MXPA06005363A

MXPA06005363A - Metodos para la produccion de apolipoproteinas en plantas transgenicas.

Info

Publication number: MXPA06005363A
Authority: MX
Inventors: Maurice M Moloney; Alexandra Reid
Original assignee: Sembiosys Genetics Inc
Priority date: 2003-11-14
Filing date: 2004-11-15
Publication date: 2006-07-19
Also published as: CN1906296A; US7786352B2; EP1682664A2; WO2005047455A3; TW200526778A; WO2005047455A2; NZ547024A; EA015167B1; AR047769A1; EA200600946A1; AU2004289720B2; KR20060124633A; US20120059150A1; EP1682664A4; NO20062480L; CN1906296B; JP2007510420A; AU2004289720A1; US20050172359A1; CA2544239A1

Abstract

Se describen métodos para la producción de una apolipoproteína en plantas. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para la expresión de apolipoproteína en plantas que comprenden:(a) proporcionar una construcción deácido nucléico quimérica comprendida en la dirección 5'a 3'de la transcripción, en la forma de componentes enlazados en forma operable:(i) una secuencia deácido nucleico con la capacidad de contralar la expresión en células de plantas;y (ii) una secuencia deácido nucléico que codifica un polipéptido de apolipoproteína, (b) introducir la construcción deácido nucléico quimérica en una célula de la planta;y crecer la célula de la planta en una planta madura con la capacidad de fijar la semilla, en donde la semilla expresa apolipoproteí

Description

MÉTODOS PARA LA PRODUCCIÓN DE APOLIPOPROTEÍNAS EN PLANTAS TRANSGÉNICAS Campo del Invento La presente invención se refiere a métodos de ingeniería de plantas genéticas y a la producción de apolipoproteínas. Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos para la producción de apolipoproteínas recombinantes en plantas transgénicas. Antecedentes del Invento En un cuerpo humano saludable, existe un equilibrio entre el suministro y la eliminación de colesterol. Cuando las personas tienen un alto nivel de lipoproteína de baja densidad (LDL) y un bajo nivel de lipoproteína de alta densidad (HDL), el desequilibrio da como resultado que se deposite más colesterol en las arterias del que se elimina (van Dam, M. J. y Asociados, 2002, Lancet 359.37-42). La ateroesclerosis, el estrechamiento y bloqueo de las arterias, es una consecuencia del depósito de colesterol repetido, denominado placa (Major, A. S. y Asociados, 2001, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21:1790-1795). Las lipoproteínas se pueden separar en lipoproteínas aterogenéticas y vasoprotectoras. Las lipoproteínas aterogenéticas generalmente son todas las lipoproteínas que contienen apolipoproteína (Apo) B, tal como lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), intermedia (IDL), baja (LDL), o lipoproteína (Lp(a)), en tanto que las lipoproteínas vasoprotectoras son Apo con contenido de Al, tal como HDL. Apo Al, es el principal constituyente de proteínas de HDL, juega un papel importante en la homeostasis de colesterol. Los estudios clínicos y en la población han demostrado una remarcada correlación inversa entre la enfermedad cardiovascular y los niveles de HDL en plasma, lo que sugiere que Apo Al HDL ayuda para servir como un papel protector contra aterogénesis (Rubins, H. B. y Asociados, 1993, Am. J. Cartiol. 71:45-52). Los estudios de ratones transgénicos (Rubin, E. M. y Asociados, 1991, Nature 353:265-267) y conejos (Duverger, N. y Asociados, 1996, Circulation 94:713-717) susceptibles a ateroesclerosis, han demostrado que la expresión de Apo Al inhibe el desarrollo de ateroesclerosis. Este efecto puede estar relacionado con su promoción eficiente de eflujo de colesterol de las células (Castro, G. y Asociados, 1997, Biochemistry 36:2243-2249), el primer paso en el proceso de "transporte de colesterol inverso" (RCT) (Glomset, J. A. 1968, J. Lipid Res. 9:155-167). Apo Al modula este proceso siendo un aceptor preferencial de colesterol celular (Rothblat, G. H. y Asociados, 1999, J. Lipid Res. 40:781-796), incrementando la actividad de la esterificación de Iecitina-colesterol-acil-transferasa (LCAT) del colesterol asociado con HDL de varios dobleces (Joñas, A. 1991, Biochim. Biophys. Acta 1084:205-220; Mahley, R. W. y Asociados, 1984, J. Lipid Res. 25:1277-1294), y el transporte de esteres de colesteril derivados de LCAT al hígado (Morrison, J. R. y Asociados, 1992, J. Biol. Chem. 267:13205-13209). A diferencia de los anti-hiperlipidémicos sintéticos, tales como LIPITOR® (calcio de atorvastatina) que actúan para disminuir los niveles de lípidos en el cuerpo inhibiendo la síntesis de colesterol (Alaupovic, P. y Asociados, 1997, Atherosclerosis 133:123-133), una infusión de Apo Al purificado estimula el eflujo de colesterol de los tejidos en el plasma (Navab, M. y Asociados, 2002, Circulation 105:290-292). Esto sugiere que Apo Al podría estimular el eflujo de colesterol de las células de esponja en la pared arterial e inducir la regresión de la placa ateroesclerótica "limpiando" en forma efectiva las arterias. En humanos, Apo Al se sintetiza en el hígado y células intestinales como una pre-pro-proteína no glucosilada (Gordon, J. I. y Asociados, 1983, J. Biol. Chem. 258:4037-4044). El segmento previo de 18 aminoácidos se elimina antes de que la proteína abandone la célula y el prosegmento de 6 aminoácidos se disocia después de la secreción a través de una proteasa no conocida en el plasma, dejando la proteína de 243 aminoácidos madura (Saku, K. y Asociados, 199, Eur. J. Clin. Invest. 29:196-203). La apolipoproteína A-lM¡?ano (Apo Al-M), es el primer variante molecular descrito de Apo Al humano (Franceschini, G. y Asociados, 1980, J. Clin. Invest. 66:892-900). Está caracterizado por la substitución de Arg 173 con Cys (Weisgraber, K. H. y Asociados, 1983, J. Biol. Chem. 258:2508-2513). La apolipoproteína mutante se transmite como un rasgo dominante autosomal y se han identificado 8 generaciones de transportadores (Gerli, G. C. y Asociados, 1984, Hum. Hered. 34:133-140). El estado del transportador Apo AI-M individual, está caracterizado por una remarcada reducción en el nivel de HDL-colesterol. A pesar de esto, los sujetos afectados aparentemente no muestran algún riesgo incrementado de enfermedad arterial; de hecho, a través de un examen del árbol genealógico aparece que estos sujetos pueden estar "protegidos" de la ateroesclerosis. El mecanismo del posible efecto protector de Apo Al-M en los transportadores, parece estar enlazado a una modificación en la estructura de la apolipoprotreína mutante, con la pérdida de una alfa-hélice de una exposición incrementada de residuos hidrofóbicos (Franceschini, G. y Asociados, 1985, J. Biol. Chem. 260:16321-16325). La pérdida de la estructura apretada de las múltiples alfa-hélices conduce a una flexibilidad incrementada de la molécula, lo cual se asocia más fácilmente con los lípidos, en comparación con A-l normal. Además, los complejos de apolipoproteína/lípidos son más susceptibles a desnaturalización, sugiriendo de esta forma que el suministro de lípidos también se mejora en el caso del mutante. El uso terapéutico de Apo Al y el mutante Apo Al-M está limitada actualmente por la carencia de un método que permita la preparación de dichas apolipoproteínas en una cantidad suficiente y en una forma adecuada. En particular, la producción recombinante de Apo Al ha demostrado ser muy difícil debido a su carácter anfifílico, autoagregación y degradación (Schmidt, H. H. y Asociados, 1997, Protein Expr. Purif. 10:226-236). Al momento de la presente invención, la Apo AI humana recombinante ha sido expresada in vitro en dos sistemas eucarióticos: células Spodoptera frugiperda (Sf9) transfectada con baculovirus (Sorci-Thomas, M. G. y Asociados, 1996, J. Lipid Res. 37:673-683) y células de ovario de hámster Chino (CHO) transfectadas de manera estable (Forte, T. M. y Asociados, 1990, Biochim. Biophys. Acta 1047:11-18; Mallory, J. B. y Asociados, 1987, J. Biol. Chem. 262:4241-4247). En el sistema de baculovirus, una vez que las células son transfectadas en forma exitosa existe un proceso de clasificación profundo antes de que las células, con la construcción correcta, puedan ser utilizadas para expresión. En forma similar, las colonias de células CHO deben pasar por un proceso de clasificación para encontrar colonias transfectadas de manera estable de alta expresión. Además, ambos de estos tipos de células requieren un período de tiempo relativamente largo antes de que se logre una expresión significativa y un nivel mucho mayor de mantenimiento que las bacterias. La expresión recombinante de las proteínas en sistemas bacterianos, generalmente es atractivo debido a que puede producir grandes cantidades de proteína pura en forma rápida y económica. Existen varios reportes de la expresión Apo Al en Escherichia coli transformada (E. coli); sin embargo, aunque se han realizado ciertas mejorías recientes en niveles de expresión (Ryan, R. O. y Asociados, 2003, Protein Expr. Purif. 27:98-103), en general estos métodos proporcionan producciones relativamente bajas o la presencia indeseable de apéndices de afinidad extraña o señales de secreción (Bergeron, J. y Asociados, 1997, Biochim. Biophys. Acta 1344:139-152; Li, H. H. y Asociados, 2001, J. Lipid Res. 42:2084-2091; McGuire, K. A. y Asociados, 1996, J. Lipid Res. 37:1519-1528). Además, las endotoxinas E. coli son conocidas por formar complejos particularmente fuertes con apolipoproteínas (Emancipator y Asociados (1992) Infecí. Immun. 60:596-601). La reducción o eliminación de la toxicidad asociada con estas endotoxinas E. coli en preparaciones farmacéuticas de apolipoproteínas es altamente deseable. La eliminación de estas toxinas, aunque técnicamente factible, comprende metodologías de purificación de proteína compleja y costosa (Patente Norteamericana No. 6,506,879), sin eliminar completamente el riesgo de la salud del humano. El uso de plantas como biorreactores para la producción a gran escala de proteínas recombinantes es conocido en la técnica, y se han producido numerosas proteínas, incluyendo proteínas terapéuticas humanas. Por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,956,282, 5,550,038 y 5,629,175 describen la producción de interferón-? en plantas; las Patentes Norteamericanas Nos. 5,650,307, 5,716,802 y 5,763,748 describen con detalle la producción de albúmina de suero humano en plantas y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,202,422, 5,639,947 y 5,959,177 se refieren a la producción de anticuerpos en plantas. Una de las ventajas significativas ofrecidas por los sistemas de producción de proteína recombinante a base de plantas es que al incrementar el área en acres de las plantas crecidas, la producción de proteína se puede elevar en forma no costosa para proporcionar grandes cantidades de proteína. En contraste, los sistemas de fermentación y cultivo celular tienen gran espacio, equipo y requerimientos de energía, volviendo muy costosa la elevación de la producción. Sin embargo, a pesar del hecho de que el uso de plantas en la forma de biorreactores está ampliamente documentado, y a pesar de las aplicaciones terapéuticas de las apolipoproteínas antes mencionadas, la técnica anterior no proporciona métodos para la producción de apolipoproteínas en plantas. Con el objeto de ofrecer una alternativa práctica a los sistemas a base de fermentación y cultivo celular, es importante que las plantas permanezcan sanas y que se acumulen apolipoproteínas en niveles significativos en las plantas. En virtud de la propiedad inherente de las apolipoproteínas de asociarse con los lípidos, las apolipoproteínas expresadas en forma recombinante se pueden asociar con los lípidos de plantas endógenas y de esta forma interferir con el metabolismo de lípidos de la planta. Por lo tanto, la expresión recombinante de apolipoproteínas puede afectar la salud de la planta. Como alternativa, la apolipoproteína expresada en forma recombinante puede fallar en acumularse en niveles efectivos, ya que los mecanismos protectores pueden dar como resultado la degradación de la apolipoproteína. Por lo tanto no queda claro cómo y si se puede hacer uso de la capacidad sintética de las plantas para lograr la producción comercial de apolipoproteínas en plantas. Por lo tanto, en virtud de los inconvenientes asociados con los métodos para la producción recombinante de apolipoproteínas en la técnica anterior, existe la necesidad en la técnica de mejorar los métodos para la producción de apolipoproteínas. Sumario del Invento La presente invención se refiere a métodos para la producción de apolipoproteínas en plantas. En particular, la presente invención se refiere a métodos para la producción de apolipoproteínas en semillas de plantas. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para la expresión de una apolipoproteína en plantas, en donde el método comprende: (a) proporcionar una construcción de ácido nucleico quimérica que está comprendida en la dirección 5' a 3' de la transcripción en la forma de componentes enlazados en forma operable: (i) una secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en células de plantas; y (¡i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína; (b) introducir la construcción de ácido nucleico quimérica en una célula de planta; y (c) crecer la célula de la planta en una planta madura con la capacidad de expresar la apolipoproteína. De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que las semillas de planta son particularmente adecuadas para la producción de apolipoproteína. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para expresar apolipoproteína en semillas de plantas, en donde el método comprende: (a) proporcionar una construcción de ácido nucleico quimérica que está comprendida en la dirección 5' a 3' de la transcripción en la forma de componentes enlazados en forma operable: (i) una secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en células de semilla de planta; y (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína; (b) introducir la construcción de ácido nucleico quimérica en una célula de planta; y (c) crecer la célula de la planta en una planta madura con la capacidad de fijar la semilla, en donde la semilla expresa la apolipoproteína. En una modalidad preferida adicional, la secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en una célula de semilla de la planta, es un promotor preferido por la semilla tal como el promotor de faseolina. En una modalidad preferida, al menos el 0.25% de la proteína de semilla total es apolipoproteína. En modalidades preferidas de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico quimérica comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de estabilización enlazado en la estructura de lectura a la secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína. Preferentemente, el polipéptido de estabilización es un polipéptido que en la ausencia de la apolipoproteína puede ser expresado fácilmente y acumularse en forma estable en una célula de planta. La proteína de estabilización puede ser específica o no de la planta. Los polipéptidos de estabilización específicos de la planta que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención, incluyen proteínas y tiorredoxinas de cuerpo aceitoso. Los polipéptidos de estabilización no específicos de la planta que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención, incluyen proteína fluorescente verde (GFP) y anticuerpos de cadena simple o fragmentos de los mismos. El polipéptido de estabilización específico de la planta o no específico de la planta, puede estar enlazado a la apolipoproteína a través del enlazador el cual puede ser disociado para liberar la apolipoproteína en su forma nativa libre. La secuencia de ácido nucleico quimérico comprende preferentemente además una señal de dirección de tal forma que el polipéptido de apolipoproteína se acumula en el retículo endoplásmico (ER) o en asociación con una vesícula de almacenamiento derivada de ER, por ejemplo un cuerpo aceitoso, adentro de la célula de la planta. Por consiguiente, la construcción de ácido nucleico quimérica puede comprender además una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido el cual tiene la capacidad de dirigir el polipéptido de apolipoproteína al ER ó a una vesícula de almacenamiento derivada de ER. Las secuencias de ácido nucleico que se pueden utilizar para dirigir la apolipoproteína al ER, incluyen por ejemplo secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias KDEL, HDEL, SDEL. Las secuencias de ácido nucleico que pueden utilizarse para dirigir la apolipoproteína a un cuerpo aceitoso, incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de cuerpo aceitoso, tales como oleosinas. Además, de acuerdo con la presente invención, la apolipoproteína puede ser dirigida al cuerpo aceitoso expresando la apolipoproteína de tal forma que la apolipoproteína no incluya una señal de dirección, siempre que, sin embargo, la secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína comprenda un pro-péptido de apolipoproteína. En otra modalidad preferida, el ácido nucleico quimérico comprende una señal de dirección de tal forma que la apolipoproteína se acumula en el apoplasto. Por consiguiente, en dicha modalidad la construcción de ácido nucleico quimérica contiene preferentemente además una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido el cual tiene la capacidad de dirigir el polipéptido de apolipoproteína al apoplasto. En una modalidad preferida aún adicional, la secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína se expresa en tal forma que la apolipoproteína se acumula en el citoplasma. En dicha modalidad, la secuencia de ácido nucleico no comprende una señal de dirección. En una modalidad preferida adicional, la construcción de ácido nucleico quimérica se introduce en la célula de la planta bajo condiciones de integración genómica. Bajo dichas condiciones la secuencia de ácido nucleico quimérica se integra de manera estable en el genoma de la planta. En una modalidad preferida aún adicional, la secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína se optimiza para el uso de codón de la planta. Las secuencias de ácido nucleico preferidas de acuerdo con la presente invención codifican apolipoproteína A-l y pro-apolipoproteína A-l de humano, bovino, o porcino. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para obtener semillas de planta que comprenden apolipoproteína. Por consiguiente, a través de la presente invención se proporciona un método para obtener una semilla de planta, en donde el método comprende: (a) proporcionar una construcción de ácido nucleico quimérica que está comprendida en la dirección 5' a 3' de la transcripción en la forma de componentes enlazados en forma operable: (i) una secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en células de tejido de la planta; y (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína; (b) introducir la construcción de ácido nucleico quimérica en una célula de planta; (c) el crecimiento de la célula de las plantas en una planta madura con la capacidad de fijar la semilla; y (c) obtener la semilla de la planta, en donde la semilla comprende la apolipoproteína. Las semillas se pueden utilizar para obtener una población de plantas de progenie, comprendiendo cada una, una pluralidad de semillas que expresan apolipoproteína. La presente invención también proporciona plantas con la capacidad de fijar semillas que expresan apolipoproteína. En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas con la capacidad de fijar la semilla comprenden una secuencia de ácido nucleico quimérico que está comprendida en la dirección 5' a 3' de la transcripción: (a) una primera secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en una célula de planta enlazada en forma operable a la misma; (b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína, en donde las células contienen la apolipoproteína. En una modalidad preferida la secuencia de ácido nucleico quimérico está integrada en el genoma nuclear de la planta. En una modalidad preferida adicional de la presente invención, la planta que se utiliza es una planta Arabidopsis y en una modalidad particularmente preferida la planta es una planta de cártamo. Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona semillas de plantas que expresan apolipoproteína. En una modalidad preferida de la presente invención, las semillas de la planta comprenden una secuencia de ácido nucleico quimérico que está comprendido en la dirección 5' a 3' de la transcripción: (a) una primera secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en una célula de planta enlazada en forma operativa a la misma; (b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína. Las semillas son una fuente en donde el polipéptido de apolipoproteína deseado, el cual es sintetizado por las células de la semilla, puede ser extraído y obtenido en una forma más o menos pura. La apolipoproteína puede utilizarse para tratar enfermedades vasculares. A partir de la descripción detallada que se encuentra a continuación se podrán apreciar fácilmente otras características y ventajas de la presente invención. Sin embargo, deberá quedar entendido que la descripción detallada y los ejemplos específicos aunque indican modalidades preferidas de la presente invención, se proporcionan a manera de ilustración únicamente, ya que los expertos en la técnica podrán apreciar diversos cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la presente invención, a partir de esta descripción detallada. Breve Descripción de los Dibujos A continuación la presente invención se describirá en relación a los dibujos, en los cuales: Figura 1. (A) secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:1) y secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO:2) de apolipoproteína A-l (Apo AI) de Homo sapiens (Amablemente proporcionada por el Dr. Norman Wong, Calgary Alberta) (Número de acceso NM_000039). Los residuos en letras negritas representan el péptido de señal de secuencia previa, los residuos subrayados representan la pro-secuencia. fB) Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:3) y secuencia de aminoácido deducida (SEQ ID NO:4) para la variante natural Apo AIM¡?ano (R173C). Los residuos en negritas/cursivas representan el aminoácido mutado. (C) Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO:5) y secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO:6) para la variante natural Apo Al Paris (R151C). Los residuos con negritas/cursivas representan el aminoácido mutado. Figura 2. Dibujo esquemático de todas las construcciones binarias creadas por la expresión de Apo Al de apolipoproteína en plantas transgénicas de Arabidopsis. (A) Construcciones que son dirigidas al citosol en la célula de planta. (B) Construcciones que están dirigidas a cuerpos aceitosos en la célula de planta. (C-E) Construcciones que están dirigidas a lá trayectoria de secreción. (D & E) Construcciones que pueden contener secuencias KDEL adicionales para ser retenidas en el retículo endoplásmico. (D) Construcciones que contienen pro-secuencia de Apo Al ó Apo Al maduro. (E) Construcciones que contienen una secuencia disociable para la liberación de pro-Apo Al ó Apo Al-maduro. La leyenda describe el tipo de promotor, péptido de señal y secuencia de codificación contenida en cada construcción.

Figura 3(A). Dibujo esquemático de la estrategia de clonación para la región que codifica GFP que será utilizada en las construcciones de fusión de traducción Apo AI-GFP.

Figura 3(B). Dibujo esquemático de la estrategia de clonación de las regiones de codificación pro y maduras de Apo AI y las construcciones de fusión de traducción Apo Al-GFP específicos de semillas. Figura 3(C). Dibujo esquemático de la estrategia de clonación para la creación de vectores binarios utilizados para transformar células Agrobacterium EHA101 para la dirección de Apo AI-GFP a base de cuerpo aceitoso y citosólico específico de la semilla. Apo10 y Apo11 que contienen el Apo AI-GFP maduro y pro-, respectivamente, dirigidos al citosol. Apo12 y Apo13 que contienen la fusión de traducción de Apo AI-GFP pro- y maduro, respectivamente, dirigidos a cuerpos aceitosos. Figura 3(D). Dibujo esquemático de la estrategia de clonación para la creación de vectores binarios utilizados para transformar células Agrobacterium EHA101 para la trayectoria de segregación específica de la semilla para la dirección de Apo AI-GFP. Apo15 y Apo16 que contienen la fusión de traducción Apo AI-GFP madura y pro-, respectivamente, dirigida a la trayectoria de secreción. Figura 4(A). Dibujo esquemático de la estrategia de clonación para la creación de los vectores binarios utilizados para transformar células Agrobacterium EHA101 para la dirección citosólica constitutiva de Apo AI-GFP. Apo17 y Apo18a que contienen la fusión de traducción Apo AI-GFP madura y pro-, respectivamente, dirigidas al citosol. Figura 4(B). Dibujo esquemático de la estrategia de clonación para la dirección citosólica constitutiva de Apo AI-GFP. Apo18b que contiene la fusión de traducción Apo-GFP pro- dirigida al citosol. Figura 5(A). Dibujo esquemático de la estrategia de clonación para las regiones de codificación pro- y maduras de Apo Al y la expresión constitutiva de la proteína de fusión de traducción Apo AI-GFP. Figura 5(A). Dibujo esquemático de la estrategia de clonación para la creación de vectores binarios utilizados para transformar células Agrobacterium EHA101 para la trayectoria de secreción constitutiva para la dirección de Apo AI-GFP. Apo19 y Apo20 que contienen la fusión de traducción Apo AI-GFP maduro y pro-, respectivamente, dirigida a la trayectoria de secreción. Figura 6. Dibujo esquemático de la estrategia de clonación para la forma madura de la región de codificación de Apo Al. Apo21 para la dirección específica de la semilla al citosol, Apo23 para la dirección específica de la semilla a los cuerpos aceitosos, Apo25 para la dirección específica de la semilla a los cuerpos aceitosos y purificación con la secuencia de disociación kl i p 8 y Apo29 para la dirección específica de la semilla a la trayectoria de secreción. Figura 7. Dibujo esquemático de la estrategia de clonación para la pro-forma de la región de codificación de Apo Al. Apo22 para la dirección específica de la semilla al citosol, Apo24 para la dirección específica de la semilla a los cuerpos aceitosos, Apo30 para la dirección específica de la semilla a la trayectoria de secreción y Apo26 para la dirección específica de la semilla a cuerpos aceitosos y purificación con la secuencia de disociación klipd. Figura 8(A). Dibujo esquemático de la estrategia de clonación de la pro-forma de la región de codificación de Apo Al con los sitios Xhol internos eliminados y que contiene un péptido de señal KDEL. Apo27 para la dirección específica de la semilla a los cuerpos aceitosos en la forma de una fusión en-estructura con oleosina. Apo31 y Apo35 ambos dirigidos a la trayectoria de secreción, con Apo31 y Apo35 fusionados en estructura con el anticuerpo de oleosina D9, y Apo35 acumulándose en el retículo endoplásmico debido al péptido de señal KDEL. Figura 8(B). Dibujo esquemático de la estrategia de clonación de la pro-forma de la región de codificación de Apo AlMüano- Apo27M para la dirección específica de la semilla de Apo AIM¡iano a los cuerpos aceitosos en la forma de una fusión en estructura con oleosina.

Figura 9. Dibujo esquemático de la estrategia de clonación para la pro-forma de la región de codificación de Apo Al con los sitios Xhol e internos eliminados. Apo28, dirigido a los cuerpos aceitosos y con la capacidad de ser disociado en la secuencia klipd, Apo32 que dirige Apo Al a la trayectoria de secreción fusionada en estructura al anticuerpo de oleosina D9. Figura 10. Dibujo esquemático de la estrategia de clonación para las formas pro- y maduras de la región de codificación de Apo AI con los sitios Xhol internos eliminados que contienen un residuo Met adicional al inicio de la región de codificación. Apo34 (Apo AI pro-) y Apo33 (Apo Al maduro) los cuales se dirigen a la trayectoria de secreción y se fusionan en estructura con el anticuerpo de oleosina D9. Figura 11. Dibujo esquemático de la estrategia de clonación para la pro-forma de la región de codificación de Apo Al con los sitios Xhol internos que contienen un péptido de señal KDEL. Apo36, dirigido a la trayectoria de secreción y está fusionado en estructura con el anticuerpo de oleosina D9, y se acumula en el retículo endoplásmico debido a un péptido de señal KDEL. Figura 12. Dibujo esquemático de la estrategia de clonación para las formas pro- y maduras de la región de codificación de Apo Al con los sitios Xhol internos eliminados que contienen un residuo Met adicional al inicio de la región de codificación y un péptido de señal KDEL. Apo38 y Apo37 los cuales están dirigidos a la trayectoria de secreción y están fusionados en estructura con el anticuerpo de oleosina D9, y se acumulan en el retículo endoplásmico debido a un péptido de señal KDEL. Figura 13. Dibujo esquemático de la estrategia de clonación de las formas pro- y maduras de la región de codificación de Apo AI y un sitio de disociación de proteasa. Apo43, Apo44, Apo39 y Apo40 dirigidas a la trayectoria de secreción, fusionadas en estructura con el anticuerpo de oleosina D9. Apo43 y Apo44 podrían acumularse en el retículo endoplásmico debido a un péptido de señal KDEL. Figura 14. Dibujo esquemático de la estrategia de clonación de las formas pro- y madura de la región de codificación de Apo Al, que contienen un residuo Met adicional al inicio de la región de codificación y un sitio de disociación de proteasa. Apo42, Apo46, Apo41, y Apo45 dirigidos a la trayectoria de secreción, fusionados en la estructura con el anticuerpo de oleosina D9. Apo46 y Apo45 se podrían acumular en el retículo endoplásmico debido a un péptido de señal KDEL. Figura 15. Dibujo esquemático de la estrategia de clonación para la forma madura de la región de codificación de Apo Al, que contiene un residuo Met adicional al inicio de la región de codificación y un sitio de disociación de proteasa. Apo47 está fusionado en estructura con la oleosina de maíz para la dirección a los cuerpos aceitosos. Figura 16. Manchados Western de la proteína de la hoja total (A) (25 µg) y la proteína de la semilla total (B) (50 µg) con anticuerpo Apo Al policlonal. Apo17 es una construcción AI-GFP ubi-mat-Apo. Se utilizaron las proteínas de hoja (25 µg) y semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo.

Figura 17. Manchados Western de la proteína de la hoja total (A) (25 µg) y proteína de la semilla total (B) (50 µg) con anticuerpo Apo Al policlonal. Apo18a es una construcción AI-GFP ubi-pro-Apo. Se utilizaron las proteínas de la hoja (25 µg) y de la semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo. Figura 18. Manchados Western de la proteína de la hoja total (A) (25 µg) y proteína de la semilla total (B) (50 µg) con anticuerpo Apo Al policlonal. Apo19 es una construcción AI-GFP ubi-PRS--mat-Apo. Se utilizaron las proteínas de la hoja (25 µg) y de la semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo. Figura 19. Manchados Western de la proteína de la hoja total (A) (25 µg) y proteína de la semilla total (B) (50 µg) con anticuerpo Apo Al policlonal. Apo20 es una construcción AI-GFP ubi-PRS-pro-Apo. Se utilizaron las proteínas de la hoja (25 µg) y de la semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo. Figura 20. Manchados Western de proteína de la semilla total (50 µg) con anticuerpo GFP policlonal. (A) Apo10 es una construcción Al-GFP pha-mat-Apo. (B) Apo11 es una construcción Al-GFP pha-pro-Apo. Se utilizó proteína de la semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 200 ng de proteína GFP purificada en la forma de un control positivo. Figura 21. Manchados Western de la proteína de semilla total (50 µg) con anticuerpo GFP policlonal. (A) Apo12 es una construcción Al-GFP pha-oleosina-mat-Apo. (B) Apo13 es una construcción Al-GFP pha-oleosina-pro- Apo. Se utilizó la proteína de semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 200 ng de proteína GFP purificada en la forma de un control positivo. Figura 22. Manchados Western de la proteína de semilla total (50 µg) con anticuerpo GFP policlonal. (A) Apo15 es una construcción Al-GFP pha-PRS-mat-Apo. (B) Apo16 es una construcción Al-GFP pha-PRS-pro-Apo. Se utilizó la proteína de semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 200 ng de proteína GFP purificada en la forma de un control positivo. Figura 23. Manchados Western de la proteína de semilla total (50 µg) con anticuerpo Apo AI policlonal. (A) Apo21 es Al pha-mat-Apo. (B) Apo22 es Al pha-pro-Apo. Se utilizó la proteína de semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo. Figura 24. Manchados Western de la proteína de semilla total (50 µg) con anticuerpo Apo Al policlonal. (A) Apo23 es Al pha-oleo-mat-Apo. (B) Apo24 es Al pha-oleo-pro-Apo. Se utilizó la proteína de semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo. Figura 25. Manchados Western de la proteína de semilla total (50 µg) con anticuerpo Apo Al policlonal. (A) Apo25 es Al( + Met) pha-oleo-klipd-mat-Apo. (B) Apo26 es Al( + Met) pha-oleo-klip8-pro-Apo. Se utilizó la proteína de semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo.

