JPH03501323A - 真正のヒト血清アルブミンをコードする人工遺伝子、その使用およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

真正のヒト血清アルブミンをコードする人工遺伝子、その使用およびその製造法 本発明は、真正のヒト血清アルブミンをコードする構造遺伝子であって、所望な らばメチオニンをコードする上流トリブレットにより補足され、且つ所望ならば 合成プレプロ　−リーダーーコード配列を延長したもの、ベクター中に挿入され た前記の遺伝子を含んで成る組換えＤＮＡ分子、前記ＤＮＡ分子で形質転換され た宿主、真正のヒト血清アルブミンの産生法、真正のヒト血清アルブミン及び真 正のヒト血清アルブミンを含んで成る薬学組成物に関する。本発明は、真正のヒ ト血清アルブミンをコードする構造遺伝子の産生法にも関する。 背景 血清アルブミンは、高等な種の血清の主要なタン白質成分である。その役割は浸 透圧平衡の保持であり、これは難溶性の代謝生成物に結合し、一つの組織からも う一つの組織への輸送、特に遊離脂肪酸の輸送に関係する。 ヒト血清アルブミンは、血液量減少、ショックおよび低アルブミン血症の治療法 に用いられる。これは、体外循環用の潅流液体の添加剤としても用いられる。ま た、ヒト血清アルブミンは実験用抗原としても用いられることがある。 ヒト血清アルブミンは、約６００のアミノ酸残基を含んで成る一本の長いポリペ プチド鎖がら成っている。このアミノ酸配列は公表されている（例えば、ローン ・アール−、ｌＺム（Ｌａｗｎ　Ｒ，Ｍ、）らの、Ｎｕｃｌｅｆｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。 第９巻、２２号（ＩＨｌ）　、８１０３〜６１１３頁を参照されたい）、。 市販のヒト血清アルブミ°ンは、ヒト血漿から製造される。 ヒト血漿の利用可能性には、限界がある。 ヒト血漿から製造される製品は慎重に熱処理を行って、Ｂ型肝炎ウィルスおよび ＨＩＶウィルスによって製品が汚染されるのを回避しなければならない。 ＨＩＶウィルスの特徴の一つはその抗原構造を頻繁に変えることであるので、耐 熱性変種を生じることはないという保証はない。 無制限の量で産生ずることができる人工的な真正のヒト血清アルブミンが必要な ことは明らかである。 先行技術 組換えＤＮＡ技術を用いることにより成熟したヒト血清アルブミンに対応する製 品を産生ずる幾つかの試みが行われてきており、例えば下記の出願明細書に公表 されている。 ＥＰ−Δ−００７３６４６号明細書（ジネンテック・インコーポレーテド（Ｇｅ ｎｅｎｔｅｃｈ　Ｉｎｃ）　）、ＥＰ−Ａ−００７９７３９号明細書（ジ・アッ プジョン・カンパニ（Ｔｈｅ　Ｕｐｊｏｈｎ　Ｃｏ、））　、ＥＰ−Ａ−００９ １５２７号明細書（バーバード大学学長と研究者（Ｐｒｅｓｉｄｅｎｔ　ａｎｄ 　Ｆｅｌｌｏｗｓ　ｏｒＨａｒｖａｒｄ　ＣｏｌｌＣｏ１１ｅ　、およびＥＰ− Ａ−０１９８７４５号明細書（ジーンティ力（Ｇｅｎｅｔｉｃａ））　ｅ前記の 特許出願は総て、ヒト肝臓からｍＲＮＡを単離することから開始し、このｍＲＮ Ａを用いて二本鎖ｃＤＮＡ　（またはその）゛ラグメント）を製造していた。 したがって、ｃＤＮＡにおけるコドンの使用は、本来ヒトでの発現に最適になっ ている。 ヒトコドンの使用は、非ヒトでの発現には理想的ではないと当業界では考えられ ている。 本発明の前には、コドンを非ヒトでの発現に最適にした真正のヒト血清アルブミ ン（構造遺伝子−１７６１ｂｐ）に必要な大きなりＮＡ配列は産生されてはいな かった。 ＥＰ−Ａ−０１８２３８３号明細書（ヴエペックス・コントラクター・リミテド （Ｖｅｐｅｘ　Ｃｏｎｔｒａｃｔｏｒ　Ｌｔｄ、）およびエムティーエイ・ツエ ジェディ・ビオロギアイ・ケラホンチャ（ＭＴＡ　Ｓｚｅｇｅｄｉ　Ｂｉｏｌｏ ｇｉａｌ　Ｋ６ｅｚｐｏｎｔｊａ））には、一本鎖ＤＮＡ片の相補的鎖を酵素的 に合成することによるオリゴ−およびポリデオキシリボヌクレオチドの産生法が 開示されている。この技法は、本発明による真正のヒト血清アルブミン（ＨＳ　 Ａ）をコードする構造遺伝子の産生法に部分的に用いられたが、それは遺伝子の 若干数の大きなフラグメントを接合する新技術と組合わせている。 本発明の主要な目的は、コドンが非ヒトでの発現に最適になっているヌクレオチ ド配列を有する人工の構造遺伝子により真正のヒト血清アルブミンを産生させる ことである。 この目的を実現するため、最初に人工の構造遺伝子をデザインして、この遺伝子 を産生ずる方法を発明することが必要であった。 人工の構造遺伝子のデザイン 非ヒトでの発現の有用な一例としての酵母での発現に特に好適なコドンを選定す ることを決定した。 これらのコドンは高度に発現した酵母タン白質についての酵母コドンか、ら選定 した（ベネッツエン、ジエイ・エル（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ、　Ｊ、Ｌ、）とホー ル、ビー・デ４−（Ｈａｌｌ。 Ｂ、　Ｄ、）、（１９８２）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅｒＡ、、　２５７．３ ０２８−３０３１．およびシャープ、ビー・エム（Ｓｈａｒｐ、　Ｐ、Ｍ、）　 、ツォーイ、ティ・エム・エフ（Ｔｕｏｈｙ、　Ｔ、Ｍ、Ｆ、）及びモスルスキ イ、ケイ・アール（Ｍｏｓｕｒｓｋｌ、　Ｋ、Ｒ，）（１９８Ｂ）　Ｎｕｃｌｅ ｌｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、　１４．５１２５−５１４３　）。 まず、酵母に最も頻繁に用いられるコドンを選定したが、第二または第三のコド ンを用いるのが好ましかった。 第二または第三のコドンを選定した理由は、（ａ）遺伝子のアセンブリの際に用 いられる制限部位が出現するのを回避するため、（ｂ）特異的酵素に対して独特 の開裂部位を作成するため、および（Ｃ）化学的に合成され、クローニングされ る遺伝子の部分内で８塩基対以上の長さのパリンドロームを除去して、それぞれ の合成オリゴヌクレオチド内で内部ループまたは二次構造の形成を回避するため であった。 真正ＨＳＡをコードする人工の構造遺伝子本発明の一態様では、゛真正のヒト血 清アルブミンをコードする構造遺伝子が提供される。この遺伝子は、真正のヒト 血清アルブミンの発現用に選定した非ヒト宿主に関してコドンが選択されである ヌクレオチド配列に特徴を有し、上記コドンの選択が下記の通り行なわれている ことを特徴とするものである。 遺伝子のアッセンブリの際に用いられる制限部位の出現を回避し、 特異的な酵素に対して一つの独特の開裂部位を作成し、化学的に合成され、クロ ーニングされる遺伝子の部分内に８塩基対以上の長さのパリンドロームを除去す るように まず、選定した非ヒト宿主によって最も頻繁に用いられるコドンが選択され、 次に、選定した非ヒト宿主によって第二または第三位に用いられるコドンを選定 する。 本発明のこの態様の一変態では、真正のヒト血清アルブミンと初めのエキストラ メチオニンをコードする構造遺伝子が提供される。この遺伝子の変種では、ヌク レオチド配列はメチオニンをコードするトリブレットから開始し、ヌクレオチド 配列の残りは上記のヒト血清アルブミンをコードする。この遺伝子が発現される ときには、用いられる発現系によって真正のヒト血清アルブミンまたはそのメチ オニル誘導体が産生される。 本発明のこの態様の他の変種では、真正のヒト血清アルブミンをコードする構造 遺伝子であって、コドンが非ヒト宿主に関して選択され且つアミノ酸配列Ｍｅｔ −Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｘ　１ｅ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌ ｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌａｕ−Ｐｈｅ−−５ｅｒ−５ｅｒ−Ａｌ　ａ−Ｔｙｒ−５ｅｒ −Ａｒｇ−Ｇｌ　ｙ−Ｖａ　ｌ　−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ　−Ａｒｇをコードする上流 ヌクレオチド配列で伸長したものが提供される。 「構造遺伝子」とは、特異ペプチドまたはタン白質をその鋳型またはメツセンジ ャーＲＮＡによってコードするＤＮＡ配列であり、停止コドンを含む。 「機能遺伝子」は、構造遺伝子に加えてフランキング配列を有する。このような フランキング配列は、調節領域、例えばプロモーター配列と転写ターミネータ− 配列を含んでいる。これらのフランキング領域は、構造遺伝子によってコードさ れるペプチドまたはタン白質の発現（および産生）に用いられる特異的ベクター と宿主に対して最適にすべきである。 本発明の好ましい態様では、真正のＨＳＡをコードする構造遺伝子は、真正のＨ ＳＡの酵母での発現に関してコドンを選択したヌクレオチド配列を有する。酵母 で発現するように選択したコドンのみを本明細書に例示するが、当業者は、本明 細書に示した教示内容によって、ヌクレオチド配列が他の非ヒト宿主、例えば細 菌性宿主または植物宿主、について選択されたコドンを有する真正のＨＳＡをコ ードする構造遺伝子をデザインおよび構成することができるであろう。 「真正のヒト血清アルブミン」という表現は、本明細書および特許請求の範囲に おいて、天然の成熟したヒト血清アルブミンのアミノ酸配列に相当するアミノ酸 配列を有する、非ヒト起源の人工的に産生じたタン白質を定義するのに用いてい る。 組換えＤＮＡ分子 本発明の他の態様では、ベクター中に挿入された、本発明による構造遺伝子を含 んで成る組換えＤＮＡ分子が提供される。 したがって、この組換えＤＮＡ分子は、フランキング配列がベクター及び用いら れる宿主に好適である機能遺伝子（本発明の構造遺伝子を含む）が挿入されたベ クターを含む。 通常用いられるベクターは、細菌、特に大腸菌、およびバクテリオファージ、例 えばラムダファージ、由来のプラスミドである。 本発明のこの態様の具体例を、本発明の好ましい態様を記載する本明細書の部分 に開示する。 形質転換宿主 本発明の更にもう一つ態様では、本発明による組換えＤＮＡ分子で形質転換され た宿主が提供される。 （本発明の好ましい態様での）構造遺伝子のヌクレオチド配列のコドンは酵母宿 主について選択されるが、酵母株は用いることができる唯一の宿主ではない。酵 母で発現するようにデザインされた構造遺伝子は細菌または植物での発現にも適 していることがある。したがって、宿主は、酵母細胞、例えば５ａｃｃｈａｒｏ ａｙｃｅｓ　ｃｅｒｌｖｌｓｌａｅ。 細菌細胞、例えば大腸菌またはＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｌｓ　ｓまたは 豆科植物、えんどう豆またはタバコ植物のような植物の細胞であることができる 。 人工的構造遺伝子の産生法 本発明の別の態様では、真正のヒト血清アルブミンをコードする構造遺伝子の産 生法が提供される。この方法は下記の工程からなることを特徴とする。 （ａ）　ＪｆＫ正のヒト血清アルブミンの発現用に選定した非ヒト宿主に関して コドンを選択し、このコドンの選択が下記の通り行なわれることによって、真正 のヒト血清アルブミンをコードするヌクレオチド配列をデザインし、即ち、遺伝 子のアッセンブリの際に用いられる制限部位の出現を回避し、 ５′−フラグメントと全遺伝子の残りとの間に独特の１個の開裂部位を作成し、 クローニングされるフラグメントのオリゴヌクレオチド内に８塩基対以上の長さ のパリンドロームを除去するように、 まず、選定した非ヒト宿主によって最も頻繁に用いられるコドンを選択し、 次に、選定した非ヒト宿主によって第二または第三位に用いられるコドンが選択 する。 （ｂ）　デザインしたヌクレオチド配列を化学的に合成される５′−フラグメン トとクローニングされる若干数のフラグメントとに分割して、この若干数のフラ グメントの接合点が適切に配置されたＧ−Ｃジヌクレオチド配列にあるようにし 、 （Ｃ）　前記の（ｂ）でデザインした若干数のフラグメントを、（ｂ）の５′− フラグメントに結合するフラグメントを除いて、５′−末端にエキストラエキス トラヌクレオチド配列ＧＧＴＡＣでそのデザインしたヌクレオチド配列を補足す ることによって改良し、更にこの若干数のフラグメントを３′−ヌクレオチドＧ を有するサブユニットに分割し、このサブユニットを次に個別的にエキストラヌ クレオチド配列ＧＧＣＣで補足し、（ｄ）　自体公知の方法で一本鎖の形態の（ Ｃ）の補足され改良されたサブユニットをそれぞれ化学的に合成し、また自体公 知の方法で二本鎖の形態の（ｂ）の５′フラグメントを化学的に合成し、 （ｅ）　（ｃ）の補足され改良された若干数のフラグメントの５′−末端から始 め、アダプターと酵素的充填反応の助けによって自体公知の方法で（ｄ）の合成 サブユニットを連続的に、若干数の個々の組換えベクター中にクローニングして 、（Ｃ）の補足され改良された若干数のフラグメントに相当する遺伝子のクロー ニングされた二本鎖フラグメントを形成し、 （ｆ）　酵素ＫｐｎＩおよび酵素ＡｐａＩで、（ｅ）の若干数の組換えベクター を、一方は作成された５′−末端のＫｐｎｌ制限部位で、他方は作成された３′ 末端のＡｐａＩの制限部位で、それぞれ対に開裂して、自体公知の方法で一本鎖 の特異酵素によって平滑末端となっている粘着末端を形成し、それぞれ末端ヌク レオチドＣおよび末端ヌクレオチドＧは残し、続いて目的とする対の組換えベク ターの両者に独特な開裂部位を有するもう一つの制限酵素で開裂することによっ て、Ｃｅ）のクローニングした二本鎖フラグメントをまとめ、一方において遺伝 子のクローニングされたフラグメントを含む線形ベクターと他方において遺伝子 の開裂したフラグメントを形成し、前記の２つのフラグメントを自体公知の方法 でプラントエンドで酵素的に接合し、遺伝子のヌクレオチド配列中に含まれるジ ヌクレオチドＧ−Ｃを接合点に形成し、最終的に、二本鎖の形態の（ｂ）の若干 数のデザインされたフラグメント総てを含む組換えベクターを得て、 （ｇ）　（ｆ）で得られる組換えベクターを（ｄ）の化学的に合成した５′フラ グメントを補足して、真正のヒト血清アルブミンをコードする全構造遺伝子を形 成する。 ５８５個のアミノ酸残基°を有する真正の成熟したヒト血清アルブミンをコード する１７６１個のヌクレオチドを有するデザインされた構造遺伝子は、好ましい 態様では５個の大きなフラグメントに分割された。第一のフラグメントは自体公 知の方法で二本鎖に合成され、第二から第五までのフラグメントはＢＰ−Ａ−０ １８２８８３号明細書に開示されている技法によって産生され、一本鎖は化学的 に合成され、補足的鎖は酵素的に合成される。 「独特な開裂部位」という表現は、開裂部位が特異的酵素に特徴的であり、接合 されるフラグメントの他の部分には存在しないことを意味する。 選択された末端ヌクレオチドを有する２個のフラグメントを接合する技法は、後 で酵母の発現ベクターへと導く中間のプラスミド構成にも用いた。 本発明の方法の詳細を、本発明の好ましい態様について記載する。 真正のＨＳＡの産生法 本発明のもう一つの態様では、発現および場合によって分泌条件下で組換えＤＮ Ａ配列を含むベクターで形質転換した宿主を増殖し、発現され且つ場合によって 分泌されたタン白質生成物を単離することによる真正のヒト血清アルブミンの産 生法が提供される。この方法の特徴は、（ａ）本発明による構造遺伝子を含むベ クターで形質転換した宿主を用い、（ｂ）真正のヒト血清アルブミンまたは所望 ならばそのメチ・オニル誘導体を単離することである。 本発明のこの点での好ましい態様では、用いられる宿主は、真正のヒト血清アル ブミンをコードする構造遺伝子を含むシャトルベクター（大腸菌−酵母）で形質 転換した５ａｃｃｈａｒｏｉｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、前記の遺 伝子はコドンが酵母宿主に関して選択されたヌクレオチド配列から成っている。 真正のＨＳＡ 本発明のもう一つの観点では、本発明による真正のヒト血清アルブミンの産生法 から得られる真正のヒト血清アルブミンが提供される。この真正のＨＳＡは、天 然の成熟したＨＳＡＯ代わりに総ての用途に用いることができる。 製剤 本発明の別の観点では、薬学上受容可能な担体および／または希釈剤と混合した 、本発明の真正のヒト血清アルブミンを含んで成る製剤が提供される。好適な担 体および／または希釈剤は、天然のＩＳＡに用いられるものであり、例えば食塩 溶液であり、例えば指針のための米国薬局方が参照される。同じことは、防腐剤 、ｐＨ調節剤、緩衝剤などの所望により包含され得る通常の添加剤にも適用され る。 図面は、プラスミドの構成とフルオログラフに関する。 具体的には、第１図は、コーリープラスミドｐＧＢ１の物理的地図を示す。 第２図は、酵母ＨＩＳ３遺伝子を含むプラスミドｐＧＢ２の地図を示す。 第３図は、プラスミドｐ　Ｇ　Ｂ　３　２２９　Ｔ　（ａ）の地図及び、中間の 構成ｐＧＢ３−２２９ＴＫ’　（ｂ）を経る基本発現ベクターｐ　Ｐ　Ｔ　２　 ＨＫ　１　（ｃ）の段階１および２によるの構築を示す。 第４図は、ｐＧＢ２（ＨＩＳ３、Ｐｌ（０５、ＰＨ０３）の地図である。 第５図は、酵母ＰＨ０５遺伝子のプロモーターを含むプラスミドｐＵｃ１８／６ ２３Ｐ（ａ）の地図と、プラスミドｐＵｃ１８＊／６２３Ｐ（ｂ）とｐＵｃ１８ 　／６２２ＰＨ（ｃ）へと導く改良（１，２および３）を示す。 第６図は、基本発現ベクタープラスミドｐＰ７２ＨＫ□の物理地図を示す。 第７図は、酵母−大腸菌シャトルプラスミドｐＢＹ２００の構成を示す。 第８図は、ｐＰＴ２／ＨＳＡからの全ｒＨ３Ａ発現カートリッジ」を含む２種舅 の、発現ベクタープラスミドｐＹＨｓＡ２２１およびｐＢＹ２／ＨＳＡの構成を 示す。 第９図は、合成ＩＳＡ遺伝子を発現する酵母ベクターの構成の流れ図を示す。゛ 第１０図は、ウマ抗−Ｈ５Ａ血清で免疫沈澱し５ＤＳ−で標識したタン白質のフ ルオログラフを示す。 第１１図は、人工のプレブローリーダーコード配列とＨＳＡ　（Ｎｏ、　１）を コードする人工遺伝子を含む酵母発現プラスミドの構成を示す。 第１２図は、精製した天然のＨＳＡ（ＡおよびＣ）と酵母で産生したＨＳＡ　（ ＢおよびＤ）のＣＮＢｒ開裂の生成物であって５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル 電気泳動法によって分割したものを示し、コマジエ（Ｃｏａ＋１ａｓｉｅ）染色 したゲルも（エル・ケイ・ビー−ウルトラ−スキャン（ＬＫＢ−Ｕｌｔｒｏ−８ ｃａｎ）を用いて）レーザー走査を行った。 第１３図は、酵母ｒＹＥプレプロ　−Ｈ３ＡＪで発現・分泌したＨＳＡ　（）ラ ックＢ及びＣ）と、ＹＨＳＡ−２２１で発現したタン白質（トラックＤおよびＥ ）とを比較したウェスタン・プロットを示し、トラックＡは精製したＨ３Ａ試料 を示す。 スキーム１　人工Ｈ３Ａ遺伝子の地図 ローマ数字：　大きなＨ８Ａフラグメント：Ｈ８Ａｌ、ＩＩ、ＩＩＩ　、ＩＶ、 　Ｖ。 アラビア数字：合成オリゴデオキシリボヌクレオチドＨＳＡＩ、２．３・・・２ ４であり、それぞれエキストラＧＧＣＣ配列を３′末端に有する。このエキスト ラ配列は１（ＳＡ配列中には現れない。 ＨＳＡ７．１３および１９オリゴヌクレオチドは５′末端にエキストラＧＧＴＡ Ｃ配列をまた有するが、これは最終的なＨＳＡ配列には現れない。 オリゴヌクレオチド（ＨＳＡＩ）をアダプター分子と結合させると、これは例え ばＨＳＡ　１＋Ａと呼ばれる（スキーム２を参照）。 ＨＳＡ　１＋Ａを一般に用いられる大腸菌ベクターｐＵｃ１９にクローニングす ると〔ヤニシューベロン・シー（Ｙａｎｎｌｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　Ｃ，）、ヴ イエイラ・ジェイｍｅｉｒａ、　Ｊ、）およびメッシング・ジェイ（Ｍｅｓｓｉ ｎｇ、　Ｊ、）Ｇｅｎｅ、　３３．１０３−１１９　（１９８５）］　、得られ るプラスミドはｐＨ５Ａ１と呼ばれる。 ＩＳＡ　２＋Ａを前記で得られたｐＨ３Ａ　ｌ中にりローニングすると、生成す るプラスミドはｐＨ５Ａ　（１−２）と呼ばれる。 続けてクローニングするとｐＨ３Ａ　（１−６）となり、このプラスミドは、ｐ Ｕｃ１９でクローニングされたＨＳＡ　ＩＩの大きなフラグメントを含み、これ はｐＨ３Ａ　ＩＩと呼ぶことができる。 同様に、ＨＳＡ　ＩＩＩ−１ＨＳＡ　ＩＶおよびＨＳＡ　Ｖの大きなフラグメン トはそれぞれオリゴヌクレオチド７−１２．１Ｂ−１８および１９−２４から得 られ、ｐＨ８Ａ　ＩＩＩ、ｐＨ５ＡＩＶおよびｐＨ５Ａ　Ｖプラスミドを生じる 。 ＨＳＡ　１１およびＩＳＡ　ＩＩＩの大きなフラグメントをｐＵｃ１９ベクター 中で結合すると、生成するプラスミドはｐＨ５Ａ　（１−１２）または ｐＨ５Ａ　（＋１−ＩＩＩ　）と呼ぶことができる。 同様に、ＨＳＡＩＶおよびＨＳＡＶの大きなフラグメントがｐＵｃ１９ベクター 中で結合すると、生成するブラスミドハｐ　ＨＳ　Ａ　（１３−２４）またはｐ Ｈ５Ａ　（ＩＶ−Ｖ）と呼ぶことができる。 ＨＳＡ　（ＩＩ−ＩＩＩ　）とＨＳＡ　（ＩＶ−Ｖ）を結合スルト、それらはｐ ａｓＡ（ＩＩ−Ｖ）を生じ、Ｈ５Ａｌ７）ｌｉｌ！全コード領域（Ｎ−末端Ｍｅ ｔを除く成熟した１３から５８５のアミノ酸）がクローニングされる。 ｐＨ５Ａ　（ＩＩ−Ｖ）をＩ）ＵＣｌ３のＨＳＡ　１７ラグメントで補足すると きには、生成するプラスミドはｐＨ５Ａと呼ばれる。 ＨＳＡ　Ｉフラグメントは、２種類の形態の部分２重らしたがって、ｐＨ５Ａの ２種類の変種、すなわちｐＨ５ＡＮｏ、ｌおよびｐＨ５ＡＮｏ、２が得られる（ スキーム５）。 ｐＨ５ＡＮｏ、２から、Ｍｅｔ−ＩＳＡ：］−ド遺伝子を（平滑末端および５ａ ｃｌエンドを有するフラグメントとして）得ることができる（スキーム６）。 ｐＨ５Ａ　Ｎｏ、１から、成熟したＨＳＡ：ｌ−ド遺伝子を（平滑末端およびＳ ａｃ　Ｉエンドを有するフラグメントとして）得ることができる（スキーム７） 。 Ｍｅｔ−ＩＳＡまたは成熟ＨＳＡコードＤＮＡ領域を、ＰＨ０５酵母プロモ一タ ー＋シグナル配列コード領域およびＨｉ　ｓ３酵母転写ターミネータ−を含むｐ ＰＴ２ＨＫ１大腸菌ベクター中にクローニングする（ｐＰＴ２／ＨＳＡを得るこ とができる）。プロモーター−シグナル配列−Ｈ５Ａ遺伝子−ターミネータ−カ セットを自己複製酵母ベクターｐＢＹ２００に配合して、ＩＳＡを発現させる。 スキーム２　オリゴヌクレオチドとアダプター分子との結合の例 ｐ　ＧＧＧＣＣ ｐ　ＧＧＧＣＣＣ−Ｇ ＣＣＣＧＧＧ−ＣＴＴＡＡ ＨＳＡ　１＋Ａ ＨＳＡ　１オリゴヌクレオチドとアダプターの上方鎖は５′−ホスホリル化して いるが、アダプターの下方鎖はホスホリル化してない。 