキシンレダクターゼであってよい。ある特定の態様において、油体タンパク質の十分な部分をコードする前記核酸配列と酸化還元融合ポリペプチドをコードする前記核酸配列との間に位置するものは、油体表面回避性リンカーアミノ酸配列をコードするリンカー核酸配列であってよい。油体表面回避性リンカーアミノ酸配列は実質的に負に荷電しているもの、または分子量が少なくとも35kdであるものでよい。選択的には、遺伝子融合物はさらに、酵素または化学物質によって特異的に切断されうるアミノ酸配列をコードするリンカー核酸配列を含み、このリンカー配列は油体表面回避性リンカーアミノ酸の配列と酸化還元融合ポリペプチドをコードする前記配列との間に位置する。
a)遺伝子融合物と機能的に結合した種子特異的プロモーターを含む核酸構築物を含むトランスジェニック植物であって、遺伝子融合物が、油体タンパク質またはその活性断片をコードする領域が第1のチオレドキシン関連タンパク質またはその活性断片をコードする領域と機能的に結合したものを含み、遺伝子融合物がチオレドキシン関連活性を含む融合タンパク質をコードする、トランスジェニック植物を提供する段階;
b)植物から種子を入手する段階;および
c)種子から油体を単離することによって融合タンパク質を回収する段階、を含む方法である。1つの態様においては、融合タンパク質の部分精製を行うために油体を分画する。油体は融合タンパク質と会合した状態にあってよい。油体の分画後に油体タンパク質をチオレドキシン関連タンパク質から切断することができる。切断の段階には、プロテアーゼまたは化学的タンパク質分解を利用することが可能である。
a)融合タンパク質と会合した油体を含む調製物を提供する段階であって、融合タンパク質が油体タンパク質またはその活性断片、およびチオレドキシン関連タンパク質またはその活性断片を含む段階;ならびに
b)調製物を食品に添加し、それにより、チオレドキシン関連タンパク質または断片の活性によって食品のアレルゲン性を低下させる段階、を含む方法である。食品は小麦粉、小麦生地、ミルク、チーズ、ヨーグルトおよびアイスクリームであってよい。1つの態様では、NADPHの実質的な非存在下で、NADHを補因子として用いる。
a)融合タンパク質を含む調製物を提供する段階であって、融合タンパク質が油体タンパク質またはその活性断片およびチオレドキシン関連タンパク質またはその活性断片を含む段階;ならびに
b)調製物を酸化ストレスを受けやすい標的と接触させ、それによってストレスに抗して処理または防御を行う段階、を含む方法である。標的は、分子、分子複合体、細胞、組織および器官からなる群より選択しうる。
本明細書に以前に述べた通り、本発明は、第1および第2の組換えポリペプチド、多量体タンパク質複合体、ヘテロ多量体タンパク質複合体、多量体融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、免疫グロブリンポリペプチド鎖、免疫グロブリン、酸化還元融合ポリペプチド、ならびに第1および第2のチオレドキシン関連タンパク質の生産のための新規かつ改良された方法;ならびに関連した生成物に関する。これらの方法により、油体と会合した状態にある活性のある多量体タンパク質複合体の生産が可能になる。多量体タンパク質複合体と会合した油体は、種々の有用な乳濁液を調製するために用いうる。
(a)油体を含む細胞において第1の組換えポリペプチドおよび第2の組換えポリペプチドを産生させる段階であって、前記第1の組換えポリペプチドは細胞内で前記第2の組換えポリペプチドと会合して前記多量体タンパク質複合体を形成することができる段階;ならびに
(b)前記油体および前記第1の組換えポリペプチドと会合しうる油体標的指向性タンパク質を介して、前記多量体タンパク質複合体を油体と会合させる段階、
を含む方法である。
別に定義する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解しているものと同じ意味を持つ。許容される場合、本明細書の全開示内容を通じて言及されるすべての特許、特許出願、公開出願および他の刊行物、ならびにジェンバンク、スイスプロおよび他のデータベースからの配列は、その全体が参照として組み入れられる。
(a)(i)前記細胞における転写を調節しうる第1の核酸配列であって、次のものと機能的に結合したもの;
(ii)酸化還元タンパク質、免疫グロブリンペプチド鎖またはチオレドキシン関連タンパク質などの第1の組換えポリペプチドが油体と融合したものをコードする、第2の核酸配列
を含む第1のキメラ核酸配列を細胞に導入する段階;
(b)(i)前記細胞における転写を調節しうる第3の核酸配列であって、次のものと機能的に結合したもの;
(ii)第2の酸化還元タンパク質、第2の免疫グロブリンポリペプチド鎖または第2のチオレドキシン関連タンパク質などの第2の組換えポリペプチドをコードする、第4の核酸配列
を含む第2のキメラ核酸配列を前記細胞に導入する段階;
(c)油体を含む子孫細胞における前記第1および第2の組換えポリペプチドの発現を可能にする条件下で前記細胞を増殖させる段階であって、前記第1の組換えポリペプチドおよび前記第2の組換えポリペプチドは、好ましくは前記子孫細胞において、多量体タンパク質複合体を形成することができる段階;ならびに
(d)前記油体タンパク質を介して、前記第1の組換えポリペプチドを油体と会合させる段階、を含む方法である。
本明細書に提供する方法および組成物によれば、多量体タンパク質複合体を形成しうる任意の2つの組換えポリペプチドを用いてよい。2つの組換えポリペプチドをコードする核酸配列は任意の生物源から入手してもよく、または合成的に調製してもよい。一般に、多量体タンパク質をコードする核酸配列は当技術分野で知られており、容易に入手可能である。多量体タンパク質複合体をコードする既知の核酸配列を、例えば、cDNAライブラリーもしくはゲノムライブラリーのスクリーニングにより、または2-ハイブリッドシステムもしくはマルチ-ハイブリッドシステムを用いることにより、多量体タンパク質複合体をコードするこれまで発見されていない核酸配列を発見および同定する目的で、核酸配列に基づくプローブの設計および構築のために用いてもよい。このため、多量体タンパク質複合体をコードするさらなる核酸配列を本明細書の記載の通りに発見して用いることもできる。
第1および/または第2の組換えポリペプチド、多量体タンパク質複合体、ヘテロ多量体タンパク質複合体、多量体融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、免疫グロブリン、免疫グロブリンポリペプチド鎖、酸化還元融合ポリペプチド、ならびに第1および/または第2のチオレドキシン関連タンパク質を、ポリペプチドまたは複合体の活性および/または到達性(accessibility)を改善することを目的として、インフレームにある油体標的指向性タンパク質から分離するために、本明細書ではさまざまな長さおよび/または負電荷のポリペプチドスペーサーまたはリンカーを用いることができる。例えば、本明細書に記述する1つの態様において、油体タンパク質の十分な部分をコードする核酸配列と、第1および/または第2の組換えポリペプチド、多量体タンパク質複合体、ヘテロ多量体タンパク質複合体、多量体融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、免疫グロブリン、免疫グロブリンポリペプチド鎖、酸化還元融合ポリペプチド、ならびに第1および/または第2のチオレドキシン関連タンパク質のいずれかをコードする核酸配列との間に位置するのは、油体表面回避性リンカーアミノ酸配列をコードするリンカー核酸配列である。
本明細書に提供する方法および組成物に用いうる油体標的指向性タンパク質をコードする核酸配列は、第1の組換えポリペプチド、ヘテロ多量体タンパク質複合体、多量体融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、免疫グロブリン、免疫グロブリンポリペプチド鎖、酸化還元融合ポリペプチド、ならびに/または第1および/もしくは第2のチオレドキシン関連タンパク質および油体と会合しうる油体標的指向性タンパク質、タンパク質断片またはペプチドをコードする、任意の核酸配列であってよい。油体標的指向性ペプチドをコードする核酸配列は合成してもよく、または任意の生物源から入手してもよい。
