SE459586B - Strukturgen som kodar foer autentiskt humant serum albumin och foerfarande foer dess framstaellning - Google Patents

Description

459 586 10 15 20 25 30 35 2 Eftersom en av HIV-vírusets karaktäristikor är att frekvent förändra sin antigena struktur, finns det inga garantier att det inte kommer att utveckla värmeresistenta stammar. _ Det finns uppenbart ett behov av artificiellt, autentískt, humant serumalbumin som kan framställas i obegränsade mängder.

Känd teknik Flera försök att framställa produkter motsvarande fullt utvecklat, humant serumalbumin med användning av rekombínant DNA-tekniker har gjorts och publicerats bland annat i följande patentansökningar.

EP-A-0 073 646 (Genentech Inc), EP-A-0 079 739 (The Upjohn Co.), EP-A-0 091 527 (President and Fellows of Harvard College), och EP-A-0 198 745 (Genetica).

Alla de ovan nämnda patentansökningarna har utgått från isolering av mRNA från human lever, och denna mRNA har använts för att framställa dubbelsträngad CDNA (eller fragment därav). Följaktligen har kodon- användningen i dessa CDNA optimerats av naturen för human expression.

På detta teknikomràde anser man att human kodon- användning inte är idealisk för icke-human expression.

Före föreliggande uppfinning har man inte fram- ställt så långa DNA-sekvenser som krävs för autentiskt, humant serumalbumin (strukturgen = 1761 bp) där kodo- nerna är optimerade för icke-human expression.

I EP-A-O 182 383 (Vepex Contractor Ltd., och MTA Szegedi Biologiai Központja) beskrives ett förfa- rande för framställning av oligo- och polydeoxiribo- nukleotider genom enzymatisk syntetisering av den komplementära strängen till enkelsträngat DNA-stycke.

Denna teknik har delvis använts i föreliggande uppfinning, lv men den kombinerades med en nyuppfunnen metod att samman- foga stora fragment av genen som kodar för autentiskt, humant serumalbumin. 10 15 20 30 35 459 586 3 Beskrivning av uppfinningen' Huvudändamàlet med föreliggande uppfinning är att åstadkomma autentiskt, humant serumalbumin med hjälp av en artificiell strukturgen som har en nukleo- tidsekvens där kodonerna är optimerade för icke-human expression.

För att förverkliga detta ändamål var det först nödvändigt att designa en artificiell strukturgen och att skissera eller planera ett förfarande för framställning av nämnda gen. 12e§i91_1_s2_§sf_1_ëz§iši9¿sllëssrslssurssssa Man beslöt att välja kodoner som är särskilt lämpliga för jästexpression som ett användbart exempel på icke-human expression.

Kodonerna valdes från jästkodoner för i hög grad uttryckta jästproteiner (Bennetzen, J.L. och Hall, B.D- (1982) J. Biol. Chem. gäl, 3026-3031, och Sharp, P.M., Tuohy, T.M.F. och Mosurski, K.R. (1986) Nucleic Acids Res. li, 5125-5143).

I första hand utvaldes de mest frekvent använda kodonerna, men där så var lämpligt användes den andra eller tredje kodonen.

Anledningarna till att välja den andra eller tredje kodonen var a) att undvika förekomsten av vissa restriktions-sites som användes under hopsättning av genen, och b) att eliminera 8-baspar långa eller längre palindrom för att undvika eventuella inre slingor eller sekundära strukturbildningar inom de individuella, syntetiska oligonukleotiderna.

För att underlätta hopsättningen av hela struktur- genen, i enlighet med förfarandet för framställning av nämnda gen enligt uppfinningen, bör start- och ändnukleotiderna hos de stora fragmenten av genen väljas så att de överensstämmer med klyvnings-sitet för ett specifikt onzym- I en föredragen utföríngsform av uppfinningen bör varje nukleotid som används vid änden av ett stort 459 10 15 20 25 30 35 586 4 fragment vara G, och varje stort fragment bör börja med en nukleotid C. êrtificiell strukturgen som kodar för autentiskt HSA _ _ “NÄL _..

I en aspekt av uppfinningen âstadkommes en struk- turgen som kodar för autentiskt, humant serumalbumin.

I denna gen består nukleotidsekvensen av kodoner som är optimerade för icke-human expression av autentiskt humant serumalbumin, närmare bestämt kodoner som är valda med hänsyn till en för expression av autentiskti humant serumalbumin vald, ickeehuman värd, varvid valet av kodoner skett så att i första hand de av den valda icke-humana värden mest frekvent använda kodonerna valts, och i andra hand de av den valda icke-humana värden i andra eller tredje hand använda kodonerna valts, för att dels undvika förekomsten av sådana restrik- tions-sites som användes under hopsättning av genen, för att dels eliminera 8-baspar långa eller längre palindrom inom individuella syntetiska oligonukleo- tider, och för att dels skapa ett unikt klyvnings-site för ett specifikt enzym.

I en variant av denna aspekt av uppfinningen àstadkommes en strukturgen som kodar för autentiskt, humant serumalbumin plus en initial extra metionin.

I denna variant av genen börjar nukleotidsekvensen med en triplett som kodar för metionin och resten av nukleotidsekvensen kodar för humant serumalbumin såsom ovan. När denna gen uttrycks framställs antingen autentiskt, humant serumalbumin eller ett metionylderi- vat därav, beroende på det använda expressionssystemet.

En strukturgen är en DNA-sekvens som kodar för É en specifik peptid eller ett specifikt protein genom dess mall (template) eller messenger RNA, och inbe- 5 griper stopkodon(er).

En funktionell gen omfattar, förutom en struktur- gen, flankerande sekvenser (Flanking sequences). Sådana 10 15 20 25 30 35 459 586 5 flankerande sekvenser omfattar regleringsregioner, såsom en promotorsekvens, en sekretionssignalsekvens, och en transkriptionsterminatorsekvens. De flanke- rande regionerna bör optimeras för de specifika vektorer och värdar som används för expressionen (och fram- ställningen) av den peptid eller det protein som kodas av strukturgenen.

I en föredragen utföringsform av uppfinningen har strukturgenen som kodar för autentiskt HSA en nukleotidsekvens där kodonerna är optimerade för jäst- expressíon av autentiskt HSA. Trots att endast kodoner som optimerats för jästexpression exemplifieras i föreliggande beskrivning möjliggör det som utlärs här att en fackman på omrâdet kan designa och konstrue- ra en strukturgen som kodar för autentiskt HSA där nukleotídsekvensen har kodoner som optimeras för en annan icke-human värd, såsom en bakterievärd eller ~ en växtvärd.

Uttrycket “autentiskt, humant serumalbumin" har använts i föreliggande beskrivning och krav för att definiera ett artificiellt framställt protein av icke- -humant ursprung som har en aminosyrasekvens som motsva- rar aminosyrasekvensen hos nativt, fullt utvecklat, humant, serumalbumin. šëzšazaaêsíërírëmsrëllQiaseyslsitërziâisisllëuëëruë: ÉEEHÉEÉE Den designade strukturgenen, som har 1761 nukleo- tider vilka kodar för autentiskt, fullt utvecklat, humant serumalbumin som har 585 aminosyrarester, inde- lades i fem stora fragment. Det första fragmentet syntetiserades dubbelsträngat på ett i och för sig känt sätt, och det andra till femte fragmentet fram- ställdes enligt den teknik som beskrivits i EP-A- 0 182 383, varvid en enkelsträng syntetiseras kemiskt och den komplementära strängen syntetíseras enzymatiskt.

Sättet att sammanfoga fyra av dessa fragment är nytt, och det kan allmänt beskrivas som ett förfa- 459 586 10 15 20 25 30 35 6 rande för framställning av en stor rekombinant DNA- -sekvens, varvid klonade fragment av rekombinant DNA- -sekvensen utökade med överflödiga nukleotider vid sammanfogningspunkten mellan tvâ fragment som skall sammanfogas framställs, vilka överflödiga nukleotider _ bildar, _. 18... _ tillsammans med fragmentens terminala nukleo- tider som ligger intill sammanfogningspunkten, ett unikt restriktions~site som är karaktäristiskt för ett specifikt enzym, digerering med nämnda enzym för att framställa enkelsträngar av nämnda överflödiga nukleotider, vilka strängar elimineras genom dige- rering med ett annat enzym, och slutligen ligeras fragmenten enzymatiskt för att framställa nämnda stora rekombinant DNA-sekvens.

I föreliggande beskrivning betyder uttrycket "överflödiga nukleotider" att nämnda nukleotider inte utgör en del av den långa rekombinant DNA-sekvens som skall framställås, dvs förekommer inte i den arti- ficiella genen.

Uttrycket "ett unikt restriktions-site" innebär att restriktions-sitet är karaktäristiskt för ett specifikt enzym och att det inte förekommer någon annanstans i de fragment som skall sammanfogas.

Såsom ovan nämnts användes denna nya metod för att sätta ihop fyra av strukturgenens stora fragment, men den användes också senare i de intermediära plas- midkonstruktionerna som ledde till jästexpressions- vektorn.

I en annan aspekt av uppfinningen åstadkommas således ett förfarande för framställning av en struk- turgen som kodar för autentiskt humant serumalbumin.

Förfarandet utföres så f a) att nukleotidsekvensen som kodar för autentiskt humant serumalbumin designas genom att kodoner väljes med hänsyn till en icke- human värd som valts för expres- sion av autentiskt humant serumalbumin, 10 15 20 25 30 35 459 586 7 varvid valet utföres så att i första hand de av den valda icke-humana värden mest frekvent använda kodonerna väljes, och i andra hand de av den valda icke-humana värden i andra eller tredje hand använda kodonerna väljes, för att undvika förekomsten av sådana restrik- tions-sites som användes under hopsättning av genen, för att eliminera 8-baspar långa eller längre palindrom inom individuella oligonukleotider som utgör delfragment av fragment som skall klonas, och för att skapa ett klyvnings-site för ett specifikt enzym, b) att den designade nukleotidsekvensen indelas i ett 5'-fragment som skall kemiskt syntetiseras och nâgra fragment som skall klonas, så att sammanfog- ningspunkterna mellan de nâgra fragmenten kommer att vara vid lämpligt belägna G-C dinukleotidsekvenser, c) att de designade några fragmenten enligt b) modifieras genom utökning av de designade nukleotid- sekvenserna med en extra nukleotidsekvens GGTAC vid 5'-terminalen, med undantag för det fragment som skall fogas till 5'-fragmentet enligt b), Och att dessa nâgra fragment ytterligare indelas i delfragment som har en 3'~nukleotid G, vilka delfragment i sin tur individuellt utökas med en extra nukleotidsekvens GGCCI d) att de modifierade utökade delfragmenten enligt c) individuellt kemiskt syntetiseras i enkelsträngad form på i och för sig känt sätt, och att 5'-fragmentet enligt b) kemiskt syntetiseras på i och för sig känt sätt i dubbelsträngad form, e) att de syntetiserade delfragmenten enligt d) klonas i följd med hjälp av adaptorer och enzymatisk ifyllningsreaktion, på i och för sig känt sätt, in i några individuella rekombinant vektorer, börjande från 5'-terminalen hos de modifierade, utökade nâgra fragmenten enligt C), för att bilda klonade dubbel- 459 586 10 15 20 25 30 35 J 8 strängade fragment av genen, vilka motsvarar de modi- g fierade utökade några fragmenten enligt C), 3 f) att de klonade dubbelsträngade fragmenten enligt e) hopsättes genom klyvning av de några rekom- binant vektorerna enligt e), parvis, med enzymet Kpnl respektive enzymet Apal, - den ena vid det skapade 5'-terminala KpnI restriktions-sitet och den andra vid det skapade 3'-terminala ApaI restriktion-sitet, - för att bilda enkelsträngsändar, vilka göres till blunt-ändar medelst ett enkelsträng-specifikt enzym pà i och för sig känt sätt - varvid en änd-nukleotid C respektive en änd-nukleotid G kvarstår - följt av klyvning med ett annat restriktionsenzym som har ett klyvnings-site som är unikt i båda rekombinant vek- torerna i det ifrågavarande paret, för att bilda á ena sidan en lineär vektor som innehåller ett klonat fragment av genen och à andra sidan ett från-klyvt fragment av genen, vilka två sistnämnda fragment sammanfogas enzymatiskt vid blunt- -ändarna pá i och för sig känt sätt - varvid en di- nukleotid G-C, som ingår i genens nukleotidsekvens, bildas - , för att erhålla en rekombinant vektor som slutli- gen inkluderar alla de några designade fragmenten enligt b) i dubbelsträngad form, och g) att den i f) erhållna rekombinant vektorn utökas med det kemiskt syntetiserade 5'-fragmentet enligt d) för att bilda hela strukturgenen som kodar för autentiskt humant serumalbumin.

Detaljer beträffande förfarandet enligt uppfinningen och de enzymer som användes beskrivs i samband med de föredragna utföringsformerna av uppfinningen.

Bslsemëinëaëßëêflælslsyl i I en ytterligare aspekt av föreliggande uppfinning àstadkommes en rekombinant DNA-molekyl som omfattar en strukturgen enligt uppfinningen insatt i en vektor. 10 15 20 25 30 35 459 586 9 Rekombinant DNA-molekylen omfattar således en vektor i vilken en funktionell gen (inbegripet en strukturgen enligt föreliggande uppfinning) har insatts, och de flankerande sekvenserna i den funktionella genen är anpassad för vektorn och värden som skall användas.

Allmänt använda vektorer är plasmider fràn bakte- rier, särskilt E. coli, och bakteriofager, t ex lambda- -fag.

Specifika exempel på denna aspekt av uppfinningen beskrivs i den del av föreliggande beskrivning som beskriver föredragna utföringsformer av uppfinningen. ïzëu§â9§@sze§_!ërë I ytterligare en annan aspekt av uppfinningen àstadkommes en värd som transformerats med en rekombi- nant DNA-molekyl enligt uppfinningen.

Trots att kodonerna i strukturgenens nukleotid- sekvens (i en föredragen utföringsform av uppfinningen) är optimerade för jästexpression, är inte jäststammar de enda värdar som kan användas. Strukturgenen som designats för jästexpression kan också vara lämplig för bakterie- eller växtexpression. Följaktligen kan värden vara en jästcell, t ex Saccharomyces cerevísiae, en bakteriecell, såsom E. coli eller Bacillus subtilis, eller en cell av en växt, såsom bönväxter, ärtväxter eller tobaksplantor.

Eëršaseeês_§ë§_š§a@§täll§in9_ë!_e9Es§§¿§Bt-ë§ê I ännu en annan aspekt av uppfinningen âstadkommes ett förfarande för framställning av autentiskt, humant serumalbumin genom förökning av en värd, som transfor- merats med en vektor omfattande en rekombinant DNA-sek- vens, under expressionsbetingelser och isolering av den uttryckta proteinprodukten. Detta förfarandes karaktäristiska särdrag är a) att en värd som trans- formerats med en vektor omfattande en strukturgen enligt uppfinningen används, och b) att autentiskt, humant serumalbumin eller eventuellt metionylderivatet därav framställs. 459 586 10 15 20 25 30 35 10 I en föredragen utföringsform av denna aspekt É 1:, av uppfinningen är värden som användes Saccharomyces cerevisiae som transformerats med en skyttelvektor (shuttle vector) (E. coli - jäst), vilken omfattar en strukturgen som kodar för autentiskt, humant serum- albumin, varvid nämnda gen består av en nukleotidssek- vens där kodonerna är optimerade för jästexpression. ê9§snëi§ä§_ë§ê Autentiskt, humant serumalbumin som resulterar från förfarandet för framställning av detsamma i en- lighet med uppfinningen kan användas för alla app- I likationer istället för nativt, fullt utvecklat HSA.

Eër@assu:i§&_ë9me9§i:i9§ Autentiskt, humant serumalbumin, som framställts enligt uppfinningen, kan ingå i en farmaceutisk kompo- sition som dessutom omfattar en farmaceutiskt acceptabel' bärare och/eller ett spädmedel. Lämpliga bärare och/eller spädmedel är de som användes för nativt ' HSA, såsom fysiologisk saltlösning, och här hänvisas exempelvis till US Farmakopén för vägledning. Samma gäller för konventionella tillsatser, såsom konser- veringsmedel, pH-regleringsmedel, buffertar etc vilka valfritt kan inkluderas.

Beskrivning av föredragna utföringsformer och experi- ment detaljer 59rä_äs§k§i!2¿§¶_ë!_§iEai§¶araa Ritningarna hänför sig till plasmidkonstruktioner och till en fluorograf. Specifikt visar Fig l schema- tiskt coliplasmiden pGBl.

Fig 2 visar schematiskt plasmiden pGB2 innehål- lande en jäst HIS3 gen.

Fig 3 visar schematiskt plasmiden pGB3-229T (a.) och konstruktion genom stegen 1 och 2 av den grundläg- gande expressionsvektorn pPT2HKl (c.) via en inter- mediär konstruktion pGB3-229TK° (b.)- Fig 4 visar schematiskt pGB2 (HIS3, PHO5, PHO3).

Fig 5 visar schematiskt plasmiden PUCI8/623? (a.) innehållande promotorn för jäst PHO5 genen och 459 586 ll de modifikationer (l., 2. och 3.) som leder till kon- struktion av piasmiaerna pucia*/6232 (c.).

Fig 6 visar schematiskt den grundläggande expres- 5 sionsvektorplasmiden pPT2HKl.

Fig 7 visar konstruktion av jäst-E. coli-skyt- telvektorplasmiden pBY200.

Pig 8 visar konstruktion av tvâ expressionsvek- torplasmider pYHSA 221 och pBY2/HSA innehållande hela 10 "HSA-expressions-kassetten" frán pPT2/HSA.

Fig 9 visar ett flödesdiagram för konstruktionen av jästvektorer som skall uttrycka en syntetisk HSA-gen.

Fig 10 visar en fluorograf av 35S~metionin-märkta proteiner som immunutfällts med häst-anti-HSA-serum 15 och upplösts i SDS-polyakrylamidgel.

Schema l - Schema för den artificiella HSA-genen Ü 1! 11 Glc ln flc i l I I I 1 I I i I I i F I | 1 li 12 3] nl sí 6 lvl al 91 io Ill 112; 13' ia] 15 is *lvl ia '19 20 21 22 23 za | Romerska sifforz stora HSA-fragment: HSA I, II, III, IV, V.

Arabiska siffor: syntetiska oligodeoxiribonukleo- tider HSA l, 2, 3 ..._ 24, som var och en innehåller en extra GGCC-sekvens vid sin 3'-terminal.

Denna extra sekvens förekommer inte i HSA-sekvensen. HSA 7, 13 och 19 oligonukleotiderna innehåller också en extra GGTAC-sekvens vid sina 5'-terminaler, vilka inte förekommer i den slutliga HSA- -sekvensen. 459 586 10 15 20 25 30 35 12 När en oligonukleotid (HSA l) är ligerad med adaptermolekylen, kallas den t ex HSA l+A (se Schema 2).

När HSA l+A klonas in i den allmänt använda E. colivektorn pUCl9 [Yannisch-Perron, Vieira, J. och Messing, J. Gene åå, 103-119, (l985)] kallas den erhållna plasmiden pHSA l. i När HSA 2+A klonas in i den ovan erhållna pHSA l, kallas den resulterande plasmiden pHSA (l-2).

Därpåföljande kloningar resulterar i pHSA (1-6), vilken plasmid innehåller det stora fragmentet HSA II klonad i pUCl9, och den kan-kallas pHSA II.

På liknande sätt erhålles de stora fragmenten HSA III, HSA IV och HSA V från oligonukleotiderna 7-12, 13-18 resp 19-24, och resulterar i plasmiderna pHsA III, pHsA Iv samt pHsA v. I När de stora fragmenten HSA II och HSA III samman- fogas i pUCl9 vektorn kan den resulterande plasmiden kallas pHSA (1-12) eller hellre pHSA (II-III).

När de stora fragmenten HSA IV och HSA V på lik- nande sätt sammanfogas i pUCl9 vektorn, kan den resul- terande plasmiden kallas pHSA (l3-24) eller hellre pHsA (IV-v).

När HSA (II-III) och HSA (IV-V) sammanfogas, resulterande i pHSA (II-V) i vilken nästan hela den HSA-kodande regionen (frán 13 - 585 aminosyror av fullt utvecklat HSA - utan N-terminal Met) är klonad.

När pHSA (II-V) utökas med HSA I fragmentet i pUCl9, benämnes den resulterande plasmiden pHSA.

HSA I fragmentet syntetiserades som en partiell duplex i två former. (Schema 4).

Följaktligen erhålles två versioner av pHSA, nämligen pHSA Nr l och pHSA Nr 2. (Schema S).

Från pHSA Nr 2 kan den Met-HSA-kodande genen erhållas (som ett fragment med blunt-ände och SacI-ände, Schema 6). (En blunt-ände är en ände av en dubbel- strängad sekvens där strängändarna är lika långa). 10 15 20 25 30 459 586 13 Från pHSA Nr 1, kan den gen som kodar för fullt utvecklat HSA erhållas (som ett fragment med blunt-ände och med SacI-ände, Schema 7).

DNA-regionen som kodar för antingen Met-HSA eller fullt utvecklat HSA kan klonas in i pPT2HK1 E. coli vektorn som innehåller PHO5 jästpromotorn + den signal- sekvenskodande regionen och His3 jästtranskriptions- terminatorn. (För erhållande av pPT2/HSA). Promotor- -signalsekvens - HSA gen - terminatormodulen kommer att inkorporeras i en själv-replikerande jästvektor pBY200 för HSA-expression.

Schema 2 - Exempel på ligering av en oligonukleotid till en adaptermolekyl p GGGCC HSA 1 + pC ------ G CCCGGG CTTAA adapter p sccccc ___- G CCCGGG CTTAA HSA 1+A HSA 1 oligonukleotiden och den övre strängen hos adaptern är 5'-fosforylerade, medan adapterns lägre sträng inte är det.

Schema 3 - Adaptrar som användes under HSA-kloning Apal EcoRI CGGACGGCGACGGCGACGGCGACCG CCCGGGCCTGCCGCTGCCGCTGCCGCTGGCTTAA Adapter 1 459 586 14 Apaï EcoRI CGAGTATGCGACAGCTGG CCCGGGCTCATACGCTGTCGACCTTAA Adapter 2 ApaI SacI EcoRI CTGGAGCTCAGTCTG CCGGGACCTCGAGTCAGACTTAA Adapter 3 Adapter 1 användes för att underlätta kloning av de flesta av HSA-oligonukleotiderna Adapter 2 användes för HSA 16, 17 och 18 oligonukleo- tiderna Adapter 3 användes för att ersätta Adapter 1 nedströms i förhållande till HSA-genen, i syfte att införa ett SacI-site som är nödvändigt för att klona HSA-genen in i E. coli vektorn pPT2HKl, vilken innehåller jästpromotor- och terminatorregionerna.

