KR0160009B1 - 한국형 페퍼 마일드 모틀 바이러스(PMMV)의 54-kDA 복제효소 유전자 및 이를 포함하는 발현벡터 - Google Patents

한국형 페퍼 마일드 모틀 바이러스(PMMV)의 54-kDA 복제효소 유전자 및 이를 포함하는 발현벡터

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KR0160009B1 KR1019950018095A KR19950018095A KR0160009B1 KR 0160009 B1 KR0160009 B1 KR 0160009B1 KR 1019950018095 A KR1019950018095 A KR 1019950018095A KR 19950018095 A KR19950018095 A KR 19950018095A KR 0160009 B1 KR0160009 B1 KR 0160009B1
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Abstract

본 발명은 페퍼 마일드 모틀 바이러스(pepper mild mottle virus; PMMV)의 게놈 RNA로부터 클로닝된 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자 및 작물을 형질전환시킴으로써 PMMV에 대한 저항성을 부여할 수 있는, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

Description

한국형 페퍼 마일드 모틀 바이러스(PMMV)의 54-kDa 복제효소 유전자 및 이를 포함하는 발현 벡터
제1도 및 제2도는 각각 한국형 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자의 염기서열 및 54-kDa 복제효소의 아미노산 서열을 나타내고,
제3도는 PMMV 54-kDa 복제효소 유전자를 플라스미드 pTRLⅡ의 NcoI과 BamHI 제한효소 인식부위 사이에 연결시킨, 본 발명에 따른 플라스미드 pOST6004의 구조를 나타내고,
제4도는 PMMV 54-kDa 복제효소 유전자를 플라스미드 pGA580의 HindⅢ 부위 사이에 포함하는 발현 카세트를 연결시켜 제작한, 본 발명에 따른 플라스미드 pPMMV/rp54의 구조를 나타낸다.
본 발명은 한국형 페퍼 마일드 모틀 바이러스(pepper mild mottle virus; PMMV)의 54-kDa 복제효소 유전자 및 이를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, PMMV의 게놈 RNA로부터 클로닝된 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자, 및 작물을 형질전환시킴으로써 PMMV에 대한 저항성을 부여할 수 있는, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
현재 다양한 작물의 재배 및 생산에 있어서 가장 큰 감수요인의 하나는 바이러스 병해로서 그 피해는 매우 심각하여 연간 피해액이 국내에서만도 수백억원에 이르는 실정이다. 그러나 바이러스병에 대한 고전적인 저항성 품종의 육종은 어렵기 때문에, 간접적으로 바이러스 매개충을 방제함으로써 이들 병해를 줄이는 방법들이 사용되고 있다. 최근에는 식물유전공학의 발달로 식물의 형질전환기술을 토대로 한 항바이러스성 작물이 많이 연구되고 있으며 그 결과도 긍정적인 것으로 평가되고 있다. 항바이러스성 작물의 제조를 위한 식물의 형질전환에 이용되는 유전자들로는 바이러스의 복제효소 유전자, 외피 단백질 유전자, 위성 RNA 유전자, 역전사 유전자, 라이보자임 유전자, 리보소옴 불활성화 단백질 유전자 등이 있다. 이들 유용한 유전자들을 분리하고 이들을 이용하여 효과적으로 작물의 바이러스병을 방제하는 것은 농가소득의 증대 뿐 아니라 안정된 국가 경제 기반 유지에도 일익을 담당하는 일이 될 것이다.