(a)油体を含む細胞において第1の酸化還元タンパク質および第2の酸化還元タンパク質を産生させる段階であって、前記第1の酸化還元タンパク質は、好ましくは細胞内で、前記第2の酸化還元タンパク質と相互作用し、前記ヘテロ多量体酸化還元タンパク質複合体を形成することができる段階;ならびに
(b)前記油体および前記ヘテロ多量体酸化還元タンパク質複合体と会合しうる油体標的指向性タンパク質を介して、前記ヘテロ多量体酸化還元タンパク質複合体を油体と会合させる段階、を含む方法である。
a)第1の酸化還元タンパク質が第2の酸化還元タンパク質と結合したものを含む酸化還元融合ポリペプチドを細胞内で産生させる段階;
b)前記酸化還元融合ポリペプチドおよび前記油体と会合しうる油体標的指向性タンパク質を介して、前記酸化還元融合ポリペプチドを油体と会合させる段階;ならびに
c)前記酸化還元融合ポリペプチドと会合した前記油体を単離する段階、を含む方法である。酸化還元タンパク質と会合した油体を用いて、さまざまな有用な乳濁液を調製することができる。
a)細胞に、
1)前記細胞における転写を調節しうる第1の核酸配列であって、次のものと機能的に結合したもの;
2)(i)前記組換え融合ポリペプチドの油体に対する標的指向性を得るのに十分な油体タンパク質の部分をコードする核酸配列であって、次のものと結合したもの;(ii)第1の酸化還元タンパク質が第2の酸化還元タンパク質と融合したものを含む酸化還元融合ポリペプチドをコードする第2の核酸配列であって、次のものと機能的に結合したもの;
3)前記細胞における転写を終結させうる第3の核酸配列
を含むキメラ核酸配列を導入する段階;
b)前記細胞を、油体を含む子孫細胞における前記酸化還元融合ポリペプチドまたは免疫グロブリンの発現を可能にする条件下で培養する段階;ならびに
c)前記子孫細胞から、前記酸化還元融合ポリペプチドを含む前記油体を単離する段階、を含む方法である。
本明細書に提供するさまざまな方法および組成物によれば、酸化還元タンパク質をコードする任意の核酸配列を用いうる。第1および/または第2の酸化還元タンパク質をコードする核酸配列は任意の生物源から入手してもよく、または合成的に調製してもよい。一般に、酸化還元タンパク質をコードする核酸配列は当技術分野で周知であり、容易に入手可能である。例えば、Cristianoら(1993)Genomes 17:(2)348〜354、Doyamaら(1998)Plant Sci. 137:53〜62、Hoeoegら(1984)Biosci. Rep. 4:917〜923;さらには表5に示したスイスプロテイン(Swiss Protein)配列を参照されたい。酸化還元タンパク質をコードする既知の核酸配列を、例えば、cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーのスクリーニングにより、酸化還元タンパク質をコードするこれまで発見されていない核酸配列を発見および同定する目的で、核酸配列に基づくプローブの設計および構築のために用いてもよい。このため、酸化還元タンパク質をコードするさらなる核酸配列を本発明に従って発見し、用いることもできる。
X C Y Y C Z
を含む活性部位を有することを特徴とし、ここでYは疎水性または非極性アミノ酸などの任意のアミノ酸であり、Xは20種のアミノ酸のいずれでもよいが、好ましくはトリプトファンなどの疎水性アミノ酸であり、Zは任意のアミノ酸でよいが、好ましくは極性アミノ酸である。ある特定の態様において、本明細書に用いるためのチオレドキシンは、アミノ酸配列X C G P C Zを有する活性部位を含む。チオレドキシンまたはチオレドキシン様タンパク質の活性部位内のシステインが酸化されていると、それらは分子内ジスルフィド結合を形成する。還元状態では、同じ活性部位が活性部位のジチオールのジスルフィドへの可逆的酸化によって酸化還元反応に関与することができ、ジチオールジスルフィド交換反応を触媒する。
1)高ストリンジェンシー:0.1×SSPE、0.1%SDS、65℃
2)中程度のストリンジェンシー:0.2×SSPE、0.1%SDS、50℃
3)低ストリンジェンシー:1.0×SSPE、0.1%SDS、50℃
本発明のもう1つの態様において、多量体タンパク質複合体は免疫グロブリンである。本明細書で用いる「免疫グロブリンポリペプチド鎖」とは、第2のポリペプチドと会合して免疫活性のある(すなわち抗原と結合可能な)多量体タンパク質複合体を形成しうる、第1のポリペプチドのことを指す。本明細書で用いることを考えている免疫グロブリンおよび免疫グロブリンポリペプチド鎖の種類には、軽鎖および重鎖の免疫活性のある(すなわち抗原と結合可能な)部分が含まれる。本明細書に用いる免疫グロブリンおよび免疫グロブリンポリペプチド鎖の例には、任意のIgG、IgA、IgD、IgEおよびIgMを含む、実質的に完全な免疫グロブリンのほか、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片およびFv断片としてよく知られた部分を含む、免疫グロブリンの任意の部分が含まれる。
a)第1の組換えポリペプチドは任意のIgG、IgA、IgD、IgEもしくはIgM重鎖を含む免疫グロブリン重鎖であってよく、第2の組換えポリペプチドはκもしくはλ免疫グロブリン軽鎖であってよい;または
b)第1の組換えポリペプチドは免疫グロブリン重鎖由来の可変ドメインおよび第1の定常ドメインであってよく、第2の組換えポリペプチドはκもしくはλ免疫グロブリン軽鎖であってよい;または
c)第1の組換えポリペプチドは免疫グロブリン重鎖由来の可変ドメインであってよく、第2の組換えポリペプチドはκもしくはλ免疫グロブリン軽鎖由来の可変ドメインであってよい。
本発明によれば、第1および/もしくは第2の組換えポリペプチド、多量体タンパク質複合体、ヘテロ多量体タンパク質複合体、多量体融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、免疫グロブリン、免疫グロブリンポリペプチド鎖、酸化還元融合ポリペプチド、または第1および/もしくは第2のチオレドキシン関連タンパク質;ならびに油体標的指向性タンパク質を、細胞内で産生させることが好都合である。組換えポリペプチドまたは多量体タンパク質複合体を産生させるためには、第1および/もしくは第2の組換えポリペプチド、多量体タンパク質複合体、ヘテロ多量体タンパク質複合体、多量体融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、免疫グロブリン、免疫グロブリンポリペプチド鎖、酸化還元融合ポリペプチド、または第1および/もしくは第2のチオレドキシン関連タンパク質;ならびに/または油体標的指向性タンパク質をコードする核酸配列を、組換え発現ベクター中に組み入れる。したがって、本明細書には、選択した細胞に適した、油体標的指向性タンパク質、ならびに第1および/もしくは第2の組換えポリペプチド、多量体タンパク質複合体、ヘテロ多量体タンパク質複合体、多量体融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、免疫グロブリン、免疫グロブリンポリペプチド鎖、酸化還元融合ポリペプチド、または第1および/もしくは第2のチオレドキシン関連タンパク質の発現のために適した本明細書に提供するキメラ核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。「選択した細胞における発現のために適した」という用語は、組換え発現ベクターが、選択した細胞における発現が確実に行われるために必要なすべての核酸配列を含むことを意味する。
