NL8901932A

NL8901932A - Produktie van heterologe eiwitten in planten of plantecellen.

Info

Publication number: NL8901932A
Application number: NL8901932A
Authority: NL
Original assignee: Mogen Int
Priority date: 1989-07-26
Filing date: 1989-07-26
Publication date: 1991-02-18
Also published as: US5763748A; US5650307A; JPH04502861A; EP0436003A1; US5716802A; WO1991002066A1

Description

Titel: Produktie van heterologe eiwitten in planten of plantecellen

Gebied van de uitvinding

De uitvinding ligt op het gebied van de recombinant DNAtechnologie, meer in het bijzonder recombinant DNA technologiein verband met de genetische manipulatie van planten en heeftbetrekking op een werkwijze voor het produceren van eiwittenof polypeptiden met behulp van genetisch gemanipuleerdeplanten of plantecellen, alsmede op de genetisch gemanipu¬leerde planten en plantecellen zelf (met inbegrip van onder¬delen van de genetisch gemanipuleerde planten), het heterologeeiwitmateriaal (bijv. een eiwit, polypeptide, e.d.) dat metbehulp van deze genetisch gemanipuleerde planten of plante¬cellen kan worden geproduceerd, en de recombinante poly-nucleotiden (DNA of RNA) welke voor de genetische manipulatiekunnen worden gebruikt.

Stand van de techniek Eén van de resultaten van de biotechnologie is de ont¬wikkeling van nieuwe productiemethoden voor eiwitten. Hierdooris het mogelijk om op preparatieve schaal recombinant-DNAbevattende microorganismen eiwitten te laten produceren diedeze organismen niet van nature, of van nature niet in zulkehoeveelheden kunnen maken. Recente voorbeelden zijn met nameinsuline, diverse interferon-typen en menselijk groeihormoondie in winbare hoeveelheden door onder meer bacteriën engistcellen worden geproduceerd.

Kenmerkend voor deze voorbeelden is het feit dat het hiervaak om relatief simpele polypeptiden gaat die geen co- ofpost-translationele verwerking ("processing") in de cel hoevente ondergaan om hun uiteindelijke vorm en biologische functiete krijgen. Voor een groot aantal complexere eiwitten vanhogere organismen is een dergelijke verwerking van belang voorhet functioneren van die eiwitten. Zij moeten bijvoorbeeld op de juiste manier worden geglycosyleerd of een membraanpassageondergaan waarbij signaalpeptides van een voorloper (hetprecursor-eiwit) worden afgesplitst. In prokaryote micro-organismen is dit niet mogelijk, waardoor in die gevallenhogere organismen, zoals schimmels, moeten worden gebruikt.

Eiwitten, gesynthetiseerd op het ruw endoplasmatischreticulum (ER), worden of uitgescheiden door de eukaryote cel,of op specifieke plaatsen van de excretieroute opgeslagen,zoals ER, Golgi complex, plasmamembraan of vacuole/lysosoom(Pfeffer & Rothman, 1987). De keuze van de excretieroute wordtbepaald door de aanwezigheid van een hydrofoob, amino-terminaal signaalpeptide dat van het precursor-eiwit wordtafgesplitst. Voorbeelden hiervan zijn signaalsequenties voorinvertase (Carlston & Botstein, 1982) of α-factor (Herskowitz& Oshima, 1982) die er voor zorgen dat de respectievelijkerijpe eiwitproducten in de periplasmatische ruimte komen.Onlangs is aangetoond dat deze signaalsequenties ook gebruiktkunnen worden om menselijke eiwitten door gistcellen uit telaten scheiden, hoewel de processing dan niet volledig is(Stetler et al. 1989).

Uit proeven met een synthese van dierlijke eiwitten inschimmels bleek dat het gebruik van schimmel-signaalsequentiesefficientere verwerking en uitscheiding geeft dan dierlijkesignaalsequenties, d.w.z. dat een signaalsequentie, afkomstigvan de als gastheer optredende schimmel, beter functioneert(Kingsman et a-1, 1987; Harkki et al, 1989) .

Voor transport richting lysosomen bij zoogdiercellen(Kornfeld, 1987), of vacuolen bij gist (Johnsson et al, 1987)en plantecellen (Dorel et al, 1989) is additionele informatienodig die gelegen is in een deel van de sequentie van hetrijpe eiwit zelf.

De kennis van signaalsequenties voor uitscheiding doorplantecellen is nog zeer beperkt (Della-Cioppa et al, 1987).

Ze zijn slechts beschreven voor 2 extensines uit wortel (Chen& Varner, 1985) en tabak (Memelink, 1988), alsmede voor drie"pathogen-related" (PR) eiwitten uit tabak (Hooft vanHuijsduijnen et al, 1985; Cornelissen et al, 1986; De Loose et al, 1988). Uit dit kleine aantal signaalsequenties is geenconsensus verkregen over de karakteristieken van splitsings- of herkenningsplaatsen. Ook wordt hieruit niet duidelijk ofplantvreemde eiwitten door plantecellen kunnen wordenuitgescheiden en of de verwerking van het signaalpeptide opeen juiste manier verloopt wanneer een fusieconstruct van eenplantaardige signaalsequentie en een heteroloog eiwit zouworden gebruikt.

Er is weliswaar aangetoond dat ook planten alsproductiesysteem voor heterologe eiwitten in aanmerking komen.Echter, tot op heden is slechts de productie van eenvoudigepeptiden in planten aangetoond (Goodman et al, 1987; Misra,1989) . Het is onduideljk of planten of plantecellen geschiktzijn voor de expressie en productie van heterologe eiwittendie co- of post-translationele verwerking moeten ondergaan.

Beschrijving van de uitvinding

Volgens de uitvinding is gevonden dat een heteroloog,bijv. niet-plantaardig eiwit met behulp van een plantaardigesignaalsequentie door transgene plantecellen uitgescheiden kanworden. Het eiwit menselijk serum albumine (HSA) is gekozenals voorbeeld van een eiwit dat tijdens uitscheiding eencomplexe in vivo verwerking moet ondergaan. HSA is debelangrijkste component van bloedplasma. Het is een eiwit meteen lengte van 585 aminozuren wanneer het volledig verwerktis, het bevat 17 disulfide bruggen (Bherens et al, 1975) . Voorverwerking van het eiwit moet een passage over de celmembraanplaatsvinden, waarbij een signaalpeptide wordt afgesplitst enhet eiwit zijn correcte vouwing kan krijgen. Eiwitten dieworden uitgescheiden door hun natuurlijke gastheercel wordenverondersteld niet of niet correct te vouwen indien dezeintracellulair worden gesynthetiseerd. Uitscheiding isnoodzakelijk om de correcte vouwing van de disulfidebruggen tebewerkstelligen.

HSA wordt tot nog toe op conventionele wijze gezuiverduit bloedplasma. Dit eiwit wordt in hoeveelheden in de ordevan meerdere grammen gebruikt ter vervanging van bloed in traumasituaties en diverse klinische situaties. Om een aantalredenen is de productie van HSA in een recombinante gastheeraantrekkelijk. Allereerst om het risico van verspreiding vaninfectieziekten (zoals AIDS en hepatitis) bij HSA-behandelingweg te nemen, en op de tweede plaats om de afhankelijkheid vanbeschikbaar bloed te verminderen. Het eiwit HSA is intra¬cellulair gesynthetiseerd in Escherichia coli (Latta et al,1987) en tevens in Bacillus subtilis tot expressie gebracht enuitgescheiden (Saunders en Guyer, 1987). Uitscheiding van HSAis aangetoond in transgene gistcellen van Saccharomycescerevisiae (Etcheverry et al, 1986).

Volgens de uitvinding wordt gebruik gemaakt van plant¬aardige signaalsequenties, bij voorkeur die welke afkomstigzijn van PR-eiwitten, in fusie-constructen met vooral niet-plantaardige eiwitten voor de productie van extracellulaireeiwitten in planten of plantecelcultures. Als voorbeeld vaneen bruikbare plantaardige signaalsequentie is gebruik gemaaktvan een signaalsequentie, afkomstig van het thaumatine-achtigePR-eiwit, gecodeerd door PR0B12 uit tabak (Cornelissen, 1986),coderend voor een hydrofoob N-terminaal peptide met een lengtevan 24 aminozuren.