Schema 4 - HSA I fragment Pstl Sau3ÅI Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys GACBCTCACAAGTCTGAAGTCGCTCÅCAGÅTTCÅÅG Nr 1 ACGTETGCGAGTGTTCAGACTTCAGCGÅGTGTCTAAGTTCCTAG P s t I Sau3 AI BclI Net Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys ÜTGATCÅTGGACGCTCÅCAÅGTCTGAAGTCGCTCACAGATTCAÅG Nr 2 ACGTEIACTAGTACCTGCGÅGTGTTCAGÅCTTCAGCGAGTGTCTÅAGTTCCTAG 459 586 15 Schema 5 - Kloning av de kompletta HSA-genversionerna in 1 puc19 Hínd III Sau3AI ApaI Sacl EcoRI | 4 1 l | 1 - l I I I I I | I | II III IV V PStI ECORI DHSÅ (II-V) pUCI9 l, Hind III-EcoRI, isolera litet fragment 2, Sau3AI Pstl-EcoRl PstI EcoRI PstI SauBAI Sau3AI Apal SacI EcoRI | ' 3 I i i i i ï I HSAI II III IV V HSA (II-V) Tu DNA-lígas PíU SšuTflAI Anal SacI EcoRI 1 | n 1 l 1 l l 1 1 T l I I I I I II III IV V pHSA Nr 1: HSA I = HSAI Nr l pHSÅ NI' 2: HSR I - HSÅI NI2 I 459 586 16 f) Schema 6 - Erhàllande ev DNA-sekvens som kodar för Met-HSA ä från pHSA Nr 2 Psu sen sas: *-_"“CTGCAÜ GATCNTGGACGCT ÜAGCTC“-- -----cAccTcAcTAcTAccTcccA cTccAs-~- ï Bcll Sacl GATCÅTGGACGCT bÅGCTC*__“_ TACCTGCGA CTCGÅG--_T- l , m u n g b e a n - n u k l e a s (mungbean = Phaceolus aureus) 2, Sacl Met Asp Ala ATGGACGCT GAGCT Dlunt-ände TACCTGCGA C SacI-ände Notera: För att erhålla Met-HSA-kodande regionen introduce- rades ett unikt restriktions -site i HSAI (sedan in i pHSA), nämligen BclI igenkänningssekvens in i HSAI (sedan in i pHSA som resulterar i pHSA Nr 2 versionen).

La 459 586 17 Schema 7 - Erhàllande av DNA som kodar för fullt utvecklat HSA från QHSA Nr 1 PSÉI Sacl ~----CTGCAGACGCT gA5gTC----- ““-'“GACGTCTGCGA CTCGAG_-*-- Fstï Sacl GACGCT GAGCTC*---_ ACGTCTGCGA CTCGAG----~ I: 1, Klenow-polymeras + dNTP 2, SacI Asp Ala GACGCT GAGCT bhmbäme CTGCGA C Sacl-ände V- 459 586 18 440 D40 044 Zm4 904 ME9 900 444 400 Omm 404 044 900 444 909 mmm N4mmÅJ 040 mnm 040 mw4 099 Hmm 404 OM4 440 D40 990 44> 440 D40 440 D40 044 Zm4 990 44> 400 Omm 904 449 040 mm4 099 Hmm 440 D40 099 404 400 D04 044 Omm 440 040 444 D40 240 mM4 909 099 044 090 D04 mN4 900 990 909 444 44> 090 400 909 440 Omm m>0 Z40 H4m=l|J 440 900 490 D40 N40 D44 099 DW4 900 444 040 mw4 004 ,ME9 ,440 Z40 940 mm4 044 Zm4 909 090 900 N40 044 094 099 DHA 044 mN4 m4mIÅ|J 044 040 040 044 ZW4 mm4 mm4 m>4 440m j 400 04% 909 090 099 mmm 900 444 049 499 099 mmm 040 mm4 099 DW4 999 Hmm 440 Z40 404 044 4mI umHxuw>u: ufifiøw www mflox 900 444 904 mm9 440 D40 900 444 040 mHm Hflmxm Eom wcw>xwm|4zQ nmcwflmmo 1 w mëwsuw 094 9mE 040 mfim 904 mm9 099 Mmm 900 444 440 D40 099 D04 990 44> 900 444 090 44> 040 mHm 900 N40 009 mmm 440 D40 994 fi4H 440 D40 440 499 099 Z40 D44 Hmm 049 904 440 499 MI9 D40 044 mæ4 044 Zm4 099 D04 909 mmm m4w$¶J 040 909 mw4 090 090 099 44> DH4 990 099 44> DH4 044 040 m>4 WHE aus < wwu saw wm~\oo4 wmæ nmq wm~\Qm 044 440 Zw4 D40 mß4\oo 044 090 mM4 44> æ4H\ow som o<< æm\o~ som o H\H 459 586 19 HU4 UHF KGB D04 0HH 404 DW4 044 044 0HH WHQ D04 0HH 0HH D04 D04 ß4wmåJ 044 H00 w>4 444 0HH 045 DM4 MNF 040 mw4 H00 444 404 0m4 HOH wN0 0HH mmm 044 mwd H04 MEH HHO 44> 440 240 H00 444 0HH mia 044 m>4 HHO 44> H00 444 044 WH4 H00 444 0HH D04 0HH D04 0HH D04 00H mmH H00 444 044 mw4 0HH D04 044 HUH WN4 Müw 000 044 444 WW4 00H HUH mmm mmm 040 000 N04 444 440 400 D40 Omm w4wIÖ|J 0HH H04 040 mmm MSH D40 HHO 44> 0HH Hmm H00 444 H00 444 H00 444 440 D40 440 D40 000 444 044 WNA 440 Z40 04H MNH 044 204 04 H00 444 404 044 H00 N40 HOH mN0 0HH mmm 040 mw4 HHH Hmm 440 D40 440 D40 HOH ww0 04H KHH 040 MHI 440 D40 H00 >40 040 mw4 440 D40 400 Omm UHH 02% H00 444 0HH mmm 404 044 H04 MIH 040 042 H00 444 044 400 wN4 Omm 0HH mmm m4wm0lJ 044 440 0HH m%4 240 0HH 440 D04 D40 0HH H00 mmm 444 404 404 0m4 0m4 H04 HOH mIH mM0 D04 040 mm4 H00 444 000 444 0H4 H02 404 0m4 00H mmm 0HH DW4 044 WH4 UH4 N44 HHO 44> .mvuow 1 < zqw mmm @m@\o- evo ewa «A< www æ@m\o@~ m o<4 æuu wwq omm wmm\QwH u<@ mwH 0m4 w>«\o@H < saw mwa w4«\o«4 u<ø osm mw< q<> @mm\o~H w mšmcuw 459 586 20 400 040 Omm mHE 04B 044 MNB ZW4 ~H 400 0B4 Omm B02 BOB BOB ww0 m%0 040 B00 mw4 444 404 044 044 wwfl D40 440 D40 404 044 404 0m4 BOB w>0 040 mm4 B00 444 BBO J4> 044 Zm4 04B m>B 040 mm4 440 DQO NH4mml|Q 044 0BB 044 wwå Dmd mun 040 040 B00 mm4 mw4 4A4 440 DQO 044 mäfl BBO A4> BOB mmm BOB WBU 04B 0BB MBB DHA BOB 440 mmm DAO 440 B00 DAO 4H4 BUB 0B4 mmm HQH HH4mm44 440 0BB DAO DHA 0BB Mmm BBO Q4> UB4 MQH BOB mmm 0BB D04 0B4 BME 0BB Hmm BOB mB0 040 mm4 040 mm4 B00 NQO 040 mm4 040 wHm 440 ZAO B00 MQO 0BB DNQ B00 444 BUB mmm 044 2m4 040 mHr 0BB mmm B00 4Q4 044 mwfl 440 D40 BOB m>0 BBO q4> 0BB D04 D40 BOB m>0 BOB mB0 vH4mI914 040 044 B00 mm4 mwfl 4A4 BUB 400 0BB Mmm Omm DNA 0BB 0BB 400 DBA DWA Omm 0B4 B4B 044 WQH MBB mwä 440 B04 040 D40 MiB mHm .munOw m æaw Bum ago æmm\o~m u mw< @m@\oo~ w<< < wwq Dqw @mæ\Om~ som use æqa ømq æß>\owN BBO 044 q<> mwq w~>\o«~ | mëwzom 459 586 21 440 ZQO 044 wwfl 009 Müm B00 NQO 400 Omm 044 wwfl u<< oss saw zmm :mn Q<> ams swe w<< mwu www maa oem < q<> zqw omm ßH4wIÅ|J 099 440 044 DHQ ZQO män 044 BBB 440 mäfl mIm DQO 440 UBB B04 DAO DWA mmß B80 A4> B09 mmm BHO Q4> 059 mmm 040 mm4 B04 mmâ BOB 089 049 mmm DBA NNE E00 B80 044 N40 d4> wfifl 044 044 B04 whfl män mmß UBB 440 B08 Dmä DQO mw0 mH4mm4IJ 089 B90 044 ämm A4> mwfl 440 04% B04 D40 mwß ÄIB 040 mm4 B00 NAO 049 MNF 044 204 H00 4A4 044 WMA 440 D40 0BB DHA 404 0M4 440 ZQO 049 NNE B00 4A4 . mH4m$@|Q E00 E09 400 4Q4 wN0 Omm 044 404 B08 Zw4 044 mmm B50 OBB OHE A4> DWQ DNA 044 HB4 OBB wwq MQH DWQ BOB 440 040 m>0 DQO wHI mH4mm4|J 099 404 099 DWQ 044 DNA 0E4 B02 050 A4> B00 4Q4 044 ZW4 400 Omm 0BB SMA 404 044 B00 440 400 040 OM4 mwfl 4Q4 mH4mmQlJ 440 SBU 0BB DQO 044 ZW4 440 ZJO 040 mw4 09% DNA A4> 440 ZQO 400 Omm B00 4A4 EBO Q4> . WUHOW w Dmfl UHF Mmm 440 DQO B00 4Q4 B90 Q4> :Au omm wHm wH~H\o«« som æuu au< mms omm mms wm~H\o~« w<< u wwq mwa saw æ@HH\oo< mao Raw was mao q<> mmm m~HH\owm som ewa ewa m>@H\o@~ UUB 04B 040 ämm mwß mw4 æHoH\ovm | måwsum 459 586 22 BOB mmm BOB 0N0 B00 4fl4 BOB mN0 mN4mmOlJ B00 044 4A4 mflä 044 440 WMA DAO 400 0B0 Omm A4> 440 B04 D40 mmB B00 4A4 044 wwfl 400 Omm 00B mmm 04B mNB BOB mM0 044 wwfl 0BB DWQ BBO A4> 0BB mmm 440 DAO BBO A4> 044 mæä 040 mur 044 mwfl NN4wm#|4 0BB 004 BOB DWQ mmB wN0 B04 440 040 MIB D40 mm4 BOB 044 B04 m>0 mwq MSB 044 mwfl B00 4d4 BBO Q4> 0B4 NQH BBO A4> BBO fl4> 440 D40 440 3A0 B00 N40 040 mm4 UBB Mmm B00 444 BBO A4> 440 DQO 0BB DHA 040 mHI 000 4A4 040 mm4 H~ 440 0BB 000 D00 Dmfl 444 404 040 BOB 044 N04 mmm B00 4Q4 040 N04 0BB DQA UBB Mmm BOB mmm BBO Q4> B04 ümB BOB mN0 UBB Hmm B00 4A4 BBO A4> 0B4 BN2 440 240 B04 MIB B00 4Q4 B04 mmB OBB Mmm B04 MEB 400 Omm BOB m>0 0BB mmm oN4mmk|Q 400 B04 044 Omm MIB man vN4mmëlJ 440 044 040 D00 044 mæä 044 m>A DQO 404 044 440 DQO mæq 0BB DHA 044 mwfl B00 4H4 404 044 040 wHm 040 B00 044 mw< mw< @ß@H\Q@m < zqo Dqw mwq mms mH@~\o«m u@< < mqH zqw mmm Duo mmm~\Q~m u<< see < zm< mmm Dam mwq mm«H\oom u<< saw oas Boa zw< q<> Dmq mmw æm«H\om« usa Eau ewa <@e amq q<> w>u amg æ>mH\o@v .mUHOm w I NENLUW 459 586 3 2 .mfi mmm :oo mfi 4mm _» mmm mzuwwfluomfixscowfifio Eo mmwuufl mcw>xwm|o4Hww HmcflEuww|.m muuxw cm wmš fififlunww :wo maw>xww|uuww ~mc@Euwu|.m øuuxw cm øwš mmwflfimumëmuw æcumUfiuomHxøcom«H0|4mm mfifim www wmxoo muwuoz Anu. mcnmø M mmm«> 1 cwmcflcuummmos mfims www Hmfluwumëmmcmmuø Eow 1 mcummfluomfixflc N mmm .H mmm All! .xw uy umfiflm nwš wcw>xww acnflnflxowøomflfio wwmuwmfluwucæm uxmfiëmx .wømmcwnumfiwxcw mv www mcuwcofluflmom 049 449 OBH B00 OBH B00 ... ... DHA »AO Dmu 444 .muHOw m m HÜHÜUOZ acw < mßH\Qmm mëwnow i « ê % % % % % % mßqnmmn wm w cm: UUUUUU»huwhuhwwh»cduduuhuuuçpuhp0.:. % % % % k % % emnnnwn mn m QmI ouuoo uuuøøu<øud uuwouhomuqwwu 24 & « « « w « f n@~-nfl« ßß N qwz uuuum»uqfåowuuwuhfwuucohuo»»øhowuucoffpuohh._.< .w k , æ % ._ % 4% & wfifilá wß fl 00000330»h ...mfixumån E... uflflsm kw» -owfixac f _. Hmuox som |om«~o . wcu>xww Q 1 qw uucwemmhß Am~c< cofluflmem .> :UD >H .H_H .HH cmflcmemmuu mnnpw mn mucmuumßeo ~mu«~ow~1:com««o\m uxmweux I m memnum 459 586 459 586 25 .F F F F F F F uuuuU< F F F F _ W F Û UUUQQFFUQQFoUu F. F F F F .v F ouo0oFuUu<< F F F F F F F UuQuoFhQuhFu0FoFU< F F F. F F .F F UUUUUFFUFF»uFhUUhuUO< wwmnfimß Qm>|omw mßwnoflw mowaænm ßmnxnßc umHxuw>»n FHHDF ~mF Hwuox som wcu>1ww á Cüfiwwwüï .m nu DL nmcflfl 4 mn mn GN on vw Ha GH m m ß Sšäc ufiu uomflxnc nomwfio | m msmcum w « _. F .v _* + __ wu< __ .__ .w L. __ k. f uuuU0< __ __. L. .v .h « k. uuuoQ<<»uøo<»hu»<<øu .P k + _* e _. M. å. uuouohfiuhfiøhhhhohPuuu»u 6 2 __. _* .f _* .f .f h. uuUuo< F e k F .P __. _. uuOuø><<<0UP«uuu<<< 459 586 mmwfiummflfl mmflfizßfififl wHH~|w«OH Heofinmwm qwm|mmm emmxnmæ um«xum>»: ufiflnu um; umuox som mcm>x@m fi cofluqwom .wuuoß mm ßfl wß wfl mn mfl Hm qfi mß n~, wß NM cm: umcmfl Hmpsac 3» fowfixnc uomqflo | Q wewflum .v .f .f .w .f + e uoooøu + + k. ß k Af k. uuuuo<< 459 586 ß .__ w ___ « k __.

Uuuuohuh Af « _* .f k .w F Uuuøuhuhu»h»Uh 27 .f F .__ .f + .f uuoww<<< ._ av k k L. .w .F uuUUw»< wmwfiamfiwfi =HwH|Nnm« fianfiumwafl mwq~|mmn~ mmnfinmnmfl mnnfifoßwfl ~mHxum>»: ufiflsß um» ammo: saw mcm>xmw « Cßfløwwom .mpnøu ßß mm am: ßß NN cm: ßß du an om mw mä cm: nß wfl umcmfi uweeac vw» |ow~x:c nomflfio nam: 1 m meuzom 459 586 28 .mcummcw>xwm Amfl :co mfi .ß dmm Mmmv UQBÜO muvxw mHmCflEnwu|.m wfl Uwë S00 0000 muuxw mHmcflEumu|.m mv wwë mcmëšmwfififlu mmm Hwwmcmfl .HwwflaowHx5cOm«H0| f ß. .__ ß .P + F s: o Hwßflummwfi ~mHxum>»: uafinß Hm» uwnox Eow mc@>xmm M Cowuflwom .muHOL mn em umcmfl Husen: ufiu xowfixac fomflfio | | m mewzuw 10 15 20 25 30 35 459 586 29 Syntetiska primers som användes för att sekvensbestämma delar av HSA genen När BSA-oligonukleotider klonades in i pUCl9 vektorn, (eller en annan BSA-nukleotid klonades in i en tidigare erhâllen pHSA-vektor), användes en sek- vensbestämningsprimer GTAACGCCAGGGTTTTCCCAGT som ti- digare syntetiserats och kallats pKO-primer I (A. Simoncsits, M. Kálmán, I. Cserpán och C. Kari, Nucleic Acids Res. Symp. Ser. No 14, 1984, 321-322) för att kontrollera de erhållna klonernas sekvens.

Denna primer är belägen mellan nukleotidpositionerna 348-369 i den publicerade pUCl9-sekvensen [Yanisch- -Perron, C., Vieira, J. och Messing, J. Gene, 33 (1985) 103-ll9], och användes för att sekvensbestâmma alla de individuella klonade HSA-oligonukleotiderna (alla 24).

När de stora fragmenten HSA II och HSA III samman- fogades kontrollerades sammanfogningspunkten med en syntetisk primer GCAGCCTTGTCGGCAGCTTG, vilken är komple- mentär med HSA-gensekvensen mellan nukleotidpositionerna S08-527 (för fullt utvecklat HSA).

Sammanfogningspunkten mellan HSA IV och HSA V kontrollerades med användning av en CGTGCAAAACACATAATTGG primer, vilken är komplementär med HSA-gensekvensen mellan positionerna 1374-1393. Sammanfogningspunkten mellan de stora fragmenten HSA III och IV i pHSA (II-V) kontrollerades med användning av själva oligonukleo- tiden HSA 10 som en sekvensbestämningsprimer_ När HSA-gensyntesen fullbordats i pUCl9-vektor sekvensbestämdes hela den HSA-kodande regionen med användning av plasmidmall (plasmid template) och lO olika sekvensbestämningsprimers. Ytterligare bekräftel- se av den HSA-kodande sekvensen erhölls när den om- placerades från pUCl9 vektorn in i Ml3mpl9-vektor (Yanisch-Perron, C. etc) och sekvensbestämning utfördes på enkelsträngad fag-DNA-mall med användning av samma 10 primers. 459 586 primer-namn pKO primer I pHSA pHSA pHSA pHSA pHSA pHSA pHSA pHSA pHSA in 30 §yntetiska prímers för kontroll av hela den HSA-kodan- de regionen antingen i pUCl9 eller i Ml3mpl9 l°i nukleotidposition i den HSA- -kodande regionen É utanför HSA, i lacZ-delen av pUCl9 primer 1 1587-1603 primer 2 1398-1414 primer 3 1195-1211 primer 4 988-1007 primer 5 795- 809 primer 6 582- 597 primer 7 382- 398 primer 8 178- 192 primer 9 66- 85 Den sista primern (primer 9) användes också för att kontrollera sammanfogningspunkten mellan HSA (fullt utvecklat HSA eller Met-form av HSA) och jäst PH05- -promotor-signalsekvensen när HSA-genen omplacerades från pUCl9 in i pPT2HKl. « 10 15 20 25 MATERIAL OCH METODER ÉEEYEÉE ApaI ECORI Klenow-polymeras T4 DNA-ligas KpnI Sacï BamHI XbaI mung bean-nukleas Hind III Sau3AI Ball Pstï Xhoï T4 polynukleotidkínas TI RNas Proteinas K Bclï SalI Helicas Glucuronidas 459 586 31 Lêyëzënëëz Boehringer New England Biolabs (NEB) Boehringer NEB NEB NEB Boehringer NEB Pharmacia NEB NEB NEB NEB Boehringer Boehringer Calbiochem Merck NEB NEB REACTIFS IBF Boehringer 459 586 10 15 20 25 30 35 32 l§9E9B§š Y-32P-ATP ( a-32P-dATP (800 Ci/mmol) : a-355-dATP (lV'l200 (Ci/mmol) kom från Amersham S-metionin (44 800 Ci/mmol) kom från Amersham 5 b I l . 1 1 1 1 I 4 I Kemisk syntes av oligodeoxiribonukleotider Antingen användes fosfat-triestermetoden med hjälp av en manuell DNA-bänksyntetisator (Omnifit), med användning av monomer- eller/och dimer-byggblock (Sproat B.S. et al 1983, Tetrahedron Letters gg, 5771), eller fosforamiditmetoden med användning av en automa- tisk Gene Assembler (Pharmacia) i enlighet med till- verkarens manual. Kemikalierna erhölls antingen från Cruachem (fosfat-triesterkemi) eller från Pharmacia (fosforamiditkemi). 5'-fosforylering av de syntetiska oligodeoxiribonukleo- tiderna I Enzymatisk fosforylering utfördes med användning av T4-polynukleotidkinas och ATP- Beroende på de speci- fika kraven utfördes denna reaktion med antingen radio- aktivt eller icke-radioaktivt ATP. a) Fosforylering med Y-32P-ATP med hög specifik akti- vítet Detta förfarande användes för HSA-oligonukleo- tider för erhållande av hybridiseringsprober eller för 5'-märkning av sekvensbestämningsprimers när sek- vensbestämningsreaktionerna utfördes på plasmid DNA- -mall. 10 pmol oligonukleotia löstes 1 Y-32P-ATP (7 ul, fU 5000 Ci/mmol, l0 mCi/ml) 250 mM Tris-HC1 pH 7,5-50 mM MgCl2 (2 ul) och 100 mM DTT (l pl). 0,5 ul T4 polynukleotidkinas (10 U/nl) tillsattes och bland- Ü ningen hölls vid 37°C under 30 min, behandling (l00°C, varpå en värme- 3 min) utfördes för att inaktivera enzymet. Lösningen späddes i enlighet med den senare behandlingen med antingen hybridiseringsbuffert eller med sterilt vatten. Överskottet av icke- I reagerat 10 15 20 25 30 35 459 586 '33 Y-32P-ATP avlägsnades inte. b) Fosforylering med Y-32?-ATP med låg specifik aktivitet Detta förfarande utnyttjades för att märka HSA- -oligonukleotiderna före de ligerades med adaptrar. 3 zP-ATP (200 Ci/mmol) löstes i 10 pl reaktionsvolym innehål- lande 50 mM Tris-HC1 pH 7,5. 10 mM MgC12 och 10 mM DTT, och 1 pl T4-polynukleotidkinas (10 U/pl) tillsat- tes. Efter att ha fått stå vid 37°C under 1 h, värme- behandlades blandningen vid l00°C under 3 min. 50 pmol oligonukleotid och 100 pmol Y- c) Fosforylering med icke-radioaktivt ATP Detta förfarande tillämpades på: den övre strängen av adapter l och adapter 2, samt på båda strängarna av andra adapter-liknande molekyler, såsom adapter 3 och HSA I-fragment-oligonukleotider_ Fosforylering av den övre strängen av adapter 1- och adapter 2-oligonukleotider utfördes i stor skala enligt följande. 2,2 nmol oligonukleotid och 20 nmol ATP löstes i 100 pl reaktionsvolym innehållande 50 mM Tris-HC1, pH 7,5, 10 mM MgC12, 10 mM DTT och 10 enheter T4 poly- nukleotidkinas. Reaktion utfördes vid 37°C under 1 h, varpå värmebehandling utfördes vid l00°C under 3 min.