(a)油体標的指向性タンパク質機能的とコードする第1の核酸配列であって、次のものとリーディングフレーム内で結合したもの;
(b)第1の組換えポリペプチド、免疫グロブリンポリペプチド鎖または酸化還元タンパク質をコードする第2の核酸配列であって、次のものとリーディングフレーム内で結合したもの;
(c)前記第1の組換えポリペプチドと第2の組換えポリペプチド、免疫グロブリンポリペプチド鎖または酸化還元タンパク質が多量体タンパク質複合体を形成しうるような、第2の組換えポリペプチド、免疫グロブリンポリペプチド鎖または酸化還元タンパク質をコードする第3の核酸配列。
1)前記細胞における転写を調節しうる第1の核酸配列であって、次のものと機能的に結合したもの;
2)(i)前記組換え融合ポリペプチドの油体に対する標的指向性を得るのに十分な油体タンパク質の部分をコードする核酸配列であって、次のものとリーディングフレーム内で結合したもの;(ii)酸化還元タンパク質または免疫グロブリンポリペプチド鎖などの第1の組換えポリペプチドが、第2の酸化還元タンパク質または第2の免疫グロブリンポリペプチド鎖などの第2の組換えポリペプチドと結合したものを含む、酸化還元融合ポリペプチドまたは免疫グロブリンなどの多量体融合タンパク質をコードする核酸配列であって、次のものと機能的に結合したもの;
3)前記細胞における転写を終結させうる第3の核酸配列。
本発明によれば、選択した細胞に組換え発現ベクターを導入し、選択した細胞を増殖させて、第1および/または第2の組換えポリペプチド、多量体タンパク質複合体、ヘテロ多量体タンパク質複合体、多量体融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、免疫グロブリン、免疫グロブリンポリペプチド鎖、酸化還元融合ポリペプチド、第1および/または第2のチオレドキシン関連タンパク質;ならびに油体標的指向性タンパク質を直接的にまたは子孫細胞内で産生させる。
(a)油体および第1の組換えポリペプチド、例えば酸化還元タンパク質(例えば、チオレドキシン関連タンパク質など)または免疫グロブリンポリペプチド鎖などを含む細胞を含む第1の植物を調製する段階であって、前記第1の組換えポリペプチドは油体標的指向性タンパク質を介して前記油体と会合することができる段階;
(b)油体および第2の組換えポリペプチド、例えば第2の酸化還元タンパク質(例えば、チオレドキシン関連タンパク質など)または第2の免疫グロブリンポリペプチド鎖などを細胞を含む第2の植物を調製する段階;ならびに
(c)前記第1の植物を前記第2の植物と性的に交配させて、油体を含む細胞を含む子孫植物を作製する段階であって、前記油体は前記第1の組換えポリペプチドと会合することができ、前記第1の組換え組換えポリペプチドは前記第2の組換えポリペプチドと会合して前記組換え多量体タンパク質複合体を形成することができる段階、
を含む方法である。
(a)油体および第1の組換えポリペプチド、例えば酸化還元(またはチオレドキシン関連)タンパク質または免疫グロブリンポリペプチド鎖などを含む細胞を含む第1の植物を調製する段階であって、前記第1の組換えポリペプチドは油体標的指向性タンパク質を介して前記油体と会合することができる段階;
(b)油体および第2の組換えポリペプチド、例えば第2の酸化還元(チオレドキシン関連)タンパク質または第2の免疫グロブリンポリペプチド鎖などを含む細胞を含む第2の植物を調製する段階であって、前記第2の組換えポリペプチドは油体標的指向性タンパク質を介して前記油体と会合することができる段階;ならびに
(c)前記第1の植物を前記第2の植物と性的に交配させて、油体を含む細胞を含む子孫植物を作製する段階であって、前記油体は前記第1の組換えポリペプチドと会合することができ、前記第1の組換え組換えポリペプチドは前記第2の組換えポリペプチドと会合して前記組換え多量体タンパク質複合体を形成することができる段階、
を含む方法である。
本明細書に提供する油体は、任意の動物細胞;植物細胞;真菌細胞;例えば酵母細胞、藻類細胞;または細菌細胞を含む、油体を含む任意の細胞から入手可能である。細胞から油体を単離するのに適した任意の工程を本明細書に用いることができる。植物種子細胞から油体を単離するための工程は米国特許に記載されており(第6,146,645号および第6,183,762号)、酵母細胞からの油体の単離はティン(Ting)ら(1997)J. Biol. Chem. 272:3699〜3706)に記載されている。
本発明によれば、油体を、第1および/または第2の組換えポリペプチド、多量体タンパク質複合体、ヘテロ多量体タンパク質複合体、多量体融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、免疫グロブリン、免疫グロブリンポリペプチド鎖、酸化還元融合ポリペプチド、第1および/または第2のチオレドキシン関連タンパク質のいずれかと、これらの多量体タンパク質複合体および油体と会合しうる油体標的指向性タンパク質との会合を介して会合させる。本明細書で用いる「油体を多量体タンパク質複合体と会合させること」という語句は、油体の、第1および/もしくは第2の組換えポリペプチド、多量体タンパク質複合体、ヘテロ多量体タンパク質複合体、多量体融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、免疫グロブリン、免疫グロブリンポリペプチド鎖、酸化還元融合ポリペプチド、または第1および/もしくは第2のチオレドキシン関連タンパク質との会合を可能にする様式で、油体を多量体タンパク質複合体の近傍に位置させることを意味する。油体の多量体タンパク質複合体との会合は、油体標的指向性タンパク質と油体および多量体タンパク質複合体の両方との会合によって達成される。特定の態様において、多量体タンパク質複合体を発現する細胞はこれらの同じ細胞から入手しうる油体と会合し、これにより、油体を含む宿主細胞システムにおける、第1および/もしくは第2の組換えポリペプチド、ヘテロ多量体タンパク質複合体、多量体融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、免疫グロブリン、免疫グロブリンポリペプチド鎖、酸化還元融合ポリペプチド、または第1および/もしくは第2のチオレドキシン関連タンパク質を含む、多量体タンパク質複合体の好都合な生産および単離が可能になる。したがって、1つの態様において、油体の多量体タンパク質複合体との会合は、細胞の増殖過程において細胞内で達成される。例えば、酸化還元融合ポリペプチドを油体タンパク質と融合させ、このキメラタンパク質を、油体を含む植物種子中に発現させてもよい。この場合には、種子からの油体の単離により、第1および/もしくは第2の組換えポリペプチド、多量体タンパク質複合体、ヘテロ多量体タンパク質複合体、多量体融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、免疫グロブリン、免疫グロブリンポリペプチド鎖、酸化還元融合ポリペプチド、または第1および/もしくは第2のチオレドキシン関連タンパク質のいずれかを含む油体の単離がもたらされる。多量体タンパク質複合体が、複合体が産生されるのと同じ細胞から入手しうる油体と会合する、もう1つの態様において、油体の多量体タンパク質複合体との会合は、細胞の完全性を破壊することによって達成される。
1つの特定の態様によれば、第1および/もしくは第2の組換えポリペプチド、多量体タンパク質複合体、ヘテロ多量体タンパク質複合体、多量体融合タンパク質、ヘテロ多量体融合タンパク質、免疫グロブリン、免疫グロブリンポリペプチド鎖、酸化還元融合ポリペプチド、または第1および/もしくは第2のチオレドキシン関連タンパク質を含む油体を、乳濁液へと調合することが好ましい。乳濁液は、薬学的組成物、パーソナルケア製品または食品の調製に用いることが好ましい。乳化された形態で、油体は、ある種の望ましい特性、例えばヒト皮膚との優れた適合性などを示す。
チオレドキシンおよびNADPHチオレドキシンレダクターゼ遺伝子の単離