Volgens de uitvinding kan een plantaardige signaal¬sequentie worden gebruikt voor de volgende doeleinden: a) productie in planten of plantecellen van eiwitten dievoor hun fysiologische werking processing moetenondergaan (bijvoorbeeld menselijk serum albumine), b) productie in planten of plantecellen van eiwitten die omeconomische of procestechnische redenen uitgescheidenmoeten worden (bijvoorbeeld voor goedkope isolatie uithet kweekmedium van suspensiecellen), c) productie van eiwitten die specifiek in de extra¬cellulaire ruimte van de plant hun functie moeten hebben(bijvoorbeeld bij het inbouwen van genen, coderend vooreiwitten die een resistentie bieden tegen pathogenen dieplanten via extracellulaire ruimtes binnendringen of dieruimtes koloniseren).

Ten behoeve van de productie van recombinante eiwittenzal de uiteindelijke keuze van het productie-organismeafhankelijk zijn van economische parameters zoals kweek-,groei- en zuiveringskosten. Tot nu toe wordt voor de productievan eiwitten geen gebruik gemaakt van planten, hoewel deze eenzeer goedkope bron van biomassa zijn. Productie van heterologeeiwitten in planten kan een goedkoop alternatief zijn voor hetgebruik van microorganismen, met name in die gevallen waarbijeen extractie van eiwit kan worden ingepast in een bestaandindustrieel proces. De teeltkosten van gemodificeerde plantenzijn laag in vergelijking met fermentatiekosten van micro¬organismen of dierlijke celkweken, en zelfs verwaarloosbaar,wanneer de plant reeds gebruikt wordt voor de winning van bulkplantaardige grondstoffen. De zetmeelindustrie (mais, tapioca,aardappel, cassave) leent zich bij uitstek voor co-productievan heterologe eiwitten omdat men in de eerste stappen van debestaande procesvorm van zetmeelextractie geen eiwit-denaturerende condities tegenkomt. De eiwitfractie wordt bijlage temperatuur in het geëxtraheerde celsap in oplossinggehouden. Deze eiwitrijke sapstroom is een afvalproduct van dezetmeelindustrie en wordt, vooral om milieutechnische redenen,slechts verwerkt tot veevoer. Voor het invoeren van een stapvan eiwitzuivering behoeft het bestaande proces voor zetmeel¬extractie niet of nauwelijks te worden aangepast: bijgevolgwordt door de introductie van commerciëel interessante,heterologe eiwitten in deze sapstroom een zeer goedkope bronvoor dergelijke eiwitten verkregen. Tevens verhoogt dezevoorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding de economischewaarde van de afvalstroom. Voor eiwitten met een hogeeconomische waarde kan uiteraard op kleinere schaal van eendergelijke productiemethode gebruik worden gemaakt en kan dezetmeelproductie van secundair belang zijn.

In ruime zin verschaft de uitvinding derhalve eenwerkwijze voor het produceren in een plantaardige gastheer vaneen heteroloog eiwitmateriaal, dat uit de cellen waarin hetgevormd wordt moet worden uitgescheiden, door planten ofplantecellen te kweken die door genetische manipulatie, eventueel van een voorouder, met behulp van een recombinantpolynucleotide voorzien zijn van de genetische informatie, dienodig is om de plantaardige gastheer in staat te stellen omhet heterologe eiwitmateriaal tot expressie te brengen en uitde cellen waarin het gevormd wordt uit te scheiden, waarbijdeze in de gastheer ingebrachte genetische informatie een voorde gastheer bruikbare expressiecassette omvat met daarin tenminste een voor het rijpe eiwitmateriaal coderend gen, direktvoorafgegaan door genetische informatie die codeert voor eenplantaardige, in de gastheer werkzame signaalsequentie.

De voorkeur heeft volgens de uitvinding een werkwijzewaarbij een eiwitmateriaal wordt geproduceerd dat in zijnnatuurlijke omgeving ontstaat uit een voorloper, welke eensignaalsequentie omvat die voor uitscheiding uit de cel zorgten zelf wordt afgesplitst, waarbij de in de plantaardigegastheer ingebrachte genetische informatie een voor degastheer bruikbare expressiecassette omvat met daarin eenconstruct van een voor het rijpe eiwitmateriaal coderend genen, direkt daaraan voorafgaande, genetische informatie welkecodeert voor een plantaardige, in de gastheer werkzamesignaalsequentie in de plaats van de genetische informatie dievoor de natuurlijke signaalsequentie van het heterologeeiwitmateriaal codeert.

Met de term "eiwitmateriaal" wordt gedoeld op materialenzoals polypeptiden en eiwitten, die al dan niet geglycosyleerdzijn. Met de term "heteroloog eiwitmateriaal" wordt gedoeld opeiwitmaterialen, die voor de gekozen plantaardige gastheervreemd zijn, d.w.z. van nature niet in deze gastheer wordengevormd. Hoewel het te produceren heterologe eiwitmateriaal inbeginsel ook van plantaardige afkomst kan zijn, of zelfs vaneen gist of een schimmel afkomstig kan zijn, is de uitvindingtoch vooral gericht op het gebruik van een plantaardigegastheer voor het produceren van dierlijke of menselijkeeiwitmaterialen, vooral complexere eiwitten die een ofmeerdere post-translationele bewerkingen vereisen. Het heeftdus volgens de uitvinding de voorkeur dat het geproduceerdeeiwitmateriaal een dierlijk of menselijk eiwit is dat een of meerdere post-translationele bewerkingen vereist, waaronderten minste een uitscheiding uit de cellen waarin het eiwit inde vorm van een voorloper, die een aan het rijpe eiwitvoorafgaande signaalsequentie omvat, wordt geproduceerd, eneen afsplitsing van deze signaalsequentie. In een bijzonderevoorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding is hetgeproduceerde eiwitmateriaal menselijk serum albumine.

De woorden "eventueel van een voorouder" houden verbandmet het feit dat planten levende wezens zijn, hetgeenimpliceert dat de voor de produktie van het heterologeeiwitmateriaal benodigde genetische informatie, ingebracht inde eerste transgene planten of plantecellen, d.w.z. de eerstegeneratie van de genetisch gemanipuleerde planten ofplantecellen, ook in de nakomelingen aanwezig kan zijn.Uiteraard kunnen en zullen ook dergelijke latere generatiesvan de transgene planten en plantecellen voor de produktie vanhet heterologe eiwitmateriaal worden gebruikt.

Met de woorden "recombinant polynucleotide" worden zowelDNA als RNA constructen bedoeld, die het gevolg zijn van opzichzelf bekende methodieken van de recombinant DNA technolo¬gie. Momenteel zijn de meeste transformatie methoden gebaseerdop het gebruik van recombinant DNA, bijv. in de vorm vanplasmiden, zodat het te gebruiken recombinant polynucleotidevolgens de uitvinding bij voorkeur bestaat uit recombinantDNA, maar de uitvinding is daartoe niet beperkt en omvatderhalve methoden van genetische manipulatie, waarbijrecombinant RNA wordt toegepast.

De term "expressiecassette" is conventioneel en duidt opeen combinatie van regulatie-elementen die de gastheer nodigheeft voor een correcte transcriptie en translatie (expressie)van de in de expressiecassette opgenomen genetischeinformatie. Tot deze regulatie-elementen behoren een geschikte(d.w.z. een in de gekozen gastheer werkzame) transcriptie-promoter en een geschikte transcriptie-terminatie sequentie.

Zoals reeds eerder is opgemerkt heeft het volgens deuitvinding de voorkeur dat de in de plantaardige gastheeringebrachte genetische informatie een voor de gastheer bruikbare expressiecassette omvat met daarin een genconstructvan een voor het rijpe eiwitmateriaal coderend gen en, direktdaaraan voorafgaande, genetische informatie welke codeert vooreen plantaardige, in de gastheer werkzame signaalsequentie dieafkomstig is van het PR (pathogenesis-related) eiwit PR0B12.Deze plantaardige signaalsequentie blijkt in verschillendeplantensoorten tot een correcte uitscheiding uit de cel, eencorrecte afsplitsing van de signaalsequentie en een correctevouwing van het rijpe eiwitmateriaal te leiden.