スキーム３　ＨＳＡのクローニング中に用いられるアダプター ＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＴＡＣＧＣＴＧＴＣＧＡＣＣＴＴＡＡＣＣＧＧＧＡＣＣＴ ＣＧＡＧＴＣＡＧＡＣＴＴＡＡ　アダプター３アダプター１は、Ｈ３Ａオリゴヌ クレオチドのほとんどのクローニングを促進するのに用い、アダプター２は、Ｈ ＳＡＩＢＳ１７および１８オリゴヌクレオチドについて用い、 アダプター３は、Ｈ８′Ａ遺伝子の下流のアダプター１を置換して、酵母プロモ ーターおよびターミネータ−領域を含む大腸菌ベクター ｐＰＴ２ＨＫ１中にＨＳＡ遺伝子をクローニングするのに必要な５ａｃ１部位を 導入した。 スキーム４　Ｈ５Ａ　Ｉフラグメント Ｎｏ　ｌ　ＡＣＩ、ＴＣＴＣＣＣＡＧＴＧＴＴＣＡＣＡＣＴＴＣＡＩＩ：ＣＣＡ ＣＴＧ丁ＣＴＡＡＣ；ＴＴＣＣＴＡＣＰｉｔｌ　５ａｕ）Ａｌ ｋ１１１４ｅｔ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｈｌｓ　ＬｙＳ　Ｓｅｒ　Ｃ１ｕ　Ｖａｌ　 Ａｌａ　Ｈ２Ｎ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　ＬｙＳｄＬＴＣｒ　ｃ　ＣＡ　ＣＣＣｒ　ｃ 　ａ　ｃ　ａ　Ａ　Ｃｒ　ｃ　ｔ　ｃ　ａ　ａ　ｃ　ｒ　ｃ　ｃ　ｃ　ｒ　ｃ　 ａ　ｃ　Ａｃ　ａ　ｒ@ｒ　ＣＡ　Ａｃ ５ｏ　２　ＡＣＣＴＣＡＣＴＡＧＴＡＣＣＴＣ，ＣＣＡＣτＣＴＴＣＡＣＡＣτ τ（ａ（：ｃｃａｃτＣＴＣτＡＡＣ，ＴＴＣＣＴＡＣスキーム５　ｐＵｃ１９ 中への完全なＨ３Ａ遺伝子の変種のクローニング Ｈａｒｄ　！ＩＩ　５ｅｕ５ＡＩ　ＡＣＩＩＩ　ｈｅ！　ＥｅｏＲ１スキーム６ 　ｐＨ５Ａ　Ｎｏ、　２からのＭｅｔ−Ｈ８ＡコードＤＮＡ片の生成 −Ｇ記ＡロＡπＡ直Ａ部ロ′□Ａ叩冗−−−ＧＡＣＧＴＣＡＣＴＡｉＡＣＣＴＧ ＣＧＡ　ＡＧ−ａｃＩ ＣＡｌ’ｃＡＴＧＧＡＣＧＣＴ　Ａ（ｍ−ＴＡＣＣ’ｌ慕ＡＡＧ− ＭｃｔＡｓｐＡｌａ ＡＴＧＧＡＣＧＣＴ　ＡＧＣＴ 平滑末端　ＴＡｅΔ□Ｃ５ａｃｌエンド註：　Ｍｅｔ−ＵＳＡコード領域を得る ために、独特の制限部位をＨＳＡＩに（次いでｐＨ５Ａへ）導入した。 すなわち、Ｂｅ１ｌ認識配列を ＨＳＡＩへ（次いで、ｐＨ３Ａへ導入して、ｐ）ＩＳＡＮｏ、　２変種を生じた ）。 スキーム７　ｐＨ５ＡＮｏ、１から成熟ＨＳＡコードＤＮＡの入手 ａｃＩ Ａ図口狂ＡＡＧ− 平滑末端　Ｃ窟刀Ａ　Ｃ５ａｃｌエンド２Ｑ　コく　フ、＜−ト　フく　りく り（Ｊ＜　Ｊ＜　（Ｅ−１−＜　＊ｕ くく　じｏ　ＱＯ＞ｏ　ＱＱ　＜＜ ψじ　口υ　リＥ−Ｉ　Ｑ（（Ｅ−−○＞＜　：！：？　＞Ｑ　αＱ　−υ　の く−く　〜ｈ　ｕｔ−＋　＜＜　＜ａ　＜ロクロ　−（Ｊ　（Ｅ−Ｉ　Ｚ＜　− Ｅ−ごト＞＜　：！：Ｅ−ＪＣ）　Ｊ＜　（Ｅ−：Ｃ（Ｊ−く　シト　（Ｑ　（ ５（Ｊ　＞Φ　トくコロ　りじ　くトー　の０　＜ト　４８口Ｉ−Ｉ　ωＥ−ｑ （、＋　＞＜　−ｕ　＜ｈ＋Ｊ［ｍ　ｔｊＥ−１＜Ｌ）、−ｉ＜　（じ　〉ａ） ＜　＜ｈ　＜ｈ＜ｈ　閲ＣＪ　、ｊＥ−、！　（−２Ｑ　＋Ｊ　Ｑ　−２ＣＪ　 ＝Ｅ−（Ｅ’ＯＬＤ　＜ａ　＜ａ　＜じ　へ←　〉ＱＺ（Ｊ　ｃ？υ　２＜　の じ　くＱ　りくψく　洲（、Ｊ（＞＜　、ｊ（Ｊ　！（（（ｈＥ−１ｊＬＩ　Ａ ＜　＜じ　ＱＯくト　の（Ｊ　＝ト　ロく　口υ　くト１、）ｏｙ　（：ｅ　（ Ｊ　Ｃｆ、じ　＝−−υくＱ　−υ　ト＜　（（０，Ｅ−＜Ｕ リ　−ト　ロ　０　の　じ　フ　ロ　匡　（Ｊ　Ｑ　（’（Ｅ−１−ＩＥ−＞＜ 　ロト　菌υ　匡Ｕ堪　〉ロ　Ｈ（ｈ５　（−５＋＋　ψト＜＜キ 区 Ｑく　りく　フく　ψロ　Ｃく 二じ　−＜　４（＞＜　αＱ ＜＜　ａａ　ｕａ　ｗ＜　＜＜ のト　区？　−Ｅ−１°ｖＩじ　フく 一＠　薗υ　＜Ｆ−４＞＜　ｔｊ（ Ｕト　のｈ　＞ａ　−＜　ａａ −υ　ｏ４（Ｊ　のト　ロＣＪ　ｈａ ｑ＜　ωく　＞ロ　＝ト　開− （Ｌ）　＜ａ　（ＪＥ−１らト　Σく ＞１−４　ｚ＜　ψυ　−Ｑ　＞？ Ｊｔ：Ｉ　Ｊ＜　Ｈ＜　り＜−０ ａａ　Ｃ：）ＣＪ　：（Ｊ　＜ａ　ｖａφυ　ｚ〇　ニド＜卜　コＱ ｙ　（ｒＡ＜　口（Ｊ　ＪＵｔＱＦ−ｍ工（Ｊ　＜＜　ψト　くじ　−ト ｔＡト　コく　のＣ５＜Ｅ＝　国Ｑ ’：ｓｔ：Ｉ　、Ｊ（−（−＋（Ｊ　：Ｅ−υト　ロａ　Ｊ（＜ａ　Ｑ、Ｅ− φｌ−１ψシ　コく　フＱ　、ｊＥ− ンＱ　＞ａ　！（ωト＜ト （ＪＥ−Ｉ　ＣＪｈ　ｏじ　−ト　〉じ切ｕ　Ｏ（＞Ｅ−＊ＣＪ　り□　ｚ＜ ＞＜　ａ：ｕ　ｗａ　Ｃｌ５ｕ　ζ＜−＜、５＜　Ｑ、ＣＪ　Ｌ）Ｃ５リド−＜ 　ロＱ−ト　山υ　公０　−ト　αトート ＝Ｑ　の（：ｌ：　Ｅ’　（Ｅ−Ｉ　国ｕ　（Ｅ−−＜＜じ　ヘト　〉０　φト 　〉口 ｗＵ　＜１−ＩＺ（Ｊ　二ＣＪ　＞？　〜ＣＪ＞＜　Ｊ（Ｊ　ＩＩＩ＜　＞＜　 ｔｊＱ　のくａ＜　＜ａ　＜＜　Ｅ−１ト　ａａ　＜じ弄 に ωｈ　ｃ＝ｕ　ａｕ　ｏ＜　ψＣ（Ｆ−＞ロ　ンく　口０　αυ　洲く　−υ （Ｊｌ−Ｉ　Ｅ−ト　のト　らｕ　Ｊ（＜ａｌ、３ト　αト　田Ｑ　コＱ　ムυ 　くト＜１−１　−〇　＝ト　却ト　り＜−〇＞　Ｑ　ｌ／）　？　ＣＭ）Ｉ　 Ｊ　Ｅ’　（ｌｊ　（Ｃｊべ ＣＧＴＧＣＡＡＡＡＣＡＣＡＴＡＡＴＴＧＧを用いてチェ、ｙりした。 ｐＨ５Ａ　（ＩＩ−Ｖ）ｉ、：おけルＨ５Ａ　ＩＩ＋オヨび１ｖノ結合は、配列 プライマーとしてＨＳＡＩＯオリゴヌクレオチド自身を用いてチェックした。 Ｈ８Ａ遺伝子合成がｐＵｃ１９ベクターで完了するときには、全Ｈ８Ａコード領 域はプラスミド鋳型および１０種類の異なる配列プライマーを用いて配列した。 更に、ｐＵｃ１９ベクターから Ｍ１３ｍｐ１９ベクター（ヤニシニーベロン、シー（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒ ｏｎ、　Ｃ，）ら）に代えて、同じ１０個のプライマーを用いて一本鎖ファージ ＤＮＡ鋳型で配列を行い、ＨＳＡコード配列を確認した。 ｐＵｃ１９またはＭ１３ｍｐ１９での全Ｈ３Ａコード領ｐＫｏプライｖ−ＩｐＵ Ｃ１９の１ａｃＺ中のＩＳＡの外側 ｐＩ（ＳＡプライマー１　１５８７−１８０３ｐＨ３Ａプライマー２　１３９８ −１４１４ｐＨＳＡプライマー３　１１９５−１２１１ｐＨ８Ａプライマー４　 ９８８−１００７ｐＨ３Ａプライマー５　７９５−８０９ｐＨＳＡプライマー６ 　５８２−５９７ｐＨ３Ａプライマー７　３８２−８９８ｐＨＳＡプライマー８ 　１７８−１９２ｐＨＳＡプライマー９８８−８５ 最後のプライマー（プライマー９）は、）（ＳＡ遺伝子をｐＵｃ１９からｐＰＴ ２ＨＫ１へ代えたとき、ＨＳＡ（成熟またはＭｅｔ型）・と酵母 ＰＨ０５プロモーター−シグナル配列の結合をチェックするのにも用いた。 Ａｐａ！　ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）ＥｃｏＲＩ　ニュー拳イング ランド・バイオラボス（罷Ｂ） フレノウ・ポリメラーゼ　ベーリンガ−（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）（Ｋｌｅｎｏ ｗ　ｐｏｌｙｕｅｒａｓｅ）Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ　）ＪＥＢ （Ｔ４　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅ） Ｋｐｎｌ　ＮＥＢ Ｓａｃｌ　ＮＥＢ ＢａｍＨＩ　ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉ　ｎｇｅｒ）ＸｂａｌＥＢ ムング・ビーン・ヌクレ　ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）アーゼ （ａｕｎｙ　ｂｅａｎ　ｎｕｃｌｅａｓｅ）Ｈｉｎｄｌｌｌ　ＮＥＢ Ｓａｕ３ＡＩ　ＮＥＢ Ｂａｌｌ　ＮＥＢ ＰｓｔｌＮＥＢ Ｘｈｏｌ　ベーリンガ−（Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ）Ｔ４ポリヌクレオチドキナー ゼ　ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉ　ｎｇｅｒ）（Ｔ４　ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔ ｉｄｅ　ｋｉｎａｓｅ）ＴＩ　ＲＮａｓｅ　カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ ｍ）プロテイナーゼＫ　メルク（Ｍｅｒｃｋ）（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ　） ｋｌｌ　ＮＥＢ Ｓａｌｌ　ＮＥＢ ヘリカーゼ　ＲＥＡＣＴＩＦＳ　ＩＢＦ（）ｔｅｌ　１ｃａｓｅ） グルクロニダーゼ　ベーリンガ−（Ｂｏｅｈｒｉ　ｎｇｅｒ）（Ｇｌｕｅｕｒｏ ｎｌｄａｓｅ） 同位体 ７−　”２Ｐ　−Ａ　Ｔ　Ｐ　（＜５ＱＯＱ　Ｃｉ／ｍｍｏｌ）ａ　−””Ｐ　 −ｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ　（８００Ｃ１／ｍｍｏｌ）ａ　−３５３−ｄ　Ａ　Ｔ　Ｐ　 （〜１２００　Ｃ１／ｗｏｏｌ）をアメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から得た 。 ３５ｓ−メチオニン（〜８００　ＣｉｌｏＣｌｌＯをアメルシャム（Ａｍｅｒｓ ｈａｍ）から得た。 オリゴデオキシリボヌクレオチドの化学合成手動式ＤＮＡベンチ合成装置（オム ニフィツト（Ｏｎ＋ｎ１ｆｉｔ）により、モノマーおよび／またはダイマー・ビ ルディング・ブロックを用いるホスフェート−トリエステル法（スブロート・ビ ー・ニス（Ｓｐｒｏａｔ　Ｂ、Ｓ、）ら１９８３、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　 Ｌｅｔｔｅｒｓ　２４．５７７１）　、または自動ジーン・アッセンブラ−（（ ｉｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ）　（ファルマシア（ＰｈａｒＩＩｌａｃｉａ） 　）を用い、製造マニュアルによるホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉ ｄｌｔｅ）法を用いた。化合物は、クルアケム（Ｃｒｕａｃｈｅｍ）　（ホスフ ェートトリエステル化合物）またはファルマシア（Ｐｈａｒｓａｃｉａ）　（ホ スホラミダイト化合物）から得た。 合成オリゴデオキシリボヌクレオチドの５１−ホスホリル化 酵素ホスホリル化は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰを用いて行っ た。特定の要件によって、この反応は放射性または非放射性ＡＴＰを用いて行っ た。 この方法は、ハイブリッド形成プローブを得るためＨＳＡオリゴヌクレオチドに 用い、またはプラスミドＤＮＡ＃型で配列反応を行うとき配列プライマーの５′ −標識に用いた。１０　ｐｏｏｌのオリゴヌクレオチドを、γ−１トリス−ＨＣ ｌ、ｐＨ７，５５０ｍＭ　Ｍｇ　ＣＩ　２　（２ＩＩ＋）およびｔｏｏ　ｍＭＤ ＴＴ　（１ｕｌ）に溶解した。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＩＯＵ／μｌ） を加え、混合物を３７℃に３０分間保持した後、加熱処理（１００℃、３分間） を行い、酵素を不活性化した。溶液を、更に用途にしたがってＩ＼イブリッド形 成緩衝液または無菌水で希釈

【７た。反応しこの方法は、ＩＳＡオリゴヌクレオ チドを、アダプターとともに結合する前に、これらを標識するのに用いた。 ５０　ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドと１００　ｐｏｏｌのγ−３２Ｐ−ＡＴＰ 　（２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ　）を、５０１ｎＭトリスーＭＣＩ。 ｐＨ７，５，１０ｄ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２および１０ｄＤＴＴを含む１０．１反応 容積に溶解し、１１ＪｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１００／ｕｌ）を加 えた。３７℃で１時間放置した後、混合物を１００℃で３分間加熱処理した。 （Ｃ）　非放射性ＡＴＰでのホスホリル化この方法を、アダプター１およびアダ プター２の上方の一本鎖に、アダプター３およびＨＳＡ　Ｉフラグメントオリゴ ヌクレオチドのような他のアダプタ一様分子では両方の鎖に適用した。 アダプター１およびアダプター２オリゴヌクレオチドの上方鎖のホスホリル化は 、下記のように大規模に行った。 ２．２　ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドと２０　ｎｍｏｌのＡＴＰを、５０Ｉｌ １ＭトリスーＨＣＬ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２．１０ｄＤＴＴ および１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む１００１１１反応容積に 溶解した。反応は、３７℃に１時間放置した後、１００℃で３分間加熱処理する ことによって行った。 他の非放射性ホスホリル化は、反応混合物に放射性の７−３２Ｐ−ＡＴＰを加え なかったことを除き、５０　ｐｒＡｏｌのオリゴヌクレオチドの規模での低特異 的活性ホスホリル化に記載したのと本質的に同様に行った。 ＩＳＡオリゴヌクレオチドとアダプターとの結合（一般的方法） ２５　ｐｒＡｏｌの５′−３２Ｐ−ホスホリル化ＩＳＡオリゴヌクレオチドを、 ７５　ｐｒＢｏｌの５′−ホスホリル化上方鎖アダプターオリゴヌクレオチドお よび７５　ｐｍｏｌの非ホスホリル化下流鎖アダプターオリゴヌクレオチドと、 ５０ＩＩＩＭトリスーＨＣＬ　ｐＨ７，５，１０ＩＩＩＭ　ＭｇＣ１２，１０ｍ ＭＤＴＴおよび１１のＡＴＰを含む５０μｍ反応容積中で混合した。混合物を１ ５℃に冷却し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ約０．２１Ｊｌ　（約８０単位）を加えた。 反応は１５℃で４〜１６時間行った。ＩＭのＮａＣｌ３０１１１とｌｕｌの酵母 担体ｔＲＮＡ　（１０μｌ／μｌ）を加え、オリゴヌクレオチドを液体窒素浴中 で３００μｌエタノールを用いて２分間沈澱させた。混合物を１２．０００　ｒ ｐｉで５分間遠心分離し、ペレットを乾燥して、８０％ホルムアミド、１００１ Ｍ　ＥＤＴＡ、　０．０５％キシレンシアツールおよび０．０５％ブロモフェノ ールブルーを含むゲル充填緩衝液１０μｍに溶解した。結合したＩＳＡオリゴヌ クレオチドの非結合オリゴヌクレオチド（およびアダプター）からの分離は、尿 素を含まない１０％アクリルアミドゲルに前記の溶液を適用することによって行 った。ゲル電気泳動は、ゲルとしての１００　ｍＭＴ　Ｂ　Ｅと操作緩衝液（１ ００ｓＭ）リス、１００１０Ｍホウ酸、２ｄＥＤＴＡ、ｐＨ８，３）を用いて４ ００　Ｖで３〜５時間行った。ゲルのラジオオートグラフィ　（２〜１０分間） の後、２種の主要な放射性バンドを特定し、その下部バンドは非結合ＨＳＡオリ ゴヌクレオチドに相当し、上部バンドはアダプター結合ＩＳＡオリゴヌクレオチ ドに相当した。後者に相当するゲル片を切り出し、３７℃で５０ｍＭＮａＣ１（ ３００１１１）に１０〜１６時間浸漬した。上澄液を（５０ＩＩＭトリスーＨＣ １，ｐＨ８，０，３００μｍで飽和した）フェノールで２回処理し、オリゴヌク レオチド−アダプター付加物を、３０１１の３　Ｍ　Ｎａ０Ａｃ、、ｐＨ５，２ 、ｌ　、１の担体ｔＲＮＡ（１０μｍ／ＩＪｌ）および７５０１１ｉのエタノー ルを添加後沈澱させた。 ベレットをエタノールで洗浄し、乾燥して、ｆｏｕｌの無菌水に溶解し、一部分 を（パフカード（Ｐａｃｋａｒｄ）製液体シンチレーションカウンター中で）計 数し、結合反応の収率を計算した。出発材料３２Ｐ−ホスフェ　）Ｈ３Ａオリゴ ヌクレオチドに対する収率は２０〜５０％（単離収率）であった。 ２４種類のＨＳＡオリゴヌクレオチドの２１種類は、アダプター１と結合した。 残りはｌ５Ａ１Ｂ、１７および１８オリゴヌクレオチドであり、アダプター２と 結合した。 （Ｉ（ＳＡ１６に対しては、・この新規なアダプターが必要であることは明らか であったが、Ｈ３Ａ１７および１８に対しては余り良好な選択であったとは思わ れなかった。とにかく、これら３種類のオリゴヌクレオチドは同時にアダプター ２と結合した。） 細菌株 ＨＳＡを含むプラスミドの形質転換および増殖のほとんどは、ＪＭＩＯＩ大腸菌 （メッシング、ジエイ（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、）　、フレア・アール（Ｃｒｅ ａ、　Ｒ，）及びシーバーブ、ビー・エイチ（Ｓｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、Ｉｌ、） 　、Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、　９．　（１９８１）、　３０４− ３２１）を用いて行った。この菌株は、次のような遺伝子型を有する。５ｕｐＥ Ｓ　ｔｈｉ。 Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、［Ｆ’　、ｔ　ｒ　ａＤ３６、ｐｒｏＡＢ、１ａｃ ｌ　９２６Ｍ１５コ　。 Ｂｅ１ｌ酵素の操作が必要となる前に、ｄａｍ−大腸菌株（０Ｍ２）（モリヌス 、エム・ジー（Ｍｏｒｉｎｕｓ、　Ｍ、Ｇ、）およびモーリス、エヌ・アール（ Ｍｏｒｒｉｓ、　Ｎ、Ｒ，）、（１９７３）Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１１４．１１４ ３−１１５０）をプラスミドの増殖に用いた。 ｐ　Ｂ　Ｙ　２／　ＨＳ　Ａ　Ｎｏ、　ｌとｐＢＹ２／Ｈ５Ａ　Ｎｏ、２の構成 の際に、大腸菌（Ｋ１２）株のＪＦ１７５４株（ｈｓｄ　ＲｈｓｄＭ　ｌａｃ　 ｇａｌ　ｍｅｔｌｅｕ　Ｂ　ｈｉｓ　Ｂ）を宿主として用いた。文献：ストーニ ス、アール・ケイ（Ｓｔｏｒｍｓ、　Ｒ，に、）、マツクネイル、ジエイ・ビー （ＭｃＮｅｌｌ、　Ｊ、Ｂ、）、カーネンデカール、ビー・ニス（Ｋｈａｒｎｅ ｎｄｅｋｇｒ、　ＰＪ、）、アン、ジー（Ａｎ、　Ｇ、）、バーカー、ジエイ（ Ｐａｒｋｅｒ、　Ｊ、）およびフリーセン、ジエイ・ディー（Ｐｒｉｅｓｅｎ、 　Ｊ、Ｄ、）　（１９７９）、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。 １４０、７３−８２．キス、ジー・ビー（Ｋｉｓｓ、　Ｇ、Ｂ、）、アミン、エ イ・エイ（Ａｍｉｎ、　Ａ、Ａ、）およびバールマン、アール、イー（Ｐｅｒｌ ｍａｎ、　Ｒ，Ｅ、）　（１９８１）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ ｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、　１．５３５−５４３゜ＪＦ１７５４の突然変異株１ ｅｕ　ＢおよびｈｉｓＢは、対応する酵母遺伝子（それぞれｌｅｕ　２およびｈ ｉｓ　３）で補足することができる。文献：ストルール、ケイ（Ｓｔｒｕｈｌ、 　Ｋ、）およびディビス、アール・ダブリｘ（Ｄａｖｌｓ、　Ｒ，Ｗ、）　（１ ９８０）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｔ、、　１３６．３０９−３３２゜ 酵母株 ＡＨ２２０［ａ、、ｔ　ｒｐ　１、ｌｅｕ　２　３．２−１１２、ｈｉｓ　３− １１．３−１５、ｐｈｏ　５、ｐｈｏ　３］実験室半数性株を、エイ・ヒンネン （＾。 旧ｎｎｅｎ）　、チバーガイギー・アーゲー（ＣＩＢＡ−にＥＩＧＹ　ＡＧ）、 バイオテクノロジ一部門、バーゼル、スイスから得た。 プラスミドとファージベクターによる大腸菌の形質転換これは、本質的にハナハ ン、ディー（Ｈａｎａｈａｎ、　Ｄ、）（ＤＮＡクローニング（ＤＮＡ　ＣＩｏ ｎｉｎｇ）　、第１巻、グローバー、ディー・エム（Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｄ、Ｍ、 ）監修、アイ・アール・シー・プレス・リミテド（ＩＲｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍ １ｔｅｄ）　、１９８５．１０９−１３５頁）に記載された方法と同じ方法で、 この文献のプロトコール３にしたがって調製した凍結コンピテント細胞を用いて 行った。 酵母の形質転換 ＡＨ２２０のヘリカーゼ処理によって調製した酵母スフェロプラストを、ヒンネ ン（ｌｌｉｎｎｅｎ）らの方法（ヒンネン、エイ（Ｈｌｎｎｅｎ、　Ａ、）、ヒ ックス、ジエイ・ビー（Ｉｌｉｃｋｓ。 Ｊ、Ｂ、）およびフィンク、ジー・アール（Ｆｌｎｋ、　Ｇ、Ｒ，）（１９７ｇ ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ：　ＵＳＡ、　７５．１９２ ９−１９３３　）によって形質転換した。 プラスミドの調製 迅速アルカリ抽出法（ビルンボイム、エイチ・シー（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ， Ｃ，）およびドーリ−、ジエイ（Ｄｏｌｙ、　Ｊ、）、（１９７９）　Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　７．１５１３−１５２３）の若干数の改良法 を用いた。 少量調製： 単一コロニーを、　１００　ｌＪｉ／ｍｌのアンピシリンを含む３　ｍｌのＬＢ −培地（マニアチス、ティー（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、）、フリッチュ、イー ・エフ（Ｆｌｒｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｐ、）およびサンプルツク、ジエイ（Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ、　Ｊ、）　（１９８２）分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ）　、コールド拳スプリング−ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、二ニー・ヨーク、４ ４０頁）に接種して、培養液を３７℃で１０〜１８時間振盪した。菌体を遠心分 離によって集め、１００　Ｌｌｌの溶液！（５０ＩＤＭプルコース、２５ＩｎＭ トリスーＨＣｌ、ｐＨ８，０、ｌｏｍｌＥＤＴＡ）に再分散して、室温で５分間 放置した。２００．