Andra icke-radioaktiva fosforyleringar utfördes väsentligen såsom beskrivits för fosforylering med låg specifik aktivitet i 50 pmol oligonukleotidskala, 32P-ATP sattes till men inget radioaktivt märkt Y- reaktionsblandningen, Ligerinq av HSA-oligonukleotider till adapter (allmänt förfarande) 25 pmol 5'-32?-fosforylerad HSA~o1igonuk1eotid blandades med 75 pmol adapter-oligonukleotid med 5'- -fosforylerad övre sträng och med 75 pmol adapter- -oligonukleotid med icke-fosforylerad nedre sträng i 50 pl reaktionsvolym innehållande 50 mM Tris-HC1, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP. Blandningen kyldes till 15°C och ungefär 0,2 pl (ca 80 enheter) 459 586 10 15 20 25 30 35 34 T4 DNA-ligas tillsattes. Reaktionen utfördes vid 1S°C under 4-16 h. 50 pl av 1 M NaC1 och 1 ul av jästbärar-tRNA 3 (10 pg/pl) tillsattes, och oligonukleotiderna utfäll- des med 300 pl etanol i flytande kväve-bad under 2 min.

Blandningen centrifugerades vid 12.000 rpm under S min, pelleten torkades och löstes i 10 ul gelbelastnings- buffert innehållande 80% formamid, 10 mM EDTA, 0,05% xylencyanol och 0,05% bromfenolblàtt. Separation av den ligerade HSA-oligonukleotiden från den icke-ligerade (och från adaptern) uppnåddes genom pàföring av den ovan angivna lösningen på en 10% akrylamidgel som inte innehöll karbamid. Gelelektrofores utfördes vid 400V under 3-5 h med användning av 100 mM TBE som gel och buffert för vandring (100 mM Tris, 100 mM borsyra, 2 mM EDTA, pH 8,3). Efter radioautografi av gelen (2-10 min) lokaliserades 2 radioaktiva huvud- band, av vilka det lägre bandet motsvarade den icke- -ligerade HSA-oligonukleotiden medan det övre bandet motsvarade den adapter-ligerade HSA-oligonukleotiden.

Gelstycket som motsvarade det senare skars ut och blötlades i 50 mM NaC1 (300 pl) vid 37°C under 10-16 h.

Supernatanten behandlades tvâ gànger med fenol (mättad med 50 mM Tris-HC1, pH 8,0, 300 ul) och oligonukleo- tid-adapter-addukten utfälldes efter tillsättning av 30 pl 3 M NaOAc, pH 5,2, 1 pl jästbärar-tRNA (10 ng/ul) och 750 pl etanol.

Pelleten tvättades med etanol, i 10 ul sterilt vatten, en Packard- torkades och löstes och en alikvot räknades (i vätskescintillationsräknare) för att upp- skatta utbytet från ligeringsreaktionen. Utbytet, baserat på utgângsmaterialet 32?-fosfat HSA-o1igo- nukleotiden, varierade mellan 20-50% (isolerat utbyte). 3 21 av de 24 HSA-oligonukleotiderna ligerades med adapter 1- Undantagen är oligonukleotiderna HSA 16, 17 och 18, vilka ligerades med adapter 2. (För HSA 16 var denna nya adapter uppenbarligen nödvän- dig, men det är möjligt att den inte var ett bättre 10 15 20 25 30 35 459 586 35 val för HSA 17 och 18. I vilket fall som helst ligera- des dessa tre oligonukleotider på samma gång med adap- ter 2).

Bakteriestammar De flesta av de HSA-innehållande plasmidtransfor- mationerna och förökningarna utfördes med användning av JMl01 E. coli (Messing, J. Crea, R. och Seeburg, P.H., Nucleic Acids Res. 2, (1981), 304-321). Denna stam har följande genotyp: supE, thi, A(lac-proAB), [F'. traD36, proAB, 1acIqZAMl5].

En dam- E. coli-stam (GM2) (Morinus, M.G. och Morris, N.R. (1973) J. Bact- llg, 1143-1150) användes för plasmidförökning innan BclI-enzymmanipulering erfordrades.

Under pBY2/HSA Nr 1 och pBY2/HSA Nr 2 konstruktio- nerna användes en E. coli (Kl2)-stamm JFl754-stam (hsd R hsdM+ lac gal met leu B his B) som värd, referen- ser: Storms, R.K., McNeil, J.B., Khanendekar, P.S., An, G., Parker, J. (1979), J. Bacte- riol. låg, 73-82; Kiss. G.B., Amin. A.A. och Perlman, R.E. (1981) Molecular and Cellular Biology, 1, 535-543.

Mutationerna leu B och his B av JFl754 kan komple- och Friesen, J.D. menteras med motsvarande jästgener (leu 2 resp his 3, referens: Struhl, K. och Davis, R.W. (1980) J. Mol.

Biol. låg, 309-332.

Jäst-stam AH22O [a, trp 1, leu 2-3, 2-112, his 3-11, 3-15, pho 5, pho 3] haploid-laboratoriestam erhölls från A- Hinnen, CIBA-CEIGY AG, Biotechnology Department, Basel, Switzerland.

E. coli transformation med plasmid- och fag-vektorer Detta utfördes väsentligen såsom beskrivits av Hanahan, D. (i DNA Cloning, Vol I. Ed. Glover, D.M., IRC Press Limited 1985, pp 109-135) med användning av frysta, kompetenta celler som framställts i enlig- het med Protocol 3 i denna artikel. 459 586 10 15 20 25 30 35 36 i Jäst-transformation - ä Jäst-sfäroplaster som framställts genom helicas-be- * handling av AH220 transformerades enligt Hinnen et al (Hinnen, A., Hicks, J.B. och Fink, G.R. (1978) “ Prcc. Natl. Acaa. sei; usn, lg, 1929-1933). - f Plasmid-framställning ( Vi använde den något modifierade versionen av det snabba, alkaliska extraktionsförfarandet (Birnboim, - ! H.C. och Doly, J. (1979) Nucleic Acids Res., 1, 1513-1523) Minipreparat: En enda koloni inokulerades i 3 ml LB-medium (Maniatis, T. Fritsch., E.F. och Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. p 440) som innehöll 100 pg/ml ampicillin och kulturen skakades vid 37°C under 10-18 h. Celler skörda- des genom centrifugering och àtersuspenderades i 100 ul av lösning I (50 mM glukos, 25 mM Tris-HCI pH 8,0, 10 mM EDTA) och lämnades vid rumstemperatur i 5 min. 200 ul av nyframställd lösning II (0,2 N NaOH, 1% SDS) tillsattes, och lösningen virvelblandades en kort stund, varpå den sattes på is i 5 min. Iskall lösning III (150 pl, 3M kaliumacetat-2M ättiksyra) tillsattes och blandningen virvelblandades en kort stund, varpå den sattes pà is i 15 min. Blandningen centrifugerades vid 12.000 rpm under 5 min och 400 ul av supernatanten pipetterades i ett färskt rör. 800 pl etanol tillsattes och blandningen lämnades att stå under 5 min, varpå den centrifugerades vid 12.000 rpm under 2 min. Pelleten àterlöstes i 400 ul 100 mM Tris-HCl, pH 8,0-50 mM Na0Ac, pH 6,5, och 1 ml 95% etanol tillsattes. Efter att ha fått stå vid -20°C 5 under 30 min, centrifugerades blandningen vid 12.000 rpm under 2 min. Pelleten torkades och löstes i l00 pl 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-l mM EDTA-lösning som innehöll 0,5U TlRNas, och lösningen hölls vid 37°C under 30 min, varpå den extraherades med 100 ul fenol som mättats 10 15 20 25 30 35 459 586 37 med S0 mM Tris-HCl, pH 8,0. Den vattenhaltiga fasen togs (ca 90 pl), och 10 pl 3M natriumacetat, pH 5,2, tillsattes, följt av 260 pl 95% etanol, varpå bland- ningen snabbt kyldes i flytande kväve-bad. Efter centri- fugering (l2.000 rpm, 3 min) återlöstes pelleten i 200 pl 0,3M NaOAc, pH 5,2 och 500 pl 95% EtOH tillsattes för att utfälla nukleinsyran såsom ovan (snabbkylning i flytande kvävebad, följt av centrifugering. Pelleten tvättades med 1 ml 95% EtOH, torkades och löstes i 30 ul sterilt vatten.

Utbytet av plasmid-DNA uppskattades till 3-5 pg.

För agarosgelelektrofores och restriktionsanalys använ- des 1-2 ul av den ovan angivna lösningen, medan 3 pl användes för sekvensbestämningsreaktioner. När den ovan erhållna plasmiden användes för senare klonings- experiment togs 20 pl lösning för linearisering med en eller vanligen med tvâ enzymer, följt av lineär vektor-isolering.

Restriktionsenzymklyvning av plasmid-DNA Alla analytiska restriktionsanalyser utfördes i enlighet med tillverkarnas rekommendationer, med undantag av att BSA alltid uteslöts ur reaktionsbuf- fertarna.

När en särskild plasmid klyves i preparativ skala med en eller flera enzymer samtidigt eller efter var- andra ges alltid reaktionsbetingelserna. pUCl9-klyvning med två olika restriktionsenzymer I allmänhet klonas de första HSA-oligonukleotiderna hos de stora BSA-fragmenten (II, III, IV och V) in i pUCl9-vektorn, som klyvts med två olika enzymer.

I enlighet med denna ursprungliga plan klonas endast oligonukleotiderna HSA l, HSA 7, HSA l3 och HSA 19, som tidigare ligerats med en adapter (adapter l) in i pUCl9. Under genhopsättningsarbetet visade det sig emellertid att det var fördelaktigare (eller snabbare) att klona ytterligare två HSA-oligonukleotider, nämligen 459 586_ 10 15 20 25 30 35 1 l 38 I HSA 4 och HSA 17, in i pUC19, istället för in i de motsvarande intermediära pHSA-vektorerna. 5 a) pQ§l9-klyvning med Pstï och EcoRI 1 2 pg pucle behandlades i 1oo pl nögsaltbuffert (100 mM Nacl, S0 mn Tris-Hcl, pH 7,5, 10 mm Mgclz, l mM DTT) med 20 enheter PstI och 20 enheter EcoRI vid 37°C i 4 h. DNA etanolutfälldes genom tillsättning av 5 ul-3M natriumacetat, pH 5,2 och 300 pl etanol, blandningen kyldes under 2 min i flytande kväve-bad, följt av centrifugering vid 12.000 rpm under 3 min.

Pelleten torkades och löstes i 60 pl 4% Ficoll 400, 0,05% bromfenolblàtt, och den lineära vektorn isolera- des efter separation genom elektrofores på en 0,5% agarosgel i 40 mM Tris-acetat, 2 mM EDTA-buffert (TAE- -buffert), följt av elektroeluering, fenolextraktion och etanolutfällning befrämjad av tillsättning av 10 pg jästbärar-tRNA [Maniatis, T., Fritsch, E.F. och Sambrook, J. Molecular Cloning, Laboratory (1982) pp. 164-l66]. löstes i 10 pl sterilt vatten, Cold Spring Harbor Den erhållna pelleten och koncentrationen av lineär vektor uppskattades genom minigelmetoden (ibia., pp. ass-469).

Denna vektor användes för kloningz HSA l b) p§§l9-klyvning med BamHI och EcoRI 2 pg pUCl9 behandlades i 100 ul högsaltbuffert med 20 enheter BamHI och 20 enheter EcoRI såsom ovan, och isolering av den lineära vektorn utfördes väsent- ligen på samma sätt som ovan beskrivits. Denna vektor användes för kloning: BSA 13, HSA 17. c) pg§l9-klyvning med XbaI och EcoRI Detta utfördes med användning av 20 enheter XbaI p och 20 enheter EcoRI för 2 pg pUC19 väsentligen såsom 3 ovan beskrivits.

Xbaï-EcoRI-pUCl9-vektorn användes för kloning: HSA 4, HSA 7, HSA 19. 10 15 20 25 30 35 459 586 39 Klyvning av de intermediära_pHSA-vektorerna med ApaI och EcoRI 20 pl pHSA-plasmid som framställts såsom tidiga- re beskrivits uppgjordes till l00 pl reaktionsvolym innehållande 6 mM Tris-HCl, pH 7,4, 6 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 1 mM DTT och 40 enheter Apaï-enzym, och reak- tionsblandningen hölls vid 37°C. Ett 2 pl prov kördes på en 0,5% agarosgel i TBE-buffert (89 mM Tris, 89 mM borsyra, 8 mM EDTA). När klyvníngen verkade vara full- bordad (efter l-4 h), tillsattes 10 pl av lM NaCl, 5 pl av lM Tris-HCI, pH 7,5 och 20 enheter EcoRI, och blandningen hölls under ytterligare 4-16 h vid 37°C. Den lineära vektor-DNA utfälldes med etanol och renades på en 0,5% agarosgel såsom tidigare be- skrivits för lineär pUCl9-vektorisolering.

Denna ApaI-EcoRI-dubbeldigerering utfördes med följande plasmíder: pHSA 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, li, 19, 20, 21, 22, 23.

Kloning av HSA-oligonukleotid-adapter-komplex i pUCl9- eller EHSA-vektorer Allmänt förfarande: Ungefär 0,1 pg dubbelklyvd pUCl9- eller pHSA-vektor blandades med 5 pmol HSA-oligonukleotid-adapter-komplex i 10 nl reaktionsvolym innehållande 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, l mM ATP och 80 enheter T4 DNA-lígas, och reaktionsblandningen hölls vid l5°C under 4-16 h. Blandningen värmdes till 60°C i 5 min, och efter kylning till rumstemperatur tillsattes 1 nl 1 mM dNTP (innehållande alla fyra deoxinukleosid-5'- -trisfosfater vid 1 mM koncentration) och 1 ul 0,5 en- heter/pl Klenow-polymeras, och reaktionsblandningen fick stå vid rumstemperatur under 15 min. Den värmdes sedan vid 60°C under 10 min och 4 pl sterilt vatten, 2 pl av en buffert innehållande 250 mM Tris-HCl, pH 7,5 samt 50 mM MgCl2, l nl 100 mM DTT, l pl 10 mM ATP och 200 enheter T4 pNA-ligas tillsattes vid l5°C. 459 586 10 15 _20' 25 30 35 40 Reaktionsblandningen hölls vid l5°C i 6-20 h, varpå den transformerades in i frysta, kompetenta JMl0l E. coli-celler såsom tidigare angivits. Kolonierna som erhållits på LB-plattor innehållande 100 pl/ml ampicillin plockades på LB-ampicillin-masterplatta och på nitrocellulosa-replika+platta [Grunstein, M. och Hogness, D. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. USA lg, 3961]. De kolonier som vuxit upp på nitrocellu- losa-replikaplattan lyserades och hybridiserades med den motsvarande 5'-32?-fosfatmärkta HSA-oligonukleo- tidproben [Maniatis, T., Fritsch, E.F. och Sambrook, J. Molecular Cloning (1982), Cold Spring Harbor Labora- tory, pp. 3l4-3251. Vanligen växte 4-10 positiva kolonier upp i 3 ml LB-ampicillin-medium och plasmid-DNA fram- ställdes såsom tidigare beskrivits.

Dideoxisekvensbestämning på plasmid-mall Supercoil-sekvensbestämningsmetoden [Chen, E.Y. och Seeburg, P.H. DNA Q, 165, (l985)] utfördes med några få modifikationer. 3 pl plasmid-DNA, som fram- ställts såsom tidigare, blandades med 17 ul 0,3M NaOH-0,3 mM EDTA vid rumstemperatur. Efter 5 min till- sattes 3 ul 2M ammoniumacetat-ättiksyra, pH 4,5 och 60 pl etanol, och blandningen fick stå vid -80°C under 15 min. Blandningen centrifugerades (12.000 rpm, 5 min) och pelleten tvättades med 70% EtOH, torkades samt löstes i 10 pl buffert innehållande 7 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl2, 5 mM B-merkaptoetanol, 0,1 mM EDTA och 0,25 pmol 5'-32P-fosfatmârkt sekvensbestäm- ningsprimer (de sekvensbestämningsprimers som användes under arbetet visas i Schema l0 och ovan. Ibland använ- des också en av HSA-oligonukleotiderna som sekvens- bestämningsprimer trots det faktum att de innehåller en extra 3'-terminal GGCC-sekvens).

Blandningen värm- des vid 45°C under 15 min.

Därefter pipetterades 2 ul alikvoter in i en mikrotiterplattas brunnar. 2 ul av var och en av de fyra dideoxitermineringsblandningarna J: n 10 15 20 25 HSA HSA 33A HSA HSA HSA 1 2 3 4 5 6 459 586 41 [Hong, G.F. Bioscience Reports, 2, 907 (l982)] och 2 ul 0,25 enheter/pl Klenow-polymeras blandades med var och en av de fyra alikvoterna av primer-mall och blandningarna hölls vid rumstemperatur under 20 min, sedan vid 50°C under 10 min. Till varje reaktions- blandning sattes 3 ul gelbelastningsbuffert innehållande 80% formamid, 10 mM EDTA, 0,05% bromfenolblàtt och 0,05% xylencyanol och blandningarna värmdes vid l00°C under 2 min- Gelelektrofores utfördes på en 6% akryl- amidgel innehållande 8M karbamid, 90 mM Tris, 90 mM borsyra, 2 mM EDTA, pH 8,3.

Kloning av de individuella HSA-oligonukleotiderna (HSA 1, 2, ....24) Den ursprungliga planen var följande: Hela den BSA-kodande regionen indelades i fem fragment, HSA I, II, III, IV och V. De senare fyra fragmenten II, III, IV och V) indelades ytterligare i 6-6 enkelsträngade oligonukleotider (som var och en slutade vid den 3'~terminala änden med G och utökats med en extra GGCC-sekvens genom kemisk syntes), samman- lagt 24 oligonukleotider. De stora HSA-fragmenten (II, III, IV och V) skulle erhållas genom pàvarandra följande kloningar av de syntetiska, enkelsträngade oligonukleotiderna (med hjälp av en adapter) in i pUCl9- eller pUCl9-härledda pHSA-vektorer, som här exemplifieras med pHSA II: klonas in i pUCl9 för erhållande av pHSA 1 " " " pHsA 1 " “ " pHsA (1-2) " “ " pHSA (1-2) för " " pHSA (l-3) " " " pHSA (1-3) " " " pusn (1-4) " " " pnsA (1-4) " " " pnsn (1-5) " " " pHsA (1-5) " " " pHsA (1-6), eller pHSA II. 459 586 10 15 20 25 30 35 42 Pâ liknande sätt erhölls pHSA III från oligonukleo- tiderna HSA 7, 8, 9, 10, ll, 12. pHSA IV erhölls från oligonukleotiderna HSA 13, 14, l5, 16, 17, 18. pHSA V erhölls från oligonukleotiderna HSA 19, 20, 21, 22, 23,.24. “a Denna allmänna strategi användes vanligen för kloning av HSA-oligonukleotider med hjälp av adapter 1 (se Schema 3l, men vi avveck från denna strategi i nägra få fall. Anledningarna till att göra det var antingen att snabba upp hopsättningsarbetet genom I parallell kloning av mer än en oligonukleotid inom w ett stort fragment (såsom ifråga om HSA II) eller att lösa kloningsproblem som vi stötte på under arbetet.

Dessa undantag är: HSA 1 oligonukleotid kunde klonas i sin helhet endast med hjälp av en partiell duplex (vid 5'-ter- malen av HSA l) HSA II stort fragment erhölls som pHSA II från de tidigare klonade HSA (1-3) och HSA (4-6 ).DNA-seg- menten ' HSA 15 oligonukleotiden kunde endast klonas för erhål- lande av den korrekta sekvensen med hjälp av komplementär oligonukleotid, som täckte nästan 2/3 delar av den ursprungliga HSA 15 oligonukleotiden kunde endast klonas med hjälp av en ny adapter (adapter 2) oligonukleotiden kunde inte klonas in i pHSA HSA 16 HSA 17 (13-16) så att den förväntade pHSA (13-17) kunde erhållas. Trots att HSA 17-sekvensen återfanns i de erhållna plasmiderna, obser- verades utplànanden i de tidigare klonade regionerna. Sá HSA 17 klonades in i pUCl9. oligonukleotiden klonades in i pHSA 17 med hjälp av adapter Å HSA 18 HSA IV stort fragment erhölls frán de tidigare klonade HSA (13-l6) och HSA (l7-18) DNA-segmenten. 459 586 43- _wme~H» :oo .= .ßmcfiw _.h.o .ucuz ..1 _»wH@°u _.n.: .pfimw _.4.= .;»H@;xu=@ IwCU>¥mm ONE w~n|HNn .< wu«u< ufimfioaz fiqæmfiv .u .fiuwx :oo .H .cmunmmu .z _c@Efiwx ..< .muflwocoefim woßfilflmwfi .w .mmm muHQ« H Hz .www .QE>m .wwm "H ~ue~Ha|oxn ufimfiuaz .^Hwm~v .u.m numEfi~n»Hme1ßfi wmw|m«w .¶ muwonmm wcmfiuwoflm ^HæmHv .L.u .mcoz "HwEHHa|mmum>mm .kwmcmnmßmhuumefiwu o»< ||||||||||||i|||||||||v H Hmsfiunnoxn wcmaemwfiñflu ^mfinEnHz uwñflmv Hzoum Hcny Hzewm u<»»uuøu»uuu<< Homm Hmem Hmnx u»<<< nmsfluunumsfßfi Hflmm Hznw |o Hawa HHW van: w» Allllllilllllll «ma«~u|wmpw>mm w~@e«~ammc«cem»wwn mflusa mo; :oflmm~mmc«coHx>~om 1 ofi msmcum 459 586 10 15 20 25 30 35 44 Kloning av HSA 1 in i pUC19 När man försökte klona HSA 1-oligonukleotiden ligerad med adapter 1 (HSA l+A1) in i BamHI-EcoRI-klyvd pUC19 genom det kloningsförfarande som ovan detaljerat k beskrivits, erhölls inte den kompletta HSA 1-regionen Z i klonad form. Ungefär 50 kolonier som hybridiserats med 5'-32P-märkt HSA 1-oligonukleotid sekvensbestämdes, och man fann att de flesta av kolonierna saknade den 5'-terminala T-resten hos HSA 1 (resten av dem saknade mer än en rest).

En ny strategi användes sedan för att fâ hela HSA 1 klonad enligt följande. Pstl-EcoRI-klyvd pUCl9 användes som en kloningsvektor, och en syntetisk, partiell duplex som hade en PstI-enkelsträngsände (sticky end) vid 5'-terminalen och en 10 nukleotid lång 5'-utskjutande region (5' vid sin 3'~terminal tär med den 5' -protruding region) , vilken senare region är komplemen- -terminala regionen hos HSA l, inkludera- des i reaktionsblandningen. Användningen av denna "hjälp-duplex" visas i Schema 11. 0,1 pg av PstI-EcoRI-klyvd pUC19-vektor blandades med 5 pmol HSA 1+Al, 5 pmol 5'-fosforylerad GTGCGATC och 5 pmol 5'-føsforylerad TCTTCACCTAGATCGCACTGCA i 10 pl reaktionsvolym, och hela kloningsförfarandet utfördes väsentligen såsom beskrivits i det allmänna förfarandet. 100 kolonier kontrollerade s genom hybridisering med 5'-32P -märkt HSA 1-oligonukleotid som en prob.