Ten aanzien van de aard van de plantaardige gastheerbevat de uitvinding in beginsel geen beperkingen, anders danalleen praktische beperkingen van tijdelijke aard in verbandmet het nog niet ontwikkeld zijn van transformatiemethodenvoor bepaalde plantensoorten. In een zeer bijzonderevoorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding wordt echter alsplantaardige gastheer een plant gebruikt van een soort dievoor de produktie van zetmeel geschikt is. Hierbij kan vooralworden gedacht aan planten van een soort, gekozen uit de groepbestaande uit aardappel, mais en cassave. Het heeft volgens deuitvinding met name de voorkeur dat als de plantaardigegastheer een voor de industriële zetmeelproduktie bruikbareaardappelvariëteit wordt gebruikt en de knollen daarvan zowelvoor de winning van zetmeel als voor de winning van hetheterologe eiwitmateriaal worden benut.

Het is volgens de uitvinding echter ook mogélijk dat alsde plantaardige gastheer plantecellen in suspensie-kweekworden gebruikt. Een dergelijke kweek van plantecellen insuspensie is op zichzelf bekend. Volgens de uitvinding is hetzeer geschikt dat hierbij als de plantaardige gastheerplantecellen van de plantensoort tabak in suspensie-kweekworden gebruikt.

In het experimentele gedeelte worden enkele concretevoorbeelden van de werkwijze volgens de uitvinding gegeven.Deze voorbeelden zijn (1) een werkwijze voor het producerenvan menselijk serum albumine door aardappelplanten te kwekendie door genetische manipulatie, eventueel van een voorouder,met behulp van een recombinant polynucleotide voorzien zijn van de genetische informatie, nodig om de aardappelplanten instaat te stellen tot een expressie en correcte post-translationele bewerking van het menselijk serum albumine,waarbij deze in de aardappel ingebrachte genetische informatieeen voor de aardappel bruikbare expressiecassette omvat metdaarin ten minste een voor het rijpe menselijk serum albuminecoderend gen, direkt voorafgegaan door genetische informatiedie codeert voor een plantaardige, in de aardappel werkzamesignaalsequentie, afkomstig van het PR (pathogenesis-related)eiwit PR0B12, en het door de genetisch gemanipuleerdeaardappelplanten geproduceerde menselijk serum albumine uit deaardappelknollen te winnen, en (2) een werkwijze voor hetproduceren van menselijk serum albumine door in suspensiecellen van de plantensoort tabak te kweken die door genetischemanipulatie, eventueel van een voorouder, met behulp van eenrecombinant polynucleotide voorzien zijn van de genetischeinformatie, nodig om de gesuspendeerde tabakscellen in staatte stellen tot een expressie en correcte post-translationelebewerking van het menselijk serum albumine, waarbij deze in detabak ingebrachte genetische informatie een voor tabakbruikbare expressiecassette omvat met daarin ten minste eenvoor het rijpe menselijk serum albumine coderend gen, direktvoorafgegaan door genetische informatie die codeert voor eenplantaardige, in tabak werkzame signaalsequentie, afkomstigvan het PR (pathogenesis-related) eiwit PR0B12, en het door degenetisch gemanipuleerde, gesuspendeerde tabakscellengeproduceerde menselijk serum albumine uit het kweekmedium tewinnen.

Meer in het bijzonder toont het experimentele gedeeltedat cellen, afkomstig van aardappel- en tabaksplanten, zijngetransformeerd met behulp van de Aarobacterium technologie,gebruik makend van een vector, bevattende een markergen voorkanamycine selectie alsmede het gen dat codeert voor menselijkserum albumine (HSA), voorafgegaan door hetzij de natuurlijkeHSA signaalsequentie (ter vergelijking), hetzij door eensignaalsequentie van een plantaardig "pathogen-related" (PR)eiwit. Tevens zijn electroporatie experimenten uitgevoerd op protoplasten van tabaksplanten. Deze experimenten hadden totdoel een uitscheiding van het HSA over het plasmamembraan vande transgene plantecellen te verkrijgen. Bij het excretie-proces wordt het HSA eiwit gemodificeerd tot een vorm waarinhet eiwit zijn fysiologische functie krijgt.

Na transformatie is expressie van HSA aangetoond in alleonderzochte plantedelen (aardappel: bladeren, stengels, stelenen knollen, de laatste zowel vers als na 2 weken opslag bij4°C zoals gebruikelijk bij industrie aardappelen; tabak:bladeren, callus en suspensiecellen). Uitscheiding van HSAdoor transgene cellen werd met drie methoden aangetoond: a) na electroporatie van tabaksprotoplasten met chimere HSA-genconstructen kon met behulp van western blotting HSAspecifiek in het kweekmedium worden gedetecteerd. Inextracten van de transgene tabaksprotoplasten kon geenHSA eiwit worden gedetecteerd.

b) uit HSA-transgene tabaksplanten werd callus (ongediffe¬rentieerd celmateriaal) verkregen. Met dit callus werdeen suspensiekweek opgezet. In het kweekmedium kon metbehulp van immunoblotting HSA worden aangetoond. Inextracten van de tabaks-suspensiecellen kon geen HSA-eiwit worden aangetoond.

c) na transformatie van aardappel met bovengenoemdeconstructen, en regeneratie van volwassen aardappel¬planten, kon in de extracellulaire vloeistof, geïsoleerduit transgeen bladmateriaal, HSA met hoge specifiekeconcentratie worden aangetoond. De extractie van extra¬cellulaire vloeistof uit bladmateriaal werd gevolgd metbehulp van cellulaire en extracellulaire marker enzymen.

Bij alle drie hierboven genoemde testmethoden (a, b & c) bleekdat zowel de menselijke als de plantaardige signaalsequentietot uitscheiding van HSA kan leiden. Echter, uit aminozuur-analyses van uit transgene planten geïsoleerd HSA bleek datalleen de plantaardige signaalsequentie leidde tot eencorrecte processing (i.e. verwijdering van het signaalpeptideop de juiste splitsingsplaats).

De werking van de heterologe constructen zoals in het experimentele gedeelte beschreven, bewijst dat een signaal— sequentie van PR-eiwit uitscheiding van heterologe eiwitten naar de extracellulaire ruimte kan laten plaats vinden.

Flcruurbesprekinq

Fig.l Overzichtskaart van de gebruikte constructen voor dechimere HSA genen. Op de schematische restrictie-kaarten wordt van links naar rechts aangegeven: deenhancer en promoter (2 open boxen), AlMV-leader(dikke lijn), signaalsequentie (gestippelde box),structureel HSA gen (zwarte box) en nos terminator(dunne lijn). De restrictieplaatsen zijn hier aange¬geven met één-letter codes.

Fig.2 Schematisch overzicht van de constructie van plasmidepM0G18. De verschillende plasmiden zijn niet op schaalweergegeven.

Fig.3 Schematisch overzicht van de constructie van plasmidepMOG36. De verschillende plasmiden zijn niet op schaalweergegeven.

Fig.4 Schematisch overzicht van de constructie van plasmidenpMOG49 en pMOG50. De verschillende plasmiden zijn nietop schaal weergegeven. De sequentie in de box, welkecodeert voor een alanine-residu, is gebruikt voor deconstructie van pMOG48.

Fig.5 Schematisch overzicht van de constructie van plasmidepMOG85. De verschillende plasmiden zijn niet op schaalweergegeven.

Experimenten X Constructie van chimere HSA genen.voor expressie inplanten

Voor de expressie van het menselijk gen voor serum albumine (HSA) is gebruik gemaakt van de volgende regulatiesequenties: 1) de constitutieve 35S promoter afkomstig van het cauliflower mosaic virus (CaMV, Guilley et al, 1982), uitgerust met een dubbele enhancer sequentie vooroptimale gen-expressie.

2) de transcriptie-terminatiesequentie afkomstig van het gencoderend voor nopaline synthase (nos) van het pTiC58plasmide van Aorobacterium tumefaciens (Bevan, 1984) .