１の新たに調製した溶液Ｉ＋（０，２Ｎ　ＮａＯＨ，，１％ ５ＤＳ）を加え、溶液を簡単に混合した後、氷上に５分装置いた。水冷溶液ＩＩ Ｉ　Ｃ１５０μｍ、３Ｍ酢酸カリウム−２Ｍ酢酸）を加え、混合物を簡単に混合 した後、氷上に１５分間放置した。混合物を１２．００Ｏｒｐｍで５分間遠心分 離し、４００．１の上澄液を新たに用意した試験管に採取した。エタノール８０ ０ν１を加え、混合物を５分間放置した後、１２．０００　ｒｐｍで２分間遠心 分離した。ペレットを４００１Ｊｌの１００ｍＭ）リス−ＨＣ１，ｐＨ８，０− ５０ｏＭ　Ｎ　ａ　ＯＡ　ｃＳｐ　Ｈ６，５に再溶解して、１ｍｌの９５％エタ ノールを加えた。−２０℃で３０分間放置した後、混合物を１２．００Ｏｒｐｍ で２分間遠心分離した。ペレットを乾燥し、１００　ｕｌのｌＯｍＭ）リス−Ｈ Ｃ１，ｐＪ（８，０−０，５υのＴＩＲＮアーゼを含む１ｄＥＤＴＡに溶解し、 溶液を３７℃に３０分間保ち、次いで５０１Ｍトリス−ＨＣｌ。 ｐＨ８，０で飽和したフェノール１００　ｌＪｌで抽出した。水性層を採取しく 約９ｈｌ）　、１０１１１の３お水性酢酸ナトリウム、ｐＨ５，２を加えた後、 ２６０μｌの９５％エタノールを加え、混合物を液体窒素浴で素早く冷却した。 遠心分離（１２，００Ｏｒｐｍ、　３分間）の後、ペレットを２００　μｍの０ ．３ＭＮａ０Ａｃ、ｐＨ５，２に再溶解し、５００　ｕｌの９５％エタノールを 加えて、核酸を前記と同様に（素早く液体窒素浴中で冷却した後、遠心分離によ り）沈澱させた。ペレットを１ｍｌの９５％エタノールで洗浄し、乾燥し、３ｈ ｌの無菌水に溶解した。 プラスミドＤＮＡの収量は、３〜５１１１と算出された。 アガロースゲル電気泳動および制限分析には、１〜２ＩＪ１の前記の溶液を用い 、配列反応には３．１を用いた。上記で得られたプラスミドを更にクローニング 実験に用いるときには、２ｈｌの溶液を用いて１種類または通常は２種類の酵素 で線形化した後、線形ベクターを単離した。 プラスミドＤＮＡの制限酵素開裂 総ての分析的制限分析は、ＢＳＡを反応緩衝液から常に除いておくこと以外は、 製造業者の指示にしたがって行った。 特定のプラスミドを１種類以上の酵素を用いて準備的規模で開裂するときには、 同時または連続反応条件を常に用いる。 ２種類の異なる制限酵素によるｐＵｃ１９開裂一般的に、大きなＨＳＡフラグメ ントの最初のＨ９Ａオリゴヌクレオチド（Ｉｆ、　Ｉｌｌ　、ＩＶおよびＶ）は 、２種類の異なる酵素でｐＵｃ１９ベクター中へクローニングする。この当初の 計画によれば、アダプター（アダプター１）と予め結合したＨＳＡＩ、Ｈ５Ａ７ 、ＨＳＡＩ３およびＨＳＡ１９オリゴヌクレオチドのみが、ｐＵＣ１９中にクロ ーニングされる。しかしながら、遺伝子アッセンブリ作業の際には、更に２種類 以上のＩＳＡオリゴヌクレオチド、すなわちＨ３Ａ４およびＨＳＡＩ７を対応す る中間のｐＨ５Ａベクター中へクローニングするよりも、ｐＵｃ１９中へクロー ニングするのが一層有利（またはより速やか）であることが判った。 ２μｌのｐＵｃ１９を、１００μｍの高濃度塩緩衝液（１００ｍｌＮａｃｌ、５ ０μｌ１ＭトリスーＨＣｌ、　ｐＨ７，５，１０ｏＭＭ　ｇ　Ｃ１２，１ａＭＤ ＴＴ）中で、２０単位のＰｓｔｌと２０単位のＥｃｏＲＩで３７℃で４時間処理 した。ＤＮＡを、５ｕｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，２と３００　ｕｌのエ タノールを加えることによってエタノール沈澱させ、液体窒素浴中で混合物を２ 分間冷却した後、１２，０００　ｒｐｍで３分間遠心分離した。ベレットを乾燥 し、４％フィコール（Ｆｉｅｏｌｌ）４００．０．０５％ブロモフェノールブル ー６０μｍに溶解し、４０ＩＩＩＭトリスーアセテート、２ｄＥＤＴＡ緩衝液（ ＴＡＥ緩衝液）中０．５９６アガロースゲル上で電気泳動した後、電気溶出、フ ェノール抽出、および酵母担体ｔＲＮＡｌｏμｍを加えることによって促進され るエタノール沈澱の後に、線形ベクターを単離したＣマニアチス、ティー　（Ｍ ａｎｌａｔｌｓ、　Ｔ、）、フリツチュ、イー−ｘ７（Ｐｉｒｔｓｃｈ、　Ｅ、 Ｆ、）およびサンプルツク、ジエイ（Ｓａｉｂｒｏｏｋ、、　Ｊ、）９子クロー ニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリングパハー バー・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ得られたベレットを１０μｌの無菌水に溶解し、 線形ベクターの濃度をミニゲル法（同上、４６８〜４６９頁）によって算出した 。 このベクターをクローニングに用いた：Ｈ５Ａｌ。 ２ＩＪｌのｐＵｃ１９を、１００μｌの高濃度塩緩衝液中で、２０単位のＢａｍ ＨＩと２０単位のＥｃｏＲＩで前記と同様に処理し、線形ベクターの単離は本質 的に前記と同じ方法で行った。このベクターを用いてクローニングした：Ｈ３Ａ １３、）（ＳＡ１７゜ これは、２．１のｐＵｃ１９に対して２０単位のＸｂａｌと２０単位のＥｃｏＲ ｌとを用いて、本質的に上記と同様に行った。 Ｘｂａｌ−ＥｃｏＲＩ　ｐＵｃ１９ベクターを用いてクローニングを行った：Ｈ ＳＡ４、Ｈ５Ａ７、ＨＳＡＩ９゜ＡｐａｌとＥｃｏＲＩによる中間ｐＨ５Ａベク ターの開裂 前記の方法で調製したｐ　ＨＳ　Ａ２０Ｌ＋１を、６ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ７，４，６ＩｅＭＮａｃ　Ｌ　ＢｍＭＭｇｃ　１２．１ｍＭＤＴＴおよび４０単 位′ｃ′）ＡｐａＩ酵素を含む１００１１１の反応容積として、反応混合物を３ ７℃に保持した。２νｌの試料をＴＨＥ緩衝液（８９ＩｏＭ　）リス、８９　ｏ Ｍホウ酸、８ｍＭＥＤＴＡ）中０．５％アガロースゲル上で処理した。 開裂が完了したようであれば（１〜４時間後）、ｌＯμｌのＩＭＮａＣｌ、５Ｉ ＪｌのＬＭ）リス−ＩＣ１，、ｐＨ７，５および２０単位のＥｃｏＲＩを加えて 、混合物を更に４〜１６時間３７℃に保持した。線形ベクターＤＮＡをエタノー ルで沈澱させ、前記の様に５％アガロースゲル上で精製し、線形ｐＵｃ１９ベク ターを単離した。 このＡｐａｌ−ＥｃｏＲＩの二重消化を次のようなプラスミドで行ワた：　ｐＨ ５Ａ１．２．４．５．７．８．９．１０．１１．１３．１４．１５．１７．１９ ．２０．２１．２２．２３゜ＨＳＡオリゴヌクレオチド−アダプター複合体のｐ ＵＣ１９またはｐＨ３Ａベクター中へのクローニング一般的方法 約０．１μＩの二重開裂したｐＵｃ１９またはｐＨ５ＡべＭｇＣｌ２．１０　ｍ Ｍ　ＤＴＴ、ｌ　ｍＭＡＴＰおよび８０単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを含むｌｈ １反応容積中で５　ｐｍｏｌのＨＳＡオリゴヌクレオチド−アダプター複合体と 混合し、反応混合物を１５℃で４〜１６時間保持した。混合物を６０℃まで５分 間加熱し、室温まで冷却した後、１　ｕｌの（１ｍＭの濃度の４種類総てのデオ キシヌクレオチド５′−トリホスフェートを含む）１ｍＭｄＮＴＰと１　ｐｉの ０．５単位／分間放置した。次いで、これを６０℃に１０分間加熱−し、４１１ １の無菌水、２５０＋ｎＭ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５および５０　ｓＭ　Ｍ　 ｇ　ＣＩ　２を含む２．１の緩衝液、ｌ　１１１の１００　ｍＭＤＴＴ、１μｍ の１０ｒｎＭＡＴＰおよび２００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを１５℃で加えた。 反応混合物を１５℃で６〜２０時間保持した後、前記のように凍結コンピテント ＪＭ１０１大腸菌細胞中に形質転換した。１００μｌ／ｍｌアンピシリンを含む ＬＢプレート上で得られたコロニーをＬＢ−アンピシリンマスタープレートおよ びニトロセルロースレプリカプレート上に移した［グルンシュタイン、エム（Ｇ ｒｕｎｓｔｅｉｎ、　Ｍ、）およびホグネス、ディー　（Ｈｏｇｎｅｓｓ。 Ｄ、）　（１９７５）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７２ ．　３９６１コ　。 ニトロセルロースレプリカプレート上で発育したコロニ−を分離して、対応する ５’　Ｐ−ホスフェート標識したＩＳＡオリゴヌクレオチドプローブでハイブリ ッド形成した［マニアチス、ティー（Ｍａｎｌａｔｌｓ、　Ｔ、）、フリッチュ 、イー・エフ（Ｆｉｒｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、）およびサンプル−／　り、ジェイ （Ｓａｃｂｒｏｏｋ、　Ｊ、）分子クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ ｉｎｇ）Ｓコールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　Ｃ１９８２）　３１４〜３ ２５頁］。通常は４〜１ｏの陽性コロニーが３　ｍｌのＬＢ−アンピシリン培地 に発育し、プラスミドＤＮＡは前記のようにして調製した。 プラスミド鋳型上でのジデオキシ配列 若干数の改良物を加えた、スーパーコイル配列法［チェノ・イー・ワイ（Ｃｈｅ ｎ、　Ｅ、Ｙ、）およびシーブルグ、ビー・エイチ（Ｓｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、１ １．）　ＤＮＡ　４．１［ｉ５　（１９８５）　］を行った。前記の方法で調製 した３１Ｊｌのプラスミドを、１７．１の０．３　Ｍ　ＮａＯＨ−０，３ｍＭＥ ＤＴＡと室温で混合した。５分後に、３．１の２Ｍ酢酸アンモニウム−酢酸、ｐ Ｈ４，５および６０μｌのエタノールを加え、混合物を−８０”Ｃで１５分間保 持した。混合物を遠心分離（１２，０００ｒｐａ＋、　５分間）し、ペレットを ７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、７１１Ｍトリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，５，７ ｗＭＭｇＣ１２，５ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．１　ｄＥＤＴＡおよび ０．２５　ｐｍｏｌの５’　Ｐ−ホスフェート標識した配列プライマー（この作 業中に用いた配列プライマーはスキーム１０および上記に示しである。時には、 ＨＳＡオリゴヌクレオチドの一つも、それが３１−末端ＧＧＣＣエキストラ配列 を含むものであっても配列プライマーとして用いた）を含むｌｈｌの緩衝液に溶 解した。混合物を４５℃で１５分間加熱した。次いで、４つの２　Ｍｌのアリコ ートをマイクロタイタープレートのウェルに採取した。それぞれ４つのジデオキ シターミネーション混合物［ホンダ・ジー拳ピー（Ｈｏｎｇ、　Ｇ、Ｐ、）旧ｏ ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｐｏｒｔｓ、　２．９０７（１９８２）］の２．１と０． ２５単位／ｕｌクレノウポリメラーゼの２　ｕｌとを前記の４つの分取したプラ イマー−鋳型のそれぞれと混合し、混合物を室温で２０分間保持し、次いで５０ ℃で１０分間保持した。それぞれ反応混合物に、８０％ホルムアミド、１０　ｄ 　ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルーおよび０．０５％キシレンシア ツールを含む３　、ｌのゲル充填緩衝液を加え、混合物を１００℃で２分間加熱 した。 ゲル電気泳動を、８Ｍ尿素、９０＋ｃＭ）リス、９０ＩＩＩＭホウ酸、２　ｍＭ 　ＥＤＴＡ、ｐＨＢ、Ｂを含む６％アクリルアミドゲル上で行った。 個々のＩＳＡオリゴヌクレオチド（ＨＳＡｌ、２、・・２４）のクローニング 当初の計画は、下記の通りであった。 全Ｈ５Ａコード領域を５つのフラグメントＨ５Ａ　Ｉ、ＩＩ、Ｉｌｌ　、ＩＶお よびＶに分割した。後者の４つのフラグメント（ＩＩ、Ｉｌｌ　、ＩＶおよびＶ ）を更に６−６一本鎖オリゴヌクレオチド（それぞれ３′末端はＧで終わり、化 学合成によるエキストラＧＧＣＣ配列で付与されている）に分割し、全部で２４ のオリゴヌクレオチドとした。 ＨＳＡの大きなフラグメント（１１、Ｉｌｌ　、ＩＶおよび■）は、（アダプタ ーの助けによって）ｐＵｃ１９またはｐＵｃ１９から誘導されたｐＨ８Ａベクタ ー中への合成一本鎖オリゴヌクレオチドの連続クローニングによって得られ、本 明細書ではｐＨ８Ａ　ＩＩで例示した。 ＨＳＡＩはｐＵｃ１９中にクローニングしてｐＨ５Ａ１が得られ、 ＨＳＡ２はｐＨ５Ａｌ中にクローニングしてｐＨ５Ａ（１−２）が得られ、 Ｈ８Ａ３はｐＨ３Ａ　（１−２）中にクローニングして、ｐＨ５Ａ　（１−：３ ＋１が得られ、 ＨＳＡ４はｐＨ５Ａ　（１−３）中にクローニングして、ｐＨ５Ａ　（１−４） が得られ、 ＨＳＡ５はｐＨ５Ａ　（１−４）中にクローニングして、ｐＨ８Ａ　（１−５） が得られ、 ＨＳＡ６はｐＨ３Ａ　（１−５）中にクローニングして、ｐＨ８Ａ　（１−６） 即ちｐＨ５Ａ　ＩＩが得られる。 同様に、ｐＨ５Ａ　Ｉｌｌは、ＨＳＡ７．８．９．１０．１１゜１２オリゴヌク レオチドから得られた。ｐＨ５ＡＩＶは、ＨＳＡｌ３．１４．１５．１Ｂ、１７ ．１８オリゴヌクレオチドから得られた。ｐＨ５ＡＶは、Ｈ８Ａ１９．２０．２ １．２２．２３．２４オリゴヌクレオチドから得られた。 この一般的な方法は、通常はアダプター１（スキーム３参照）の助けによってＩ ＳＡオリゴヌクレオチドをクローニングするのに用いられるが、２．３数の場合 にこれの変更を行った。これを行う理由は、（ＩＳＡ　１１の場合のような）大 きなフラグメントで２個以上のオリゴヌクレオチドを平行してクローニングする ことによってアッセンブリ作業を速やかに行い、またはこの作業中に出会うクロ ーニングの問題を解決するためであった。 これらの特例は次の通りである。 ＨＳＡＩ　オリゴヌクレオチドは、全体として（ＨＳＡｌの５′−末端での）部 分二らせんの助けによってのみクローニングされた。 ＨＳＡ　ＩＩ　大きなフラグメントは、予めクローニングされたＨＳＡ　（１− ３）とＨＳＡ　（４−６）ＤＮＡセグメントからｐＨ５Ａ　１１　として得られ た。 ＨＳＡｌ５　オリゴヌクレオチドは、元のＩ（ＳＡ１５の約３分の２をカバーす る相補的オリゴヌクレオチドの助けによってクローニングしてのみ正確な配列を 褥ることができた。 ＨＳＡｌＢ　オリゴヌクレオチドは、新たなアダプター（アダプター２）の助け によってのみクローニングすることができた。 ＨＳＡｌ７　オリゴヌクレオチドはｐ　ＨＳ　Ａ　（１８−１６）中にクローニ ングして子弁ｊされるｐＨ５Ａ　（１Ｂ−１７）を得ることはできなかった。Ｈ ８Ａ１７配列は得られたプラスミドに見られたが、予めクローニングした領域に は欠失が見られた。したがって、ＨＳＡ１７はｐＵｃ１９にクローニングされた 。 ｌ５Ａ１８　オリゴヌクレオチドは、アダプター２の助けによってｐ）ＩＳＡＩ ７中にクローニングされた。 ｌ５ＡＩＶ　大きなフラグメントは予めクローニングしたＨＳＡ　（１３−１８ ）および）ＩＳＡ　（１７−１８）　ＤＮＡセグメントから得られた。 ＨＳＡＩのｐＵｃ１９中へのクローニングアダプター１　（ＨＳＡ　１＋Ａ□） と結合したＨＳＡ１オリゴヌクレオチドを、前記のクローニング法によってＢａ ｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＵＣ１９中にクローニングすることを試みたと きには、完全なＨＳＡＩ領域はクローニングされた形態では得られなかった。 ５′−３２Ｐ−標識したＨＳＡＩオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する約 ５０のクローンの配列を特定化すると、これらのクローンのほとんどはＨＳＡＩ の５′−末端Ｔ残基を欠いていた（それらの残りのものは２個以上の残基を欠い ていた）。 次に、新規な方法を用いて、下記のようにクローニングした全ＨＳＡ１を得た。 Ｐｓ　ｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＵｃ１９をクローニングベクターとして 用い、５′−末端にＰｓｔｌ粘看末端とその３′−末端に１０ヌクレオチドの長 さの５′−突出領域とを有する（この後者の領域がＨＳＡ１の５′−末端領域に 相補的である）部分二重らせんは反応混合物に含まれた。この「ヘルパー二重ら せん」を、スキーム１１に示す。 ０．１．１のＰｓ　ｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＵｃ１９ベクターを、ｌｈ ｌの反応容積でＨＳＡ　１＋Ａ１５ｐｍｏｌと５′−ホスホリル化ＧＴＧＣＧＡ ＴＣを５　ｐｍｏｌと５′−ホスホリル化したＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＧ ＣＡＣＴＧＣＡを５　ｐｍｏｌと混合し、全クローニング法を一般的方法に記載 した本質的に通りに行った。 １００個のコロニーを、プローブとしてのｓ′　３２ｐ−標識したＨＳＡＩオリ ゴヌクレオチドでハイブリツド形成させることによってチェックした。２９個の 陽性クローンの内１０個を、ｐＫＯプライマー■およびリノく一スプライマーに よって配列決定に用いた。１０個の内８個のクローンが正確な配列を有していた 。適正なりローンの一つのプラスミドＤＮＡを次の段階でｐＨ５Ａ１として、Ａ ｐａｌ−Ｅｃ−ｏＲに重消化およびｌ５Ａ２オリゴヌクレオチドのクローニング に用いた。 ｌ５Ａ２のｐＨ５Ａｌ中へのクローニング０．１　ｕｌのＡｐａｌ−ＥｃｏＲｌ で開裂したｐ）ｉｓＡｌを１０ｕｌの反応容積で５　ｐｍｏｌのＩＳＡ　２＋Ａ １と混合して、クローニング工程を前記と同様に行った（スキーム１２）。 ４０コロニーをレプリカプレートして、プローブとしての５’　−３２Ｐ−Ｈ８ Ａ２オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成した。９個の陽性コロニーが得られ 、これからプラスミドＤＮＡを調製し、これをｐＫｏプライマーＩを用いて配列 を特定した。５個のクローンは正確なＨＳＡ２配列を含んでいた。正確なりロー ン［ｐＨ５Ａ　（１−２）］の一つからのプラスミドＤＮＡを次の工程で用いて 、ＨＳＡ３オリゴヌクレオチドをクローニングした。 Ｈ８Ａ３のｐＨ５Ａ　（１−２）中へのクローニング０．１　ｕｌのＡｐａｌ− ＥＣＯＫＩで關裟し７：　ｐ　ｆｌ　５　ＡＨＳＡ４のｐＵｃ１９へのクローニ ング０．１４１］のＸｂａｌ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＵｃ１９と５　ｐｍｏｌ のＨ３Ａ４＋Ａ］を、前記と同様にｌ０Ｌ１１の反応容積で反応させた（スキー ム１４）。 １１０コロニーを選出し、その４５個が５′−３２Ｐ−ＩＳＡ４オリゴヌクレオ チドプローブとハイブリッド形成した。４個の陽性クローンから、プラスミドＤ ＮＡを調製し、これをｐＫｏプライマー１を用いて配列を特定化したところ、そ れらは総て予想したフランキング領域と共に正確なＨＳＡ４配列を含むことが判 った。このようにして得られたｐＨ８Ａ４はＩ（ＳＡ４の５′−末端に再生した Ｘｂａ１部位を含み、これは後でＨ８Ａ３とＨ５Ａ４オリゴヌクレオチドとの結 合点で除去することができた。 ｐＨ５Ａ４を用いて、次の工程でＨ５Ａ５をクローニングした。 ｘｘｃＡｃｍ−ｘｘｃＡ／＾Ｍｈ＋、、−＋−ｈ−０．１ｕｌのＡｐａｌ−Ｅｃ ｏＲＩで開裂したｐＨ５Ａ４ＨＳＡ６のｐＨ５Ａ　（４−５）へのクローニング ０．１ｕｌのＡｐａ　Ｉ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＨ８Ａ（４−５）と５　ｐｏ ｏｌのＨ８Ａ６＋Ａ１を、一般的方法にしたがって反応させた（スキーム１８） 。 ＝３２ ２２５個のコロニーを複製し、５’　Ｐ−）ＩＳＡ６オリゴヌクレオチドブロー ブとハイブリッド形成したところ、７２個が陽性であり、この１０個を用いて、 プラスミドＤＮＡを調製した。それらの１０の（ｐＫｏプライマー１を用いて） 配列を特定したところ、内の２個は、正確なＨＳＡ６配列を含み、これらのプラ スミドの一つをｐＨ５Ａ　（４−６）と命名した。 ｐＨ５Ａ　（４−６）を用いて、更゛にＨＳＡ　（４−６）ＤＮＡセグメントを 得て、これをｐＩＳＡ　（１−３）にクローニングして、ｐＨ８Ａ　（１−６） 即ちｐＨ５Ａ１１を得た。 ＨＳＡ７のｐＵｃ１９へのクローニング０．１ｕｌのＸｂａｌ−ＥｃｏＲｌで開 裂したｐυＣユ９フラグメントと結合させることができるようにした。このエキ ストラ配列は、関連の反応を行った後には消失するので、この配列はスキーム１ ７に示されるように、ｐＨ５Ａ７に既にクローニングされたときにはＨＳＡ７の 一部としては含まれていない。 ＨＳＡ８のｐＨ５Ａ７へのクローニング０．１ｕｌのＡｐａ　Ｉ−ＥｃｏＲＩで 開裂したｐＨ３Ａ７ＨＳＡ９のｐＨ９Ａ　（７−８）へのクローニング０．１　 ｕｌのＡｐａ　Ｉ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＨ５Ａ（７−８）と５　ｐｏｏｌの ＨＳＡ９＋Ａ１を、一般的方法にしたがって反応させた（スキーム１９）。 ２４０個のコロニーをレプリカブレーティングし、５′−３２Ｐ−ＨＳＡ９オリ ゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成した。１３個の陽性クローンの８個 から、プラスミドＤＮＡを調製し配列を特定した。８個の配列したクローンの内 の３個は、正確なＨ５Ａ　（７−９）プラスミドを含んでいた。 Ｈ５ＡＩＯのｐＩＳＡ　（７−９）へのクローニングに ０、ＩＩＪｌのＡｐａ　１−ＥｃｏＲＩ：開裂したｐＨ５Ａ（７−９）と５　ｐ ｌＩｏｌのＨ８Ａ１０＋Ａ１を、通常の方法で反応させた（スキーム２０）。 Ｈ５Ａ１１のｐＨ５Ａ　（７−１１））へのクローニング０．１　ｕｌのＡｐａ ｌ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＨ５Ａ反応させた（スキーム２１）。 １６０個のコシニーをレプリカブレーティングし、その内の９個が５’　−”２ Ｐ−ＨＳＡＩＩオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成したところ、陽 性であった。 この陽性クローンを用いて調製したプラスミドを、ｐＫＯプライマー■を用いて 配列特定した。一つのクロ、。 −ンは予想した配列を含んでおり、このクローンから調製したプラスミドＤＮＡ を次の工程でｐＨ５Ａ　（７−１１）として用いた。 ＨＳＡ１２のｐＨ５Ａ　（７−１１）へのクローニング弄 べ ０．１　ｕｌのＡｐａｌ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＨ３ＡＨＳＡ１３のｐＵｃ１ ９へのクローニング０．