Av de 29 positiva klonerna användes 10 för sekvensbe- stämning med hjälp av pK0-primer I och reverse-primer. 8 av de 10 sekvensbestämda klonerna innehöll den kor- rekta sekvensen. Plasmid-DNA från en av de korrekta É klonerna användes i nästa steg som pHSA 1 för ApaI-EcoRI- -dubbeldigerering och för kloning av HSA 2 -o1igonukle- otid. 459 586 45 fi|1||x1||1|.H OBHBBUBBU ||||:o<<@eu11|:|owwuuuesuo<< |||||o@a< Hmoum Hama H mømflfilmzo wa .M NPZUIT WMHNGCnHOQIÉOCWHM . N m«@Hfi| < U||l||UUUUOUá4UUBB mflunm w>>Hx« |Hm0um1Huwm |||||@ x|:r|uee<<@ U<<< Hámfimm Humm =xwH@øw-mHWfiß= maueau uaæouøawm H<+fi áwm u mwlllll HH mšwcum 459 586 10 15 46 Kloning av HSA 2 in i pHSA 1 0,1 pg Apaï-EcoRI-klyvd pHSA l blandades med g S pmol HSA 2+A1 i 10 pl reaktionsvolym, och klonings- stegen utfördes såsom ovan beskrivits. (Schema 12). 40 kolonier ståmpelympades (replica plated) och hybriaiseraaes med 9-32 P-HSA 2-oligonukleotid som en prob. 9 positiva koloníer erhölls och plasmid-DNA framställes från dem. De sekvensbestämdes med användning av pK0-primer I. 5 klonier innehöll den korrekta HSA 2-sekvensen. Plasmid-DNA från en av de korrekta klonerna [pHSA (1-2)] användes i nästa steg för att klona HSA-3- -oligonukleotid. 'h 459 586 47 fl N .QmI H áwfl Q nallløæaeeu|||||wwwuuo ^~|Hv Hmoum Hmmm mm@fiH; mBz©+ mmumëæfiomxšocmfim .N wmmflfizazo va .H H<+~ < ux|x|1uuuwwo@u<4<< waaufioumuuæm m > H u> Hx»Hmoum|Hm <1||1|uaa<<@ uuwow< H dwmfl fl cfi N 4mm >m mcflfioflx I NH måwnum 459 586 10 15 48' Kloning av HSA 3 in i pHSA (1-2) 0,1 pg Apal-EcoRI-klyvd pHSA (1-2) bringades att reagera med 5 pmol HSA 3+Al i 10 pl reaktionsvolym, såsom tidigare beskrivits. (Schema 13). 187 kolonier stämpelympades och hybridiserades med 5'-32P-HSA 3-oligonukleotídprob. Av de 42 positiva klonerna användes 10 för framställning av plasmíd-DNA och de sekvensbeståmdes med användning av pKO-primer I. En klon var korrekt och den plasmid som framställdes därav kallades pHSA (1-3). pHSA (1-3) användes senare för att klona HSA (4-6) DNA-segment (se nedan). n U __ ___” _______A____A___ “MW __ __ 459 586 49 ^m|H, amma .~|H. amma ø>mHg|Hmoom|Hmm< lxzllwaaeaulrlllwowuuu |||||uaa< Hmoum Hmmm mmmHH| mBzw+ wmHwE>HOm43ocwHx .N mmmHH| H 4 +~ am: < o|||11uuuwwoaowu lllllw muæuaaealltll 1|||1uaa< «1!|11|11||1m mfi mëwcuw 459 586 50 Kloning av HSA 4 in i pUCl9 0,1 pg av XbaI-EcoRI-klyvd pUCl9 och 5 pmol HSA 4+A1 bringades att reagera i 10 pl reaktionsvolym såsom tidigare beskrivits (Schema 14). 110 kolonier plockades och 45 av dem visade hybri- disering med 5'-32P-HSA 4-oligonukleotidprob. Plasmid- -DNA framställdes från 4 positiva kloner, varpå de sekvensbestämdes med användning av pKO-primer I, och alla befanns innehålla den korrekta HSA 4-sekvensen samt de förväntade flankerande regionerna. Sålunda erhállen pHSA 4 innehöll det regenererade XbaI-sitet vid 5'-terminalen av HSA 4, som senare kunde elimine- ras vid sammanfogningspunkten mellan oligonukleotiderna HSA 3 Och HSA 4. 10 15 pHSA 4 användes för att klona HSA 5 i nästa steg. m. 459 586 51 %ll||l||l||!w fimm |1|||w< « Hmoum Hmmá Hmnx wmmfiH1 mBz@+ mmnwëæflomlšocwfix .N wøwflH| H<+« w||||1uuuwwwo<øu<< uazllw mua mfluam @>>Hx«Hmouw|Hmnx u@@<<@ B va mEwLum 459 586 52 Kloning av HSA 5 in i pHSA 4 0,1 pg av ApaI-EcoRI-klyvd pHSA 4 och 5 pmol HSA 5+Al bringades att reagera i enlighet med det allmänna förfarandet (Schema 15). 65 kolonier hybridiserades med 5'-32?-HSA 5-prob och 3 av dem visade sig vara positiva. Plasmíd-DNA framställdes från de positiva klonerna och en av dem var korrekt, denna kallades pHSA (4 för att klona HSA 6 i nästa steg.

-S) och användes n? 459 586 mSZU+ 53 v amma |||||w< ^m|«v =:;;=; efiz- m HMOUW Hmmd wwmflH| mmnwšmflomašocwñx .w wm@HH« H<+m amm 4 OII|||UUUOUO< |i|1|w ø>>H1|Hmoum|Hmm< ||:fluee< UBBBÜOOBBOBOOBOOBB U@4@UUU< u<< mowauuee|1||| uuwoøu mfi mEm§um 459 586 54 Kloning av HSA 6 in i pHSA (4-5) 0,1 pg av ApaI-EcoRI-klyvd pHSA (4-5) och S pmol HSA 6+Al bríngades att reagera i enlighet med det allmänna förfarandet, (Schema 16). 5 225 kolonier replíkerades och hybridiserades med 5'-32P-HSA 6-oligonukleotidprob. 72 av dem visade sig vara positiva och 10 av de senare användes för att framställa plasmid-DNA. Av de 10 sekvensbestämda -primer I) plasmiderna innehöll 10 2 den korrekta HSA 6-sekvensen, plasmider kallades pHSA (4-6). (med användning av pK0 och den ena av dessa pHSA (4-6) användes senare för att erhålla HSA (4-6) DNA-segment, som klonades in i pHSA (1-3) för att erhålla pHSA (l-6), eller pHSA II. 15 459 586 55 í|s|||||1|zz@ 1|1|1|11|||||||u< lån? UI||I|IUUUUU UOG/wwfld Awxq. amma l|||1oea< Hmoom Hmmm w«m«H| mazï. .wmuwšæfiomašocwfiz .w mm@flH| H 4+@ æmm < w||4a|ouoooooæaoea oeeuasau | a > hm w. mmm |1|||w @usauwsa1||1| w> Hx:Hmoom|Hm <||||luaa< mä mswfluw 459 586 10 15 20 25 30 ss i Kloning av HsA 7 in i pUc19 ' 0,1 pg av XbaI-EcoRI-klyvd pUCl9 och 5 pmol HSA ö 7+Al bringades att reagera i enlighet med det allmänna förfarandet (Schema 17).

Klonerna som innehöll HSA 7 utvaldes i enlighet 5 med en färgreaktion. Efter transformation ympades de transformerade cellerna på platta i närvaro av IPTG (IPTG: isopropyl-B-D-tiogalaktopyranosid) och X-gal (X-gal: 5-bromo-4-kloro-3-indoyl-B-galaktosid) [Vieira, J. och Messing, J. (1982) Gene lg, 259-268].

Vita kolonier på blå bakgrund förväntades innehålla den korrekta HSA-sekvensen. 10 slumpvis plockade vita kolonier inokulerades i LB-ampicillin-medium och plasmid-DNA som framställts från dessa sekvensbestämdes med användning av pK0-primer I. 7 av dem innehöll den korrekta HSA-sekvensen, och en av dem användes senare som pHSA 7 för att klona HSA 8 i nästa steg.

Oligonukleotiden HSA 7 innehåller, oligonukleotiden i HSA III-fragmentet, 5'-terminal sekvens, som den första en extra GGTAC vilken infördes för att man skulle kunna använda denna sekvens, som bildar ett KpnI-site för att sammanfoga det stora fragmentet BSA III med det stora fragmentet HSA II. Denna extra sekvens bör försvinna efter det att relevanta reaktioner utförts, tillsammans med nästa C-rest, så denna sekvens ingår inte som en del av HSA 7 när den redan är klonad i pHSA 7, såsom visas i Schema 17. 459 586 57 nxzllw< ß mmma |||||ues< Hmoum Hmmm Hamn mm@fl~1 mBzø+ wmumfiæfioaxšocmflx .N wmm«H« H<+> mmsaulilxnwwwouu wsaulluuuwwøeaweaa o< m w |||1|u muaæø<|1a|i mflum w> HåuHmoumfHmE«m||1||uea< ïïß (mm llclll! ßfl mëwfluw 459 586 S8 Kloning av HSA 8 in i pHSA 7 0,l pg av ApaI-EcoRI-klyvd pHSA 7 bringades att reagera med 5 pmol HSA 8+Al i enlighet med det allmänna förfarandet (Schema 18). 5 240 kølonier testades genom hybrídisering med prob 5'-32?-HSA 8, och 6 av dem var positiva. 2 av dem uppvisade den korrekta HSA-sekvensen efter sek- vensbestämníng med pKO-primer I. Plasmid-DNA från en korrekt klon medfördes vid den allmänna klonings- 10 strategin som pHSA (7-8) för att klona HSA 9 i nästa steg. 15 459 586 59 +||||||;\||:.@ ||lllU4 .mnßu amma 111110aaæmølsllluuowwwsauuaa Hmouw Hmmm wmwfiflnæzo va .m mBzø+ mmwwšæfiømušøcwflx .N wmmfiH| 4 UIIIIIUUUUUOBBUUBB ||||1w > amma w>>Hx|Hmoum|Hm@< ||1||uaa<<@ BUU H<+@ mu< uuwwwæeoeae11||| æfl mëwzuw 459 586 60 Kloning av HSA 9 in i pHSA (7-8) 0,1 pg av Apal-EcoRI-klyvd PHSA (7-8) och 5 pmol HSA 9+Al bringades att reagera i enlighet med det allmänna förfarandet (Schema 19). 240 kolonier stämpelympades och hybridiserades med 5'-32?-HSA 9-oligonukleotidprob. Plasmid-DNA fram- ställdes från 8 av de 13 positiva klonerna och sek- vensbestämdes. 3 av de 8 sekvensbestämda klonerna innehöll den korrekta pHSA (7-9) plasmiden. 459 586 61, .A..-.-la;@ 1|||:w< ^m«ß. awmm xnlliveemawulllluuuwwoauww<< wwu@aw<<< Hmoum Hmm< wmmflHc mBzU+ wmuwšæfiomlšocmfix _N wmmfiH| H<+m æwm <<@@o111||wøouoo o||||1uuuouweuwo<< wwuHew<<< 1 Q > .m ßv ø> HM|Hmoum«Hm <|||||uae< mä NEUCUW 459 586 62 Kloning av HSA 10 in i pHSA (7-9) 0,1 pg av Apaï-EcoRI-klyvd pHSA (7~9) och S pmol HSA l0+A1 bringades att reagera på det vanliga sättet (Schema 20). 5 Av de 202 kolonierna uppvisade 58 hybridisering med 5'-32?-HSA 10-oligonukleotidprob. 10 positiva kloner användes för att framställa plasmid-DNA för sekvensbestämning, och 8 av dem innehöll den kørrekta pHSA (7-10). 10 15 459 586 63 rllzlomæasu|||||wwwuuo< ^oH«ßV amma |1|||wßsmmu|||1|wpmmwwaeuæwe < Hmoum Hmmæ wmmHH| mßz©+ wmHwE>Hom|30cmHx ~N wmmïzmza FH Ä H<+oH mmm aæasullualwowuuu o|1|||uuuøooaav 1 Q w > Am ßv mmm |||||u @u > I OO I m Hx Hm m H <|11:1uee<<@ u@wwwsuow<<||111 ?||l|l|l|lllofi dmm m ëwfl ON mswnvw 459 586 10 15 64 Kloning av HSA 11 in i pHSA (7-10) 0,1 pg av ApaI-EcoRI-klyvd pHSA (7-10) och 5 pmol HSA l1+Al bringades att reagera på det vanliga sättet (Schema 21). 160 kolonier stämpelympades och 9 av dem visade sig vara positiva efter hybridisering med 5'-32P-HSA 11-oligonukleotidprob. Plasmider som framställts från de positiva klonerna sekvensbestämdes med användning av pKO-primer I. En av klonerna befanns innehålla den förväntade sekvensen och plasmid-DNA som framställts från denna klon användes i nästa steg som pHSA (7-ll). 459 586 65 ..- :1|||:||1|1HH |1||1w< _HH|ß.

Hmoum Hama mmwHH| maz®+ mmnwëæfiomlzocmfim .N ww@HH1 H«+ñH amm < oulualuuuwwwaæaues uweøaaæwossm 4 Q > AQH ß. mmm ||||Iw mu< ø> Hx|Hmoum«Hm 4 uae< flm mšmcum 459 586 10 15 20 66 Kloning av HSA 12 in i pHSA (7-ll) 0,1 pg av ApaI-EcoRI-klyvd pHSA (7-ll) bringades att reagera med 5 pmol HSA l2+Al i enlighet med det allmänna förfarandet (Schema 22). 240 kloner testades och ll av dem visade sig vara positiva efter hybridisering med 5'-32P-HSA 12- oligonukleotidprob. 2 av 10 sekvensbestämda (pKO primer I) plasmid-DNA verkade vara korrekta och en av dem användes senare som pHSA (7-12) eller pHSA III, dvs som innehöll det stora HSA III fragmentet plasmid.

Sekvensen för HSA (7-12), eller HSA III fragmentet bekräftades genom sekvensbestämning i Ml3mpl9- och mpl8-vektorer. pHSA III klyvdes med PstI-och EcoRI, det lilla fragmentet isolerades och klonades in i PstI-EcoRI-klyvda Ml3mpl8- och mpl9-vektorer. Enkel- strängad fag-DNA framställdes från rekombinanterna och de sekvensbestämdes med användning av 17-mer-primern. 459 586 67 HHH amma |||1au< Hwfiflw ^~H|~.

Hmoum Hm@< wwwflH| mBz@+ wmumE>Hom|3OcwHx .N mmmfiflzmzn «e .H H<+~H <4EBUl|lIlOOUUUU OIIIIIUUUUU094440U|Il|l||ll|l||||OB< Afifiußv mmma |||||w @uaa<ø<<11|:| w>»Hz|Hmoum|Hm@< oasama uuoww<@suaB411|| mm mšwnvw fllslxlllæwfi 459 586 10 15 20 68 Kloning av HSA 13 in i pUC19 0,1 pg av BamHI-EcoRI-klyvd pUCl9 och 5 pmol BSA l3+A1 bringades att reagera i enlighet med det allmänna förfarandet (Schema 23). 80 kloner testades genom hybridisering med 5'-32P- -HSA 13-prob och 14 av dem befanns vara positiva.

Plasmid-DNA framställdes från 10 positiva kloner och sekvensbestämdes med användning av pKO primer I. 6 av dem var identiska med den förväntade pHSA l3-plas- miden.

BSA 13-oligonukleotiden, i likhet med HSA 7, innehåller en extra GGTAC 5'-terminalsekvens, eftersom denna oligonukleotid är den första i det stora frag- mentet HSA IV. I detta fall bildades också ett Kpnl- -site, som senare kan användas för att sammanfoga de stora fragmenten HSA III och HSA IV så att denna extra sekvens elimineras vid sammanfogningspunkten. pHSA 13 användes för att klona HSA 14 i nästa steg. w i 459 586 69 fxnasulnxnnnlmfi |||||w<<æ@u1|||1wwwuuue@u mä Hmoum Hmma Hcmw. mm@flH| mBzU+ mmnwE>HOQ|3ocwAM .N mwmflfizazo wa _~ H<+~H 4 w|||:|uuuwwwmmweuw||l||1||x«|111|uo m > mfluø |||||w @o ø> Hz:Hmoom|Hmeøm1||1|usa< mv! mm Ewßom 459 586 10 70 Kloning av HSA 14 in i pHSA 13 0,1 pg av ApaI-EcoRI-klyvd pHSA 13 bringades att reagera med 5 pmol HSA l4+Al i enlighet med det allmänna förfarandet (Schema 24). 2 av 160 kloner som testats genom hybridisering med 5'-32?-HSA 14 var positiva. Efter plasmidfram- ställning och sekvensbestämning med pKO primer I, innehöll den ena av de två plasmid-DNA den förväntade sekvensen. Den kallades pHSA (13-14) och användes i nästa steg. 459 586 71. fllllxulxsvfi |||||w< ^«H|mHv mmmm 1||||uaa< Hmoum wmmw wm@flH- mHZU+ mmuwäæfiomlzocwfim .N _mm@fiH| Há+wH áwm 4 OIIIIIUUUUUOBBUHBO||l|ll|l|llll|lBBUU MH mmmm uzfllw moeeu w>>Hx|Hmoum|Hm@< usaaæm uuouwææoaowllzal vw mëmzum 459 586 10 15 20 25 30 35 72 Kloning av HSA 15 in i pHSA (13-14) När man försökte klona HSA l5+Al in i ApaI-EcoRI- “j -klyvd pHSA (13-14) i enlighet med det allmänna för- farandet erhölls ett stort antal kolonier som hybri- diserade med 5'-32?-HSA-15, men efter sekvensbestämning v av deras plasmider återfanns aldrig den förväntade HSA 15-sekvensen. Istället erhölls en dubbel-muterad HSA 15, i vilken mutationen G->T uppträdde vid nukleo- tidpositionerna 1082 och 1106 (nukleotidpositioner i fullt utvecklat HSA-gensekvensen). Dessa G-rester var omgivna av T-rester. Möjligheten att dessa synbara mutationer endast berodde på màngtydig gelavläsning, vilket ibland förekommer med användning av plasmid- -DNA-mall, uteslöts efter omkloning in i Ml3mpl9 _fag_ vektor av den region som var av intresse.

Eftersom dessa två mutationer uppträdde samtidigt i samtliga fall (19 olika positiva kloner testades), var vi tvungna att ändra den allmänna kloningsstrategin i detta fall, så att en komplementär oligonukleotid som täckte muta- tionsställena i HSA 15 användesš En komplementär 42-mer-oligonukleotid framställdes, och den inkluderades i ligationsblandningen av 5'-fos- fat-HSA 15 och adapter 1. 50 pmol 5'-32?-HSA 15 blan- dades med_l00 pmol 5'-fosfat-42-mer, l00 pmol av övre strängen av S'-fosfat-adapter l och 100 pmol av lägre oligonukleotidsträngen av 5'-hydroxyl-adapter l. Den partiella duplexen isolerades efter gelelektrofores såsom tidigare beskrivits i OJ 30% utbyte baserat pà BSA 15. Denna partiella duplex kallas HSA 15 + C + A1 i Schema 25.

Därefter bringades 0,1 pg av ApaI-EcoRI-klyvd pHSA (13-14) att reagera med 5 pmol HSA 15 + C + A , ; och reaktionerna utfördes i enlighet med det allmänna förfarandet. 340 kloner testades med 5'-32?-HSA 15-prob och av de 17 positiva klonerna användes 12 för att framställa plasmid-DNA. De sekvensbestämdes (pKO primer I) och 2 av dem innehöll den förväntade HSA l5-sekven- 459 586 73 sen. Denna sekvens bekräftades genom omkloning av den sålunda erhållna HSA (13-15)-regionen in i M13mp19-fagvektor øch genom utförande av sekvensbe- stämningsreaktioner på enkelsträngad DNA-mall.

En av de korrekta plasmiderna användes som pHSA (13-15) i nästa steg. 459 586 74 É md ^mH-nHV < Innfxuh»<<@|1||1QuUQ@u< ~=@uw HmQ< wm@qH1<2Q QR .n mkzu+ mmhms>~on:zocmHx »N mm@fi~« H<+U+mH <<»hQ uouuuuh»<@uu»< @|||1|uuu@uu<<»uøU<»Huh>Hx|HmQuu-HmQ< u»»< mm@~fi««zQ qh H nmunmnm < o uoouuu ua ab~ ma qmz uuoUo<<»uuudwhU~ mm wåmcum 10 15 20 25 459 586 75 Kloning av HSA 16 in i pHSA (13-15) När HSA l6+Al klonades in i ApaI-EcoRI-klyvd pHSA (13-15), hade alla de 16 sekvensbestämda positiva klonerna en 9 baspar utpláning vid den 5'-terminala änden av HSA 16-regionen. Ny undersökning av HSA l6-sek- vensen avslöjade att dess 5'-terminala region och den 5'-terminala regionen hos den lägre strängen av adapter 1 var nästan perfekt komplementära. Vi planerade att använda en annan ApaI-EcoRI-adapter som saknade denna komplementära region (adapter 2, se Schema 3).

HSA-oligonukleotider ligerades med adapter 2 på exakt samma sätt som med adapter l. 0,1 pg Apal-EcoRI-klyvd pHSA (13-15) bringades att reagera med 5 pmol HSA l6+A2 enligt det allmänna förfarandet. Av 60 kloner befanns 24 vara positiva ZP-HSA 16-prob. 10 positiva kloner användes för att framställa plasmid-DNA, de efter hybrídisering med 5'-3 sekvensbestämdes med pKO-primer I och två av dem visade sig vara den förväntade pHSA (13-16). pHSA (13-16) användes senare för att framställa HSA (13-16)-DNA-region, som klonades in i pHSA (l7~l8) för erhållande av pHSA (l3~l8), dvs pHSA IV. 76 459 586 .J Ö Awfllmflv amma ^mH|mHv æwma ø>>~x|Hmoom|Hmm< Tllllallulwfl »||||w< HMOUW Hwmfi wm@fl~: mezmï mmumäæfioa.. Bocmåm _ N wm@«H| ~<+wH mmm ÉBBUIIIOOOUUU |||||uee< OIIIJUUUUUU< |||||o |||||ues< @oas uoowø< om mEwLUm 10 15 459 586 77 Kloning av HSA 17 in i pUC19 0,1 pg av BamHI-EcoRI-klyvd pUC19 bringades att reagera med 5 pmol HSA l7+A2 på det vanliga sättet (Schema 27). 160 kloner testades genom hybridisering med 5'-32 P- -HSA 17. Av dem var 30 positiva, och plasmider framställ- des från 8 av dem. 2 kloner innehöll den förväntade pHSA 17-plasmiden enligt sekvensbestämningsdata (pKO primer I)- 78 459 586 %|||1||||||1|>H l|I||w< ßfi Qwmm |I|I|uBBa Hmoum , Hmmd Hmëmm wmmHH- mBzU+_ mmnwEæHom|3ocwHz .N mm@«H« ~<+ßH <4BBUl|I|IOOOUUO U!||||UUOOOOBBBO<<íll||l{||l||||4UB0UUBB< Q _ m mfiua |||l|o @o I OO I m w> Hx Hm m Hma m|||11uBe< ßw mewßum 10 15 459 586 79 Kloning av HSA 18 in i pHSA 17 0,1 pg av ApaI-EcoRI-klyvd pHSA 17 bringades att reagera med 5 pmol HSA l8+A2 (Schema 28).