여러 작물들 중에서도 특히 고추는 한국의 주요 작물중의 하나로서 바이러스의 감염으로 인해 큰 피해를 입고 있다. 고추 생산은 여러가지 질병에 의해 해마다 그 생산량의 변화가 매우 심한데 특히 바이러스병으로 인한 요인이 가장 커서, 1988년의 경우 온실 재배령 50일 고추묘에서 바이러스 발병율은 21.6%, 노지로 옮긴 후 40일째에는 그 발병율이 88.9%에 이르렀었다. 고추의 주된 바이러스 병징은 모자이크와 주름증세로써 각각 38.2%와 58.4%의 수치를 기록하고 있고, 성장기에 가장 심하게 발병을 일으키는 바이러스로는 담배 모자이크 바이러스(TMV)를 꼽을 수 있으며 그 발병율은 전체의 89.1%에 달한다(J.S. Kim et al., J. Kor. Capsicum Res. Coop. 2, 12-40(1993)). 현재 국내에서 고추에 감염하는 바이러스는 주로 TMV-OM(보통종), TMV-p(고추종), TMV-t(토마토종)등 세 종류의 것이 알려져 있으며 이들은 대부분 오이 모자이크 바이러스(CMV) 등의 바이러스와 복합감염하는 것으로 알려져 있다. 이외에도 아직 분리, 동정되지 않은 바이러스에 의한 감염도 전체의 23.9%로 보고되어 있으며, 국내에서는 알려지지 않았으나 외국(Spain)의 경우 페퍼 마일드 모틀 바이러스 등도 심각한 피해를 끼치는 것으로 보고되어 있다(J.S. Kim et al., J. Kor. Capsicum Res. Coop, 2, 12-30(1993)).
상기와 같은 고추의 바이러스성 질병을 타개하기 위해 야생종으로부터 바이러스 저항성 인자를 도입하기 위한 육종이 시도되고 있으나 기존의 품질을 유지하는 바이러스 저항성 고추 품종의 개발은 아직 미비한 상태에 있다. 따라서, 새로운 형질전환 기술을 이용한 작물의 개발을 위해 식물유전공학을 이용하는 방법들이 대두되고 있는데, 그에 관한 것으로는 '오이 모자이크 바이러스 코트단백질 유전자'(출원인:The Upjohn Company, 국내 공개번호 제90-700604호, 1989년 6월 29일 공개)에 관한 출원이 있다.
항바이러스성 고추 품종을 제조하기 위해서는 위에서 언급한 여러 가지 유전자를 이용하는 것이 가능하겠으나 본 발명에서는 특이적으로 54-kDa 복제효소 유전자를 선택하였다. 이들 기술은 담배 모자이크 바이러스(TMV-OM)의 54-kDa 복제효소 유전자를 담배에 도입시켜 효과적으로 바이러스를 방제할 수 있었던 연구 결과에 근거하고 있다(Golemboski, D. B. et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA. 87, 6311-6315(1990)). 상기 TMV-OM의 54-kDa 복제효소 유전자는 이미 미국에서 작물에 도입되어 항바이러스성을 준다고 보고된 바 있으나(Golemboski, D. B. et al., Proc. NatI. Acad. Sci., USA, 87, 6311-6315(1990)), TMV-p와 TMV-t에 대한 항바이러스성 작물을 제조하기 위한 54-kDa 복제효소 유전자의 유전자 조작은 아직 이루어지지 않은 상태이다.
따라서, 본 발명자들은 고추에 심각한 폐혜를 끼치는 것으로 알려진 TMV-p의 54-kDa 복제효소 유전자를 클로닝하여 이를 식물에 도입함으로써 바이러스 저항성을 가지는 고추 또는 다른 작물을 개발하는데에 이용하고자 하였는데, 클로닝된 TMV-p의 54-kDa 복제효소 유전자의 염기서열을 결정한 결과 TMV-p가 PMMV와 동일함을 밝혀냈다.
이에 따라, 본 발명의 목적은 한국형 PMMV에 저항성을 가지는 작물, 특히 저항성 고추를 개발하는데 사용할 수 있는 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 식물세포를 형질전환시켜 한국형 PMMV에 저항성을 가지는 작물을 제조하는데 유용한, 상기 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자를 포함하는 제조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에서는 제1도에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는 한국형 PMMV의 54-kDa 복제효소 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.