3) de 5' leadersequentie van het alfalfa mosaic virus (A1MV,Brederode et al, 1980) gericht op stabilisering van hetchimere messenger RNA. Er werd een fusie gemaakt tussendeze leadersequentie en de sequenties, coderend voor hetHSA (fig. 1).

Een overzichtskaart van de vier gebruikte constructies isweergegeven in figuur 1.

Voor de constructie van de verschillende plasmiden viastandaard recombinant DNA technieken (Maniatis et al, 1982) isuitgegaan van plasmide pMOG18 (fig. 2). Dit plasmide isafgeleid van £. coli vector pUC18 (Yanish-Perron et al, 1985)en bevat in de polylinker de CaMV 35S promoter/enhancergevolgd door de AMV leadersequentie, het gen voor β-glucuronidase (Sleat et al, 1987) en de nos-terminator (Bevan,1984). Dit plasmide. is verkregen zoals aangegeven in fig. 2.

De expressiecassette bestaande uit de CaMV 35S promoter en denos-terminator werd als EcoRI - HindlII fragment (afkomstigvan plasmide pROKl; Baulcombe et al, 1986) geplaatst inplasmide pUC18 (=pM0G3). Vervolgens werd het 5' proximalegedeelte van de 35S promoter verwijderd door de Ncol knip-plaats in de promoter blunt te maken met Klenow polymerase, envia digestie met EcoRI en inserteren van een EcoRI linker hetplasmide in te korten, resulterend in plasmide pMOG4. HetBamHI - HindlII fragment van plasmide pM0G4 werd vervangendoor een synthetisch fragment dat de leadersequentie van hetalfalfa mosaic virus (A1MV) bevat. De aangegeven Ncol knip-plaats in het synthetisch fragment is direct stroomafwaartsvan de A1MV leadersequentie gelegen en bevat het ATG-translatie-initiatiecodon. In het ontstane plasmide pMOGllwerd het BamHI - HindlII fragment met de nos-terminatorteruggeplaatst, resulterend in plasmide pMOG12. In plasmidepM0G12 werd het gen, coderend voor β-glucuronidase (afkomstig van plasmide pRAJ275; Jefferson, 1987) als Ncol - BamHIfragment geplaatst, resulterend in plasmide pM0G14. Tenslotte werd de enhancer sequentie van de 35S promoter, die gelegen isop een AccI - EcoRV fragment van pM0G14, geïsoleerd, blunt gemaakt met Klenow polymerase en geplaatst in de bluntgemaakte EcoRl - knipplaats van pM0G14, hetgeen resulteerde in plasmide pM0G18 dat een dubbele 35S-enhancer sequentie bevat(fig. 2).

Het HSA-eiwit wordt van nature gesynthetiseerd als eenprecursor (Judah et al, 1973), waarin het rijpe eiwit van 585aminozuren wordt voorafgegaan door een "prepro"-peptide van24 aminozuren. Het gedoneerde cDNA voor preproHSA (Lawn etal, 1981) werd gebruikt als uitgangsmateriaal voor deconstructie van plasmide pMOG36, waarin de sequentie coderendvoor het HSA-eiwit wordt voorafgegaan door het menselijke HSA-prepro peptide (Lawn et al, 1981). Tevens werd de sequentiecoderend voor het rijpe HSA-eiwit op twee manieren gefuseerdaan een signaalpeptide van plantaardige oorsprong (plasmidenpM0G49 en pMOGSO). Tenslotte werd een HSA gen geconstrueerddat geen sequentie coderend voor een signaalpeptide bevatte(plasmide pMOG85).

a) constructie van plasmide PMOG36, bevattende preproHSA

Zoals aangegeven in fig. 3 werd de coderende sequentievoor preproHSA gedoneerd als een Bst Eli - Clal fragment. Deknipplaats voor het enzym Bst Eli (GGTAACC) ligt negennucleotiden achter het startcodon van het HSA gen (Lawn et al,1981). Met behulp van standaard methoden werd 27 bp achter hetTAA stopcodon van het HSA gen, door de sequentie TACCAT temutageniseren tot de sequentie ATCGAT, een knipplaats voorClal gecreëerd, waarbij gebruik werd gemaakt van M13 vectoren(Yanisch-Perron et al, 1985). Het Bst Eli - Clal fragment hadhierdoor een grootte van 1850 bp. Een synthetisch Ncol - BamHIfragment van 29 bp werd geplaatst in plasmide pMOG18. In hetresulterende plasmide pMOG33 bevonden zich direct achter hetATG startcodon de ontbrekende 9 nucleotiden tot aan de BstEII-knipplaats, gevolgd door een knipplaats voor Clal. In plasmide pMOG33 werd het preproHSA gen geplaatst zoalsaangegeven in fig. 3, resulterend in plasmide pMOG36.

b) constructie van de plasmiden pMOG49 en pMQG50. bevattende

een fusie van het PR0B12 signaalpeptide._aan het rijpe HSA

eiwit

De sequentie coderend voor het rijpe HSA-eiwit werd optwee manieren gefuseerd aan een signaalpeptide van het PR-eiwit PR0B12 uit Samsun NN tabak (Cornelissen et al, 1986).

Dit plantaardige signaalpeptide heeft een lengte van 25aminozuren en een Ala-Ala peptide binding vormt de splitsings-plaats tussen het signaalpeptide en het rijpe PR0B12 eiwit. Desplitsingsplaats tussen de 24 aminozuren lange preprosequentievan HSA en het rijpe HSA eiwit is Arg-Asp (Lawn et al, 1981).In de twee hier gepresenteerde constructies zijn tweeverschillende fusies gemaakt tussen het PR0B12 signaalpeptideen het rijpe HSA eiwit, namelijk een fusie tussen het laatsteaminozuur van het PR0B12 signaalpeptide en de start van hetrijpe HSA eiwit (Ala-Asp), en een fusie waarin het rijpe HSAeiwit voorafgegaan wordt door de splitsings-sequentie van hetPR-eiwit (Ala-Ala-Asp, fig. 4).

Voor de constructie van de plasmiden pMOG49 en pMOG50werd op het 9e en 10e codon van het rijpe HSA gen de sequentieCAT CGG T gemutageniseerd in CAT CGA T met behulp vanstandaard procedures (Kunkel, 1985) gebruik makend van M13vectoren (Yanisch-Perron et al, 1985). Hierbij werd een Clal-knipplaats gecreeerd zonder dat dit een wijziging in hetgecodeerde eiwit ten gevolge had (fig. 4); de correctemutagenese werd bevestigd door sequentie analyse. Voor defusering aan de planteregulatie signalen werd uitgegaan vanplasmide pMOG18, waarin een synethetisch Ncol - BamHI fragmentvan 80 bp werd geplaatst, welk fragment codeert voor hetsignaalpeptide van PROB12, vanaf het ATG startcodon tot aan deSphI-knipplaats die gelegen is direct voor het eerste Ala-residu van de splitsingsplaats (Cornelissen et al, 1986). Inhet resulterende plasmide pMOG42 werden tenslotte tweeverschillende synthetische linkers geplaatst, coderend voor enerzijds een Ala-Ala-Asp fusie met het rijpe HSA gen tot aande gecreëerde C1aI-knipplaats in het 9e en 10e codon van hetrijpe eiwit, anderzijds voor de corresponderende Ala-Aspfusie. In de resulterende plasmiden pMOG48 en pMOG43 werdvervolgens het gemutageniseerde HSA gen als Clal-fraamentgeplaatst, resulterend in respectievelijk de plasmiden pMOG49en pMOG50 (fig. 4).

c) constructie van plasmide PMOG85. bevattende rijp HSA

Met behulp van standaard procedures (Kunkel, 1985) werdhet HSA gen in een M13-afgeleide vector zodanig gemutageni-seerd dat in de coderende sequentie het eerste aminozuur vanhet rijpe eiwit (Asp) werd voorafgegaan door een Ncol-knipplaats, bevattende een ATG-translatiestartcodon in hetjuiste leesraam (fig. 5). Het aldus na mutagenese verkregenHSA gen, inclusief de Ncol-knipplaats. werd op DNA-sequentiegecontroleerd en vervolgens in 2 stappen gesubcloneerd inplasmide pM0G18 (fig. 5). Het Ncol - BamHI fragment bevattende het C-terminale deel van het HSA gen werd geïsoleerd uitplasmide pMOG50 en in vector pM0G18 geplaatst, resulterend inplasmide pM0G4HSA. De eerste 742 bp van het HSA gen inclusiefhet gecreëerde ATG-startcodon werd als Ncol-fragment geplaatstin plasmide pM0G4HSA. Het resulterende plasmide pMOG85 bevattenu het rijpe HSA gen zonder enige signaalpeptide sequentie ineen expressievector.