アラビドプシス長角果cDNAライブラリーCD4-12を、アラビドプシス生物資源センター(Arabidopsis Biological Resource Centre)(ABRC、http://aims.cps.msu.edu)アラビドプシス貯蔵センターから入手し、アラビドプシスからチオレドキシンh(Trxh)およびチオレドキシンレダクターゼ遺伝子を単離するためのテンプレートとして用いた。Trxh遺伝子の単離のために、以下のプライマーを合成した:
発表されているチオレドキシンレダクターゼ遺伝子の5'末端と同一な配列(Jacquotら、J Mol Biol.(1994)235(4):1357〜63)を太字で示した。
植物発現ベクターの構築
種子におけるチオレドキシンおよびNADPHチオレドキシンレダクターゼの種子特異的な過剰発現が可能になるように、発現ベクターを構築した。ベクターは、自然な細胞内位置における過剰発現、および油体上での蓄積が可能になるように構築した。
実施例1に記載したアラビドプシスのチオレドキシンh遺伝子を、一般的な豆であるインゲンマメ(Phaseolus vulgaris)(Slightomら(1983)Proc. Natl Acad Sc USA 80:1897〜1901;Sengupta-Gopalanら(1985)PNAS USA 82:3320〜3324)のファゼオリンプロモーターおよびファゼオリンターミネーターの調節制御下に配置した。重複伸長法(overlap extension technique)による遺伝子スプライシング(Hortonら(1989)15:61〜68)を用いて、ファゼオリンプロモーターをTrxh遺伝子と融合させた。標準的な分子生物学の実験手法(例えば、Sambrookら(1990)「Molecular Cloning」第2版、Cold Spring Harbor Pressを参照)を用いて、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターにそれぞれPstI部位およびHindIII/KpnI部位を付与した(配列番号:14参照)。同じく標準的な分子生物学の実験手法を用いて、ファゼオリンターミネーターをTrxh遺伝子の下流に配置した。PstI-ファゼオリンプロモーター-Trxh-ファゼオリンターミネーター-KpnI挿入配列をpSBS3000のPstI-KpnI部位にクローニングし(pSBS3000はアグロバクテリウムバイナリープラスミドpPZP221の派生物である(Hajdukiewiczら、1994、Plant Molec. Biol. 25:989〜994)。pSBS3000では、除草剤グルフォシネートアンモニウムに対する抵抗性を付与するために、pPZP221のCaMV35Sプロモーター-ジェンタマイシン抵抗性遺伝子-CAMV 35Sターミネーターがパセリユビキチンプロモーター-フォスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子-パセリユビキチン転写終結配列に置換されている)、その結果得られたプラスミドをpSBS2520と命名した。ファゼオリンプロモーター-アラビドプシスTrxh-ファゼオリン転写終結配列の配列を配列番号:14に示す。
アラビドプシスオレオシン遺伝子の3'コード配列(van Rooijenら(1992)Plant Mol. Biol.18:1177〜1179)を、NcoI部位を1つ含むように改変した。Trxhを含むベクターpSBS2500(実施例1)からのNcoI-HindIII断片を、このNcoI制限部位を利用してこのアラビドプシスオレオシンのコード配列と連結した。重複伸長法による遺伝子スプライシングを用いて(Hortonら(1989)15:61〜68)、合成PstI部位を含む(pSBS2520の構築を参照)ファゼオリンプロモーター(Slightomら(1983)Proc. Natl Acad Sc USA 80:1897〜1901;Sengupta-Gopalanら(1985)PNAS USA 82:3320〜3324)をアラビドプシスオレオシンのコード配列と融合させた。標準的な分子生物学の実験手法(例えば、Sambrookら(1990)「Molecular Cloning」第2版、Cold Spring Harbor Pressを参照)を用いて、ファゼオリンターミネーターを含むHindIII-KpnI断片(pSBS2520の構築を参照)をTrxh遺伝子の下流に配置した。PstI-ファゼオリンプロモーター-オレオシン-Trxh-ファゼオリンターミネーター-KpnI挿入配列をpSBS3000のPstI-KpnI部位にクローニングした。この結果得られたプラスミドをpSBS2510と命名した。ファゼオリンプロモーター-オレオシンTrxh-ファゼオリン転写終結配列の配列を配列番号:16に示す。
このベクターは、Trxh遺伝子がオレオシン遺伝子の5'末端と融合している点を除き、pSBS2510の挿入物と同じ遺伝因子を含む。天然の終止コドンを含むオレオシン3'コード配列(van Rooijenら(1992)Plant Mol. Biol.18:1177〜1179)にHindIIIクローニング部位を付与した。同じく重複伸長法による遺伝子スプライシング(Hortonら(1989)15:61〜68)を用いて、ファゼオリンプロモーターをTrxh遺伝子と融合させ、Trxh遺伝子をオレオシン配列と融合させた。標準的な分子生物学の実験手法(例えば、Sambrookら(1990)「Molecular Cloning」第2版、Cold Spring Harbor Pressを参照)を同じく用いて、ファゼオリンターミネーターを含むHindIII KpnI断片(pSBS2520の構築を参照)をオレオシン遺伝子の下流に配置した。PstI-ファゼオリンプロモーター-Trxhオレオシンファゼオリンターミネーター-KpnI挿入配列をpSBS3000のPstI-KpnI部位にクローニングした。この結果得られたプラスミドをpSBS2521と命名した。ファゼオリンプロモーター-Trxhオレオシン-ファゼオリン転写終結配列の配列を配列番号:19に示す。
実施例1に記載のアラビドプシスNADPHチオレドキシンレダクターゼ遺伝子を、普通の豆であるインゲンマメ(Phaseolus vulgaris)(Slightomら(1983)Proc. Natl Acad Sc USA 80:1897〜1901;Sengupta-Gopalanら(1985)PNAS USA 82:3320〜3324)のファゼオリンプロモーターおよびファゼオリンターミネーターの調節制御下に配置した。同じく重複伸長法による遺伝子スプライシング(Hortonら(1989)15:61〜68)を用いて、ファゼオリンプロモーターをチオレドキシンレダクターゼ遺伝子と融合させた。標準的な分子生物学の実験手法(例えば、Sambrookら(1990)「Molecular Cloning」第2版、Cold Spring Harbor Pressを参照)を用いて、ファゼオリンプロモーターおよびターミネーターにそれぞれPstI部位およびHindIII/KpnI部位を付与した(配列番号:14参照)。同じく標準的な分子生物学の実験手法を用いて、ファゼオリンターミネーターをチオレドキシンレダクターゼ遺伝子の下流に配置した。PstI-ファゼオリンプロモーター-チオレドキシンレダクターゼ-ファゼオリンターミネーター-KpnI挿入配列を、pSBS3000のPstI-KpnI部位にクローニングした。その結果得られたプラスミドをpSBS2527と命名した。ファゼオリンプロモーター-アラビドプシスチオレドキシンレダクターゼ-ファゼオリン転写終結配列の配列を配列番号:22に示す。