또한 본 발명에서는 상기 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 발현 벡터 pOST6004 및 pPMMV/rp54를 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
유전 정보가 아직 알려져 있지 않은 TMV-p로부터 전체 게놈(genome) RNA를 분리하여, 랜덤 헥사머(random hexamer) 및 역전사효소(reverse transcriptase; 입수처:BRL, USA.)를 이용하여 단일가닥(single strand)의 상보적인(complementary) 데옥시-리보핵산(cDNA)을 합성하고, 여기에 대장균 RNase H, 대장균 DNA 중합효소 I을 첨가하여 두번째 가닥의 cDNA를 합성한다.
상기 cDNA가 도입된 대장균 형질전환체로부터 생거의 디데옥시 방법에 의한 염기서열 결정방법(Sanger, et al., NatI. Acad. Sci., USA, 74, 5463(1977))에 의해 염기서열을 결정한 후 데이터 뱅크 시스템의 염기서열 정보와 비교한 결과, TMV-p가 기존의 PMMV(E. Alsonso et al., J. Gen. Virol. 72, 2875-2884(1991))와 동일한 바이러스임을 확인하였다.
본 발명의 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자는 PMMV로부터 게놈 RNA를 분리하여 cDNA를 합성한 후 클로닝하거나, 제1도의 염기서열을 되도록 공지된 화학적 DNA 합성 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
예를 들면, 우선 순수 분리한 한국형 페퍼 마일드 모틀 바이러스에서 전체 게놈(genome) RNA를 분리한다. PMMV는 담배 모자이크 바이러스와 마찬가지로 그 전체 게놈이 복제효소(replicase), 이동단백질(movement protein)과 외피단백질(coat protein) 등으로 구성되어 있어 TMV와 같은 토바모 바이러스(Tobamo virus) 그룹으로 구분된다(E. Alonso et al., J. Gen. Virol, 72, 2875-2884(1991)). 알론소(E. Alonso) 등에 의해 보고된 PMMV(J. Gen. Virol. 72, 2875-2884(1991))의 RNA의 염기서열을 참조하여 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자를 포함하는 3499번째 뉴클레오티드로부터 4908번째 뉴클레오티드까지를 클로닝하기 위하여, 복제효소 유전자 3'-말단과 5'-말단에 상보적인 2개의 올리고뉴클레오티드(pr54-3':5'-CGGGATCCTTACTCCAAAAACAATGT-3'; 26개 뉴클레오티드 및 pr54-5':5'-TTTCTGCCATGGAATATTATTACG-3'; 24개의 뉴클레오티드)를 합성하고, PMMV RNA를 주형으로 사용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)에 의해 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자를 증폭시킨다.
본 발명의 유전자의 염기서열은 그에 의해 암호화되는 단백질의 생물학적 특성에 변화가 없는 범위 내에서 적절히 치환, 부가, 삭제할 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터는, 상기 54-kDa 복제효소 유전자를 포함하며 상기 유전자를 발현시킬 식물 숙주세포의 종류에 따라 당분야에 공지된 벡터 중 하나를 선택하여 상기 유전자를 포함하도록 공지된 DNA 조작방법을 적절히 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 PCR의 결과로 생성된 DNA를 그 내부에 가지고 있는 NcoI과 BamHI 제한효소 인식부위를 이용하여 잘라낸 후 그 DNA를 발현 조절 가능한 Dual CaMV 35S 프로모터(promoter)-TEV 리더(leader)-CaMV 터미네이터(terminator) 카세트가 들어 있는 벡터, 예를 들어 플라스미드 pTRLⅡ(입수처:Dr. James Carrington, Dept. of Biology, Texas A M Univ., 참고문헌:J. virology, 60, 1590-1597(1990))에 도입하여 플라스미드 pOST6004를 제작한다.