Figura 26. Manchados Western de la proteína de semilla total (50 µg) con anticuerpo policlonal Apo Al. (A) Apo28 es Al pha-oleo-klip8-pro-Apo. (B) Apo29 es Al pha-PRS-mat-Apo. Se utilizó la proteína de semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo. Figura 27. Manchados Western de la proteína de semilla total (50 µg) con anticuerpo policlonal Apo Al. (A) Apo30 es Al pha-PRS-pro-Apo. Se utilizó la proteína de semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo. Figura 28. Manchados Western de la proteína de semilla total (50 µg) con anticuerpo policlonal Apo Al. (A) Apo32 es Al pha-PRS-D9 scFv-pro-Apo. (B) Apo33 es AI( + met) pha-PRS-D9 scFv-mat-Apo. Se utilizó la proteína de semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo. Figura 29. Manchados Western de la proteína de semilla total (50 µg) con anticuerpo policlonal Apo Al. (A) Apo34 es Al( + met) pha-PRS-D9 scFv-pro-Apo. (B) Apo35 es AI-KDEL pha-PRS-D9 scFv-mat-Apo. Se utilizó la proteína de semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo. Figura 30. Manchados Western de la proteína de semilla total (50 µg) con anticuerpo policlonal Apo Al. (A) Apo36 es AI-KDEL pha-PRS-D9 scFv-pro-Apo. (B) Apo37 es AI( + met)-KDEL pha-PRS-D9 scFv-mat-Apo. Se utilizó la proteína de semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo. Figura 31. Manchados Western de la proteína de semilla total (50 µg) con anticuerpo policlonal Apo Al. (A) Apo38 es AI( + met)-KDEL pha-PRS-D9 scFv-pro-Apo. Se utilizó la proteína de semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo. (B) Apo29 es Al pha-PRS-D9 scFv-KLI P8-Apo. La semilla de tipo natural fue utilizada como un control negativo y se utilizaron 3 µg de Apo Al de humano de plasma de humano normal (US Biological) en la forma de un control positivo. Figura 32. Manchados Western de la proteína de semilla total (50 µg) con anticuerpo policlonal Apo Al. (A) Apo40 es Al pha-PRS-D9 scFv-klipd-pro-Apo. (B) Apo41 es Al( + met) pha-PRS-D9 scFv-klip8-mat-Apo. Se utilizó la proteína de semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo. Figura 33. Manchados Western de la proteína de semilla total (50 µg) con anticuerpo policlonal Apo Al. (A) Apo42 es Al( + met) pha-PRS-D9 scFv-kIip8-pro-Apo. Se utilizó la proteína de semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo. Figura 34. Manchados Western de la proteína de semilla total (50 µg) con anticuerpo policlonal Apo Al. (A) Apo44 es AI-KDEL pha-PRS-D9 scFv-klip8-pro-Apo. (B) Apo45 es Al( + met) pha-PRS-D9 scFv-klipd-mat-Apo. Se utilizó la proteína de semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo. Figura 35. Manchado Western de la proteína de semilla total (50 µg) con anticuerpo policlonal Apo Al. (A) Apo46 es AI( + met)-KDEL pha-PRS-D9 scFv-klip8-pro-Apo. Se utilizó la proteína de semilla (50 µg) c24 en la forma de un control negativo y se utilizaron 0.5 µg de proteína de suero de sangre humana en la forma de un control positivo. Figura 36. Revisión de la asociación de Apo Al-GFP no dirigida y dirigida al cuerpo aceitoso con fracciones celulares específicas de semillas. Análisis de manchado Western que utiliza el anticuerpo Apo Al policlonal y cantidades aproximadamente iguales de proteína total (50 µg) de la fracción acuosa (AQ), lavados de fosfato (PW) y urea (UW) de los cuerpos aceitosos (PO y UO respectivamente, aproximadamente con 20 µg de cuerpos de aceite totales utilizados) y la fracción microsomal (ER) de semillas maduras. Manchado Ponceau-S del inmunomanchado muestra cantidades de proteína relativas cargadas en el gel (panel superior). Se utilizó suero de sangre humana (0.5 µg) como un control positivo para la expresión Apo Al. (A) Apo10 es Al-GFP Apo. Apo11 es Al-GFP pro-Apo. (B) Apo12 es Al-GFP oleosina-Apo y Apo13 es Al-GFP oleosina-pro-Apo. Figura 37. Revisión de asociación Apo Al-GFP pro- y madura segregada con reacciones celulares específicas de semillas. Análisis de manchado Western utilizando el anticuerpo anti-Apo Al y cantidades aproximadamente ¡guales de proteína total (50 g) aislada de la fracción acuosa (AQ), lavados de fosfato (PW) y urea (UW) de los cuerpos aceitosos (PO y UO respectivamente, aproximadamente con 20 µg de la proteína de cuerpo aceitoso total utilizado) y la fracción microsomal (ER) de las semillas maduras. El manchado Ponceau-S del inmunomanchado, mostró cantidades de proteína relativas cargadas en el gel (panel superior). Se utilizó suero de sangre humana (0.5 µg) como un control positivo para la expresión Apo Al. Apo15 es Al-GFP PRS-Apo. Apo16 es Al- GFP PRS-pro-Apo. Figura 38. Expresión constitutiva de las construcciones de fusión de traducción Apo Al-GFP en hojas. El análisis de manchado Western utilizando el anticuerpo anti-GFP y cantidades aproximadamente iguales de proteína total (50 µg) aislada de las hojas. El manchado Ponceau-S del inmunomanchado mostró cantidades de proteínas relativas cargadas en el gel (panel superior). Se utilizaron plantas tipo natural (c24) en la forma de un control negativo para la expresión GFP. Se utilizó proteína GFP purificada (200 ng) en la forma de un control positivo para GFP. Se incluyeron UG-14 y UR2 como controles positivos para la acumulación de proteína GFP en hojas. Las masas esperadas fueron como se indica a continuación: Apo17 = 55.4 kDa; Apo18 = 56.4 kDa; Apo19 = 58.3 kDa; Apo20 = 59.3 kDa; UG-14 = 26.8 kDa; UR2 = 50 kDa. Figura 39. Expresión específica de la semilla de Apo Al segregado y no dirigido en semillas. El análisis de manchado Western utilizando anticuerpo anti-Apo Al y cantidades aproximadamente iguales de proteína total (50 µg) aisladas de semillas maduras. El manchado Ponceau-S del inmunomanchado muestra las cantidades de proteíná relativas cargadas en el gel (panel superior). Se utilizaron plantas tipo natural (c24) como un control negativo para la expresión Apo Al. Se utilizó suero de sangre humana (0.5 µg) como un control positivo para la expresión Apo AI. Las masas esperadas son como se indica a continuación: Apo21 = 28.3 kDa; Apo22 = 29.32 kDa; Apo23 = 46.9 kDa; Apo24 = 47.8 kDa; Apo25 = 51.5 kDa; Apo26 = 52.5 kDa; Apo27 = 51.3 kDa; Apo28 = 52.3 kDa; Apo29 = 31.3 kDa; Apo30 = 32.2 kDa. Figura 40. Revisión de fracciones subcelulares de Apo22-3 (Apo Al pro- no dirigido) T3 de generación de semillas. El análisis de manchado Western utilizando el anticuerpo anti-Apo Al y cantidades aproximadamente iguales de proteína total (50 µg) aislada de la fracción acuosa (AQ), lavados de fosfato (PW) y urea (UW) de cuerpos aceitosos (PO y UO respectivamente, aproximadamente con 20 µg de cuerpos aceitosos totales utilizados) de semillas maduras. El manchado Ponceau-S del inmunomanchado mostró cantidades de proteínas relativas cargadas en el gel (panel superior). Se utilizó suero de sangre humana (0.5 µg) como un control positivo para la expresión Apo Al. Los tamaños de peso molecular se indican a la izquierda. Figura 41. Micrográficas confocales de construcciones específicas de semilla Apo Al-GFP expresadas en células de embrión de tapa cotiledonaria tardía manchadas con rojo Nilo (A-C) Apo10 es Apo Al maduro no dirigido fusionado a GFP. (D-F) Apo11 es Apo Al pro- no dirigido fusionado a GFP. (G-I) Apo12 es Apo Al maduro fusionado a GFP dirigido a cuerpos aceitosos utilizando oleosina. (Columna 1) canal verde. (Columna 2) canal rojo. (Columna 3) canales fusionados. Barra = 5 µm. Figura 42. Micrográficas confocales de construcciones específicas de semilla Apo Al-GFP expresadas en células de embrión de tapa cotiledonaria tardía manchadas con rojo Nilo. (A-C) Apo13 es Apo Al pro- fusionada a GFP dirigido a cuerpos aceitosos utilizando oleosina. (D-F) Apo15 es Apo Al maduro fusionada a GFP dirigido a la trayectoria de secreción. (G-I) Apo16 es AI pro-Apo fusionado a GFP dirigido a la trayectoria de secreción. (Columna 1) canal verde. (Columna 2) canal rojo. (Columna 3) canales fusionados, barra = 5 µm. Figura 43. Micrográficas confocales de proteína de fusión Apo Al-GFP segregada y no dirigida expresada en forma constitutiva en células de embrión de tapa cotiledonaria tardía manchada con rojo Nilo. (A-C) Apo17 es Apo Al madura no dirigida fusionada a GFP. (D-F) Apo18 es Apo Al pro- no dirigida fusionada a GFP. (G-H) Apo19 es Apo Al madura fusionada a GFP dirigido a la trayectoria de secreción. Apo20 es Apo AI pro- fusionada a GFP dirigido a la trayectoria de secreción. (Columna 1) canal verde. (Columna 2) canal rojo. (Columna 3) canales fusionados, barra = 5 µm.

Figura 44. Micrográficas confocales de construcciones constitutivas Apo Al-GFP expresadas en células epidérmicas de hoja. (A-C) Apo17 es Apo AI maduro no dirigido fusionado a GFP. (D-F) Apo18 es Apo Al pro- no dirigido fusionado a GFP. (G-H) Apo19 es Apo AI maduro fusionado a GFP dirigido a la trayectoria de secreción. (J-L) Apo20 es Apo Al pro- fusionado a GFP dirigido a la trayectoria de secreción. (Columna 1) canal verde. (Columna 2) canal rojo. (Columna 3) canales fusionados. Barra = 5 µm. Figura 45. Purificación de Apo25, Apo26, y Apo28 mediante cromatografía de fase inversa. (A) trazo HPLC de Apo Al estándar, (B) trazo HPLC de Apo25, (C) trazo HPLC de Apo26, (D) trazo HPLC de Apo28. Longitudes de onda individuales utilizadas incluyeron 214, 254, 280, y 326 nm. Descripción Detallada del Invento Tal como se mencionó anteriormente, la presente invención se refiere a métodos para la producción de apolipoproteína en plantas transgénicas. Los inventores de la presente invención han descubierto de manera sorprendente que la producción de apolipoproteínas en plantas no es únicamente factible, sino que también ofrece ventajas substanciales con respecto a las metodologías convencionales. Los materiales sin procesar para la producción a base de plantas son más estables, particularmente conforme la proteína se produce en las semillas de plantas, y además, están libres de endotoxinas bacterianas. Por lo tanto, la presente invención proporciona un material fuente seguro para la fabricación de apolipoproteínas. También se descubierto que la expresión recombinante de apolipoproteína puede producir la apolipoproteína nativa en una forma más o menos pura en niveles que permiten la fabricación de apolipoproteínas a escala comercial. Por consiguiente, de acuerdo con la presente invención se proporciona un método para la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica apolipoproteínas en plantas, en donde el método comprende: (a) proporcionar una construcción de ácido nucleico quimérica comprendida en la dirección 5' a 3' de la transcripción en la forma de componentes enlazados en forma operable: (i) una secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en células de plantas; y (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína. (b) introducir la construcción de ácido nucleico quimérica en una célula de planta; y (c) crecer la célula de planta en una planta madura que expresa apolipoproteína.

Los inventores de la presente invención han descubierto que los altos niveles de expresión de apolipoproteína pueden lograrse expresando la proteína recombinante en semillas de plantas. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para expresar apolipoproteína en semillas de plantas, en donde el método comprende: (a) proporcionar una construcción de ácido nucleico quimérica comprendida en la dirección 5' a 3' de la transcripción, en la forma de componentes enlazados en forma operable: (i) una secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en células de semillas de plantas; y (i i) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína. (b) introducir la construcción de ácido nucleico quimérica en una célula de planta; y (c) crecer la célula de planta en una planta madura con la capacidad de fijar semilla, en donde la semilla expresa la apolipoproteína. Términos y Definiciones A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente invención deben tener el mismo significado que los expertos en la técnica, a la cual pertenece la presente invención, comprenden normalmente. Cuando sea permitido, todas las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones, incluyendo las secuencias de ácido nucleico y polipéptido de GenBank, SwissPro, y otras bases de datos referidas en la presente invención, están incorporadas en su totalidad como referencia a la presente invención. El término "secuencia de ácido nucleico" tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una secuencia de monómeros de nucleósido o nucleótido que consisten en ligaduras de bases, azúcares e interazúcares (esqueletos) que ocurren naturalmente. El término también incluye secuencias modificadas o substituidas que comprenden monómeros que no ocurren naturalmente o partes de los mismos. Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención, pueden ser secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN) o secuencias de ácido ribonucleico (ARN) y pueden incluir bases que ocurren naturalmente que incluyen adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo. Las secuencias también pueden contener bases modificadas. Los ejemplos de dichas bases modificadas incluyen adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo aza y deaza; y xantina e hipoxantina. Los términos "secuencia de ácido nucleico que codifica apolipoprotéina" y "secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína", los cuales se pueden utilizar de manera intercambiable en la presente invención, se refieren a cualesquiera y todas las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de apolipoproteína, incluyendo cualquier polipéptido de apolipoproteína de mamífero y cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique pro-apolipoproteína y pre-pro-apolipoproteína. Tal como se utiliza en la presente invención, "el término pro-apoliproproteína" se refiere a un polipéptido de apolipoproteína que incluye un polipéptido que está disasociado en forma pos-traducción. En la apolipoproteína humana nativa el pro-péptido es una cadena de polipéptido de residuo de 6 aminoácidos. El término "pre-pro-apolipoproteína" se refiere a una molécula de pro-apolipoproteína que comprende además una secuencia de señal de terminal-N que facilita el transporte intracelular de la cadena de polipéptido. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de apolipoproteína incluyen además cualesquiera y todas las secuencias de ácido nucleico que (i) codifican los polipéptidos que son substancialmente idénticos a las secuencias de polipéptidos de apolipoproteína aquí establecidas; o (ii) hibridan a cualesquiera secuencias de ácido nucleico de apolipoproteína establecidas en la presente invención bajo condiciones de hibridación al menos moderadamente estrictas o que pueden hibridar al mismo bajo condiciones al menos moderadamente estrictas, aunque para el uso de codones sinónimos. Por el término "substancialmente idéntico" se entiende que las dos secuencias de polipéptido son preferentemente al menos el 70% idénticas, y más preferentemente al menos el 85% idénticas y lo más preferentemente al menos el 95% idénticas, por ejemplo, 96%, 97%, 98% ó 99% idénticas. Con el objeto de determinar el porcentaje de identidad entre las dos secuencias de polipéptido, las secuencias de aminoácido de las dos secuencias se alinean, utilizando por ejemplo, el método de alineación de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol., 1970, 48: 443), tal como lo indica la revisión de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482), de modo que se obtenga la correspondencia del orden más alto entre las dos secuencias y el número de aminoácidos idénticos se determina entre las dos secuencias. Los métodos para calcular el porcentaje de identidad entre las dos secuencias de aminoácidos generalmente son reconocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, los descritos por Carrillo y Lipton (SIAM J. Applied Math., 1988, 48: 1073), y los descritos en la publicación de Computational Molecular Biology, Lesk, ed. Oxford University Press, Nueva York, 1988, Biocomputing: Informatics and Genomics Projects. Generalmente, se emplearán programas de computadora para dichos cálculos. Los programas de computadora que pueden ser utilizados para este aspecto incluyen, pero no se limitan a, GCG (Devereux y asociados, Nucleic Acids Res., 1984, 12: 387) BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul y asociados, J. Molec. Biol., 1990: 215: 403). Un método particularmente preferido para determinar el porcentaje de identidad entre los dos polipéptidos comprende el algoritmo Clustal W (Thompson, JD, Higgines, DG and Gibson TJ, 1994, Nucleic Acid Res 22(22): 4673-4680) junto con la matriz de clasificación BLOSUM 62 (Henikoff S & Henikoff, JG, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89: 10915-10919), utilizando una penalidad por abertura de brecha de 10 y una penalidad por extensión de brecha de 0.1, de modo que se obtiene las correspondencia del orden más alto entre dos secuencias en donde al menos el 50% de la longitud total de una de las dos secuencias, está involucrado en la alineación. Por el término "condiciones de hibridación al menos moderadamente estrictas", se entiende que las condiciones se seleccionan para promover la hibridación selectiva entre dos moléculas de ácido nucleico complementarias en solución. Puede ocurrir la hibridación en toda o en una parte de la molécula de secuencia de ácido nucleico. La parte de hibridación normalmente tiene al menos 15 (por ejemplo 20, 25, 30, 40 ó 50) nucleótidos de longitud. Los expertos en la técnica reconocerán que la estabilidad del dúplex de ácido nucleico, o híbridos, se determina mediante Tm, los reguladores con contenido de sodio son una función de la concentración de iones de sodio y temperatura (Tm = 81.5°C - 16.6 (Log10 [Na + ]) + 0.41 (%(G + C) - 600/1), o una ecuación similar). Por consiguiente, los parámetros en las condiciones de lavado que determinan la estabilidad de híbrido son concentración de iones de sodio y temperatura. Con el objeto de identificar moléculas que son similares, pero no idénticas, para una molécula de ácido nucleico conocida, se puede asumir que una falta de correspondencia del 1% dará como resultado una disminución de aproximadamente 1°C en Tm, por ejemplo, si se consideran las moléculas de ácido nucleico, teniendo una identidad >95%, la temperatura de lavado final se reducirá en aproximadamente 5°C. Con base en estás consideraciones, los expertos en la técnica tendrán la capacidad de seleccionar fácilmente las condiciones de hibridación adecuadas. En modalidades preferidas, se seleccionan condiciones de hibridación estrictas. A manera de ejemplo se pueden emplear las siguientes condiciones para lograr la hibridación estricta: hibridación en 5 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC)/5 por solución de Denhardt/1.0% SDS en Tm (con base en la ecuación anterior) -5°C, seguido de un lavado de 0.2 x SSC/0.1% SDS a 60°C. Las condiciones de hibridación moderadamente estrictas incluyen un paso de lavado en 3 x SSC a 42°C. Sin embargo quedará entendido que se pueden lograr rigurosidades equivalentes utilizando reguladores, sales y temperaturas alternativas. La guía adicional con respecto a las condiciones de hibridación se puede encontrar en: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1. - 6.3.6 y en: Sambrook y asociados., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol. 3. Tal como se utiliza en la presente invención, los términos "apolipoproteína" y "polipéptido de apolipoproteína" se refiere a cualesquiera y todas las secuencias de polipéptido de una apolipoproteína que incluyen todos los polipéptidos de apolipoproteína de mamífero y un polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácido la cual es (i) substancialmente idéntica a las secuencias de aminoácido que constituyen cualesquiera polipéptidos de apolipoproteína aquí establecidos o (ii) codificados por una secuencia de ácido nucleico con la capacidad de hibridar bajo condiciones al menos moderadamente estrictas para cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica a apolipoproteína establecida en la presente invención, o con la capacidad de hibridar bajo condiciones al menos moderadamente estrictas para cualquier secuencia de aminoácido que codifica la apolipoproteína aquí establecida, pero que para el uso de codones sinónimos. Los términos apolipoproteína y polipéptido de apolipoproteíná incluyen polipéptidos de pro- apolipoproteína. El polipéptido de apolipoproteína es preferentemente de origen humano, de porcino o de bovino. En modalidades preferidas, estas apolipoproteínas incluyen, pero no se limitan a, Apolipoproteína A-I (Apo AI), Apolipoproteína A-IV (Apo AIV), Apolipoproteína A-V (ApoAV) y Apolipoproteína E (Apo E). El término "quimérico" tal como se utiliza dentro del contexto de las secuencias de ácido nucleico, se refiere al menos a dos secuencias de aminoácido enlazadas las cuales no están enlazadas en forma natural. Las secuencias de ácido nucleico quiméricas incluyen secuencias de ácido nucleico enlazadas de diferentes orígenes naturales. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que constituye un promotor de planta enlazado a una secuencia de ácido nucleico que codifica a apolipoproteína humana se considera como quimérica. Las secuencias de ácido nucleico quiméricas también pueden comprender secuencias I de ácido nucleico del mismo origen natural, siempre que no estén enlazadas en forma natural. Por ejemplo, se puede enlazar una secuencia de ácido nucleico que constituye un promotor obtenido de un tipo de célula en particular, a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido obtenido del mismo tipo de célula, pero normalmente no enlazada a la secuencia de ácido nucleico que constituye el promotor. Las secuencias de ácido nucleico quiméricas también incluyen secuencias de ácido nucleico que comprenden cualquier secuencia de ácido nucleico que ocurre naturalmente enlazada a cualquier secuencia de ácido nucleico que no ocurre naturalmente. Preparación de vectores de expresión recombinante que comprenden secuencias de ácido nucleico quimérico que codifican la apolipoproteína y una secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en una célula de planta Las secuencias de ácido nucleico que codifican la apolipoproteína que puede utilizarse de acuerdo con los métodos y composiciones aquí proporcionados, pueden ser cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique un polipéptido de apolipoproteína, incluyendo cualquier proapolipoproteína y preproapolipoproteína. Existe un número de diferentes apolipoproteínas que se encuentran en un plasma de sangre humana, y pueden actuar como señales, que originan que las lipoproteínas actúan en ciertos tejidos y que activan las enzimas que actúan en dichas lipoproteínas. (Lehninger, A. y asociados, Principies of Biochemistry, segunda edición, Nueva York, Worth Publishers, 1993). Estas proteínas incluyen pero no se limitan a alelos e isoformas de apolipoproteína A-l (Apo Al) (ver por ejemplo, la publicación de Sharpe CR y asociados, Nucleic Acids Res. 12 (9), 3917-3932 (1984)), Apo II ((ver por ejemplo, la publicación de Sharpe CR y asociados, Nucleic Acids Res. 12 (9), 3917-3932 (1984)), Apo AIV (ver por ejemplo la publicación de Elshourbagy NA y asociados, J. Biol. Chem. 261 (5), 1998-2002 (1986)), Apo AV (ver por ejemplo, la publicación de Hubacek y asociados, Physiol. Res. 2004. 53: 225-228), Apo B-100 (ver por ejemplo, la publicación de Law SW y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 83 (21), 8142-8146 (1986)), Apo B-48 (ver por ejemplo, la publicación de Powell LM y asociados, Cell 50 (6), 831-840 (1987)), Apo C-ll (ver por ejemplo, la publicación de Sharpe CR y asociados, Nucleic Acids Res. 12 (9), 3917-3932 (1984)), Apo C-lll (ver por ejemplo, la publicación de Sharpe CR y asociados, Nucleic Acids Res. 12 (9), 3917-3932 (1984)), Apo C-IV (ver por ejemplo, la publicación de Alian CM y asociados, Genomics 28 (2), 291-300 (1995)), Apo D (Drayna D y asociados, J. Biol. Chem. 261 (35), 16535-16539 (1986)), Apo E (ver por ejemplo, la publicación de Brewslow JL y asociados, J. Biol. Chem. 257 (24), 14639-14641 (1982)), Apo F (ver por ejemplo, la publicación de Day JR y asociados, Biochem. Biophys. Res. Commun. 203 (2), 1146-1151 (1994)), Apo H (ver por ejemplo, la publicación de Mehdi, H., y asociados, Gene 108 (2), 293-298 (1991) y Apo L (ver por ejemplo, la publicación de Duchateau, P.N., y asociados. J. Biol. Chem. 272 (41), 25576-25582 (1997)). Las secuencias de ácido nucleico de ejemplo que codifican la apolipoproteína son bien conocidas en la técnica y generalmente están fácilmente disponibles a partir de una diversa variedad de fuentes de mamíferos incluyendo humano (ver anteriormente), porcino (ver por ejemplo, la publicación de Trieu VN y asociados, Gene 134 (2), 267-270 (1993)), bovino (ver por ejemplo, la publicación de Yang, Y.W., y asociados, J. Mol. Evol. 32 (6), 469-475 (1991)), ovino (ver por ejemplo, la publicación de Robertson, J.A., y asociados, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 67 (4), 285-292 (1998)) y similares. Las secuencias que codifican la apolipoproteína humana que se pueden utilizar, incluyen las que codifican cadenas de polipéptidos establecidas como SEQ ID NO: 1, 7 y 8. Las secuencias que codifican apolipoproteína no humana adicional que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención, se establecen en la SEQ ID NO: 9-55 y 241-251. Las secuencias de ácido nucleico correspondientes respectivas que codifican las cadenas de polipéptidos de apolipoproteína pueden ser fácilmente identificadas a través de los números de identificación de Acceso proporcionados en la Tabla 1. Utilizando estas secuencias de ácido nucleico, la apolipoproteína novedosa adicional codifica las secuencias de ácido nucleico o puede ser fácilmente identificada utilizando técnicas conocidas para los expertos en el arte. Por ejemplo, las bibliotecas, tales como las bibliotecas de expresión, bibliotecas de cADN genómicas, pueden ser clasificadas, y las bases de datos que contienen información de la secuencia de los proyectos de secuenciación pueden ser investigadas para secuencias similares. Los métodos alternativos para aislar secuencias de ácido nucleico adicionales que codifican polipéptidos de apolipoproteína pueden ser utilizadas, y se pueden descubrir secuencias novedosas y utilizarse de acuerdo con la presente invención. En modalidades preferidas las secuencias de ácido nucleico que codifican la apolipoproteína son apolipoproteína de humano, porcino y bovino. Se conocen numerosos análogos de apolipoproteína de la técnica anterior (ver por ejemplo, la publicación de Cheung MC y asociados., Biochim Biophys Acta. 1988, Mayo 2; 960 (1): 73-82 y Strobl W y asociados, Pediatr Res. 1988 Agosto 24 (2): 222-8) y pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención. Los análogos que pueden ser utilizados en la presente invención incluyen moléculas de apolipoproteína humana en donde una variedad de mutaciones y modificaciones naturales y sintéticas que han sido descubiertas incluyen, pero no se limitan a, mutaciones de punto, mutaciones de eliminación, mutaciones de cambio de estructura y modificaciones químicas. De acuerdo con la presente invención, en una modalidad preferida, se utiliza la variante natural conocida como Apo Al-M. Los ejemplos de mutaciones y modificaciones que pueden ser utilizadas de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, las estables ideas en la tabla 2. En modalidades preferidas, la secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína que se utiliza es pro -apolipoproteína. Las alteraciones a la secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína para preparar análogos de apolipoproteína, se pueden realizar utilizando una variedad de técnicas de modificación de ácido nucleico conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis dirigida, mutagénesis aleatoria, la adición de solventes orgánicos, desordenamiento genético o una combinación de estas y otras técnicas conocidas para los expertos en el arte (Shraishi y asociados, 1988, Arch. Biochem. Biophys, 358: 104-115; Galkin y asociados, 1997, Protein Eng. 10: 687-690; Carugo y asociados, 1997, Proteins 28: 10-28; Hurley y asociados, 1996, Biochem, 35: 5670-5678; Holmberg y asociados, 1999, Protein Eng. 12: 851-856).

De acuerdo con la presente invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína está enlazada a una secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión del polipéptido de apolipoproteína en una célula de planta. Por consiguiente, la presente invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica a apolipoproteína enlazada a un promotor con la capacidad de controlar la expresión en una célula de planta. Las secuencias de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en células de planta que se pueden utilizar en la presente invención, incluyen cualquier promotor derivado de plantas con la capacidad de controlar la expresión de polipéptidos en las plantas. Generalmente, los promotores obtenidos de las especies de plantas dicotiledóneas serán utilizados cuando se seleccione una planta dicotiledónea de acuerdo con la presente invención, en tanto que se utilizará un promotor de planta monocotiledónea cuando se selecciona una especie de planta monocotiledónea. En una modalidad, se utiliza un promotor que da como resultado la expresión del polipéptido de apolipoproteína en toda la planta. Los promotores constitutivos que pueden ser utilizados incluyen, por ejemplo, el promotor de virus de mosaico de coliflor 35S (CaMV) (Rothstein y asociados, 1987, Gene 53: 153-161), el promotor de actina de arroz (McEIroy y asociados, 1990, Plant Cell 2: 163-171; Patente Norteamericana No: 6,429,357), un promotor de ubiquitina, tal como promotor de ubiquitina de maíz (Patentes Norteamericanas Nos. 5,879,903; 5,273,894), y un promotor de ubiquitina de perejil (Kawalleck, P. y asociados. 1993, Plant Mol. Biol. 21: 673-684). En modalidades particularmente preferidas de la presente invención, se produce la apolipoproteína en semillas de plantas. La producción en semillas de plantas ofrece flexibilidad en almacenamiento y envío de apolipoproteína en la forma de un material sin procesar, ya que la apolipoproteína retiene su actividad al momento de la extracción de la semilla almacenada. Además, la cantidad de biomasa que se necesita someter a extracción, se limita debido al contenido de agua relativamente bajo que se encuentra en las semillas de las plantas. Por consiguiente, en una modalidad preferida de la presente invención, la célula de la planta es una célula de semilla y las plantas se crecen en una planta madura con la capacidad de fijar la semilla, en donde la semilla expresa la apolipoproteína. En una modalidad preferida adicional, la secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en una célula de planta, es un promotor preferido de semilla, tal como el promotor de faseolina. En dicha modalidad, se utiliza un promotor que da como resultado la expresión preferencial del polipéptido de apolipoproteína en el tejido de semilla. Los "promotores preferidos de las semillas" en este aspecto, son promotores que controlan la expresión de una proteína recombinante (por ejemplo, apolipoproteína) de modo que al menos el 80% de la cantidad total de proteína recombinante presente en la planta madura, se encuentra en la semilla. Más preferentemente, al menos el 90% de la cantidad total de proteína recombinante que se encuentra en la planta madura, está presente en la semilla. Más preferentemente al menos el 95% de la cantidad total de proteína recombinante presente en la planta madura, se encuentra en la semilla. Los promotores preferidos de la semilla que pueden ser utilizados en este aspecto incluyen, por ejemplo, el promotor de faseolina de fríjol (Sengupta-Gopalan y asociados, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82: 3320-3324); el promotor de oleosina 18 kDa de Arabidopsis (Patente Norteamericana No. 5,792,922) o el promotor de oleosina de lino (Publicación WO 01/16340); el promotor de proteína de almacenamiento de semilla tipo leguminosa de lino (linina) (Publicación WO 01/16340); el promotor de proteína de almacenamiento de lino 2S (Publicación WO 01/16340); un promotor preferido de endosperma tal como promotor Amy32b (Rogers and Milliman, J. Biol. Chem., 1984, 259: 12234-12240), el promotor Amy6-4 (Kursheed and Rogers, J. Biol. Chem., 1988, 263: 18953-18960) o el promotor Aleurain (Whittier y asociados, 1987, Nucleic Acids Res., 15: 2515-2535) o el promotor de arcelina de fríjol (Jaeger GD, y asociados, 2002, Nat. Biotechnol..Dec; 20: 1265-8). Constantemente se descubren nuevos promotores útiles en diversas plantas. Los ejemplos numerosos de promotores de plantas se pueden encontrar en la publicación de Ohamuro y asociados (Biochem. of PInts., 1989, 15: 1-82). En modalidades de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico quimérica comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de estabilización enlazado en la estructura de lectura a la secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína. El polipéptido de estabilización se utiliza para facilitar el doblez de la proteína y/o aumentar la acumulación estable de la apolipoproteína en las células de plantas. Además, se puede utilizar el polipéptido de estabilización para dirigir la apolipoproteína a un lugar deseado dentro de la célula de la planta y/o facilitar la purificación de la apolipoproteína. Preferentemente el polipéptido de estabilización es un polipéptido que en la ausencia de la apolipoproteína puede ser expresado fácilmente y acumularse en forma estable en las células de plantas transgénicas. El polipéptido de estabilización puede ser un polipéptido específico de una planta o no específico de una planta. Los polipéptidos de estabilización específicos de plantas que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención, incluyen proteínas de cuerpo aceitosos (ver más adelante) y tioredoxinas, por ejemplo, la tioredoxina mostrada en la SEQ ID NO: 56. Los polipéptidos de estabilización no específicos de las plantas que se pueden utilizar de acuerdo a la presente invención incluyen, proteína fluorescente verde (GFP) (Davis and Viestra, 1996, Weeds World 3(2): 43-48) (SEQ ID NO: 57), y los anticuerpos de cadena simple o fragmentos de los mismos. Preferentemente los polipéptidos de estabilización no específicos de planta son optimizados por codón para expresión óptima en plantas. Los anticuerpos de cadena simple o anticuerpos que son utilizados preferentemente en la presente invención, incluyen anticuerpos de cadena simple o fragmentos de los mismos que facilitan la purificación de la apolipoproteína. De acuerdo con la presente invención, por ejemplo, un anticuerpo de cadena simple o fragmento del mismo que tiene la capacidad de asociación específica con un cuerpo aceitoso o una proteína de cuerpo aceitoso puede ser utilizado, permitiendo de esta forma la purificación conjunta de la apolipoproteína con la fracción de cuerpo aceitoso, que se puede obtener fácilmente de las semillas de plantas. Preferentemente, el anticuerpo de cadena simple tiene la capacidad de asociarse con una proteína de cuerpo aceitoso que se puede obtener de la semilla, en donde la apolipoproteína se expresa, por ejemplo, en una modalidad de la presente invención en donde se utilizan células de planta Arabidopsis, se selecciona un anticuerpo de cadena simple o fragmento del mismo que tiene la capacidad de asociarse con una proteína de cuerpo aceitoso Arabidopsis. En una modalidad preferida adicional, el anticuerpo de cadena simple es un anticuerpo FV de cadena simple con la-capacidad de asociarse en forma específica con la oleosina 18 kDa de Arabidopsis thaliana (D9scFv). En la modalidad más preferida, el anticuerpo de cadena simple se muestra en la SEQ ID NO: 240. El término "fragmento de anticuerpo de cadena simple" (scFv) o "fragmento de anticuerpo", tal como se utiliza en la presente invención, significa un polipéptido que contiene un dominio ligero variable (V ) enlazado a un dominio pesado variable (VH) a través de un enlazador de péptido (L), representado por VL-L-VH. El orden de los dominios VL y VH puede ser obtenido para obtener polipéptidos representados como VH-L-V . El término "dominio" es un segmento de proteína que asume una función independiente, tal como un enlace de antígenos o reconocimiento de antígenos. Los fragmentos de anticuerpo de cadena simple para utilizarse en la presente invención, pueden derivarse de los dominios variables de cadena ligera y/o pesada de cualquier anticuerpo.