重複伸長法による遺伝子のスプライシング(Hortonら(1989)15:61〜68)を用いて、アラビドプシスオレオシンとファゼオリンプロモーターを融合させた(Slightomら(1983)PNAS USA 82:3320-3324)。同じ遺伝子スプライシング法を用いて、チオレドキシンレダクターゼコード配列とオレオシン遺伝子を融合させた。標準的な分子生物学の実験手法(例えば、Sambrookら(1990)「Molecular Cloning」第2版、Cold Spring Harbor Pressを参照)を同じく用いて、チオレドキシンレダクターゼ遺伝子の下流のファゼオリンを含むHindIII KpnI断片をクローニングした。PstI-ファゼオリンプロモーター-オレオシン-チオレドキシンレダクターゼ-ファゼオリンターミネーター-KpnI挿入配列をpSBS3000のPstI-KpnI部位にクローニングした。この結果得られたプラスミドをpSBS2531と命名した。ファゼオリンプロモーター-オレオシン-チオレドキシンレダクターゼ-ファゼオリン転写終結配列の配列を配列番号:24に示す。
このベクターは、チオレドキシンレダクターゼ遺伝子がオレオシン遺伝子の5'末端と融合している点を除き、pSBS2531の挿入物と同じ遺伝因子を含む。天然の終止コドンオレオシン3'コード配列(van Rooijenら(1992)Plant Mol. Biol. 18:1177〜1179)にHindIIIクローニング部位を付与した。同じく重複伸長法による遺伝子スプライシング(Hortonら(1989)15:61〜68)を用いて、ファゼオリンプロモーターをチオレドキシンレダクターゼ遺伝子と融合させ、チオレドキシンレダクターゼ遺伝子をオレオシン配列と融合させた。標準的な分子生物学の実験手法(例えば、Sambrookら(1990)「Molecular Cloning」第2版、Cold Spring Harbor Pressを参照)を同じく用いて、ファゼオリンターミネーターを含むHindIII KpnI断片(pSBS2520の構築を参照)をオレオシン遺伝子の下流に配置した。PstI-ファゼオリンプロモーター-チオレドキシンレダクターゼオレオシン-ファゼオリンターミネーター-KpnI挿入配列をpSBS3000のPstI-KpnI部位にクローニングした。この結果得られたプラスミドをpSBS2529と命名した。ファゼオリンプロモーター-チオレドキシンレダクターゼオレオシン-ファゼオリン転写終結配列の配列を配列番号:27に示す。
ライ菌のチオレドキシンレダクターゼ/チオレドキシン遺伝子(Mlep TR/Trxh)を含む植物形質転換ベクターを構築した。ライデン大学(オランダ)の免疫血液学部門および血液バンク(the department of Immunohematology and Blood bank、Leiden University、Netherlands)から、pHIS/TR/Trxh(Wielesら(1995)J Biol Chem 270:25604〜25606)と呼ばれる構築物を入手し、これをpSBS2530を作製するためのPCR用のテンプレートとして用いた。pSBS2530の構築は、アラビドプシスチオレドキシンレダクターゼ遺伝子の代わりにMlep TR/Trxh遺伝子を用いた点を除き、pSBS2531の構築と同じであった。重複伸長法による遺伝子スプライシング(Hortonら(1989)15:61〜68)を用いて、ファゼオリンプロモーター(Slightomら(1983)Proc. Natl Acad Sc USA 80:1897〜1901;Sengupta-Gopalanら(1985)PNAS USA 82:3320〜3324)をアラビドプシスオレオシンのコード配列と融合させた。同じ遺伝子スプライシング法をオレオシン遺伝子とMlep TR/Trxhコード配列との融合にも用いた。標準的な分子生物学の実験手法(例えば、Sambrookら(1990)「Molecular Cloning」第2版、Cold Spring Harbor Pressを参照)を同じく用いて、ファゼオリンを含むHindIIl-KpnI断片をMlep TR/Trxh遺伝子の下流に配置した。PstI-ファゼオリンプロモーター-オレオシン-Mlep TR/Trxhファゼオリンターミネーター-KpnI挿入配列をpSBS3000のPstI-KpnI部位にクローニングした。この結果得られたプラスミドをpSBS2530と命名した。ファゼオリンプロモーター-オレオシン-Mlep TR/Trxhファゼオリン転写終結配列の配列を配列番号:30に示す。
初期活性アッセイ法(図4)により、オレオシン-M. lep TR/Trxh融合タンパク質を発現する油体はかなり高い還元活性を有することが明らかになった。アラビドプシスチオレドキシンレダクターゼおよびチオレドキシンタンパク質をコードする同様のオレオシン融合構築物も、類似した様式の挙動を示すことが予想された。分子モデル化法を用いて、この種の構築物の設計を支援した。チオレドキシンレダクターゼとチオレドキシンタンパク質との間の合成リンカーペプチドをコードするプライマーを設計した(チオレドキシンlink-L:
およびチオレドキシンlink-R:
これらのプライマーをプライマーGVR 873
およびGVR834
とともに用い、重複伸長法による遺伝子スプライシング(Hortonら(1989)15:61〜68)を利用して、チオレドキシンレダクターゼ-リンカー領域-チオレドキシンをコードする領域を増幅した。続いて、このチオレドキシンレダクターゼ-リンカー-チオレドキシンのコード配列を、標準的な分子生物学の手法(Sambrookら(1990)、「Molecular Cloning」第2版、Cold Spring Harbor Press)を用いて、既存のpSBS3000ベクター中にクローニングした。この結果得られたプラスミドをpSBS2542と命名した。ファゼオリンプロモーター-オレオシン-チオレドキシンレダクターゼ-リンカー-チオレドキシン-ファゼオリン転写終結領域の配列を配列番号:33に示す。このアラビドプシスチオレドキシンレダクターゼ-リンカーチオレドキシンとライ菌TR/Trxhタンパク質との間のアミノ酸配列の比較を図12に示している。
トランスジェニック種子抽出物のポリアクリルアミドゲル電気泳動およびイムノブロット法
アラビドプシスチオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼおよびオレオシン抗体の供給源
アラビドプシスチオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼタンパク質の過剰発現が行われるように、細菌発現ベクターpRSETB(Invitrogen)中にアラビドプシスチオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼ遺伝子をインフレーム的にクローニングした。標準的なプロトコール(例えば、Invitrogen社のプロトコールを参照)を用いてこれらのタンパク質を精製し、標準的な生化学の手法(例えば、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、N.Y.(1989)を参照)を用いてウサギに抗体を産生させた。アラビドプシスオレオシンタンパク質の過剰発現が可能になるように、アラビドプシスオレオシン遺伝子を細菌発現ベクターpRSETB(Invitrogen)中にクローニングした。このタンパク質を標準的なプロトコール(例えば、Invitrogen社のプロトコールを参照)を用いて精製し、標準的な生化学の手法(例えば、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、N.Y.(1989)を参照)を用いてマウスモノクローナル抗体を調製するためにこれを用いた。
アラビドプシス種子を約20倍容積の2%SDS、50mM Tris-Cl中で粉砕し、この抽出物を煮沸して遠心し、標準的なプロトコールを用いて、上清をポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)用に調製した。
アラビドプシス種子を約20倍容積の水中で粉砕し、微量遠心管に入れて遠心処理を行った。油体を回収し、約20倍容積の水、8M尿素および100mM炭酸ナトリウムを含む高ストリンジェンシー洗浄バッファー、ならびに水で順次洗浄した。この最後の洗浄の後に、標準的なプロトコールを用いて油体をポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)用に調製する。