아그로박테리움-매개(Agrobacterium-mediate) 형질전환 방법을 이용하여 유전자를 식물체내로 도입하기 위해, 위의 재조합 벡터에서 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자를 포함하는 발현 카세트 부위만을 절단하여 아그로박테리움 벡터, 예를 들어 pGA580(KCTC 580)에 도입시켜 플라스미드를 제조하고, 이 플라스미드로 아그로박테리움을 형질전환시킨다. 또한, 클로닝한 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자의 염기서열을 결정한다.
상기 형질전환된 아그로박테리움을 사용하여 아그로박테리움 매개 형질전환 방법(Robert, B. H., et al., Plant Molecular Biology Manaal A42, 1-9(1988))에 따라 식물세포를 형질전환시킨 후 상기 형질전환된 세포를 조직배양 방법으로 배양하여 완전한 식물체로 성장시킬 수 있다.
이하 본 발명을 다음 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
순수 분리된 한국형 PMMV로부터의 게놈 RNA 분리
0.01M 인산 나트륨 완충액(300μl)에 용해된 PMMV의 바이러스를 동일 부피(300μl)의 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(24:24:1) 혼합액과 섞은 후 12,000g로 5분 동안 원심분리하여 상층액만을 새로운 미량 원심분리(microcentrifuge) 튜브로 옮기는 과정을 2번 반복하였다. 마지막에 얻은 상층액에 1/10 부피(30μl)의 아세트산 나트륨(pH 6.0)과 300μl의 이소프로판올을 첨가한 후 -70℃에 20분간 두었다. 용액을 12,000g로 10분 동안 원심분리한 후 침전물만을 0.5ml의 70% 에탄올로 세척하고 진공건조시킨 다음 30μl의 증류수에 녹여 다음의 반응에 사용하였다.
[실시예 2]
한국형 PMMV의 게놈 RNA로부터 cDNA의 합성
실시예 1에서 얻은 PMMV의 게놈 RNA로부터 cDNA 합성 키트(TimeSaver cDNA synthesis kit, Pharmacia에서 구입)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
미량 원심분리 튜브에 5μg의 PMMV RNA를 넣고 RNase에 오염되지 않은 증류수를 혼합하여 20μl 부피로 만들고 65℃에서 10분 동안 반응시킨 후 얼음위에서 냉각시켰다. 위의 반응물을 역전사효소(murine reverse transcriptase), 소혈청 알부민(BSA), dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 수용액 상태로 녹아 있는 첫번째 가닥 반응 혼합물(first strand reaction mixes, 구입처:Pharmacia, U.S.A)과 혼합한 후, 여기에 1μl의 디티오트레이톨(dithiothreitol:DTT) 용액(200mM)과 프라이머로서 cDNA 합성 키트에 포함된 랜덤 헥사머(random hexamer) 1μl(0.5mg/ml)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
위 반응 산물 전체를 두번째 가닥 반응 혼합물(second strand reaction mixes:대장균 RNase H, 대장균 DNA 중합효소 I 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP의 혼합물)가 함유되어 있음)에 옮긴 후 12℃에서 30분동안, 이어서 22℃에서 1시간동안 반응시켰다. 65℃에서 10분 동안 가열하여 위의 반응을 끝내고, 100μl의 페놀:클로로포름(1:1(v/v))을 첨가하여 1분간 원심분리한 다음, cDNA를 포함하는 수성층(100μl)만을 cDNA 합성 키트에 포함되어 있는 스펀 컬럼(spun column)을 이용하여 정제하였다.
정제한 cDNA를 플라스미드 p블루스크립트(pBluescript+)에 연결하기 위해, 제한효소 인식부위가 내재되어 있는 EcoRI/NotI 어댑터(adaptor) 0.5μg, PEG(polyethylene glycol) 완충액 30μl, 20mM ATP 1μl 및 10 단위 리가제 1μl와 혼합하고 16℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 65℃에서 10분 동안 가열하여 반응을 끝내고 얼음위에서 냉각시켰다. 반응물에 1μl의 70mM ATP와 1μl의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(polynucleotide kinase) 10단위를 혼합한 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. 위 반응산물을 65℃에서 10분동안 가열하여 반응을 끝낸 후 140μl의 페놀:클로로포름(1:1(v/v))을 첨가하여 1분간 원심분리한 다음 cDNA를 포함하는 수성층(100μl)만을 cDNA 합성 키트에 포함되어 있는 스펀 컬럼을 이용하여 정제하였다.