１　ｕｌのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＵｃ１ ９と５　ｐｏｏｌのＨ３Ａｌ３＋Ａ１を、一般的方法によって反応させた（スキ ーム２３）。 ８０個のクローンを５’　−３２Ｐ−ＩＳＡ１３１０−ブとのハイブリッド形成 によって試験したところ、その内の１４個が陽性であった。１０個の陽性クロー ンからプラスミドＤＮＡを調製し、ｐＫｏプライマー１を用いて配列を特定した 。これらの６個は、予想された。ｌ５ＡＩ３プラスミドと同一であった。 ＨＳＡ７と同様に、ＨＳＡ１３オリゴヌクレオチドは、ｌ５ＡＩＶの大型フラグ メント中の最初のものであるので、エキストラＧＧＴＡＣ５’　−末端配列を含 む。この場合には、Ｋｐｎ１部位も形成され、これを用いて更にＨＳＡ　ＩＩＩ とＨＳＡＩＶの大型フラグメントを結合して、このエキストラ配列が結合点で除 去されるようにすることができる。 ｐＨ５ＡｌＢを用いて、次の工程でＨＳＡ１４をクローニングした。 Ｈ８Ａｌ４のｐＨ５Ａ１３へのクローニングに ０．１１１のＡｐａｌ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＨ５Ａ１３を、５　ｐｌＩｏｌ のＨ８Ａｌ４＋Ａ１と一般的方法によって反応させた（スキーム２４）。 ＨＳＡｌ５のｐＨ５Ａ　（１３−１４）へのクローニング一般的な方法でＡｐａ 　Ｉ−ＥｃｏＲＩ開裂したｐＨ５Ａ　（＋３−１４）中へのＨ３Ａ１５＋Ａ１の クローニングを試みたとき、多数の５’　−３２Ｐ−ＨＳＡｌ５とＩ＼イブリッ ド形成するコロニーが得られたが、それらのプラスミドの配列を特定したところ 、予想したＨＳＡ１５配列は見られなかった。その代わりに、二重に変異したＨ ＳＡｌ５であって、Ｇ−＞Ｔ突然変異がヌクレオチド位置１０７２および１０９ Ｇ　（成熟Ｈ５Ａ遺伝子配列におけるヌクレオチド位Ｗ）で起こったものが得ら れた。これらのＧ残基は、Ｔ残基によって取り囲まれていた。これらの見掛けの 変異は、単に、プラスミドＤＮＡ１型を用いると時々起こるあいまいなゲルの読 みに因るものであるという可能性は、対象とする領域をＭ１３ｍｐ１９ファージ ベクターに再クローニングしたところ除外された。これらの２つの突然変異は、 （１９種類のことなる陽性クローンを試験した）総ての場合に同時に起こったの で、この場合には一般的クローニング法を変更しなければならず、ＨＳＡｌ５の 突然変異の部位をカバーする相補的オリゴヌクレオチドを用いるようにした。 ４２−ａｅｒの相補的オリゴヌクレオチドを調製して、５′−ホスフェ　）ＨＳ Ａｌ５とアダプター１との連結混合物中に含めた。５０　ｐｏｏｌの５’　−” ２Ｐ−ＨＳＡｌ５を１００　ｐａ＋ｏｌの５′−ホスフェート４２−ｍｅｒ　、 １００　ｐｍｏｌの５′−ホスフェートアダプター１の上方鎖及び１００　ｐｍ ｏｌノ５′　−ヒドロキシルアダプター１の下方鎮オリゴヌクレオチドと混合し た。前記と同様にして、ゲル電気泳動を行った後、部分二重らせんを、ＨＳＡｌ ５に対して約３０％の収率で単離した。この部分二重らせんを、スキーム２５で Ｈ８Ａ１５＋Ｃ＋Ａ１と命名した。 次に、０．１　ＭｌのＡｐａｌ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐ　ＨＳ　Ａ　（１３− １４）を、５ｐＩＩＩＯ１のＨ３Ａ１５＋Ｃ＋Ａ１と反応させ、反応は一般的方 法によって行った。３４０個のクローンを５’　−３２Ｐ−Ｈ５Ａ１５プローブ によって試験し、１７個の陽性クローンの内の１２個を用いて、プラスミドＤＮ Ａを調製した。それらの配列を特定すると（ｐＫＯプライマー１）、それらの２ 個が予想されたＨＳＡ１５配列を含んでいた。この配列は、こうして得られたＩ ＳＡ　（１３−１５）領域をＭ１３ｍｐ１９ファージベクター中に再クローニン グし、一本鎖ＤＮＡ鋳型上で配列反応を行うことによって、確認された。 適正なプラスミドの一つを、次の工程でｐＨ５Ａ（１３−１５）として用いた。 ＨＳＡｌ［ｉのｐ　ＨＳ　Ａ　（１３−１５）へのクローニングｌ５Ａ１Ｂ＋Ａ １をＡｐａｌ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＨ５Ａ　（１３−１５）へクローニング したとき、１６個の配列を特定した陽性クローンは総てＨ３Ａ１６領域の５′　 −末端に９塩基対の欠失を有していた。Ｈ５ＡｌＢ配列を再検討したところ、そ の５′−末端領域とアダプター１の下流鎖の５′−末端領域とは、はぼ完全に相 補的であった。 この相補領域を欠＜Ａｐａ　Ｉ−ＥｃｏＲＩアダプター（アダプター２、スキー ム２を参照）を用いることを計画した。ＨＳＡオリゴヌクレオチドを、アダプタ ー１と全く同じ方法でアダプター２と連結した。 ０．１　＋＋１のＡｐａ　Ｉ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐ　ＨＳ　Ａ　（１３−１ ５）を、５　ｐｍｏｌのＨＳＡＩＢ＋Ａ２と一般的方法によって反応させた。６ ０個のクローンの内の２４個は、５’　−３２Ｐ−Ｈ８Ａ１Ｂプローブとのハイ ブリツド形成を行ったところ、陽性であった。１０個の陽性クローンを用いて、 プラスミドＤＮＡを調製し、それらをｐＫ。 プライマー■で配列特定したところ、それらの２個が予想されたｐ　ＨＳ　Ａ　 （１３−１６）であった。 ｐ　ＨＳ　Ａ　（１３−１ｆｉ）を用いて、更にＩＳＡ　（１３−１６）ＤＮＡ 領域を調製し、これをｐＨ５Ａ　（１７−１８）にクローニングしテｐＨ５Ａ　 （１３−１８）　、すなわちｐＨ５ＡＩＶを得た。 井 Ｋ Ｈ８Ａ１７のｐＵｃ１９へのクローニング０．１　、ｉのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ Ｉで開裂したｐＵｃ１９を、同様な方法で５　ｐｍｏｌのＨＳＡ１７＋Ａ２と反 応させた（スキーム２７）。 １６０個のコロニーを５’　−３２Ｐ−Ｈ５Ａ１７とハイブリッド形成すること によって試験した。それらの３０個が陽性であり、この８個を用いて、プラスミ ドを調製した。 配列データーによれば、２個のクローンが予想したｐＨ５Ａ１７ブラスミドを含 んでいた（ｐＫｏプライマーＩ）。 ＩＳＡｌｇのｐＨ３Ａ１７へのクローニングを、５ｐｗｏｌのＨ５ＡｌＢ＋Ａ２ と反応させた（スキーム２８）。 Ｋ ＨＳＡ１９のｐＵｃ１９へのクローニング０．１　ｕｌのＸｂａ　Ｉ−ＥｃｏＲ Ｉで開裂したｐＵｃ１９を、一般的方法にしたがって５　ｐｍｏｌのＨＳＡ１９ ＋Ａ１と反応させた（スキーム２９）。 形質転換したＪＭＩＯＩ大腸菌細胞をｐＨ３Ａ７について記載したようにＸ−ｇ ａｌおよびＩＰＴＧの存在下にてＬＤ−アンピシリンプレートに接種した。無作 為に採取した６個の白色コロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ｐｒｏプライ マーｌを用いて配列特定した。それらの２個は、正確なｐＨ５Ａ１９であった。 ＨＳＡ１９は、Ｈ３Ａ７およびＨ３Ａ１３と同様に、その５′−末端にエキスト ラＧＧＴＡＣ配列を含む。この配列は、上記のように、Ｈ８Ａ　Ｖの大型フラグ メントとＨ５ＡＩＶとの結合を容易にする（後記を参照）。 Ｈ５Ａ２０のｐＨ５Ａ１９へのクローニング０．１　ｔＪｌのＡｐａｌ−Ｅｃｏ ＲＩで開裂したｐＨｓＡ１９Ｈ８Ａ２１のｐ　ＨＳ　Ａ　（１９−２０）へのク ローニング０．Ｉ　ＬｌｌのＡｐａｌ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＨ５Ａ（１９− ２０）と５　ｐｍｏｌのＨＳＡ２１＋Ａ１とを、通常の方法で反応させた（スキ ーム３１）。 ２４０個のクローンを５’　−３２Ｐ−Ｈ５Ａ２１プローブとハイブリッド形成 したところ、３３個が陽性であった。６個の陽性のクローンを用いてプラスミド ＤＮＡを調製し、ｐＫＯプライマー！を用いて配列を特定したところ、３種類の クローンは予測されたｐＨ５Ａ　（１９−２１）プラスミドを含んでいた。 ＨＳＡ２２のｐ　ＨＳ　Ａ　（１９−２１）へのクローニング０．１，１のＡｐ ａｌ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＨ５Ａ（１９−２１）と５　ｐｍｏｌのＨＳＡ２ ２＋Ａ１とを、通常の方法で反応させた（スキーム３２）。 、−３２ ８０個のクローンを５　Ｐ−ＨＳＡ２１プローブでハイブリッド形成について試 験したところ、１０個が陽性であった。これらから調製したプラスミドＤＮＡを 、ｐＫｏプライマー！を用いて配列特定したところ、ＩＦＪ類のみが正確であっ た。これをｐ　Ｉ　Ｓ　Ａ　（１９−２２）と命名する。 特表千３−５０１３２３　（３０） Ｈ５Ａ２３のｐＨ５Ａ　（１９−２２）へのクローニング０．１　ｕｌのＡｐａ ｌ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＨ５Ａ（１９−２２）と５ｐ口。１のＨ５Ａ２３＋ Ａ１とを、通常の方法で反応させた（スキーム３３）。 １６０個のクローンを試験したところ、それらの１００個が５’　−３２Ｐ−Ｉ ＳＡ２３プローブとハイブリッド形成を示した。プラスミドＤＮＡを６個の陽性 クローンから調製し、それらをｐＫｏプライマーｌを用いて配列特定した。それ らの３種類が、適正な環境中で正確なＨＳＡ２３配列を含んでいた。それらの１ 個を次の工程においてｐ　ＨＳ　Ａ　（１９−２３）として用いた。 ｉｃｅ　ＡＱＪ／Ｔｈｗ’Ｅｊｅ　Ａ　／ＩＱ　ＱＯ）　八／ｈ／７　轡　−” −ｈ’０．１　ｔｔｌのＡｐａｌ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＨ５Ａ（１９−２３ ）を５　ｐｏｏｌのＨＳＡ２４＋Ａ１と通常の方法で反ＩＳＡの大型フラグメン トの結合 Ｈ５Ａ遺伝子は５個の大型フラグメント（ＩＳＡ　Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ　、ＩＶお よび■）から組立てる計画であったが、現在までのところＨＳＡ　１１Ｉおよび ＨＳＡ　Ｖの合成しか報告されていなかった。′ＨＳＡ　ＩはＩＳＡの柔軟な５ ′−末端領域であり、これは比較的短いＰｓｔｌ−８ａｕ３Ａ１セグメントとし て化学的に合成された（スキーム４参照）、ＨＳＡＩＩとＨ８ＡＩＶは２種類の ＤＮＡセグメントから得られ、すなわちＩＳＡ　１１またはＨＳＡ　（１−６） は）ＩＳＡ　（１−３）およびＨＳＡ（４−６）から得うレ、一方Ｉ（ＳＡＩＶ またはＨＳＡ（１Ｂ−１８）はＨＳＡ　（１３−１６）およ゛びＨＳＡ　（１７ −１８）から得られた。ＨＳＡ　１１　とＨ５ＡＩＶの大型フラグメントをアセ ンブリする際には、制限消化の後にムング・ビーン・ヌクレアーゼ処理またはク レノウボリメラーゼ＋ｄＮＴＰ処理のような反応系を用いた。ｐＨ５Ａ　ＩＩお よびｐＨ５ＡＩＶを得るためのこれらの反応条件は詳細に記載されており、ＩＳ Ａの大型フラグメントで処理するときの同様な反応のみを説明する。 ムングビーンヌクレアーゼおよびクレノウポリメラーゼ＋ｄＮＴＰ処理を用いて 、制限酵素開裂の後に得られる５′−または３′−懸垂一本鎖ＤＮＡ領域を除去 して平滑末端を生成した。ムングビーンヌクレアーゼは５′−突出末端を除去し 、クレノウポリメラーゼ＋ｄＮＴＰ処理では３′−突出末端を除去する。後者の 処理では、同時に５′−突出末端を塞ぎ、平滑末端を生成する。 ｐＨ５Ａ　ＩＩ ｐＨ５Ａ　ＩＩとしてｐＵＣ１９でクローニングされたＨＳＡＩ＋大型フラグメ ントは、ＨＳＡ　（１−３）とＨＳＡ　（４−６）ＤＮＡセグメントから得られ 、ｐＨ５Ａ　（１−３）はＨＳＡ　（４−６）をクローニングするベクターとし て用いられた。 １１Ｊ１のｐＨ５Ａ　（４−６）を、１００　ａＭＮ　ａ　Ｃ１，５０ｍＭ）リ ス−ＨＣｌ％ｐＨ７，５，１０ａＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２．１ｖｎＭＤＴＴを含む ５０μｍの反応容積（高濃度塩緩衝液Ｉ液）中で、１０単位のＸｂａＩで３７℃ で１時間処理した。こうして得られる線形ベクターＤＮＡをエタノール沈澱させ 、乾燥し、５０ＩＪ１のムングビーンヌクレアーゼ緩衝液（３０ｍＭ酢酸ナトリ ウム、ｐＨ５，０，１００ａＭＮ　ａ　Ｃ１。 ２ｍＭＺｎＣｌ２．１０％グリセロール、０．５　ｍｇ／　ｍＩ変性ウシ胸腺Ｄ ＮＡ）中に溶解し、ＩＩＪｌのＩＯＵ／ｕｌムングビーンヌクレアーゼで３７℃ で３０分間処理した。反応混合物をフェノール抽出し、次いでＤＮＡをエタノー ルで沈澱させた。ペレットを５０μｌの高濃度塩緩衝液（Ｘｂａｌ処理に就いて の前記記載を参照）に溶解し、２０単位のＥｃｏＲＩを反応混合物に加えて、３ ７℃で１時間保持した。エタノール沈澱を行った後、小型のＨＳＡ　（４−６） フラグメントを２％アガロースゲル（ＴＡＥ緩衝液中）上で電気泳動によって単 離した後、電気溶出およびエタノール沈澱を行った。このフラグメントは５′− 末端に平滑末端を有し、３′−末端にＥｃｏＲＩ粘着末端を有する（スキーム８ ５）。 １−のＩ）ＨＳＡ　（１−３）を、ＥｌｍＭＮａＣｌ、６ｍ１ＤＴＴを含む５０ ｕ１の低濃度塩緩衝液に溶解し、ｌＯ単位のＡｐａｌで３７℃で１時間処理した 。エタノール沈澱の後、ペレットを、７ｍＭ）リス−ＩＣ１，ｐＨ７，５，７ｍ ＭＭ　ｇ　ＣＩ　２．５　ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．１　ｍＭＥＤＴ Ａおよび０．１　ｒａｉｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐを含む５０−のフレノウ（ｋ　ｌ　ｅｎ ｏν）緩衝液に溶解して、０．５−の５Ｌｌ／μｌクレノウボリメラーゼで室温 で１０分間処理した。フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、ペレットを５ ０ｕｌの高濃度塩緩衝液に溶解し、ｌＯ単位のＥｃｏＲｌを加えた。反応混合物 を３７℃で２時間保持した後、ＤＮＡをエタノール沈澱した。平滑末端とＥｃｏ Ｒ１末端を有する大型ベクターフラグメントを、ＴＡＥ緩衝液中０．５％アガロ ースゲル上で電気泳動の後、電気溶出およびエタノール沈澱によって単離した（ スキーム３５）。 開裂したｐＨ８Ａ　（１−３）ベクター（０，１ｕｌ）を、５０ｓＭ）リス−Ｈ Ｃ１，ｐＨ７，５，１０μｌＭＭｇＣ１２，１０ｓＭＤＴＴおよび１ｓＮＡＴＰ を含む反応容積（リガーゼ緩衝液）１０μｍ中で、ＨＳＡ　（４−６）フラグメ ント（約０．０３ｕｌ）と連結し、８０単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを１５℃で １２時間を要して加えた。反応混合物を凍結コンピーテントＪＭユＤユ細胞に形 質転換した後、ＬＢ−アンピシリンプレートに接種した。１１０個のレプリカプ レートの内、５５個が５’　−Ｐ−ＨＳＡ４オリゴヌクレオチドプローブとハイ ブリッド形成を示した。プラスミドＤＮＡを１０個の陽性クローンから調製し、 これを逆プライマーを用いて配列特定した。これらの２種類はＨＳＡ３およびＨ ３Ａ４オリゴヌクレオチドの結合部で予測された配列を示し、これは更にｐＨ３ Ａ　（１−６）またはｐＨ８Ａ　ＩＩとして用いた（スキーム３５）。 （ＨＳＡ　ＩＩの配列は、これをＰｓ　ｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩで開裂したＭ　１３ 　ｍ　ｐ　１　ｇおよびｍｐ１９ファージベクター中にサブクローニングして確 かめ、配列反応は一本鎖ＤＮＡ鋳型上で行った。） 高濃度塩緩衝液に溶解して、２０単位のＰｓｔｌを３７℃でｌ５ＡＩＶの大型フ ラグメントは、予めクローニングしたＨＳＡ　（１３−１８）およびＨＳＡ　（ １７−１８）　ＤＮＡセグメントから、ｐＨ８Ａ　（１７−１８）ベクターを用 いてＨＳＡ　（１３−１６）をクローニングするようにしたものから得た（スキ ーム３６）。 ｌν】のｐＩＳＡ　（１３−１８）を、５０１１１の低濃度塩緩衝液中で２０単 位のＡｐａｌで、３７℃で１時間処理した。 ＤＮＡをエタノール沈澱し、０．１　ｍａｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐを含む５ｈｌのフレノ ウ緩衝液に溶解し、２．５単位のクレノウボリメラーゼで室温で１０分間処理し た。反応混合物をフェノール抽出し、エタノール沈澱を行い、ペレットを２０単 位のＰｓｔｌを含む５０＋Ｊｌの高濃度塩緩衝液中に８７℃で１時間溶解した。 エタノール沈澱の後、小型のフラグメントを、２％アガロースゲル上で電気泳動 の後、電気溶出によって単離した。この方法では、平滑末端とＰｓｔｌ粘着末端 を有するＨＳＡ　（１ｇ−ＩＳ）ＤＮＡセグメントを生成した（スキーム３Ｂ） 。 Ｉ　ＩＪｌのｐ　ＨＳ　Ａ　（１７−１８）を、高濃度塩緩衝液を含む５ｈＩ反 応容積中で、３７℃で１時間、ｌＯ単位のＢａｍＨｌで開裂した。ＤＮＡをエタ ノール沈澱させ、５０ＩＪ１のムングビーンヌクレアーゼ緩衝液に溶解した後、 １０単位のムングビーンヌクレアーゼを３７℃で３０分間加えた。フェノール抽 出およびエタノール沈澱の後、ベレットを５０μｍの１時間加えた。大型の線形 ベクターフラグメントをエタノール沈澱し、０．５％アガロースゲル（ＴＡＥ緩 衝液）上で電気泳動を行った後、電気溶出により精製した。この反応系では、平 滑末端とＰｓｔｌ粘着末端を有するｐＨ３Ａ　（１７−１８）ベクターを生成し た（スキーム３Ｂ）。 開裂したｐＩ（ＳＡ　（１７−１２１）ベクター（０，１ν１）を、８０単位の Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含む１０μｌのリガーゼ緩衝液中でＨＳＡ　（１３−１６ ）　（約０．０ｈＩ）と１５℃で１２時間連結した。次いで、混合物を凍結コン ピテントＪＭＩＯＩ細胞に形質転換して、ＬＢ−アンピシリンプレートに接種し た。２３０個のコロニーを、５’　Ｐ−Ｈ８Ａ１Ｂプローブとハイブリッド形成 することによって試験したところ、８６種類が陽性であった。プラスミドＤＮＡ を１０個のクローンから調製し、ｐＫＯプライマーｌを用いて配列特定した。５ 個のプラスミドＤＮＡは、）ｌｓＡｌ［ｉおよびＨ５Ａ１７オリゴヌクレオチド 領域の間に正確な結合部を示し、これらを更にｐ　ＨＳ　Ａ　（１３−１８）ま たはｐＨ５ＡＩＶとして用いた（スキーム３Ｂ）。 （ＨＳＡＩＶの配列は、これを７フ一ジベクターＭ１３ｍｐ１８およびｍｐ１９ にサブクローニングして確かめた。配列反応は一本５ｊｉＤＮＡｎ型上で行った 。）ｐＨ５Ａ　（ＩＩ−Ｉｌｌ　） この場合には、ｐＨ５Ａ　ＩＩＩはＨＳＡ　Ｉｌ！フラグメントをクローニング するベクターとして用いた（スキーム３７）。 ＩＳＡ　ＩＩ＋ＩＩグメントの調製 ５ＩＪｌのｐＨ５Ａ　Ｉｌｌを、１００μｌの低濃度塩緩衝液中で４０単位のＫ ｐｎｌで３７℃で３時間処理した。開裂したベクターをエタノール沈澱させ、ペ レットを０．１　ｍＭｄＮＴＰと２．５単位のフレノウポリメラーゼを含む５０ １Ｊ１のフレノウ緩衝液に溶解し、混合物を室温で１０分間処理した。フェノー ル抽出およびエタノール沈澱の後、ペレットを５ｈｌの高濃度塩緩衝液に溶解し 、４０単位のＥｃｏＲＩを加え、混合物を３７℃で２時間保持した。ＤＮＡをエ タノール沈澱した後、ＨＳＡ　ＩＩ＋ＩＩグメントをＴＡＥ緩衝液中２％アガロ ースゲル上で電気泳動した後電気溶出によフて単離した。大型のフラグメントを 含むＨＳＡ　Ｉｌｌは、平滑末端とＥｃｏＲＩ粘着末端を有する（スキーム３７ ）。 ｐＨ５Ａ　Ｈベクター開裂 １　ｕｌのｐＩＳＡ　ＩＩを５ｏｕｌの低濃度塩緩衝液中で、１０単位のＡｐａ ｌで３７℃で２時間処理した。エタノール沈澱の後、ペレットを０．１　ｍａｄ 　Ｎ　Ｔ　Ｐを含む５０ＩＪ１のフレノウ緩衝液に溶解し、２．５単位のフレノ ウポリメラーゼで室温で１０分間処理した。混合物をフェノール抽出し、ＤＮＡ をエタノール沈澱した後、ペレットを高濃度塩緩衝液５ｈ２に溶解した後、２０ 単位のＥｃｏＲｌを加えた。 反応混合物を３７℃で２時間保持し、ＤＮＡをエタノール沈澱した。大型のベク ターフラグメントを、ＴＡＥ緩衝液中０．５％アガロースゲル上で電気泳動した 後電気溶出によって単離した。こうした得られた線形ベクターは、平滑末端とＥ ｃｏＲＩ粘着末端を有する（スキーム３７）。 連結 ０．２　ｕｌの開裂したｐＨ５Ａ　！＋ベクターを、ｆｏｕｌのりガーゼ緩衝液 中で、０．１　ｕｌのＨＳＡＩＩ＋フラグメントと混合して、８０単位の７４Ｄ ＮＡリガーゼを加えた。反応混合物を、１５℃で１４時間保持した後、ＪＭＩＯ Ｉ大腸菌細胞中に形質転換した。約５０％のアンピシリン耐性コロニーは、５’ 　Ｐ−ＩＳＡ　Ｉ＋オリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成した。８個 の陽性コロニーから調製したプラスミドＤＮＡをＨＳＡオリゴヌクレオチドの一 部（成熟Ｈ５Ａ遺伝子のヌクレオチド位置５０ｇ−５２７の間）と相補的な合成 プライマーを用いて配列特定すると、８個の総てがＨＳＡ　ＩＩとＨＳＡ　Ｉｌ ｌの大型のフラグメントの結合点で適正な配列を示した。 ｐＨ５Ａ　（ＩＶ−４”） この場合には、ｐＨ５Ａ　ＶはＨＳＡＩＶフラグメントをクローニングするベク ターとして作用した（スキーム３８）。 ＨＳＡＩＶフラグメントの調製 ２μｍのｐＩＳＡ　ＩＶを、５０μｍの低濃度塩緩衝液中で１０単位のＡｐａｌ で３７℃で２時間処理した。線形ベクターをエタノール沈澱させ、ペレットを０ ．１　Ｉｎｄｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐを含む５０．１のフレノウ緩衝液に溶解し、２．５ 単位のフレノウポリメラーゼを加えて、混合物を室温で１０分間処理した。 フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、ペレットを５０μｍの高濃度塩緩衝 液に溶解し、４０単位のＰｓｔｌを加え、混合物を３７℃で２時間保持した。エ タノール沈澱の後、）ｉｓＡＩＶ配列を含む小さなフラグメントをＴＡＥ緩衝液 中２％アガロースゲル上で電気泳動した後電気溶出によって精製した。小型のフ ラグメントは、Ｐｓｔｌ粘着末端と平滑末端を有する（スキーム３８）。 ｐＨ５Ａ　Ｖベクター開裂 ２μｍのｐＨ８Ａ　Ｖを５０μｌの低濃度塩緩衝液中で、１０単位のＫｐｎＩで ３７℃で４時間処理した。エタノール沈澱の後、ペレットを０．１　ｍａｄ　Ｎ 　Ｔ　Ｐと２．５単位のフレノウポリメラーゼを含む５０ＩＪｌのフレノウ緩衝 液に溶解し、室温で１０分間保持した。フェノール抽出し、エタノール沈澱した 後、ペレットを高濃度塩緩衝液５０ＩＩｌに溶解し、４゜単位のＰｓｔｌを加え た。混合物を３７℃で４時間保持した。エタノール沈澱した後、線形ベクターを 、ＴＡＥ中０．