pSBS2510で形質転換された植物からの全種子および油体タンパク質抽出物をポリアクリルアミドゲルにかけ、クーマシーブリリアントブルーで染色するか、またはPVDF膜に対するエレクトロブロッティングを行った。アラビドプシスチオレドキシンに対して産生されたポリクローナル抗体、またはアラビドプシス18.5kDaオレオシンに対して産生されたモノクローナル抗体を膜と反応させ、アルカリホスファターゼを用いて可視化した。オレオシン-チオレドキシンの発現により、31.2kDaの新たなバンドが生じる。その結果から、チオレドキシン抗体が予想された正しい分子量(31.2kDa)のバンドと免疫学的に反応すること、ならびにオレオシン抗体が、天然のアラビドプシスオレオシンに対応するバンド(18.5kDa)に加えて、融合タンパク質に関して予想された正しい分子量(31.2kDa)のバンドとも免疫学的に反応することが示されている。このことは、オレオシン-チオレドキシンがアラビドプシス種子内で発現され、油体に正しく向かうことを示している。
pSBS25121で形質転換された植物からの全種子および油体タンパク質抽出物をポリアクリルアミドゲルにかけ、クーマシーブリリアントブルーで染色するか、またはPVDF膜に対するエレクトロブロッティングを行った。アラビドプシスチオレドキシンに対して産生されたポリクローナル抗体、またはアラビドプシス18.5kDaオレオシンに対して産生されたモノクローナル抗体を膜と反応させ、アルカリホスファターゼを用いて可視化した。オレオシン-チオレドキシンの発現により、31.2kDaの新たなバンドが生じる。その結果から、チオレドキシン抗体が予想された正しい分子量(31.2kDa)のバンドと免疫学的に反応すること、ならびにオレオシン抗体が、天然のアラビドプシスオレオシンに対応するバンド(18.5kDa)に加えて、融合タンパク質に関して予想された正しい分子量(31.2kDa)のバンドとも免疫学的に反応することが示されている。このことは、オレオシン-チオレドキシンがアラビドプシス種子内で発現され、油体に正しく向かうことを示している。
pSBS2520で形質転換された植物からの全種子抽出物をポリアクリルアミドゲルにかけ、クーマシーブリリアントブルーで染色するか、またはPVDF膜に対するエレクトロブロッティングを行った。アラビドプシスチオレドキシンに対して産生されたポリクローナル抗体を膜と反応させ、アルカリホスファターゼを用いて可視化した。その結果から、チオレドキシン抗体が予想された正しい分子量(12kDa)にほぼ近いバンドと免疫学的に反応することが示された。非形質転換種子では検出可能なチオレドキシンのバンドは認められない。
pSBS2529で形質転換された植物からの全種子および油体タンパク質抽出物をポリアクリルアミドゲルにかけ、PVDF膜に対するエレクトロブロッティングを行った。アラビドプシスチオレドキシンレダクターゼに対して産生されたポリクローナル抗体、またはアラビドプシス18.5kDaオレオシンに対して産生されたモノクローナル抗体を膜と反応させ、アルカリホスファターゼを用いて可視化した。チオレドキシンレダクターゼ-オレオシンの発現により、53.8kDaの新たなバンドが生じる。その結果から、チオレドキシンレダクターゼ抗体が予想された正しい分子量(53.8kDa)のバンドと免疫学的に反応すること、ならびにオレオシン抗体が、天然のアラビドプシスオレオシンに対応するバンド(18.5kDa)に加えて、融合タンパク質に関して予想された正しい分子量(53.8kDa)のバンドとも免疫学的に反応することが示されている。このことは、チオレドキシンレダクターゼ-オレオシンがアラビドプシス種子内で発現されることを示している。
pSBS2527で形質転換された植物からの全種子抽出物をポリアクリルアミドゲルにかけ、PVDF膜に対するエレクトロブロッティングを行った。アラビドプシスチオレドキシンレダクターゼに対して産生されたポリクローナル抗体を膜と反応させ、アルカリホスファターゼを用いて可視化した。チオレドキシンレダクターゼ抗体は予想された正しい分子量(35.3kDa)にほぼ近いバンドと免疫学的に反応する。非形質転換種子では検出可能なチオレドキシンのバンドは認められない。
アラビドプシスT2種子におけるオレオシンDMSRの発現、およびアラビドプシス油体の正しい標的指向性をアッセイするタンパク質ゲルおよびイムノブロットを調製した。導き出したアミノ酸配列に基づく予想分子量は53,817Daと算出される。トランスジェニックオレオシン-チオレドキシンレダクターゼ試料の油体抽出物では約54kDaのバンドがさらに観察された。イムノブロット法により、このバンドはオレオシン-チオレドキシンレダクターゼであることが確認された。ポリアクリルアミドゲルにより、オレオシン-チオレドキシンレダクターゼの発現が、アラビドプシスオレオシンの主な18.5kDaの発現と比べて約2倍であることが観察された。これは全種子タンパク質の約2〜4%に相当する。
アラビドプシスT2種子におけるオレオシンM.lep TR/Trxhの発現、およびアラビドプシス油体の正しい標的指向性をアッセイするタンパク質ゲルおよびイムノブロットを調製した。導き出したアミノ酸配列に基づく予想分子量は67,550Daと算出される。トランスジェニックオレオシン-M.lep TR/Trxh試料の油体抽出物では約68kDaのバンドがさらに観察された。イムノブロット法により、このバンドはオレオシン-M.lep TR/Trxhであることが確認された。ポリアクリルアミドゲルにより、オレオシン-M.lep TR/Trxhの発現が、アラビドプシスオレオシンの主な18.5kDaの発現と同程度であることが観察された。これは全種子タンパク質の約1〜2%に相当する。
pSBS2542系統からの油体粗抽出物を、1mLの100mM Trisバッファー、pH 7.5中で100μgの種子を粉砕することによって調製した。次に油体画分を単離するために試料を遠心した。次に油体画分を発現分析のためにSDSポリアクリルアミドゲルにかけた。クーマシー染色したゲルにより、検討した4系統中3系統からの油体粗抽出物中で合成融合物が高レベルに蓄積していることが判明した。融合タンパク質は全種子タンパク質の約2〜5%に相当すると推定された。さらに、抗チオレドキシンまたは抗チオレドキシンレダクターゼ抗体を用いたウエスタンブロット法により、過剰発現された70kDaタンパク質がまさにオレオシン-チオレドキシンレダクターゼリンカー-チオレドキシンであることが確かめられた。
チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼの形質転換体の生物活性
初期還元アッセイ法:
DTNBアッセイ法
チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼの活性を、DTNB[5,5'-ジチオールビス(2-ニトロ安息香酸)]比色アッセイ法を用いて決定した。このアッセイ法は、100mM Tris-Cl pH 8.0、5mM EDTA、200μM DTNB[5,5'-ジチオールビス(2-ニトロ安息香酸)]および200μM NADPHを含む700μLの反応容積中で行った。チオレドキシンレダクターゼおよびチオレドキシンを添加すると、NADPHはチオレドキシンレダクターゼを還元し、続いて後者がチオレドキシンを還元して、今度はこれがDTNBを還元すると考えられる(以下の式参照)。
NADPH2+チオレドキシンレダクターゼox―→チオレドキシンレダクターゼred+NADP+チオレドキシンレダクターゼred+チオレドキシンox―→チオレドキシンred+チオレドキシンレダクターゼox
チオレドキシンred+DTNBox―→2(2-ニトロ-5-メルカプト安息香酸)+チオレドキシンox