EcoRI과 NotI 제한효소로 미리 절단된 플라스미드 p블루스크립트+에 EcoRI/NotI 어댑터가 붙은 cDNA를 삽입하기 위해, 상기의 스펀 컬럼 용출액 15μl, 연결반응 완충액(66mM 트리스-HCl(pH 7.6), 0.1mM 스퍼미딘(spermidine), 6.6mM MgCl2, 10mM DTT, 150mM NaCl) 10μl, PEG 완충액 6μl, EcoRI과 NotI 제한효소로 미리 절단된 플라스미드 p블루스크립트+100ng, 3mM ATP 1μl 및 T4 DNA 리가제 1μl(10단위)를 모두 혼합한 후(최종 부피:35μl), 16℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
상기 반응산물 DNA의 대장균(E. coli) DH5α으로의 형질전환은 염화칼슘방법(Maniatis et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 250-251(1982))에 의해, 50μg/ml의 앰피실린을 함유한 LB 고체 배지(1리터당 박토-트립톤 10g, 박토아가 16g)에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양한 후 재조합 플라스미드를 포함하는 콜로니 10개를 선별하였다.
상기 10개의 콜로니로부터 알칼리 용해 방법(Maniatis et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 368-369(1982))에 의해 플라스미드를 분리하였다. 상기와 같이 분리한 플라스미드를 EcoRI 및 NotI 제한효소로 절단한 후 아가로스 겔상에서 전기영동하여 PMMV RNA로부터 합성한 cDNA 절편이 플라스미드내에 삽입된 것을 확인하였다. 상기 cDNA 절편의 크기는 500bp부터 2kbp로 다양하게 나타났다. 생거의 디데옥시 방법에 의한 염기서열 결정방법으로, 플라스미드 p블루스크립트+의 상용 프라이머를 이용하여 합성된 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 상기 cDNA의 양 말단으로부터 대략 150개의 염기서열을 확인한 결과 알론소(E. Alonso) 등에 의해 보고된 PMMV의 뉴클레오티드 서열과 유사한 것으로 나타났다.
이어서 한국형 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자만을 클로닝하기 위해 다음의 실험을 실시하였다.
[실시예 3]
한국형 PMMV의 게놈 RNA로부터 54-kDa 복제효소 유전자의 증폭
실시예 1에서 얻은 PMMV의 게놈 RNA로부터 54-kDa 복제효소 유전자를 클로닝하기 위하여, 실시예 2에서 얻은 유전정보로부터 54-kDa 복제효소 유전자의 3'-말단 및 5'-말단 염기서열을 참조하여 하기의 염기서열을 갖는 3'-말단 및 5'-말단에 대응하는 올리고뉴클레오티드(프라이머)를 합성하였다:
PMMV의 게놈 RNA 0.5μg(8μl 부피)을 65℃에서 10분 동안 가열한 후 얼음에서 냉각시켰다. PMMV RNA로부터 첫번째 가닥의 cDNA를 합성하기 위해 미량 원심분리 튜브에 PMMV RNA 0.5μg과 10 단위 역전사효소(murine reverse transcriptase; BRL, U.S.A) 1μl, 20mM dNTP 1μl, 0.1M DTT 및 pr54-3' 0.2μg을 넣고 혼합한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 완료 후 RNA-cDNA 복합체(duplex)를 90℃에서 5분 동안 가열한 다음 냉각시켰다.