５％アガロースゲル上で電気泳動した後電気溶出によって精製し た。こうした得られた開裂したｐＨ５Ａ　Ｖベクターは、Ｐｓｔｌ粘着末端とプ ラントエンドををする（スキーム３８）。 連結 約０．１μｍの線形のｐＨ５Ａ　Ｖベクターと、０．０５＋＋］のＨＳＡＩＶを 含むフラグメントを、１０μｍのリガーゼ緩衝液中で８０単位のＴ４ＤＮＡリガ ーゼで１５℃で４時間処理した。ＪＭ１０１大腸菌細胞中に形質転換した後、ア ンピシリン耐性コロニーを、５’　Ｐ−ＩＳＡｌＢオリゴヌクレオチドプローブ で試験したところ、それらの約４０％が陽性であった。８個のコロニーを用いて プラスミドＤＮＡを調製し、これらをＨ５Ａ１９オリゴヌクレオチドの一部（成 熟ＨＳＡ遺伝子のヌクレオチド位置５０８−５２７の間）と相補的な合成プライ マーを用いて配列特定し、それらの７個がＨＳＡＩＶとＨＳＡ　Ｖの間の結合点 で正確な配列を有していた。 Ａｐａ　ｌ−５ａｃ　Ｉ−ＥｃｏＲＩアダプターを有する前記ノヨうにして得た ｐＨ５Ａ　（ＩＶ−Ｖ）は、ＨＳＡコード領域の下流にアダプター１を含む。Ｉ ＳＡ遺伝子の大腸菌−酵母シャトルベクターの大腸菌部分（ｐＰＴ２ＨＫ１）へ のクローニングには、下流の５ａｃ１部位を必要とし、したがってこの部位をど うにかして導入しなければならない。これを遺伝子のアセンブリの段階で導入す るのが有利であると思われる。 ５ａｃ１部位を導入する極めて明白な方法は、内部５ａｃ１部位を有する同様な アダプター（アダプター３、スキーム３）でＡｐａ　Ｉ−ＥｃｏＲＩアダプター １を置換することと思われる。 ＩＳＡ　（ＩＶ−Ｖ）領域は、ｐＨ８Ａ　（ＩＶ　Ｖ）　からＰｓｔＩ−Ａｐａ Ｉフラグメントとして単離され、アダプター３　（Ａｐａ　ｌ−５ａｃ　Ｉ−Ｅ ｃｏＲＩアダプター）と共にＰｓ　ｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＵｃ１９に クローニングされた。 ＨＳＡ　（ＩＶ−Ｖ）フラグメントの単離２　ｕｌのｐＨ５Ａ　（ＩＶ−Ｖ）を 、５０ｕ１の低濃度塩緩衝液中で２０単位のＡｐａｌで、３７℃で３時間処理し た。エタノール沈澱の後、ペレットを５０μｌの高濃度塩緩衝液に溶解して、２ ０単位のＰｓｔＩを加えた。反応混合物を３７℃で４時間保持した。ＨＳＡ　（ ＩＶ−■）フラグメントを、ＴＡＥ緩衝液中２％アガロースゲル上でゲル電気泳 動の後電気溶出によって精製した。 連結（スキーム３９） ０．１　ｕｌのＰｓ　ｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩで開裂したｐＵｃ１９を、２ｈｌのリ ガーゼ緩衝液中で、０．０５ｕｌのＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ　ＨＳＡ　（ＩＶ−Ｖ ）フラグメントおよびレオチドと混合した。８０単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを 加え、混合物を１５℃で１４時間保持した。形質転換の後、アンピシリン耐性コ ロニーを、５’　−３２Ｐ−ＨＳＡｌ［ｉオリゴヌクレオチドブローブまたは５ ’　Ｐ−アダプター３下方鎮オリゴヌクレオチドプローブを有する２種類の異な るレプリカプレート上でスクリーニングした。 約５０％のコロニーが、両方のプローブとハイブリッド形成を示した。陽性コロ ニーを用いてプラスミドＤＮＡを調製し、逆プライマーおよびｐＫＯプライマー ｌによって配列特定を行った。配列決定によってチェックした１０個のクローン の総ては、正確であった。 下記において、アダプター３を導入することによって下流の５ａｃ１部位が供給 されるこのｐＨ８Ａ　（ＩＶ−Ｖ）を、次のＨＳＡ遺伝子のアセンブリの工程に 用いる。 ｐＨ５Ａ　（ＩＩ−Ｖ） メントをＴＡＥ緩衝液中０．５％アガロースゲル上で電気この場合には、ｐＨ５ Ａ　（１１−ＩＩＩ　）は、ＨＳＡ（ＩＶ−Ｖ）フラグメントをクローニングす るためのベクターとして用いた（スキーム４０）。 ｐＨ８Ａ　（ＩＩ−ＩＩＩ　）ベクター開裂２μｌのｐＨ５Ａ　（ＩＩ−ＩＩＩ 　）を、低濃度塩緩衝液中で、４０単位のＡｐａｌで、３７℃で５時間処理した 。エタノール沈澱の後、ペレットを０．１　ｍａｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐを含む５ｈｌの フレノウ緩衝液に溶解し、２．５単位のフレノウポリメラーゼを加えた。混合物 を室温で１０分間保持した後、フェノール抽出およびエタノール沈澱を行った。 ペレットを、５ｈｌの高濃度塩緩衝液に溶解して、２０単位のＥｃｏＲＩを加え た。混合物を３７℃で５時間保持した後、線形ベクターを、ＴＡＥ緩衝液中０． ５％アガロースゲル上で電気泳動した後電気溶出によって単離した。 ＩＳＡ　（ＴＶ−Ｖ）フラグメントの単離２１ＪＩ（７）　ｐ　ＨＳ　Ａ　（Ｉ Ｖ　−Ｖ）を５０Ｉ１１（７）低濃度塩緩衝液に溶解して、２０単位のＫｐｎｌ で３７℃で５時間処理した。 エタノール沈澱の後、ペレットを０．１　’ｗｅｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐと２６５単位の フレノウポリメラーゼを含むフレノウ緩衝液に溶解した。混合物を室温で１０分 間保持した後、ＤＮＡをエタノール沈澱させ、５０μｌの高濃度塩緩衝液に溶解 し、２０単位のＥｃｏＲＩを加えた。反応混合物を３７℃で５時間保持した後、 ＨＳＡ　（ＩＶ−Ｖ）領域を含む小さなフラグ泳動した後電気溶出によって単離 した。 連結 約０．１　ｕｌの線形化したｐＨ５Ａ　（ＩＩ−ＩＩＩ　＞ベクターと０．０５ １ＪｌのＨＳＡ　（ＩＶ−Ｖ）を含むフラグメントを、８０単位のＴ４　ＤＮＡ リガーゼを含むｌｈｌのりガーゼ緩衝液に混合して、混合物を１５℃で７時間保 持した。 ３Ｍ１０１大腸菌細胞中に形質転換した後、アンピシリン耐性コロニーを５’　 −３２Ｐ−ＨＳＡ２１オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成により 試験したところ、コロニーの約４０％は陽性であった。８個のコロニーを用いて プラスミドＤＮＡを調製し、これらを配列決定プライマーとして５’　−３２Ｐ −Ｈ３ＡＩＩオリゴヌクレオチドを用いて配列特定した。８個のコロニーは総て 、ＩＳＡ　ＩＩＩとＩ（ＳＡＩＶ領域の間に適正な結合点を有していた。 ｐＨ５Ａ　（Ｉｔ−Ｖ）　の領域を含む全ＩＳＡ　（ＩＩ−Ｖ）を、プラスミド 鋳型上で配列することによってチェックしたところ（ｐＫｏプライマー１および ＨＳＡＩ−８プライマーを用いた）、過誤は見られなかった。 ｐＨ５Ａベクター（Ｎｏ、　ｌ　％　Ｎｏ−２）ＨＳＡ　（１１−Ｖ）　フラグ ）　ントとＩＨｓＡ　１７ラグメントを、ｐＵｃ１９ベクター中でクローニング することによって、ＩＳＡ　（ＩＩ−ｖ）フラグメントを１（ＳＡ　Ｉフラグメ ントに補足させた（スキーム４１）。 ＨＳＡ　（ＩＩ−Ｖ）は、遺伝子中に独特な５ａｕ３Ａ１部位があるので、５ａ ｕ３ＡＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして直接単離することができた。しかしな がら、ｐＵｃ１９ベクタ一部分は、多くの５ａｕ３Ａ１部位を含み、制限消化と フラグメント分離が複雑になる。第一に、ＨＳＡ　（ＩＩ−Ｖ）は、Ｈｉｎｄ　 ＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ７ラグメント中に単離され、これはＳ’ａｕ３Ａ１処理によ り更に短くなった。 ５．１ノＨＳＡ　（ＩＩ−Ｖ）をＩＣｌ０ＬＩＩ（７）高濃度塩緩衝液中で、４ ０単位のＨｉｎｄｌｌｌ　と４０単位のＥｃｏＲＩとで３７℃で３時間処理した 。混合物を０．５％アガロースゲル（ＴＡＥ緩衝液）に適用し、電気泳動の後、 ２種類のフラグメントを得た。小さな方のフラグメントを電気溶出して、エタノ ール沈澱した。ペレットを５０ν】の高濃度塩緩衝液に溶解して、７．５単位の ５ａｕ３ＡＩで３７℃で１４時間処理した。反応混合物をフェノール抽出（２ｘ ）およびエタノール沈澱を行ったが、大きなＳ　ａ　ｕ　３Ａ　Ｉ　−ＥｃｏＲ １フラグメントはこの場合にはゲル電気泳動によっては精製されなかった。 ２種類の別個な連結物を用意した。それぞれＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＩ開裂したｐＵ ｃ１９クローニングベクターと５ａｕ３ＡＩ−ＥｃｏＲＩ　ＨＳＡ　（ＩＩ−Ｖ ）フラグメントと、（Ｐｓ　ｔ　ｌ−５ａｕ３Ａｌアダプターを形成する２種類 のオリゴヌクレオチドの混合物としての）２種類のＨＳＡ　Ｉフラグメントの一 方を含んでいた。 ０．２　ｕｌのＰｓ　ｔ　Ｉ−ＥｃｏＲｌで開裂したｐＵｃ１９と、０．１ｕｌ の５ａｕ３Ａ１−ＥｃｏＲＩ　ＨＳＡ　（ｌｌ−■）フラグメントを、１０μｍ のリガーゼ緩衝液を含む２種類の別個な反応混合物中で、５−５　ｐｍｏｌの５ ′−ホスホリル化Ｈ３ＡＩＮｏ、ｌまたはＨＳＡ　Ｉ　Ｎｏ、２（スキーム４） と混合した。８０単位の７４　ＤＮＡリガーゼを両方の反応混合物に加えて、１ ５℃で６時間保持した後、３Ｍ１０１大腸菌細胞中に形質転換した。形質転換し た混合物を、ＬＢ−アンピシリンプレートに接種した。コロニーを２個のニトロ セルロースフィルター上で二重複製し、これらは５’　Ｐ−Ｈ５Ａ５オリゴヌク レオチドプローブ（第一のフィルター）および対応する５′−３２Ｐ−ＨＳＡＩ オリゴヌクレオチドプローブ（第二のフィルター）と、ハイブリッド形成した。 これらのコロニーの約８０％は、両方の場合に両方のプローブとハイブリッド形 成した。プラスミドＤＮＡを２種類の構成の４−４クローンから調製し、これら を逆プライマーを用いて配列特定して、Ｈ６Ａｌ変種が適正にｐＩＳＡベクター 中に挿入されていることをチェックした。総ての配列した構成は、正確であった 。 ｐＨ３ＡＮｏ、１とＮｏ、　２からの全ＨＳＡコード領域は、Ｐｓ　ｔ　Ｉ−Ｅ ｃｏＲＩフラグメントとしてＭｌ：３ｍｐ１８およびｍｐ１９ファージベクター にサブクローニングされ、全配列をｍｐ１９では１７−ｏｅｒプライマーおよび １（ＳＡ１−９プライマーを用いてチェックした。ｍｐ１８構成は％１７−ｍａ ｒプライマーのみでチェックした。 スキーム　４１ 酵母プロモーターおよびターミネータ−配列を有する大腸菌プラスミドの構成 １、出発クローニングベクター（ｐＧＢｌ、第１図）は、ｐＢＲ３２７ブラスミ ド（ソベロン、エックス（Ｓｏｂｅｒｏｎ、　Ｘ、）　、コバルヒアス、エル（ Ｃｏｖａｒｒｕｂｌａｓ、　Ｌ、）およびポリバー、エフ（Ｂｏｌｉｖａｒ、　 Ｆ、）　（１９８０）　Ｇｅｎｅ　９゜２８７−３０５　）であって、ＡｐＲ領 域からのＰｓｔｌとＨｉｎｄｌ１部位はＥＭＳおよびＩ（Ａ突然変異誘発および 反復制限酵素消化により除去されたる改良によって得られた。突然変異誘発の条 件は、ミラー、ジエイ・エイチ（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｊ、Ｈ，）、分子遺伝学の実 験（Ｅｘｐｅｒｉ−ｗｅｎｔ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｅｎｅｔｔｃｓ、　 ：Ｉ−ルド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ）　ｓコールド・スプリング・ハーバ− （Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ）、二ニー・ヨークに記載の条件と 同じであった。 ＸｈｏＩ部位は、独特な（充填）Ａｖａ１部位で挿入されたＣＣＴＣＧＡＧＧリ ンカ−として導入された。 ２８　プラスミドｐＧＢ２　（ＨＩＳ３）：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅ ｒｅｖｉｓｉａｅの全クローニングＨＩＳ３遺伝子を含む１Ｂ２７　ｂｐのＢａ ｍＨｌ−Ｘｈｏ１７ラグメント［ストーニス、アール・ケイ（ＳｔｏｒｒＡｓ、 　Ｒ，に、）、マツクネイル、ジェイ・ビー（ＭｅＮｅｉｌ、　Ｊ、Ｂ、）、カ ンデカ−、イーａニス（Ｋｈａｎｄｅｋａｒ、　Ｐ、Ｓ、）　、アン、ジー（Ａ ｎ、　Ｇ、）、バーカー、ジェイ（Ｐａｒｋｅｒ、Ｊ、）およびフリーセン、ジ エイ・ディー（Ｆｒｉｅｓｅｎ、　Ｊ、Ｄ、）　（１９７９）　Ｊ、　Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌ、。 １４０、７３−８２　、およびストルール、ケイ（Ｓｔｒｕｈｌ、　Ｌ）（１９ ８５）　Ｎｅｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３．８５８７−８６０１ １は、ｐＹＦ９２　（ストーニス（Ｓｔｏｒｍｓ）ら、同上）（ゲオルギー・ビ ー・キス（Ｇｙｏｒｇｙ　Ｂ、Ｋ１５ｓ）　、インステイテニート・オブ・ゲネ ティックス、バイオロジカル・リサーチ・センター・オブ・ザ・ハンガリアン争 アカデミー壷オブ・サイエンシズ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｒ　Ｇｅｎｔｉｅｓ 、　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｈ ｕｎｇａｒｉａｎ　ＡｃａｄｅＩＩＩｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ）スツェージド 、ハンガジーから入手）から切除して、ｐＢＧｌの独特なりａｍＨＩおよびＸｈ ｏ１部位に挿入されて、ｐＧＢ２　（ＨＩＳ３）を生じた（第２図）。 酵母Ｈｉ　ｓ３遺伝子の転写ターミネータ−領域を含むプラスミドｐＧＢ３−２ ２９Ｔ　： ｐＧＢ２　（ＨＩＳ３）の）：ｃｏＲｌ−Ｋｐｎｌフラグメントは、プラスミド ｐＪＲＤ　１５８（デイビソン、ジエイ（Ｄａｖｌｓｏｎ、　Ｊ、）　、ホイス タースブルーテ、エム（Ｈｅｕｓｔｅｒｓｐｒｕｔｅ、　Ｍ、）　、メルチエラ 壽エム（Ｍｅｒｃｈｅｚ、　Ｍ、）およびプルネル、イー（Ｂｒｕｎｅｌ、　Ｅ 、）　Ｇｅｎｅ　２Ｌ　３１１−３１８　）［ジョン・ディビソン（Ｊｏｈｎ　 Ｄａｖｌｓｏｎ）　（ユニット・オブ争モレキニラー・バイオロジー、インター ナショナル・インスティチュート・オブ・セルシーラー・アンド・モレキニラー 拳パソロジ−（Ｕｎｉｔ　ｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ。 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｒ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　 ａｎｄ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰａｔｈｏｌｏｇｙ）、７５、アヴｘ　ニニ−・ヒ ポクラート、Ｂ−１２００、ブリニラセル、ベルギー）から入手〕からの１８２ ７１）ｐＴＣＲカートリッジで置換した。ｐＧＢ３−２２９Ｔは、Ａｐ＋ｏ　ｒ 　ｉカートリッジの外に、（３′−末端に追加の５ａｃ１部位を有する）全ＴＣ Ｒ遺伝子とＨＩＳ３遺伝子の転写ターミネータ−領域を有する。ｐＧＢ−２２９ Ｔは更に、（１）ｐＧＢ−２２９７のＫｐｎ１部位を欠失してｐＧＢ３−２２９ ＴＫ”を生成すること（第３ｂ図）および（２）ｐＵｃｌｇ　／６２２ＰＨ（第 ５図）からＨｉｎｄｌｌｌ−８ａｌｌプロモーターフラグメントを挿入すること によってｐＰ７２ＨＫ１（第３Ｃ図）を生成することによっても改良された。 ４、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＨ０５遺伝子のプ ロモーター領域のクローニング ＰＨ０５遺伝子は、抑制酸性ホスファターゼ細胞外酵素（正リン酸−モノエステ ルホスファヒドラーゼ（酸性が最適）　、ＥＣ３，１，３，２，）をコードする 。これは、８　ｋｂのＥｃｏＲＩゲノムＤＮＡフラグメントの一部である（クラ マー、アール・エイ（Ｅｒａｓｅｒ、　Ｒ，Ａ、）、アンプルセン、エフ（Ａｎ ｄｅｒｓｅｎ、　Ｎ、）　（１９８０）　Ｐｒｏｅ、　Ｎａ１ｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７７、６５４１−８５４５７およびロジャー ズ、ディー・ティー（Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｄ、Ｔ、）、レミレ、ジェイ、エム（Ｌ ｅａｌｒｅ、　Ｊ、Ｍ、）およびボスティアン、ケイ・エイ（Ｂｏｓｔｉａｎ、 Ｋ、Ａ、）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９゜２１ ５７−２１［ｉｌ）。 ＰＨ０５遺伝子（ディビソン（Ｄａｖｊｓｏｎ）ら、同上）を有するプラスミド を得るため、酵母遺伝子バンク（Ｓ。 ｃｅｒｅν１ｓｉａｅのゲノムＤＮＡから構成されるニスミドライブラリー、ゼ ット・フエーハー（Ｚ、　Ｐｅｈｅｒ）・デブレセン医材大学、デブレセン、ハ ンガジーから入手）を次のようにスクリーニングした。すなわち、組換えニスミ ドＤＮＡの混合物をＥｃｏＲＩで消化した。アガロースゲルから８　ｋｂのＥｃ ｏＲＩフラグメントが単離され、これをプラスミドｐＧＢ２　（ＨＩＳ３）のＥ ｃｏＲ１部位で再クローニングした。次に、ＰＨ０５−遺伝子含有プラスミド（ ｐＧＢ２　（ＨＩ　Ｓ　３、ＰＨ０５、ＰＨ０３）（第４図）を、酵母の株ＤＢ −４（Ｃ７ジヤーズ（Ｒｏｇｅｒｓ）ら、同上）およびＡＨ２２０（ａ、ｔ　ｒ ｐ　１．１ｅｕ２−３．２−１１２、ｈｉｓ３−１１．３−１５、ｐｈａ５、ｐ ｈａ３）（エイ・ヒンネン（Ａ、　１ｉｎｎｅｎ）、チバーガイギ−（ＣＩ　Ｂ Ａ−ＧＥ　Ｉ　ＧＹ）、バーゼルによって提供；タイト−カムラド、エイ・ジー （Ｔａ１ｔ−Ｋａｍｒａｄｔ、　Ａ、Ｇ、）ターナ−、ケイ・ジェイ（Ｔｕｒｎ ｅｒ、　ＬＪ、）クラマ、アール・エイ（Ｋｒａｍｅｒ、　Ｒ，Ａ、）、エリオ ツド、キニー・ディー（Ｅｌｌｉｏｔｔ、　Ｑ、Ｄ、）ボスティアン、ニス・ジ ニイ（Ｂｏｓｔｉａｎ。 Ｓ、Ｊ、）ティール、ジー・ビー（Ｔｈ目１．　Ｇ、Ｐ、）ロジャーズ、ディー −ティー（Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｄ、Ｔ、）およびボスティアン、ケイ（Ｂｏｓｔｊ ａｎ、　Ｋ、）Ｍｏｌｅｃ、　ａｎｄ　Ｃｅ１１．　Ｂ！ｏｆ、、　６．１８５ ５−１８６５参照）におけるｐｈａ５の相補性に基づいて選択した。 ５、　ＰＨ０５遺伝子プロモーター領域のサブクローニング 抑制酸性ホスファターゼ遺伝子（ＰＨ０５）のプロモーターを、ＢａｍＨＩ＋Ｓ ａ　ｌ　Ｉ制限酵素消化によッテブラスミドｐＧＢ２　（ＨＩＳ３、ＰＨ０５、 ＰＨ０３）から６２３　ｂｐのフラグメントとして切除することができる（メイ ハツク、ビー（）Ｉｅｙｈａｃｋ、　Ｂ、）　、バジュワ、ダブリニ（Ｂａｊｖ ａ、　Ｗ、）ルドルフ、エイチ（Ｒｕｄｏｌｐｈ、　）１．）およびヒンネン、 エイ（Ｈｌｎｎｅｎ、　Ａ、）　（１９８２）　ＥＭＢＯＪ、　１．８７５−ｅ ｇｏ　＞　、後者をＢａｍＨＩ−８ａ　ｌ　１部位でｐＵｃ１８に再クローニン グし、プラスミドｐＵｃ１８／６２３Ｐを生成し、挿入物の配列は配列特定を行 うことによって確かめ、公表された文献記載の配列と比較した（メイハック（Ｍ ｅｙｈａｃｋ）ら、同上；及びアリマ、ケイ（Ａｒｊｍａ、に、）オーシマ、テ ィー　（Ｏｓｈｊｍａ、　Ｔ、）、クボタ、アイ（Ｋｕｂｏｔａ。 Ｉ）ナカムラ、エフ（Ｎａｋａｍｕｒａ、　Ｎ、）、ミズナガ、ティー（Ｍｉｚ ｕｎａｇａ、　Ｔ、）およびトーエ、エイ（Ｔｏｈ−ｅ、　Ａ、）　（１９８３ ）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１．１１ｉ５７−１６７２）。 ｐＵｃ１８／６２３ＰプラスミドのＢａｍＨｌ−Ｓ　ａ　ｌ　Ｉ　（Ｃ３ｂｐ） は、ＰＨ０５上流活性化配列とコード配列の一部（Ｎ−末端１７アミノ酸分泌シ グナルペプチドおよび成熟遺伝子生成物のＮ−末端から更に１０個のアミノ酸を コードする）を含む。 ＰＨ０５遺伝子の分泌シグナルコード領域の一次構造：Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ 　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　ＳＣｒ　ｌ　Ｉｅ　Ｌｅｕ↑７°−Ｅ−？ 　−ＡＴＧ　ｍ　ＡＡＡ　ＴＣＴ　ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＴＡＴ　ＴＣＡ　ＡＴＴ　 ＴｒＡＢａｍＨＩ　Ｄｒａｌ Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｉａ　Ｇｌｙ　ＴｈｒＧ ＣＣＧＣＴ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　ＣＣＣＡＡＴ　ＧＣＡ　Ｃｍ　ＡＣＣシグナル末 端 この構造では、「シグナル末端」コドンＡｌａから下流に位置するＫｐｎ１部位 は、５′　一方向に１塩基だけシフトすると、クローニング部位（Ｋｐｎｌおよ び３′−突出配列をトリミングすることによって平滑末端とされたもの）として 、Ｃ３Ａコード遺伝子に用いることができた。 ｐＵｃ１８／６２３Ｐでは、上流のＫｐｎ１部位（ｘ　ｓ第５ａ図）がプラスミ ドから欠失されていなければ、前記のＫｐｎ１部位は処理することができなかっ た。それ故、プラスミドはＳａｃ　ＩとＢａｒｎＨｌで開裂した後、５ａｃｌ末 端から突出３′−末端ヌクレオチドを除去することによって平滑末端を作成し、 ＢａｍＨ１末端にＤＮＡポリメラーゼｌクレノウフラグメントとヌクレオチドト リホスフェートを付した（第５図、工程１）。再連結および形質転換により、プ ラスミドｐＵｃ１８　／６２３Ｐ　（第５ｂ図）を生じ、ＢａｍＨＩ部位が復帰 し、「シグナル末端」コドンから下流のＫｐｎ　１部位は特異になり、更に処理 および生体外での突然変異誘発に好適となった（下記を参照）。 ６、「シグナル末端」部位の生体外突然変異誘発：Ｋｐｎ１部位の１塩基シフト による「シグナル末端」コドン（Ａｌａ）と「同位相（ｉ　ｎ−ｐｈａ　ｓ　ｅ ）　Ｊの接合部位を作成。 ＨＳＡ遺伝子の５′−平滑末端を正確な位相でＰＨ０５シグナルコ一ド配列と連 結することができるようにするには、Ｋｐｎ１部位は１塩基だけ５′一方向にシ フトさせねばならない。Ｋｐｎ１部位の上流のアデノシン残基（Ａ）が欠失して も、シグナル配列内でコードされるアミノ酸の性状には何んら変化がなかフた。 