Av de 160 klonerna som testats genom hybridisering 32 med 5'~ Plasmid-DNA från fyra av de positiva klonerna framställ- P-HSA 18-prob, befanns 24 vara positiva. des och sekvensbestämdes med användning av pKO primer I. 2 kloner innehöll den korrekta pHSA (17-18) plas- miden. 459 586 80 flllllllsluæfl ||l|lw4 ||I||uBe< fimfilßflv Hmoom H mm< mmmflH« mszw+ wmumëæfiomlzocmflz ~ N wmmflfilæzo va .H N <+mH mwm < o||||1uuoouwa@ ßfl w>>Hx|Hmoum|Hmm< ua@< UBUBO< mu<< u0w@wBeeu<<||||| mm mEwcUm 10 15 459 586 81 Kloning av HSA 19 in i pUCl9 0,1 pg av XbaI-EcoRI-klyvd pUC19 bringades att reagera med 5 pmol HSA l9+Al i enlighet med det allmänna förfarandet. (Schema 29).

Transformerade JMl0l E. coli-celler ympades pà LD-ampicillin-platta i närvaro av X-gal och IPTG såsom beskrivits för pHSA 7. Plasmid-DNA från 6 slumpvis plockade vita kolonier framställdes och sekvensbestämdes med användning av pKO primer I. 2 av dem visade sig vara den korrekta pHSA 19.

HSA 19, i likhet med HSA 7 och HSA 13, innehåller en extra GGTAC-sekvens vid dess 5'-terminal. Denna sekvens, såsom tidigare beskrivits, underlättar sam- manfogning av de stora fragmenten HSA V och HSA IV (se även senare). 459 586 +1|||1||||1|1m~ |||||w< mfi amma |||:|uaa< HMOUW H mmá Hcmx wmmflflzdzn wß .m mBzU+ mmuwëæfiomlšocwflm _~ _ wmmflflaæzn qa .H æ H<+m~ . < w1l|!|ouuwow<<< Q > mñuo |||||w moe w> Hx|Hmoom«Hmnx|||||oee<<@ 91111! mw flšwcuw 10 15 459 586 83 Kloning av HSA 20 in i pHSA 19 0,1 pg av Apal-EcoRI-klyvd pHSAl9 bringades att reagera med 5 pmol HSA 20+A1 såsom beskrivits i det allmänna förfarandet (Schema 30). l60 kloner testades med 5'-3 tidprob och 58 av dem var positiva. flasmid-DNA som framställts från 11 positiva kloner seßyensbestämdes ZP-HSA 20-oligonukleo~ med användning av pKO primer I, och 8 av dem innehöll den korrekta pHSA (19-20) plasmiden. fiomamfiv æmmm %|a1|1|||a||o~ |l|||w< |l||iuaa<«w|||||uouwwweueoea uaaaw wmoum H mmæ 84 mfi ø>>Hx1Hmoum|Hmm< 459 586 mm@flH| maz©+ mmuwëæflomošocmfim .N mm@«H| H<+o~ <<æeu|||||owwuuu w||1|1uuu@uweueuae uBaaw fæøraw § muaeeBuw||||| fllfluasææm uuoøø<<< Om flEwLUm 10 459 586 85 Kloning av HSA 21 in i pHSA (19-20) 0,1 pg av Apaï-EcoRI-klyvd pHSA (19-20) och 5 pmol HSA 2l+Al bringades att reagera på det vanliga sättet (Schema 31). 33 av 240 kloner befanns vara positiva efter hybridisering med 5'-32 P-HSA 21-prob. 6 positiva kloner användes för att framställa plasmid-DNA, och efter sekvensbestämning med pK0 primer I, visades 3 kloner innehålla den förväntade pHSA (19-21) plasmiden. 459 586 86 .--@~V Åomzmflv æmmm u>>Hx|Hmoom|Hmm< %||||111||1|A~ æmmnillllllllillfów awmncnix |||||@ nøllloaaaeurzzllwwouuu |11:auee< Hmoom H mmm m«mHH| mBzø+ mmuwšæfiomlzocmfix .N mwmflfi| H<+H~ mm: < wlazlnuuuwowauaæua aaoaæwoeauum @o |uaa<<@ uøwowaueueallaun än mewßuw 10 15 459 586 87 Kloning av HSA 22 in i pHSA (19-21) 0,1 pg av Apaï-EcoRI-klyvd pHSA (19-21) och 5 pmol HSA 22+A1 bringades att reagera på det vanliga sättet.

(Schema 32). 80 kloner testades för hybridisering med 5'-32 P-HSA 22-prob, och 10 befanns vara positiva. Plasmid-DNA som framställts från dem sekvensbestämdes med användning av pK0 primer I, och endast en visade sig vara korrekt.

Denna kallades pHSA (19-22). 459 586 88 .||l..|\.I.Fi.É_\.;1_.E. _ .. _» Q +||||||||||:||- O< .NNIQHV amma uee< Hmoum ~ m < m@mflH: mBzw+ wmuwëæflomlaocwfiz ~w wmmflH1 H«+- mmm < o|||||ouuwwo<< I Q > AHN mfi. w> Hx|Hmoum|Høm< uea< Nm mewzuw 10 15 459 586 89 Kloning av HSA 23 in i pHSA (19-22) 0,1 pg av ApaI-EcoRI-klyvd pHSA (19-22) och 5 pmol HSA 23+Al allmänna förfarandet (Schema 33). bringades att reagera i enlighet med det 160 kloner testades och 100 av dem uppvisade hybridisering med 5'-32P-HSA 23-prob. Plasmid-DNA framställdes från 8 positiva kloner och de sekvens- bestämdes med pKO primer I. 3 avldem innehöll den korrekta HSA 23-sekvensen i de korrekta omgivningarna.

En av dem användes i nästa steg som pHSA (19-23). 459 586 90 ^m~|mH. flwwlmfiv æwmm U>>Hx|Hm0om|Hmm< f¶|Illl||||l||«mN ímm Illll||||i|lI|;iw~ |||11w< znziluea< Hmoum H m@< mmwflfifazn qg _~ mez©+ mmnmëæflomsšocwflx .N mmwflH» ~<+m~ mmm QÉBBUIIIIIUUUUUU w||||1uuuwowu |||1|uea< uueaawwuzliil uuwww<< mm mëwsom lO 15 20 459 586 91 Kloning av HSA 24 in i pHSA (19-23) 0,1 pg av Apal-EcoRI-klyvd pHSA (19-23) bringades att reagera med 5 pmol HSA 24+Al på det vanliga sättet (Schema 34).

Av 160 kloner uppvisade 37 hybridisering med 5'-32P-HSA 24-prob. Plasmid-DNA framställdes från 3 positivà kloner, och de sekvensbestämdes med pKO- -primer I. 2 av de ovan angivna plasmiderna innehöll den korrekta HSA 24-sekvensen, och en av dem använ- des senare som pHSA (19-24) eller pHSA V.

Sekvensen för HSA V bekräftades efter det att den omklonats som ett PstI-EcoRI-fragment, som erhållits från pHSA V, in i Pstl-EcoRI-klyvda Ml3mpl8- och mpl9- -vektorpar. .> mwmm Hwfiflw _^«N|mHV amma 92 Ammfmflv æwmm +|11\||1||||\«~ UBB< HMOUM H mmá mmmflH| msz©+ .mmuwëæfiomlšocwflm ~w mmwflfixæzn vs .H H<+«~ mww <4BBUII||lOOUUUU o|||1|uuuwow |||||w ¶>>Hx|Hmoum|Hmm< 459 586 :|111uee< @uweu uuwoøu vn nëwcum |||;1- U4<8HUIIIIIUOOUOUH 10 15 20 25 30 35 459 586 93 SAMMANFOGNING AV DE STORA FRAGMENTEN AV HSA Trots att HSA-genen planerats för att sättas ihop av 5 stora fragment (HSA I, II, III, IV och V), har hittills endast syntes av HSA III och HSA V visats.

HSA I är en flexibel 5'-terminal region av HSA och den syntetiserades kemiskt som ett relativt kort Pstï-Sau3AI-segment (se Schema 4). HSA II och HSA IV erhölls från två DNA-segment, dvs HSA II eller (HSA 1-6) erhölls från HSA (l-3) och HSA (4-6), medan HSA IV eller HSA (13-18) erhölls från HSA (l3-16) och HSA (17-l8). Under hopsättningen av de stora frag- menten HSA II och HSA IV utnyttjades reaktionsserier såsom restriktionsdigestion följt av antingen mung- bean-nukleasbehandling eller Klenow-polymeras +dNTP-be- handling. Dessa reaktionsbetingelser har fullt ut beskrivits för erhållande av pHSA II och pHSA IV, och liknande reaktioner kommer endast att hänvisas till när stora fragment av HSA manipuleras.

Mung bean-nukleasbehandling och Klenow-polymeras +dNTP-behandling används för att avlägsna 5'- eller 3'-utskjutande enkelsträngade DNA-regioner som erhållits efter restriktíonsenzymklyvning för att framställa blunt-ändar. Mung bean-nukleas avlägsnar 5'-utskjutande ändar, medan Klenow~polymeras +dNTP-behandling avlägsnar 3'-utskjutande ändar. Den senare behandlingen fyller samtidigt i den 5'-utskjutande änden för att ge blunt- -ände.

QHSA II Det stora fragmentet HSA II, klonad i pUC19 som pHSA II, erhölls från HSA (l-3)- och HSA (4-6)-DNA-seg- ment så att pHSA (l-3) användes som en vektor för att klona HSA (4-6). l ng av pHSA (4-6) behandlades med 10 enheter XbaI i 50 pl reaktionsvolym innehållande l00 mM NaCl, 50 mM Tris~HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, l mM DTT (högsalt- buffert) vid 37°C under l h. Lineär vektor-DNA som erhållits på detta sätt etanolutfälldes, torkades och löstes i 50 pl mung bean-nukleasbuffert (30 mM 459 586 10 15 20 25 30 94 natriumacetat, pH 5,0, 100 mM NaCl, 2 mM ZnC12, 10% glycerol, 0,5 mg/ml denaturerad kalvtymus-DNA) och J behandlades med 1 pl av 10 U/ml mung bean-nukleas f vid 37°C under 30 min. Reaktionsblandningen fenolextra- herades, varpå DNA etanolutfälldes. Pelleten löstes i 50 ul högsaltbuffert (se tidigare för XbaI-behand- ling) och 20 enheter EcoRI sattes till reaktionsbland- ningen, vilken hölls vid 37°C under 1 h. Efter etanolut- fällning isolerades det lilla fragmentet HSA (4-6) genom elektrofores pá en 2% agarosgel (i TAE-buffert), _ följt av elektroeluering och etanolutfällning. Detta ~ fragment har en blunt-ände vid 5'-terminalen och en EcoRI-enkelsträngsände vid 3'-terminalen (Schema 35). 1 pg pHSA (1-3) löstes i 50 pl lågsaltbuffert innehållande 6 mM NaCl, 6 mM Tris-HC1, pH 7,4, 6 mM MgC12 och 1 mM DTT och behandlades med 10 enheter ApaI vid 37°C under 1 h. Efter etanolutfällning löstes pelleten i 50 ul Klenow-buffert innehållande 7mM Tris- -HCI, pH 7,5, 7 mM MgCl2, 5 mM B-merkaptoetanol, 0,1 mM EDTA och 0,1 mM dNTP och behandlades med 0,5 pl 5 U/ul Klenow-polymeras vid rumstemperatur under 10 min.

Efter fenolextraktion och etanolutfällning löstes pelleten i 50 pl högsaltbuffert, och 10 enheter EcoRI tillsattes. Reaktionsblandningen hölls vid 37°C under 2 h, varpå DNA etanolutfälldes. Stora vektorfragment som hade en blunt-ände och en EcoRI-ände isolerades genom elektrofores på 0,5% agarosgel i TAE buffert följt av elektroeluering och etanolutfällning. 35).

(Schema Den klyvda pHSA (1-3)-vektorn (0,1 pg) ligerades med HSA (4-6)-fragmentet (ungefär 0,03 pg) i 10 ul reaktionsvolym innehållande 50 mM Tris-HC1, pH 7,5, 10 mM MgC12, 10 mM DTT, 1 mM ATP (ligasbuffert) och 80 enheter T4 DNA~1igas tillsattes vid l5°C i 12 h.

Reaktionsblandningen transformerades in i frysta, kompetenta JMl01 celler, och de ympades sedan på LB- -ampicillinplattor. Av 110 stâmpelympade kolonier 10 15 459 586 95 uppvisade 55 hybridíseríng med 5'-32 P-HSA 4-oligonukleo- tidprob. Plasmid-DNA framställdes från 10 positiva kloner, och de sekvensbestämdes med användning av reverse-primern. 2 av dem uppvisade den förväntade sekvensen vid sammanfogningspunkten mellan oligonuk- leotiderna HSA 3 och HSA 4, och de användes senare som pHSA (1-6) eller pHSA II (Schema 35).

(Sekvensen för HSA II bekräftades efter det att den subklonats in i PstI-EcoRI-klyvd M13mpl8 och mp19- -fagvektor, och sekvensbestämningsreaktionerna utfördes på enkelsträngad DNA-mall). 459 586 “1 I41IJ .- K _ \ 1 ~ _ + + w m Q m N fi + ~mouw \\\ _~ß< H<~=~m »/~»wm v mßm@_-<2Q F / _ ..\ 4 u - i J - u \\M» + m m Q + .\w + M N H + »w _, ,u ~«°um _~@< @n=w-~==_n _«°Um @u=m¿==_@ H 9 ...cmsmmnß “_32 >m mcfiuæpomu f» .Hopxg »mmcï >m mcfimfio: ñv fißoum ^m _@°Uw ^~ mmmfišflïcßmn mfš S “Czïåon 30,55. AN Hmßx ^_ -n< ^_ ^w-«v I 1 n n _ / _ - - _ _ . \ \\w + Q m Q + \\» Q M N _ + nf Éouw :AZ :Ex Éouw ÉÄ< 222,3 :nu mm mëmsom 10 15 20 25 30 35 459 586 97 QHSA IV Det stora fragmentet HSA IV erhölls från de tidigare klonade DNA-segmenten HSA (13-16) och HSA (17-18) så att pHSA (17-18)-vektorn användes för att klona HSA (13-16) (Schema 36). 1 pg pHSA (13-16) behandlades med 20 enheter Apaï i 50 ul lågsaltbuffert under l h vid 37°C.

DNA etanolutfälldes och löstes i 50 ul Klenow- -buffert innehållande 0,1 mM dNTP och behandlades med 2,5 enheter Klenow-polymeras vid rumstemperatur under 10 min. Reaktionsblandningen fenolextraherades och etanolutfälldes, och pelleten löstes i 50 pl hög- saltbuffert innehållande 20 enheter PstI vid 37°C under l h. Efter etanolutfällning isolerades det lilla fragmentet genom elektrofores på en 2% agarosgel, följt av elektroeluering. Detta förfarande gav DNA~seg- mentet HSA (13-16) som hade en blunt-ände och en Pstl- -enkelsträngsände (Schema 36). 1 pg pHSA (17-18) klyvdes med 10 enheter BamHI i 50 pl reaktionsvolym innehållande högsaltbuffert vid 37°C under 1 h. DNA etanolutfâlldes och löstes i 50 ul mung bean-nukleasbuffert, varpå 10 enheter mung bean-nukleas tillsattes vid 37°C i 30 min. Efter fenolextraktion och etanolutfällning löstes pelleten i 50 ul högsaltbuffert, och 20 enheter Pstl tillsattes vid 37°C i l h. Det stora, lineära vektorfragmentet etanolutfälldes, renades genom elektrofores på en 0,5% agarosgel (TAE-buffert) följt av elektroeluerinq.

Denna reaktionsserie resulterade i klyvd pHSA (l7-l8)- -vektor som hade en blunt-ände och en PstI-enke1strängs~ (Schema 36).

Den klyvda pHSA (17-18)-vektorn (0,1 pg) ligerades med HSA (13-16) (Ca 0,05 pg) i 10 ul ligasbuffert innehållande 80 enheter T4 DNA-ligas vid l5°C i 12 h.

Blandningen transformerades sedan in i frysta, kompe- ände. tenta JMlO1-celler och ympades LB-ampicillinplattor. 230 kolonier testades genom hybridisering med 459 586 10 15 98 5'-32?-HSA 16-prob och 86 av dem befanns vara positiva.

Plasmid-DNA framställdes från 10 kloner och de sekvens- bestämdes med användning av pK0-primer I. 5 plasmid-DNA uppvisade den korrekta sammanfogningspunkten mellan oligonukleotidregionerna HSA 16 och HSA 17, och de användes senare som pHSA (13-18), eller pHSA IV (Schema 36).

(Sekvensen för HSA IV bekräftades efter dess subkloning i fagvektor Ml3mpl8 och mpl9. Sekvensbe- stämning utfördes på enkelsträngad DNA-mall). f: 459 586 99 .>~ 1 m w md Nfl wñ mfi wa mä g w m Hzouw H22 Éšš u.

V. m~@W_| W n Ü wfi WH qfi MH à q mv=m-~==_ß ~=E@m Humß pcmemmwß ßmvfifi >w m:fiHmflomH Av fipmm ^m @Pzv+.~°Q zocwrx AN H@@< AH \» _ wa mfl Q" -_ _ Hmcuw ~@Q< Hzewm H~m@ _ 4 \» H mä Nä ~ H SER.. 222 mflëmäfišïa Så Hfläxwä H@®CfiH Em @C%HÜdOWH AW _»m@ Am wmwfixacncmmn m::E AN Hxeflm Afi v > 4 4 \» i æfi wa å å 330m :nå Ésmm ZLÄ Om MEUEUW 459 586 10 15 20 25 30 35 100 gHsA (II-III) I detta fall användes pHSA III som en vektor för att klona fragmentet HSA III (Schema 37)-I gramställning av fragmentet HSA III 5 pg pHSA III behandlades med 40 enheter KpnI i l0O pl lågsaltbuffert vid 37°C i 3 h. Den klyvda vektorn etanolutfâlldes och pelleten löstes pelleten i 50 ul Klenow-buffert innehållande 0,1 mM dNTP och 2,5 enheter Klenow-polymeras och blandningen hölls vid rumstemperatur under 10 min. Efter fenolextraktion _ och etanolutfällning löstes pelleten i 50 pl högsalt- buffert, varpå 40 enheter BcoRI tillsattes och bland- ningen hölls vid 37°C under 2 h. DNA etanolutfälldes och fragmentet HSA III isolerades genom elektrofores på en 2% agarosgel i TAE-buffert följt av elektro- eluering. Det sålunda erhållna stora fragmentet in- nehållande HSA III hade en blunt-ände och en EcoRI- -enkelsträngsände (Schema 37). 131222iagnsynzëêêlkyslsee: l pg pHSA II löstes i 50 pl lâgsaltbuffert och behandlades med l0 enheter ApaI vid 37°C under 2 h.

Efter etanolutfällning löstes i 50 ul Klenow-buffert innehållande 0,1 mM dNTP och behandlades med 2,5 enheter Klenow-polymeras vid rumstemperatur under 10 min.

Blandningen fenolextraherades och DNA etanolutfälldes.

Pelleten löstes i 50 pl högsaltbuffert, varpå 20 enheter EcoRI tillsattes. Reaktionsblandníngen hölls vid 37°C under 2 h, och DNA etanolutfälldes. Det stora vek~ torfragmentet isolerades genom elektrofores pá en O,5% agarosgel i TAE-buffert följt av elektroelue- ring. Den sålunda erhållna lineära vektorn har en blunt-ände och en EcoRI-enkelsträngsände (Schema 37).

Liaëëiea 0,2 pg av klyvd pHSA II-vektor blandades med 0,1 pg HSA III-fragment i 10 pl ligasbuffert, och 80 enheter T4 DNA-ligas tillsattes. Reaktionsblandníngen hölls vid l5°C under 14 h och transformerades sedan 10 15 459 586 101 in i JM10l B. coli-celler. Ungefär 50% av de ampicil- linresistenta kolonierna uppvisade hybridisering med 5'-32?-HSA ll-oligonukleotidprob. Plasmid-DNA som framställts från 8 positiva kloner sekvensbestämdes med användning av en syntetisk primer som var komple- mentär med en del av HSA-oligonukleotiden (mellan nukleotidpositionerna 508-527 hos genen för fullt utvecklat HSA), och alla 8 uppviade den korrekta sekven- sen vid sammanfogningspunkten mellan de stora fragmenten HSA II Och HSA III. 459 586 102 .w~Hm-Huw1 uwufiuamncfi .m»flm-Hpm@ Haag mucmfifimcumß H we@-mQu= Hm eow mouflw nu Hufifiwzwccfl âow :ua mfiusn can; Hmssmuwflmn som mvfimnmmcflcofix ufimaflpfine nmuå ^H_H-H~V ~ fi - n . q . u mo: Hmouufng ~ H.. HH á _@Q< fi m~m._1<=Q Q» . u _ u _ » ~.H . _ __ .wuz Mmoum » ~«oumm|L A % ~@n< mu:w|«==_n n ; un:-Q H ~:msmm~¥ gwufia >m mcfiuuflomfi Av ~o»xm> Hmwcflfi >m mcflum~omH ^w ~1oum Am _mouu An @hzv+._on zø=m_x AN @wzv+._o@ :o=w~¥ AN ~=Q¥ AH H~Q< AH _ . . _ _ _ ~ _ % H__ \% %mU= 11% Å HW % mus *menu H~n< Mza! Hzemm Huouw _ Q< ~ ßm måwcuw l 20 25 30 35 0 15 459 586 103 Q§§ê_LšY:Y) I detta fall tjänstgjorde pHSA V som en vektor för kloning av HSA IV-fragmentet (Schema 38).

Framstšllning av HSA IV-fragment x 2 ug pHSA IV behandlades med 10 enheter Apaï i 50 ul lágsaltbuffert vid 37°C under 2 h. Den lineära vektorn etanolutfälldes och pelleten löstes i 50 pl Klenow-buffert innehållande 0,1 mM dNTP, och 2,5 enheter Klenow-polymeras tillsattes vid rumstemperatur i 10 min.

Efter fenolextraktion och etanolutfällning löstes pelleten i 50 ul högsaltbuffert, varpå 40 enheter Pstl tillsattes och blandningen hölls vid 37°C under 2 h. Efter etanolutfällning renades det lilla fragmen- tet som innehöll HSA IV-sekvensen genom elektrofores på en 2% agarosgel i TAE-buffert, följt av elektro- eluering. Det lilla fragmentet hade en PstI-enkel- strängsände och en blunt~ände. (Schema 38). 5lx!u¿a9_a!_2ë§è_!:ysë:9: 2 pg pHSA V behandlades med 10 enheter KpnI i S0 ul lågsaltbuffert vid 37°C i 4 h. Efter etanolut- fällning löstes pelleten i 50 ul Klenow-buffert inne- hållande 0,1 mM dNTP och 2,5 enheter Klenow-polyme- ras och hölls vid rumstemperatur under 10 min. Efter fenolextraktion och etanolutfällning löstes pelleten i 50 ul högsaltbuffert och 40 enheter Pstl tillsattes.