두번째 가닥의 cDNA의 PMMV 54-kDa 복제효소 유전자의 증폭을 위해, 상기 RNA-cDNA 복합체 5μl를 10배 중합효소 연쇄반응 완충액 5μl, dNTP 혼합액(dATP, dCTP, dGTP, dTTP가 각각 20mM) 1μl, 프라이머 pr54-3' 1μl(40pmol), 프라이머 pr54-5' 1μl(40pmol) 및 디나자임(Dynazyme) 중합효소(입수처:Finnzymes Oy) 0.5μl(2단위)와 함께 0.5ml PCR 튜브에서 섞은 후 증류수로 최종부피를 50μl로 조정하였다. 그 위에 미네랄 오일(50μl)을 아래층의 용액과 섞이지 않도록 조심스럽게 첨가한 후 온도 순환기(thermal cycler:MJ research Inc., U.S.A)를 사용하여 94℃에서 5분 동안 반응시킨 후, 94℃, 1분; 42℃, 1분; 72℃, 1분의 사이클을 15회 반복하고 최종 중합반응으로 72℃에서 15분 동안 반응시킴으로써 PCR을 수행하였다.
PCR로 증폭된 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자를 0.7%의 아가로스 젤상에서 전기영동하여, 약 1.5bp 크기의 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자가 합성되었음을 확인하였다.
상기의 PCR 생성물을 동일 부피의 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(24:24:1)과 혼합한 후, 12,000g에서 5분 동안 원심분리하여 상층액만을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮기는 과정을 2번 반복하고, 1/10 부피의 아세트산 나트륨(pH 6.0)과 2배 부피의 에탄올로 침전시킨 후 건조시켰다.
[실시예 4]
플라스미드 pOST6004의 제작 및 대장균(E. coli)의 형질전환
실시예 3에서 얻은 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자 50ng을 NcoI과 BamHI으로 이중 절단하고, Dual CaMV 35S 프로모터-TEV 리더의 일부-35S 터미네이터를 가지고 있는 플라스미드 pTRLⅡ(J. Virology, 60, 1590-1597(1990)) 200ng을 NcoI과 BamHI으로 절단한 후, 혼합하였다. 상기 혼합물에 T4DNA 리가제 1단위, 10배 농도 연결반응 완충용액(0.5M 트리스(pH 7.4), 0.1M MgCl2, 0.1M DTT, 10mM 스퍼미딘, 1mg/ml 우형 혈청 알부민(BSA)) 2μl, 10mM ATP 2μl를 첨가한 후 증류수로 최종부피를 20μl로 조정하였다. 상기 혼합물을 16℃에서 15시간 동안 반응시켜 플라스미드 pTRLⅡ의 NcoI과 BamHI 인지부위 사이에 54-kDa 복제효소 유전자가 삽입되도록 하였다.
제작된 플라스미드를 pOST6004로 명명하고 이를 이용하여 염화칼슘 방법에 의해 대장균 DH5α(Gibco-BRL, U.S.A)를 형질전환시켰다. 플라스미드 pOST6004로 형질전환된 대장균 DH5α는 1995년 6월 9일자로 한국과학기술연구원 유전공학연구소 부설 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 8670P호로서 기탁되어 있다.
상기 형질전환를 50μg/ml의 앰피실린을 함유한 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하여 재조합 플라스미드를 포함하는 콜로니를 선별하였다. 상기 콜로니로부터 알칼리 용해 방법에 따라 플라스미드를 분리하였고, 분리된 플라스미드를 NcoI과 BamHI 제한효소로 절단한 후 아가로스 젤상에서 전기영동하여 PMMV 54-kDa 복제효소 유전자 절편이 플라스미드내에 삽입된 것을 확인하였다.
PMMV 54-kDa 복제효소 유전자가 도입된 상기 플라스미드 pOST6004의 구조를 제3도에 나타내었다.