De plasmiden pMOG36, pMOG49, pMOG50 en pMOG85 bevatten nuhet te introduceren HSA-gen als een 3,0 kb EcoRI-HindlIIrestrictiefragment.

II Electroporatie van tabaksprotoplasten

De isolatie en electroporatie van tabaksprotoplasten(Nicotiana tabacum cv. SRI) werd uitgevoerd volgens Rodenburget al (1989). Voor de electroporatie werden 5xl05 protoplastengesuspendeerd in 0,5 ml buffer, gedurende 10 minuten bij 0°Cgepreïncubeerd in aanwezigheid van 40 μg/ml supercoiled DNA vaneen van de plasmiden pMOG36, pMOG49, en pMOG50 en vervolgensgeëlectroporeerd bij 300V/cm en één puls van 38 msec. Naopnieuw 10 minuten 0°C, werden de cellen verdund in 5 volumes K3G medium en verder in het donker gekweekt bij 20eC. Deaanwezigheid van HSA-eiwit werd getoetst zoals hierna wordt beschreven in VI.

III Transformatie van tabak en inductie van susoensiecellenVoor de introductie van genconstructies in planten zijnverschillende technologieën beschikbaar zoals transformatiemet Aarobacterium tumefaciens of Aarobacterium rhizogene.S.,micro-injectie, partiele bombardement, DNA opname inprotoplasten, etc. De feitelijke methode van introductie vanDNA in de plant is niet kritisch met betrekking tot dezeuitvinding. Voor de transformatie van tabak werd gebruikgemaakt van cocultivatie van bladponsjes met Aarobacteriumtumefaciens volgens de procedure van Horsch et al (1985). Dezewijze is gebaseerd op het principe van het binaire vector¬systeem (Hoekema et al, 1983), waarin Aarobacterium stammengebruikt worden die enerzijds een plasmide bevatten met daaropde virulentie (vir) genen, en anderzijds een daarmeecompatibel plasmide dat het in te bouwen gen bevat. Hiertoewerden de vier relevante genconstructies zoals aanwezig op deplasmiden pMOG36, pMOG49, pMOG50 en pMOG85 gedoneerd in debinaire vector pMBV4. Deze vector kan repliceren in zowel£. coli als in Aarobacterium. en is een afgeleide van debinaire vector Binl9 (Bevan, 1984) en wijkt niet op voor dezevinding essentiële punten daarvan af. Vectoren pMBV4 en Binl9bevatten tussen de linker- en rechter-bordersequentie van hetT-DNA een identiek chimeer NPTII-gen coderend voor kanamycineresistentie (Bevan, 1984), 'alsmede een zogenaamde polylinkervoor de clonering van in te bouwen genconstructen. De chimereHSA-genen gelegen op de plasmiden pMOG36, pMOG49, pMOG50 enpMOG85 werden als een 3,0 kb EcoRI-HindlII fragment geplaatstin de polylinker van vector pMBV4 welke gelineariseerd was metEcoRI en HindlII. De hierdoor verkregen binaire plasmiden,respectievelijk pMOG236, pMOG249, pMOG250 en pMOG285 werden nudoor middel van mobilisatie met behulp van het plasmide pRK2013 (Ditta et al, 1980) overgedragen naar een Aarobacteriumstam, bevattende een plasmide met daarop de vir-genen vooroverdracht van het T-DNA naar de plant.

Met behulp van de aldus verkregen Acrrobacterium stammenwerd transformatie van tabak (Nicotiana tabacum SRI) uitge¬voerd. Transgene planten werden geregenereerd uit scheutjesdie ontwikkelden op selectiemedium (100 mg/1 kanamycine). Deaanwezigheid van HSA-eiwit werd getoetst zoals hierna wordtbeschreven in VI. Van de transgene plant die het hoogsteexpressieniveau te zien gaf (clone pMOG249#l) werd eensuspensiecultuur geïnitieerd. Hiervoor werd callus geïnduceerdop transgene bladschijfjes door groei op MS medium, 3% sucrose(MS30), 2,0 mg/1 NAA, 0,1 mg/1 kinetine en 50 mg/1 kanamycine,waarna het callus werd overgebracht naar vloeibaar medium vandezelfde samenstelling. Na 1 week in suspensie werd het mediumvervangen door nieuw MS30, nu met 0,5 mg/1 2,4-D. Dit medium·werd elke week ververst totdat een homogene cultuur werdverkregen. Vanaf de 7e week werd de kanamycine selectie instappen van '25 mg/1 opgevoerd naar 100 mg/1.

HL Transformatie van aardappel

Voor de transformatie van aardappel werd gebruik gemaaktvan het binaire vectorsysteem, ontwikkeld voor Aqrobacteriumtumefaciens. zoals hiervoor beschreven onder III. Aardappel-schijfjes van de cultivar Desiree werden gecocultiveerd met deAcrrobacterium stammen, die de plasmiden pMOG236, pMOG249 ofpMOG250 bevatten, via de beschreven procedure van Hoekema etal (1989). In totaal werden 75 transgene planten geregenereerduit scheutjes die ontwikkelden op selectie medium (100 mg/1kanamycine), nl. 51 planten met het construct pMOG236, 12 metpMOG249 en 12 met pMOG250. De transgene planten werden invitro vermeerderd waarna deze in potgrond tot volwassenplanten werden opgegroeid voor analyses.

Y Detectie van HSA-mRNA en HSA-eiwit

Alle transgene aardappelplanten werden getest op deaanwezigheid van HSA-mRNA (Verwoerd et al, 1989) met behulpvan northern blotting. In 46 van de 51 pMOG236, 10 van de 12pMOG250 en alle pMOG249 transgene planten werd HSA-mRNAgedetecteerd.

De aanwezigheid van HSA-eiwit werd getoetst door deoplosbare eiwitfractie van verschillende plantedelen tescheiden op 7,5 - 15% SDS-polyacrylamide gradiënt gels gevolgddoor western blotting op nitrocellulose en immunodetectie metgeit-anti-HSA (Sera-Lab, USA) gevolgd door konijn-anti-geit-peroxidase. De bindingscondities tijdens de incubatie vannitrocellulose met antilichamen waren 10 mM NaPi, pH 7,2, 150mM NaCl, 1,25% Blotto, 0,2% Tween 20, 0,1% Triton X100, 35°C.HSA werd zichtbaar gemaakt door een peroxidase kleuring met o-dianisidine. Detecteerbare hoeveelheden HSA werden aangetoondbij 31 pMOG236, 8 pMOG249 en 9 pMOG250 planten en wel inbladeren, stengels en knollen.