Blandningen hölls vid 37°C under 4 h. Efter etanolut- fällning rendes den lineära vektorn genom elektro- fores på O,5% agarosgel i TAE-buffert, följt av elektro- eluering. Den sålunda erhållna klyvda pHSA V-vektorn har en PstI~enkelsträngsände och en blunt-ände (Schema 38). ë¿9맿9n Ungefär 0,1 pg linearíserad pHSA V-vektor och 0,05 pg av fragmentet som innehåller HSA IV behandla- des med 80 enheter T4 DNA-ligas i l0 ul ligasbuffert vid l5°C under 4 h. Efter transformation in i JMl0l E. coli-celler testades de ampicillinresistenta kolo- 459 586 10 104 nierna med 5'-32?-HSA 16-oligonukleotídprob och unge- fär 40% av dem var positiva. 8 kolonier användes för att framställa plasmid-DNA. De sekvensbestâmdes med en syntetisk primer som var yomplementâr med en del ev HSA 19-oligonukleotiden (nukleotidpositíonerna 1374-1393 i genen för fullt utvecklat HSA) och 7 av dem hade den korrekta sekvensen vid sammanfognings- punkten mellan regionerna HSA IV och HSA V. 4 oo nu Hzewm ^>->~V 9 ï ß :J _» Ü “” Q »Q .||» à > >H ä ~ ~m°Um -Q< Hcg! Huwm m~@wT. . _=E~m ß w 1 _ _ \. f|||||1|||z||||1||L:f|+ 4 _ > A >_ Q Q _=°uw.||%_r@< @2fi-»== L Hamn mUcw-~=f.@ Hcnx Humfl HoÉw> umuc: >w mcfmfiofl f» »cwemmfi umuï >m mcfflåofl :_ Hama ^m Hpmß Am @»=u+._°Q :0=w_¥ .N @k2@+._oQ =°=@_¥ AN ~=Q¥ ^H Hïgmm _«@< AH Hïeflm __ /// n u Q nu N .\ /f *_ > mmm >~ L _ à _ L å _ a Sšuw :nå 25. :Ä Zogu Énš. _53. ÜÄ H m muflcmohcwaewm | mm Ecmzum 459 586 10 15 20 25 30 35 . _ ...,,.__.___.__f 106 QHSA (IV-V) med Apaï-SacI-EcoRI-adapter [pHSA (IV-V) êêjfi i pHSA (IV-V) som erhållits såsom tidigare inne- Ä; håller adapter 1 nedströms i förhållande till den HSA-kodande regionen. Kloning av HSA-genen in i E. coli- -delen (pPT2HKl) av E. coli-jäst-skyttelvektorn er- fordrar ett nedströms SacI-site och detta site måste således införas på något sätt. Det synes vara för- delaktigt att införa det i detta steg av genhopsätt- É ningen. Det mest uppenbara sättet att få ett Sacl-site _ synes vara utbyte av Apaï-EcoRI-adapter l mot en lik- nande adapter som har ett inre Sacl-site (adapter 3, se Schema 3).

HSA (IV-V)-regionen isolerades från pHSA (IV-V) som ett PstI-Apal-fragment och det klonades, till- sammans med adapter 3 (ApaI-Sacl-EcoRI-adapter), in i PstI-EcoRI-klyvd pUCl9. 2 pg pHSA (IV-V) behandlades med 20 enheter Apal i 50 ul làgsaltbuffert vid 37°C under 3 h. Efter etanol- utfällning löstes pelleten i 50 ul högsaltbuffert, och 20 enheter Pstl tillsattes. Reaktionsblandningen hölls vid 37°C under 4 h. HSA.(IV-V)-fragmentet renades genom gelelektrofores på en 2% agarosgel i TAE-buffert, följt av elektroeluering.

Lisëëàsa: (Schema 39) 0,1 pg Pstl-EcoRI-klyvd pUC19 blandades med 0,05 pg Apal-EcoRI HSA (IV-V)-fragment och med 5-5 pmol 5'- -fosforylerade adapter 3-oligonukleotider i 20 ul ligasbuffert. 80 enheter T4 DNA-ligas tillsattes och blandningen hölls vid l5°C under l4 h. Efter transfor- mation avsöktes ampicillinresistenta kolcnier på två olika replikaplattor med antingen 5'-32P-HSA-l6-oli- gonukleotidprob eller av 5'-32?-adapter 3-lägre sträng- -oligonukleotidprob., .

Ungefär 50% av kolonierna uppvisade hybridisering med båda proberna. Positiva kolonier användes för 10 459 586 107 att framställa plasmid-DNA och sekvensbestämning utför- des med både reverse-primer och pKO-primer I. Alla de 10 kolonier som kontrollerades genom sekvensbestäm- ning visade sig vara korrekta.

I det följande användes denna pHSA (IV-V), som är utökad med ett nedströms SacI-site genom införing av adapter 3, för de följande BSA-genhopsättníngsstegen. 459 586 108 mm< ^>|>HV Hmmm Hwemm ff % > >H \& _ _ _ _ _ - _ _ - n Hmoum Hmmm Hpmm mm@HH| Humm m .uwummvm _ % _ Hmoum Hmm< ^>1>H, Hmsmm > >H . _ w m QHUDQ @>>Hg _ Hmm< _ Hpwm |Hmoom-H@w@ / _ Hmoum Hpwm mm .NEWCUW 10 15 20 25 30 35 459 586 109 QHSA (II-V) I detta fall tjänstgjorde pHSA (II-III) som en vektor för kloning av HSA (IV-V) fragmentet (Schema 40).

Klyvning av p§§§ (II-III) ygktor 2 pg pHSA (II-III) behandlades med 40 enheter Apal i 50 ul làgsaltbuffert vid 37°C under 5 h. Efter etanolutfällning löstes pelleten i 50 ul Klenow-buffert innehållande 0,1 mM dNTP, och 2,5 enheter Klenow poly- meras tillsattes. Blandningen hölls vid rumstempera- tur under l0 min, varpå den fenolextraherades och etanolutfälldes. Pelleten löstes i S0 ul högsaltbuffert och 20 enheter EcoRI tillsattes. Blandningen hölls vid 37°C under 5 h, varpå den lineära vektorn isolerades genom elektrofores på en 0,5% agarosgel i TAE-buffert, följt av elektroeluering.

Lseleri§9_ëY_ë§ê_LlY:!l_ärë¶@s2§= 2 ug pHSA (IV-V) löstes i 50 pl lágsaltbuffert och behandlades med 20 enheter Kpnl vid 37°C under 5 h. Efter etanolutfällning löstes pelleten i Klenow- ~buffert innehållande 0,1 mM dNTP och 2,5 enheter Klenow-polymeras. Blandningen hölls vid rumstempera- tur under lO min, varpå DNA etanolutfälldes och löstes i 50 ul högsaltbuffert, och 20 enheter EcoRI tillsat- tes. Reaktionsblandningen hölls vid 37°C under 5 h, varpå det lilla fragmentet innehållande HSA (IV-V) regionen isolerades genom elektrofores på en 2% agaros~ gel i TAE~buffert, följt av elektroeluering. ëi9ë§i9§¿ Ungefär 0,1 ng lineariserad pHSA (II-III) vektor och 0,05 pg HSA (IV-V)-innehållande fragment blandades i 10 ul ligasbuffert innehållande 80 enheter T4 DNA- . ~ligas, och blandningen hölls vid l5°C under 7 h.

Efter transformation in i JMl0l E. coli-celler testa~ des ampicillinresistanta kolonier genom hybridisering med S'-32P-HSA 21-oligonukleotidprob, och ungefär 459 586 10 15 110 40% av kolonierna visades sig vara positiva. 8 kolo- nier användes för att framställa plasmid-DNA, de sek- vensbestämdes med användning av 5'-32P-HSA ll-oligo- nukleotid som en sekvensbestämningsprimer. Alla 8 hade korrekt sammanfogningspunkt mellan regionerna HSA III och HSA IV.

Hela den HSA (II-V)-innehållande regionen av pHSA (II-V) kontrollerades genom sekvensbestämning på plasmid-mall (pKO primer I och HSA l-8 primers användes) och inga misstag påträffades. 's 459 586 Humm ^>-H_V * _ \w\ “ M v U N M M A u 4/ à » > >H .H_ HH _ * . _ _¥°Qu H@@< _ m~mf_-<=@ Q? _u@m fiumm 1 ...r _ f» ~F - ._ 1 _1_J4 _ J. .q ~ ~." 1* » * > >* * \1 ~ _ _". ~H ~ _\1J ~moum ~mQ< m9fi«~==_m fimouu wÉä|uc:_m H ßcmemmum umufifi >m ucflnwfioww uo~xm> Hmwcflfi >m mcfluwficwfi ~«°uJ ..m ~«°uw ..m mHzv+ mmkwenfiou :c=w%¥ ..~ @~=u+ mmLwE»_aa zocwßg ..~ ~= ¥ ~ ^>->_v _u%m ~:%@m Humm \1 w W h > « >_ A u n / \1 M %1 _- U WN Ü ß ü / _ * _ _ nuoum _@Q< HCQ1 -wm _mouw -Q< Himzmw Hfiwwcwz ov øEwcUw 459 586 10 15 20 25 30 35 112 pHSA-vektorer (Nr 1, Nr 2) HSA (II-V)-fragmentet utökades med HSA I-fragmentet genom kloning av dessa två fragment in i pUCl9 vektor. * (schema 41). f HSA (II-V) skulle ha kunnat isoleras som Sau3AI- -EcoRI-fragment direkt, eftersom det finns ett unikt Sau3AI-site i genen. pUCl9-vektordelen innehåller emellertid många Sau3AI-sites, vilket komplicerar restriktionsdigestion och fragmentseparation. Först isolerades HSA (II-V) i ett HindIII-EcoRI-fragment, vilket ytterligare förkortades genom Sau3AI-behandling. -5 ug av HSA (II-V) behandlades i 100 ul högsalt- buffert med 40 enheter HindIII och 40 enheter EcoRI vid 37°C under 3 h. Blandningen sattes på en 0,5% _ agarosgel (TAE-buffert) och, efter elektrofores, erh- hölls två fragment. Det mindre fragmentet elektro- eluerades och etanolutfälldes.

Pelleten löstes i 50 ul högsaltbuffert och be- handlades med 7,5 enheter Sau3AI vid 37°C under 14 h.

Reaktionsblandningen fenolextraherades (2x), etanol- utfälldes, och således renades inte det stora Sau3AI- -EcoRI-fragmentet genom elektrofores i detta fall.

Två separata ligationer uppställdes, varvid var- dera innehöll Pstl-EcoRI-klyvd pUCl9-kloningsvektor och Sau3AI-EcoRI HSA (II-V)-fragmentet, och det ena av de två HSA I-fragmenten (som en blandning av två oligonukleotider som bildar en Pstl-Sau3AI-adapter). 0,2 pg Pstl-EcoRI-klyvd pUCl9 och 0,1 pg Sau3AI- -EcoRI HSA (II-V)-fragment blandades med 5-5 pmol S'-fosforylerad HSA I Nr l, eller HSA I Nr 2, (Schema 4) i tvâ separata reaktionsblandningar innehållande 10 ul ligasbuffert. 80 enheter T4 DNA-ligas sattes till de båda reaktionsblandhingarna, varpå de hölls vid l5°C under 6 h, varefter de transformerades in i JMl0l E. coli-celler. De transformerade blandningar- na sattes på LB-ampicillinplattor. Kolonier dubbel- replikerades på två nitrocellulosafilter och de hyb- 10 15 20 459 586 113 ridiserades med 5'-32P-ESA 5-oligonukleotidprob (första filter) och med motsvarande 5'-32P-HSA I-oligonukleo- tidprob (andra filter). Ungefär 80%'av kolonierna uppvisade hybridisering med båda proberna i båda fallen.

Plasmid-DNA framställdes från 4-4 kloner av de tvâ konstruktionerna och de sekvensbestämdes med användning av reverse-primern för att kontrollera korrekt insätt- ning av HSA I-versionerna in i pHSA-vektorerna. Alla de sekvensbestämda konstruktionerna var korrekta.

Hela de HSA-kodande regionerna från pHSA Nr 1 och Nr 2 subklonades som PstI-EcoRI-fragment in i Ml3mpl8- och mpl9-fagvektorer, och hela sekvensen kontrollerades i mpl9 med användning av 17-mer-primer och HSA 1-9-primer. mpl8-konstruktionerna kontrolle- rades enbart med 17-mer-primern. 459 586 114 Schema 41 Hind III SauIAI Anal Seel ECORI 1 ' 1 I l 1 | . l | 1 | I I 'I \ l II III IV V PstI EcoRI PHSÅ (II-V) pUC19 1, Hind III-Ecom, isolera litet fragment 2, Sau3AI PstI-EcoRI PstI EcoRI PstI SauBA Sau3AI Apa! Sac! EcoRI .- fi' : i å g i ä fi' HSAI II III IV V HSA (II~V) TI: DNA-lígas Pítl sâuzm npa1 sacl Ecom _41 s | I I I I I | g 1 | I n 1 I II Ill IV V pHSA Nr l: HSA I = HSAI Nrl DHSA pHSÅ Nr22 HSA I = HSM Nr? 10 15 20 25 30 35 459 586 115 Konstruktion av E. coli-plasmiden som har jästpromotor- och -terminatorsekvenserna 1. Utgångskloningsvektorn (pGBl, Fig 1) erhölls genom modifiering av pBR327 plasmid (Soberön, X., Covarrubias, L. och Bolivar, F. (1980): Gene 9, 287-305) från vilken Pstï- och HindII-sites från ApR- -regionen eliminerades genom EMS och HA mutagenes och upprepad restriktionsenzymdigestion. Mutagenesbe- tingelserna var samma som beskrivits i Miller, J.H.: Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

Xhol-site introducerades som en CCTCGAGG-linker insatt vid det unika (ifyllda) AvaI-sitet. 2. Plasmiden pGB2 (HIS3): 1327 bp BamHI-XhoI-fragmentet som innehöll den hela klonade HIS3-genen från Saccharomyces cerevisiae (Storms, R.K., McNeil, J.B., Khandekar, P.S., An, G., Parker, J., och Friesen, J.D. (1979) J. Bacteriol. 140, 73-82; och Struhl, K. (1985): Nucleic Acids Res. 13, 8587-8601) avlägsnades från pYF 92 (Storm, et al. ibid) (erhållen från Gyorgy B. Kiss, Institute of Genetics, Biological Research Center of the Hunga- rian Academy of Sciences, Szeged, Hungary) och insat- tes vid de unika BamHI~ och Xhol-sites hos pGBl, vilket resulterade i pGB2 (HIS3) (Fig 2). 3. Plasmiden pGB3-229T som innehåller transkrip- tionsterminatorregionen från jästgenen His3: EcoRI~KpnI-fragmentet av pGB2 (HIS3) ersattes med 1327 bp TCR-kassetten (EcoRI-Kpnl) från plasmiden pJRD 158 (Davison, J., Heustersprute, M., Merchez, M., och Brunel, E (1984): Gene 28, 311-318) ferhållen från John Davison (Unit of Molecular Biology, Interna- tional Institute of Cellular and Molecular Pathology, 75, Avenue Hippocrate, B-1200, Brussels, Belgium)]. pGB3-229T _ här, fÖIUtOm ApR+0ri-ka55etten - hgla genen TCR (med ett ytterligare Sacl-site vid sin 3'- 4559 10 15 20 25 30 35 5536 116 ände) och transkriptionsterminatorregíonen från HIS3-ge- nen. (Fíg 3a). pGB-229T modifíerades ytterligare genom 1) avlägsnande av Kpnï-sitet i pGB-2291 för erhål- lande av pGB3-229TK° (Fíg. 3b) och 2) införande av HindIII-SalI-promotor-fragmentet från pUCl8x/622PH (enligt Fig. 5) resulterande i pPT2HKl (Fig. 3c). 4. Kloning av promotorregionen hos PH05-genen från Saccharomyces cerevisiae.

PH05-genen kodar för ett repressibelt syrafos- fatasexoenzym (ortofosforsyra - monoester fosfahydrolas (syra-optimum), EC 3.l.3.2.). Det är en del av ett 8 kb. EcoRI genomiskt DNA-fragment (Kramer, R.A., Andersen, N. (1980): Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 6541-6545; och Rogers, D.T., Lemire, J.M., och Bostian, K.A. (1982): Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 2157-2161).

För att erhålla den plasmid som har PH05-genen (Davison et. al. ibid) avsöktes en jästgenbank (ett kosmid-bibliotek konstruerat av genomiskt DNA hos S. cerevisiae, erhâllen från Z. Feher, Debrecen Medical University, Debrecen, Hungary) enligt följande: en blandning av rekombinant kosmíd-DNA digererades med ECQRI. 8 kb EcoRI-fragment isolerades från agaros- geler, och omklonades vid EcoRI-sitet hos plasmiden pGB2 (HIS3). Den plasmid pGB2 (HIS3, PH05, PH03) som innehöll PH05-genen (Fig 4) utvaldes sedan baserat på komplementering av pho5-mutatíonen i jäststammarna DB-4 (Rogers et. al. ibid.) och AH220 (a, trpl, leu2-3, 2-112, his3-11, 3-15, pho5, pho3) erhållna från A. ¿ sinnen, cIBA-GEIGY, Basel; se Teit-Kamradt, A.G., i Turner, K.J., Kramer, R.A., Elliott, Q.D., Bostian, S.J., Thill, G.P., Rogers, D.T., och Bostian. K. (1986): Molec. och Cell. Biol. 6, 1855-1865). 5. Subkloning av PHO5~genpromotorregionen.

Promotorn hos den repressibla sura fosfatasgenen (PHO5) kan avlägsnas från plasmiden pGB2 (HIS3, PHO5, PH03) genom BamHI+SalI-restriktionsenzymdigestion 10 15 459 586 117 digestion som ett 623 bp fragment (Meyhack, B., Bajwa, W., Rudolph, H., och Hinnen, A. (1982): EMBO J. 1, 675-680).

Det senare omklonades i pUCl8 vid BamHI-SalI-sitet, vilket resulterade i plasmiden pUC18/623P (Fig. Sa) i vilken sekvensen för det som införts verifierades genom sekvensbestämning och jämfördes med den från publicerad litteratur (Meyhack, et. al. ibid; och Arima, K., Oshima, T., Kubota, I., Nakamura, N., Mízunaga, T., och Toh-e, A (1983): Nucleic Acids Res. ll, 1657-1672).

BamHI-Sali (623 bp)-fragmentet i plasmiden pUCl8/623P innehåller PHO5 uppströms aktíverande sek- venserna och en del av den kodande sekvensen (som kodar för den N-terminala 17-aminosyra-sekretionssignal- peptiden och 10 ytterligare aminosyror från N-änden av den fullt utvecklade genprodukten).

Primärstrukturen för den sekretionsignal-kodande regionen hos PHOS-genen är: 'Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu TPROMOTOR - ATG TTT AAA TCT GTT GTT TAT TCA ATT TTA BamHI Dral Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala Gly Thr GCC GCT TCT TTG GCC AAT GCA GGT ACC Balï TKpnI Signal-ände I denna struktur skulle Kpnï-sitet, som är beläget nedströms från "signal-ändens" kodon Ala, kunna användas som ett kloningssite (gjort till blunt-ände med Kpnl, följt av trimning av den 3'-utskjutande sekvensen) för den HSA-kodande genen om den förflyttades en bas i 5'-riktningen. 459 586 10 15 20 25 30 35 118 I pUCl8/623P kunde inte det ovan angivna Kpnl- -sítet manipuleras om inte uppströms Kpnï-sitet (X, Fig Sa) hade avlägsnats från plasmiden). Därför klyv- ä des plasmiden med SacI och BamHI, följt av skapande av blunt-ändar genom avlägsnande av de utskjutande 3'-terminala nukleotiderna från SacI~änden och ifyllning lå av BamHI-änden med DNA-polymeras I Klenow-fragment och nukleosidtrifosfater (steg l. i Fig 5). Efter àterligation och transformation erhölls plasmiden pUCl8x/623P (Fig 5b), och BamHI-sítet áterupprättats och Kpnl-sitet nedströms från "signal-ändens" kodon blev unikt och således lämpligt för ytterligare mani- pulationer och in vitro mutagenes (se nedan). 6. In vitro mutagenes av "signal-ände"-sitet: en en-bas förflyttning av Kpnl-sitet för att skapa ett splitsningssite som är “i-fas" med “signal-ändens“ kodon (Ala).

.För att kunna ligera HSA-genens 5'-blunt-ände med den PH05-signalkodande sekvensen i korrekt fas mäste Kpnl-sitet förflyttas en bas i 5'-riktningen- Man noterade att avlägsnande av adenosinresten (A) uppströms från Kpnl-sitet inte resulterade i någon förändring av de kodade aminosyrornas natur inom signal- sekvensen r Ser Leu Ala Asn Ala Gly Thr .....TCT TTG GCC AAT GCA GGT ACC A...

BalI Kpnl Signal-ände Ser Leu Ala Asn Ala Val .....TCT TTG GCC AAT GCG GTA CCA Ball KpnI 10 15 20 25 30 35 459 586 119 Klyvning av den modifierade sekvensen med KpnI och därefter avlägsnande av de utskjutande GTAC-3'- -nukleotiderna med DNA-polymeras I*Klenow-fragment +dNTP alstrar en blunt-ände vid vilken KpnI-sitet blir exakt sammanfallande med positionen för "signal- -ändens“ kodon (GCG).

För att åstadkomma den ovannämnda strukturför- ändringen utbyttes -fragmentet hos pUCl8x/623P beläget mellan CCAATGCAGGTAC GGTTACGTC Ball- och Kpnl-sites mot en syntetisk linker CCAATGCGGTAC GGTTACGC vilket resulterade i plasmiden pUCl8x/622P. Utbytet veri- fierades genom sekvensbestämning (steg 2. i Fig. 5).

För senare kloningsändamål utbyttes också ECORI- -sitet (uppströms från PHO5-promotorn) mot ett nytt HindIII-site genom insättning av en HindIII-linker (CAAGCTTG) i det ifyllda Ecom-siter (steg 3. i Pig. 5). Denna nya konstruktion kallades pUCl8x/622PH (Fig Sc). 7. Konstruktion av plasmiden pPT2HK1 som inne- håller jästexpressionskassetten: Plasmiden pGB3-229T (Fig 3) innehåller ett Sacl- -site (Sstï) och ett KpnI-site nedströms från TCR-genen.