[실시예 5]
플라스미드 pOST6004에 도입되어 있는 PMMV 54-kDa 복제효소 유전자의 염기서열 결정
PMMV 54-kDa 복제효소 유전자의 염기서열을 결정하기 위해 플라스미드 pOST6004를 BamHI과 NcoI으로 절단한 후, PMMV 54-kDa 복제효소 유전자를 포함하는 절편을 플라스미드 p블루스크립트에 클로닝하였다. 이를 상용 프라이머로 하여 생거의 디데옥시 방법에 의한 염기서열 결정방법에 의해 합성된 유전자의 염기서열을 확인하였으며, 그 결과를 제1도에 나타내었다. 또한, 상기 염기서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 제2도에 나타내었다.
[실시예 6]
플라스미드 PMMV/rp54의 제작 및 아그로박테리움 투메파시엔세스(Agrobacterium tumefaciences) LBA4404의 형질전환
상기 실시예 4에서 제작된 플라스미드 pOST6004에 포함된 발현 카셋트(Dual CaMV-35S 프로모터-TEV 리더의 일부-PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자-35S 터미네이터)를, 식물체내로 도입 가능한 형태의 플라스미드 pGA580(KCTC 580)에 삽입시키기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
플라스미드 pGA580 200ng을 HindⅢ로 절단한 후, 역시 HindⅢ로 절단한 플라스미드 pOST6004 50ng과 혼합하고, T4 DNA 리가제 1단위, 10배 농도 연결반응 완충용액 2μl 및 10mM ATP 2μl를 첨가한 후 증류수를 가하여 최종부피를 20μl로 조정하였다. 상기 혼합물을 16℃에서 15시간 동안 반응시켜 플라스미드 pGA580의 HindⅢ 인지부위 사이에 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자를 포함하는 발현 카셋트가 삽입되도록 하였다.
제작된 플라스미드를 이용하여 염화칼슘 방법에 의해 대장균 DH5α를 형질전환시키고, 형질전환체를 13μg/ml의 테트라사이클린을 함유한 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양한 후 재조합 벡터를 포함하는 콜로니를 선별하였다.
상기 콜로니로부터 알칼리 용해 방법에 의해 플라스미드를 분리하였다. 상기와 같이 분리한 플라스미드를 HindⅢ 제한효소로 절단한 후 아가로스 젤상에서 전기영동하여 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자를 포함하는 발현 카세트 절편이 플라스미드 pGA580내에 삽입된 것을 확인하였다. PMMV 54-kDa 복제효소 유전자가 도입된 상기 플라스미드를 pPMMV/rp54라 명명하였으며 그의 구조를 제4도에 나타내었다.
상기 플라스미드를 이용하여 동결-해동(freeze-thaw) 방법(S. B. Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, PMAN-A3/7(1988))에 의해 아그로박테리움 LBA4404(Clontech Laboratories Inc., U.S.A, Cat. No. 6027-01)를 형질전환시켰다. 상기 형질전환체를 13μg/ml의 테트라사이클린을 함유한 YEP 고체 배지(리터당 박토-트립톤 10g, 박토-아가 16g, 효모 추출물 15g)에 도말하여 30℃에서 16시간 동안 배양한 후 재조합 벡터를 포함하는 콜로니를 선별하였다.
상기 콜로니로부터 아그로박테리움 플라스미드 퀵-스크린(quick-screen) 방법(S. B. Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, PMAN-A3/9∼10(1988))에 의해 플라스미드를 분리하였다. 상기와 같이 분리정제한 플라스미드를 HindⅢ 제한효소로 절단한 후 아가로스 젤상에서 전기영동하여 PMMV의 54-kDa 복제효소 유전자 절편이 플라스미드 pGA580내에 삽입된 것을 확인하였다.

Claims (4)

  1. 하기 염기서열을 갖는 한국형 페퍼 마일드 모틀 바이러스(PMMV)의 54-kDa 복제효소 유전자:
  2. 제1항의 유전자에 의해 암호화되는 하기 아미노산 서열을 갖는 단백질:
  3. 제1항의 유전자를 포함하는 발현 벡터 pOST6004(KCTC 8670P).
  4. 제1항의 유전자를 포함하는 발현 벡터 pPMMV/rp54.
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