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒシグナル末端 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　ＶａｔＢａｌｌ　Ｋｐｎｌ 改良された配列をＫｐｎｌで開裂した後、突出ＧＴＡｃ−３’　ヌクレオチドを ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメント＋ｄＮＴＰで除去すると、ＫｐｎＩ 部位が「シグナル末端」コドン（ＧＣＧ）の位置と正確に一致する平滑末端を生 じる。前記の構造上の変化を達成するために、Ｂａ１ｌとＫｐｎ１部位との間に 配置された プラスミド　ｐＵｃ１８　／６２２Ｐを生成した。この置換は配列決定によって 確かめた（第５図、工程２）。 （ＰＨ０５プロモーターの上流の）ＥｃｏＲ１部位を更にクローニングするため に、Ｈｉｎｄｌｌ！リンカ−（ＣＡＡＧＣＴＴＧ）を補充したＥｃｏＲ１部位を 挿入することによって、新規なり１ｎｄｌｌＩ部位で置換した（第５図、工程３ ）。この新たな構成はｐＵｃ１８”／６２２ＰＨと呼ばれた（第５Ｃ図）。 ７、　酵母発現カセットを含むプラスミドｐＰＴ２ＨＫ１の構成ニ プラスミドｐＧＢ３−２２９７　（第３図）は、ＴＣＲ遺伝子の下流にＳａｃ　 Ｉ　（Ｓｓ　ｔ　１）とＫｐｎＩ部位を含む。ＰＨ０５プロモーター領域を（ｐ Ｕｃ１８　／６２２ＰＨの独特なＨｉｎ″ｄｌｌｌおよび５ａ１１部位に）挿入 することによって、ｐＧＢ３−２２９ＴのＫｐｎ１部位は余計なものになり、Ｋ ｐｎ１部位は、Ｋｐｎｌ消化によってｐＧＢ３−２２９Ｔから欠失し、フレノウ ポリメラーゼ＋ｄＮＴＰによって突出３′末端が除去され、平滑末端を再連結し 、形質転換した。新規なプラスミド（ｐＧＢ３−２２９ＴＫ”　）（第３図）（ ＫｐｎＩ部位を欠く）は、Ｈｉｎｄｌｌｌと５ａｉｌで開裂され、（改良された ＰＨ０５プロモーターおよびシグナル配列を含む）ｐＵｃ１８／６２２ＰＨのＨ ｉｎｄｌｌＩ−Ｓａｌｌフラグメントはクローニングされ、生体外で突然変異誘 発されたＰＨ０５プロモーターとシグナルコード領域およびＨＩＳ３遺伝子の転 写ターミネータ−から成る機能生酵母発現カセットを有するテトラサイクリン感 受性のプラスミドｐＰＴ２ＨＫ１（第３図および第６図）が生じる。 ８、　大腸菌−酵母シャトルベクタープラスミドｐＢＹ２００の構成 主な要点は、次の通りである。 「古典的な」大腸菌−８，ｃｅｒｃｖｉｓｉａｅのシャトルベクタープラスミド ｐＪＤＢ２０７　（ベッグス、ジエイ・ディー（Ｂｅｇｇｓ、　Ｊ、Ｄ、）　（ １９８１）多重コピー酵母プラスミドベタターズ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｃｏｐｙ 　ｙｅａｓｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒｓ）、フォン・ウェットシュタイ ン、ディー（Ｖｏｎ讐ｅＬＬｓｔｅ！ｎ。 Ｄ、）、フリイス、ジエイ（Ｐｒｉｉｓ＝　Ｊ、）　、キールランド−ブラット 、エム（Ｈｅｌｌａｎｄ−Ｂｒａｄｔ、　Ｍ、）およびステンデラップ、エイ（ Ｓｔｅｎｄｅｒｕｐ、　Ａ、）　（監修）、酵母の分子遺伝学（Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｉｎ　ｙｅａｓｔ）　％アルフレッド・ベンゾン・シ ンポジウム（Ａｌｆｒｅｄ　Ｂｅｎｚｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）　、第１Ｂ巻 、３８Ｂ−３９０）の有用な特性、すなわち、（１）他の多くの酵母クローニン グベクターと比較して大きさが比較的小さい、（２）酵母宿主細胞でのプラスミ ドの高コピー数の複製、（３）Ｌ、ＥＵ２の選択的マーカー遺伝子の存在による （ｌｅｕ２フェノタイプの）プラスミド含有酵母細胞の安定な選択と、これによ る（４）ｌｅｕＢ大腸菌宿主における直接選択の可能性を利用すること、および 酵母発現カセット（上記を参照）を有する大腸菌プラスミドｐＰ７２ＨＫ１およ びその組換え誘導体と調和する適当な制限酵素認識部位を含むこと。 プラスミドｐＢＹ２００は、２工程のクローニングによって構成される（第７図 ）： １、　ｒＬＥＵ２＋２μｏｒｉＪカートリッジ［ｐＪＤＢ２０７の部分ＥｃｏＲ Ｉ消化によって得られる３、４　ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメント（ベッグス（Ｂ ｅｇｇｓ）ら、同上）のｐＧＢｌのＥｃｏＲ１部位への挿入、２、　ｒ２μｏｒ ｉＪ領域でのＸｂａ１部位のＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントの充填（ の後平滑末端の再連結）。この改良は、Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅでのプラスミ ドの複製能には影響しない。 ｐＰＴ２ＨＫ　大腸菌ベクター中のＩＳＡ遺伝子（Ｎｏ。 １、Ｎｏ、２）のクローニング ｐＰＴ２ＨＫユ大腸菌ベクターは第３図および第６図に示してあり、その改良さ れた配列領域は前記の通りである。 ＩＳＡ遺伝子のクローニングの観点からのその主要な特徴は、これが酵母Ｐ）Ｉ Ｏ５ブロモ−クーおよびＰＨ０５シグナル配列並びに酵母転写ターミネータ−（ ＨＩｓ３）を含むことである。プロモーター−シグナル配列およびターミネータ −領域は独特の制限部位によって分離されて、Ｈ９Ａコード遺伝子セグメント（ 構造ＨＳＡ遺伝子）がこれらの２個の領域の間に挿入することができるようにな っている。 ｐＰ７２ＨＫ　ベクターでは、ＨＳＡ遺伝子を挿入すす るのに用いられる制限部位はＫ　ｐ　ｎ　ＩおよびＳａｃ１部位である。シグナ ル配列（リーダーペプチドコード領域）の末端のＫｐｎ１部位は、予めシフトさ せてあり、ＫｐｎＩ開裂と生成する３′−突出領域のトリミングの後に、平滑末 端が形成され、この平滑末端はリーダーペプチドコード領域の末端と正確に一致 する（スキーム４２）。Ｓａｃ　１部位はＨＩＳ３ターミネータ−領域の上流に 配置され、Ｓａｃ　Ｉ開裂はＫｐｎｌ開裂と平滑末端形成の後に行われる。 ２い１のｐＰＴ２ＨＫ１を、５ｈｌの低濃度塩緩衝液中で、２０単位のＫｐｎＩ で、３７℃で２時間処理した。エタノール沈澱の後、ベレットを０．１　ｍａｄ 　Ｎ　Ｔ　Ｐと２．５単位のフレノウポリメラーゼを含む５０μｌのフレノウ緩 衝液に溶解し、反応混合物を室温で１０分間保持した。反応混合物をフェノール 抽出し、エタノール沈澱を行った。ペレットを５０ｕｌの低濃度塩緩衝液に溶解 し、２０単位の５ａｃＩを加工た後、３７℃で５時間インキュベーションした。 エタノール沈澱した後、大きなベクターフラグメントをＴＡＥ緩衝液中０．５％ アガロースゲル上で電気泳動の後電気溶出を行って単離した。 ５０１Ｊｌの高濃度塩緩衝液に溶解した２　ｕｌのｐＨ５ＡＮｏ、１を、２０単 位のＰｓｔｌで３７℃、２時間処理した。 エタノール沈澱の後、ベレットを０．１　ｃｏｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐと２．５単位のフ レノウポリメラーゼを含む５０１．１１のフレノウ緩衝液に溶解し、反応混合物 を室温で１０分間保持した。反応混合物をフェノール抽出し、エタノール沈澱を 行った。 ペレットを５０μｌの低濃度塩緩衝液に溶解し、２０単位の３ａｃｌを加えた。 混合物を３７℃で５時間保持した後、０．５％アガロースゲル（ＴＡＥ緩衝液） 上に適用した。 小さなフラグメントを、電気泳動の後電気溶出を行って単離した。 ｐＨ３Ａ　Ｎｏ、２をｄａｍ　大腸ｍｎカラ再’Ｊ１離して、アデニンメチル化 に感受性のＢｃｌＩ酵素で処理することができるようにした。 ７５　ｍＭ　ＫＣＩ、６　ｍＭ）リス−ＭＣＩ、ｐＨ７，４，１０ｍＭ　ＭｇＣ １２および１ｍＭＤＴＴを含む５０μｍの緩衝液に溶解した２　ｌＪｌのｐＨ５ Ａ　Ｎｏ、２を、２０単位のＢａ１ｌで、５０℃、５時間処理した。エタノール 沈澱の後、ベレットを５ｈｌのムングビーンヌクレアーゼ緩衝液に溶解し、１０ 岸位のムングビーンヌクレアーゼを加え、３７℃で３０分間処理した。フェノー ル抽出し、エタノール沈澱を行った後、ペレットを５０＋＋］の低濃度塩緩衝液 に溶解し、２０単位の５ａｃｌを加えた。 混合物を３７℃で５時間保持した。ＨＳＡ　Ｎｏ、２を含む小さなフラグメント を、ＨＳＡ　Ｎｏ、１について記載したのと同様にして単離した。 車積 ０．１１１１の開裂したｐＰＴ２ＨＫ１と、０．２μｍのＨ５ＡＮｏ、１または ＩＳＡ　Ｎｏ、２フラグメントをｆｏｕｌのリガーゼ緩衝液に混合して、８０単 位のＴ４　ＤＮＡリガーゼを加えた。反応混合物を１５℃で１５時間保持した後 、これをＪＭ　１０１大腸菌細胞中に形質転換し、次いでＬＢ−アンピシリンプ レートに接種した。コロニーを、５’　−３２Ｐ−ＨＳＡ　５オリゴヌクレオチ ドプローブとハイブリッド形成することによって試験したところ、約１０％が陽 性であった。プラスミドＤＮＡを５−５組換体から調製し、ＨＳＡプライマー９ を用いて配列特定した。 ＰＩ（０５リーダー配列とＨ５Ａコード配列との適正な結合が、ＨＳＡ　Ｎｏ、 １について２例で得られ、Ｉ　Ｓ　ＡＮｏ、２では３例で得られた。これらのプ ラスミドを、それぞれｐＰＴ／Ｈ３Ａ　Ｎｏ、１およびｐＰＴ２／ＨＳＡ　Ｎｏ 、２と命名する。 これらの構成では、ＩＳＡ遺伝子を、酵母プロモーター＋シグナル配列と酵母転 写ターミネータ−との間の大腸菌プラスミド中でクローニングする。次の工程で 、このｒＨＳＡ発現カートリッジ」を大腸菌−酵母シャトルベクター中に移すこ とにする。 ｐＢＹ２００およびｐＪＤＢ　２０７中へのＨ８Ａ発現カートリッジのクローニ ング 酵母−大腸菌シャトルベクターｐＢＹ２００は、酵母および大Ｂ菌の複製源、Ａ ｐＲ領域およびＬｅｕ２７−カーを含む。このプラスミドは、Ｈｉｎｄｌｌｌと Ｘｈｏｌ酵素で開裂することにより生成する大型の７ラグメントが総ての上記の 領域を保持するようにすることができ、ベクターとして働いてＨｉｎｄｌｌｌと Ｘｈｏｌによる開裂によってｐＰＴ２／ＨＳＡから得られるＨＳＡ発現カートリ ッジをクローニングすることができる（第８図）。 ｐＢＹ２００開裂： ５　ｕｌのｐＢＹ　２００を、５０ｗＭＮａＣ１，１（１＋Ｍ　）リス−ＨＣ１ ，ｐＨ７，５，１０ｗＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２および２　ａＭＤＴＴを含む１００ ．１の緩衝液（培地緩衝液中に溶解し、４０単位のＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉと６０単 位のＸｈｏｌで、３７℃で６時間処理した。大きなフラグメントをＴＡＥ緩衝液 中０．５％アガロースゲル上でゲル電気泳動の後電気溶出によって単離した。 ｐＪＤＢ　２０７開裂： 同様に、酵母−大腸菌シャトルベクタープラスミドを、ＸｈｏＩの代わりに４５ 単位の５ａｉｌを用いたことを除いて、ｐＢＹ２００についての上記の条件下で ＨｉｎｄＩＩＩと５ａｌＩ制限酵素で開裂した。大きなベクターフラグメント（ 第８図）を電気泳動によって屯離し、アガロースゲルから電気溶出によって精製 した。 ｐＰＴ２／Ｈ９Ａ開裂： ５−のｐＰＴ２／ＨＳＡ　Ｎｏ、１またはｐＰＴ２／ＨＳＡ　Ｎｏ、２を、前記 と同様にして培地緩衝液中で、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　ＩおよびＸｈｏｌ酵素で処理し た。大きなフラグメントを、いずれの場合にも、０．５％アガロースゲル上で電 気泳動の後電気溶出を行って、単離した。 連結 ０．２．１のＸｈｏｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌで開裂したｐＢＹ２００を、それぞれ０ ．２ｕｌのｐＰＴ２／ＨＳＡ　Ｎｏ。 １のＸｈｏｌ−Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉフラグメントまたは０．２ｕｌのｐＰＴ２／ ＨＳＡ　Ｎｏ、２のＸｈｏｌ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントと、１０．１のりガ ーゼ緩衝液中で混合し、これらの混合物に８０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え て、１５℃で１５時間保持した。反応混合物を、凍結したコンピテント大腸菌細 胞（ＪＦ１７５４）中に形質転換した後、ＬＢ−アンピシリンプレート上に接種 した。同様な条件を用いて、ｐＰＴ２／Ｈ８Ａ　Ｎｏ、１のＸｈｏＩ−Ｈｉｎｄ ｌ　Ｉ　ＩフラグメントをＨｉ　ｎｄＩＩＩと５ａｌＩで開裂したｐＪＤＢ２０ ７に連結した。 ｐＢＹ２／ＨＳＡ　Ｎｏ、１とｐＢＹ２／ＨＳＡ　Ｎｏ。 ２ＦＡ換体の選択および分析 ＬＢ−アンピシリンプレート上で発育したコロニーを、（１）２０　ｕｌ／ｍｌ メチオニンおよび２０ｕｌ／ｍｌヒスチジンを含む（しかしロイシンを欠く）Ｍ ９最少プレート、（２）ＬＢ−テトラサイクリンプレート、および（３）アンピ シリン−ＬＢプレート上に置いたニトロセルロースフィルターに接種した。ニト ロセルロース上で生育したコロニーを溶解し、３２Ｐ−標識したＨＳＡ６オリゴ ヌクレオチドブローブとハイブリッド形成した。プレート２でテトラサイクリン 感受性であり、プレート１でｌｅｕ相補性を示す（すなわち、プレート２では生 育せず、プレート１で生育する）ｖＡ性コロニーを選択して、これらからプラス ミドＤＮＡを調製した（ＬＢ−アンピシリンプレートで得られた全コロニーの約 ２０％が、プレート（１）〜（３）について予測された表現型を示した）。組換 えプラスミドＤＮＡをＸｈｏｌとＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉとの混合物で開裂し、開裂 をＴＢＥ緩衝液中０．５％のアガロースゲル上で電気泳動によってチェックした 。この二重開裂により、ｐＢＹ２／Ｈ３Ａ　Ｎｏ、１とｐＢＹ２／Ｈ８ＡＮｏ、 ２は両方とも、それぞれ出発ｐＢＹ２００、ｐＰＴ２／Ｈ３Ａ　Ｎｏ、１および ｐＰＴ２／ＨＳＡＮｏ、２７ラグメントの大きさに対応する大きさを有する２種 類のフラグメントを生じた。同時に、ＫｐｎＩによる開裂では、両方とも線形化 したベクターを生じた。 ｐＹＨｓＡ２２１の構造をｇ整するため、組換えプラスミドをＸｂａｌで開裂す ると、物理マツプから予測される大きさを有する２種類のフラグメントを生じた （第８図）。 総てのプラスミドの構成とＩＳＡ造伝子を含む酵母発現ベクターへ至るクローニ ング工程は、第９図にまとめている。 組換え酵母細胞での合成）ＩＳＡ遺伝子の発現酵母細胞の形質転換およびＰＨ０ ５プロモーターの誘導のための培養条件 合成ＨＳＡ遺伝子を、酵母−大腸菌シャトルプラスミドｐＢＹ２／ＨＳＡ　Ｎｏ 、１およびｐＢＹ２／Ｈ８ＡＮｏ、２とｐＹＨ５Ａ２２１の構成へ導く上記に詳 細に記載した一連の操作において酵母ＰＨ０５プロモーターの調節下に置いた。 酵母細胞（ＬＬ２０；　Ｌｅｕ２−３．１１２、Ｈｉｓ３−１１．１５ニスドー ム（Ｓｔｏｒｍ）ら、同上）を、ベッグス、ジェイ・ディー（Ｂｅｇｇｓ、　Ｊ 、Ｄ、）（Ｎａｔｕｒｅ　２７５．１０４　（１９７８）またはイト−、エイチ （ｌｔｏ。 Ｈ，）ら（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、、　１５３．１６３　（１９８３）のス フェロプラスト−ＰＥＧ法によって形質転換した。 組換え酵母細胞を、そのＨｉｓ−１Ｌｅｕ＋表現型に基づいて選択して、前記の プラスミドをホルム（ｌｌｏｌｍ）らＣＧｅｎｅ、　１２．１６９　（１９８Ｂ ）の方法によって１０ｍ１の培養液から単離し、制限酵素開裂および１％アガロ ースゲル上で電気泳動によりその構造を分析することによって形質転換プラスミ ドの存在について試験した。それぞれの場合の組換え酵母細胞は、適当な大きさ と構造を有する形質転換発現ベクタープラスミドを含んでいた。これらの細胞を ２％のグルコースと０．１５％のＫＨ２ＰＯ４を含むＹＮＢ培地（ディフコ（Ｄ ｉｒｃｏ）　）中で、０Ｄ６ｏｏが２．０になるまで生育させ、採取し、（ＰＨ ０５プロモーターを活性化するための３０ａ＋ｇのＫＨ２ＰＯ４を含む）低すン 酸塩ＹＮＢ培地中で希釈し、６０時間再生育させた後、採取した（ＯＤ６ｏｏ約 ６ｏｏ）。次いで、細胞を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、１％トラ イトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ　−１００，０，１ｍＭフェニルメチル−７、／ｌ、 　＊　、：。 ルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む同じ緩衝液の１／１００容積中に再分散し、ガ ラスピーズ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）　、Ｉ　Ｖ型、２５０−３００　ミクロン） と共に混合することによって破壊した。或いは、細胞を洗浄し、ＩＨソルビトー ルに再分散し、β−グルクロニダーゼ（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ） 　；　１％溶液）と共に１００　ｍＭβ−メルカプトエタノール中で３０℃で、 プロブラストを生成し、これを次に１％トライトンＸ−１００で溶解した。細胞 抽出液を、１０，０００　ｒｐｃで１５分間遠心分離することによって透明にし て、いわゆる「ペリプラズム画分」を生じ、ＩＳＡを下記のような免疫および電 気泳動法によって検定した。 マイクロＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験 ＥＬＩＳＡプレートに、抗−ＨＳＡ−Ａｂ　（プロティンＡ−セファ０−ス４Ｂ カラム上でウマ血清から精製、ヒユーマン（）ＩＬＩＭＡＮ）製品、入ンガジー ）をコーティングし、０．５％ゼラチン（シグマ（Ｓｉｇｌｌａ）　）で宜包和 した。コーティングしたウェルに１００μｍの透明にした酵母細胞抽出液を適当 な希釈率で成層し、３７℃で１時間インキュベーションした。ＨＳＡ−抗−ＨＳ Ａ−Ａｂ結合を、ビオチン化したセイヨウワサビペルオキシダーゼ−ストレプト アビジン錯体、基質としてのＨ２Ｏ２および展開剤としてのオルト−フェニレン ジアミンを用いて、通常の呈色反応によって観察した。 ウェル当たり精製したＨＳＡ　（レアナル（Ｒｅａｎａｌ）、ハンガジー）　２ 　ｌＪ１〜１５ｕｌの範囲の連続希釈物を、較正のために用いた。１０００倍希 釈したヒト結成を陽性コントロールとして用い、ゼラチンコーティングしたウェ ル並びに非組換え酵母細胞（ＬＬ２０、ＩＳＡ検定用に加工）はマイクロ−ＥＬ Ｉ　ＳＡ試験におけるネガティブコントロールとして用いた。呈色反応は、ケン ブリッジ・ライフ・サイエンシズ・リミテド（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｌｉｆｅ　 ５ｃｉｅｎｃｅｓＬｉｄ、）　英国、のマイクロプレートリーダーで評価した。 ３５Ｓ−メチオニン−標識したタン白質の免疫沈澱組換え酵母細胞の全細胞タン 白質細胞を、１．　ｍ１当たり４０ＢｇＣ１の３５ｓ−メチオニンを含む「低メ チオニン、低すン酸塩ＪＹＮＢ培地中で３０℃で１６時間培養することによって 、組換え酵母細胞の全タン白質を３５８−メチオニンで標識した。 ２０μ】のウマ抗−Ｈ５Ａ血清を、透明にした細胞溶解物（０，５ｍ１）の１０ ８個の細胞数のものに加え、０，１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ８，０中で４℃で９０ 分間処理した。免疫沈澱物を１ｍｌプロティンＡ−セファ０−ス（ファルマシア （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に４℃で９０分間吸着させ、洗浄した。免疫沈澱した タン白質をプロティンＡ−セファ０−スビーズ（コナー、ジー・イー（Ｃｏｎｎ ｅｒ、Ｇ、Ｅ、）ら、Ｊ、　Ｅｘｐ。 Ｍｅｄ、１５Ｂ、　１４７５．１９８２）　）から溶出させ、１５％５ＤＳ−ポ リアクリルアミドゲル上で分割し、フルオログラフィを行った。３５ｓ−メチオ ニン標識した非組換えＬＬ２０細胞から得られる透明な抽出液とＢ型肝炎表面抗 原（ＨＢｓＡｇ）を発現する絹換え酵母株の抽出液をコントロールとして用いた 。 結果 プラスミドｐＢＹ２／ＨＳＡ　Ｎｏ、１およびｐＹＨ３Ａ２２１で形質転換した 酵母細胞は、Ｈ３Ａタン白質を活発に産生じ、これはＥＬＩＳＡによって容易に 検出され、またＨＳＡに対する特異抗血清で沈澱することができた。 マイクロＥＬＩＳＡ試験によれば、ＨＳＡの比率は全細胞タン白質の３〜８％で あった。 第１Ｏ図は、ペリプラズム画分から得られヤギ抗Ｈ５Ａ血清で免疫沈澱し、５Ｄ Ｓ−ポリアクリルアミドゲル中で分割した３５Ｓ−メチオニン標識タン白質のフ ルオログラフを示す。 トラックＮ１は、１４Ｃ−タン白質分子量マーカー混合物（ＢＲＬ）でありニド ラックＡは、抗−ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ抗体で沈澱した組換え３５Ｓ−ＨＢｓＡｇで あり；トラックＢは、抗１（ＳＡ血清で沈澱した組換え酵母中に産生される標ｍ Ｈ５Ａであり；トラックＣおよびＤは、それぞれ抗ＨＳＡ血清とＨＢｓＡｇ含有 酵母溶解物との交差免疫反応の欠除および抗ＨＢｓＡｇ血清とＨ３Ａ溶解物との 交差免疫反応の欠除を示している。 免疫沈澱したＨＳＡの電気泳動の易動度は、Ｂ７ｋｄの標識タン白質マーカーの 易動度とほぼ同じであった。この結果はＰＨ０５遺伝子の全シグナルペプチドを 含む発現ベクターの構成によってペリプラズム空間に分泌されるＨ３Ａタン白質 の大半は正確に加工されて、成熟（天然の）ＩＳＡの大きさを有するタン白質生 成物を生じることを示している。 ２種類の独立したイムノブロッティング（ウェスタンブロッティング）の実験で は、同じ分子′ｆｉｆｆｉのタン白質であることを示していた。 酵母培養液からの発現したＨＳＡの実験室規模での精製ｐＢＹ２／Ｈ５Ａまたは ｐＹＨｓＡ２２１で形質転換した酵母細胞の５００　ｍｌ培養液を、０．１５％ （重量／容積）ＫＨ２Ｐ０２２０ｍｇ／リットルし一ヒスチジン、および２％（ 重量／容積）グルコースを含む０．６７％ＹＮＢ培地（ディフコ＜ＤＩＦＣＯ） 　）中で、３０℃で０Ｄ６ｏｏ−２，０まで（通常は２４〜４８時間）生育させ た。細胞を２０００ｘｇで５分間遠心分離することによって集め、ＫＨ２ＰＯ４ を３０ａｇ／リットル、０．１％（重量／容積）　ＫＣｌ、　２０ｍｇ／リット ルのＬ−ヒスチジンおよび２％（重量／容積）のグルコースを含む０．６７％（ 重量／容積）ＹＮＢ培地ｌＯリットルに再分散した。培養液の生育を８０時間（ ＯＤ　６ｏ。 −１，８〜２．