DTNBアッセイ法による結果は、インスリン還元アッセイ法で裏付けられた。このアッセイ法では、インスリンを最終濃度1mg/mLとして100mM KH2PO4 pH 7.0+5mM EDTA中に含める。NADPH(500μM)、チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼの存在下でインスリンは還元されて溶液から沈殿する。通常はインスリンの還元後にOD 650の濁度を測定する。または、340nmでの吸光度の低下を観測することによってNADPH2のNADP+への変換を測定することもできる。
初期DTNBアッセイ法およびインスリン還元アッセイ法によれば、オレオシン<->チオレドキシン型およびオレオシン<->チオレドキシンレダクターゼ型トランスジェニック種子由来の油体を混合すると還元活性が極めて低くなることが明らかになった(注:<->はオレオシン融合物の双方の構成を示す;すなわち、オレオシン<->チオレドキシンはオレオシン-チオレドキシン融合物およびチオレドキシン-オレオシン融合物を表す)。
4種類のpSBS2542系統からの油体抽出物を、以前に記載した標準的なプロトコールを用いて、DTNBアッセイ法およびインスリン還元アッセイ法にて還元活性に関して検討した。この場合も、オレオシン-チオレドキシンレダクターゼ-リンカー-チオレドキシンタンパク質を含む油体抽出物は顕著な還元活性を有していた。この種のアッセイ法に基づき、オレオシン-チオレドキシンレダクターゼ-リンカー-チオレドキシン合成融合タンパク質の活性がオレオシン-M.lep TR/Trxh融合物よりも高いことが判明した。さらに、オレオシン-チオレドキシンレダクターゼ-リンカー-チオレドキシンタンパク質を含む油体は、オレオシン<->チオレドキシンおよびオレオシン<->チオレドキシンレダクターゼを共発現する二重トランスジェニック系統からの油体よりも還元活性が高いように思われた。種々のチオレドキシンレダクターゼ/チオレドキシン構築物の還元活性を比較した結果を表4にまとめた。表4には種々のトランスジェニック系統のDTNB還元活性をまとめている。オレオシン-チオレドキシンレダクターゼ-リンカー-チオレドキシンを発現するpSBS2542系統は、「遊離」型のアラビドプシスチオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼ、ならびに同等の大腸菌タンパク質に匹敵する顕著な還元活性を有する。大腸菌チオレドキシンおよびチオレドキシン混合物の相対活性を100%に設定している。
DTNBアッセイ法およびインスリン還元アッセイ法を、大腸菌チオレドキシンレダクターゼおよびチオレドキシンを利用する系における電子供与体としてNADPHの代わりにNADHを用いた点を除き、以前の記載の通りに行った。すなわち、チオレドキシンレダクターゼ/チオレドキシン系の補因子(電子供与体)としてのNADHとNADPHとの利用を比較した。DTNBアッセイ法の場合、反応混合物は、100mM Tris-Clバッファー、pH 8.0中に400μM DTNB、10μg/mL大腸菌チオレドキシンおよび10μg/mL大腸菌チオレドキシンレダクターゼを含むものからなる。次にNADHまたはNADPHをDTNB反応物に対して以下の通りに添加した:
反応A.200μM NADPH(Sigma)
反応B.800μM NADH(Sigma)
反応C.800μM NADH(Roche)
反応D.(-)補因子
反応E.800μM NADH(TRもTrxhもなし)
反応A.800μM NADPH(Sigma)
反応B.800μM NADH(Sigma)
反応C.800μM NADH(Roche)
反応D.(-)補因子
反応E.2mM NADH(TRもTrxhもなし)
植物種子細胞における多量体免疫グロブリンタンパク質の産生、およびプロテインA-オレオシン融合タンパク質を用いた油体上での捕捉
1―植物種子細胞における多量体免疫グロブリンタンパク質の産生
多量体免疫グロブリン複合体を含む多量体タンパク質複合体の発現のためには、軽鎖および重鎖を個別にコードするcDNA配列を、1)特定の抗体を発現する細胞系、例えばクローンB細胞系もしくはハイブリドーマ細胞系などから単離することができる;またはそれらは、2)選択した軽鎖および重鎖可変ドメインと、それぞれ軽鎖および重鎖の使用可能な定常ドメイン配列を組み合わせることによって構築した組換え抗体であってもよい。特異的な結合特性を備えた可変ドメインは、通常は一本鎖Fvファージディスプレイライブラリーの形態にある、このような配列の集団スクリーニングによって単離しうる。
免疫グロブリンタンパク質を油体上で捕捉して提示するために、免疫グロブリン結合タンパク質を提示するように油体を人工的に操作する。この実施例には、プロテインA由来のよく知られた抗体結合ドメインを用いる。黄色ブドウ球菌由来のプロテインAの配列に基づき、細菌プロテインA配列から5つの連続したIg結合ドメインを単離するためのPCRプライマーを設計する。プライマーは、油体へのターゲティングのためにN末端またはC末端のいずれかがオレオシン配列と融合したプロテインA配列のクローニングが可能になるように設計する。プロテインAとオレオシンとのインフレーム翻訳融合物をコードする配列を種子特異的発現のために植物発現カセット中にクローニングする。最終的なカセットは、種子における発現をもたらす調節性プロモーター配列、プロテインA-オレオシン融合配列および転写終結のための調節配列からなる。プロテインA-オレオシン発現カセットを、アグロバクテリウムを介した植物形質転換との適合性のある植物形質転換ベクター中にクローニングする。形質転換ベクターは、プロテインA-オレオシン発現カセットに隣接する左方および右方の境界配列、ならびに近傍にある植物選択マーカーカセットを含む。このベクターを含むアグロバクテリウム株を用いて植物組織を感染させ、その後に再生させて、トランスジェニック植物の作出のためのトランスジェニック植物材料の選択を行う。
軽鎖および重鎖の多量体免疫グロブリン複合体を1つのトランスジェニック植物系統に産生させ、第2の植物系統におけるプロテインA-オレオシン融合タンパク質の油体標的指向性を介してプロテインAを油体上に提示させれば、少なくとも2つの態様を用いて、免疫グロブリン複合体をプロテインA油体上に捕捉することができる。第1の態様では、免疫グロブリンおよびプロテインA-オレオシン発現系統の双方からのトランスジェニック種子を最適な比で配合した後に、双方の種子系統からの破壊された材料が同じ抽出物中に配合されるように一緒に粉砕する。プロテインAによる免疫グロブリンの回収が最大になる条件下で、配合された種子抽出物を混合および/またはインキュベートする。標準的な相分離法(例えば、遠心)を用いて油体画分を分離する。回収した油体画分は、免疫グロブリン発現系統由来の天然の油体、およびプロテインA-オレオシン発現系統からのトランスジェニックプロテインA油体の両方を含む。
集合した多量体免疫グロブリン複合体の油体標的指向性ドメインとの融合物としての作製
個々のポリペプチドを、油体上での提示のために油体標的指向性配列(例えば、オレオシン)との融合タンパク質として作製する。自然に会合するヘテロ二量体タンパク質の個々のサブユニットは個別のオレオシン融合物として同時に産生させても、油体の表面上に活性のあるヘテロ二量体として会合しうることが明らかになっている。この実施例において、ヘテロ二量体は免疫グロブリン複合体の軽鎖および重鎖サブユニットである、またはそれに由来する部分である。
分泌シグナル配列を含まない成熟型軽鎖配列を、インフレームN末端融合物としてオレオシン配列に結合させる。この融合配列を、種子特異的プロモーター配列、軽鎖オレオシン融合配列および転写終結配列からなる種子特異的発現カセットの形に構築する。発現カセットを、形質転換ベクターの左方および右方の境界マーカーの間で、しかも植物選択マーカーカセットの近傍に挿入する。アグロバクテリウム中にある形質転換ベクターを用いて植物を感染させ、トランスジェニック植物を作製する。