Preferentemente, los dominios variables de cadena ligera y pesada son específicamente para el mismo antígeno. Más preferentemente el antígeno es una proteína de cuerpo aceitoso. Los fragmentos de anticuerpo individuales que se unen para formar un anticuerpo de cadena simple multivalente, pueden ser dirigidos contra el mismo antígeno o pueden ser dirigidos contra diferentes antígenos. Las metodologías que crean los anticuerpos de cadena simple son bien conocidas en el arte. Por ejemplo, los anticuerpos de cadena simple pueden ser creados clasificando bibliotecas de despliegue de fagos de cadena simple (scFV). Las metodologías para crear anticuerpos de cadena simple a partir de bibliotecas de despliegue de fagos, son bien conocidas en la técnica. McCarrerty y asociados. (Nature 348: 552-554) demostró el uso del sistema de despliegue de fagos en donde los fragmentos de anticuerpos fueron expresados como una proteína de fusión con un vector de fago fd para permitir la expresión de anticuerpos de cadena simple en la superficie del fago. La producción de una biblioteca de despliegue de fago de anticuerpo de cadena simple puede lograrse utilizando por ejemplo, el Sistema de Anticuerpo de Fago Recombinante desarrollado por Amersham Biosciences y Cambridge Antibody Technology. Un protocolo más detallado está disponible en Amersham Biosciences el cual se vende en 3 partes, incluyendo una molécula scFV de ratón, y un módulo de expresión y un módulo de detección. En síntesis, el protocolo para la producción de anticuerpos de cadena simple es como se indica a continuación. Se puede obtener el ARN mensajero de cualquier hibridoma de ratón o células de bazo de ratón de un ratón que se haya inmunizado con el antígeno de interés. El hibridoma de ratón representa la fuente más abundante para el gen de anticuerpos que será clonado, ya que expresa los genes de cadena pesada y ligera para un anticuerpo simple, pero los anticuerpos no pueden ser clonados utilizando células de bazo de un ratón inmunizado. El mARN se convierte a cADN utilizando transcriptasa inversa y cebadores de hexameros aleatorios. El uso de hexameros aleatorios dará como resultado moléculas de cADN que tienen una longitud suficiente para clonar las regiones variables de las moléculas de cadena pesada y ligera. Una vez que se crean las moléculas de cADN, las regiones PCR principales se llevan a cabo para amplificar por separado las regiones variables pesadas y ligeras. Los cebadores se diseñan para amplificar la región variable de cadena pesada y ligera hibridando a extremos opuestos de la cadena. Una vez que las cadenas variables se amplifican, las reacciones PCR se someten a electroforesis de gel de agarosa y gel purificado para eliminar los cebadores y cualesquiera productos PCR extraños. Una vez que las regiones variables de cadena ligera y pesada han sido purificadas se ensamblan en un solo gen utilizando un enlazador. La región del enlazador está diseñada para asegurar que se mantenga la estructura de lectura correcta entre la cadena pesada y ligera. Por ejemplo, las cadenas pesadas variables (VH) y ligeras variables (V ) pueden estar enlazadas utilizando el enlazador (Gly4Ser)3 para obtener un fragmento de anticuerpo de cadena simple (scFv) o desde aproximadamente 750 pares base de longitud. Una vez que se ensamblan las cadenas pesadas y ligeras con el enlazador, se lleva a cabo una reacción PCR secundaria para amplificar los fragmentos de ADN scFV ensamblados. Los cebadores deben ser diseñados para introducir sitios de restricción para permitir la clonación en vectores de expresión de fagemido. Por ejemplo, los sitios Sfi I y Not I pueden ser agregados al extremo 5' y 3' de estos genes scFv para clonarse en el vector pCANTAB 5 E (Amersham Biosciences). Una vez que se completa el PCR, los fragmentos de ADN deben ser purificados para eliminar cebadores no incorporados y dNTPs. Esto se puede lograr utilizando purificación de columna con giros. Una vez que el fragmento de ADN ha sido purificado y cuantificado, los fragmentos son digeridos con las enzimas de restricción adecuadas para permitir la clonación en el vector de expresión adecuado. Los fragmentos de ADN se ligan subsecuentemente en un vector de expresión, por ejemplo, pCANTAB 5E (Amersham Biosciences) y se introducen en células £. coli competentes. Las células deben crecerse en un medio de selección adecuado para asegurar que crezcan únicamente las células que contienen el vector de expresión (por ejemplo, utilizando una fuente de carbón específica y selección de antibiótico). Una vez que se crece el E. coli, las colonias que contienen fagemidos se infectan con fago auxiliar M13 (por ejemplo, KO7 - Amersham Biosciences) para producir fago recombinante que despliega los fragmentos scFv. El fago M13 iniciará la replica de fago y se producirán partículas de fago completas y serán liberadas de las células, expresando especies scFv en su superficie. Los fagos que despliegan los anticuerpos scFv correctos, son identificados mediante lavado, utilizando el antígeno específico. Para eliminar el fago no específico, se puede transferir el cultivo de fago recombinante a un soporte cubierto con antígeno (por ejemplo, un frasco o tubo), y lavarse. Únicamente los fagos que despliegan scFv correctos serán enlazados al soporte. Una cepa susceptible de E. coli es infectada subsecuentemente o enlazado al soporte recubierto con antígenos. El fago puede ser enriquecido, rescatándolo con el fago auxiliar y lavándolo contra el antígeno varias veces o puede ser plaqueado directamente en un medio sólido sin enriquecimiento adicional. Las células E. coli que han sido infectadas con el fago seleccionado contra el antígeno adecuado, son plaqueadas y se recolectan colonias individuales. Los fagos, de las colonias individuales posteriormente son ensayados utilizando por ejemplo, el ensayo ELISA (ensayo inmunoabsorbente enlazado por enzimas). Los anticuerpos de fagos que son positivos utilizando el ensayo ELISA posteriormente pueden ser utilizados para infectar células HB2151 E. coli para la producción de anticuerpos recombinantes solubles. Una vez que se seleccionan los clones adecuados, se puede identificar la secuencia de gen de anticuerpo scFv y utilizarse para la presente invención. La proteína de estabilización puede ser enlazada a la apoiipoproteína a través del enlazador, la cual puede ser disociada para liberar la apolipoproteína en su forma nativa libre. Los enlazadores que pueden ser incluidos en este aspecto, incluyen secuencias de péptido reconocidas por el Factor Xa, proteasa IgA, o enterocinasa. En una modalidad particularmente preferida, el enlazador codifica una prosecuencia de quimosina que puede ser disociada con la quimosina madura tal como se establece en la Solicitud de Patente PCT WO 98/49326. En modalidades preferidas, la secuencia de ácido nucleico comprende además una "señal de dirección". La señal de dirección, tal como se utiliza en la presente invención, significa cualquier secuencia de aminoácidos con la capacidad de dirigir el polipéptido de apolipoproteína, cuando se expresa, a un lugar deseado dentro de la célula de la planta. Las señales de dirección adecuada que pueden ser utilizadas en la presente invención, incluyen las que tienen la capacidad de dirigir el polipéptido de apolipoproteína al retículo endoplásmico o una vesícula de almacenamiento derivada del retículo endoplásmico, tal como un cuerpo aceitoso y el apoplasto. Con el objeto de lograr la acumulación de la apolipoproteína en el ER o una vesícula de almacenamiento derivada de ER, el polipéptido que codifica el polipéptido que codifica la apolipoproteína se enlaza a una señal de dirección que origina que la apolipoproteína sea retenida en el ER o una vesícula de almacenamiento derivada de ER. En una modalidad preferida de la presente invención, la señal de dirección que tiene la capacidad de retener la apolipoproteína en el ER contiene un motivo de retención- ER con terminal-C. Los ejemplos de dichos motivos de retención-ER terminal-C incluyen secuencias KDEL, HDEL, DDEL, ADEL y SDEL. Otros ejemplos incluyen HDEF (Lehmann y asociados, 2001, Plant Physiol. 127(2): 436-439), o dos residuos de arginina cercanos al término-N localizado en las posiciones 2 y 3, 3 y 4 ó 4 y 5. (Resumen de la publicación Plant Biology 2001 Program, ASPB, Julio 2001, Providence, Rhode Island, EUA). Las secuencias de ácido nucleico que codifican el motivo de retención de terminal-C están enlazadas preferentemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína de tal forma que el polipéptido con la capacidad de retener la apolipoproteína en el ER, está enlazada al extremo de la terminal-C del polipéptido de apolipoproteína. En modalidades de la presente invención, en donde la apolipoproteína se retiene en el ER, la secuencia de ácido nucleico quimérica puede contener además una secuencia de ácido nucleico que dirige la secuencia de ácido nucleico al subsistema de endomembrana ("péptido de señal"). En modalidades de la presente invención, en donde el polipéptido de apolipoproteína se retiene en el ER utilizando una secuencia, tal como el poli péptido KDEL, HDEL o SDEL, es particularmente deseable incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal. Los péptidos de señal de ejemplo que pueden ser utilizados en la presente invención, incluyen la secuencia de señal de proteína relacionada con patogénesis de tabaco (PR-S) (SEQ:ID:NO:58) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8: 217-221), secuencias de señal de lecitina (Boehn y asociados., 2000, Transgenic Res, 9(6): 477-86), secuencia de señal de la glucoproteína rica en hidroxiprolina de Phaseolus vulgaris (Yan y asociados, 1997, Plant Phyiol. 115(3): 915-24 y Corbin y asociados, 1987, Mol Cell Biol 7(12): 4337-44), secuencia de señal de patatina de papa (Iturriaga, G y asociados, 1989, Plant Cell 1: 381-390 y Bevan y asociados, 1986, Nuc. Acids Res. 41: 4625-4638) y la secuencia de señal de amilasa alfa de cebada (Rasmussen y Johansson, 1992, Plant Mol. Biol. 18(2): 423-7). El Ejemplo No. 3 de la presente invención, muestra la acumulación de la apolipoproteína en el ER. En una modalidad preferida adicional, el polipéptido de apolipoproteína está enlazado a un polipéptido que tiene la capacidad de retener el polipéptido de apolipoproteína en la vesícula de almacenamiento derivada de ER. En una modalidad preferida, la vesícula de almacenamiento derivada de ER es un cuerpo aceitoso y la apolipoproteína está enlazada a una proteína de cuerpo aceitoso. Las proteínas de cuerpo aceitoso que pueden utilizarse en este aspecto incluyen cualquier proteína que se asocie naturalmente con un cuerpo aceitoso (ver SEQ ID Nos: 59-137 en la Tabla 3). Las secuencias de ácido nucleico correspondientes respectivas que codifican las cadenas de polipéptidos de proteína del cuerpo aceitoso pueden ser fácilmente identificadas a través de los números de identificación de Acceso proporcionados en la Tabla 3.

Utilizando estas secuencias de ácido nucleico, las proteínas de cuerpos aceitosos novedosos adicionales que codifican las secuencias de ácido nucleico, pueden ser fácilmente identificadas utilizando técnicas conocidas por los expertos en el arte. Por ejemplo, bibliotecas, tales como bibliotecas de expresión, bibliotecas de cADN genómicas, pueden ser clasificadas y se pueden investigar para secuencias similares las bases de datos que contienen información de la secuencia de los proyectos de secuenciación. Los métodos alternativos para aislar secuencias de ácido nucleico adicionales que codifican polipéptidos de proteína de cuerpos aceitosos pueden ser utilizadas, y se pueden descubrir secuencias novedosas y utilizarse de acuerdo con la presente invención. Las proteínas de cuerpos aceitosos que son particularmente preferidas son oleosinas, por ejemplo, oleosina de maíz (Bowman-Vance y asociados., 1987, J. Biol. Chem. 262: 11275-11279; Qu y asociados, 1990, J, Biol. Chem. 265: 2238-2243 o Brassica (Lee y asociados, 1991, Plant Physiol. 96: 1395-1397), caleosinas, ver por ejemplo, el número de acceso Genbank AF067857) y esteroleosinas (Lin y asociados, 2002 Plant Physiol. 128(4): 1200-11). En una modalidad preferida adicional, la proteína de cuerpo aceitoso es una oleosina de planta y comparte similitud de secuencia con otras oleosinas de plantas tales como oleosina aislada de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 138) o Brassica napus (SEQ ID NO: 139). En otra modalidad adicional, la proteína del cuerpo aceitoso es una proteína que enlaza a caleosina o calcio de planta, hongos u otras fuentes y comparte homología de secuencia con caleosinas de plantas, tal como la caleosina aislada de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 140 y SEQ ID NO: 141). En otra modalidad, la proteína de cuerpo aceitoso es esteroleosina (SEQ ID NO: 142), una deshidrogenasa de enlace de esterol (Lin L-J y asociados, (2002) Plant Physiol 128: 1200-1211). Esta modalidad de la presente invención, se ejemplifica en el Ejemplo No. 3. Además, de acuerdo con la presente invención, la apolipoproteína también puede ser dirigida a un cuerpo aceitoso expresando la apolipoproteína de tal forma que la apolipoproteína no incluya una señal de dirección, sin embargo, siempre que la secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína comprenda un pro-péptido de apolipoproteína. Esta modalidad de la presente invención se ejemplifica en el Ejemplo No. 3. Los polipéptidos con la capacidad de retener la apolipoproteína en el ER o una vesícula de almacenamiento derivada de ER, normalmente no están disociados y la apolipoproteína se puede acumular en la forma de una proteína de fusión, lo cual es, por ejemplo, normalmente el caso cuando se utiliza una señal de retención KDEL para retener el polipéptido en el ER o cuando se utiliza una proteína del cuerpo aceitoso para retener el polipéptido en un cuerpo aceitoso. En otra modalidad de la presente invención, el polipéptido de apolipoproteína se expresa en tal forma que el polipéptido se acumula en el apoplasto. Con el objeto de lograr dicha acumulación, la secuencia de ácido nucleico quimérica comprende preferentemente una secuencia de dirección con la capacidad de dirigir el polipéptido de apolipoproteína al ER ("péptido de señal"). Los péptidos de señal de ejemplo que se pueden utilizar en la presente invención, incluyen la secuencia de señal de la proteína relacionada con patogénesis de tabaco (PR-S) antes mencionada (SEQ.ID:NO:58) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8: 217-221), la secuencia de señal de lecitina (Boehn y asociados., 2000, Transgenic Res, 9(6): 477-86), la secuencia de señal de la glucoproteína rica en hidroxiprolina de Phaseolus vulgaris (Yan y asociados, 1997, Plant Phyiol. 115(3): 915-24 y Corbin y asociados, 1987, Mol Cell Biol 7(12): 4337-44), la secuencia de señal de patatina de papa (Iturriaga, G y asociados, 1989, Plant Cell 1: 381-390 y Bevan y asociados, 1986, Nuc. Acids Res. 41: 4625-4638) y la secuencia de señal de amilasa alfa de perejil (Rasmussen y Johansson, 1992, Plant Mol. Biol. 18(2): 423-7). Las señales de dirección pueden ser disociadas in vivo del polipéptido de apolipoproteína, el cual por ejemplo, normalmente es el caso cuando una señal de dirección de apoplasto, tal como la secuencia de señal de proteína-S relacionada con patogénesis de tabaco (PR-S) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8: 217-221), se utiliza. Se pueden anticipar otros péptidos de señal utilizando el servidor SignalP World Wide Web (http://www.cbs.dtu.dk/services/SiqnalP/), el cual anticipa la presencia de la ubicación de los sitios de disociación de péptido de señal en secuencias de aminoácidos de diferentes organismos. En general, existe muy poca conservación de la secuencia de aminoácidos primaria, aunque las propiedades fisioquímicas generales se conservan hasta el mismo grado. La estructura genérica de los péptidos de señal tiene 3 regiones, la "región-n" de terminal de amino corta que contiene residuos cargados en forma positiva, la "región-h" hidrofóbica central que fluctúa en tamaño de 7 a 15 aminoácidos y la "región-c" de terminal carboxi que contiene aminoácidos polares y un sitio de disociación que es reconocido por las enzimas de peptidasa de señal enlazadas a la membrana (Nakai K., 2000, Advances in Protein Chem 54: 277-344). También se puede utilizar una señal de dirección que, de acuerdo con la presente invención, incluye la secuencia de señal de apolipoproteína nativa (18 aminoácidos de longitud en el caso de la secuencia humana). En modalidades preferidas de la presente invención, se utiliza una secuencia de dirección de apoplasto localizada en el término-N, tal como la secuencia PR-S de tabaco mencionada anteriormente, combinada con una secuencia de retención ER localizada en la terminal-C, tal como la secuencia KDEL. En una modalidad aún preferida, la secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína se expresa de tal forma que la apolipoproteína se acumula en el citoplasma. En dicha modalidad, la secuencia de ácido nucleico no comprende una señal de dirección. Preferentemente, en dicha modalidad la apolipoproteína comprende un polipéptido de estabilización adicional, tal como una proteína fluorescente verde (GFP). La secuencia de ácido nucleico quimérico también puede comprender extensiones de polipéptido de terminal-N y/o terminal-C. Dichas extensiones se pueden utilizar para estabilizar y/o ayudar al doblez de la cadena de polipéptido de apolipoproteína o pueden facilitar la dirección a un compartimento en la célula, por ejemplo, el cuerpo aceitoso. Las extensiones de polipéptido que pueden utilizarse en este aspecto, incluyen por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo de cadena simple, o una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína fluorescente verde (Davis y Viestra, 1996, Weeds World 3(2): 43-48), o combinaciones de dichos polipéptidos. Las extensiones de anticuerpo de cadena simple que son particularmente deseables incluyen las que permiten la asociación de la apolipoproteína con un cuerpo aceitoso con el objeto de facilitar la purificación de la apolipoproteína en asociación con la fracción del cuerpo de aceite. Dichas extensiones están incluidas preferentemente en las modalidades de la presente invención, en la cuales se expresa la apolipoproteína en la semilla de la planta y se dirige dentro de la célula de la semilla al ER o al apoplasto.

En una modalidad adicional, se puede localizar un sitio de disociación en la corriente ascendente del término-N o corriente descendente del término-C del péptido A-l Apolipoproteína, permitiendo que el polipéptido A-l Apolipoproteína sea disociado de la parte de fusión, obteniendo de esta forma A-l de Apolipoproteína aislado. Los ejemplos de dichos sitios de disociación se pueden encontrar en la Publicación WO 98/49326 (Método para la disociación de proteínas de fusión) y solicitudes relacionadas y en la publicación de La Vallie y asociados (1994), disociación enzimática y química de proteínas de fusión en Current Protocols in Molecular Biology pp 16.4.5-16.4.17, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York NY. En una modalidad preferida, el sitio de disociación es KLIP 8 (SEQ ID NO: 143) el cual se puede disociar mediante proteasas aspárticas que incluyen quimosina. En una modalidad preferida adicional, se agrega un residuo de metionina extra al término-N del polipéptido Al Apo o el polipéptido Al pro-Apo. La presente invención proporciona además métodos para la separación de proteínas heterólogas de los componentes de la célula huésped, dividiendo la fracción del cuerpo aceitoso y subsecuentemente liberando la proteína heteróloga a través de disociación específica de la proteína heteróloga - fusión de proteína de cuerpo aceitoso. Opcionalmente, se puede localizar un sitio de disociación en la corriente ascendente del término-N y en la corriente descendente del término-C del polipéptido heterólogo, permitiendo que el polipéptido de fusión sea disociado y separado mediante separación de fase en sus péptidos componentes. La secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína, puede ser alterada para mejorar los niveles de expresión, por ejemplo, utilizando la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el uso de codón preferido para un tipo de célula de planta en particular, el cual se selecciona para la expresión del polipéptido de apolipoproteína, o alternado los motivos conocidos para desestabilizar los mARN (ver por ejemplo: la Solicitud de Patente PCT 97/02352). La comparación del uso de codón de la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de apolipoproteína, con el uso de codón del tipo de célula de la planta, permitirán la identificación de codones que pueden ser cambiados. La construcción de genes sintéticos alterando el uso de codón, se describe por ejemplo, en la Solicitud de Patente PCT 93/07278. En una modalidad preferida, la secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína que se utiliza, se representa mediante SEQ. ID. NO. 1, SEQ. ID. NO. 3 ó SEQ. ID. NO. 5. Ciertos elementos genéticos con la capacidad de mejorar la expresión del polipéptido de apolipoproteína se pueden utilizar en la presente invención. Estos elementos incluyen las secuencias conductoras no traducidas de ciertos virus, tales como la secuencia conductora AMV (Jobling and Gehrke, 1987, Nature, 325: 622-625) y el intrón asociado con el promotor de ubiquitina de maíz (Patente Norteamericana No. 5,504,200). Generalmente la secuencia de ácido nucleico quimérica será preparada de modo que los elementos genéticos con la capacidad de aumentar la expresión, estén localizados en 5' para la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de apolipoproteína. De acuerdo con la presente invención, las secuencias de ácidos nucleicos quiméricos que comprenden un promotor con la capacidad de controlar la expresión en la planta enlazada a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína, pueden integrarse en un vector de expresión recombinante que asegura una buena expresión en una célula. Por consiguiente, la presente invención incluye un vector de expresión recombinante que comprende la dirección 5' a 3' de la transcripción en la forma de componentes enlazados en la forma operable: (i) una secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en células de planta; (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína; en donde el vector de expresión es adecuado para la expresión en una célula de planta. La frase "adecuado para la expresión en una célula de planta" significa que el vector de expresión recombinante comprende la secuencia de ácido nucleico quimérica de la presente invención enlazada a elementos genéticos requeridos para lograr la expresión en una célula de planta. Los elementos genéticos que pueden ser incluidos en el vector de expresión en este aspecto, incluyen una región de términos de transcripción, una o más secuencias de ácido nucleico que codifican genes marcadores, uno o más orígenes de replica y similares. En modalidades preferidas, el vector de expresión comprende además elementos genéticos requeridos para la integración del vector o una parte del mismo en el genoma nuclear de la célula de planta, por ejemplo, las secuencias de límite de izquierda y derecha de ADN-T que facilitan la integración en el genoma nuclear de la planta en modalidades de la presente invención, en donde las células de la planta se transforman utilizando Agrobacterium. En una modalidad preferida adicional, dicha célula de planta es una célula de semilla de planta. Tal como se mencionó anteriormente, el vector de expresión recombinante comprende generalmente un terminador de transcripción que además de servir como una señal para la terminación de transcripción, puede servir además como un elemento protector con la capacidad de extender la vida media del mARN (Guarneros y asociados, 1982, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 79: 238-242). El terminador de transcripción generalmente es de aproximadamente 200 nucleótidos hasta aproximadamente 1000 nucleótidos, y el vector de expresión se prepara de modo que el terminador de transcripción se localiza 3' de la secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína. Las secuencias de terminación que se pueden utilizar en la presente invención incluyen, por ejemplo, la región de determinación de nopalina (Bevan y asociados, 1983, Nucí. Acids. Res., 11: 369-385), el terminador de faseolina (van der Geest y asociados, 1994, Plant J. 6: 413-423), el terminador de arcelina (Jaeger GD, y asociados, 2002, Nat. Biotechnol. 20: 1265-8), el terminador para los genes de sintasa de octopina de Agrobacterium tumefaciens u otros elementos de función similar. Los terminadores de transcripción se pueden obtener tal como se describe en An (An, 1987, Methods in Enzym. 153: 292). De acuerdo con la presente invención, el vector de expresión puede contener además un gen marcador. Los genes marcadores que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención incluyen todos los genes que permiten la distinción de las células transformadas de las células no transformadas, incluyendo todos los genes marcadores seleccionables y clasificables. Un gen marcador puede ser un marcador de resistencia, tal como un marcador de resistencia de antibióticos contra, por ejemplo, canamicina (Patente Norteamericana No. 6,174,724), ampicilina, G418, bleomicina, higromicina que permite la selección de una particularidad a través de medios químicos o un marcador de tolerancia contra el agente químico, tal como mañosa de azúcar normalmente fitotóxica (Negrotto y asociados, 2000, Plant Cell Rep. 19: 798-803). Otros marcadores convenientes que pueden ser utilizados en la presente invención, incluyen marcadores con la capacidad de transportar resistencia con herbicidas tales como glifosfato (Patentes Norteamericanas Nos. 4,940,935; 5,188,642), fosfinitrocina (Patente Norteamericana No. 5,879,903), o ureas de sulfonilo (Patente Norteamericana No. 5,633,437). Los marcadores de resistencia, cuando se enlazan en proximidad cercana a la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de apolipoproteína, se puede utilizar para mantener la presión de selección en una población de células de planta o plantas que no han perdido la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de apolipoproteína. Los marcadores clasificables que pueden emplearse para clasificar los transformadores a través de inspección visual incluyen, ß-glucuronidasa (GUS) (Patentes Norteamericanas Nos. 5,268,463 y 5,599,670) y proteína fluorescente verde (GFP) (Niedz y asociados, 1995, Plant Cell Rep., 14: 403). Los vectores recombinantes adecuados para la introducción de secuencias de ácido nucleico en plantas incluyen vectores a base de Agrobacterium y Rhizobium, tales como plásmidos Ti y Ri, incluyendo por ejemplo, pBIN19 (Bevan, Nucí. Acid. Res., 1984, 22: 8711-8721), pGKB5 (Bouchez y asociados, 1993, C R Acad. Sci. Paris, Life Sciences, 316: 1188-1193), la serie de vectores binarios pCGN (McBride and Summerfelt, 1990, Plant Mol. Biol., 14: 269-276) y otros vectores binarios (por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,940,838).