０　）行った後、細胞を遠心分Ｍ　（４０００ｘｇ、　５分間） によって集め、水冷蒸留水で２回洗浄し、２００　ｍｌの０．１％のトライトン （Ｔｒｌｔｏｎ）Ｘ　−１００，０，５ＭのＮａＣ１，２０１ＯＮ　トリス−Ｈ Ｃ１，ｐＨ７，５，１００吐β−メルカプトエタノールおよびｌａＭＰＭｓＦに 再分散した。細胞を、予備冷却したガラスピーズ細胞ホモジナイザー（ブラウン （Ｂｒｕｎ）Ｍ　Ｓ　Ｋモデル）中で６０秒間ホモジナイズした。細胞抽出液を 、高速遠心分離（２００００ｘｇ　。 ４℃、３０分間）によって透明にした。透明にした溶解液のｐＨを（ＩＭＨｃＩ を滴下して加えることによって）４．０〜５６０に調整し、次いで、硫酸アンモ ニウムの飽和溶液を加えて最終濃度を飽和時の６０％とした。混合物を氷水浴で ２時間撹拌した後、ツルパル（Ｓｏｒｖａｌｌ）　ＲＣ−５０遠心分離機で１８ ０００　ｒｐａ＋　（２℃）で３０分間遠心分離した。ペレットを１００　ｍｌ の５０　ｍＭとスートリス緩衝液、ｐＨ８，５に溶解した後、同じ緩衝液２０容 積に対して一晩透析した。透析した溶解液を遠心分離（１８０００ｒｐｍ　、　 ２℃）を３０分間行い、透明な上澄液を同じ緩衝液で平衡にしたスーペロース（ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　ＭＯＮＯＱ　ＨＲ５１５ＦＰＬＣカラム（ファルマシア（ Ｐｈａｒｓａｃｌａ）　）に適用した。 アニオン交換クロマトグラフィおよび総ての連続的クロマトグラフィ精製工程は 、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｅｉａ）ＦＰＬＣカラム上で行った。 短時間のＮａＣ１線形グラディエンド（０，０〜０．１　Ｍ　＞の後、０．１Ｍ ＮａＣ１（インクラチック溶出）で溶出するタン白質を集め、０．０５　ＭＮ　 ａ−リン酸塩緩衝液、ｐＨ７，５に対して透析した。この両分を、アルキルース ーベロース（Ａｌｋｙｌ−８ｕｐｅｒｏｓｅ）　ＨＲ５／　５カラム上で一水亘 相互作用クロマトグラフイに付した。 固形の硫酸アンモニウムを上記の透析した画分に加え、最終濃度を２．０Ｍに調 整し、試料を５０１１Ｍ　Ｎ　ａ−リン酸塩緩衝液中２Ｍ　（ＮＨ４）２Ｓ０４ で平衡にしたアルキルースーペロース（Ａｌｋｙｌ−９ｕｐｅｒｏｓｅ）　ＨＲ ５／　５カラムに加えた。結合タン白質は、（ＮＨ４）２Ｓ０４の線形降下濃度 グラディエンドで溶出した。ＨＳＡ含有画分は、約１．２Ｍ　（ＮＨ４）２Ｓ０ ４で溶出し、これは溶出画分の５ＤＳ−ＰＡＧＥで観察した。 ゲル濾過 前記の工程からのｒＨ８ＡＪ画分をアミコン（＾ｔｉｅｏｎ）撹拌セル（フィル ター：ＰＭ−３０）中で限外濾過によって濃縮した後、０．１５　ＭＮ　ａ　Ｃ １を含む５０　ｍＭ　Ｎ　ａ−リン酸塩緩衝液、ｐＨ７，５で平衡にしたスーベ ロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　１２　ＨＲ１０／３０カラムに充填した。 ゲル濾過時の最初の大きなピークは、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｌ）英国、Ｎａｔｕ ｒｅ　２２７．８８０　（１９７０）の５ＤＳ−ＰＡＧＥによって試験したとこ ろ、高度に精製されたモノマー性Ｈ８Ａを含んでいた。他の分子分析は、「原始 的」条件でのＰＡＧＥＳ　ＩＥＦおよび限定ＣＮＢｒ−開裂（バーシニ、ジー・ ニス（Ｂａｒｓｈ、　Ｇ、Ｓ、）およびパイアース、ビー・エイチ（Ｂｙｅｒｓ 、　Ｐ、Ｈ，）　ｓ　（１９８１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。 Ｓｃ１．　ＵＳＡ　７Ｂ：　５１４２−５１４６）を行った。 組換え酵母から精製したＨＳＡの分子特性酵母細胞から精製したＨＳＡは、５Ｄ Ｓ−ポリアクリルアミドゲル中で単一の６８キロダルトンのタン白質バンドとし て示され、これは成熟した天然のＩＳＡと同じ分子質量を有することを示してい た。 原始的条件下（製造業者の指示により、ファルマシア（Ｐ）ＩＡＲＭＡＣＩＡ） の１０〜１５％ファースト・ゲル（ＰＨＡＳＴ　ＧＥＬＳ）で実施）の電気泳動 では、酵母によって産生されるＩＳＡの挙動は天然の成熟したＨＳＡの挙動と同 じであり、恐らく分子間−８−８−橋掛は結合が無作為に形成されることによる ２、３または多量体複合体を形成するという同様な傾向も有していた。 酵母に産生されたＨＳＡにグリコジル化がないことは、コン・エイ−セファロー ス（Ｃｏｎ　Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）クロマトグラフィによって証明された。 Ｈ３Ａ産生酵母細胞から得られる部分的に精製されたタン白質５００　ｕｌを、 ２０畦トリス−ＩＣ１％ｐＨ７，４および０．５ＭＮａＣ１を含む１．５ｍｌ緩 衝液中で、膨潤したコン−エイ−セファ０−ス（Ｃｏｎ　Ａ−３ｅｐｈａｒｏｓ ｅ）　（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　）　７５０　ＩＪｌに結合させ た。懸濁液を一晩４℃で緩やかに振盪し、コン・エイ−セファ０−スを１２．０ ００　Ｘ　ｇで１０分間遠心分離することによって（未結合タン白質を含む）緩 衝液から分離した。次に、このコン・エイ−セファロースゲルを、１００　ｍｌ の同緩衝液で２５寵の円形のワットマン（Ｖｈａｔｉａｎ）　ＣＦ　／　Ａフィ ルターを通して濾過することによって洗浄した。 結合タン白質を、２０ｍＭ）リス−ＨＣ１，ｐＨｌｉ、８．０．２５　Ｈａ　− Ｄ−メチルマンノシド（サーブｙ　（Ｓｅｒｖａ）　）および０．２５　ＭＮ　 ａ　Ｃ１を含む緩衝液で溶出した。 未結合および（フン・エイ−セファ０−スゲルに対して）結合タン白質両分を１ ０５Ｍ　）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ６，８）に対して透析し、（１）レムリ（Ｌａ ｅｍｗｌｌ）英国、Ｎａｔｕｒｅ２２７、８８０　（１９７０）による５ＤＳ− ＰＡＧＥ、および（２）ＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験に付して、ＩＳＡの存在を調節した 。 同様な方法は、精製したＨＳＡの画分に対しても適用した。 それぞれの場合に、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験の結果、６８　ｋ ｄのタン白質のＣｏｎＡ−結合タン白質および抗−ＨＳＡ−Ａｂと免疫反応を示 すタン白質の両分は存在しないことが判った。ＨＳＡは、試料を適用したときコ ン・エイ−セファ０−スに結合しないタン白質画分から定量的に回収された。 これらの結果は、酵母中で産生されるＩＳＡの分子にはグリコジル化がないこと を示している。 限定タン白質分解によるペプチドマツプ作成の前に、還元剤を添加せずに０．５ ％（重量／容積）ＳＤＳの存在下試料を加熱変性し、１０〜２０分間酵素消化を 行った。サブチリシン、サーモリシン、トリプシンおよびパパインを用いた。Ｃ ＮＢ　ｒによる開裂は、バーシニ（Ｂａｒｓｈ）ら（同上）によって記載された のと同様に行った。 第１２図は、開裂したポリペプチドの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分離によりて冷時される のと同様に、天然ＨＳＡ（ＡおよびＣ）（材料源から前記のようにして精製）お よび酵母によって産生されたＨＳＡ　（ＢおよびＤ）のＣＮＢｒ開裂パターンを 示している。消化の後に、ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールを、それぞれ ２．５％および１０％の濃度（重量／容積）になるまで加えた。試料を８〜２５ ％グラディエンドのファースト・ゲル（ＰＨＡＳＴ　ＧＥＬ）（ファルマシア（ Ｐ）ＩＡＲＭＡＣＩＡ）　）に充填し、電気泳動を製造業者の指示にしたがって ファルマシア・ファースト・ゲル（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ　Ｐ）ＩＡｓＴ　ＧＥＬ ）で行った。 得られた結果は、組換え酵母から精製したＨＳＡは、天然Ｈ５Ａと同様のタン白 質分解酵素および臭化シアンによる分解パターンを示した（特に、酵母によって 産生されたＩＳＡは、使用条件下では天然Ｈ８Ａよりもパパインによって消化さ れ難った）。 酵母から精製したＨＳＡの試料を、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉ ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４７０　Ａ型気相シークエンサーでＮ末端配列決 定を行った。配列決定の結果は、予測したアミノ酸残基以外のものは見られなか った。 新規な発現−分泌ベクターの構成についての実験法は、プレプロＨＳＡは生体外 で酵母ＫＥＸ２エンドペプチダーゼによって正確に処理されて成熟したＡｓｐ− Ａｌａ−ＨＳＡを生成するという知見に基づいていた（バトウスト、アイ・シー （Ｂａｔｈｕｒｓｔ、　１．Ｃ，）ら、１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ２３５、３４ ８−３５０）。天然のＮ−末端ＨＳＡブレブローリーダーペプチドは、組換え酵 母からのＨＳＡの分泌を促進することができる配列として評価した。 Ｈ５Ａプレプロ　−リーダーペプチドをコードする１０３−ｍｅｒ合成りＮＡフ ラグメントの配列を、次のようにしてデザインした。 ＫＷＶＴＦ Ｍｅｔ　ＬｙＳＴｒｐ　Ｖａｌ　’ｒｈｒ　ＰｈｅＧＡＴＣＡＡＡＡＡＣＡＣＴ ＡＡＡＡＴＡＴＡＡＴＣＡＡＡ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＧＧ　ＧＴＴ　ＡＣＴ　Ｔ ＴＣＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲ Ｘ１ｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　 Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＡｒｇＡＴＣＴＣＴ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＣＴＴＧ 　ＴＴＣＴＣＴ　ＴＣＴ　ＧＣＴ　ＴＡＣＴＣＴ　ＡＧＡＧＶＦＫ”Ｒ Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　ＡｒｇＧＧＴ　ＧＴＴ　ＴＴＣＰ、ＡＧ　Ａ ＧＧ　ＣＣＴ　Ｇｔｕ　１ ＡＴＧコドンの上流の配列（２７ヌクレオチド）は、強力な構成酵母ブロモ・〜 ターの下流末端、すなわちグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナ ーゼ（ＧＡＰＤＨ；ホランド、ジェイ・ピー（ｌｌａｌ　１ａｎｄ、　Ｊ、Ｐ、 ）およびホランド、エム・ジニ・イ（Ｉｌｏｌｌａｎｄ、　Ｍ、Ｊ、）　、　１ ９７９゜Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２５４．９８３９−９８４５）をコ ードする遺伝子の下流末端）に極めて類似するようにデザインした。上記のＤＮ Ａ配列の他の特徴には、酵母コドンの極めて頻繁な利用と、ＡＡＧ　ＡＧＧコド 、ンによってコードされる「理想的Ｊ　ＫＥＸ２開裂部位（Ｋ−Ｒ↓−クリヤー ン、ジェイ（Ｋｕｒｊａｎ、　Ｊ、）およびヘルシュコビッツ、アイ（）ｌｅｒ ｓｈｋｏｖｊｔｚ、　！、）１９ｇ２．　Ｃｅ１ｉ　３０．９３３−９４３　） があり、このコドンが、このデザインによれば、５ｔｕｌ制限工ンドヌクレアー ゼ消化部位と一致する。 ｐＨ３Ａ　Ｎｏ、１　（すなわちＨＳＡをコードする遺伝子からのり、Ｓ　ｋｂ のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓａｃｌフラグメントを、ＨｉｎｄｌｌＩおよびＳａｃ　１ 部位でｐＧＢ３−２２９ＴＫ’　（第３ｂ図）にクローニングした。 ＨＳ　Ａ遺伝子を挿入した後には（Ｈｉ　ｓ　３ターミネータ−領域に配置され た）ＰｓｔＩ部位が二倍になるので、このクローニング工程の前に、Ｐｓｔ１部 位を欠失させた。０．５１１のｐＧＢ３−２２９ＴＫ”を、２０口１の培地塩緩 衝液中で１０単位のＰｓｔｌで３７℃で２時間処理した。 フェノール抽出およびエタノール沈澱の後、ベレットを０．１１℃Ｍ　ｄ　Ｎ　 Ｔ　Ｐと２．５単位のフレノウポリメラーゼを含む５０ＩＪ＋のフレノウ緩衝液 に溶解し、反応混合物を室温で４０分間保持した。次いで、反応混合物をフェノ ール抽出およびエタノール沈澱した。ＤＮＡぺ１ノツトを、１００μｌのリガー ゼ緩衝液に溶解し、５ｅ単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加えた。リガーゼの反応を １５℃で１５時間行った後、大腸菌ＪＭＩ　０９の形質転換を行った。ＰｓｔＩ 部位を含まない（全形質転換体の約３０％からの）プラスミド（ｐＧＢ３Ｔと命 名）を選択して、下記の方法でＨ３Ａ遺伝子の挿入に用いた。 （ａ）　２ｕｌのｐＧＢ３Ｔを、低濃度塩緩衝液中で１０単位のＳａｃ　Ｉで最 終容積が２０μｌで３７℃で４時間消化した。 次に、緩衝液をＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ消化に最適になるように調整し、１０単位の Ｈｉｎｄｌｌｌを加え（最終容積４０ｕｌ）処理を３７℃で更に４時間行った。 ２．０６　ｋｂのベクターが、０．８％アガロースゲル中に分離した。 （ｂ）５ｕｌのｐＨ５Ａ　Ｎｏ、１を５ａｃＩとＨｉｎｄｌｌｌで前記と同様に 消化した。１．８　ｋｂのＨＳＡフラグメントが０．８％アガロースゲルから単 離した。 （ｃ）　２．０８　ｋｂのｐＧＢ３Ｔベクターと１．８　ｋｂのＩＳＡインサー トの連結を、（８０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む）２ｈｌの結合混合物中で １５℃で１６時間行った。大腸菌３Ｍ１０９細胞（ヤニツシニーベロン、シー（ Ｙａｎｌｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，）ら、同上）を形質転換した。テトラサ イクリン感受性の形質転換体から単離されたプラスミドを、制限酵素消化パター ンについて、例えば５ａｌＩとＸｈｏｌを用いる二重消化によって試験した。 生成するプラスミドをｐＨ３Ａ−Ｔと命名した（第１１図）。 ２、強力な構成ブロー一ターおよび人工ブレブローリーダー配列のｐＨ５Ａ−Ｔ への挿入； プラスミドｐＧｐｒｅｐｒｏ＊Ｈ８Ａ−Ｔの構成（第１１図） （ａ）　Ｇ　Ａ　Ｐ　Ｄ　Ｈプロモーターの下流の人工のプレブローリーダー− コード配列のクローニング０．５μｌのＭ１３／ＧＰＤ−３（ＲＦ）ＤＮＡ　（ ビター、ジー・エイ（Ｂｉｔｔｅｒ、　Ｇ、Ａ、）およびニーガン、ケイ・エム （Ｅｇａｎ、　ＬＭ、）　（１９８４）　Ｇｅｎｅ　３２．２６３−２７４）を 、培地塩緩衝液中で５単位のＥｃｏＲｌで３７℃で２時間処理した後、高濃度塩 緩衝液中で５単位のＢａｍＨＩによって３７℃で更に２時間消化を行った。消化 をフェノール抽出およびエタノール沈澱によって停止した。ＤＮＡベレットを７ ０％エタノールで洗浄し、真空乾燥し、５．１のＨっ０に溶解して、人工Ｈ３Ａ プレプロ　−リーダーとりガーゼ反応させた。 連結混合物は、１５μｌのリガーゼ緩衝液中に、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ処理し たＭ１Ｂ／ＧＰＤ−３ＤＮＡ、　１　ｐｍｏｌの合成二本鎖１０３−ｍｅｒＤＮ Ａフラグメント（プレブロ−リーダーをコード）および８０単位の７４ＤＮＡリ ガーゼを含んでいた。リガーゼ反応は１５℃で１６時間行い、その後大腸菌ＪＭ １０９に形質転換した。 ファージ形質転換体を、ジデオキシヌクレオチド配列法によって１０３−ｓｅｒ 　ＢａｍＨＩ”　−ＥｃｏＲＩプレプロ１−リーダー−コードフラグメントの挿 入についてスクリーニングした。 ＧＡＰＤＨプロモーターの後に配置されたＨ５Ａプレプロ１−リーダー−コード 配列を含む形質転換体を、Ｍ１３／Ｇｐｒｅｐｒｏ　ＫＲと命名した（第１１図 ）（ｒＫＲＪはＬｙｓ−Ａｒｇを表わし、ＣはＧＡＰＤＨプロモーターを表わす ）。 ＧＡＰＤＨプロモーター−プレプロ　配列融合体の後のＩＳＡ遺伝子のクローニ ング： （ａ）ｐＨｓＡ−ｒをＰｓｔｌで消化しく０．５　ｕｌＤＮＡ。 ５単位のＰｓｔｌ、３７℃、４時間）、開裂した３′−突出末端をフレノウポリ メラーゼで処理して平滑末端とした。次いで、線形化したプラスミドを、更に５ 単位のＨｉｎｄｌｌｌで開裂しく３７℃、４時間）、フェノール抽出およびエタ ノール沈澱を行った。 （ｂ）　２０単位のＢｉｎｄｌｌｌと２Ｄ単位の５ｔｕＩで６．１のプラスミド ＤＮＡを同時消化（培地塩緩衝液中、３７℃、５時間）することによって、ＧＡ ＰＤＨプロモータ、−十人工ブレブロ　−リーダーーコード配列を、Ｍ１３／Ｇ プレプロ　ＫＲから単離した。０．７５　ｋｂのプロモーター＋プレプロ　フラ グメントを、１％アガロースゲル中で電気泳動によって単離し、電気溶出し、フ ェノール抽出およびエタノール沈澱を行った。 （ｅ）　精製したプロモーター＋プレプロ　フラグメントをＰｓｔｌ（平滑）− Ｈｉｎｄｌｌｌ処理したベクターｐＨ５Ａ−Ｔ中に連結しく２０μｌ混合物中、 １５℃、１６時間）、次いで大腸菌ＪＭ１０１の形質転換を行った。得られたプ ラスミドｐＧｐｒｅｐｒｏ　ＨＳＡ−Ｔ（第１１図）を、制限エンドヌクレアー ゼ開裂部位を決定することによって試験した。 プレプロ”−ＩＳＡ−発現−分泌カセットを含む酵母−大腸菌シャトルベクター の構成 ＋Ｘｈｏｌ消化（２ｕｌＤＮＡ、　２０ｕｌ高塩濃度緩衝液中、それぞれ１０単 位のＨｉｎｄｌｌｌとＸｈｏｌ、８７℃、１０時間の後、０．８％アガロースゲ ル上での電気泳動分離、電気溶出、フェノール抽出およびエタノール沈澱）によ って、ｐＧｐｒｅｐｒｏ　ＨＳＡ−Ｔから単離した。 Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ−Ｘｈｏ１７ラグメントを、次に（Ｈｉｎｄｌｌｌと５ｕｌ １部位の間の）ｐＪＤＢ２０７に連結して、ＹＥｐ／Ｇｐｒｅｐｒｏ＊ＨＳＡ　 （第１１図）を生成し、これを酵母ＬＬ２０の、形質転換に用いた。酵母形質転 換体はＹＮＢ−寒天プレート（ロイシンを欠（）上で選択した。ＨＳＡの発現と 分泌を、下記のような振盪−フラスコ培養で試験した。 酵母ＹＥｐｒｅｐｒｏ　ＨＳＡの単一コロニーを２％グルコースと２００　ｕｌ ／ｍｌヒスチジンを含む１０ｍ１のＹＮＢ培地に接種し、細胞を８１［１℃で一 晩連続振盪培養した。−晩培養液の１μｌを、前記の培地２００　ｍｌ中に加え て希釈して、更にｏＤ６ｏｏ−２，０になるまで生育させた。細胞を遠心分離（ ６，０００ｒｐｍ　、　４℃、１５分間）によって沈澱し、上澄液を集めて、Ｐ Ｍ３０フィルターを供えたアミコン（ＡｒＡｉｃｏｎ）製撹拌限外濾過セルを用 いて１０倍に濃縮した。 濃縮した細胞液を２０　ａ＋Ｍ　トリス／グリシン・ｐＨ８・３・］、ｍＭＥＤ ＴＡ、５１）Ｍβ−メルカプトエタノールおよび０、Ｏ１％ＳＤＳに対して一晩 透析した。 分泌されたＩＳＡを、前記と同様に定量用マイクロ−ＥＬＩＳＡによって評価し た。 酵母細胞ＹＥｐｒｅｐｒｏ　ＨＳＡによって、１００　ｍｌ培地当たり少なくと も３０００μｍのＨＳＡが産生されることが判った。 分泌されたＨＳＡを、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル−電気泳動の後、通常の 方法によ・るイムノブロッティングおよび染色を行った。 成熟ＨＳ　Ａ　（８８ｋｄ）は、培地中に観察される主要生成物であるが分子質 量が４Ｃ〜４８　ｋｄのＨＳＡのフラグメントも、産生された総Ｈ５Ａの約１／ ３量検出された（第１３図）。６８　ｋｄの成熟ＨＳＡは、酵母培養物からの発 現したＨＳＡの実験室規模での生成に関して前記した通り、一連のクロマトグラ フィ工程およびゲル濾過（スーペロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　１２　ＨＲ１０ ／　３０上）によって容易に精製することができた。 ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、４ に乙ｚｚｚ２＝ｚ　ＰＨＯ５グｏｅ−Ｆ−ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ 特表千３−５０１３２３　（４Ｂ） ＦＩＧ、１０ ｄ ＦＩＧ、１コ ！”ｌＧ、１３　ｋＤ　Ａ　Ｂ　ＣＤ　ε補正書の翻訳文提出書（特許法第１８ ４条の８）平成２年り月／ｌＩｔ日ｊ 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、　国際出願の表示 ＰＣＴ／ＳＥ　８８１００４７０ ２、発明の名称 真正のヒト血清アルブミンをコードする人工遺伝子、その使用およびその製造法 ３、特許出願人 住　所　スエーデン国ストックホルム、ノルランドスガクン、１５ （郵便番号ｌＯの ５、　補正書の提出年月日 浄書（内容に変更なし） 請求の範囲 １、　真正のヒト血清アルブミンをコードする構造遺伝子でありて、この構造遺 伝子が、真正のヒト血清アルブミンの発現用に選定した非ヒト宿主に関してコド ンが選択されであるヌクレオチド配列に特徴を有し、上記コドンの選択が下記の 通り行われていることを特徴とする構造遺伝子。 遺伝子のアッセンブリの際に用いられる制限部位の出現を回避し、 特異的な酵素に対して一つの独特の開裂部位を作成し、化学的に合成され、クロ ーニングされる遺伝子の部分内に８塩基対以上の長さのパリンドロームを除去す るように、 まず、選定した非ヒト宿主によって最も顛繁に用いられるコドンを選択し、 次に、選定した非ヒト寅主によって第二または第三位に用いられるコドンを選定 する。 ２、　酵母宿主に関してコドンが選択されたヌクレオチド配列を特徴とする請求 の範囲第１項に記載の構造遺伝子。 ３、　下記のヌクレオチド配列を特徴とする請求Ｃ範囲′！Ｊ２項に記載の構造 遺伝子。 