VI Excretie van HSA door olantecellen

Na transformatie kon zowel synthese als ook excretie vanHSA door transgene plantecellen worden aangetoond. Het bleekdat elk van de gebruikte signaalsequenties in staat was om HSAuit de plantecel uit te scheiden. Uitscheiding kon op driemanieren worden aangetoond: a) na electroporatie van tabaksprotoplasten met de bovenge¬noemde vectoren, gevolgd door transient expressie van hetingebrachte gen en signaalsequentie, kon na een kweek-periode van 48 uur HSA eiwit met behulp van westernblotting specifiek in het kweekmedium worden aangetoond.Hiervoor werd het medium ontzout over een PD10/G25 kolomen door vriesdrogen geconcentreerd. In extracten van detransgene tabaksprotoplasten (na lysis van de gepelle-teerde protoplasten in 2x geconcentreerd SDS-samplebuffer) was het HSA niveau beneden de detectie grens (<1 ng HSA / 25 μg oplosbaar eiwit).

b) in het medium van suspensiecellen van transgene tabak konmet behulp van western blotting HSA worden aangetoond (2 ng / 10 μg extracellulair eiwit). In extracten vangepelleteerde suspensiecellen lag het HSA niveau op dedetectiegrens van 1 ng HSA / 25 μg oplosbaar eiwit.

c) door analyse van extracellulaire vloeistof in transgeenbladmateriaal van aardappelplanten. Het bleek mogelijk om na vacuuminfiltratie van bladrepen in 5 mM Hepes, pH 6,3,50 mM NaCl, gevolgd door langzame centrifugatie (600 g)extracellulaire vloeistof te extraheren (Hendriks et al,1985). Deze vloeistof kon als zodanig worden getypeerddoor het bepalen van de specifieke activiteit van demarker enzymen glucose-6P dehydrogenase (cytoplasmatisch)en peroxidase. Uit western blotting analyse bleek dat deextracellulaire vloeistof een ca. 20x hogere concentratieHSA (per mg eiwit) bevatte dan een totaal bladextract.

Uit bladeren van transgene tabaksplanten met het constructpMOG285, bevattende het HSA-gen zonder signaalpeptide, werdextracellulaire vloeistof geextraheerd zoals hiervoorbeschreven voor aardappelplanten. In deze vloeistof kon geen,HSA worden gedetecteerd.

VII In vivo processing van HSA

Om na te gaan of HSA op de juiste manier verwerkt wordttijdens transport door de plantecel, waarbij het betreffendesignaalpeptide moet worden afgesplitst vóór het Asp-startcodonvan rijp HSA (fig. 1), werden verschillende experimentengedaan. Aangezien HSA geen enzymatische functie heeft kondenalleen fysische eigenschappen worden geanalyseerd, waarbijplantaardig HSA werd vergeleken met standaard HSA (degebruikte analyse methoden worden in detail beschreven in VIIIt/m X): a) het molekuulgewicht werd vergeleken met behulp van FPLC-gelfiltratie en SDS-PAGE (7,5 - 15% gradiënt gels).

b) het elutiepatroon tijdens een zoutgradient op MonoQanionenwisselaar (0 -> 350 mM NaCl in 50 mM Tris pH 8,0) c) CNBr digesties van gezuiverd HSA werd geanalyseerd op20-27% SDS-PAGE gradiënt gels na zilverkleuring.

d) aminozuursequentie van HSA gezuiverd uit transgeneplanten.

De enige afwijkingen die hierbij werden gevonden bestonden uitverschillen in de N-terminale aminozuur sequentie, afhankelijkvan de gebruikte signaalsequentie (zie IX), en verschillen inhet CNBr-digestie patroon (zie X) .

VIII Zuivering van HSA uit transgene aardappelplanten

Van de clones met de hoogste expressie, voor elk construct één (clones 236#31, 249#10 en 250#6), werdenvoldoende planten gekweekt voor zuivering van HSA. Hiervoorwerd 500-1000 gram plant materiaal gehomogeniseerd in 10 mMNaPi pH 7,2, 150 mM NaCl (PBS) met 0,6% PVPP, 0,1 mM PMSF, ImMEDTA bij 4°C. De oplosbare fractie werd gezuiverd vanceldebris en 4 uur geincubeerd met anti-HSA gekoppeld aan1,5 ml Reactigel HF-65 (Pierce Chemicals) en 0,5% Tween 80.

Het complex HSA-antiHSA-Reactigel werd door centrifugatieteruggewonnen, overgebracht naar een 2 ml kolom en gewassenmet 0,5% Tween 80 in PBS. Desorptie van HSA vond plaats doorelutie met 0,1 M glycine pH 2,5, 10% dioxan waarna een snellebufferwisseling naar 50 mM Tris, pH 8,0 werd uitgevoerd meteen PD10/G25 kolom (Pharmacia). Het eluaat werd directgefiltreerd (0,22 μιη) en opgebracht op een MonoQ kolom (HR5/5Pharmacia). Door middel van een lineaire gradiënt (0 naar 350mM NaCl in 50 mM Tris/HCl pH 8,0 in 20 minuten, 1 ml/min) werdHSA grotendeels gezuiverd van aspecifiek-gebonden eiwitkomponenten. De fracties, die in een western blotting analyseeen hoge concentratie HSA bleken te bevatten, werden doorvriesdrogen geconcentreerd en opgebracht op een HR10/30Superose 6 gelfiltratie kolom (Pharmacia) in PBS. Hetelutievolume van HSA, geïsoleerd uit transgene planten, kwamop beide kolommen precies overeen met het elutievolume vanstandaard HSA. De zuiverheid van het geïsoleerde HSA werdbevestigd met behulp van een zilvergekleurde SDS-gel.

IX N-terminale aminozuur sequenties van HSA uit transgene

pIjaai-SR

De HSA-piek van de Superose 6 gelfiltratie kolom (VIII)werd direct gespot op Immobilon PVDF membraan voor een nadereaminozuursequentie analyse met behulp van een AppliedBiosystems 477A Protein Sequencer (Eurosequence B.V.,Groningen). Verrassenderwijs bleek dat alleen HSA uit pMOG250planten de juiste processing had ondergaan; de aminozuurvolg- orde aan de N-terminus van gezuiverd HSA werd vastgesteld alsAsp-Ala-His-Lys-Ser-Glu. Deze sequentie komt volledig overeenmet de N-terminale sequentie van correct verwerkt HSA aanwezigin menselijk bloedplasma (Lawn et al, 1981) .

Uit de aminozuur volgorde aan de N-terminus van HSA,gezuiverd uit pMOG236 planten (i.e. het construct met hetmenselijk signaalpeptide) bleek dat het geëxcreteerde HSA noghet propeptide bevatte: Arg-Gly-Val-Phe-Arg-Arg. Alleen hetprepeptide van 18 aminozuren was afgesplitst. Bij mensen wordthet propeptide in een laat stadium tijdens de uitscheidingafgesplitst met behulp van een serine proteinase (Brennan etal, 1984). Deze klasse van proteinases is zeldzaam in planten(Ryan & Walker-Simmons, 1981).

HSA, gezuiverd uit transgene pMOG249 planten, bleekchemisch geblokkeerd voor Edman-degradatie aan de N-terminus,mogelijk als gevolg van de aanwezigheid van het alanine residu(Persson et al, 1985) dat afkomstig is van het gebruiktesignaalpeptide construct (cf. fig.l).

Σ. Cyanoaeen bromide digestie van HSA uit transgene planten

Gezuiverd HSA (VIII) op PVDF membraan werd gebruikt alsuitgangsmateriaal voor CNBr digestie. De desorptie van hetmembraan vond plaats met 50 mM Tris/HCl, pH 9, 2% SDS, 2%TritonXlOO, gevolgd door koude acetonprecipitatie. Hetgedroogde pellet werd opgenomen in 10 μΐ 70% mierezuur met200 nmol CNBr / μg eiwit en 24 uur geincubeerd bij kamer¬temperatuur. Het digest werd na verdunnen drooggevroren engeanalyseerd op 20-27% SDS-PAGE volgens Giuilan et al, (1983).Hierbij bleek dat alleen het digest, afkomstig van HSA dat uittransgene pMOG236 planten was geïsoleerd, een afwijkendpatroon had in vergelijking met een digest van standaard HSA.Dit is zeer waarschijnlijk een gevolg van de aanwezigheid vanhet propeptide dat aan het HSA voorafgaat, zoals blijkt uit deaminozuursequentie gegevens (zie IX).