Los vectores de expresión recombinante de la presente invención, pueden ser preparados de acuerdo con metodologías conocidas por los expertos en la técnica de biología molecular. Dicha preparación normalmente comprenderá especies bacterianas Escherichia coli como un huésped de clonación intermediario. La preparación de vectores E. coli, así como los vectores de transformación de plantas, pueden lograrse utilizando técnicas comúnmente conocidas tales como digestión por restricción, ligación, gelectroforesis, secuenciación de ADN, la Reacción de Cadena de Polimerasa (PCR) y otras metodologías. Está disponible una amplia variedad de vectores de clonación para llevar a cabo los pasos necesarios que se requieren para preparar un vector de expresión recombinante. Entre los vectores con un sistema de replica funcional en E. coli, se encuentran vectores tales como pBR322, la serie de vectores pUC, la serie de vectores M13mp, pBluescript, etc. Normalmente, estos vectores de clonación contienen un marcador que permite la selección de células transformadas. Las secuencias de ácido nucleico pueden ser introducidas en estos vectores, y los vectores pueden ser introducidos en E. coli crecido en un medio adecuado. Los vectores de expresión recombinante pueden ser fácilmente recuperados de las células al momento de recolectar y lisar las células. Además, la guía general con respecto a la preparación de los vectores recombinantes se puede encontrar, por ejemplo, en la publicación de Sambrook y asociados, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol. 3. Preparación de plantas que comprenden semillas con la capacidad de expresar a apolipoproteína De acuerdo con la presente invención, la secuencia de ácido nucleico quimérica se introduce en una célula de planta y las células se crecen en plantas maduras, en donde las plantas expresan el polipéptido de apolipoproteína. De acuerdo con la presente invención, se pueden seleccionar cualesquiera especies de plantas o células de plantas. Las células particulares utilizadas en la presente invención, incluyen células que se pueden obtener en Arabidopsis thaliana, no es de Brasil (Betholettia excelsa); fríjol de castor (Riccinus communis); coco (Cocus nucífera); cilantro (Coriandrum sativum); algodón (Gossypium spp.); cacahuate (Arachis Hypogaea); jojoba (Simmondsia chinensis); linaza/lino (Linum usitatissimum); maíz (Zea mays); mostaza (Brassica spp. y Sinapis alba); aceite de palma (Elaeis guiñeéis); olivo (Olea eurpaea); semilla de colza (Brassica spp.); arroz (Oryza sativa); cártamo (Carthamus tinctorius); fríjol soya (Glycine max); chayóte (Cucúrbita máxima); cebada (Hordeum vulgare); trigo (Traeticum aestivum); lenteja acuática (Lemnaceae sp.) y girasol (Helianthus annuus). De acuerdo con la presente invención, en una modalidad preferida se utilizan especies de plantas o células de plantas de plantas con semillas con aceite. Las plantas con semillas con aceite que se pueden utilizar en la presente invención incluyen maní (Arachis hypogaea); mostaza (Brassica spp. y Sinapis alba); semilla de colza (Brassica spp.); garbanzo (Cicer arietinum); fríjol soya (Glycine max); algodón (Gossypium hirsutum); girasol (Helianthus annuus); (Lentil Lens culinaris); linaza/lino (Linum usitatissimum); trébol blanco (Trifolium repens); olivo (Olea eurpaea); aceite de palma (Elaeis guiñeéis); cártamo (Carthamus tinctorius); y fríjol "narbon" (Vicia narbonesis). De acuerdo con la presente invención, en una modalidad particularmente preferida se utiliza Arabidopsis, lino o cártamo. Las metodologías para introducir los vectores de expresión recombinante en plantas en una célula de planta, también son referidos en la presente invención como "transformación", que son bien conocidos en la técnica y normalmente varían dependiendo de la célula de la planta que sea seleccionada. Las técnicas generales para introducir vectores de expresión recombinante en células incluyen, electroporación; técnicas transmitidas en forma química, por ejemplo, captación de ácido nucleico transmitido por CaCI2; bombardeo de partículas (biolísticas); el uso de secuencias de ácido nucleico naturalmente infecciosos, por ejemplo, secuencias de ácido nucleico derivadas en forma viral, o secuencias derivadas de Agrobacterium o Rhizobium, captación de ácido nucleico transmitida por polietilénglicol (PEG), microinyección y el uso de barbas de carburo de silicona. En modalidades preferidas, se selecciona una metodología de transformación la cual permite la integración de la secuencia de ácido nucleico quimérico en el genoma de la célula de la planta, y preferentemente el genoma nuclear de la célula de la planta. De acuerdo con la presente invención, esto se considera particularmente deseable ya que el uso de dicha metodología dará como resultado la transferencia de la secuencia de ácido nucleico quimérico a plantas de progenie al momento de la reproducción sexual. Los métodos de transformación que se pueden utilizar en este aspecto, incluyen biolísticas y métodos transmitidos por Agrobacterium. Las metodologías de transformación para especies de plantas dicotiledóneas son bien conocidas. Generalmente, se utiliza transformación transmitida por Agrobacterium debido a su alta eficiencia, así como la susceptibilidad general por muchos, sino es que todas las especies de plantas dicotiledóneas. La transformación mediante Agrobacterium, generalmente comprende la transferencia en un vector binario, tal como uno de los vectores binarios mencionados anteriormente, que comprenden la secuencia de ácido nucleico quimérico de la presente invención procedente de E. coli a una cepa Agrobacterium adecuada (por ejemplo, EHA101 y LBA4404), por ejemplo, mediante correspondencia tri-parental con una cepa E. coli que lleva el vector binario recombinante y una cepa E. coli que lleva un plásmido auxiliar con la capacidad de movilizar el vector binario hacia la cepa Agrobacterium objetivo, o mediante transformación de ADN de la cepa Agrobacterium (Hofgen y asociados, Nucí. Acids. Res., 1988, 16: 9877). Otras técnicas que pueden ser utilizadas para transformar las células de plantas dicotiledóneas incluyen, técnicas biolísticas (Sanford, 1988, Trends in Biotechn. 6: 299-302); electroporación (Fromm y asociados, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA., 82: 5824-5828); captación de ADN transmitida por PEG (Potrykus y asociados, 1985, Mol. Gen. Genetics, 199: 169-177); microinyección (Reich y asociados, Bio/Techn., 1986, 4: 1001-1004); y barbas de carburo de silicona (Kaeppler y asociados, 1990, Plant Cell Rep., 9: 415-418) o en transformación de planta utilizando por ejemplo, metodología de goteo de flor (Clough and Bent, Plant J., 16: 735-743).

Las especies de plantas monocotiledóneas pueden ser transformadas utilizando una variedad de metodologías incluyendo bombardeo de partículas (Christou y asociados, 1991, Biotechn. 9: 957-962; Weeks y asociados, Plant Physiol., 1993, 102: 1077-1084; Gordon-Kamm y asociados, Plant Cell, 1990, 2: 5603-618); captación de ADN transmitida por PEG (Patentes Europeas Nos. 0292 435; 0392 225) o transformación transmitida por Agrobacterium (Goto-Fumiyuki y asociados, 1999, Nature-Biotech. 17: 282-286). La metodología de transformación de plantas exacta, puede variar hasta cierto punto dependiendo de la especie de la planta y del tipo de célula de la planta (por ejemplo, tipos celulares derivados de semilleros, tal como hipocotilos y cotiledones o tejido embriónico) que se selecciona como el objetivo celular para la transformación. Tal como se mencionó anteriormente en una modalidad particularmente preferida, se utiliza cártamo. Una metodología para obtener transformadores de cártamo está disponible en la publicación de Baker y Dyer (Plant Cell Rep., 1996, 16: 106-110). Los protocolos de transformación específicas de plantas adicionales se pueden encontrar en las publicaciones: Biotechnology in Agriculture and Forestry 46: Transgenic Crops I (Y.P.S. Bajaj ed.), Springer-Verlag, Nueva York (1999), y Biotechnology in Agriculture and Forestry 47: Transgenic Crops II (Y.S.P. Bajaj ed.), Springer-Verlag, Nueva York (2001). Después de la transformación, las células de planta crecen y al momento del surgimiento de la diferenciación de tejido, tal como retoños y raíces, se regeneran las plantas maduras. Normalmente se regenera una pluralidad de plantas. Las metodologías para regenerar las plantas generalmente dependen del tipo de célula y especie de la planta, y serán conocidos para los expertos en la técnica. Se puede encontrar una guía adicional con respecto al cultivo de tejido de planta, por ejemplo: Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds., Kluwer Academic Publishers; y en: Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111), 1999, Hall Eds, Humana Press. En un aspecto, la presente invención proporciona un método para obtener semillas de plantas que comprenden apolipoproteína. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para obtener semillas de plantas que comprende apolipoproteína, y en donde el método comprende: (a) proporcionar una construcción de ácido nucleico quimérica que está comprendida en la dirección 5' a 3' de la trascripción, en la forma de componentes enlazados en forma operable: (i) una secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en células de semilla de plantas; y (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína; (b) introducir la construcción de ácido nucleico quimérica en una célula de planta; (c) crecer la célula de la planta en una planta madura; y (d) obtener la semilla de la planta en donde la semilla comprende apolipoproteína. La semillas se pueden utilizar para obtener una población de plantas de progenie, comprendiendo cada una, una pluralidad de semillas que expresan a apolipoproteína. En una modalidad preferida, al menos aproximadamente el 0.25% de la proteína de la semilla total es apolipoproteína. Más preferentemente, al menos aproximadamente el 0.5% de la proteína de la semilla total es apolipoproteína. Más preferentemente, al menos aproximadamente el 1.0% de la proteína de la semilla total es apolipoproteína. En modalidades preferidas, se obtiene una pluralidad de plantas transformadas, se crecen y clasifican con respecto a la presencia de la secuencia de ácido nucleico quimérica deseada, cuya presencia en transformadores putativos puede ser probada, por ejemplo, medio crecimiento en un medio selectivo, en donde se utilizan marcadores de resistencia a herbicidas, mediante aplicación directa del herbicida de la planta o mediante manchado Southern. Si se detecta la presencia de la secuencia de ácido nucleico quimérica, las plantas transformadas pueden ser seleccionadas para generar la progenie y finalmente plantas maduras que comprenden una pluralidad de semillas que comprenden la secuencia de ácido nucleico quimérica deseada. Dichas semillas se pueden utilizar para aislar apolipoproteína o pueden ser plantadas para generar dos o más generaciones subsecuentes. Generalmente será deseable plantar una pluralidad de semillas transgénicas para obtener una población de plantas transgénicas, comprendiendo cada una semillas que comprenden una secuencia de ácido nucleico quimérica, que codifica a apolipoproteína. Además, generalmente será deseable asegurar la homocigosidad en las plantas, para asegurar la herencia continua del polipéptido recombinante. Los métodos para seleccionar plantas homocigosas son bien conocidas para los expertos en la técnica. Los métodos para obtener plantas homocigosas que pueden utilizarse incluyen la preparación y transformación de células o tejidos haploides seguidos por la regeneración de células de tejidos haploides seguido por la regeneración de plantaciones haploides y la conversión subsecuente a plantas diploides, por ejemplo, a través del tratamiento con colchina u otros agentes que interrumpen los microtubulos. Las plantas pueden ser crecidas de acuerdo con otras prácticas agrícolas convencionales. En otro aspecto, la presente invención también proporciona plantas con la capacidad de fijar la semilla que expresa la apolipoproteína. En una modalidad preferida de la presente invención, las plantas con la capacidad de fijar la semilla comprenden una secuencia de ácido nucleico quimérica que está comprendida en la dirección 5' a 3' de la transcripción: (a) una primera secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en una célula de semilla de la planta que está enlazada en forma operativa a la misma; (b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína, en donde la semilla contiene apolipoproteína. En una modalidad preferida la secuencia de ácido nucleico quimérica está integrada en forma estable en el genoma nuclear de la planta. Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona semillas de plantas que expresan a apolipoproteína. En una modalidad preferida de la presente invención, las semillas de la planta comprenden una secuencia de ácido nucleico quimérica que está comprendida en la dirección 5' a 3' de la transcripción: (a) una primera secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en una célula de semilla de la planta que está enlazada en forma operativa a la misma; (b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína. El polipéptido de apolipoproteína puede encontrarse en una variedad de diferentes tipos de células de semilla, que incluyen por ejemplo, los hipocotilos y los ejes embriónicos, incluyendo las raíces embriónicas y las hojas embriónicas, y en donde las especies de plantas monocotiledóneas, incluyendo cereales y maíz, se utilizan en el tejido de endosperma. Una vez que las plantas han sido obtenidas, se puede extraer la proteína de apolipoproteína y obtenerse de la planta en una forma más o menos pura. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método para preparar a apolipoproteína substancialmente pura, en donde el método comprende: (a) proporcionar una construcción de ácido nucleico quimérica comprendida en la dirección 5' a 3' de la trascripción, en la forma de componentes enlazados en forma operable: (i) una secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en las células de la semilla de la planta; y (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína; (b) introducir la construcción de ácido nucleico quimérica en una célula de planta; (c) crecer la célula de la planta en una planta madura; y (d) obtener la semilla de la planta en donde la semilla comprende apolipoproteína. (e) separar la apolipoproteína de los constituyentes de la semilla de la planta para obtener apolipoproteína substancialmente pura. Con el objeto de separar la apolipoproteína de los constituyentes de la semilla, las semillas de la planta pueden ser molidos utilizando cualquier proceso de molido que de como resultado una interrupción substancial de la membrana de las célula y de las paredes de la célula de la semilla. Las condiciones de molido tanto en seco como con humedad (Patente Norteamericana No. 3,971,856; Lawhon y asociados, 1977, J. Am. Oil Chem. Soc, 63: 533-534) pueden ser utilizadas. El equipo de molido adecuado en este aspecto incluye molinos coloidales, molinos de disco, molinos IKA, homogenizadores de escala industrial y similares. La selección de equipo de molido dependerá del tipo de semilla y los requerimientos de rendimiento. El contaminante de semilla sólida tal como cascaras, materiales fibrosos, carbohidratos no disueltos, proteínas y otros contaminantes no solubles en agua pueden ser eliminados de la fracción de la semilla utilizando por ejemplo, metodologías a base de exclusión por tamaño, tal como filtración o procesos a base de gravedad tales como centrifugación. En modalidades preferidas, el uso de solventes orgánicos comúnmente utilizados en extracción de aceite, tal como hexano, se evita debido a que dichos solventes pueden dañar el polipéptido de apolipoproteína. Tal como se mencionó anteriormente en modalidades preferidas de la presente invención, la apoliproteína se prepara en una forma que permite la asociación del polipéptido de apolipoproteína con los cuerpos de aceite de la semilla. Por consiguiente, los cuerpos de aceite de la semilla que comprenden la apolipoproteína, pueden prepararse después del molido de la semilla, utilizando por ejemplo, las metodologías que se describen en la Patente Norteamericana No. 6,146,645. Por lo tanto, la presente invención también incluye cuerpos de aceite substancialmente puros que comprenden apolipoproteína obtenida de la semilla de la planta. Los cuerpos de aceite pueden utilizarse en la forma de una fracción de semilla de la planta refinada para purificar en forma adicional la apolipoproteína. La apolipoproteína substancialmente pura puede recuperarse de la semilla utilizando una de una variedad de metodologías de purificación adicionales, tales como técnicas a base de centrifugación; metodologías a base de extrusión por tamaño, incluyendo por ejemplo, ultrafiltración de membrana y ultrafiltración de flujo cruzado; y técnicas cromatográficas, incluyendo por ejemplo, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía por afinidad, cromatografía líquida, de alto desempeño (HPLC), cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC), cromatografía de interacción hidrofóbica y similares. Generalmente, se utilizará una combinación de dichas técnicas para obtener a apolipoproteína substancialmente pura. Una metodología preferida para obtener la apoliproteína substancialmente pura en su forma nativa procedente de semillas de plantas transgénicas se detalla en forma adicional en el Ejemplo 6 de la presente invención. Por lo tanto, la presente invención también incluye a apolipoproteína substancialmente pura obtenida de una planta. Las formulaciones de apolipoproteína farmacéutica pueden prepararse a partir de la apolipoproteína purificada y dichas formulaciones se pueden utilizar para tratar enfermedades vasculares. Generalmente la apolipoproteína purificada será mezclada en adiciones con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable en cantidades suficientes para ejercer un efecto terapéuticamente útil en la ausencia de efectos secundarios indeseables en el paciente tratado. Para formular una composición de apolipoproteína, se disuelve la fracción de peso de la apolipoproteína, se suspende, se dispersa o se mezcla de otra forma en un vehículo o diluyente seleccionado en una concentración efectiva, de modo que se aminore la condición tratada. Las formulaciones de apolipoproteína farmacéuticas, se formulan preferentemente para administración de dosis simples. Las dosis terapéuticamente efectivas para suministro parenteral de apolipoproteína humana, son bien conocidas en la técnica. Cuando se utilizan análogos de apolipoproteína u otros modos de suministro, se utilizan dosis terapéuticamente efectivas que pueden ser determinadas en forma empírica fácilmente por los expertos en la técnica, utilizando protocolos de pruebas o mediante extrapolación de datos de prueba in vivo o in vitro. Sin embargo quedará entendido que las concentraciones y las dosis pueden variar de acuerdo con la severidad de la condición aliviada. Quedará entendido en forma adicional que para cualquier sujeto en particular, se pueden ajustar regímenes de dosis específicos con el tiempo, de acuerdo con el juicio individual de la persona que administre o supervise a la administración de las formulaciones. Las soluciones o suspensiones farmacéuticas pueden incluir por ejemplo, un diluyente estéril tal como, por ejemplo, agua, lactosa, sacarosa, fosfato de dicalcio o celulosa de carboximetilo. Los transportadores que se pueden utilizar incluyen, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, glicoles, etanol y similares, para formar de esta manera una solución o suspensión. Si se desea las composiciones farmacéuticas también pueden contener substancias auxiliares no toxicas, tales como agentes de humectación; agentes de emulsificación; agentes de solubilización; agentes antimicrobianos, tales como alcohol bencílico y parabenos de metilo; antioxidantes, tales como ácido ascórbico y bisulfito de sodio; agentes de quelación tales como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA); agentes de regulación de pH tales como reguladores de acetato, citrato o fosfato; y combinaciones de los mismos. La formulación final de la preparación de apolipoproteína generalmente dependerá del modo de suministro de apolipoproteína. La apolipoproteína preparada de acuerdo con la presente invención, se puede suministrar en cualquier forma deseada; sin embargo las formas de administración parenteral, orales y nasales se consideran los modos de administración usados más probablemente. Las preparaciones parentérales pueden ser guardadas en ampolletas, jeringas desechables o frascos de dosis simples o múltiples elaborados de vidrio, plástico u otros materiales adecuados. Ejemplos Los ejemplos que se encuentran a continuación se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación.

