KR0149216B1 - 페퍼마일드 모틀 바이러스의 외피유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 페퍼 마일드 모틀 바이러스(pepper mild mottle virus; PMMV)의 게놈 RNA로부터 클로닝된 PMMV의 외피유전자 및 작물을 형질 전환시킴으로써 PMMV에 대한 저항성을 부여할 수 있는, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

Description

페퍼 마일드 모틀 바이러스(PMMV)의 외피 유전자

제1도는 PMMV의 외피 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 외피 단백질의 아미노산 서열을 나타내고,

제2도는 CaMV-35S 프로모터, TEV의 리더(leader) 서열 및 CaMV 터미네이터(terminater)를 포함하는 플라스미드 pTRLII의 NcoI 제한 효소 인식 부위 사이에 PMMV 외피 유전자를 연결시켜 제작된 플라스미드 pOST6002를 나타내고,

제3도는 아그로박테리움 LBA4404에 PMMV 외피 유전자를 도입시키기 위해 플라스미드 pGA580의 Hind III 부위 사이에 PMMV 외피 유전자를 포함하는 발현 카세트를 연결시켜 제작한 플라스미드 pPMMV/cp를 나타낸다.

본 발명은 페퍼 마일드 모틀 바이러스(pepper mild mottle virus; PMMV)의 외피 유전자 및 이를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, PMMV의 게놈 RNA로부터 클로닝된 PMMV의 외피 유전자 및 작물을 형질 전환시킴으로써 PMMV에 대한 저항성을 부여할 수 있는, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

현재 다양한 작물의 재배 및 생산에 있어서 가장 큰 감수 요인의 하나는 바이러스 병해로서 그 피해는 매우 심각하여 연간 피해액이 국내에서만도 수백억원에 이르는 실정이다. 그러나 바이러스 병에 대한 고전적인 저항성 품종의 육종은 어려우므로 이들 병해를 줄이기 위해서는 간접적으로 바이러스 매개충을 방제하는 방법들이 사용되고 있다.

최근에는 식물 유전 공학의 발달로 식물의 형질 전환 기술을 토대로 한 항바이러스성 작물이 많이 연구되고 있으며 그 결과도 긍정적인 것으로 평가되고 있다. 항바이러스성 작물의 제조를 위한 식물의 형질 전환에 이용되는 유용 유전자들로는 바이러스의 복제 효소 유전자, 외피 단백질 유전자, 위성 RNA 유전자, 역전사 유전자, 라이보자임 유전자, 리보소옴 불활성화 단백질 유전자 등이 있다. 따라서 이들 유용 유전자들의 분리와 이들을 이용한 효과적인 작물의 바이러스병 방제는 농가 소득의 증대 뿐 아니라 안정된 국가 경제 기반 유지에도 일익을 하게 될 것이다.

여러 작물들 중에서도 특히 고추는 한국의 주요 작물중의 하나로서 바이러스의 감염으로 인해 큰 피해를 입고 있다. 고추 생산은 여러 가지 질병에 의해 해마다 그 생산량의 변화가 매우 심한데 특히 바이러스 병으로 인한 요인이 가장 커서 1988년의 경우 온실 재배령 50일 고추묘에서 바이러스 발병율이 21.6%, 노지로 옮긴 후 40일째에는 그 발병율이 88.9%에 이르렀었다. 고추의 주된 바이러스 병징은 모자이크와 주름 증세이고, 성장기에 가장 심하게 발병을 일으키는 바이러스로는 담배 모자이크 바이러스(TMV)를 꼽을 수 있으며 그 발병율은 전체의 89.1%에 달한다(J.S. Kim et al., J. Kor. Capsicum Res. Coop. 2, 12-40(1993)).