Genom insättning av PHO5-promotorregionen (vid de unika Hindui- och san-sites från psclsä/ezzps) skuue Kpnï-sitet fràn pGB3-229T blir överflödigt, varför Kpnï-sitet avlägsnades från pGB3-229T genom KpnI-di- gestion och avlägsnande av den utskjutande 3'-änden ' y~ med Klenow polymeras +dNTP, áterligering av blunt- -ändarna och transformation. Den nya plasmiden (pGB3-229Tx°> (Fi-g 3, som saknar Kpm-givet) klyvaes 459 sad 10 15 20 25 30 35 120 med HindIII och Sa1I, och HindIII-SalI-fragmentet från pncufi/szzvn (innehållande den modifierade Pnos- -promotor- och signalsekvensen) klonades in, varigenom bildades en tetracyklinkänslig plasmid pPT2HK1 (Fig 3 och 6) vilken har en funktionell jästexpressions- kassett som består av den in vitro mutageniserade PHO5-promotor- och signal-kodande regionen och transkrip- tionsterminatorn från HI53-genen. 8. Konstruktion av E. coli-jäst-skyttelvektor- plasmiden pBY200.

Huvudpunkterna som skall beaktas är: - att utnyttja de användbara egenskaperna hos den "klassiska" E. coli-S. cerevisiae-skyttelvektorplas- miden pJDB207 (Beggs, J.D. (1981): Multiple-copy yeast plasmid vectors. Von Wettstein, D., Friis, J., Kielland- -Bradt, M., och Stenderup, A. (Ed) Molecular genetics in Yeast. Alfred Benzon Symposium Vol. 16, 383-390), dvs 1) relativt liten storlek i jämförelse med många andra jästkloningsvektorer; 2) replikering av plasmiden i högt kopietal i jästvärdceller; 3) stabil selektion av plasmid-innehållande jästceller (av leu 2 fenotyp) beroende på närvaron av den selektiva markörgenen LEU2, vilket ger 4) även möjlighet till direktselektion i leuB E. coli -värdar; - att lämpliga restriktionsenzym-igenkänningssites skall ingå som gör den kompatibel med E. coli-plasmi- den pPT2HKl, vilken har jästexpressionskassetten (se ovan) och dess rekombinant-derivat.

Plasmiden pBY 200 konstruerades genom tvâ klonings- steg (Fig 7): l. Insättning av “LEU2 + 2 u ori"-kassetten (ett 3,4 kb EcoRI-fragment som erhållits genom partiell EcoRI-digestion av pJDB 207 (Beggs et. al., ibid)) i EcoRI-sitet hos pGB1; (J l0 15 20 25 30 35 459 586 121 2. Ifyllning med DNA-polymeras Klenow fragment (följt av áterligation av blunt-ändarna) av Xba I-sitet i “2 u ori"-regionen. Denna modifikation hade ingen effekt på plasmidens förmåga att replikera i S. cerevisiae.

Kloning av BSA-generna (Nr 1, Nr 2) in i pPT2HK1 E. coli- -vektorn pPT2HK1 E. coli-vektorn visas i Fig 3 och 6, och dess modifierade signalsekvensregion har beskri- vits ovan.

Dess huvudsärdrag är ur HSA-gen-kloningssynpunkt att den innehåller jäst-PH05-promotorsekvensen och- PHO5-signalsekvensen samt en jästtranskriptionster~ minator (HIS3). Promotor-signa1sekvens- och termina- torregionerna är separerade från varandra medelst unika restriktionssites så att det HSA-kodande genseg- mentet (HSA-strukturgen) kan insättas mellan dessa tvà regioner.

I pPT2HKl-vektorn är de restriktionssites som användes för att insätta HSA-genen Kpnï- och SacI-sites.

KpnI~sitet vid änden av signalsekvensen (ledarpeptid- kodande region) förflyttades tidigare av oss så att efter KpnI-klyvning, följt av trimning av den resulte- rande 3'-utskjutande regionen, bildades en blunt-ände och denna blunt-ände sammanföll exakt med den ledarpep- tidkodande regionens ände (Schema 42). SacI-sitet är beläget uppströms i förhållande till HIS3-termine- ringsregionen och Sacl-klyvning utfördes efter KpnI- -klyvningen och bildningen av blunt-ände.

QPT2HK1~klyvning: 2 ng pPT2HKl behandlades med 20 enheter Kpnl i 50 pl làgsaltbuffert vid 37°C under 2 h. Efter etanol- utfällning löstes pelleten i 50 ul Klenow-buffert innehållande 0,1 mm dNTP och 2,5 enheter Klenow poly- meras, och reaktionsblandningen hölls vid rumstemperatur under 10 min. Reaktionsblandningen fenolextraherades 459 10 15 20 25 30 35 586 122 och etanolutfälldes. Pelleten löstes i 50 pl lâgsalt- buffert och 20 enheter SacI tillsattes, följt av inku- bation vid 37°C under 5 h. Efter etanolutfällning isolerades det stora vektorfragmentet'genom elektro- fores på en 0,5% agarosgel i TAE-buffert, följt av elektroeluering.

Q§§§ Nr l-klyvning för erhållande av HSA Nr l-fragment: 2 pg pHSA Nr l löst i 50 pl högsaltbuffert behand- lades med 20 enheter PstI vid 37°C i 2 h. Efter etanol- utfällning löstes pelleten i 50 pl Klenow-buffert innehållande 0,1 mM dNTP och 2,5 enheter Klenow poly- meras och reaktionsblandningen hölls vid rumstemperatur under 10 min. Reaktionsblandningen fenolextraherades och etanolutfälldes. Pelleten löstes i 50 pl làgsalt- buffert och 20 enheter SacI tillsattes. Blandningen hölls vid 37°C under 5 h, varpå den sattes på en 0,5% agarosgel (TAE-buffert). Det mindre fragmentet isolera- des efter elektrofores, följt av elektroeluering. eëêêßlr Z-klyvfliflg för erhêllaflës-arjiêèflg-Zzâzasæsaë= pHSA Nr 2 återisolerades från en dam(-) E. coli- -stam för att man skulle kunna arbeta med Bcll-enzym, vilket är känsligt för adeninmetylering. 2 pg pHSA Nr 2 löst i S0 pl buffert innehållande 75 mM KCl, 6 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2 och 1 mM DTT behandlades med 20 enheter Bell vid 50°C under S h. Efter etanolutfällning löstesgpelleten i 50 pl mung bean-nukleasbuffert och 10 enheter mung bean-nukleas tillsattes vid 37°C i 30 min. Efter fenol- extraktion och etanolutfällning löstes pelleten i 50 pl lågsaltbuffert och 20 enheter SacI tillsattes.

Blandningen hölls vid 37°C under 5 h. Det mindre fragmentet som innehöll HSA Nr 2 isolerades såsom beskrivits för HSA Nr l.

Iiisëëieasrz 0,1 pg av klyvd pPT2HKl och 0,2 pg HSA Nr l- eller HSA Nr 2~fragment blandades i l0 pl ligasbuffert m :n 10 15 20 459 586 123 80 enheter T4 DNA-ligas tillsattes. Reaktionsbland- ningarna hölls vid l5°C under 15 h, varpå de transfor- merades in i JM 101 E. coli-celler, följt av ympning på LB-ampicillinplattor. Kolonier testades genom hybri- 32?-HSA 5-oligonukleotádprob, och ungefär 10% av dem befanns vara positiva. Plasmid-DNA disering med 5'- framställdes från 5-5 rekombinanter och de sekvens- bestämdes med användning av HSA-primer 9. Korrekt sammanfogning av PH05-ledarsekvensen och den HSA-ko- dande sekvensen erhölls i två fall för HSA Nr l och i ara fan för nsA u: 2. massa plaamiaar kallas ppm/msn Nr 1 respektive pPT2/HSA Nr 2.

I dessa konstruktioner klonas HSA-genen in i en E. coli-plasmid mellan en jästpromotor + signal- sekvens och en jästtranskriptionsterminator. I nästa steg skall denna “HSA~expressionskassett" överföras till en E. coli-jäst-skyttelvektor. »mfimnmcofiaxauounuwuama mumuueka» »uu umw? x X %~ Hz ~ uz .il-lll huuu 124 459 586 noumcfleuo» 0 uumm fimm , % x cm: mä Qma um: mm@flH1 _ _ _ mmm-1 Hmwm cofimmu mncmnoxfârugwz 2% HE hmmm: sam :G52 +¿|u...||||»Uuu .å Hma< Homm ~ma< Humw .^n Humm .An Huøm .An .mmmfixncu :m3 mcsz .Û m~zu+ wmäešoawzucmflx .Û mhz? mmumešoanxocudx .Q Hflum .^_ Hcnx .^~ fiumm .Ad H23 N å ää Hšæïa 33 fi å <9: e fLTï.2Inlh.uu .W % fimøum H«Q< L. . r||^nmnnnnnnnu|L|||||| U fqddß |.= .oumcqeuma ~ 4 “Umm Hmoum .mQ< _ mucmuoxuflanma _ cofimmk lumflmfi + uOuOE0uQ Wüll Na NENCUW 10 15 20 25 30 35 459 586 125 Kloning av HSA-expressionskassetten in i pBY200 och BJDB 207 Jäst-E. coli-skyttelvektorn pBY200 innehåller både jäst- och E. coli-replikationsbörjan, en ApR- -region och en Leu2-markör. Denna plasmid kan klyvas med HindIII- och XhoI-enzymer så att det resulteran- de stora fragmentet kvarháller hela den ovannämnda regionen och kan tjänstgöra som en vektor för att klona HSA-expressionskassetten som erhållits fràn pPT2/HSA genom HindIII-klyvning och XhoI-klyvning (Pig. 8). 9§X_â99:ëlxyai§¶= 5 pg pBY 200 löstes i 100 ul buffert innehållande 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2 och 2 mM DTT (mediumsaltbuffert) och behandlades med 40 enheter HindIII och 60 enheter Xhoï vid 37°C under 6 h. Det stora fragmentet isolerades genom gelelektro- fores på en 0,5% agarosgel i TAB-buffert, följt av elektroeluering.

E§Q§_39Z:El!!EiB9= På liknande sätt klyvdes jäst-E. coli-skyttel- vektorplasmiden med HindIII- och Sa1I-restriktionsen- zymer under de betingelser som ovan beskrivits för pBY200, med undantag för att 45 enheter SalI använ- des istället för Xhoï. Det stora vektorfragmentet (Fig. 8) isolerades genom elektrofores och renades från agarosgel genom elektroeluering. 9Eïš¿ë§ê:tlx!nia¶= 5 pg pPT2/HSA Nr l eller pPT2/HSA Nr 2 behandlades såsom ovan i 100 pl mediumbuffert med HindIII- och XhoI-enzymer. Det stora fragmentet isolerades i båda fallen genom elektrofores på en 0,5% agarosgel, följt av elektroeluering. ëà9맿9a= 0,2 pg XhoI-HindIII-klyvd pBY 200 blandades sepa- rat med antingen 0,2 pg Xhol-HindIII-fragment av pPT2/HSA Nr l eller 0,2 pg XhoI-Hind III-fragment av pPT2/HSA Nr 2 459 586 lO 15 20 25 30 35 126 i 10 pl ligasbuffert, och 80 enheter T4 DNA-ligas sattes till båda blandningarna, vilka hölls vid l5°C under 15 h. Reaktionsblandningarna transformerades in i frysta kompetenta E. coli-celler (JF 1754), följt av ympning på LB-ampicillinplattor. Liknande betingel- ser användes för ligering av Xhol-HindIII-fragmentet av pPT2/HSA Nr 1 in i pJDB 207 som klyvts med HíndIII och SalI. §glektion och analys av pBY2/HSA Nr l och pBY 2/HSê__ Iflsàsslsemäieënëss .

Kolonier som växte på LB-ampicillinplattor plocka- des och ympades på 1.) M9 minimal platta innehållande 20 pg/ml metíonin och 20 pg/ml histidin (men saknade leucin), 2.) LB-tetracyklinplatta och 3.) ett nitro- cellulosafilter placerat pà en ampicillin-LB-plat- ta. De kolonier som växte upp på nítrocellulosafiltret lyserades och hybridiserades med 32?-märkt HSA 6-oligo- nukleotidprob. Positiva kolonier som var tetracyklin- känsliga på platta 2 och uppvisade leu-komplementering på platta 1 (dvs växte inte pà platta 2, men växte upp på platta 1) utvaldes och plasmid-DNA framställ- des från dem (ungefär 20% av det totala antalet kolo- nier som erhållits på LB-ampillinplattan uppvisade den förväntade fenotypen på plattorna l-3). Rekombi- nant plasmid-DNA klyvdes med en blandning av Xhol och Hind III, och klyvningen kontrollerades genom elektrofores på en 0,5% agarosgel i TBE-buffert. Efter denna dubbelklyvning gav både pBY2/BSA Nr 1 och pBY2/HSA Nr 2 tvâ fragment, vars storlekar motsvarade storleken hos utgàngsfragmenten pBY 200, pPT2/HSA Nr l respekti- ve pPT2/HSA Nr 2. Samtidigt resulterade KpnI-klyvning i en lineariserad vektor i båda fallen. För att kontrol- lera strukturen hos pYHSA 221 klyvdes rekombinant- plasmiden med XbaI, vilket resulterade i två frag- ment vars storlekar kunde förväntas från Schemat (Pig. 8).

Alla plasmidkonstruktioner och kloningssteg som ledde till jästexpressionsvektorerna, vilka innehåller BSA-genen, har sammanfattats i Fig. 9. _? 10 15 20 25 30 35 459 586 127 Expression av den syntetiska HSA-genen i rekombinant- jästceller Transformation av_jästcel1er och odlingsbetiggelggr §§r_induktion av_g§OS-promotorn: Den syntetiska HSA-genen placerades under jäst-PHO 5- -promotorkontroll i en serie manipulationer, som ovan i detalj beskrivits och som ledde till konstruktionen av jäst-E. coli-skyttelplasmiden pBY2/HSA Nr 1 och pBY2/HSA Nr 2, och pYHSA 221 (Fig 8). Jästceller (LL 20; Leu 2-3, 112, His 3-ll, 15: Storm, et. al., ibid) transformerades antingen genom sfäroplast-PEG-metoden enligt Beggs, J.D. (Nature 275, 104, (1978)) eller Ito, H. et. al. (J. Bacteriol. 153, 163 (1983)).

Rekombinantjästcellerna utvaldes pá basen av deras His-, Leu+-fenotyp och testades beträffande närvaro av de transformerande plasmiderna genom åter- isolering av plasmiderna ur 10-ml kulturer genom metoden enligt Holm et al. (Gene lg, 169 (1986)) och analys av deras struktur genom restriktionsenzymklyvníng samt elektrofores på 1% agarosgel. Rekombinantjäst- cellerna innehöll i samtliga fall transformerande expressionsvektorplasmider av korrekt storlek och struktur. Dessa celler odlades i YNB-medium (Difco) innehållande 2% glukos och 0,15% KHZPOQ till ODGOO av 2,0, skördades och späddes i ett lágfosfat-YNB-medium (innehållande 30 mg KHZPO4 per liter, för att aktivera PHO 5-promotorn), och odlades på nytt under 60 h innan de skördades (OD6O0fU 2,0). Cellerna tvättades sedan med 0,1 M Na-fosfatbuffert, àtersuspenderades i en hundradelsvolym av samma buffert innehållande 1% Triton X-100, 0,1 mM fenylmetyl-sulfonylfluorid (PMSF) och söndrades genom virvelblandning med glaspärlor (Sigma, typ IV, 250-300 um). Alternativt tvättades och åter- suspenderades cellerna i 1M sorbitol och inkuberades med B-glukuronidas (Boehringer; 1% lösning) i 100 mM ß~merkaptoetanol vid 30°C för att framställda proto- plaster, vilka sedan lyserades med 1% Triton X-100. 459 586 10 15 20 25 30 35 128 Cellextrakten klarnades genom centrifuering vid 10 000 varv/min under 15 min, och HSA analyserades genom följande immunologíska och elektroforetiska metoderl äšë§9:§Eš§ê:E§§E= ELISA-plattor belades med anti-HSA-antikropp (renat från hästserum - en produkt från HUMAN, Ungern - på protein A-Sepharose 4B-kolonner) och mättades med 0,5% gelatin (Sigma). 100 pl klarnade jästcell- extrakt skiktades i lämpliga utspädningar pà de belagda brunnarna och inkuberades under l h vid 37°C. HSA-antí- .

-HSA-antikroppsbindning övervakades med hjälp av en konventionell färgreaktion med användning av biotinyle- rat pepparotsperoxidas-streptavidinkomplex. HZOZ som substrat och orto-fenylendiamin som framkallare.

Serieutspädningar som sträckte sig från 2 pg till 15 pg av renat HSA (Reanal, Ungern) per brunn användes som referens för kalibrering. En tusenfaldig utspädning av humant serum användes som en positiv kontroll, och gelatínbelagda brunnar samt extrakt från ieke-rekembinenrjäereeller (min, preparerade såsom för HSA-analys) tjänstgjorde som negativa kontrol- ler i mikro-ELISA-testen. Färgreaktionerna utvärdera- des medelst en avläsningsapparat för mikroplatta fràn Cambridge Life Sciences Ltd., UK. märktes under 16 h vid 30°C med 358-metionin genom att jästcellerna odlades i "låg-metionin, YNB-medium innehållande 40 pCi 355 liter. låg-fosfat" -metionin per milli- 20 ul häst-anti-HSA-serum sattes till 108 cell- ekvivalenter av klarnade cell-lysat (0,5 ml) i 90 min vid 4°C i 0,1 M fosfatbuffert, pH 8,0. Immunofällningar- na adsorberades pá l-ml protein A-Sepharose (Pharmacia) under 90 min vid 4°C och tvättades. Immunoutfällda proteiner eluerades från protein A-Sepharose-kulorna i i 10 15 20 25 30 35 459 586 129 (Conner, G.E. et. al., J. Exp. Med. 156, 1475, 1982) och upplöstes pà en 15% SDS-polyakrylamidgel och fluoro- 35 S-met- jonin-märkta icke-rekombinanta LL 20 celler och det graferades. Klarnade extrakt som erhållits från av en rekombinant jäststam som uttrycker hepatit B- ivtantigen (HBsAg) användes som kontroller. §É§EÄÉêÉ= Jästcellerna som transformerats med plasmiden pBY2/HSA Nr 1 uppvisade aktiv produktion av HSA-pro- teinet:vilket lätt detekterades genom ELISA-testet och utfälldes med specifikt antiserum riktat mot HSA.

Enligt mikro-ELISA-testet varierade andelen av HSA mellan 3-8% av totalt cellprotein. 355-metionin-märkta Fig. 10 visar fluorgrafen för proteiner som immunoutfällts med häst-anti-HSA~serum och upplösts i SDS-polyakrylamidgel.

Bana M - 14C-proteinmolekylviktsmarkörblandning ”s-HBSAG utfänt maa anti-HBsAg antikroppar; bana B - märkt HSA som fram- (BRL); bana A - rekombinant ställts i rekombinant jästen utfällt med anti-HSA-serum: banorna C och D visar avsaknaden av korsimmunreaktioner mellan anti-HSA-serum och HBsAg-innehållande jästlysat respektive mellan anti-HBsAg-serum och HSA-lysat.

Den elektroforetiska mobiliteten hos det immuno- utfällda HSA var ungefär samma som den för den 67 kd märkta proteínmarkören. Detta resultat indikerar att största delen av det HSA-protein som producerats i jäst från expressionsvektorkonstruktionen involverande PHO 5~genens hela signalpeptid, produceras korrekt och ger en proteinprodukt som har en storlek motsvarande fullt utvecklat (naturligt) HSA.

Två oberoende immunoblotting-experiment (western blots) visade ett protein med samma molekylmassa.

Esaiassy_13ëësysäsëêê-âråatiësëëelëëšsgi_leë9:s's9:¿s:_ S00-ml kultur av jästceller som transformerats med antingen pBY2/HSA eller pYHSA 221 odlades vid 459 586 10 15 20 25 30 35 130 30°C till ODSOO = 2,0 (vanligen 24-28 h) i 0,67% YNB- medium (DIFCO) innehållande 0,15% (vikt/vol) KHZPOZ 20 mg/liter L-histidin och 2% (vikt/vol) glukos. Cel- lerna uppsamlades genom centrifugering vid 2000 x g under 5 min och átersuspenderades i 4 liter 0,67% (vikt/vol) YNB-medium innehållande 30 mg/liter KHZPO4, 0,1% (vikt/vol) KCl, 20 mg/liter L-histidin och 2% (vikt/vol) glukos. Efter 60 h av kulturtillväxt (till OD600 flJ1,8-2,0) skördades cellerna genom centrifugering (4000 x g, 5 min) tvättades 2 ggr med iskallt, de- stillerat vatten och återsuspenderades i 80 ml 0,lM K-fosfat-buffert (pH 5,4), 10 mM B-merkaptoetanol, lM sorbitol. B-glukuronidas (BOEHRINGER) tillsattes till en slutkoncentration av 2% (vol/vol) och suspen- sionen inkuberades (genom försiktig skakning vid 30°C) under 40 min. Cellerna uppsamlades genom centrifugering (5000 x g, 10 min), tvättades 2 ggr med lM sorbitol och átersuspenderades i 40 ml 1% (vol/vol) Triton X-100 (BOEHRINGERI, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (BOEHRINGER), 50 mM KC1, 25 mM Tris-HCl, pH 7,0. Sus- pensionen skakades med 10 ml glaskulor (0,4 mm diameter, SIGMA) på en VORTEX provrörsskakare under 2 min, varpå cellysatet klarnades genom centrifugering vid 10 000 x g under 10 min vid 4°C. Triton X-100 avlägsnades genom omröring av det klarnade cell-lysatet under 40 min i närvaro av 6 g aktivt kol (200 mesh, SIGMA) som sedan avlägsnades genom filtrering av suspensionen genom WHATMAN GF-A glasfilter.

Lysatet sattes sedan direkt pâ en 0,8 x 8 cm kolonn av Blue-Sepharose CL-6B (PHARMACIA) som jämvikts- inställts med 50 mM KCl, 25 mM Tris/HCl pH 7. Kolonnen tvättades sussessivt med 50 ml av samma buffert inne- hållande 0,1M KCl och 0,2M KCl.

Den hårt bundna protein- fraktionen, tillsammans med rekbominant HSA, eluerades sedan med 1,5 M KC1, 50 mM Tris/HC1, pH 7,0, dialyse- rades över natten.mot 0,15 M NaCl, 10 mM Na-fosfat- buffert (pH 7,2) och underkastades flera immunaffi- nitetskromatograficykler på en anti~HSA-Ab-Sepharose 4B kolonn. __ .

(I 10 15 20 25 30 35 459 586 131 [anti-HSA-Ab hade renats från serum från häst som immuniserats med HSA med användning av Protein A- -Sepharose-kromatografi i enlighet med de instruk- tioner som givits av PHARMACIA. Den renade antikrop- pen bands sedan till AH-Sepharose (med användning av EDC som kopplingsagens) eller CNBr-Sepharose 4B (se PHARMACIA's broschyr "Affinity chromatography")].

Som ett slutsteg för HSA-rening användes en pre- paratív SDS-polyakrylamidgel-elektrofores. Det pro- teinband som motsvarade 68 kd elektroeluerades från gelen i en dialyspàse, och dialyserades sedan mot 5 mM Tris (pH 7,2); 0,1 mM EDTA och frystorkades.