Ejemplo 1 Construcción de clones de Apolipoproteína A-l Apo 10 Apo10 (SEQ ID NO: 144) es un clon diseñado para expresarse en una forma específica de la semilla, el cual está construido tal como en la figura 3(A), 3(B) y 3(C). Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apolo consiste de un promotor específico de la semilla y un terminador (faseolina) que conduce la expresión de una proteína de fusión (SEQ ID NO: 145) entre Apo Al y GFP maduro. Para construir este clon, el cebador directo 1186 (SEQ ID NO:146 (5'-G 3ATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3'), eliminó un sitio Ncol del inicio de GFP (plantilla derivada del vector pVS-GFP). El cebador inverso 1187 (SEQ ID NO-.147) (5'- AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAGTTC-3'. agregó sitios Pstl, Xbal y Hindlll después del codón de detención. Se ligó el fragmento PCR en el vector de clonación EcoRI Topo (Invitrogen) creando G1 de plásmido (figura 3(A)). El cebador directo 1190 (SEQ ID NO:148) (5'CCATGG_ggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3') amplifica la secuencia madura de Apo AI y agrega un sitio Ncol al inicio del gen. El cebador inverso 1189 (SEQ ID NO:149) .5'-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3'_ elimina ei codón de detención del gen y agrega un sitio BamHI para ayudar a crear una fusión de traducción en estructura con GFP (Plasmid G1). La plantilla de estos cebadores fue un vector a base de pKS+ (Strategene) que contiene toda la secuencia de codificación para el gen Apo AI de humano. Se ligó el fragmento PCR en el sitio EcoRI del vector de clonación Topo (Invitrogen) creando el Plásmido M2. El plásmido M2 contuvo la secuencia madura de Apo Al que se cortó con enzimas de restricción Ncol y BamHI. El plásmido G'1 contiene la secuencia de codificación GFP y se cortó con BamHI y Xbal (ver figura 3(B)). Los fragmentos de M2 y G'1 se ligaron juntos en los sitios Ncol y Xbal del plásmido SBS2090 (ver figura 3(B)) para crear el plásmido 2M4. El plásmido 2M4 se cortó con Ncol y Hindlll para eliminar la cinta de fusión Apo Al-GFP y los fragmentos se utilizaron subsecuentemente para clonarse en los sitios Ncol/Hindlll del vector binario. pSBS4006 (ver figura 3(C)). Se debe observar que este plásmido contiene el promotor/terminador ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80: 1897-1901) y un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawalleck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo11 Apo11 (SEQ ID NO:150) es un clon diseñado para expresarse en una forma específica de la semilla, el cual está construido tal como en la figura 3(A), 3(B) y 3(C). Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo11 consiste de un promotor y terminador específico de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de una proteína de fusión (SEQ ID NO:151) entre pro-Apo Al y GFP. Para construir este clon, el cebador directo 1186 (SEQ ID NO:146) (5'-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3' .. eliminó un sitio Ncol del inicio de GFP (plantilla derivada del vector pVS-GFP). El cebador inverso 1187 (SEQ ID NO:147) (5'-AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAGTTC-3'. agregó los sitios Pstl, Xbal y Hindlll después del codón de detención. El fragmento PCR se ligó en el vector de clonación EcoRI Topo (Invitrogen) creando el plásmido G1 (figura 3(A)). El cebador directo 1191 (SEQ ID NO:152) (5'-CCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3') amplifica la pro-secuencia de Apo Al y agrega un sitio Ncol al inicio del gen. El cebador inverso 1189 (SEQ ID NO:149) (5'-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') elimina el codón de detención del gen y agrega un sitio BamHl para ayudar a crear una fusión de traducción con GFP (Plasmid G1). La plantilla para estos cebadores fue un vector a base de pKS+ (Strategene) que contiene toda la secuencia de codificación para el gen Apo AI de humano. Los fragmentos PCR fueron ligados por separado cada uno en el sitio EcoRI del vector de clonación Topo (Invitrogen) creando el Plásmido P2. El plásmido P2 contuvo la secuencia pro-Apo Al que se cortó con enzimas de restricción Ncol y BamHl. El plásmido G'1 contiene la secuencia de codificación GFP y se cortó con BamHl y Xbal (ver figura 3(B)). Los fragmentos de P2 y G'1 se ligaron juntos en los sitios Ncol y Xbal del plásmido SBS2090 (ver figura 3(B)) para crear el plásmido 2P5. El plásmido 2P5 se cortó con Ncol y HindIII para eliminar la cinta de fusión pro-Apo Al-GFP y los fragmentos se utilizaron en forma subsecuentemente para clonarse en los sitios Ncol/H ind H I del vector binario pSBS4006 (ver figura 3(C)). Se debe observar que este plásmido contiene el promotor/terminador ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80: 1897-1901) y un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawalleck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo12 Apo12 (SEQ ID NO:153) es un clon diseñado para expresarse en una forma específica de la semilla, el cual se construyó para las figuras 3(A), 3(B) y 3(C). Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo12 consiste en un promotor y terminador específico de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de una proteína de fusión (SEQ ID NO:154) entre una oleosina (van Rooijen, G.J., y asociados, Plan Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179 (1992)), Apo Al y GFP madura. Para construir este clon, el cebador directo 1186 (SEQ ID NO:146) (5'-GGATCC_CCtTGGCTAGTAAAGG-3'), eliminó un sitio Ncol del inicio de GFP (plantilla derivada del vector pVS-GFP). El cebador inverso 1187 (SEQ ID NO:147) (5'- AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAGTTC-3'. agregó los sitios Pstl, Xbal y Hindlll después del codón de detención. El fragmento PCR se ligó en el vector de clonación EcoRI Topo (Invitrogen) creando el plásmido G1 (figura 3(A)). El cebador directo 1190 (SEQ ID NO:148) (5'CCATGGaaCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3") amplifica la secuencia madura de Apo Al y agrega un sitio Ncol al inicio del gen. El cebador inverso 1189 (SEQ ID NO:149) (5'-GGATCC_cCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') elimina ei codón de detención del gen y agrega un sitio BamHl para ayudar a crear una fusión de traducción en-estructura con GFP (Plasmid G1). La plantilla para estos cebadores fue un vector a base de pKS+ (Strategene) que contiene toda la secuencia de codificación para el gen Apo AI de humano. El fragmento PCR se ligó en el sitio EcoRI del vector de clonación Topo (Invitrogen) creando el Plásmido M2. El plásmido M2 contuvo la secuencia madura de Apo Al que se cortó con enzimas de restricción Ncol y BamHl. El plásmido G'1 contiene la secuencia de codificación GFP y se cortó con BamHl y Xbal (ver figura 3(B)). Los fragmentos de M2 y G'1 se ligaron juntos en los sitios Ncol y Xbal del plásmido SBS2090 (ver figura 3(B)) para crear el plásmido 2M4. El plásmido 2M4 se cortó con Ncol y HindIII para eliminar la cinta de fusión Apo Al-GFP y los fragmentos se utilizaron en forma subsecuentemente para clonarse en los sitios Ncol/Hindlll del vector binario pSBS4008 (ver figura 3(C)). Se debe observar que este plásmido contiene el promotor/terminador ß-faseolin de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80: 1897-1901) que controla la expresión del gen de oleosina Arabidopsis (van Rooijen, G.J., y asociados, Plan Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179) para la fusión con la fusión Apo AI/GFP. El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37)) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawalleck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo13 Apo13 (SEQ ID NO:155) es un clon diseñado para expresarse en una forma específica de la semilla, que está construido para las figuras 3(A), 3(B) y 3(C). Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo13 consiste en un promotor y terminador específico de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de fusión (SEQ ID NO:156) entre oleosina, pro-Apo Al y GFP. Para construir este clon, el cebador directo 1186 (SEQ ID NO:146) (5'-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3'), eliminó un sitio Ncol del inicio de GFP (plantilla derivada del vector pVS-GFP). El cebador inverso 1187 (SEQ ID NO.147) (5'- AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAGTTC-3'. agregó los sitios Pstl, Xbal y Hindlll después del codón de detención. El fragmento PCR se ligó en el vector de clonación EcoRI Topo (Invitrogen) creando el plásmido G1 (figura 3(A)). El cebador directo 1191 (SEQ ID NO:152) (5'- CCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3') amplifica la pro-secuencia de Apo Al y agrega un sitio Ncol al inicio del gen. El cebador inverso 1189 (SEQ ID NO:149) (5'-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3") elimina el codón de detención del gen y agrega un sitio BamHl para ayudar a crear una fusión de traducción con GFP (Plasmid G1). La plantilla para estos cebadores fue un vector a base de pKS+ (Strategene) que contiene toda la secuencia de codificación del gen Apo Al de humano. Los fragmentos PCR se ligaron en el sitio EcoRI del vector de clonación Topo (Invitrogen) creando el Plásmido P2. El plásmido P2 que contuvo la secuencia pro-Apo Al se cortó con enzimas de restricción Ncol y BamHl. El plásmido G'1 contiene la secuencia de codificación GFP y se cortó con BamHl y Xbal (ver figura 3(B)). Los fragmentos de P2 y G'1 se ligaron juntos en los sitios Ncol y Xbal del plásmido SBS2090 (ver figura 3(B)) para crear el plásmido 2P5. El plásmido 2P5 se cortó con Ncol y Hindlll para eliminar la cinta de fusión pro-Apo Al-GFP y los fragmentos se utilizaron en forma subsecuentemente para clonarse en los sitios Ncol/HindIII del vector binario pSBS4008 (ver figura 3(C)). Se debe observar que este plásmido contiene el promotor/terminador ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80: 1897-1901) que controla la expresión del gen de oleosina Arabidopsis (van Rooijen, G.J., y asociados, Plan Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179) para la fusión con la fusión Apo AI/GFP. El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37)) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawalleck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo15 Apo15 (SEQ ID NO:157) es un clon diseñado para expresarse en una forma específica de la semilla, que está construido para las figuras 3(A), 3(B) y 3(D). Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo15 consiste en un promotor y terminador específico de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de fusión (SEQ ID NO:158) entre Apo Al y GFP. La proteína de fusión se dirigió para la expresión a través de la trayectoria de 1 secreción utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patogénesis de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Para construir este clon, el cebador directo 1186 (SEQ ID NO:146) (5'-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3') eliminó un sitio Ncol del inicio de GFP (plantilla derivada del vector pVS-GFP). El cebador inverso 1187 (SEQ ID NO:147) (5'- AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAGTTC-3'. agregó los sitios Pstl, Xbal y H i nd II I después del codón de detención. El fragmento PCR se ligó en el vector de clonación EcoRI Topo (Invitrogen) creando el plásmido G1 (figura 3(A)). El cebador directo 1190 (SEQ ID NO:148) (5'-CCATGGaqCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3') amplifica la secuencia madura de Apo Al y agrega un sitio Ncol al inicio del gen. El cebador inverso 1189 (SEQ ID NO:149) (5'-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') elimina el codón de detención del gen y agrega un sitio BamHl para ayudar a crear una fusión de traducción con GFP (Plasmid G1). La plantilla para estos cebadores fue un vector a base de pKS+ (Strategene) que contiene toda la secuencia de codificación del gen Apo Al de humano. Los fragmentos PCR se ligaron en el sitio EcoRI del vector de clonación Topo (Invitrogen) creando el Plásmido M2. El plásmido M2 que contenía la secuencia madura de Apo AI se cortó con enzimas de restricción Ncol y BamHl. El plásmido G'1 contiene la secuencia de codificación GFP y se cortó con BamHl y Xbal (ver figura 3(B)). Los fragmentos de M2 y G'1 se ligaron juntos en los sitios Ncol y Xbal del plásmido SBS2090 (ver figura 3(B)) para crear el plásmido 2M4. El plásmido 2M4 se cortó con Ncol y Hindlll para eliminar la cinta de fusión Apo Al-GFP y los fragmentos se utilizaron en forma subsecuentemente para clonarse en los sitios Ncol/Hindlll del vector binario pSBS4011 (ver figura 3(D)). Se debe observar que este plásmido contiene el promotor/terminador ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80: 1897-1901) fusionado al péptido de señal PRS. El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37)) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo16 Apo16 (SEQ ID NO:159) es un clon diseñado para expresarse en una forma específica de la semilla, que está construido para las figuras 3(A), 3(B) y 3(D). Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo16 consiste en un promotor y terminador específico de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de fusión (SEQ ID NO:160) entre pro-Apo Al y GFP. La proteína de fusión se dirigió para la expresión a través de la trayectoria de secreción utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patogénesis de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8: 217-221). Para construir este clon, el cebador directo 1186 (SEQ ID NO:146) (5'-GGATCCCCtTGGCTAGTAAAGG-3Y eliminó un sitio Ncol del inicio de GFP (plantilla derivada del vector pVS-GFP). El cebador inverso 1187 (SEQ ID NO:147) (5'-AAGCTTTCTAGACTGCAGTCATGACTTATTTGTATAGTTC-3") agregó los sitios Pstl, Xbal y Hindlll después del codón de detención. El fragmento PCR se ligó en el vector de clonación EcoRI Topo (Invitrogen) creando el plásmido G1 (figura 3(A)). El cebador directo 1191 (SEQ ID NO:152) (5'-CCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3') amplifica la pro-secuencia de Apo Al y agrega un sitio Ncol al inicio del gen. El cebador inverso 1189 (SEQ ID NO:149) (5'-GGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') elimina el codón de detención del gen y agrega un sitio BamHl para ayudar a crear una fusión de traducción con GFP (Plasmid G1). La plantilla para estos cebadores fue un vector a base de pKS+ (Strategene) que contiene toda la secuencia de codificación del gen Apo Al de humano. Los fragmentos PCR se ligaron en el sitio EcoRI del vector de clonación Topo (Invitrogen) creando el Plásmido P2. El plásmido P2 que contenía la secuencia pro-Apo Al se cortó con enzimas de restricción Ncol y BamHl. El plásmido G'1 contiene la secuencia de codificación GFP y se cortó con BamHl y Xbal (ver figura 3(B)). Los fragmentos de P2 y G'1 se ligaron juntos en los sitios Ncol y Xbal del plásmido SBS2090 (ver figura 3(B)) para crear el plásmido 2P5. El plásmido 2P5 se cortó con Ncol y Hindlll para eliminar la cinta de fusión pro- Apo Al-GFP y los fragmentos se utilizaron en forma subsecuentemente para clonarse en los sitios Ncol/H i nd 111 del vector binario pSBS4011 (ver figura 3(D)). Se debe observar que este plásmido contiene el promotor/terminador ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80: 1897-1901) fusionado al péptido de señal PRS. El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37)) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo 17 Apo17 (SEQ ID NO:161) es un clon diseñado para expresarse en una forma constitutiva el cual se construye como para la figura 4(A). Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo17 consiste en un promotor y terminador constitutivo (ubiquitina) que conoce la expresión de una proteína de fusión (SEQ ID NO:162) entre Apo AI y GFP. Para construir este clon, el plásmido 2M4 (ver figura 3(B)) se cortó con Ncol y Pstl para eliminar la cinta de fusión Apo Al-GFP y el fragmento se ligó en los sitios Ncol y Pstl del plásmido pKUO3' para crear un plásmido KU2M4. El plásmido pKUO3' contiene un gen de oleosina Brassica napus el cual se elimina cuando el vector se corta con Ncol y Pstl dando como resultado la construcción de fusión Apo AI/GFP bajo el control de un promotor de ubiquitina de perejil y un terminador de ubiquitina (Kawaileck, P. y asociados, 1993, Plant Mol. Biol. 21: 673-684). El plásmido KU2M4 se cortó con Kpnl y se ligó en el sitio Kpnl del vector binario SBS3000 (figura 4). Se debe observar que el plásmido que contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37)) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. El clon Apo17 contiene una fusión de traducción Apo Al-GFP madura y se dirige al citosol. Apo 18a Apo18a (SEQ ID NO:163) es un clon diseñado para expresarse en una forma constitutiva el cual se construye como para la figura 4. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo18a consiste de un promotor y terminador constitutivo (ubiquitina) que conoce la expresión de una proteína de fusión (SEQ ID NO:164) entre pro-Apo Al y GFP. Para construir este clon, el plásmido 2P5 (ver figura 3(B)) se cortó con Ncol y Pstl para eliminar la cinta de fusión pro-Apo Al-GFP y el fragmento se ligó en los sitios Ncol y Pstl del plásmido pKUO3' para crear un plásmido KU2P5. El plásmido pKUO3' contiene un gen de oleosina Brassica napus el cual se elimina cuando el vector se corta con Ncol y Pstl dando como resultado la construcción de fusión pro-Apo AI/GFP bajo el control de un promotor de ubiquitina de perejil y un terminador de ubiquitina (Kawaileck, P. y asociados, 1993, Plant Mol. Biol. 21: 673-684). El plásmido KU2P5 se cortó con Kpnl y se ligó en el sitio Kpnl del vector binario SBS3000 (figura 4). Se debe observar que este plásmido que contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37)) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. El clon Apo18a contiene una fusión de traducción pro-Apo Al-GFP madura y se dirige al citosol. Apo18b El Apo18b (SEQ ID NO:163) es un clon diseñado para expresarse en una forma constitutiva el cual se construye como para la figura 4(B). Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo18b consiste en un promotor y terminador constitutivo (ubiquitina) que conoce la expresión de una proteína de fusión (SEQ ID NO:164) entre pro-Apo Al y GFP. Se debe observar que los clones Apo18a y Apo18b ambos consisten en tener un promotor constitutivo (ubiquitina) que conoce la expresión de una proteína de fusión (SEQ ID NO:164) entre pro-Apo Al y GFP. Se debe observar que ambos de los clones Apo18a y Apo18b, tienen un promotor constitutivo (ubiquitina) que conduce la expresión de una proteína de fusión (SEQ ID NO:164) entre por-Apo Al h GFP. La diferencia entre los 2 clones es que Apo18a se inserta en el sitio Kpnl del vector binario pSBS3000 (el cual contiene el gen pat que confiere la resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37)) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. En contraste, Apo18b se inserta en el sitio Kpnl del vector binario pSBS5001 (que contiene el gen pmi (Miles y asociados, 1984, Gene 21: 41-48), que codifica la isomerasa de fosfomanosa que permite la selección positiva de mañosa que contiene la selección positiva en el medio de selección que contiene mañosa. El gen pmi está bajo el control del promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. Para construir este clon, se cortó el vector binario Apo18a con Kpnl removiendo la cinta de fusión pro-Apo Al-GFP y el fragmento se ligó en el sitio Kpnl del plásmido SBS5001 para la expresión en Agrobacterium. El clon Apo18b contiene una fusión de traducción pro-Apo Al-GFP y se dirige al citosol. Apo19 Apo19 (SEQ ID NO:165) es un clon diseñado para expresarse en una forma constitutiva, el cual se construye como para las figuras 5(A) y 5(B). Tal como se aprecia en la figura 2, el clon Apo19 consiste de un promotor y terminador constitutivo (ubiquitina) que conduce la expresión de una proteína de fusión (SEQ ID NO:166) entre Apo Al y GFP. La proteína de fusión se dirigió para la expresión a través de la trayectoria de secreción utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Biol/technology, 8: 217-221). Para construir este clon, se utilizó Apo15 como plantilla. El cebador directo 1177 (SEQ ID NO:167) (5'-GCAGCATTCATGAACTTCCTTAAGTCTTTCC-3') amplifica el inicio de la pre-secuencia de planta (PRS) que contiene un sitio BspHI en el codón de inicio. El cebador inverso 1178 (SEQ ID NO:168) (5'- GGTGGTGGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') elimina el codón de detención del gen y agrega un sitio BamHl para ayudar a crear una fusión de traducción en-estructura con GFP. Se dejaron bases extra en los extremos de ambos cebadores para facilitar la digestión de enzimas de restricción. El plásmido G1 (ver figura 3(A)) fue digerido con BamHl y Pstl para ligadura en pubiP + iS3' que contiene el promotor y terminador de ubiquitina procedente de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684). El fragmento PCR PRS-Apo Al se digirió con BspHI y BamHl y se ligó con el fragmento G1 en el plásmido pub¡P + ¡S3' para crear el plásmido 19-6. El plásmido 19-6 se digirió con EcoRI para eliminar la cinta de expresión y posteriormente se ligó la cinta en el plásmido pKUO3'K (figura 4(A)) entre los sitios EcoRI (eliminando la cinta existente), creando el plásmido KU19-6. KU19-6 se digirió con Kpnl y el fragmento se ligó en los sitios Kpnl del plásmido SBS3000 (figura 5(B)). Se debe observar que este plásmido contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37)) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. El clon Apo19 contiene una fusión de traducción Apo Al-GFP madura, respectivamente dirigida a la trayectoria de secreción. Apo20 Apo20 (SEQ ID NO:169) es un clon diseñado para expresarse en una forma constitutiva, el cual se construye como para las figuras 5(A) y 5(B). Tal como se aprecia en la figura 2, el clon Apo20 consiste de un promotor un terminador constitutivo (ubiquitina) que conduce la expresión de una proteína de fusión (SEQ ID NO:170) entre pro-Apo Al y GFP. La proteína de fusión se dirigió para la expresión a través del sistema de secreción utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Biol/technology, 8: 217-221). Para construir este clon, se utilizó Apo16 como plantilla. El cebador directo 1177 (SEQ ID NO:167) (5'-GCAGCATTCATGAACTTCCTTAAGTCTTTCC-3') amplifica el inicio de la pre-secuencia de planta (PRS) que contiene un sitio BspHI en el codón de inicio. El cebador inverso 1178 (SEQ ID NO:168) (5'-GGTGGTGGATCCcCTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTG-3') elimina el codón de detención del gen y agrega un sitio BamHl para ayudar a crear una fusión de traducción en-estructura con GFP. Se dejaron bases extra en los extremos de ambos cebadores para facilitar la digestión de enzimas de restricción. El plásmido G1 (ver figura 3(A)) fue digerido con BamHl y Pstl para ligadura en pubiP + iS3' que contiene el promotor y terminador de ubiquitina procedente de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684). El fragmento PCR PRS-pro-Apo Al se digirió con BspHI y BamHl y se ligó con el fragmento G1 en el plásmido pubiP + iS3' para crear el plásmido 20-11. El plásmido 20-11 se digirió con EcoRI para eliminar la cinta de expresión y posteriormente se ligó la cinta en el plásmido pKUO3'K (figura 4(A)) entre los sitios EcoRI (eliminando la cinta existente), creando el plásmido KU20-11. KU20-11 se digirió con Kpnl y el fragmento se ligó en los sitios Kpnl del plásmido SBS3000 (figura 5(B)). Se debe observar que este plásmido contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37)) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. El clon Apo20 contiene una fusión de traducción pro-Apo Al-GFP, respectivamente dirigida a la trayectoria de secreción. Apo21 Apo21 (SEQ ID NO:171) es un clon preferido de semilla el cual se construye como para la figura 6. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo21 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de Apo Al (SEQ ID NO:172). Para construir este clon, el cebador directo 1203 (SEQ ID NO:173) (5'- GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3') agrega un sitio Ncol al inicio del Apo Al maduro. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'- GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTC CTCcAGAGCG-3') agrega un sitio Hindlll después del codón de detención y agrega una mutación silente para eliminar el segundo sitio Xhol. Ambos cebadores contienen bases extra en los extremos 5' para facilitar la digestión de enzimas de restricción. Se digirió el fragmento PCR con Ncol y Hindlll y se ligó en el plásmido SBS2090 creando el plásmido 5-3 (figura 6). El plásmido 5-3 se digirió con Ncol y Hindlll y se ligó el fragmento Apo Al en los sitios Ncol/Hindlll de SBS4006 (figura 3(C)). SBS4006 contiene el promotor/terminador ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80: 1897-1901) y un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37)) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo21 es un clon para la dirección específica de la semilla de Apo Al al citosol. Apo22 Apo22 (SEQ ID NO:175) es un clon preferido de semilla el cual se construye como para la figura 7. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo22 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de pro-Apo Al (SEQ ID NO:176). Para construir este clon, el cebador directo 1201 (SEQ ID NO:177) (5'-GCAGCACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3') agrega un sitio Ncol al inicio del pro-Apo Al. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'- GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTC CTCcAGAGCG-3') agrega un sitio Hindlll después del codón de detención y agrega una mutación silente para eliminar el segundo sitio Xhol. Ambos cebadores contienen bases extra en los extremos 5' para facilitar la digestión de enzimas de restricción. Se digirió el fragmento PCR con Ncol y Hindlll y se ligó en el plásmido SBS2090 (figura 3(B)) creando el plásmido 4-2 (figura 7). El plásmido 4-2 se digirió con Ncol y Hindlll y se ligó el fragmento pro-Apo Al en los sitios Ncol/Hindlll de SBS4006 (figura 3(C)). SBS4006 contiene el promotor/terminador ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80: 1897-1901) y un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37)) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo22 es un clon para la dirección específica de la semilla de pro-Apo AI al citosol. Apo23 Apo23 (SEQ ID NO:178) es un clon preferido de semilla el cual se construye como para la figura 6. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo23 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de oleosina/Apo Al (SEQ ID NO:179). Para construir este clon, el cebador directo 1203 (SEQ ID NO:173) (5'- GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3') agrega un sitio Ncol al inicio del Apo Al maduro. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'- GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTC CTCcAGAGCG-3') agrega un sitio Hindlll después del codón de detención y agrega una mutación silente para eliminar el segundo sitio Xhol. Ambos cebadores contienen bases extra en los extremos 5' para facilitar la digestión de enzimas de restricción. Se digirió el fragmento PCR con Ncol y Hindlll y se ligó en el plásmido SBS2090 creando el plásmido 5-3 (figura 6). El plásmido 5-3 se digirió con Ncol y Hindlll y se ligó el fragmento Apo Al en los sitios Ncol/H ind 111 de SBS4008 (figura 3(C)). SBS4008 contiene el promotor/terminador ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80: 1897-1901) que controla la expresión del gen de oleosina Arabidopsis (van Rooijen G.J. y asociados, 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179) y un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37)) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo23 es un clon para la dirección específica de la semilla de oleosina/Apo Al a los cuerpos aceitosos. Apo24 Apo24 (SEQ ID NO:180) es un clon preferido de semilla el cual se construye como para la figura 7. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo24 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de oleosina/pro-Apo Al (SEQ ID NO:181). Para construir este clon, el cebador directo 1201 (SEQ ID NO:177) (5'- GCAGCACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3') agrega un sitio Ncol al inicio del pro-Apo Al. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'- GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTC CTCcAGAGCG-3') agrega un sitio Hindlll después del codón de detención y agrega una mutación silente para eliminar el segundo sitio Xhol. Ambos cebadores contienen bases extra en los extremos 5' para facilitar la digestión de enzimas de restricción. Se digirió el fragmento PCR con Ncol y Hindlll y se ligó en el plásmido SBS2090 creando el plásmido 4-2 (figura 7). El plásmido 4-2 se digirió con Ncol y Hindlll y se ligó el fragmento pro-Apo Al en los sitios Ncol/Hindlll de SBS4008 (figura 3(C)). SBS4008 contiene el promotor/terminador ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80: 1897-1901) que controla la expresión del gen de oleosina de Arabidopsis (van Rooijen G.J. y asociados, 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179) y un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37)) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo24 es un clon para la dirección específica de la semilla de oleosina/pro-Apo Al a los cuerpos aceitosos. Apo25 Apo25 (SEQ ID NO:182) es un clon preferido de semilla el cual se construye como para la figura 6. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo25 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de oleosina/klipd/met/Apo Al (SEQ ID NO:183). Esta construcción tiene una secuencia de disociación klip8 (SEQ ID NO.143) para facilitar la disociación de la proteína de fusión con quimosina. Para construir este clon, el cebador directo 1203 (SEQ ID NO:173) (5'-GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3') agrega un sitio Ncol al inicio del Apo Al maduro. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'- GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTC CTCcAGAGCG-3') agrega un sitio Hindlll después del codón de detención y agrega una mutación silente para eliminar el segundo sitio Xhol. Ambos cebadores contienen bases extra en los extremos 5' para facilitar la digestión de enzimas de restricción. El fragmento PCR se digirió con Ncol y HindIII y se ligó en el plásmido SBS2090 (figura 3(B)) creando el plásmido 5-3 (figura 6). El plásmido 5-3 se digirió con Ncol y Hindlll y se ligó el fragmento Apo Al en los sitios Ncol/Hindlll de SBS4010 (figura 7). SBS4010 contiene el promotor/terminador ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80: 1897-1901) que controla la expresión del gen de oleosina de Arabidopsis (van Rooijen G.J. y asociados, 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179) y un sitio de disociación klipd. El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37)) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo25 es un clon para la dirección específica de la semilla de oleosina/klip8/met/Apo Al para los cuerpos aceitosos y la purificación utilizando la secuencia de disociación kl i p 8. Apo26 Apo26 (SEQ ID NO:184) es un clon preferido de semilla el cual se construye como para la figura 7. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo26 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de oleosina/klip8/met/pro-Apo Al (SEQ ID NO:185). Esta construcción tiene una secuencia de disociación k I i p 8 (SEQ ID NO:143) para facilitar la disociación de la proteína de fusión con quimosina. Para construir este clon, el cebador directo 1201 (SEQ ID NO:177) (5*- GCAGCACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3') agrega un sitio Ncol al inicio del pro-Apo Al. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'- GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTC CTCcAGAGCG-3') agrega un sitio Hindlll después del codón de detención y agrega una mutación silente para eliminar el segundo sitio Xhol. Ambos cebadores contienen bases extra en los extremos 5' para facilitar la digestión de enzimas de restricción. Se digirió el fragmento PCR con Ncol y Hindlll y se ligó en el plásmido SBS2090 (figura 3(B)) creando el plásmido 4-2 (figura 7). El plásmido 4-2 se digirió con Ncol y Hindlll y se ligó el fragmento pro-met-Apo Al en los sitios BspHI/HindlII de SBS4010 (figura 7). SBS4010 contiene el promotor/terminador ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80: 1897-1901) que controla la expresión del gen de oleosina de Arabidopsis (van Rooijen G.J. y asociados, 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179) y un sitio de disociación klipd. El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37)) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo26 es un clon para la dirección específica de la semilla de oleosina/klipd/met/pro-Apo Al para los cuerpos aceitosos y la purificación utilizando la secuencia de disociación klipd. Apo27 Apo27 (SEQ ID NO:186) es un clon preferido de semilla el cual está construido como para la figura 8(A). Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo27 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de oleosina/klipd/Apo Al (SEQ ID NO:187). Apo27 fue dirigido para la expresión a los cuerpos aceitosos utilizando la secuencia de oleosina Arabidopsis (van Rooijen G.J. y asociados, 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179) y tiene una secuencia de disociación klip8 (SEQ ID NO:143) para facilitar la disociación de la proteína de fusión con quimosina. Para construir este clon, el cebador directo 1200 (SEQ ID NO:188) (5'- GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA-3') agrega un sitio Xhol y nucleótidos extra para facilitar la clonación en-estructura en la secuencia de disociación klipd (SEQ ID NO:143) al inicio de pro-Apo Al. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'- GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTC CTCcAGAGCG-3') agrega un sitio HindIII después del codón de detención y agrega la mutación silente para eliminar el segundo sitio Xhol. La plantilla para estos cebadores fue el plásmido Apo33 que contiene la pro-forma de Apo Al sin sitios Xhol internos y el residuo Met adicional. Los fragmentos PCR fueron cortados con Xhol y ligados en los sitios Xhol/EcoRV de pKS+ creando el plásmido 6-3. El plásmido 6-3 se cortó con Xhol y Hindlll y se ligó en los sitios Xhol/Hindlll del vector binario SBS4010 (figura 7). Se debe observar que SBS4010 contiene el promotor/terminador ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80: 1697-1901) que controla la expresión del gen de oleosina Arabidopsis (van Rooijen G.J. y asociados, 1992, Plant Mol. Biol. 1d (6), 1177-1179) y el sitio de disociación klipd. El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37)) conducido por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684)) para la transformación en Agrobacterium. Apo27 es un clon para la dirección específica de la semilla de Apo Al a los cuerpos aceitosos y la purificación con klipd de la secuencia de disociación. Apo27M Apo27M (SEQ ID NO:1d9) es un clon preferido de semilla el cual está construido como para la figura 8(B). Tal como se aprecia en la figura 2, el clon Apo27M consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de oleosina/klip8/met/Apo Al-M (SEQ ID NO:190). Esta construcción tiene una secuencia de disociación klipd (SEQ ID NO:143) para facilitar la disociación de la proteína de fusión con quimosina. Para construir este clon, el cebador directo 1202 (5'-GCAGCACTCGAGcaagttcGATGAACCCCCCCAGAGCCC-3') (SEQ ID NO:191) agrega un sitio Xhol y nucleótidos extra para facilitar la clonación en-estructura en la secuencia de disociación klipd para el inicio de mat-Apo AI. El cebador directo 1225 (5'-CGCCAGtGCTTGGCCGCGCGCCTTG-3') (SEQ ID NO:192) es un cebador con extremo romo que elabora una mutación de pares base de C a T para cambiar un residuo Arg a un residuo Cys. El cebador inverso 1206 (5'- GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTC CTCcAGAGCG-3') (SEQ ID NO:174) agrega un sitio Hindlll después del codón de detención y agrega una mutación silente para eliminar el segundo sitio Xhol. Ambos cebadores contienen bases en los extremos 5' para facilitar la digestión de enzimas de restricción. La plantilla para estos cebadores fue el plásmido P-10 el cual ya tenía mutados sus sitios Xhol. La plantilla de doble hebra se eliminó mediante digestión Dpnl. El fragmento PCR se digirió con Xhol y Hindlll y se ligó en los sitios pKS + Xhol/Hindlll creando el plásmido ApoM. ApoM se digirió con Xhol y Hindlll y el que fragmento se ligó en los sitios Xhol/Hindlll del plásmido SBS4010 (figura 7). SBS4010 contiene el promotor/terminador ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1963, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80: 1897-1901) que controla la expresión del gen de oleosina de Arabidopsis (van Rooijen G.J. y asociados, 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179) y el sitio de disociación klipd. El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70: 25-37) conducido por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo27M es un clon para la dirección específica de la semilla de oleosina/klipd/met/Apo Al-M a los cuerpos aceitosos y la purificación utilizando la secuencia de disociación klipd. Apo26 Apo28 (SEQ ID NO:193) es un clon preferido de semilla el cual está construido como para la figura 9. Tal como se aprecia en la figura 2, el clon Apo28 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de oleosina/klip8/pro-Apo Al (SEQ ID NO:194). Para construir este clon, el cebador directo 1200 (SEQ ID NO:18d) (5'- GCAGCACTCGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA-3') agrega un sitio Xhol y nucleótidos extra para facilitar la clonación en-estructura en la secuencia de disociación klipd para el inicio de pro-Apo Al. El cebador directo 1205 (SEQ ID NO:195) (5'-CCAAGCCCGCGCTaGAGGACCTCCG-3') con extremo romo, agrega una mutación silente para eliminar el sitio Xhol. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'-GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTC CTCcAGAGCG-3'), agrega un sitio Hindlll después del codón de detención y agrega una mutación silente para eliminar el segundo sitio Xhol. Ambos cebadores contienen bases en los extremos 5' para facilitar la digestión de enzimas de restricción. La plantilla para estos cebadores con vector a base de pKS+ (Strategene) contiene toda la substancia del codificador para el gen Apo Al de humano. La plantilla con hebra doble se eliminó mediante digestión de Dpnl. El fragmento PCR se digirió con Xhol y Hindlll y se ligó en los sitios pKS+ Xhol/Hindlll creando el plásmido P-10. P-10 se digirió con Xhol y Hindlll y el que fragmento se ligó en los sitios Xhol/Hindlll del plásmido SBS4010 (figura 7). SBS4010 contiene el promotor/terminador ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1963, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80: 1897-1901) que controla la expresión del gen de oleosina de Arabidopsis (van Rooijen G.J. y asociados, 1992, Plant Mol. Bioi. 18 (6), 1177-1179) y el sitio de disociación klipd. El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de planta huésped (Wohlleben y asociados, 19d8, Gene 70: 25-37)) conducido por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21: 673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo28M es un clon pr-Apo Al drigido a lo cuerpos de aceite y con la capacidad de ser disociado en la secuencia klipd. Apo29 Apo 29 (SEQ ID NO:196) es un clon preferido de la semilla el cual está construido como para la figura 6. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo29 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de PRS-Apo Al (SEQ ID NO:197). Apo29 fue dirigido para la expresión a través de la trayectoria de segregación utilizando el péptido de la señal de la frecuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8:217-221). Para construir este ción, el cebador directo 1203 (SEQ ID NO:173) (5'- GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3') agrega un sitio Ncol al inicio del Apo Al maduro. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'- GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTC CTCc AGAGCG-3') agrega un sitio Hindlll después del codón de detención y agrega una mutación silente para eliminar el segundo sitio Xhol. Ambos cebadores contenían bases extra en los extremos 5' para facilitar la digestión de enzimas de restricción. El fragmento PCR se digirió con Ncol y Hindlll y se ligó en el plásmido SBS2090 creando el plásmido 5-3 (figura 6). El plásmido 5-3 se digirió con Ncol y Hindlll y el fragmento Apo Al se ligó en los sitios Ncol / Hindlll de SBS4011 (figura 3D). SBS4011 contiene el promotor/terminador ß/faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80:1897-1901) controlando la expresión del gen de oleosina Arabidopsis (van Rooijen G.J. y asociados 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179) y el péptido de señal PRS (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8:217-221). El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 1968, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina del Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Piant. Mol. Bio., 21:673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo29 es un clon para la dirección específica de la semilla de Apo Al a la trayectoria de segregación. Apo30 Apo30 (SEQ ID NO:198) es un clon preferido de la semilla el cual está construido como para la figura 7: Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo30 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de PRS-pro-Apo Al (SEQ ID NO:199). Pro-Apo Al se dirigió para la expresión a la trayectoria de segregación utilizando el péptido de la señal de la secuencia relacionada con el patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 6:217-221). Para construir este clon, el cebador directo 1201 (SEQ ID NO:177) (5'- GCAGCACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3') agrega un sitio Ncol al inicio de pro-Apo Al. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'- GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTC CTCc AGAGCG-3') agrega un sitio H i nd I II después del codón de detención y agrega una mutación silente para remover el codón del sitio Xhol. Ambos cebadores contienen bases extra en los extremos 5' para facilitar la digestión RE. El fragmento PCR se digirió con Ncol y Hindlll y se ligó en el plásmido SBS2090 creando el plásmido 4-2 (figura 7). El plásmido 4-2 se digirió con Ncol y Hindlll y el fragmento Apo Al se ligó en los sitios Ncol y Hindlll de pSBS4011 (figura 3D). SBS4011 contiene el promotor/terminador ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80:1897-1901) controlando la expresión del gen de oleosina Arabidopsis (van Rooijen G.J. y asociados 1992, Plant Mol. Biol. 18 (6), 1177-1179) y el péptido de señal PRS (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8:217-221). El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de ia planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina del Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant.