ＧＡＣＧＣＴ　ＣＡＣＡＡＧ　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＧＴＣＧＣＴ　ＣＡＣＡＧＡ　 Ｔ’ｒ’ＣＡＡＧ　ＧＡＴＣＴＡ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＡＡＣＴｉｃ　入 ＡＧ　ＧＣＴ　ＴＴＧ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＡＴＴ　ＧＣＴＴＴＣＧＣＴ　ＣＡＡ 　ＴＡＣＴＴＧ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　ＴＧＴ　ＣＣＡ　ＴＴＣＧＡＡ　ＧＡＣＣＡ ＣＧＴＣＡＡＧ↑ＴＧ　ＧＴＣＡＡＣＧＡＡ　ＧＴＴ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＴＴＴ 　ＧＣＴ　ＡＡＧ　ＡＣＣＴＧＴ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＧＡＣＧＭ　ＴＣＴ　ＧＣ Ｔ　ＧＭ　ＡＡＣＴＧＴ　ＧＡＣＡＡＧ　ＴＣＣＴＴＧ　ＣＡＣＡＣＴ　ＴＴＣ ＴＴＣＧにＴ　ＧＡＣＭＧ　ＴＴＧ　ＴＧＴ　ＡＣＴ　ＧＴＴ　ＧＣ’ｌ’ＡＣ Ｔ　ＴＴＧ　ＡＧＡ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＴＡＣＣＧ’ｆ’　ＧＭ　ＡＴＧ　ＧＣ Ｔ　ＧＡＣＴＧＴ　ＴＧ’ｌ”ＧＣ’！’　ＡＡＡ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＣＣＡ　 ＧＡＡ　ＡＧＡ　ＡＡＣＧＡＡ　ＴＧＴ　ＴＴＣＴＴＡ　ＣＡＡＣＡＣＡＡＧ　 ＧＡＣＧＡＣＭＣＣＣＡ　ＡＡＣＴＴＧ　ＣＣＡ　ＡＧＡ　ＴＴＧ　ＧＴＴ　Ａ ＧＡＣＣＡ　ＧＡＡ　ＧＴＣＧＡＣＧＴＴ　ＡＴＧ　’ｌ’ＧＴ　ＡＣＴ　ＧＣ Ｔ　Ｔ’ｌ’ＣＣＡＣＧＡＣＭＣＧ入Ａ　ＧＡＧ　ＡＣτ↑ＴＣＴＴＧ　ＡＡＧ 、ＡＡＧ　ＴＡＣＴＴＧ　ＴＡＣＧＡＡ　ＡＴＣＧＣＣＡＧＡ　ＡＧＡ　ＣＡＣ ＣＣＡ　ＴＡＣＴ’ｌ’ＣＴＡＣＧＣＴ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　Ｔ ＴＣＴＴＣＧＣＴ　ＭＧ　ＡＧＡ　ＴＡＣＡＡＧ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　’！’ＴＣ 、ＡＣ’！’　ＧＡＡ　Ｔ’ＧＴ　ＴＧＴＣＡＡ　ＧＣ’ｆ’　ＧＣＣＧＡＣＡ ＡＧ　ＧＣＴ　（、ＣＴ　ＴＧＴ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＣＣＡ　ＡＡＧ　ＴＴＧＡ ＧＡ　ＧＣＣＴＴＣＡＡＧ　ＧＣＣＴにＧ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＡＧＡ　 ＴＴＧ　ＴＣＴ　ＣＡＡＡＧＡ　’ｒＴｃ　ＣＣＡ　ＡＡＧ　ＧＣＴ　ＧＭ　Ｔ ＴＴ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＧＴＴ　ＴＣＴ　ＡＡＧ　ＴＴＧＧＴＴ　ＡＣＴ　ＧＡ ＣＴＴＧ　ＡＣ’ｌ’　ＡＡＧ　ＧＴＴ　ＣＡＣＡＣＴ　ＧＡＡ　ＴＧＴ　ＴＧ Ｔ　ＣＡＣＧＧＴ　ＧＡＣＴＴＧ　？ｌ’Ｇ　ＧＡＡ　ＴＧＴ　ＧＯＴ　ＧＡＣ ＧＡＣＡＧＡ　ＧＣ’Ｅ’　ＧＡＣＴＴＧＧＣ’！’　ＡＡＧ　ＴＡＴ　ＡＴＣ ＴＧＴＣＡＡ　ＡＡＣＣＡＡ　ＧＡＣＴＣＴ　ＡＴＣＴＣＴ　ＴＣＴＭＧ　’Ｊ ’ＴＧ　ＡＡＧ　ＧＡＡ　ＴＣＴ　ＴＧＴ　ＧＭ　ＭＧ　ＣＣＡ　ＴＴＧ　ＴＴ Ｇ　ＧＭ　ＡＡＧＴＣＴ　ＣＡＣＴＣＴＡＴＣＧＣ’！’　ＧＡＡ　ＧＴＴ　Ｇ ＡＡ　ＡＡＣＧＡＣＧＡＡ　ＡＴＧ　ＣＣＡＧＣＴ　ＧＡＣＴＴＧ　ＣＣＡ　Ｔ Ｃ’Ｅ’　ＴＴ’Ｇ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＡＣＴＴＣＧＴＴ　ＧＭ　ＴＣＴＡＡ Ｇ　ＧＡＣＧＴＴ　ＴＧＴ　ＡＡＧ　ＭＣ’Ｉ”ＡＣＧＣＴ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　 ＭＧ　ＧＡＣＧＴＴＡＣＴ　’！’ＡＣＧＡＡ　ＡＣＴ　ＡＣＴ　ＴＴＧ　ＧＡ Ａ　ＭＧ　ＴＧＴ　ＴＧＴ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＣＴＧＡＣＣＣＡ　ＣＡＣＧＡ Ａ　ＴＣＴ　ＴＡＣＧＣＴ　ＭＧ　ＧＴＴ　ＴＴＣＧＡＣＧＡＡ　ＴＴＴＡＡＧ 　ＣＣＡ　Ｔ’ｒ’Ｇ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＣＣＡ　ＣＡＡ　ＡＡＣＴＴ Ｇ　ＡＴＴ　ＡＡＧ　ＣＡＡＡＡＣＴＧＴ　ＧＭ　ＴｒＧ　ＴＴＣＭＧ　ＣＡＡ 　’！’Ｔに　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＴＡＣＡＡＧ　ＴＴＣＣＡＡ　ＭＣＧＣＴ　Ｔ ＴＧ　ＴＴＧ　ＧＴｒ　ＡＧＡ　ＴＡＣＡＣ’ｌ”　ＭＧ　ＡＡＧ　ＧＴ’Ｉ’ 　ＣＣＡＧＣＴ　ＡＡＧ　ＡＧＡ　ＡＴＧ　ＣＣＡ　ＴＧＴ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　 ＧＡＣＴＡＣＴＴＧ　ＴＣＴ　ＧＴＴＧＴＴ　ＴＴＧ　ＭＣＣＡＡ　ＴＴＡ　Ｔ ＧＴ　ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＣＡＣＧＭ　ＡＡＧ　ＡＣＴ　ＣＣＡＧＴＴ　ＴＣＴ　 ＧＡＣＡＧＡ　ＧＴＴ　ＡＣＴ　ＡＡＧ　ＴＧＴ　ＴＧＴ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　Ｔ ＣＴ　ＴＴＧＧＴＴ　ＡＡＣＡＧＡ　ＡＧＡ　ＣＣＡ　ＴＧＴ　ＴＴＣＴＣＴ　 ＧＣＣＴＴＧ　ＧＡＡ　ＧＴＴ　ＧＡＣＧＡＡ　ＡＣＴ　ＴＡＣＧＴＣＣＣＡ　 ＡＡＧ　ＧＡＡ　ＴＴＴ　ＡＡＣＧＣＴ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＴＴＣＡＣＴ　ＴＴ ＣＣＡＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＴＧＴ　ＡＣＣＴＴＧ　ＴＣＣＧＡＡ　ＡＡＧ　Ｇ ＡＡＡＧＡ　ＣＡＡ　ＡＴＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＣＡＡ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＴＴＧ 　ＣＴ７　ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＧＴＴＡＡＧ　ＣＡＣＡＡＧ　ＣＣＡ　ｊ’ＡＧ　 ＧＣＴ　ＡＣＴ　ＡＡＧ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＴＴＧ　ＡＡＧ　ＧＣＴＧＴＴ　Ａ ＴＧ　ＧＡＣＧＡＣＴＴＣＧＣＴ　ＧＣＴ　ＴＴＣＧＴＴ　ＧＡＡ　ＪｉｉＡＧ 　ＴＧＴ　ＴＧＴＡＡＧ　ＧＣＴ　ｃｘｉ：　ＧＡＣＡＡＧ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　 ＴＧＴ　ＴＴＣＧＣＴ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＧＧＴＡＡＧ　ＡＡＧ　ＴＴＧ　ＧＴ Ｔ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　（１，ＣＴ　ＴＴＧ　ＧＧＴ　 ＴＴＧＴＡＡ　ＴＡＧ。 ４、メチオニンをコードする上流のヌクレオチド配列により補足された、請求の 範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の構造遺伝子。 ５、コドンが非ヒト宿主に関して選択されており且つ下記のアミノ酸配列 Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｈａ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｌｅｕ− Ｌｅ＊−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−−５ｅｒ−５ｅｒ−Ａ　１　ａ−Ｔｙｒ−５ ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｙ−Ｖａ　１−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ　−Ａ　ｒｇをコードする 上流のヌクレオチド配列で伸長された、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に 記載の構造遺伝子。 ６、コドンが酵母宿主に関して選択されている、請求の範囲第５項に記載の構造 遺伝子。 ７、　アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が下記の通りであることを特 徴とする請求の範囲第６項に記載の構造遺伝子。 ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＧＧ　ＧＴＴ　ＡＣＴ　ＴＴＣＡＴＣＴＣＴ　ＴＴＧ　ＴＴ Ｇ　ＴＴＣＴＴＧ　ＴＴＣＴＣＴ　ＴＣＴ　ＧＣＴ　ＴＡＣＴＣＴ　ＡＧＡ　Ｇ ＧＴ　ＧＴＴ　ＴＴＣＭＧ　ＡＣＣ８、ベクターに挿入される、請求の範囲第１ 〜７項のいずれか１項に記載の遺伝子を含んで成る組換えＤＮＡ分子。 ９、請求の範囲第８項に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主。 １０、真正のヒト血清アルブミンをフードする構造遺伝子の産生法であって、下 記の工程からなることを特徴とする方法。 （ａ）　２４正のヒト血清アルブミンの光玩用に選定した非ヒト宿主に関してコ ドンを選択し、このコドンの選択が下記の通り行われることによって、真正のヒ ト血清アルブミンをコードするヌクレオチド配列をデザインし、即ち、遺伝子の アッセンブリの際に用いられる制限部位の出現を回避し、 特異的な酵素に対して一つの独特の開裂部位を作成し、化学的に合成され、クロ ーニングされる遺伝子の部分内に８塩基対以上の長さのパリンドロームを除去す るように、 まず、選定したビークヒト宿主によって最も頻繁用いられるコドンを選択し、 次に、選定した非ヒト宿主によって第二または第三位に用いられるコドンを選択 する； （ｂ）　デザインしたヌクレオチド配列を化学的に合成される５′−フラグメン トとクローニングされる若干数のフラグメントとに分割して、この若干数のフラ グメントの接合点が適切に配置されたＧ−Ｃジヌクレオチド配列にあるようにし 、 （Ｃ）　前記の（ｂ）でデザインした若干数のフラグメントに、（ｂ）の５′− フラグメントに接合するフラグメントを除いて５′−末端にエキストラヌクレオ チド配列ＧＧＴＡＣを補足することによってこのデザインした若干数のフラグメ ントを改良し、更にこの若干数のフラグメントを３′−ヌクレオチドＧを有する サブユニットに分割し、このサブユニットを次に個別的にエキストラヌクレオチ ド配列ＧＧＣＣで補足し、 （ｄ）　自体公知の方法で一本鎖の形態の（Ｃ）の補足され改良されたサブユニ ットをそれぞれ化学的に合成し、また自体公知の方法で二本鎖の形態の（ｂ）の ５′フラグメントを化学的に合成し、 （ｅ）　（ｅ）の補足され改良された若干数のフラグメントの５′−末端から始 め、アダプターと酵素的充填反応の助力によって自体公知の方法で（ｄ）の合成 サブユニットを速続的に若干数の個々の組換えベクター中にクローニングして、 （Ｃ）の補足され改良された若干数のフラグメントに相当する遺伝子のクローニ ングされた二本鎖フラグメントを形成し、 （ｆ）　酵素ＫｐｎＩおよび酵素Ａ、　ｐ　ａ　！で、（ｅ）の若干数の組換え ベクターを、一方は作成された５′−末端のＫｐｎＴ制限部位で、他方は作成さ れた３′末端のＡｐａｌの制限部位で、それぞれ対に開裂して、自体公知の方法 で一本鎖の特異酵素によって平滑末端とされる粘着末端を形成し、それぞれ末端 ヌクレオチドＣおよび末端ヌクレオチドＧは残し、続いて目的とする対の組換え ベクターの両者に独特な開裂部位を有するもう一つの制限酵素で開裂することに よって、（ｅ）のクローニングした二本鎖フラグメントをまとめ、 一方において遺伝子のクローニングされたフラグメントを含む線形ベクターと他 方において遺伝子開裂したフラグメントを形成し、前記の２つのフラグメントを 自体公知の方法で平滑末端で酵素的に接合しく遺伝子のヌクレオチド配列中に含 まれるジヌクレオチドＧ−Ｃを接合点に形成し、 最終的に、二本鎖の形態の（ｂ＞の若干数のデザインされたフラグメント総てを 含む組換えベクターを得て、（ｇ）　（ｒ）で得られる組換えベクターに（ｄ） の化学的に合成した５′フラグメントを補足して、真正のヒト血清アルブミンを コードする全構造遺伝子を形成する。 １１、（ａ）において、選定される非ヒト宿主が酵母であり、 （ｂ）において、デザインされたヌクレオチド配列が下記の通りであり、 ＧＡＣＧＣＴ　ＣＡＣＡＡＧ　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＧＴＣＧＣＴ　ＣＡＣＡＧＡ　 ＴＴｅ　ＡＡＧ　ＧＡＴＧＴＣＡＡＧ　Ｔ’ｊ’Ｇ　ＧＴＣＡＡＣＧＡＡ　ＧＴ Ｔ　ＡＣＴ　ＧＡＡ　ＴＴＴ　ＧＣＴ、ＡＡＧ　ＡＣＣＴＧＴ　ＧＴＴ　ＧＣＴ 　ＧＡＣＧＡＡ　ＴＣＴ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＡＡＣＴＧＴ　ＧＡＣＡＡＧ　Ｔ’ ＣＣＴＴＧ　ＣＡＣＡＣＴ　ＴＴＧ　ＴＴＣＧＧＴ　ＧＡＣＭＧ　ＴＴＧ　ＴＧ Ｔ　ＡＣＴ’　ＧＴＴ　ＧＣＴＣＡＣＭＧ　ＧＡＣＧＡＣＡＡＣＣＣＡ　ＡＡＣ ’Ｉ’ＴＧ　ＣＣＡ　ＡＧＡ　ＴＴＧ　ＧＴ’Ｔ　ＡＧＡＣＣＡ　ＧＡＡ　ＧＴ ＣＧＡＣＧＴＴ　ＡＴＧ　ＴＧＴ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ｉ’Ｔｃ　ＣＡＣＧＡＣＡ ＡＣＧＡＡ　ＧＡＧ　ＡＣ’ｌ’　ＴＴＣＴＴＧ　ＡＡＧ　’ＡＡＧ　ＴｋＣ’ Ｉ’ＴＧ　ＴＡＣＧＡＡ　ＡＴＣＧＣＣＡＧＡ　ＡＧＡ　ＣＡＣＣＣＡ　ＴＡＣ ＴＴＣＴＡＣＧＣＴ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＣＣＡＡ　ＡＧＡ 　ＴＴＧ　ＡＡＧ　ＴＧ’ｒ　ＧＣＴ　ＴＣＣＴＴＧ　ＣＭ　ＡＡＧ　ＴＴＣＧ ＧＴ　Ｇ晶ＡＧＡ　ＧＣＣＴＴＣＡＡＧ　ＧＣＣ’ｒＧＧ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　Ｇ ＣＴ　ＡＧＡ　ＴＴＧ　、’ｌ’ＣＴ　ＣＡＡＡＧＡ　ＴＴＣＣＣＡυ和ＧＣＴ 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の合成サブユニットを下記のアダプターを用いて４Ｆ！類の大腸菌ベクターに連 続的にクローニングし、 Ａｐａ工　ＥｃｏＲＩ ＣＧＡＣＴＡＴＧＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＴＡＣＧＣＴＧＴ ＣＧＡＣＣＴＴＡＡ（ｆ）において、一本鎖の特異的酵素がフレノウポリメラー ゼである、請求の範囲第１０項に記載の構造遺伝子の産生法。 １２、発現および所望ならば分泌条件下で組換えＤＮＡ配列を含むベクターで形 質転換した宿主を増殖し、発現され且つ場合により分泌されるタン白質生成物を 単離することから成る真正のヒト血清アルブミンの産生法であって、請求の範囲 第１〜７項のいずれか１項に記載の構造遺伝子を含んで成るベクターで形質転換 した宿主を用い、真正のヒト血清アルブミンを単離することを特徴とする方法。 手　続　補　正　書　（方式） ％式％ １　事件の表示 ＰＣＴ／ＳＥ　８８１００４７０ ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 発送日　平成　２年　１２月　１１　日６　補正の対象 手続補正書Ｃ方式） ％式％ １　事件の表示 ＰＣＴ／ＳＥ　８８１００４７０ ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 ５　補正命令の日付 発送日　平成　２年　１２月　】１日 ６　補正の対象 ７　補正の内容 補正−の翻訳文の浄書（内容に変更なし）国際調査報告 −ｍ””−”ｍ”　ＰＣＴ／Ｓ［８８１００４７０

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．真正のヒト血清アルブミンをコードする構造遺伝子であって、この構造遺伝 子が、真正のヒト血清アルブミンの発現用に選定した非ヒト宿主に関してコドン が選択されてあるヌクレオチド配列に特徴を有し、上記コドンの選択が下記の通 り行われていることを特徴とする構造遺伝子。 遺伝子のアッセンブリの際に用いられる制限部位の出現を回避し、 特異的な酵素に対して一つの独特の開裂部位を作成し、化学的に合成され、クロ ーニングされる遺伝子の部分内に８塩基対以上の長さのパリンドロームを除去す るように、 まず、選定した非ヒト宿主によって最も頻繁に用いられるコドンを選択し、 次に、選定した非ヒト宿主によって第二または第三位に用いられるコドンを選定 する。
2. ２．酵母宿主に関してコドンが選択されたヌクレオチド配列を特徴とする、請求 の範囲第１項に記載の構造遺伝子。
3. ３．下記のヌクレオチド配列を特徴とする、請求の範囲第２項に記載の構造遺伝 子。 【配列があります】．
4. ４．メチオニンをコードする上流のヌクレオチド配列により補足された、請求の 範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の構造遺伝子。
5. ５．コドンが非ヒト宿主に関して選択されており且つ下記のアミノ酸配列 【配列があります】 をコードする上流のヌクレオチド配列で伸長された、請求の範囲第１〜４項のい ずれか１項に記載の構造遺伝子。
6. ６．コドンが酵母宿主に関して選択されている、請求の範囲第５項に記載の構造 遺伝子。
7. ７．アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が下記の通りであることを特徴 とする、請求の範囲第６項に記載の構造遺伝子。 【配列があります】
8. ８．ベクターに挿入される、請求の範囲第１〜７項のいずれか１項に記載の遺伝 子を含んで成る組換えＤＮＡ分子。
9. ９．請求の範囲第８項に記載の組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主。
10. １０．真正のヒト血清アルブミンをコードする構造遺伝子の産生法であって、下 記の工程からなることを特徴とする方法。 （ａ）　真正のヒト血清アルブミンの発現用に選定した非ヒト宿主に関してコド ンを選択し、このコドンの選択が下記の通り行われることによって、真正のヒト 血清アルブミンをコードするヌクレオチド配列をデザインし、即ち、遺伝子のア ッセンブリの際に用いられる制限部位の出現を回避し、 特異的な酵素に対して一つの独特の開裂部位を作成し、化学的に合成され、クロ ーニングされる遺伝子の部分内に８塩基対以上の長さのパリンドロームを除去す るように、 まず、選定したピークヒト宿主によって最も頻繁用いられるコドンを選択し、 次に、選定した非ヒト宿主によって第二または第三位に用いられるコドンを選択 する； （ｂ）　デザインしたヌクレオチド配列を化学的に合成される５′−フラグメン トとクローニングされる若干数のフラグメントとに分割して、この若干数のフラ グメントの接合点が適切に配置されたＧ−Ｃジヌクレオチド配列にあるようにし 、 （ｃ）　前記の（ｂ）でデザインした若干数のフラグメントに、（ｂ）の５′− フラグメントに接合するフラグメントを除いて５′−末端にエキストラヌクレオ チド配列ＧＧＴＡＣを補足することによってこのデザインした若干数のフラグメ ントを改良し、更にこの若干数のフラグメントを３′−ヌクレオチドＧを有する サブユニットに分割し、このサブユニットを次に個別的にエキストラヌクレオチ ド配列ＧＧＣＣで補足し、 （ｄ）　自体公知の方法で一本鎖の形態の（ｃ）の補足され改良されたサブユニ ットをそれぞれ化学的に合成し、また自体公知の方法で二本鎖の形態の（ｂ）の ５′フラグメントを化学的に合成し、 （ｅ）（ｃ）の補足され改良された若干数のフラグメントの５′−末端から始め 、アダプターと酵素的充填反応の助力によって自体公知の方法で（ｄ）の合成サ ブユニットを連続的に若干数の個々の組換えベクター中にクローニングして、（ ｃ）の補足され改良された若干数のフラグメントに相当する遺伝子のクローニン グされた二本鎖フラグメントを形成し、 （ｆ）　酵素ＫｐｎＩおよび酵素ＡｐａＩで、（ｅ）の若干数の組換えベクター を、一方は作成された５′−末端のＫｐｎＩ制限部位で、他方は作成された３′ 末端のＡｐａＩの制限部位で、それぞれ対に開裂して、自体公知の方法で一本鎖 の特異酵素によって平滑末端とされる粘着末端を形成し、それぞれ末端ヌクレオ チドＣおよび末端ヌクレオチドＧは残し、続いて目的とする対の組換えベクター の両者に独特な開裂部位を有するもう一つの制限酵素で開裂することによって、 （ｅ）のクローニングした二本鎖フラグメントをまとめ、 一方において遺伝子のクローニングされたフラグメントを含む線形ベクターと他 方において遺伝子開裂したフラグメントを形成し、前記の２つのフラグメントを 自体公知の方法で平滑末端で酵素的に接合し、遺伝子のヌクレオチド配列中に含 まれるジヌクレオチドＧ−Ｃを接合点に形成し、 最終的に、二本鎖の形態の（ｂ）の若干数のデザインされたフラグメント総てを 含む組換えベクターを得て、（ｇ）（ｆ）で得られる組換えベクターに（ｄ）の 化学的に合成した５′フラグメントを補足して、真正のヒト血清アルブミンをコ ードする全構造遺伝子を形成する。
11. １１．（ａ）において、選定される非ヒト宿主が酵母であり、 （ｂ）において、デザインされたヌクレオチド配列が下記の通りであり、 【配列があります】 （但し、矢印は化学的に合成される最初の５′フラグメントとクローニングされ る４個のフラグメントとを分割する点を示す）、 （ｃ）において、（ｂ）の改良フラグメントの補足された一本鎖サブユニットが 下記の通りであり、【配列があります】 【配列があります】 （ｅ）において、（ｄ）の合成サブユニットを下記のアダプターを用いて４種類 の大腸菌ベクターに連続的にクローニングし、 【配列があります】 【配列があります】 （ｆ）において、一本鎖の特異的酵素がクレノウポリメラーゼである、請求の範 囲第１０項に記載の構造遺伝子の産生法。
12. １２．発現および所望ならば分泌条件下で組換えＤＮＡ配列を含むベクターで形 質転換した宿主を増殖し、発現され旦つ場合により分泌されるタン白質生成物を 単離することから成る真正のヒト血清アルブミンの産生法であって、請求の範囲 第１〜７項のいずれか１項に記載の構造遺伝子を含んで成るベクターで形質転換 した宿主を用い、真正のヒト血清アルブミンを単離することを特徴とする方法。
13. １３．請求の範囲第１２項記載の方法に由来することを特徴とする、真正のヒト 血清アルブミン。
14. １４．薬学上許容可能な担体および／または希釈剤と混合した、請求の範囲第１ ３項による真正のヒト血清アルブミンを含んで成る、医薬組成物。