De torkade proteinproverna löstes i 50 ul H20 och underkastades analys genom l) molekylmassabestämning (SDS-PAGE utförd enligt Laemmli, U.K., Nature 221, 680 (1970), 2) peptidkartläggning genom begränsad proteolys (Cleveland, D.W., Fischer, S.G., Kirschner, M.W., J. Biol. Chem. åâg, ll02 (1977)), 3) protein- sekvensbestämning av den N-terminala regionen. jäst HSA som renats från jästceller visades vandra som ett enda 68-kildalton-proteinband i SDS-po1yakryl- amidgeler, vilket indikerade att det har samma mole- kylmassa som fullt utvecklat, naturligt HSA.

Elektrofores under nativa betingelser (utfört på PHARnAcIzvs 10-152, PHAsT GELs i enlighet med till- verkarens instruktioner) indikerade att beteendet hos HSA som framställts av jäst, liknande det hos naturligt, fullt utvecklat HSA och hade också samma tendens att bilda dubbel-, trippel-, och multimer- komplex, antagligen genom slumpvis bildning av -S-S- -bryggor.

Frånvaro av glykosylering i HSA som framställts i jäst bekräftades genom Con A-Sepharose-kromatografi: Q$500 pg av ett partiellt renat proteinextrakt som erhållits från HSA-producerande jästceller (den proteinfraktion som eluerades fràn Blue Sepharose CL-6B 459 586 10 15 20 25 30 35 132 -kolonnen användes - se reningsstegen) tilläts binda till 750 pl svälld Con-A-Sepharose (Pharmacia) i 1,5 ml buffert innehållande 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, och 0,5 M NaCl. Suspensionen skakades långsamt över natten vid 4°C och Con A-Sepharose separerades från bufferten f! innehållande de icke bundna proteinernaš) genom centri- fugering vid 12 000 x g under 10 min. Con A-Sepha- rosegelen tvättades sedan med 100 ml av samma buffert genom filtrering igenom en 25-mm cirkel av Whatman GF/A filter.

De bundna proteinerna eluerades med en buffert innehàuanae zo mm fria-Hcl, pH 6,8, 0,25 M a-n-methyh f mannosid (Serva) och 0,25 M NaCl. E Både de icke bundna och bundna (till Con A-Sepha~ rose) proteinfraktionerna dialyserades mot 10 mM Tris- -HCI (pH 6,8) och underkastades l) SDS-PAGE i enlighet med Laemmli, U.K. (Nature 221, 680 (1970)), och 2) ELISA-test för att kontrollera närvaron av HSA.

En liknande behandling tillämpades på en fraktion av renat HSA.

I varje enskilt fall visade SDS-PAGE och ELISA-tes- ten frånvaro i fraktionen av Con A~bindande proteiner av 68 kd protein samt proteiner som uppvisade immu- nologiska reaktioner med anti-HSA-Ab. Det renade HSA band ej heller till Con-A-Sepharose. HSA utvanns kvan- titativt ur proteinfraktionen som inte band till Con A-Sepharose vid pàförande av provet.

Resultaten indikerar starkt frånvaro av glykosyle- ring i molekylerna av HSA som producerats i jäst.

Före pepetidkartläggning genom begränsad proteo- lys värmedenaturerades proverna i närvaro av 0,5% (vikt/vol) SDS utan tillsättning av ett reduktions- medel, och underkastades enzymatisk digestion under 10-20 min. Subtilisin, termolysin, trypsin och papain användes. Efter digestion tillsattes SDS och B-merkap- toetanol till koncentrationerna (vikt/vol) 2,5% respek- f! 10 15 20 459 586 133 tive 10%. Proverna satsades på 8-25% gradient PHAST GEL (PHARMACIA) och elektroforesen utfördes i ett PHARMACIA PHAST SYSTEM i enlighet med tillverkarens instruktioner.

De erhållna resultaten indikerar att HSA som producerats i rekombinant jäst uppvisade klyvnings- mönster med proteolytiska enzymer som var lika de för naturligt HSA (med en notering att jästproducerat HSA var mindre åtkomligt för papaindigestion under de betingelser som användes än naturligt HSA).

Ett prov av det autentiska HSA som uttryckts i jäst underkastades N-terminal sekvensbestämning på en Applied Biosystems Model 470 A gasfas-sekvensbe- stämningsanordning. Resultatet från sekvensbestämningen avslöjade inte några andra aminosyrarester än de som förväntats.

Claims (9)

459 10 15 20 25 30 35 586 134 PATENTKRAV

1. Strukturgen som kodar för autentiskt humant serumalbumin, k ä n n e t e c k n a d av en nukleo- tidsekvens där kodonerna är valda med hänsyn till f!! en för expression av autentiskt humant serumalbumin vald, icke-human värd, varvid valet av kodoner skett så att i första hand de av den valda icke-humana värden - mest frekvent använda kodonerna valts, och i andra hand de av den valda icke-humana värden i andra eller tredje hand använda kodonerna valts, för att dels undvika förekomsten av sådana restrik- tions-sites som användes under hopsättning av genen, för att dels eliminera 8-baspar långa eller längre palindrom inom individuella syntetiska oligonukleo- tider, och y för att dels skapa ett unikt klyvnings-site för ett specifikt enzym.

2. Strukturgen enligt kravet 1, k ä n n e t e c k - av en nukleotidsekvens där kodonerna är valda med hänsyn till en jäst-värd. n a d

3. Strukturgen enligt kravet 2, k ä n n e t e c k - n a d av nukleotidsekvensen s GAC GCT CAC AAG TCT GAA GTC GCT CAC AGA TTC AAG GAT CTA GGT GAA GAA AAC TTC AAG GCT TTG GTT TTG ATT GCT TTC GCT CAA TAC TTG CAA CAA TGT CCA TTC GAA GAC CAC GTC AAG TTG GTC AAC GAA GTT ACT GAA TTT GCT AAG ACC TGT GTT GCT GAC GAA TCT GCT GAA AAC TGT GAC AAG TCC TTG CAC ACT TTG TTC GGT GAC AAG TTG TGT ACT GTT GCT ACT TTG AGA GAA ACT TAC GGT GAA ATG GCT GAC TGT TGT GCT AAA CAG GAA CCA GAA AGA AAC GAA TGT TTC TTA CAA CAC AAG GAC GAC AAC CCA AAC TTG CCA AGA TTG GTT AGA CCA GAA GTC GAC GTT ATG TGT ACT GCT TTC CAC GAC AAC C GAA GAG ACT TTC TTG AAG AAG TAC TTG TAC GAA ATC GCC AGA AGA CAC CCA TAC TTC TAC GCT CCA GAA TTG TTG TTC 10 15 20 25 30 35 TTC CAA CAA TTG GCT GTT GTT GTT GAA ACT AGA AAG GTT AAG AAG TAA med GCT GCT GAA AGA GCC TTC ACT GAC AAG TTG CAC GAC GAC TTG GAC TAC CCA CCA TGT AAC GTC GGT AAG TTG TCT AAC ACT TTC CAA CAC ATG GCT AAG TAG.

4. AAG GCC TTG TTG TTC CCA GAC TTG TAT AAG TGT TTG GTT GGT TAC GAA CAC TTG GAA GCT TCC AAG AGA AAC GAC AGA TAC CAC ATC AAG GAC GAC TTG AGA GAC AGA AAG AAG AAG TTG TTG ATC GAA ATC CCA TGT ATG TCC ACT GAA GTT TTG TTG ACT GTT ATG CAA AGA AGA GTC GCC AAG CCA GAC GAC GTT TAC AAG GAC TGT GCC GCT ACT GAA TGT TGT GCT TCT AAG TTC GTT ACT TGT GAA TTC TTG CCA GGT CCA TTA GTT CCA CCA GAC AAG AAG TTC AAG GCT AAG GCT GAA GCT TGG GAA AAG TGT GAA TGT GAA TTG AAC TTG GTT TTG TAC GAA AAG GTT ACT TCT TGT TGT ACT TGT AAG ATC CAA GCT GCT GAA GCT 135 GCT GCT GGT TCC GCT TTT GTT GCT AAC GAA GTT GCT TAC TAC TTG GAA GCT CCA CAA AGA TTG AAG GCT GTT AAG TTC GAA TGT ACT ACT GCT ACT TCT GCT TGT AAG TTG GTT GCT CAC GAC CAA AAG GAA GCT GCT GAA TTG AAG AAG CAA TTG TAC GTT TGT GAA TTG TGT TCT TTT ACC GCT AAG TTC TGT CAA TTC TTG GCT CAA GCT GAA ACT GAC GAC CCA AAC GAC GAA TAC TTG TGT GTT AAC GGT ACT GAA TGT GAC CAC TGT GCC AAC TTG TTG GAA GTT TTC GCT ACT TTG TCT AAG AGA GTT GAA AGA TCT TTG GAC TTC GCT GCT AGA TGT TTC TTG GAA AAG GTC AAG TAC GAA ACT TTG GCT TCC GTT CAA GAA GCT GCT GAA CCA TCC TTC TTG TCT TGT GCT ATC TTG GAA GTT AAG AGA TTG GCT GAC ATT TAC AAG TCT CAC TTG AAG EGAA GAA GAA GAA GAA TTG AAG GAA TTG 459 586 TGT AAG GCT GGT TCT AAG TGT GAC TCT GAA ATG GAA GAC AGA GCT GCT GAA AAG AAG GTT AGA CCA TCT ACT TCT GTT ACT AAG TTG AAG TGT GAA GGT Strukturgen enligt något av kraven 1-3, en uppströms nukleotidsekvens som kodar för TGT TTG AAG GAA CAA TTG CAC TTG TCT AAG CCA TCT GTT CAC AAG GCT TTT CAA TTC CCA AAC GAA GTT CCA TTG GAC TTC GAA GTT GCT TGT GGT TTG utökad metionin.

5. Rekombinant DNA-molekyl omfattande en gen enligt något av kraven 1-4, insatt i en vektor. 459 10 15 20 25 30 35 586 136'

6. Värd transformerad med en rekombinant DNA-mole- kyl enligt kravet 5.

7. Förfarande för framställning av en strukturgen som kodar för autentiskt humant serumalbumin, k ä n n e - t e c k n a t av a) att nukleotidsekvensen som kodar för autentiskt humant serumalbumin designas genom att kodoner väljes med hänsyn till en icke-human värd som valts för expres- sion av autentiskt humant serumalbumin, varvid valet utföres så att _ i första hand de av den valda icke-humana värden mest frekvent använda kodonerna väljes, och i andra hand de av den valda icke-humana värden i andra eller tredje hand använda kodonerna väljes, för att undvika förekomsten av sådana restrik- tions-sites som användes under hopsättning av genen, för att eliminera 8-baspar långa eller längre palindrom inom individuella oligonukleotider som utgör delfragment av fragment som skall klopas, och för att skapa ett klyvnings-site för ett specifikt enzym, b) att den designade nukleotidsekvensen indelas i ett 5'-fragment som skall kemiskt syntetiseras och några fragment som skall klonas, så att sammanfog- ningspunkterna mellan de nâgra fragmenten kommer att vara vid lämpligt belägna G-C dinukleotidsekvenser, c) att de designade nâgra fragmenten enligt b) modifieras genom utökning av de designade nukleotid- sekvenserna med en extra nukleotidsekvens GGTAC vid 5'-terminalen, med undantag för det fragment som skall fogas till 5'-fragmentet enligt b), och att dessa några fragment ytterligare indelas i delfragment som har en 3'-nukleotid G, vilka delfragment i sin tur individuellt utökas med en extra nukleotidsekvens Gccc , i d) att de modifierade utökade delfragmenten enligt c) individuellt kemiskt syntetiseras i enkelsträngad U f!! 10 15 20 25 30 35 459 586 137 form på i och för sig känt sätt, och att S'-fragmentet enligt b) kemiskt syntetiseras på i och för sig känt sätt i dubbelsträngad form, e) att de syntetiserade delfragmenten enligt d) klonas i följd med hjälp av adaptorer och enzymatisk ifyllningsreaktion, på i och för sig känt sätt, in i några individuella rekombinant vektorer, börjande från 5'-terminalen hos de modifierade. Utökade några fragmenten enligt c), för att bilda klonade dubbel- strängade fragment av genen, vilka motsvarar de modi- fierade utökade nàgra fragmenten enligt C), f) att de klonade dubbelsträngade fragmenten enligt e) hopsättes genom klyvning av de några rekom- binant vektorerna enligt e), parvis, med enzymet KpnI respektive enzymet Apal, - den ena vid det skapade 5'-terminala KpnI restriktions-sitet och den andra vid det skapade 3'-terminala Apaï restriktion-sitet, - för att bilda enkelsträngsändar, vilka göres till blunt-ändar medelst ett enkelsträng-specifikt enzym pà i och för sig känt sätt - varvid en änd-nukleotid C respektive en änd-nukleotid G kvarstår - följt av klyvning med ett annat restriktionsenzym som har ett klyvnings-site som är unikt i båda rekombinant vek- torerna i det ifrågavarande paret, för att bilda å ena sidan en lineär vektor som innehåller ett klonat fragment av genen och å andra sidan ett från-klyvt fragment av genen, vilka två sistnämnda fragment sammanfogas enzymatiskt vid blunt- -ändarna på i och för sig känt sätt - varvid en di- nukleotid G-C, som ingår i genens nukleotidsekvens, bildas - , för att erhålla en rekombinant vektor som slutli- gen inkluderar alla de några designade fragmenten enligt b) i dubbelsträngad form, och 9) att den i f) erhållna rekombinant vektorn utökas med det kemiskt syntetiserade 5'-fragmentet enLigt d) för att bilda hela strukturgenen som kodar för autentiskt humant serumalbumin. 459 586 138

8. Föríarande för framställning av en strukturgen enligt kravet 7, k ä n n e t e c k n a t därav, att i a) är den valda icke-humana värden jäst, i b), är den designade nukleotidsekvensen GAC GCT CAC AAG TCT GAA GTC GCT CAC AGA TTC AAG GAT GEA GGT GAA GAA AAC TTC AAG GCT TTG GTT TTG ATT GCT TTC GCT CAA TAC TTG CAA CAA TGT CCA TTC GAA GAC CAC GTC AAG TTG GTC AAC GAA GTT ACT GAA TTT GCT AAG ACC 10 TGT GTT GCT GAC GAA TCT GCT GAA AAC TGT GAC AAG TCC TTG CAC ACT TTG TTC GGT GAC AAG TTG TGT ACT GTT GCT ACT TTG AGA GAA ACT TAC GGT GAA ATG GCT GAC TGT TGT GCT AAA CAG GAA CCA GAA AGA AAC GAA TGT TTC TTA CAA CAC AAG GAC GAC AAC CCA AAC TTG CCA AGA TTG GTT AGA 15 CCA GAA GTC GAC GTT ATG TGT ACT GCT TTC CAC GAC AAC GAA GAG ACT TTC TTG AAG AAG TAC TTG TAC GAA ATC GCC AGA AGA CAC CCA TAC TTC TAC GCT CCA GAA TTG TTG TTC TTC GCT AAG AGA TAC AAG GCT GCT TTC ACT GAA TGT TGT CAA GCT GCC GAC AAG GCT GCT TGT TTG TTG CCA AAG TTG 20 GAC GAA TTG AGA GAC GAA GGT AAG GCT TCT TCC GCT AAG CAA AGA TTG AAG TGT GCT TCC TTG CAA AAG TTC GGT GAA AGA GCC TTC AAG GCC TGG GCT GTT GCT AGA TTG TCT CAA AGA TTC CCA AAG GCT GAA TTT GCT GAA GTT TCT AAG TTG GTT ACT GAC TTG ACT AAG GTT CAC ACT GAA TGT TGT CAC 25 GGT GAC TTG TTG GAA TGT GCT GAC GAC AGA GCT GAC TTG GCT AAG TAT ATC TGT GAA AAC CAA GAC TCT ATC TCT TCT AAG TTG AAG GAA TGT TGT GAA AAG CCA TTG TTG GAA AAG TCT CAC TGT ATC GCT GAA GTT GAA AAC GAC GAA ATG CCA GCT GAC TTG CCA TCT TTG GCT GCT GAC TTC GTT GAA TCT 30 AAG GAC GTT TGT AAG AAC TAC GCT GAA GCT AAG GAC GTT TTC TTG GGT ATG TTC TTG TAC GAA TAC GCT AGA AGA CAC CCA GAC TAC TCC GTT GTT TTG TTG TTG AGA TTG GCT ACT TAC GAA ACT ACT TTG GAA AAG TGT TGT GCT GCT GAC CCA CAC GAA TGT TAC GCT AAG GTT TTC GAC GAA TTT 35 AAG CCA TTG GTT GAA GAA CCA CAA AAC TTG ATT AAG CAA AAC TGT GAA TTG TTC AAG CAA TTG GGT GAA TAC AAG TTC CAA AAC GCT TTG TTG GTT AGA TAC ACT AAG AAG GTT CCA AAG GCT (14 10 15 20 25 30 35 459 586 139 CAA GTC TCC ACT CCA ACT TTG GTT GAA GTC TCT AGA AAC TTG GGT AAG GTT GGT TCT AAG TGT TGT AAG CAC CCA GAA GCT AAG AGA ATG*CCA TGT GCT GAA GAC TAC TTG TCT GTT GTT TTG AAC CAA TTA TGT GTT TTG CAC GAA AAG ACT CCA GTT TCT GAC AGA GTT ACT AAG TGT TGT ACT GAA TCT TTG GTT AAC AGA AGA CCA TGT TTC TCT GCC TTG GAA GTT GAC GAA ACT TAC GTC CCA AAG GAA TTT AAC GCT GAA ACT TTC ACT TTC CAC GCC GAC ATC TGT ACC TTG TCC GAA AAG GAA AGA CAA ATC AAG AAG CAA ACT GCT TTG GTT GAA TTG GTT AAG CAC AAG CCA AAG GCT ACT AAG GAA CAA TTG AAG GCT GTT ATG GAC GAC TTC GCT GCT TTC GTT GAA AAG TGT TGT AAG GCT GAC GAC AAG GAA ACT TGT TTC GCT GAA GAA GGT AAG AAG TTG GTT GCT GCT TCT CAA GCT GCT TTG GGT TTG TAA TAG där pilarna visar indelningen i det första 5'-fragmentet som skall kemiskt syntetiseras och fyra fragment som skall klonas, i c), är de utökade enkelsträngade delfragmenten av de modifierade fragmenten enligt b) TAGGTGAAGAAAACTTCAAGGCTTTGGTTTTGATTGCTTTCGCTCAATACT~ TGCAACAATGTCCATTCGAAGGGCC ACCACGTCAAGTTGGTCAACGAAGTTACTGAATTTGCTAAGACCTGTGTT- GCTGACGAATCTGCTGAAAACTGGGCC TGACAAGTCCTTGCACACTTTGTTCGGTGACAAGTTGTGTACTGTTGCT- ACTTTGAGAGAAACTTACGGTGGGCC AAATGGCTGACTGTTGTGCTAAACAGGAACCAGAAAGAAACGAATGTTTCT- TACAACACAAGGACGGGCC ACAACCCAAACTTGCCAAGATTGGTTAGACCAGAAGTCGACGTTATGTG- TACTGCTTTCCACGACAACGAAGGGCC AGACTTTCTTGAAGAAGTACTTGTACGAAATCGCCAGAAGACACCCATAC- 459 586 10 15 20 25 30 35 140 TTCTACGCTCCAGAATTGTTGTTCTTCGGGCC GGTACCTAAGAGATACAAGGCTGCTTTCACTGAATGTTGTCAAGCTGCCGAC- AAGGCTGCTTGTTTGTTGGGCC CCAAAGTTGGACGAATTGAGAGACGAAGGTAAGGCTTCTTCCGCTAAGCA- AAGATTGAAGTGTGCTTCCTTGGGCC . CAAAAGTTCGGTGAAAGAGCCTTCAAGGCCTGGGCTGTTGCTAGATTGTC- TCAAAGATTCCCAAAGGCTGGGCC AATTTGCTGAAGTTTCTAAGTTGGTTACTGACTTGACTAAGGTTCACACTGA- ATGTTGTCACGGTGACTTGGGCC TTGGAATGTGCTGACGACAGAGCTGACTTGGCTAAGTATATCTGTGAAAAÜCA- AGACTCTATCTCTTCTAAGGGCC TTGAAGGAATGTTGTGAAAAGCCATTGTTGGAAAAGTCTCACTGTATCGCT- GAAGTTGAAAACGACGAAATGGGCC GGTACCCAGCTGACTTGCCATCTTTGGCTGCTGACTTCGTTGAATCTAAG_ GACGTTTGTAAGAACTACGCTGAAGGGCC CTAAGGACGTTTTCTTGGGTATGTTCTTGTACGAATACGCTAGAAGACACC- CAGACTACTCCGTTGTTTTGTTGTTGGGCC AGATTGGCTAAGACTTACGAAACTACTTTGGAAAAGTGTTGTGCTGCTGCT- GACCCACACGAATGTTACGCTAAGGGCC GTTTTCGACGAATTTAAGCCATTGGTTGAAGAACCACAAAACTTGATTAAG- CAAAACTGTGAATTGTTCAAGGGCC CAATTGGGTGAATACAAGTTCCAAAACGCTTTGTTGGTTAGATACACTAA- GAAGGTTCCÄCAAGTCTCCACTCCAACTTTGGGCC GTTGAAGTCTCTAGAAACTTGGGTAAGGTTGGTTCTAAGTGTTGTAAGCAC~ CCAGAAGCTAAGAGAATGGGCC (I (I O' 10 15 20 25 30 35 459 586 141 GGTACCCATGTGCTGAAGACTACTTGTCTGTTGTTTTGAACCAATTATGTGT- TTTGCACGAAAAGGGCC ACTCCAGTTTCTGACAGAGTTACTAAGTGTTGTACTGAATCTTTGGTTAACA~ GAAGACCATGTTTCTCTGGGCC CCTTGGAAGTTGACGAAACTTACGTCCCAAAGGAATTTAACGCTGAAACTT- TCACTTTCCACGCCGACATCTGGGCC TACCTTGTCCGAAAAGGAAAGACAAATCAAGAAGCAAACTGCTTTGGTTGAA~ TTGGTTAAGCACAAGCCAAAGGGCC GCTACTAAGGAACAATTGAAGGCTGTTATGGACGACTTCGCTGCTTTCGTT- GAAAAGTGTTGTAAGGCTGACGGGCC ACAAGGÅAACTTGTTTCGCTGAAGAAGGTAAGAAGTTGGTTGCTGCTTCTCAA- GCTGCTTTGGGTTTGTAATAGGGCC i e), klonas de syntetiserade delfragmenten enligt d) i följd in i fyra individuella E. coli vektorer med hjälp av adaptorerna Apaï EcoRI CGGACGGCGACGGCGACGGCGACCG CCCGGGCCTGCCGCTGCCGCTGCCGCTGGCTTAA Apal EcoRI CGAGTATGCGACAGCTGG CCCGGGCTCATACGCTGTCGACCTTAA i f), är det enkelsträng-specifika enzymet Klenow- polymeras. 459 586 142

9. Förfarande för framställning av autentiskt humant serumalbumin genom förökning av en värd som transformerats med en vektor omfattande en rekombi- nant DNA-sekvens under expressionsbetingelser och 5 isolering av den uttryckta proteinprodukten, k ä n - n e t e c_k n a t av utnyttjande av en värd som transformerats med en vektor omfattande en strukturgen enligt något av kraven 1-4, och isolering av autentiskt humant serumalbumin. 10 f) Of'