Mol. Bio., 21:673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo30 es un clon para la dirección específica de la semilla de PRO-Apo Al a la trayectoria de secreción. Apo31 Apo31 (SEQ ID NO:200) es un clon preferido de la semilla el cual está construido como para la figura 8(A). Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo2d consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de fusión PRS/D9 scFV/Apo Al (SEQ ID NO:201). D9 scFV/Apo Al también se dirigió para la expresión a la trayectoria de segregación utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con el patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8:217-221). Para construir este clon, el cebador directo 1200 (SEQ ID NO:188) (5'-GCAGCACTGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA-3') agrega un sitio Xhol al inicio de pro-Apo Al. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'-GTG GTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTC cAGAGCG-3') agrega un sitio Hindlll después del codón de detención y agrega una mutación silente para eliminar el segundo sitio Xhol. La plantilla para estos cebadores fue el plásmido Apo33 que contiene la pro-forma de Apo Al sin los sitios Xhol internos y el residuo Met adicional. Los fragmentos PCR fueron cortados con Xhol y ligados en los sitios Xhol/EcoRV de pKS+ creando el plásmido 6-3. El plásmido 6-3 se cortó con Xhol y Hindlll y se ligó en los sitios Xhol/Hindlll del vector binario SBS4055 (figura 9). Se debe observar que SBS4055 contiene el promotor/terminador de ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 19d3, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80:1697-1901) controlando la expresión de la estructura interna fusionada a la frecuencia de señal PRS al inserto D9 scFV/Apo Al. El plásmido también contiene un gen pat que confiere la resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 198d, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina del Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo31 es un clon para la dirección específica de la semilla de Apo Al a la trayectoria de segregación y la purificación con el anticuerpo D9 scFV oleosín. Apo32 Apo32 (SEQ ID NO:202) es un clon preferido de la semilla el cual se construye como para la figura 9. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo32 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de D9 scFV/Apo Al (SEQ ID NO:203). Para construir este clon, el cebador directo 1200 (SEQ ID NO:188) (5'- GCAGCACTGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA-3') agrega un sitio Xhol al inicio de pro-Apo Al. El cebador directo 1205 (SEQ ID NO:195) (5'- CCAAGCCCGCGCaGAGGACCTCCG-3') es un cebador con extremo romo el cual agrega una mutación silente para eliminar el primer sitio Xhol. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'-GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTC CTCc AGAGCG-3') agrega un sitio Hindlll después del codón de detención y agrega una mutación silente para eliminar el segundo sitio Xhol. Ambos cebadores contenían bases extra en los extremos 5' para facilitar la digestión de enzimas de restricción. La plantilla para estos cebadores fue un vector a base de pKS+ (Stratagene) el cual contenía toda la secuencia de codificación para el gen Apo Al humano. La plantilla con doble hebra se eliminó mediante digestión Dpnl. El Fragmento PCR se digirió con Xhol y Hindlll y se ligó en los sitios Xhol/H ind 111 del plásmido pKS+ creando el plásmido P-10. El plásmido P-10 fue digerido con Xhol y Hindlll y el fragmento se ligó en los sitios Xhol/Hindlll del plásmido SBS4055 (figura 9). Se debe observar que SBS4055 contiene el promotor/terminador de ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 80:1897-1901) controlando la expresión de la estructura interna fusionada por la secuencia de señal PRS al anticuerpo D9 scFV. El plásmido también contiene un gen pat que confiere la resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70:25-37^ conducida por el promotor/terminador de ubiquitina del Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo32 es un clon que dirige pro-Apo Al a la estructura interna fusionada por la trayectoria de segregación al anticuerpo de oleosina D9 para llegar a la purificación. Apo33 Apo33 (SEQ ID NO:204) es un ción preferido de la semilla el cual se construye como para la figura 10. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo33 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de fusión PRS/D9 scFV/met/Apo Al (SEQ ID NO:205). D9 scFV/met/Apo Al fue dirigido para la expresión a través de la trayectoria de segregación utilizando el péptido de la señal de la frecuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8:217-221). Para construir este clon, el cebador directo 1203 (SEQ ID NO:173) (5'- GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3") agrega un sitio Ncol al inicio del Apo Al maduro. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'-GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTC CTCc AGAGCG-3') agrega un sitio Hindlll después del codón de detención y agrega una mutación silente para eliminar el segundo sitio Xhol. Ambos cebadores contenían bases extra en los extremos 5' para facilitar la digestión de enzimas de restricción. La plantilla para estos cebadores fue el plásmido P-10 (figura 9) el cual contiene la pro forma de Apo Al sin sitios Xhol internos. El fragmento PCR se digirió con Ncol y Hindlll y se ligó en los sitios Ncol/Hindlll del plásmido pSBS2090 creando el plásmido 20-2. El plásmido se cortó con Ncol y Hindlll y el fragmento se ligó en los sitios BspHI/HindIII del vector pSBS4010 creando el plásmido 4010 + 20-2. El plásmido se cortó con Xhol y Hindlll y el fragmento se ligó en los sitios SBS4055 del vector binario (figura 10). Se debe observar que SBS4055 contiene el promotor/terminador de ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80:1897-1901) controlando la expresión de la estructura interna fusionada por la secuencia de señal PRS al anticuerpo D9 scFV. El Plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina del Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo33 es un clon específico de la semilla que dirige Apo Al a la trayectoria de segregación y fusiona la estructura interna con el anticuerpo de oleosina D9 para llegar a la purificación. Apo34 Apo34 (SEQ ID NO:206) es un clon preferido de la semilla el cual se construye como para la figura 10. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el ción Apo34 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de fusión PRS/D9 scFV/met/Apo Al (SEQ ID NO:207). D9 scFV/met/Apo Al fue dirigido para la expresión a la trayectoria de segregación utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8:217-221). Para construir este clon, el cebador directo 1201 (SEQ ID NO:173) (5'- GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3') agrega un sitio Ncol al inicio del Apo Al maduro. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'-GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTC CTCc AGAGCG-3') agrega un sitio Hi nd I II después del codón de inicio y agrega una mutación silente para eliminar el segundo sitio Xhol. Ambos cebadores contenían bases extra en los extremos 5' para facilitar la digestión de enzimas de restricción. La plantilla para estos cebadores fue el plásmido P-10 (figura 9) que contiene la pro forma de Apo Al sin sitios Xhol internos. El Fragmento PCR se digirió con Ncol y Hindlll y se ligó en los sitios Ncol/Hindlll de SBS2090 (figura 3(B)) creando el plásmido 19-2. El plásmido se cortó con Ncol y Hindlll y el fragmento se ligó en los sitios BspHI/HindIII del vector SBS4010 creando el plásmido 4010 + 19-2. El plásmido se cortó con Xhol y Hindlll y el fragmento se ligó en los sitios Xhol/Hindlll del vector binario SBS4055 (figura 10). Se debe observar que SBS4055 contiene el promotor/terminador de ß-fáseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80:1897-1901) controlando la expresión de la estructura interna fusionada por la secuencia de señal PRS al anticuerpo D9 scFV. El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo34 es un clon específico de la semilla que dirige met/pro-Apo Al a la trayectoria de segregación y fusiona la estructura interna con el anticuerpo de oleosina D9 para llegar a la purificación. Apo35 Apo35 (SEQ ID NO:208) es un clon preferido de la semilla el cual se construye como para la figura 8. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo35 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de fusión PRS/D9 scFV/Apo AI/KDEL (SEQ ID NO:209). D9 scFV/Apo Al se dirigió para expresión a la trayectoria de segregación utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8:217-221) y la señal de retención KDEL (Munro y Pelham, 1987, Cell 48:899-907) se utilizó para retener el polipéptido en el ER. Para construir este clon, el cebador directo 1200 (SEQ ID NO:188) (5'- GCAGCACTGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA-3') agrega un sitio Xhol al inicio de pro-Apo Al. El cebador inverso 1208 (SEQ ID NO:210) (5'- AAGCTTTCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3') agrega una secuencia KDEL antes del codón de detención y un sitio Hindlll después del codón de detención. La Plantilla para estos cebadores fue el plásmido Apo33 que contiene la pro-forma de Apo Al sin los sitios Xhol internos y el residuo Met adicional. Los fragmentos PCR fueron cortados con Xhol y ligados en los sitios Xhol/EcoRV de pKS+ creando el plásmido 8-5. El plásmido 8-5 se cortó con Xhol y Hindlll y se ligó en los sitios Xhol/Hindlll del vector binario SBS4055 (figura 9). Se debe observar que SBS4055 contiene el promotor/terminador de ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80:1897-1901) controlando la expresión de la estructura interna fusionada a la frecuencia de señal PRS al inserto D9 scFV. El Plásmido también contiene un gen pat que confiere la resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina del Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo35 es un clon para la dirección específica de la semilla de Apo Al a la trayectoria de segregación y la purificación con el anticuerpo D9 scFV oleosín. Apo36 Apo36 (SEQ ID NO:211) es un clon preferido de la semilla el cual se construye como para la figura 11. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo36 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de fusión PRS/D9 scFV/pro-Apo AI/KDEL (SEQ ID NO:212). D9 scFV/pro-Apo Al se dirigió para expresión a la trayectoria de segregación utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8:217-221) y la señal de retención KDEL (Munro y Pelham, 1987, Cell 48:899-907) se utilizó para retener el polipéptido en el ER. Para construir este clon, ef cebador directo 1200 (SEQ ID NO:18d) (5'- GCAGCACTGAGcaagttcCGGCATTTCTGGCAGCAAGA-3') agrega un sitio Xhol y nucleótidos extra para facilitar la clonación de estructura interna en la secuencia de disociación klipd al inicio de pro-Apo Al. El cebador inverso 120d (SEQ ID NO:210) (5'- AAGCTTTCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3') agrega una secuencia KDEL antes del codón de detención y un sitio Hindlll después del codón de detención. La plantilla para estos cebadores fue el plásmido P-10 (figura 9) que contiene la pro-forma de Apo Al sin sitios Xhol internos. El fragmento PCR se cortó con Xhol y Hindlll y se ligó en los sitios Xhol/Hindlll de pKS+ creando el plásmido 7-12. El plásmido 7-12 fue cortado con Xhol y Hindlll y se ligó en los sitios Xhol/Hindl 11 del vector binario SBS4055 (figura 9). Se debe observar que SBS4055 contiene el promotor/terminador de ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 60:1897-1901) controlando la expresión de la estructura interna fusionada por la secuencia de señal PRS al inserto D9 scFV. El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina del Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo36 es un clon para la expresión específica de la semilla de pro-Apo Al dirigida a la trayectoria de segregación y es una estructura interna fusionada con el anticuerpo de oleosina D9 en el retículo endoplásmico debido a un péptido de señal KDEL. Apo37 Apo37 (SEQ ID NO:213) es un ción preferido de la semilla el cual se construye como para la figura 12. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo37 consiste en un promotor/terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de fusión PRS/D9 scFV/met/Apo AI/KDEL (SEQ ID NO:214). D9 scFV/met/Apo Al se dirigió para expresión a la trayectoria de segregación utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 6:217-221) y se utilizó la señal de retención KDEL (Munro y Pelham, 1987, Cell 48:899-907) para retener el polipéptido en el ER. Para construir este clon, el cebador directo 1203 (SEQ ID NO:173) (5'- GCAGCACCATGGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTG-3") agrega un sitio Ncol al inicio del Apo Al maduro. El cebador inverso 1208 (SEQ ID NO:210) (5'- AAGCTTTCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3') agrega una secuencia KDEL antes del codón de detención y un sitio Hindlll después del codón de detención. La plantilla para estos cebadores fue el plásmido P-10 (figura 9) que contiene la pro-forma de Apo Al sin sitios Xhol internos. Se ligó el Fragmento PCR en los sitios EcoRV de pKS+ creando el plásmido 10-2. El plásmido se cortó con Ncol y HindIII y el fragmento se ligó en los sitios BspHI/HindIII del vector SBS4010 creando el plásmido 4010 + 10-2. El plásmido se cortó con Xhol y Hindlll y el fragmento se ligó en los sitios Xhol/Hindlll del vector binario SBS4055 (figura 9). Se debe observar que SBS4055 contiene el promotor/terminador de ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 80:1897-1901) controlando la expresión de la estructura interna fusionada por la secuencia de señal PRS al inserto D9 scFV. El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina del Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) para transformación en Agrobacterium. El Apo37 es un clon que dirige met/Apo Al a la trayectoria de segregación y es una estructura interna fusionada con el anticuerpo de oleosina D9, y se acumula en el retículo endoplásmico debido a un péptido de señal KDEL. Apo38 Apo38 (SEQ ID NO:215) es un clon preferido de la semilla el cual se construye como para la figura 12. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo38 consiste en un promotor/terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de fusión PRS/D9 scFV/met/pro-Apo AI/KDEL (SEQ ID NO:216). D9 scFV/met/pro-Apo Al se dirigió para expresión a la trayectoria de segregación utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, d:217-221) y se utilizó la señal de retención KDEL (Munro y Pelham, 1987, Cell 48:d99-907) para retener el polipéptido en el ER. Para construir este clon, el cebador directo 1201 cebador directo 1201 (SEQ ID NO:177) (5'- GCAGCACCATGGggCGGCATTTCTGGCAGCAAGATG-3') agrega un sitio Ncol al inicio de pro-Apo Al. El cebador inverso 1208 (SEQ ID NO:210) (5'- AAGCTTTCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3') agrega una secuencia KDEL antes del codón de detención y un sitio Hindlll después del codón de detención. La plantilla para estos cebadores fue el plásmido P-10 (figura 9) que contiene la pro-forma de Apo Al sin sitios Xhol internos. Se ligó el Fragmento PCR en los sitios EcoRV de pKS+ creando el plásmido 9-2. El plásmido se cortó con Ncol y Hindlll y el fragmento se ligó en los sitios BspHI/HindIll del vector SBS4010 creando el plásmido 4010 + 9-2. El plásmido se cortó con Xhol y Hindlll y el fragmento se ligó en los sitios Xhol/Hindlll del vector binario SBS4055 (figura 9). Se debe observar que SBS4055 contiene el promotor/terminador de ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80:1697-1901) controlando la expresión de la estructura interna fusionada por la secuencia de señal PRS al inserto D9 scFV. El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina del Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) para transformación en Agrobacterium. El Apo38 es un clon que dirige met/pro-Apo Al a la trayectoria de segregación y es una estructura interna fusionada con el anticuerpo de oleosina D9, y se acumula en el retículo endoplásmico debido a un péptido de señal KDEL. Apo39 Apo39 (SEQ ID NO:217) es un clon preferido de la semilla el cual se construye como para la figura 13. Tal como se aprecia en la figura 2, el clon Apo39 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de la fusión PRS/D9 scFV/klip8/Apo Al (SEQ ID NO:218). D9 scFV/klip8/Apo Al se dirigió para la expresión a la trayectoria de segregación utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8:217-221) y se utilizó la señal de retención KDEL (Munro y Pelham, 1987, Cell 48:899-907) para retener el polipéptido en el ER. Este clon tiene una secuencia de disociación klipd (SEQ ID NO:143) para facilitar la disociación de la proteína de fusión con quimosina. Para construir este clon, el cebador directo 1207 (SEQ ID NO:219) (5'- GCAGCAGTCGACtATGGCTGAGATCACCCGCATTC-3') se elaboró en secuencia y agrega un sitio Salí al codón de inicio. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'-GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTC CTCcAGAGC G-3') agrega un sitio Hindlll después del codón de detención y agrega una mutación silente (se amplifica al inicio del klipd) para eliminar el segundo sitio Xhol. La plantilla para la reacción PCR fue el plásmido Apo27 (figura 8(A)). El producto PCR se cortó con Salí y Hindlll y se ligó en pKS+ creando el plásmidol 3-1. El plásmido se cortó con Salí y Hindlll y se ligó en los sitios Xhol/Hindlll del plásmido SBS4055 (figura 9). Se debe observar que SBS4055 contiene el promotor/terminador de ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80:1697-1901) controlando la expresión de la estructura interna fusionada a la frecuencia de señal PRS al inserto D9 scFV. . El Plásmido también contiene un gen pat que confiere la resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina del Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo39 es un clon para la expresión preferida para la semilla D9 scFV/klip8/Apo Al a la trayectoria de segregación. Se agregó la purificación de Apo Al utilizando el anticuerpo D9 scFV el cual tiene afinidad para la oleosina del cuerpo aceitoso. La proteína puede ser disociada utilizando quimosina la cual disocia el sitio klipd. Apo40 Apo40 (SEQ ID NO:220) es un clon preferido de la semilla el cual se construye como para la figura 13. Tal como se aprecia en la figura 2, el clon Apo40 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de la fusión PRS/D9 scFV/klip8/pro-Apo Al (SEQ ID NO:221). D9 scFV/klip8/pro-Apo Al se dirigió para la expresión a la trayectoria de segregación utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8:217-221) Este clon tiene una secuencia de disociación klipd (SEQ ID NO:143) para facilitar la disociación de la proteína de fusión con quimosina. Para construir este clon, el cebador directo 1207 (SEQ ID NO.219) (5'- GCAGCAGTCGACtATGGCTGAGATCA CCCGCATTC-3') se hizo en secuencia y agrega un sitio Salí al codón de inicio. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'-GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGT TGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGAGC G-3') agrega un sitio Hindlll después del codón de detención y agrega una mutación silente para eliminar el segundo sitio Xhol. La plantilla para la reacción PCR fue el plásmido Apo27 (figura d(A)). El producto PCR se cortó con Salí y Hindlll y se ligó en pKS+ creando el plásmido 14-5. El plásmido se cortó con Salí y Hindlll y se ligó en los sitios Xhol/Hindlll del plásmido SBS4055 (figura 9). Se debe observar que SBS4055 contiene el promotor/terminador de ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80:1897-1901) que controla la expresión de la estructura interna fusionada por la frecuencia señal PRS al inserto D9 scFV. El Plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador de del Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo40 es un clon para la expresión preferida de la semilla D9 scFV/klipd/pro-Apo Al dirigido a la trayectoria de secreción. La purificación de pro-Apo Al se logró utilizando el anticuerpo D9 scFV el cual tiene afinidad para la oleosina en el cuerpo aceitoso. La proteína puede ser disociada utilizando quimosina la cual disociará el sitio klipd. Apo41 Apo41 (SEQ ID NO:222) es un clon preferido de la semilla el cual se construye como para la figura 14. Tal como se aprecia en la figura 2, el clon Apo41 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de fusión PRS/D9 scFV/klipd/met/Apo Al (SEQ ID NO:223). D9 scFV/klip8/met/Apo Al se dirigió para expresión a la trayectoria de segregación utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8:217-221). Este clon tiene una secuencia de disociación klipd (SEQ ID NO:143) para facilitar la disociación de la proteína de fusión con quimosina. Para construir este clon, el cebador directo 1207 (SEQ ID NO:219) (5'- GCAGCAGTCGACtATGGCTGAGATCA CCCGCATTC-3') amplifica el inicio de la secuencia klip8 y agrega un sitio Salí al codón de inicio. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO: 174) (5'-GTGGTGAAGCTTTCACTGGGTGT TGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAGAGC G-3') agrega un sitio H i nd l II después del codón de detención y agrega una mutación silente para eliminar un segundo sitio Xhol. La plantilla para la reacción PCR fue el plásmido Apo25 (figura 6). El producto PCR se cortó con Salí y Hindlll y se ligó en pKS+ creando el plásmidol 1-1. El plásmido se cortó con Salí y Hindlll y se ligó en el sitio Xhol/Hindlll del vector binario SBS4055 (figura 9). Se debe observar que SBS4055 contiene el promotor/terminador de ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80:1897-1901) que controla la expresión de la estructura interna fusionada por la frecuencia de señal PRS a un inserto D9 scFV. El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 198d, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador del Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo41 es un clon para la expresión preferida de la semilla D9 scFV/klip8/met/Apo Al dirigido a la trayectoria de segregación. La purificación de met/Apo Al se logró utilizando un anticuerpo D9 scFV el cual tiene afinidad para la oleosina en el cuerpo aceitoso. La proteína se puede disociar utilizando quimosina la cual disociará el sitio klipd. Apo42 Apo42 (SEQ ID NO:224) es un clon preferido de la semilla el cual se construye como para la figura 14. Tal como se aprecia en la figura 2, el clon Apo42 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de la fusión PRS/D9 scFV/klip8/met/pro-Apo Al (SEQ ID NO:225). D9 scFV/klipd/met/pro-Apo Al se dirigió para la expresión a la trayectoria de segregación utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8:217-221). Este clon tiene una secuencia de disociación klipd (SEQ ID NO:143) para facilitar la disociación de la proteína de fusión con quimosina. Para construir este clon, el cebador directo 1207 (SEQ ID NO:210) (5'- GCAGCAGTCGACtATGGCTGAGATCA CCCGCATTC-3') amplifica el inicio de la secuencia klipd y agrega un sitio Salí al codón de inicio. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:174) (5'-GTGGTG AAGCTTTCACTGGGTGTTGAGCTTCTTAGTGTACTCCTCcAG AGCG-3') agrega un sitio Hindlll después del codón de detención y agrega una mutación silente para eliminar el segundo sitio Xhol. La plantilla para la reacción PCR fue el plásmido Apo26 (figura 7). El producto PCR se cortó con Salí y Hindlll y se ligó en pKS+ creando el plásmidol 2-1. El plásmido se cortó con Salí y Hindlll y se ligó en el sitio Xhol/Hindlll del vector binario SBS4055 (figura 9). Se debe observar que SBS4055 contiene el promotor/terminador de ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80:1897-1901) que controla la expresión de la estructura interna fusionada por la secuencia de señal PRS a un inserto D9 scFV. El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina procedente de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo42 es un ción para la expresión preferida de la semilla D9 scFV/klip8/met/pro-Apo Al dirigida a la trayectoria de secreción. La purificación de met/Apo Al se logró utilizando el anticuerpo D9 scFV el cual tiene afinidad para la oleosina del cuerpo aceitoso. La proteína puede ser disociada utilizando quimosina, la cual disociará el sitio klipd. Apo43 Apo43 (SEQ ID NO:226) es un clon preferido de la semilla el cual se construye como para la figura 13. Tal como se aprecia en la figura 2, el clon Apo43 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de fusión PRS/D9 scFV/klipd/Apo AI/KDEL (SEQ ID NO:227). D9 scFV/klipd/Apo Al se dirigió para la expresión a la trayectoria de segregación utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 6:217-221) y se utilizó la señal de retención KDEL (Munro y Pelham, 1987, Cell 48:899-907) para retener el polipéptido en el ER. Este clon tiene una secuencia de disociación klipd (SEQ ID NO.143) para facilitar la disociación de la proteína de fusión con quimosina. Para construir este clon, el cebador directo 1207 (SEQ ID NO:219) (5'-G C AG C AGTCGACtATGG CTG AGATC A CCCGCATTC-3') se elaboró en secuencia y agrega un sitio Salí al codón de inicio. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:210) (5'-AAGCTTTCAtagctcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3') agrega una secuencia KDEL antes del codón de detención y un sitio Hindlll después del codón de detención. La plantilla para la reacción PCR fue el plásmido Apo27 (figura 8(A)). El producto PCR se cortó con Salí y Hindlll y se ligó en pKS + creando el plásmidol 7-1. El plásmido se cortó con Salí y Hindlll y se ligó en los sitios Xhol/H ind II I del plásmido SBS4055 (figura 9). Se debe observar que SBS4055 contiene el promotor/terminador de ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80:1897-1901) que controla la expresión de la estructura interna fusionada por la secuencia de señal PRS al inserto D9 scFV. El Plásmido también contiene un gen pat que confiere la resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo43 es un clon para la expresión preferida de la semilla D9 scFV/klipd/Apo AI/KDEL dirigida a la trayectoria de segregación. Apo43 se acumulará en el ER, debido al péptido de señal KDEL. La purificación de Apo Al se logró utilizando el anticuerpo D9 scFV el cual tiene afinidad para la oleosina en el cuerpo aceitoso. La proteína puede ser disociada utilizando quimosina, la cual disociará el sitio klipd. Apo44 Apo44 (SEQ ID NO:22d) es un clon preferido de la semilla el cual se construye como para la figura 13. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo44 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de fusión PRS/D9 scFV/klip8/pro-Apo AI/KDEL (SEQ ID NO:229). D9 scFV/klip8/pro-Apo AI/KDEL se dirigió para expresión a la trayectoria de segregación utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 6:217-221) y se utilizó la señal de retención KDEL (Munro y Pelham, 1987, Cell 48:699-907) para retener el polipéptido en el ER. Este clon tiene una secuencia de disociación klipd (SEQ ID NO:143) para facilitar la disociación de la proteína de fusión con quimosina. Para construir este clon, el cebador directo 1207 (SEQ ID NO:219) (5'-GCAGCAGTCGACtATGGCTGAGATCA CCCGCATTC-3') se elaboró en secuencia y agrega un sitio Salí al codón de inicio. El cebador inverso 120d (SEQ ID NO:210) (5'-AAGCTTTCAtaactcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3') agrega una secuencia KDEL antes del codón de detención y un sitio Hindlll después del codón de detención. La plantilla para la reacción PCR fue el plásmido Apo28 (figura 9). El producto PCR se cortó con Salí y Hindlll y se ligó en pKS + creando el plásmido 18-2. El plásmido se cortó con Salí y Hindlll y se ligó en los sitios Xhol/Hindlll del plásmido SBS4055 (figura 9). Se debe observar que SBS4055 contiene el promotor/terminador de ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80:1897-1901) que controla la expresión de la estructura interna fusionada por la secuencia de señal PRS a un inserto D9 scFV. El plásmido también contiene un gen pat que confiere resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo44 es un clon para la expresión preferida de la semilla D9 scFV/klipd/pro-Apo AI/KDEL dirigido a la trayectoria de secreción. Apo44 se acumulará en el ER debido al péptido de señal KDEL. La purificación de pro-Apo Al se logró utilizando el anticuerpo D9 scFV el cual tiene afinidad para la oleosina en el cuerpo aceitoso. La proteína puede ser disociada utilizando quimosina, la cual disociará el sitio klipd. Apo45 Apo45 (SEQ ID NO:230) es un clon preferido de la semilla el cual se construye como para la figura 14. Tal como se aprecia en la figura 2, el ción Apo45 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de fusión PRS/D9 scFV/klip8/met/Apo AI/KDEL (SEQ ID NO:231). D9 scFV/klipd/met/Apo AI/KDEL se dirigió para expresión a la trayectoria de segregación utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 6:217-221) y se utilizó la señal de retención KDEL (Munro y Pelham, 1987, Cell 48:699-907) para retener el polipéptido en el ER. Este clon tiene una secuencia de disociación klipd (SEQ ID NO:143) para facilitar la disociación de la proteína de fusión con quimosina. Para construir este clon, el cebador directo 1207 (SEQ ID NO:219) (5'- G CAG C AGTCGACtATGG CTG AGATC A CCCGCATTC-3') amplifica el inicio de la secuencia klipd y agrega un sitio Salí al codón de inicio. El cebador inverso 1206 (SEQ ID NO:210) (5'- AAGCTTTCAtaactcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3') agrega una secuencia KDEL antes del codón de detención y un sitio Hindlll después del codón de detención. La plantilla para la reacción PCR fue el plásmido Apo25 (figura 6). El producto PCR se cortó con Salí y Hindlll y se ligó en pKS + creando el plásmido 15-1. El plásmido se cortó con Salí y Hindlll y se ligó en el sitio Xhol/H i nd 111 del vector binario SBS4055 (figura 9). Se debe observar que SBS4055 contiene el promotor/terminador de ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80:1897-1901) que controla la expresión de la estructura interna fusionada a la secuencia de señal PRS a un inserto D9 scFV. El Plásmido también contiene un gen pat que confiere la resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 1988, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo45 es un clon para la expresión preferida de la semilla de D9 scFV/klip8/met/Apo AI/KDEL dirigido a la trayectoria de secreción. Apo45 se acumulará en el ER debido al péptido de señal KDEL. La purificación de Apo Al se logra utilizando el anticuerpo D9 scFV el cual tiene afinidad para la oleosina en el cuerpo aceitoso. La proteína puede ser disociada utilizando quimosina, la cual disociará el sitio klipd. Apo46 Apo46 (SEQ ID NO:232) es un clon preferido de la semilla el cual se construye como para la figura 14. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo46 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (faseolina) que conduce la expresión de la proteína de fusión PRS/D9 scFV/klipd/met/pro-Apo AI/KDEL (SEQ ID NO:233). D9 scFV/klipd/met/pro-Apo Al se dirigió para expresión a la trayectoria de segregación utilizando el péptido de señal de la secuencia relacionada con patógeno de tabaco (PRS) (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 8:217-221) y se utilizó la señal de retención KDEL (Munro y Pelham, 1987, Cell 48:899-907) para retener el polipéptido en el ER. Este clon tiene una secuencia de disociación klipd (SEQ ID NO:143) para facilitar la disociación de la proteína de fusión con quimosina. Para construir este clon, el cebador directo 1207 (SEQ ID NO:219) (5'- GC AGC AGTCGACtATGG CTG AGATCACCCGCATTC-3') amplifica el inicio de la secuencia klipd y agrega un sitio Salí al codón de inicio. El cebador inverso 1208 (SEQ ID NO:210) (5'-AAGCTTTCAtaactcatctttCTGGGTGTTGAGCTTCTTAG-3' agrega una secuencia KDEL antes del codón de detención y un sitio Hindlll después del codón de detención. La plantilla para la reacción PCR fue el plásmido Apo26 (figura 7). El producto PCR se cortó con Salí y Hindlll y se ligó en pKS + creando el plásmido 16-4. El plásmido se cortó con Salí y Hindlll y se ligó en el sitio Xhol/Hindlll del vector binario SBS4055 (figura 9). Se debe observar que SBS4055 contiene el promotor/terminador de ß-faseolina de Phaseolus vulgaris (Slightom y asociados, 1983, Proc. Nati. Acad. Se. EUA 80:1897-1901) que controla la expresión de la estructura interna fusionada por la secuencia de señal PRS al inserto D9 scFV. El plásmido también contiene un gen pat que confiere la resistencia a fosfinotricina de la planta huésped (Wohlleben y asociados, 198d, Gene 70:25-37) conducida por el promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-664) para la transformación en Agrobacterium. Apo46 es un clon para la expresión preferida de la semilla de D9 scFV/klipd/met/pro-Apo Al dirigido a la trayectoria de secreción y retenido en el ER. La purificación de Apo Al se logra utilizando el anticuerpo D9 scFV el cual tiene afinidad para la oleosina en el cuerpo aceitoso. La proteína puede ser disociada utilizando quimosina, la cual disociará el sitio klipd. Apo47 Apo47 (SEQ ID NO:234) es un clon preferido de la semilla el cual se construye como para la figura 15. Tal como se puede apreciar en la figura 2, el clon Apo47 consiste en un promotor y terminador preferido de la semilla (linina) que conduce la expresión de la oleosina de maiz/klipd/met/Apo Al (SEQ ID NO:235). Esta construcción tiene una secuencia de disociación klipd (SEQ ID NO:143) para facilitar la disociación de la proteína de fusión con quimosina. Para construir este clon, el cebador directo 1226 (5'GCAGCACCATG_GCTGATCACCACCG-3') (SEQ ID NO.236) se utilizó para amplificar la secuencia de codificación de oleosina de maiz de pSBS2377 y agrega un sitio Ncol al inicio del gen en combinación con el cebador inverso 1227 (5'-GTGGTGAAGCTTAGACCCCTGCGCC-3') (SEQ ID NO:237) que elimina el codón de detención del gen y agrega un sitio Hindlll para ayudar a crear una fusión de traducción de la estructura interna con klipd/met/Apo Al. La secuencia de codificación de klipd/met/Apo Al procedente de Apo25 se amplificó utilizando el cebador directo 1228 (5'-GCAGCAAAGCTTATGGCTGAGATCAC-3') (SEQ ID NO:238) que amplifica la secuencia y agrega un sitio Hindlll al inicio del gen. El cebador inverso 1229 .GTGGTGGGATCCTCACTGGGTGTTG-3') (SEQ ID NO:239) agrega un sitio BamHl después del codón de detención. Los fragmentos PCR que contienen el cADN de la oleosina de maiz y klipd/met/Apo Al, se ligaron en los sitios EcoRI del vector de clonación Topo (Invitrogen). El plásmido MzOleo se cortó con enzimas de restricción Ncol y Hindlll. El plásmido klipd/met/Apo Al se cortó con Hindlll y BamH.l. Los fragmentos de MzOleo y klipd/met/Apo Al se ligaron juntos en los sitios Ncol y BamHl del plásmido SBS5709 para crear el plásmido Apo47. pSBS5709 contiene el promotor/terminador de linina procedente de la publicación WO 01/16340 flanqueando un sitio de clonación múltiple. pSBS5709 también contiene el gen pmi (Miles y asociados, 1984, Gene 21:41-48), que codifica la isomerasa de fosfomannosa que permite la selección positiva en el medio de selección que contiene mañosa. El gen pmi está bajo el control del promotor/terminador de ubiquitina de Petroselinum crispum (Kawaileck y asociados, 1993, Plant. Mol. Bio., 21:673-684) para la transformación en Agrobacterium. Apo47 es un clon para la dirección de la semilla de oleosina de maiz/klipd/met/Apo Al a los cuerpos aceitosos y la purificación utilizando la secuencia de disociación klipd. Ejemplo 2 Transformación de Agrobacterium y Arabidopsis Se utilizó Arabidopsis thaliana cv. Columbia (C24) para todos los experimentos. Las semillas se plantaron en la superficie de una mezcla de tierra (2/3 de tierra-Redi y 1/3 de perlita con un pH = 6.7) ó una mezcla de tierra de Arabidopsis suministrada por Lehle Seeds (perlita, verniculita, musgo, tierra verde, con pH = 5.5) en tarros de 10.16 cm (4 pulgadas). Los sembradíos se dejaron crecer hasta una etapa de roseta de 6 a 8 hojas con un diámetro de aproximadamente 2.5 cm. Estos sembradíos se transplantan en tarros de 10.16 cm (4 pulgadas) que contienen la mezcla de tierra anterior, se cubren con un material de pantalla de ventana el cual tiene 5 agujeros con diámetro de 1 cm cortados en la malla; uno en cada una de las esquinas, y uno en el centro. Los tarros se colocaron dentro de un domo a una temperatura de 4°C durante 4 días para un tratamiento en frío y subsecuentemente se movieron a una temperatura de 24°C, se crecieron en una habitación con luz constante en aproximadamente 150 µE y 50% de humedad relativa. Las plantas se irrigaron en un intervalo de 2 a 3 días y se fertilizaron semanalmente con 1% de Peters 20-20-20. Cada tarro contiene 5 plantas. Cuando las plantas alcanzan aproximadamente 2 cm de altura, se cortan los retoños primarios para estimular el crecimiento de los retoños secundarios y terciarios. Cuatro a cinco días después de cortar los primeros retoños, las plantas ya están listas para ser infectadas cpn Agrobacterium. El plásmido se transformó en Agrobacterium electro-competente EHA101. Los tarros con las plantas de Arabidopsis se invirtieron e infectaron con 500 ml de una re-suspensión en un cultivo de Agrobacterium durante la noche que contiene el vector de transformación de la planta de interés durante 20 segundos. Es importante que el cultivo de Agrobacterium contenga 5% de sacarosa y 0.05% de tensoactivo Silwet L-77 (Lehle Seeds). Los tarros se cubrieron subsecuentemente con un domo de plástico transparente durante 24 horas para mantener una humedad superior. Las plantas se dejaron crecer hasta madurarse y las semillas (no transformadas y transformadas) se recolectaron. Para la selección de las líneas transgénicas, se esterilizaron las semillas transformadas putativas en un lavado rápido con 70% de etanol, posteriormente blanqueador comercial al 20% durante 15 minutos y después se enjuagaron al menos 4 veces con ddH2O. Se mezclaron aproximadamente 1,000 semillas esterilizadas con 0.6% de ágar superior y se dispersaron de manera uniforme en una placa MS de resistencia media (Murashige y Skoog, 1962, Physiologia Plantarum 15: 473-497) que contiene 0.5% de sacarosa y 80 µM de la fosfinotricina herbicida (PPT) DL. Las placas posteriormente se colocaron en una habitación de crecimiento con un régimen de luz de oscuridad y 16 horas de luz a una temperatura de 24°C. Después de 7 a 10 días, los sembradíos transgénicos putativos son verdes y crecen mientras que se bleached los sembradíos no transformados. Después del establecimiento de las raíces, los sembradíos transgénicos putativos se transfieren en forma individual a tarros (las plantas se irrigan en forma individual en intervalos de 3 días y se fertilizan con Peters 20-20-20 al 1% en intervalos de 5 días) y se dejaron crecer hasta madurarse. Los tarros se cubrieron con un domo de plástico transparente durante 3 días para proteger los sembradíos sensibles. Después de 7 días, los sembradíos se cubrieron con un recolector de semilla de Lehle Seeds para evitar que las semillas se perdieran durante la scattering. Las semillas de otras plantas transgénicas se recolectaron en forma individual y se dejaron listas para un análisis. Preparación de Extracto de Hoja Total Se congeló una hoja de Arabidopsis con nitrógeno líquido y se molió en un tubo de micro-fuga de 1.5 ml utilizando un perforador. Se agregaron 200-250 µl de 0.5M Tris-HC1, pH 7.5 y la muestra se puso en hielo. Se agregó SDS al 20% en una concentración final de 2%. La muestra se hirvió durante 5 minutos y el extracto se giró en una micro-fuga a una velocidad máxima durante 15 minutos. El líquido se eliminó a otro tubo de micro-fuga y se almacenó a una temperatura de -20°C. Se cuantificaron las proteínas solubles utilizando el ensayo de proteína BCA (Píerce) y se analizaron en un SDS-PAGE al 15% seguido de un manchado Western. Se utilizó un anti-suero de conejo anti-Apo Al o anti-GFP como el anticuerpo primario; y se utilizó conjugado (Bio-Rad) anti-ratón-lgG [H + Lj-AP como el anti cuerpo secundario. Preparación de Extracto de Semilla Total Se molieron aproximadamente 40 semillas de Arabidopsis (semillaT2) en 50 µL de regulador (50 mM Tris pH 7.5) en un tubo de micro-fuga utilizando el mezclador de laboratorio Stir-Pak. Subsecuentemente se agregó SDS al 20% a la muestra en una concentración final del 2% y la muestra se hirvió durante 5 minutos y se centrífugo a velocidad máxima durante 5 minutos. Para la carga un gel SDS-PAGE, se agregaron a la muestra regulador de carga SDS-PAGE 2X (100 mM Tris pH 6.8, 20% de glicerol, 4% SDS, 2mg/mL de azul bromofenol, 200 mM DTT) y 1M DTT, se hirvieron durante 5 minutos y se centrifugaron a velocidad máxima durante 2 minutos. Ejemplo 3 Análisis de Manchado Western para expresión de apolipoproteína. Expresión constitutiva Apo17 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo17 (SEQ ID NO:27) es un proteína de fusión entre Apo Al y GFP maduro. Se utilizó un promotor y terminador de ubiquitina para la expresión constitutiva de la construcción. El análisis de manchado Western (figura 16(A)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal, detectó muy bajas cantidades (menor a 0.1% de proteína de hoja Total) de la proteína de fusión Apo-AI/GFP en un extracto de hoja total, en un peso molecular de aproximadamente 55 kDa en 9 de los 12 clones. Sin embargo, la expresión sustancial (al menos 1% de proteína de semilla total) de la proteína de fusión Apo17 se detectó en un extracto de semilla total (figura 16(B)) en aproximadamente 55 kDa en 11 de los 12 clones probados. Apo18a Tal como se aprecia en la figura 1, Apo18 (SEQ ID NO:29) es una proteína de fusión entre pro-Apo Al y GFP. Se utilizaron un promotor y terminador de ubiquitina para la expresión de la construcción. El análisis de manchado Western (figura 17(A)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal, detectó cantidades muy bajas (menor a 0.1% de la proteína de hoja total) de la proteína de fusión pro-Apo AI/GFP en un extracto de hoja total en un peso molecular de aproximadamente 56 kDa en 3 de los 12 clones probados. Se detectó la expresión sustancial (al menos 1% de la proteína de semilla total de la proteína de fusión AP18, en un extracto de semilla total (figura 17(B)) en aproximadamente 56 kDa en todos los clones probados. Apo19 Tal como se aprecia en el ejemplo 1, Apo19 (SEQ ID NO:31) es una proteína de fusión entre Apo Al y GFP. Se utilizó un promotor y terminador de ubiquitina para la expresión de la construcción y se utilizó el péptido de señal PRS para la expresión dirigida de la proteína de fusión al ER. El análisis de manchado Western (figura 18(A)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó niveles muy bajos (menor a 0.1% de la proteína de hoja total) de la proteína de fusión Apo AI/GFP en un extracto de hoja total en un peso molecular de aproximadamente 58 kDa en 10 de los 12 clones probados. Sin embargo, la expresión sustancial (al menos el 1% de la proteína de semilla total) de la proteína de fusión Apo19 fue detectada en un extracto de semilla total (figura 18(B)) en aproximadamente 58 kDa en 17 de los 18 clones probados. Apo20 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo20 (SEQ ID NO:35) es una proteína de fusión entre pro-Apo Al y GFP. Se utilizaron un promotor y terminador de ubiquitina para la expresión de la construcción y se utilizó el péptido de señal PRS para la expresión dirigida de la proteína de fusión al ER. El análisis de manchado Western (figura 19 (A)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó niveles muy bajos (menor a 0.1% de la proteína de hoja total) de la proteína de fusión pro-Apo AI/GFP en un extracto de hoja total en un peso molecular de aproximadamente 59 kDa en 3 de los 12 clones probados. Sin embargo, la expresión sustancial (al menos el 1% de la proteína de semilla total) de la proteína de fusión Apo20 se detectó en un extracto de semilla total (figura 19 (B)) en aproximadamente 59 kDa en 16 de los 18 clones probados. Expresión específica de la semilla Apo10 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo10 (SEQ ID NO:10) es una proteína de fusión entre pro-Apo Al y GFP maduro. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para la expresión específica de la semilla de la construcción. El análisis de manchado Western (figura 20 (A)), utilizando un anticuerpo GFP policlonal detectó la proteína de fusión Apo AI/GFP en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 55 kDa en 7 de los 10 clones probados. Apo11. Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, el Apo11 (SEQ ID NO:16) es una proteína de fusión entre pro-Apo Al y GFP. El promotor y terminador de faseolina se utilizan para la expresión específica de la semilla de la construcción. El análisis de manchado Western (figura 20(B)) utilizando un anticuerpo GFP policlonal detectó la proteína de fusión pro-Apo AI/GFP en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 56 kDa en 10 de los 14 clones probados. Apo12 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, el Apo12 (SEQ ID NO:19) es una proteína de fusión entre oleosina Apo Al maduro y GFP. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para la expresión específica de la semilla de la construcción. El análisis del manchado Western (figura 21(A)) utilizando el anticuerpo GFP policlonal, detectó la proteína de fusión Apo AI/GFP en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 74 kDa en los 17 clones probados. Apo13 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo13 (SEQ ID NO:21) es una proteína de fusión entre oleosina, pro-Apo Al y GFP. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para la expresión específica de la semilla de la construcción. El análisis de manchado Western (figura 21 (B)) utilizando el anticuerpo GFP policlonal detectó la proteína de fusión oleosina/pro-Apo AI/GFP en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 75 kDa en los 18 clones probados. Apo15 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo15 (SEQ ID NO:23) es una proteína de fusión entre Apo Al maduro y GFP. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para la expresión específica de la semilla de la construcción y se utilizó el péptido de la señal PRS para expresión dirigida de la proteína de fusión al sistema de secreción. El análisis de manchado Western (figura 22 (A)) utilizando el anticuerpo GFP policlonal detectó la proteína de fusión Apo AI/GFP en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 58 kDa en 9 de los 10 clones probados.