Referenties

Baulcombe, Saunders, Bevan, Mayo, Harrison (1986) Nature 321, 446-449

Bevan (1984) Nucl Acid Res 12., 8711-8721

Bherens, Spiekerman, Brown (1975) Fed Proc 34., 591

Brederode, Koper-Zwarthoff, Bol (1980) NAR 3, 2213-2223

Brennan, Owen, Boswell, Lewis, Carrell (1984) Biochem BiophysActa 332., 24-28

Carlson, Botstein (1982) Cell 28., 145-154Chen, Varnei (1985) EMBO J 1, 2145-2151

Cornelissen, Hooft van Huijsduijnen, Bol (1986) Nature 321,531-532

Della-Cioppa, Kishore, Beachy, Fraley (1987) Plant Physiol 31,965-968

De Loose, Alliotte, Gheysen, Gielen, Soetaert, Van Montagu,Inze (1988) Gene 23, 13-23

Ditta, Stanfield, Corbiu, Helinski (1980) Proc Nat Acad Sci,USA 72, 7347-7351

Dorel, Voelker, Herman, Chrispeels (1989) J Cell Biol 108,327-337

Etcheverry, Forrester, Hitzeman (1986) Bio/Techn ±, 726-730Giuilan, Moss, Greaser (1983) Anal Biochem 122, 277-287Goodman, Knauf, Houck, Comai (1987) PCT/WO 87/00865

Guilley, Dudley, Jonard, Balazs, Richards (1982) Cell 2Ώ., 763- 773

Harkki, Uusitalo, Bailey, Penttila, Knowles (1989) Bio/Techn2, 596-603

Hendriks, Van den Berg, Schram (1985) Planta 164, 89-95

Herskowitz, Oshima (1982) in: The molecular biology of theyeast Saccharomyces Vol. 1, 181-210

Hoekema, Hirsch, Hooykaas, Schilperoort (1983) Nature 303,179-180

Hoekema, Huisman, Molendijk, Van den Elzen, Cornelissen (1989)Bio/Techn 7, 273-278

Hooft van Huijsduijnen, Cornelissen, Van Loon, Van Boom,

Tromp, Bol (1985) EMBO J 4, 2167-2171

Horsch, Fry, Hoffmann, Wallroth, Eichholtz, Rogers, Fraley(1985) Science 225. 1229-1231

Jefferson (1987) Plant Mol Biol Report 5., 387-405

Johnsson, Bankaitis, Emr (1987) Cell 48. 875-885

Judah, Gamble, Steadman (1973) Biochem J 134. 1083-1091

Kingsman, Kingsman, Mellor (1987) Trends in Biotechn ü, 53-56

Kornfeld (1987) Fed Am Soc Exp Biol J 1, 462-468

Kunkel (1985) Proc Nat Acad Sci, USA £2., 488-492

Latta, Knapp, Sarmientos, Brefort, Becquart, Guerrier, Jung,Mayaux (1987) Bio/Techn 5., 1309-1314

Lawn, Adelman, Bock, Franke, Houck, Najarian, Seeburg, Wion(1981) Nucl Acid Res 2, 6103-6114

Maniatis, Fritsch, Sambrook (1982) Molecular Cloning, ColdSpring Harbour Lab

Memelink (1988) Altered gene expression in T-DNA transformedtobacco tissues. Thesis, Rijksuniversiteit Leiden

Misra (1989) Plant Physiol 89, S47

Persson, Flinta, Heijne, Jörnval (1985) Eur J Biochem 152.523-527

Pfeffer, Rothman (1987) Ann Rev Biochem 22/ 829-852

Rodenburg, De Groot, Schilperoort, Hooykaas (1989) Plant MolBiol (submitted)

Ryan, Walker-Simmons (1981) Plant Proteinases. In: The

Biochemistry of Plants, Stumpf, Conn (eds) Acad Press.New York

Saunders, Guyer (1987) EP-A-0229712

Sleat, Gallie, Jefferson, Bevan, Turner, Wilson (1987) Gene217. 217-225

Stetler, Forsyth, Gleason, Wilson, Thompson (1989) Bio/Techn1, 55-60

Verwoerd, Dekker, Hoekema (1989) Nucl Acid Res 12, 2362

Yanisch-Perron, Vieira, Messing (1985) Gene 22., 103-119

Claims

1. Werkwijze voor het produceren in een plantaardigegastheer van een heteroloog eiwitmateriaal, dat uit de cellenwaarin het gevormd wordt moet worden uitgescheiden, doorplanten of plantecellen te kweken die door genetischemanipulatie, eventueel van een voorouder, met behulp van eenrecombinant polynucleotide voorzien zijn van de genetischeinformatie, die nodig is om de plantaardige gastheer in staatte stellen om het heterologe eiwitmateriaal tot expressie tebrengen en uit de cellen waarin het gevormd wordt uit tescheiden, waarbij deze in de gastheer ingebrachte genetischeinformatie een voor de gastheer bruikbare expressiecassetteomvat met daarin ten minste een voor het rijpe eiwitmateriaalcoderend gen, direkt voorafgegaan door genetische informatiedie codeert voor een plantaardige, in de gastheer werkzamesignaalsequentie.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij een eiwitmateriaalwordt geproduceerd dat in zijn natuurlijke omgeving ontstaatuit een voorloper, welke een signaalsequentie omvat die vooruitscheiding uit de cel zorgt en zelf wordt afgesplitst,waarbij de in de plantaardige gastheer ingebrachte genetischeinformatie een voor de gastheer bruikbare expressiecassetteomvat met daarin een construct van een voor het rijpeeiwitmateriaal coderend gen en, direkt daaraan voorafgaande,genetische informatie welke codeert voor een plantaardige, inde gastheer werkzame signaalsequentie in de plaats van degenetische informatie die voor de natuurlijke signaalsequentievan het heterologe eiwitmateriaal codeert.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij de in deplantaardige gastheer ingebrachte genetische informatie eenvoor de gastheer bruikbare expressiecassette omvat met daarineen genconstruct van een voor het rijpe eiwitmateriaalcoderend gen en, direkt daaraan voorafgaande, genetischeinformatie welke codeert voor een plantaardige, in de gastheer werkzame signaalsequentie die afkomstig is van het PR (pathogenesis-related) eiwit PR0B12.

4. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies,waarbij als plantaardige gastheer een plant wordt gebruikt vaneen soort die voor de produktie van zetmeel geschikt is.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij als deplantaardige gastheer een plant wordt gebruikt van een soort,gekozen uit de groep bestaande uit aardappel, mais en cassave.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarbij als deplantaardige gastheer een voor de industriële zetmeelproduktiebruikbare aardappelvariëteit wordt gebruikt en de knollendaarvan zowel voor de winning van zetmeel als voor de winningvan het heterologe eiwitmateriaal worden benut.

7. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-3, waarbij alsde plantaardige gastheer plantecellen in suspensie-kweekworden gebruikt.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarbij als deplantaardige gastheer plantecellen van de plantensoort tabakin suspensie-kweek worden gebruikt.

9. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies,waarbij het geproduceerde eiwitmateriaal een dierlijk ofmenselijk eiwit is dat een of meerdere post-translationelebewerkingen vereist, waaronder ten minste een uitscheiding uitde cellen waarin het eiwit in de vorm van een voorloper, dieeen aan het rijpe eiwit voorafgaande signaalsequentie omvat,wordt geproduceerd, en een 'afsplitsing van dezesignaalsequentie.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, waarbij het geproduceerdeeiwitmateriaal menselijk serum albumine is.

11. Werkwijze voor het produceren van menselijk serumalbumine door aardappelplanten te kweken die door genetischemanipulatie, eventueel van een voorouder, met behulp van eenrecombinant polynucleotide voorzien zijn van de genetischeinformatie, nodig om de aardappelplanten in staat te stellentot een expressie en correcte post-translationele bewerkingvan het menselijk serum albumine, waarbij deze in de aardappel ingebrachte genetische informatie een voor de aardappelbruikbare expressiecassette omvat met daarin ten minste eenvoor het rijpe menselijk serum albumine coderend gen, direktvoorafgegaan door genetische informatie die codeert voor eenplantaardige, in de aardappel werkzame signaalsequentie,afkomstig van het PR (pathogenesis-related) eiwit PR0B12, enhet door de genetisch gemanipuleerde aardappelplantengeproduceerde menselijk serum albumine uit de aardappelknollente winnen.