配列番号:1〜4は、実施例1に記載した通り、アラビドプシスからチオレドキシンh(Trxh)およびチオレドキシンレダクターゼの遺伝子を単離するために合成したプライマーを示している。
Claims (30)
- 組換え多量体タンパク質複合体と会合した油体を生産する方法であって、
(a) 油体を含む植物細胞において第1の組換えポリペプチドおよび第2の組換えポリペプチドを産生させる段階であって、該第1の組換えポリペプチドは該第2の組換えポリペプチドと会合して該多量体タンパク質複合体を形成する段階;ならびに
(b) 該油体および該第1の組換えポリペプチドと会合する油体標的指向性タンパク質を介して、該多量体タンパク質複合体を細胞内で油体と会合させる段階であって、該油体標的指向性タンパク質は油体タンパク質または免疫グロブリンである段階、
を含み、第1および第2の組換えポリペプチドの永続的もしくは反復的な相互作用、または永続的もしくは反復的な協調が提供されて、第1および第2の組換えポリペプチドを含む生物活性のある組換え多量体タンパク質複合体が形成される方法。 - 該組換え多量体タンパク質複合体が以下を含む方法によって発現され、
(a) 以下を含む第1のキメラ核酸配列を植物細胞に導入する段階;
(i) 該細胞における転写を調節しうる第1の核酸配列であって、次のものと機能的に結合したもの;
(ii) 第1の組換えポリペプチドをコードする第2の核酸配列
(b) 以下を含む第2のキメラ核酸配列を該細胞に導入する段階;
(i) 該細胞における転写を調節しうる第3の核酸配列であって、次のものと機能的に結合したもの;
(ii) 第2の組換えポリペプチドをコードする第4の核酸配列
(c) 油体を含む子孫細胞における該第1および第2の組換えポリペプチドの発現を可能にする条件下で該細胞を増殖させる段階であって、該第1の組換えポリペプチドおよび該第2の組換えポリペプチドは多量体タンパク質複合体を形成することができる段階;ならびに
(d) 該油体および該第1の組換えポリペプチドと会合する油体標的指向性タンパク質を介して、該第1の組換えポリペプチドを細胞内で油体と会合させる段階であって、該油体標的指向性タンパク質は油体タンパク質または免疫グロブリンである段階、
第1および第2の組換えポリペプチドの永続的もしくは反復的な相互作用、または永続的もしくは反復的な協調が提供されて、第1および第2の組換えポリペプチドを含む生物活性のある組換え多量体タンパク質複合体が形成される、請求項1記載の組換え多量体タンパク質複合体と会合した油体を生産する方法。 - 組換え多量体タンパク質複合体と会合した油体を単離する段階、をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
- 油体および第2の組換えポリペプチドと会合する第2の油体標的指向性タンパク質と第2の組換えポリペプチドを会合させる、請求項1または2記載の方法。
- 第2の油体標的指向性タンパク質が油体タンパク質または免疫グロブリンである、請求項4記載の方法。
- 第1または第2の油体標的指向性タンパク質がオレオシンまたはカレオシンである、請求項1、2、または5記載の方法。
- 油体標的指向性タンパク質がオレオシンまたはカレオシンであり、該第1の組換えポリペプチドを該オレオシンまたはカレオシンと融合させる、請求項1または2記載の方法。
- 第2の組換えポリペプチドを、油体と会合する第2のオレオシンまたは第2のカレオシンと融合させる、請求項7記載の方法。
- 第1および第2の組換えポリペプチドを、該第1および第2の組換えポリペプチドを含む多量体融合タンパク質として産生させる、請求項1または2記載の方法。
- 多量体タンパク質複合体がヘテロ多量体タンパク質複合体である、請求項1または2記載の方法。
- ヘテロ多量体タンパク質複合体が酵素活性のある酸化還元複合体(redox complex)または免疫グロブリンである、請求項10記載の方法。
- 第1の組換えポリペプチドが細胞内で該第2の組換えポリペプチドと会合する、請求項1または2記載の方法。
- 第1の組換えポリペプチドがチオレドキシンであり、第2の組換えポリペプチドがチオレドキシンレダクターゼである、請求項1または2記載の方法。
- チオレドキシンが配列番号:38、42、46、50および配列番号:52〜194からなる群より選択される、請求項13記載の方法。
- チオレドキシンレダクターゼが配列番号:8、9、10、40、44、48、50および配列番号:195〜313に示されたものからなる群より選択される、請求項13記載の方法。
- 植物細胞がベニバナ細胞である、請求項1または2記載の方法。
- 第1の組換えポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖または免疫活性のあるその一部であり、該第2の組換えポリペプチドが免疫グロブリン重鎖または免疫活性のあるその一部である、請求項1または2記載の方法。
- 油体標的指向性タンパク質がさらにプロテインA、プロテインLまたはプロテインGを含む、請求項17記載の方法。
- 多量体融合タンパク質をコードするキメラ核酸配列であって、
(a) 油体標的指向性タンパク質をコードする第1の核酸配列であって、該油体標的指向性タンパク質は油体タンパク質または免疫グロブリンから選択され、次のものとリーディングフレーム内で機能的に結合したもの;
(b) 第1の組換えポリペプチドをコードする第2の核酸配列であって、次のものとリーディングフレーム内で結合したもの;
(c) 第2の組換えポリペプチドをコードする第3の核酸配列であって、該第1および第2の組換えポリペプチドが多量体タンパク質複合体を形成する第3の核酸配列、
を含み、第1および第2の組換えポリペプチドの永続的もしくは反復的な相互作用、または永続的もしくは反復的な協調が提供されて、第1および第2の組換えポリペプチドを含む生物活性のある組換え多量体タンパク質複合体が形成される核酸。 - 油体タンパク質がオレオシンまたはカレオシンである、請求項19記載の核酸。
- 多量体タンパク質複合体がヘテロ多量体タンパク質複合体である、請求項20記載の核酸。
- 第1および第2の組換えポリペプチドが酵素活性のあるヘテロ多量体酸化還元複合体または免疫グロブリンを形成する、請求項19記載のキメラ核酸配列。
- 第1および第2の組換えポリペプチドがチオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼである、請求項22記載のキメラ核酸配列。
- チオレドキシンが配列番号:38、42、46、50および配列番号:52〜194からなる群より選択される、請求項23記載のキメラ核酸。
- チオレドキシンレダクターゼが配列番号:8、9、10、40、44、48、50および配列番号:195〜313に示されたものからなる群より選択される、請求項23記載のキメラ核酸。
- 第1の組換えポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖または免疫活性のあるその一部であり、第2の組換えポリペプチドが免疫グロブリン重鎖または免疫活性のあるその一部である、請求項22記載のキメラ核酸。
- 油体標的指向性タンパク質がさらにプロテインA、プロテインLまたはプロテインGを含む、請求項26記載のキメラ核酸。
- 油体標的指向性タンパク質をコードする核酸配列と、第1の組換えポリペプチドをコードする核酸配列との間に、油体表面回避性リンカーアミノ酸配列をコードするリンカー核酸配列が位置する、請求項19記載のキメラ核酸。
- 油体表面回避性リンカーアミノ酸配列が実質的に負に荷電している、またはその分子量が少なくとも35kdである、請求項28記載のキメラ核酸。
- 遺伝子融合物がさらに、酵素または化学物質によって特異的に切断されうるアミノ酸配列をコードするリンカー核酸配列を含み、該リンカー配列が油体表面回避性リンカーアミノ酸配列と第1の組換えポリペプチドをコードする該配列との間に位置する、請求項29記載のキメラ核酸。
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