Apo16 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo16 (SEQ ID NO:25) es una proteína de fusión entre pro-Apo Al y GFP. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para la expresión específica de la construcción y se utilizó el péptido de señal PRS para la expresión dirigida de la proteína de fusión a la trayectoria de secreción. El análisis de manchado Western (figura 22 (B)) utilizando el anticuerpo GFP policlonal detectó la proteína de fusión pro-Apo AI/GFP en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 59 kDa en 10 de los 13 clones probados. Apo21 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo21 (SEQ ID NO:37) es Apo Al. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para la expresión específica de la semilla de la construcción. El análisis del manchado Western (figura 23(A)) utilizando el anticuerpo Apo Al policlonal se utilizó para detectar una proteína Apo Al en un extracto de semilla total. El peso molecular esperado fue de aproximadamente 28 kDa. En los 12 clones probados, se detectó un número de diferentes proteínas con el anticuerpo Apo Al que fluctúo desde aproximadamente 25 kDa hasta 55 kDa. Se debe apreciar que la expresión de Apo Al fue perjudicial para la salud de las plantas (por ejemplo, cascaras con extremo romo y la ausencia de semillas). Apo22 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo22 (SEQ ID NO:41) es pro-Apo Al. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción. El análisis de manchado Western (figura 23 (B)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal, se utilizó para detectar la proteína Apo Al en el extracto de semilla total. El peso molecular esperado fue de aproximadamente 29 kDa. En los 6 clones probados se detectó un número de diferentes proteínas con el anticuerpo Apo Al el cual fluctúa de aproximadamente 25 kDa hasta 55 kDa. El clon 22-3 tiene una proteína del peso molecular adecuado. Se debe observar que la expresión de pro-Apo Al fue hasta cierto punto perjudicial para la salud de las plantas con un fenotipo intermediario, en comparación con la salud de las plantas que expresan las construcciones Apo21, Apo29 y Apo30 versus Apo23. Apo23 " Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo23 (SEQ ID NO:44) es una proteína de fusión entre oleosina y Apo Al. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción. El análisis de manchado Western (figura 24(A)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó la proteína de fusión oleosina/Apo Al en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 47 kDa en 4 de los 5 clones probados. Apo24 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo24 (SEQ ID NO:46) es una proteína de fusión entre oleosina y pro-Apo Al. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción. El análisis de manchado Western (figura 24 (B)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó la proteína de fusión de oleosina/Apo Al en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 46 kDa en los 7 clones probados. Apo25 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo25 (SEQ ID NO:48) es una proteína de fusión entre oleosina y Apo Al( + Met) con una secuencia de disociación klipd que separa los dos componentes. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción. El análisis de manchado Western (figura 25(A)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó la proteína de fusión oleosina-klipd-Apo Al( + Met) en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 51 kDa en los 4 clones probados.

Apo26 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo26 (SEQ ID NO:51) es una proteína de fusión entre oleosina y pro-Apo Al( + Met) con una secuencia de disociación klipd que separa los dos componentes. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción. El análisis de manchado Western (figura 25(B)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó la proteína de fusión oleosina-klipd-proApo Al( + Met) en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en los 11 clones probados. Apo28 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo28 (SEQ ID NO:60) es una proteína de fusión entre oleosina y pro-Apo Al con una secuencia de disociación klipd que separa los dos componentes. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción. El análisis de manchado Western (figura 26(A)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal para detectar la proteína de fusión oleosina-klipd-pro-Apo Al en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 52 kDa en los 7 clones probados. Apo29 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo29 (SEQ ID NO:63) es Apo Al. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción y el péptido de señal PRS se utilizó para la expresión dirigida de la proteína a la trayectoria de secreción. Se utilizó el análisis de manchado Western (figura 26(B)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal para detectar la proteína de fusión Apo Al en un extracto de semilla total. El peso molecular esperado fue de aproximadamente 31 kDa. En los 10 clones probados, únicamente un clon tubo proteína detectada pero el peso molecular estuvo dentro del rango de 37 kDa. Se deberá apreciar que la expresión de Apo Al fue perjudicial para la salud de las plantas (por ejemplo, cascaras con extremo romo y la ausencia de semillas). Apo30 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo30 (SEQ ID NO:65) es pro-Apo Al. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción y el péptido de señal PRS se utilizó para la expresión dirigida de la proteína de fusión a la trayectoria de secreción. Se utilizó el análisis de manchado Western (figura 27) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal para detectar la proteína Apo Al en el extracto de semilla total. El peso molecular esperado fue de aproximadamente 32 kDa. En los 13 clones probados, se detectó un número de diferentes proteínas con el anticuerpo Apo Al el cual fluctuó de aproximadamente 25 kDa hasta 55 kDa. Se deberá apreciar que la expresión de pro-Apo Al fue perjudicial para la salud de las plantas (por ejemplo cascaras con extremo romo y la ausencia de semillas). Apo32 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo32 (SEQ ID NO:69) es una proteína de fusión entre el anticuerpo D9 scFV y pro-Apo Al. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción y el péptido de señal PRS se utilizó para la expresión dirigida de la proteína de fusión a la trayectoria de secreción. Se utilizó el análisis de manchado Western (figura 28(A)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó la proteína de fusión D9 scFV-pro-Apo Al en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 59 kDa en los 5 clones probados. Apo33 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo33 (SEQ ID NO:71) es una proteína de fusión entre el anticuerpo D9 scFV y Apo Al( + met). Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción y el péptido de señal PRS se utilizó para la expresión dirigida de la proteína de fusión a la trayectoria de secreción. Se utilizó el análisis de manchado Western (figura 26(B)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó la proteína de fusión D9 scFV-Apo Al( + met) en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 59 kDA en 1 de los 8 clones probados. Apo34 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo34 (SEQ ID NO:73) es una proteína de fusión entre el anticuerpo D9 scFV y pro-Apo Al( + met). Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción y el péptido de señal PRS se utilizó para la expresión dirigida de la proteína de fusión a la trayectoria de secreción. Se utilizó el análisis de manchado Western (figura 29) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó la proteína de fusión D9 scFV-p irio-Apo Al( + met) en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 59 kDa en 6 de los 7 clones probados. Apo36 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo36 (SEQ ID NO:78) es una proteína de fusión entre el anticuerpo D9 scFV y pro-Apo Al. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción y el péptido de señal PRS se utilizó para la expresión dirigida de la proteína de fusión a la trayectoria de secreción y se utilizó la señal de retención KDEL para retener el polipéptido en. el ER. Se utilizó el análisis de manchado Western (figura 30(A)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó la proteína de fusión D9 scFV-pro-Apo AI-KDEL en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 60 kDa en los 13 clones probados. Apo37 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo37 (SEQ ID NO:80) es una proteína de fusión entre el anticuerpo D9 scFV y pro-Apo Al( + met). Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción y el péptido de señal PRS se utilizó para la expresión dirigida de la proteína de fusión a la trayectoria de secreción y se utilizó la señal de retención KDEL para retener el polipéptido en el ER. Se utilizó el análisis de manchado Western (figura 30(B)) utilizando un anticuerpo Apo Al pol.iclonal detectó la proteína de fusión D9 scFV-Apo Al( + met) en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 59 kDa en los 15 clones probados. Apo38 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo38 (SEQ ID NO:82) es una proteína de fusión entre el anticuerpo D9 scFV y pro-Apo Al( + met). Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción y el péptido de señal PRS se utilizó para la expresión dirigida de la proteína de fusión a la trayectoria de secreción y se utilizó la señal de retención KDEL para retener el polipéptido en el ER. Se utilizó el análisis de manchado Western (figura 31A) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó la proteína de fusión D9 scFV-pro-Apo AI( + met)-KDEL en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 60 kDa en 9 de los 11 clones probados. Apo39 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo39 (SEQ ID NO:83) es una proteína de fusión entre el anticuerpo D9 scFV, KLIP8 y Apo Al. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción, se utilizo el péptido de señal PRS para la expresión dirigida de la proteína de fusión a la trayectoria de secreción y se utilizó KLIP8, como el enlazador di soc i able. Se utilizó el análisis de manchado Western (figura 31B) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó la proteína de fusión D9 scFV-KLIP8-Apo Al en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 55 kDa en los 12 clones probados.

Apo40 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo40 (SEQ ID NO:87) es una proteína de fusión entre el anticuerpo D9 scFV y pro-Apo Al con una secuencia de disociación klipd que separa los dos componentes. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción y el péptido de señal PRS se utilizó para la expresión dirigida de la proteína de fusión a la trayectoria de secreción. Se utilizó el análisis de manchado Western (figura 32(A)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó la proteína de fusión D9 scFV-klipd-pro-Apo Al en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 63 kDa en 12 de los 13 clones probados. Apo41 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo41 (SEQ ID NO:89) es una proteína de fusión entre el anticuerpo D9 scFV y Apo Al( + met) con una secuencia de disociación klipd que separa los dos componentes. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción y el péptido de señal PRS se utilizó para la expresión dirigida de la proteína de fusión a la trayectoria de secreción. Se utilizó el análisis de manchado Western (figura 32 (B)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó la proteína de fusión D9 scFV-klip8-Apo Al( + met) en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 63 kDa en 8 de los 9 clones probados. Apo42 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo42 (SEQ ID NO:91) es una proteína de fusión entre el anticuerpo D9 scFV y pro-Apo Al( + met) con una secuencia de disociación klipd que separa los dos componentes. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción y el péptido de señal PRS se utilizó para la expresión dirigida de la proteína de fusión a la trayectoria de secreción. Se utilizó el análisis de manchado Western (figura 33(A)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó la proteína de fusión D9 scFV-klipd-pro-Apo Al( + met) en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 64 kDa en los 13 clones probados. Apo44 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo44 (SEQ ID NO:95) es una proteína de fusión entre el anticuerpo D9 scFV y pro-Apo Al. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción y el péptido de señal PRS se utilizó para la expresión dirigida de la proteína de fusión a la trayectoria de secreción y se utilizó la señal de retención KDEL para retener el polipéptido en el ER. Se utilizó el análisis de manchado Western (figura 34(A)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó la proteína de fusión d9 SCfv-pro-Apo AI-KDEL en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 64 kDa en cuatro de los 15 clones probados. Apo45 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo45 (SEQ ID NO:97) es una proteína de fusión entre el anticuerpo D9 scFV y Apo Al( + met). Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción y el péptido de señal PRS se utilizó para la expresión dirigida de la proteína de fusión a la trayectoria de secreción y se utilizó la señal de retención KDEL para retener el polipéptido en el ER. Se utilizó el análisis de manchado Western (figura 34 (B)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó la proteína de fusión D9 scFV-Apo AI( + met)-KDEL en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 63 kDa en los 12 clones probados. Apo46 Tal como se puede apreciar en el ejemplo 1, Apo46 (SEQ ID NO:99) es una proteína de fusión entre el anticuerpo D9 scFV y pro-Apo Al( + met) con una secuencia de disociación klipd que separa a los dos componentes. Se utilizaron un promotor y terminador de faseolina para expresión específica de la semilla de la construcción y el péptido de señal PRS se utilizó para la expresión dirigida de la proteína de fusión a la trayectoria de secreción y se utilizó la señal de retención KDEL para retener el polipéptido en el ER. Se utilizó el análisis de manchado Western (figura 35(A)) utilizando un anticuerpo Apo Al policlonal detectó la proteína de fusión D9 scFV-klipd-pro-Apo AI( + met)-KDEL en un extracto de semilla total en un peso molecular de aproximadamente 64 kDa en 10 de los 11 clones probados. Ejemplo 4 Análisis de manchado Western para la localización de apolipoproteína. El aislamiento de los cuerpos aceitosos se llevó a cabo tal como se describió anteriormente (van Rooijen & Moloney, 1995) con las siguientes modificaciones. En síntesis, 250 mg de las semillas maduras secas fueron esterilizadas en la superficie con etanol al 70%, enjuagadas dos veces con agua estéril y una vez con un regulador de fosfato (100 mM pH 8 con 0.5M NaCI). Después del lavado, las semillas se resuspendieron en regulador de fosfato para análisis analítico y posteriormente se molieron utilizando un mortero esterilizado. Después del molido, la muestra se transfirió a una botella centrífuga y se centrifugó durante 15 minutos a 10,000 g a RT. Después de la centrifugación, la almohadilla de grasa que contiene los cuerpos aceitosos se eliminó de la fase acuosa (AQ) y se transfirió a un tubo de microfuga de 1.5 mL. Los cuerpos aceitosos se resuspendieron en un regulador de fosfato de baja rigurosidad (100 mM) regulador de fosfato, pH d con 0.5M NaCI). La muestra se centrífugo durante 15 minutos a 10,000 g a una temperatura de 4°C y se eliminó el subnadante. El subnadante (PW) y los cuerpos aceitosos (PO) lavados con fosfato se probaron con respecto a la presencia de la apolipoproteína. Los cuerpos aceitosos fueron resuspendidos subsecuentemente en un regulador de urea de baja rigurosidad (dM Urea en 100 mM de regulador de Na-Carbonato pH d). La muestra se centrífugo durante 15 minutos a 10,000 g a una temperatura de 4°C y se eliminó el subnadante. El subnadante (UW) y los cuerpos aceitosos lavados con urea (UO) se probaron con respecto a la presencia de la apolipoproteína. Se debe observar que los cuerpos aceitosos se trataron con lavados de alta y baja rigurosidad con el objeto de eliminar las proteínas que se asocian con los cuerpos aceitosos. La oleosina resiste lavados de alta rigurosidad y permanece con la fracción del cuerpo aceitoso. Se obtuvo la fracción microsomal (ER) moliendo aproximadamente 250 mg de las semillas secas en 4 ml de regulador de molido de microsomas (regulador 0.5M de sacarosa, 0.2 m Hepes-NaOH, pH 7.4), en una pasta con un mortero. La pasta se centrífugo a 10,000 g durante 30 minutos a una temperatura de 4°C. El sobrenadante se transfirió en tubos nuevos, y se centrífugo nuevamente en 10,000 g durante otros 30 minutos a una temperatura de 4°C para eliminar completamente los cuerpos aceitosos. Posteriormente el sobrenadante se centrífugo durante 2 horas a 100,000 g a una temperatura de 4°C utilizando un ultracentrífugo con un rotor de cubo de oscilación. El pellet se lavó con regulador de molido de microsoma, se centrífugo rápidamente durante 5 minutos 10,000 g y se resuspendió en 10-15 µl de regulador de molido de microsoma y se almacenó a una temperatura de -20°C. Construcciones no dirigidas Tal como se puede apreciar en la figura 36A, las fusiones Apo Al-GFP pro (Apo11) y maduras (Apo10) Apo Al-GFP sin señales de dirección adicionales, se revisaron en las diferentes fracciones. Apo10 muestra que mientras que la proteína de fusión Apo Al-GFP madura se detecta en todas las fracciones celulares, parece haber más acumulación de proteína con los cuerpos aceitosos lavados con amortiguador de fosfato y la fracción de lavado con urea. Esto sugiere que aunque Apo10 posee cierta afinidad para los cuerpos aceitosos, es suficiente un lavado de alta rigurosidad para eliminarla de la superficie de los cuerpos aceitosos. Apo11 muestra que la presencia de la prosecuencia nativa de Apo Al dirige la proteína de fusión Apo Al-GFP a la fracción del cuerpo aceitoso a un grado mayor que cuando falta el pro-péptido, y que la proteína permanece enlazado a los cuerpos aceitosos incluso cuando se utilizan lavados de alta rigurosidad. Parece que el péptido pro-Apo Al actúa como una secuencia "de anclaje", para mantener pro-Apo Al en la superficie de los cuerpos aceitosos. Se pueden detectar múltiples bandas de peso molecular inferior en estas fracciones, los cuales pueden ser productos de degradación. Construcciones dirigidas de cuerpo aceitoso. Este patrón de asociación ajustada de la proteína de fusión Apo Al-GFP con los cuerpos aceitosos también se puede observar en las construcciones dirigidas por los cuerpos aceitosos (figura 36B). Las fusiones de Apo Al-GFP pro(Apo13) y maduras (Apo12), se fusionan en la estructura interna al término-C de oleosina, lo cual sirve como una señal de dirección para los cuerpos aceitosos. Tal como se apreció previamente para la fusión Al-GFP pro no dirigida, la proteína se asocia predominantemente con las fracciones del cuerpo aceitoso lavadas con fosfato y urea. También se detectaron múltiples bandas de peso molecular ¡nferior en estas fracciones, lo que indica que existe algo único para las fracciones asociadas al cuerpo aceitoso, que conduce a una acumulación de posibles productos de degradación. Construcciones dirigidas del sistema de segregación El péptido de señal PRS (Sijmons y asociados, 1990, Bio/technology, 6:217-221)) que dirige las proteínas a la estructura de segregación, se agregó como una fusión de traducción en la estructura interna a las formas de Apo Al-GFP pro(Apo16) y madura (Apo15) (Figura 37). Normalmente, esto da como resultado la secreción de la proteína de fusión en el espacio extracelular (apoplasto) de las células de la planta. Sin embargo cuando las fracciones celulares de las dos construcciones fueron revisadas, se detectó la proteína de fusión Apo Al-GFP en todas las fracciones, habiéndose detectado más proteína en las fracciones del cuerpo aceitoso. También se puede observar una banda del tamaño de la proteína de fusión recombinante en las fracciones del cuerpo aceitoso, cuando se revisó el inmunomanchado teñido con Ponceau-S (figura 37, panel superior). La presencia de la pro-secuencia nativa de Apo Al no pareció cambiar la asociación de la proteína de fusión segregada con una fracción celular específica. El péptido de señal de reconocimiento de la presecuencia de planta (PRS) interfiere con la característica de "anclaje" del péptido pro-Apo Al. Expresión Constitutiva de Apo Al-GFP en las hojas El tejido de la hoja que expresó constitutivamente las formas pro y maduras segregadas y no dirigidas de Apo Al-GFP fue revisado para determinar si la proteína de fusión Apo Al-GFP se puede acumular en los tejidos que no producen aceite. Los tejidos de las hojas fueron homogeneizados (tal como se describió en el ejemplo 2) de las líneas de plantas transgénicas que expresan en forma constitutiva las formas de Apo Al-GFP no dirigidas pro-(Apold) y maduras (Apo17) y segregadas pro- (Apo20) y maduras (Apo19). El material de la hoja también fue muestreado de las plantas tipo natural (c24) para un control negativo y procedentes de plantas UR2 (oleosina-GFP conducida por ubiquitina) y plantas UG-14 (GFP conducido por ubiquitina) para controles positivos de la expresión de la hoja. Se separaron cantidades similares de proteína mediante SDS-PAGE y se detectó la proteína de fusión Apo Al-GFP mediante inmunomanchado con un anticuerpo anti-GFP (Figura 38 panel inferior). Se detectaron bandas tenues en la línea no transformada, en tanto que se detectó fácilmente la fusión tanto de GFP conducida por ubiquitina (UG-14) como de oleosina-GFP (UR2) en el inmunomanchado a través del anticuerpo anti-GFP. Sin embargo, aunque se cargó una cantidad similar de proteína de la hoja en el inmunomanchado tal como se puede apreciar en el manchado de Ponceau-S de la membrana (panel superior, Figura 38), no se detectaron bandas para cualesquiera de las construcciones de proteína de fusión Apo Al-GFP. La banda tenue detectada en el fondo del inmunomanchado, puede ser debido a la reactividad cruzada con Rubisco, la proteína más prevalente encontrada en el tejido de las hojas (Spreitzer RJ & Salvucci ME (2002) Rubisco: structure, regulatory interactions, and possibilities for a better enzyme. Annu Rev Plant Biol. 53:449-475), la cual se puede observar en el panel manchado con Ponceau-S del inmunomanchado por el tamaño (55 kDa) de acuerdo con los marcadores de peso molecular. Expresión específica de Apo Al no dirigida y segregada en semillas Se seleccionó una línea transgénica de cada una de las plantas transgénicas Apo Al de generación T2 que mostraron cierta acumulación de proteína ApoAl ya sea pro o madura en los extractos de semilla total. De las líneas de plantas que fueron transgénicas putativas, únicamente una línea mostró expresión de proteína: Apo21 (Apo Al madura no dirigida), Apo22 (pro-ApoAl no dirigida), y Apo29 (Apo Al madura segregada); se encontraron dos líneas para Apo30 (pro-Apo Al segregado). Todas las líneas de plantas transgénicas que contienen las construcciones Apo23 y Apo24, parecieron expresar y acumular la proteína de fusión oleosina-Apo Al. Se separaron cantidades similares de proteína mediante SDS-PAGE y se detectó proteína Apo Al mediante inmunomanchado con anticuerpo anti-Apo Al (figura 39). Se incluyó un control negativo para el inmunomanchado al preparar un extracto de proteína similar procedente de una planta no transformada (c24). El tamaño correcto de la banda de Apo Al expresada sola (peso molecular esperado de 28.3 kDa de Apo Al maduro y 29.3 kDa de pro-Apo Al) se observó únicamente en la línea Apo22-3 (pro-Apo Al no dirigido). La banda predominante detectada en Apo21-11 (Apo Al madura no dirigida) es el tamaño incorrecto, y aunque únicamente se detectaron bandas menores en APO29-11 (Apo Al madura segregada) y Apo30-14 (proApo Al segregada) ninguna tiene el tamaño correcto. Sin embargo, para ambas de las fusiones de oleosina, Apo23-11 (Apo Al de oleosina madura) y Apo24-6 (oleosina-pro-Apo Al), se detectó una cantidad significativa de proteína de fusión Apo Al mediante anticuerpo anti-Apo Al y también se puede detectar en el inmunomanchado teñido con Ponceau-S (panel superior). Localización subcelular de semillas T3 Apo Al (Apo22) no dirigida La expresión específica de la semilla de la pro forma de la proteína Apo Al (Apo22) no dirigida y su asociación con una fracción celular específica fue revisada en semillas maduras (figura 40). Las semillas se homogeneizaron y se trataron tal como se describió anteriormente, y las fracciones celulares fueron sometidas a inmunomanchado con un anticuerpo Apo Al. Apo22-3 muestra que la presencia de la pro-secuencia nativa de Apo Al, dirige la proteína Apo Al a la fracción de cuerpo aceitoso, y que la proteína requiere lavados de alta rigurosidad para eliminar la proteína de los cuerpos aceitosos. También se puede detectar parte de la proteína en la fase acuosa lo que indica que no toda la proteína por-Apo Al está asociada con los cuerpos aceitosos. Se pueden detectar múltiples bandas de peso molecular inferior en estas fracciones, las cuales pueden ser productos de degradación. Ejemplo 5 Microscopía confocal para localización de apolipoproteína. Se seccionaron embriones inmaduros de las cascaras Apo Al-GFP con agua estéril en un plato de Petri, utilizando fórceps y un microscopio de división. Los embriones se eliminaron de la cubierta de la semilla mediante la presión suave sobre las semillas inmaduras con una cubierta de corredera de microscopio de vidrio. Los embriones se transfirieron con pipeta en un tubo de microfuga de 1.5 mL agregándose agua hasta un volumen final de 1 mL. Se utilizó Rojo Nilo (Molecular Probes) en una concentración final de 1 µg/µL. Los embriones que se diluyeron en Rojo Nilo se dejaron incubar durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Los embriones se enjuagaron 3 veces en agua estéril y se montaron en agua sobre las correderas de vidrio del microscopio. Se prepararon células epidérmicas de hoja cortando simplemente pequeñas porciones de hoja (0.5cm2) con un bisturí y se montaron en agua en las correderas del microscopio con las correderas de cubierta. Se colocaron las secciones de la hoja de modo que la epidermis superior estuviera orientada hacia arriba (menos interferencia con cloroplastos autofluorescentes). Se analizó toda la fluorescencia dependiente de GFP de embriones de Arabidopsis y las células epidérmicas de hoja en agua para observaciones microscópicas y se revisaron con un microscopio confocal de exploración láser Zeiss LSM 510 (Edmonton, AB). Para la detección simultánea de GPF y Rojo Nilo, se ajustó un modo de rastreo simple de secuencia de línea con la exitación controlada por AOTF con luz de 48d nm y 543 nm, al 20% y 100%, respectivamente. Se utilizó un objetivo Plan-Appochromat 63x/1.4 Oil DIC con un zoom de exploración 5X. Se optimizó el agujero para pasador para el Canal 2 (verde) a 94 µm y para el Canal 1 (rojo) a 106 µm. Las micrográficas resultantes pueden ser observadas en las figuras 42 a 45. La localización conjunta (indicada con color amarillo) entre fusiones Al-GFP pro-Apo no dirigida (Apo11) y cuerpos aceitosos manchados con rojo Nilo, es evidente en la figura 41 (D-F). También existe una localización conjunta (indicada con color amarillo) entre Apo12, Apo Al madura fusionada a GFP dirigida a cuerpos aceitosos utilizando oleosina, (G-l de la figura 41) y Apo13, pro-Apo Al fusionada a GFP dirigido a cuerpos de aceite utilizando oleosina (A-C de figura 42). La localización conjunta (indicada con amarillo) entre las fusiones pro-Apo Al-GFP no dirigidas (Apo18) y cuerpos aceitosos manchados con rojo Nilo, es evidente en (D-F de la figura 43) entre la proteína de fusión Apo Al-GFP (Apo19) y los cuerpos aceitosos (G-H de la figura 43). No fue evidente la localización conjunta en las hojas en la figura 44. En conclusión, en la ausencia de un objetivo de cuerpo aceitoso (por ejemplo oleosina) se observa la localización conjunta de Apo Al únicamente en los embriones (en la presencia de lípido neutral) y únicamente cuando el pro-péptido de Apo Al se expresa en el citoplasma (por ejemplo, no cuando se segrega). Ejemplo 6 Disociación y análisis HPLC de Apo 25, 26 y 28 que expresa semilla de Arabidopsis Disociación de proteína recombinante de Apo25, Apo26 y Apo28. El aislamiento de los cuerpos aceitosos se llevó a cabo tal como se describió previamente (van Rooijen & Moloney, 1995) con las siguientes modificaciones. En síntesis, 250 mg de semillas maduras secas fueron esterilizadas en la superficie con etanol al 70%, enjuagadas dos veces con agua estéril y una vez con un regulador de fosfato (100 mM regulador de fosfato pH 6 con 0.5M NaCI). Después del lavado, las semillas fueron resuspendidas en regulador de fosfato para análisis analítico, y posteriormente molidas utilizando un mortero esterilizado. Después del molido, la muestra se transfirió a una botella centrífuga y se centrífugo durante 15 minutos a 10,000 a RT. Después de la centrifugación, la almohadilla de grasa que contiene los cuerpos aceitosos fue transferida a un tubo de microfuga de 1.5 mL y resuspendida en regulador de urea (8M Urea en 100 mM de regulador de Na-Carbonato pH 8). La muestra fue centrifugada durante 15 minutos a 10,000 g a una temperatura de 4°C y se eliminó el subnadante. La almohadilla de grasa fue resuspendida en ddH2O estéril, centrifugado durante 15 minutos a 10,000 g a una temperatura de 4°C y se eliminó el subnadante. Los cuerpos aceitosos fueron resuspendidos en 50 µL de ddH2O y almacenados en la oscuridad a una temperatura de 4°C. La reacción de disociación se llevó a cabo en un volumen de reacción de 20 µL que contiene 100 mM de regulador de fosfato, pH 4.5, con una proporción final de 1:100 de proteasa a la proteína del cuerpo aceitoso, a una temperatura de 37°C durante 2 horas. Una reacción de la muestra puede ser como se indica a continuación: se combinaron 20 µg de Apor25, Apo26, ó Apo28 purificado con 2 µL de 1M de regulador de fosfato pH 4.5 (concentración final 100mM), 2 µL de quimosina (0.1_g/_1) con ddH2O estéril para llevar a un volumen final de 20 µL. Después de 2 horas, la reacción de disociación fue centrifugada durante 15 minutos, y el sobrenadante fue eliminado de ia almohadilla de grasa y cada fase fue analizada con respecto a proteína recombinante. Purificación de Apo25, Apo26 y Apo28 mediante cromatografía de fase inversa Se disociaron aproximadamente 1000 µg de Apo25, Apo26, ó Apo28 mediante quimosina durante 2 horas a una temperatura de 37°C. Después que se completó la reacción de disociación, la reacción fue centrifugada durante 15 minutos a 10,000 g a una temperatura de 4°C y se recuperó el subnadante. La almohadilla de grasa fue resuspendida en un regulador de urea (8M Urea en 0.1 mM de regulador Na-Carbonato pH 8) y se centrífugo nuevamente durante 15 minutos. El subnadante o lavado fue recuperado, y los lavados se repitieron durante tres veces adicionales, siendo recuperado el subnadante cada vez y reunido en un tubo Falcon de 15 mL. Después que se completaron los lavados de urea los lavados de alicuotaron en tubos de microfuga de 1.5 mL, y se centrifugaron durante 15 minutos para eliminar cualquier residuo y contaminante del cuerpo aceitoso. Se recuperaron los sobrenadantes y se filtraron en un tubo Falcon de 15 mL nuevo utilizando un filtro de 0.2 mieras. Se equilibraron 5 mieras de sílice VYDAC 214TP54 C4(Grace Vydac, Anaheim, CA) mediante columna de cromatografía de fase inversa (0.24 X 25 cm) en regulador A (10% de acetonitrilo y 0.1% de ácido trifluoroacético) en un rango de flujo de 2 mL/min. Se cargó en la columna el subnadante de urea reunido Apo25, Apo26 ó Apo28* disociado con quimosina. Se agregó un gradiente lineal a la columna de 0 al 60% de regulador B (95% de acetonitrilo, 0.1% de ácido trifluoroacético) para la elusión de Apo Al. Se utilizó Apo Al (US Biological, Catalogue number A2299-10) como un estándar para la comparación de los productos disociados procedentes de Apo25, Apo26 y Apo26. Se recolectaron fracciones 19.6' a 20.8' (0.2' = 0.4 mL cada uno). Comparando las intensidades relativas de los trazos DAD en 214, 254, 280 & 326 nm, se indica que el material que se eluye en la zona 19.5-21.0' representa de manera más probable el polipéptido Apo Al (Figura 45A). Estos picos también se incrementan en intensidad en comparación con una inyección previa de 0.020 mL de la misma muestra. Para purificar el producto de disociación de Apo25 (oleosin- klipd-Apo Al(met+)), se recolectaron fracciones tratadas con quimosina de 7 a 25' @ 1 mL de cada uno. El pico de polipéptido mayor esta en 20.5' (figura 45B), el cual tiene solo 0.2' de madurez con respecto el estándar hApo Al sospechado. Para purificar el producto de disociación de Apo26 (olesin-klipd-pro-Apo Al(met + )), se recolectaron fracciones de 7 a 25' en 1 mL cada uno. El pico de polipéptido mayor está en 1d' (figura 45C), el cual es 2.4' más temprano que el estándar hApo Al sospechado. Para purificar el producto de disociación de Apo28 (oleosin-klip8-pro-Apo Al), se recolectaron fracciones de 7 a 25' en 1 mL cada uno. El pico de polipéptido mayor está en 18' (Figura 45D) el cual es 2.4' más temprano que el estándar hApo Al sospechado pero similar a la corrida de Apo26. Espectrometría de Masa Los espectros de masa fueron adquiridos en Doug Olson (National Research Council of Canadá, Plant Biotechnology Institute BioAnalitical Spectroscopy Group, Saskatoon, SK) en un instrumento de espectrometría de masa (Applied Biosystemas, Foster City, CA) de tiempo de ionización en vuelo de desapsorción láser ayudada por matriz STR (MALDI-TOF) de Applied Biosystems Voyager-DE. Las muestras se mancharon en un inserto OPI-TOF LC MADLI (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando una matriz de ácido sinapínico saturado en 30% de acetonitrilo/70%agua/0.1 % TFA. Los iones fueron acelerados en +20 kV y las masas se detectaron en un modo lineal, utilizándose mioglobina de corazón de caballo como un calibrador externo. La espectrometría de masa de ionización de electrorocío de la proteína Apo25 madura recombinante purificada, produjo una masa molecular de 28, 325 Da, la cual es 6 Da mayor al peso molecular calculado de 28, 319 Da. La diferencia en valor del valor observado al esperado, puede ser debido a un caso de conducción de muestra limitada para una proporción de señal a ruido disminuida y una precisión disminuida. El peso molecular esperado de Apo Al maduro es de 28, 187 Da, pero se debe a la presencia del residuo Met adicional, la proteína Apo Al madura recombinante disociada tiene un peso molecular incrementado. La proteína hApo Al estándar purificada también fue analizada mediante espectrometría de masa, y poseía dos picos distintos en 25, 969 Da y 22, 815 Da. Ambos de estos valores observados son significativamente inferiores al valor esperado de 28, 187 Da; sin embargo, estos dos pesos moleculares inferiores predominantes fueron observados previamente en los inmunomanchados. Es probable que esta sea una disminución en peso molecular que de cómo resultado un perfil de elusión ligeramente diferente de las proteínas humanas y recombinantes, tal como se puede apreciar mediante RP- HPLC. Ejemplo 7 Transformación de cártamo Este protocolo de transformación es similar al señalado en la publicación de Orlilcowska T.K. y asociados, (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 40:85-91), pero con modificaciones y mejorías tanto para la transformación S-317 como para la utilización de fosfinotricina como el marcador seleccionable. Las semillas descontaminantes de la variedad de cártamo California S-317, las cuales no fueron dañadas, desquebrajadas o afectadas, en 0.1% HCI2 durante 12 minutos seguido de 4 a 5 enjuagues con agua destilada estéril. El germinado estéril se sembró en la oscuridad en un medio MS (Murashige T. & Skoog F (1962) Physiol. Plant. 15: 473-497) con 1% de sacarosa y 0.25% de Gelrita. Se iniciaron los cultivos de Agrobacterium a partir de existencias de glicerol congeladas en 5 ml de medio líquido mínimo AB con selección de antibióticos, y se crecieron durante 48 horas a una temperatura de 28°C. Se creció una alícuota de este cultivo crecido durante la noche en 5 ml de caldo Luria con selección para transformación. Se lavaron 6 a 8 ml de células bacterianas dos veces con medio AB, y se elaboró hasta una densidad celular final de 0.4-0. (0D600). Se eliminaron cotiledones de dos días de edad de los sembradíos germinados, se gotearon en las células de Agrobacterium preparadas, y se plaquearon en un medio MS con 3% de sacarosa, 4 µM de N6-benciladenina (BA) y 0.8 µM de ácido naftalenoacético (NAA). Se incubaron placas a una temperatura de 21°C bajo condiciones de oscuridad. Después de 3 días, se transfirieron al mismo medio con 300 mg/L de timentina. Después de 4 días adicionales se movieron todos los cultivos a la luz. Después de 3 días, se colocaron los explantes en medio de selección con fosfinotricina agregada en 0.5 mg/L. Para continuar con la elongación del brote, se transfirieron las explantas semanalmente en un medio MS sin fitohormonas, pero con dos veces la cantidad basal de KNO3. Se cortaron las raíces y los botones que habían crecido más de 10 mm de la planta inicial y se crecieron individualmente en medio de selección. Para las raíces, se colocaron los botones verdes, que representan tejido transgénico putativo, en medio MS con 2% de sacarosa, 10 µM de ácido indolebutírico y 0.5 µM de NAA. Se transfirieron los botones enraizados a una mezcla de tierra drenada y se crecieron bajo alta humedad y 12 horas de luz. Ejemplo 8 Protocolo de transformación de lino Este procedimiento de transformación es similar al que se señala en la publicación de Dong J. and McHughen A.