12. Werkwijze voor het produceren van menselijk serumalbumine door in suspensie cellen van de plantensoort tabak tekweken die door genetische manipulatie, eventueel van eenvoorouder, met behulp van een recombinant polynucleotidevoorzien zijn van de genetische informatie, nodig om degesuspendeerde tabakscellen in staat te stellen tot eenexpressie en correcte post-translationele bewerking van hetmenselijk serum albumine, waarbij deze in de tabak ingebrachtegenetische informatie een voor tabak bruikbareexpressiecassette omvat met daarin ten minste een voor hetrijpe menselijk serum albumine coderend gen, direkt vooraf¬gegaan door genetische informatie die codeert voor eenplantaardige, in tabak werkzame signaalsequentie, afkomstigvan het PR (pathogenesis-related) eiwit PR0B12, en het door degenetisch gemanipuleerde, gesuspendeerde tabakscellengeproduceerde menselijk serum albumine uit het kweekmedium tewinnen.

13. Planten, plantedelen en plantecellen, die door genetischemanipulatie, eventueel van een voorouder, met behulp van eenrecombinant polynucleotide voorzien zijn van de genetischeinformatie, die nodig is om de planten, plantedelen of plante¬cellen in staat te stellen om een heteroloog eiwitmateriaaltot expressie te brengen en uit de cellen waarin het gevormdwordt uit te scheiden, waarbij deze in de plantaardigegastheer ingebrachte genetische informatie een voor degastheer bruikbare expressiecassette omvat met daarin tenminste een voor het rijpe eiwitmateriaal coderend gen, direkt voorafgegaan door genetische informatie die codeert voor eenplantaardige, in de gastheer werkzame signaalsequentie.

14. Planten, plantedelen en plantecellen volgens conclusie13, welke een heteroloog eiwitmateriaal kunnen produceren datin zijn natuurlijke omgeving ontstaat uit een voorloper, welkeeen signaalsequentie omvat die voor uitscheiding uit de celzorgt en zelf wordt afgesplitst, waarbij de in de plantaardigegastheer ingebrachte genetische informatie een voor degastheer bruikbare expressiecassette omvat met daarin eenconstruct van een voor het rijpe eiwitmateriaal coderend genen, direkt daaraan voorafgaande, genetische informatie welkecodeert voor een plantaardige, in de gastheer werkzamesignaalsequentie in de plaats van de genetische informatie dievoor de natuurlijke signaalsequentie van het heterologeeiwitmateriaal codeert.

15. Planten, plantedelen en plantecellen volgens conclusie 13of 14, waarbij de in de plantaardige gastheer ingebrachtegenetische informatie een voor de gastheer bruikbareexpressiecassette omvat met daarin een construct van een voorhet rijpe eiwitmateriaal coderend gen en, direkt daaraanvoorafgaande, genetische informatie welke codeert voor eenplantaardige, in de gastheer werkzame signaalsequentie dieafkomstig is van het PR (pathogenesis-related) eiwit PROB12.

15, Planten, plantedelen en plantecellen volgens een van deconclusies 13-15, zijnde van een soort die voor de produktievan zetmeel geschikt is.

17. Planten, plantedelen en plantecellen volgens conclusie 16, zijnde van een soort, gekozen uit de groep bestaande uitaardappel, mais en cassave.

18. Planten, plantedelen en plantecellen volgens conclusie 17, zijnde van een voor de industriële zetmeelproduktiebruikbare aardappelvariëteit.

19. Planten, plantedelen en plantecellen volgens een van deconclusies 13-15, zijnde van een voor suspensie-kweekgeschikte soort.

20. Planten, plantedelen en plantecellen volgens conclusie 19, zijnde van de soort tabak.

21. Planten, plantedelen en plantecellen volgens een van deconclusies 13-20, waarbij het heterologe eiwitmateriaal eendierlijk of menselijk eiwit is dat een of meerdere post-translationele bewerkingen vereist, waaronder ten minste eenuitscheiding uit de cellen waarin het eiwit in de vorm van eenvoorloper, die een aan het rijpe eiwit voorafgaande signaal-sequentie omvat, wordt geproduceerd, en een afsplitsing vandeze signaalsequentie.

22. Planten, plantedelen en plantecellen volgens conclusie21, waarbij het heterologe eiwitmateriaal menselijk serumalbumine is.

23. Aardappelplanten, alsmede delen en cellen daarvan,geschikt voor het produceren van menselijk serum albuminedoordat zij door genetische manipulatie, eventueel van eenvoorouder, met behulp van een recombinant polynucleotidevoorzien zijn van de genetische informatie, nodig om hen instaat te stellen tot een expressie en correcte post-translationele bewerking van het menselijk serum albumine,waarbij deze in de aardappel ingebrachte genetische informatieeen voor de aardappel bruikbare expressiecassette omvat metdaarin ten minste een voor het rijpe menselijk serum albuminecoderend gen, direkt voorafgegaan door genetische informatiedie codeert voor een plantaardige, in de aardappel werkzamesignaalsequentie, welke afkomstig is van het PR (pathogenesis-related) eiwit PROB12.

24. Tabaksplanten, alsmede delen en cellen daarvan, geschiktvoor het produceren van menselijk serum albumine doordat zijdoor genetische manipulatie, eventueel van een voorouder, metbehulp van een recombinant polynucleotide voorzien zijn van degenetische informatie, nodig om hen in staat te stellen toteen expressie en correcte post-translationele bewerking vanhet menselijk serum albumine, waarbij deze in de tabakingebrachte genetische informatie een voor tabak bruikbareexpressiecassette omvat met daarin ten minste een voor het rijpe menselijk serum albumine coderend gen, direktvoorafgegaan door genetische informatie die codeert voor eenplantaardige, in tabak werkzame signaalsequentie, afkomstigvan het PR (pathogenesis-related) eiwit PR0B12.

25. Eiwitmateriaal, verkregen onder toepassing van dewerkwijze volgens een van de conclusies 1-12 en/of verkregenuit planten, plantedelen of plantecellen volgens een van deconclusies 13-24.

26. Menselijk serum albumine, verkregen onder toepassing vande werkwijze volgens een van de conclusies 1-12 en/ofverkregen uit planten, plantedelen of plantecellen volgens eenvan de conclusies 13-24.

27. Recombinant polynucleotide, omvattende een gen, datcodeert voor een dierlijk of menselijk eiwit in zijn rijpevorm, alsmede direkt voorafgaande aan dit gen, genetischeinformatie, welke codeert voor een plantaardigesignaalsequentie.

28. Recombinant polynucleotide volgens conclusie 27, waarbijde genetische informatie die codeert voor een plantaardigesignaalsequentie, genetische informatie is die codeert vooreen plantaardige signaalsequentie, afkomstig van het PR(pathogenesis-related) eiwit PR0B12.

29. Recombinant polynucleotide volgens conclusie 27 of 28,waarbij het gen, dat codeert voor een dierlijk of menselijkeiwit in zijn rijpe vorm, een voor rijp menselijk serumalbumine coderend gen is.

30. Recombinant polynucleotide volgens een van de conclusies27-29, waarbij het gen, dat codeert voor een dierlijk ofmenselijk eiwit in zijn rijpe vorm, en de daaraan voorafgaandegenetische informatie, die codeert voor een plantaardigesignaalsequentie, opgenomen zijn in een voor een plantaardigegastheer geschikte expressiecassette.

31. Recombinant polynucleotide volgens conclusie 30, waarbijde voor een plantaardige gastheer geschikte expressiecassetteeen voor aardappel, mais, cassave of tabak geschikteexpressiecassette is.

32. Recombinant polynucleotide volgens een van de conclusies27-31, waarbij het polynucleotide bestaat uit DNA.

33. Recombinant DNA volgens conclusie 32, bestaande uit eenvectorplasmide, waarin is ingevoegd een voor een plantaardigegastheer geschikte expressiecassette met daarin een gen, datcodeert voor een dierlijk of menselijk eiwit in zijn rijpevorm, en direkt daaraan voorafgaande, genetische informatiedie codeert voor een plantaardige signaalsequentie.

34. Recombinant DNA volgens conclusie 33, waarvan het vector¬plasmide een voor klonering in een bacteriële gastheergeschikte vector is.

35. Recombinant DNA volgens conclusie 33, waarvan het vector¬plasmide een voor een plantaardige gastheer geschikte vectoris.