(Plant Cell Reports (1991) 10:555-560), Dong J. and McHughen A. (Plant Sciences (1993) 13: 282-285). Se descontaminaron las semillas de lino, las cuales no habían sido dañadas, resquebrajadas, o afectadas en una solución de etanol al 70% durante de 5 a 7 minutos, seguido de 25 minutos en una solución de lejíal 50% con Tween 20 (3 a 4 gotas por 100ml) con agitación continua. Se enjuagaron las semillas 5 a 7 veces con agua destilada estéril. Se germinaron las semillas descontaminadas en la luz en un medio MS (Murashige T. & Skoog F (1962) Physiol. Plant. 15: 473-497) con 2% de sacarosa y 0.3% Gelrite® en jarras de magenta. Para la transformación, se crecieron durante la noche cultivos de Agrobacterium en caldo AB más el antibiótico adecuado para selección. Se lavaron 6 a 8ml células durante la noche, y se resuspendieron en 5 ml de caldo AB; se agregaron 2ml de este material de existencia a 98 ml de medio de inducción (medio basal MS con 3% de sacarosa, 5 µM de 6-bencilaminopurina (BA) y 0.25 µM de ácido acético de alfa-naftaleno (NAA) y se ajustó a un OD6oo final de 1.0. Se seccionaron explantes de hipocotilo y se inocularon en la solución de Agrobacterium preparada durante aproximadamente 4 horas (se agitaron placas suavemente 1 a 2 veces durante este período). Después del período de infección, se eliminaron los explantes del medio de inoculación líquido y se mancharon en papel de filtro estéril. Se plaquearon de 15 a 20 explantas en medio de inducción solidificado con agar al 0.7% en placas de cultivo de tejido. Se sellaron las placas con envoltura de plástico, y se cultivaron en conjunto explantas durante 48 horas bajo condiciones de luz (23-24°C). Después de 2 días, se transfirieron las explantes verdes, meristemáticas, al mismo medio que contiene 300 mg/L de Timentina (medio de pre-selección) y se envolvieron con envolturas de plástico. Después de tres días, se transfirieron los cultivos al medio anterior que contiene 10 mg/L de DL PPT (Selección 1). Se envolvieron las placas con Parafilm® y se incubaron a una temperatura de 24°C bajo condiciones de luz. Se transfirieron los cultivos cada dos semanas y se mantuvieron en este medio durante un mes. Para la elongación del retoño, se transfirieron los cultivos cada dos semanas en un medio de selección II (medio basal MS que contiene sacarosa al 2%, 500 mg/L de regulador MES, 300 mg/L de Timentina y 10 mg/L de DL PPT) en jarras de Magenta. Los retoños transformados putativos, los cuales sobrevivieron la selección, fueron color verde oscuro y formaron raíces vigorosas en de 7 a 10 días, cuando se plantaron individualmente en el medio de selección II. Se transfirieron los retoños enraizados a tierra mezclada de invernadero esterilizada en pequeños tarros y se cubrieron las plantas con copas de plástico claras para aclimatarse. Para maduración, se transfirieron las plantas que crecen activamente a tarros de un galón con mezcla de tierra bien drenada y se crecieron bajo condiciones de invernadero. Aunque la presente invención ha sido descrita con referencia a lo que actualmente se considera como los ejemplos preferidos, quedará entendido que la misma no se limita a los ejemplos descritos. Por el contrario, la presente invención pretende cubrir diversas modificaciones y ajustes equivalentes que estén incluidos dentro del alcance y espíritu de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente que se describen en la presente invención están incorporadas a la presente invención como referencia hasta el mismo punto como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual estuviera indicada de manera específica e individual como incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. Sumario de Secuencias La SEQ ID NO:1 y 2 establecen la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida, respectivamente, de la proteína pro-Apo Al de humano. La SEQ ID NO:3 y 4 establecen la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida, respectivamente, de la proteína Apo Al Milano de humano.

La SEQ ID NO:5 y 6 establecen la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida, respectivamente, de la proteína Apo Al Paris de humano. La SEQ ID NO:1, 7 y 8 son secuencias de Apolipoproteína humana conocidas que se describen en la tabla 1. La SEQ ID NO:9 a 24 son secuencias de Apolipoproteína A-l conocidas que se describen en la tabla 1. La SEQ ID NO:25 a 34 son secuencias de Apolipoproteína A-IV conocidas que se describen en la tabla 1. La SEQ ID NO:35-55 son secuencias de Apolipoproteína E conocidas que se describen en la tabla 1. La SEQ ID NO:56 establece la secuencia de ácido nucleico de una tioredoxina Arabidopsis thaliana. La SEQ ID NO:57 establece la secuencia de ácido nucleico de una proteína fluorescente verde soluble. La SEQ ID NO:58 establece la secuencia de aminoácido de una secuencia de señal PRS. La SEQ ID NO:59 a 116 son secuencias de proteína de cuerpos aceitosos de oleosina conocidas las cuales se describen en la tabla 3. La SEQ ID NO:117 a 129 son secuencias de proteína del cuerpo aceitoso de caleosina conocidas las cuales se describen en la tabla 3. La SEQ ID NO:130 a 137 son secuencias de proteína del cuerpo aceitoso de esteroleosina conocidas las cuales se describen en la tabla 3. La SEQ ID NO:13d establece una secuencia de proteína de cuerpo aceitoso de oleosina conocida de Arabidopsis thaliana. La SEQ ID NO:139 establece una secuencia de proteína de cuerpo aceitoso de oleosina conocida de Brassica napus. La SEQ ID NO:140 establece una secuencia de proteína de cuerpo aceitoso de caleosina conocida de Arabidopsis thaliana. La SEQ ID NO:141 establece una secuencia de proteína de cuerpo aceitoso de caleosina conocida de Arabidopsis thaliana. La SEQ ID NO:142 establece una secuencia de proteína de cuerpo aceitoso de ácido nucleico conocida de stereoleosin. La SEQ ID NO:143 establece la secuencia de nucleótidos de la secuencia de disociación klipd. La SEQ ID NO:144 y 145 establecen la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácido deducida, respectivamente del clon Apo10. La SEQ ID NO:146 establece la secuencia de nucleótidos del cebador directo 11d6 el cual es complementario a la región 5' de GFP y está diseñado para eliminar el sitio Ncol. La SEQ ID NO:147 establece la secuencia de nucleótidos del cebador inverso 1167 el cual es implementario a la región 3' de GFP y esta diseñado para agregar los sitios Pstl, Xbal y Hindlll después del codón de detención. La SEQ ID NO:148 establece la secuencia de nucleótidos del cebador directo 1190 el cual es complementario a la región 5' de Apo Al madura y está diseñada para agregar un sitio Ncol al inicio del gen. La SEQ ID NO:149 establece la secuencia de nucleótido del cebador inverso 1189 el cual es complementario a la región 5' de Apo Al madura y esta diseñado para eliminar el codón de detención del gen y agregar un sitio BarnHI para ayudar a crear una fusión de traducción en estructura con GFP. La SEQ ID NO:150 y 151 establecen las secuencias de nucleótidos y de aminoácido deducidas, respectivamente del clon Apo11. La SEQ ID NO:152 establece la secuencia de nucleótidos del cebador directo 1191 el cual es complementario a la región 5' de pro-Apo Al y esta diseñado para agregar un sitio Ncol al inicio del gen.

La SEQ ID NO:153 y 154 establecen las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducido, respectivamente del clon Apo12. La SEQ ID NO:155 y 156 establecen las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducido, respectivamente del clon Apo13. La SEQ ID NO:157 y 158 establecen las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducido, respectivamente del clon Apo15. La SEQ ID NO:159 y 160 establecen las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducido, respectivamente del clon Apo16. La SEQ ID NO:161 y 162 establecen las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducido, respectivamente del clon Apo17. La SEQ ID NO:163 y 164 establecen las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducido, respectivamente del clon Apo18. La SEQ ID NO:165 y 166 establecen las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducido, respectivamente del clon Apo19. La SEQ ID NO:167 establece la secuencia de nucleótidos del cebador directo 1177 el cual es complementario de la región 5' de PRS/Apo Al (clon Apo15) y esta designado para amplificar el inicio de la presecuencia de planta (PRS) la cual contiene un sitio BspHI en el codón de inicio. La SEQ ID NO:168 establece la secuencia de nucleótidos del cebador inverso 1178 el cual es complementario a la región 3' de Apo Al y esta designado para eliminar el codón de inicio del gen y agregar un sitio BarnHI para ayudar a crear una fusión de traducción en-estructura con GFP. La SEQ ID NO:169 y 170 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo20. La SEQ ID NO:171 y 172 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo21. La SEQ ID NO:173 establece la secuencia de nucleótidos del cebador directo 1203 el cual es complementario a la región 5' de Apo Al y esta diseñado para agregar un sitio Ncol al inicio del Apo Al maduro. La SEQ ID NO:174 establece la secuencia de nucleótidos del cebador inverso 1206 el cual es complementario a la región 3' de Apo Al y esta diseñado para agregar un sitio Hindlll después del codón de detención. La SEQ ID NO:175 y 176 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo22. La SEQ ID NO:177 establece la secuencia de nucleótidos del cebador directo 1201 el cual es complementario a la región 5' de pro Al y esta designado para agregar un sitio Ncol al inicio de pro-Apo Al. La SEQ ID NO:178 y 179 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo23. La SEQ ID NO:180 y 181 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo24. La SEQ ID NO:182 y 183 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo25. La SEQ ID NO:184 y 185 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo26. La SEQ ID NO:186 y 1d7 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo27. La SEQ ID NO:188 establece la secuencia de nucleótidos del cebador directo 1200 el cual es complementario a la región 5' de Apo Al madura y esta diseñado para agregar un sitio Xhol y nucleótidos extra para facilitar la clonación en estructura en la secuencia de disociación klipd al inicio de pro-Apo Al. La SEQ ID NO:189 y 190 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo27M. La SEQ ID NO:191 establece la secuencia de nucleótidos del cebador directo 1202 el cual es complementario a la región 5' de Apo Al de humano, agregar un sitio Xhol y nucleótidos extra para facilitar la clonación en estructura en la secuencia de disociación klipd al inicio de mat-Apo Al. La SEQ ID NO:192 establece la secuencia de nucleótidos del cebador directo 1225 y es un cebador con extremo blunt que realiza una mutación de par base de C a T, para cambiar un residuo Arg en un residuo Cys, creando de esta forma la mutación Apo-Milano. La SEQ ID NO:193 y 194 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo2d. La SEQ ID NO:195 establece la secuencia de nucleótidos del cebador directo 1205 el cual es complementario a la región 5' de pro-Apo All y esta diseñado para ser un cebador con extremo blunt el cual agrega una mutación silente para eliminar el primer sitio Xhol. La SEQ ID NO:196 y 197 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo29. La SEQ ID NO:198 y 199 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo30. La SEQ ID NO:200 y 201 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo31. La SEQ ID NO:202 y 203 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo32. La SEQ ID NO:204 y 205 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo33. La SEQ ID NO.206 y 207 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo34. La SEQ ID NO:208 y 209 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo35. La SEQ ID NO:210 establece la secuencia de nucleótidos del cebador inverso 1208 el cual es complementario a la región 3' de pro-Apo Al y esta diseñado para agregar una secuencia KDEL antes del codón de detención y un sitio Hind 111 después del codón de detención.

La SEQ ID NO:211 y 212 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo36. La SEQ ID NO:213 y 214 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo37. La SEQ ID NO:215 y 216 establecen la secuencia de n ucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo36. La SEQ ID NO:217 y 218 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo39. La SEQ ID NO:219 establece la secuencia de nucleótidos del cebador di riecto 1207 el cual es complementario a la región 5' de la secuencia de disociación klipd y esta diseñado para amplificar el inicio de la secuencia klip8 y agregar un sitio Salí al codón de inicio.

La SEQ ID NO:220 y 221 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo40. La SEQ ID NO:222 y 223 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo41. La SEQ ID NO:224 y 225 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo42. La SEQ ID NO:226 y 227 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente,, del clon Apo43. La SEQ ID NO:228 y 229 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo44. La SEQ ID NO:230 y 231 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo45. La SEQ ID NO:232 y 233 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo46. La SEQ ID NO:234 y 235 establecen la secuencia de nucleótidos y aminoácido deducida, respectivamente, del clon Apo47. La SEQ ID NO:236 establece la secuencia de nucleótidos del cebador directo 1226 la cual es complementaria a la región 5' de la secuencia de oleosina de maíz y esta designada para amplificar la secuencia de oleosina de maíz y agregar un sitio Ncol al codón de inicio.

La SEQ ID NO:237 establece la secuencia de nucleótidos del cebador directo 1227 el cual es complementario a la región 3' de la secuencia de oleosina de maíz y esta designada para amplificar la oleosina de maíz, eliminar el codón de detención del gen y agregar un sitio Hindlll para ayudar a crear una fusión de traducción en estructura con klipd/matApo Al. La SEQ ID NO:238 establece la secuencia de nucleótidos del cebador directo 1228, la cual es complementaria a la región 5' del clon Apo25 y esta diseñado para amplificar la secuencia Apo25 y agregar un sitio Salí al codón de inicio. La SEQ ID NO:239 establece la secuencia de nucleótidos del cebador inverso 1229, la cual es complementaria a la región 3' del clon Apo25 y esta diseñado para amplificar la secuencia Apo25 y agregar un sitio BarnHI después del codón de detención. La SEQ ID NO:240 establece la secuencia de aminoácidos del anticuerpo D9scFV de cadena simple. La SEQ ID NO:241 a 251 son secuencia AV Apolipoproteína conocidas que se describen en la tabla 1.

Tabla 1 : Ejem plos de Secuencia de Apolipoproteína SECUENCIA ID. NO. FUENTE DE APOLIPOPROTEINA (Número de Acceso) Apolipoproteina A-I 1 Humano (NM 000039, BC005380, J00098, M11791, M27875, M29068, X00566, X01038, X02162, X07496) 9 Danto rerio (NP_571203) 10 attus norvegious (P04639) 11 Bos taurus (P15497) 12 Mus muscuhjs (Q00623) 13 Ovis aries (AAB57840) 14 Sus scrofa (P18648) 15 Cypripus carpió (CAC34942) 16 Gallus gallus (AAA48593) 17 Oryctolagus cuniculus (P09809) 18 Macaca fascicularis (P15568) 19 Coturnix japónica (P32918) 20 Canis famlliaris (P02648) 21 Tupaia belangeri (018759) 22 Anas platyrhynchos (042296) 23 Papio anubis (AAA35380) 24 Macaca mulatto (P14417) Apolipoproteina A-IV 7 Humano (NM 0000482, J02758, M10373, M13654, M14566, M14642, X13629, P0672) 25 Rattus norvegicus (AAA85909) 26 Mus musculus (P06728) 27 Mus musculus catapeus (AAA37216) 28 Sus scrofa (046409) 29 Papio apubis (Q28758) 30 Macaca fasclcularis (P336321) 31 Pan trogtodytes (154248) 32 Papio sp. (A47141) 33 Gillichthys mirabilis (AAG13299) 34 Oryctolagus cuniculus (AAB34783) Apolipoproteina A-V 241 Mus musculus (NM 080434) 242 Rattus norvegicus (NM_080576) 243 Homo sapiens (NP_443200) 244 Mus musculus (BC011198) 245 Homo saplesn (AY555191 ) 246 Homo sapiens (AY422949) 247 Mus musculus (AF327059) 248 Homo sapiens (AF202890) Tabla 2 Ejemplos de mutaciones y modificaciones de apolipoproteína conocidas Tabla 3: Ejemplos de secuencias de proteína de cuerpo aceitoso conocidas

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S 1.- Un método para la expresión de apolipoproteína en plantas en donde el método comprende: (a) proporcionar una construcción de ácido nucleico que está comprendido en la dirección 5' a 3' de la trascripción, en la forma de componentes: (i) secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en células de plantas; y (ii) secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína. (b) introducir una construcción de ácido nucleico quimérica en una célula de planta; (c) crecer la planta en una planta madura en donde la planta expresa apolipoproteína. 2.- Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico quimérica se introduce en la célula de planta bajo condiciones de integración genómica nuclear. 3.- Un método de conformidad con la reivindicación 1 ó 3, caracterizado porque la célula de planta es una semilla. 4.- Un método de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3 caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico tiene la capacidad de controlar la expresión en las células de planta, es un promotor preferido de la semilla. 5.- Un método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el promotor preferido de la semilla es un promotor de faseolina. 6.- Un método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que tiene la capacidad de controlar la expresión en las células de planta, es un promotor constitutivo. 7.- Un método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el promotor constitutivo es un promotor de ubiquitina. d.- Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la construcción de ácido nucleico quimérico comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de estabilización enlazado a una estructura de lectura a la secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína. 9.- Un método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el polipéptido de estabilización es específico de la planta. 10.- Un método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el polípéptido de estabilización no es específico de la planta. 11.- Un método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el polipéptido de estabilización específico de la planta es una proteína de cuerpo aceitoso, o una tioredoxina o fragmento del mismo. 12.- Un método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la proteína de cuerpo aceitoso es seleccionado del grupo que consiste en oleosina, caleosina y esteroleosina. 13.- Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la oleosina, caleosina y esteroleosina son de Arabidopsis thalania. 14.- Un método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la tioredoxina es SEQ ID NO:56. 15.- Un método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polipéptido de estabilización no específico de la planta es una proteína fluorescente verde o un anticuerpo de cadena simple o fragmento del mismo. 16.- Un método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polipéptido de estabilización no específico de la planta es un codón optimizado para la expresión óptima en plantas. 17. Un método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la proteína fluorescente verde es SEQ ID NO:57. 18. Un método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo de cadena simple tiene la capacidad de facilitar la purificación de apolipoproteína expresada en semillas. 19. Un método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo de cadena simple tiene la capacidad de asociarse en forma específica con una proteína de cuerpo aceitoso. 20. Un método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo de cadena simple es un anticuerpo Fv de cadena simple con la capacidad de asociarse en forma específica con la oleosina 18 kDa de Arabidopsis thaliana (D9scFv). 21. Un método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo de cadena simple es SEQ ID NO:240. 22. Un método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el polipéptido de estabilización está enlazado a la apolipoproteína a través de un enlazador disociable. 23. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el enlazador disociable es una prosecuencia de quimosina. 24. Un método de conformidad con la reivindicación r 23, caracterizado porque la prosecuencia de quimosina es SEQ ID NO.143. 25. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico quimérica comprende además una señal de dirección con la capacidad de dirigir la apolipoproteína al ER ó a una vesícula de almacenamiento derivada de ER. 26. Un método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la vesícula de almacenamiento derivada de ER es un cuerpo aceitoso y la secuencia de dirección codifica la proteína de cuerpo aceitoso. 27. Un método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la señal de dirección comprende un motivo de retención ER de terminal-C. 28. Un método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el motivo de retención-ER de terminal-C es KDEL. 29. Un método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la construcción de ácido nucleico quimérica comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal que tiene la capacidad de dirigir el polipéptido de apolipoproteína al apoplasto. 30. Un método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el péptido de señal es una secuencia de señal de proteína relacionada con patogénesis de tabaco (PR-S). 31. Un método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la secuencia de señal PR-S es SEQ ID NO:58. 32. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 31, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína es seleccionada del grupo de secuencias de ácido nucleico que consisten en apolipoproteína humana, pro-apolipoproteína humana, apolipoproteína de porcino, pro-apolipoproteína de porcino, apolipoproteína de bovino y pro-apolipoproteína de bovino. 33. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 32, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína es optimizada para uso en codón de planta. 34. Un método para obtener semilla de planta que comprende apolipoproteína, en donde el método comprende: (a) proporcionar la construcción de ácido nucleico quimérica que está comprendida en la dirección 5' a 3' de la transcripción, en la forma de componentes enlazados en forma operable; (i) una secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en células de semilla de plantas; y (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína', (b) introducir la construcción de ácido nucleico quimérica en una célula de planta; y (c) crecer la célula de la planta en una planta madura; obtener el tejido de la planta, en donde la semilla comprende apolipoproteína; (d) obtener la semilla de la planta, en donde la semilla comprende apolipoproteína. 35. Una planta que comprende una secuencia de ácido nucleico quimérica que está comprendida en la dirección 5' a 3' de la transcripción: (a) una primera secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en una planta enlazada en forma operable a la misma; (b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína, en donde los contenidos son de apolipoproteína. 36. Una planta de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico quimérica está integrada en el genoma nuclear de la planta. 37. Una planta de conformidad con la reivindicaciones 1 a 36, caracterizado porque la planta que se utiliza es una planta de Arabidopsis o cártamo. 38. Una semilla de planta que comprende una secuencia de ácido nucleico quimérica comprendida en la dirección de 5' a 3' de la transcripción: (a) una primera secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en una semilla de la planta enlazada en forma operable a la misma; (b) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína. 39. Una composición que comprende cuerpos aceitosos substancialmente puros que comprenden apolipoproteína obtenida de las plantas. 40. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la apolipoproteína enlazada a la secuencia de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en una célula de la planta. 41. Una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque la célula de la planta es una célula de semilla. 42. Una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que tiene la capacidad de controlar la expresión en una célula de planta, es un promotor preferido de la semilla. 43. Un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el promotor preferido de la semilla es el promotor de faseolina. 44. Una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en las semillas de la planta, es un promotor constitutivo. 45. Una secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el promotor es el promotor de ubiquitina. 46. Un vector de expresión recombinante adecuado para la expresión en una célula de planta que comprende la secuencia de ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones de la 1 a la 45. 47. Un método para preparar apolipoproteína substancialmente pura, en donde el método comprende: (a) proporcionar una construcción de ácido nucleico quimérica que está comprendida en la dirección 5' a 3' de la transcripción, en la forma de componentes enlazados en forma operable; (i) una secuencia de ácido nucleico con la capacidad de controlar la expresión en células de semilla de planta; y (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína; (b) introducir la construcción de ácido nucleico quimérica en una célula de planta; y (c) crecer la célula de la planta en una planta madura; y (d) obtener la semilla de la planta, en donde la semilla comprende apolipoproteína; (e) separar la apolipoproteína de los constituyentes de la semilla de la planta para obtener apolipoproteína substancialmente pura. 48. El uso de una planta preparada de conformidad con las reivindicaciones de la 1 a la 38, para obtener apolipoproteína esencialmente pura. 49. Una composición que comprende apolipoproteína substancialmente pura obtenida de una planta. R E S U M E N Se describen métodos para la producción de una apolipoproteína en plantas. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para la expresión de apolipoproteína en plantas que comprenden: (a) proporcionar una construcción de ácido nucleico quimérica comprendida en la dirección 5' a 3' de la transcripción, en la forma de componentes enlazados en forma operable: (i) una secuencia de ácido nucleico con la capacidad de contralar la expresión en células de plantas; y (ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de apolipoproteína; (b) introducir la construcción de ácido nucleico quimérica en una célula de la planta; y crecer la célula de la planta en una planta madura con la capacidad de fijar la semilla, en donde la semilla expresa apolipoproteína.