현재 국내에서 고추에 감염하는 바이러스는 주로 TMV-OM(보통종), TMV-p(고추종), PMMV(토마토종)등 세 종류의 것이 알려져 있으며 이들은 대부분 오이 모자이크 바이러스(CMV) 등의 바이러스와 복합 감염하는 것으로 알려져 있다. 이외에도 아직 분리, 동정되지 않은 바이러스에 의한 감염도 전체의 23.9%로 보고되어 있으며, 국내에서는 알려지지 않았으나 외국(Spain)의 경우 페퍼 마일드 모틀 바이러스 등도 심각한 피해를 끼치는 것으로 보고되어 있다(J.S. Kim et al., J. Kor. Capsicum Res. Coop, 2, 12-30(1993)).

상기와 같은 고추의 바이러스성 질병을 타개하기 위해 야생종으로부터 바이러스 저항성 인자를 도입하기 위한 육종이 시도되고 있으나 기존 품질을 유지한 바이러스 저항성 고추 품종의 개발은 아직 미미한 상태에 있다. 따라서, 새로운 형질 전환 기술을 이용한 작물의 개발을 위해 식물 유전 공학을 이용하는 방법들이 대두되고 있는데, 그에 관한 것으로는 '오이 모자이크 바이러스 코트 단백질 유전자'(출원인:The Upjohn Company, 국내 공개 번호 제 90-700604호, 1989년 6월 29일 공개)에 관한 출원이 있다.

항바이러스성 고추 품종을 제조하기 위해서는 위에서 언급한 여러 가지 유전자를 이용하는 것이 가능하고 본 발명자들은 그중 고추에 심각한 폐해를 끼치는 TMV-p의 외피 유전자를 클로닝하여 이를 식물에 도입함으로써 바이러스 저항성을 가진 식물을 개발하는데에 이용하고자 하였으며, 그 결과 클로닝된 TMV-p의 외피 유전자의 염기 서열을 결정한 결과 TMV-p가 PMMV임을 밝혀냈다.

따라서, 본 발명의 목적은 한국형 PMMV에 저항성을 가지는 작물, 특히 저항성 고추를 개발하기 위해 사용할 수 있는 PMMV의 외피 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 식물 세포를 형질 전환시켜 한국형 PMMV에 저항성을 가지는 작물을 제조하는데 유용한 상기 PMMV의 외피 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다. 이러한 목적에 따라 본 발명에서는 한국형 PMMV의 외피 단백질을 암호화하는 외피 유전자를 제공한다. 또한 본 발명에서는 상기 유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하는 다음과 같다.

유전 정보가 아직 알려져 있지 않은 TMV-p로부터 cDMA합성 키트를 이용하여 cDNA를 합성하고 그의 뉴클레오티드 서열을 결정한 후 데이터 뱅크 시스템의 뉴클레오티드 서열 정보와 비교한 결과, TMV-p가 기존의 PMMV와 동일한 바이러스임을 확인하였다.

본 발명의 PMMV의 외피 단백질 유전자는 PMMV로부터 게놈 RNA를 분리하여 cDNA를 합성한 후 클로닝하거나, 제1도의 뉴클레오티드 서열을 갖도록 공지된 화학적 DNA 합성 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

예를 들면, 우선 순수 분리한 한국형 페퍼 마일드 모틀 바이러스에서 전체 게놈(genome) RNA를 분리한다. PMMV는 담배 모자이크 바이러스와 마찬가지로 그 전체 게놈이 복제 효소(replicase), 이동 단백질(movement protein) 및 외피 단백질(coat protein)을 코드하는 유전자 등으로 구성되어 있어 TMV와 같은 토바모 바이러스(Tobamo virus) 그룹으로 구분된다(E. Alonso et al., J. Gen. Virol, 72, 2875-2884(1991). 알론소(E. Alonso)등에 의해 보고된 PMMV (J. Gen. Virol. 72, 2875-2884(1991))의 RNA의 뉴클레오티드 서열에서 3'-5'CATAGCATGG GCCGCTACCC GCGG-3') 및 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 PMMV RNA로부터 단일 가닥(single strand)의 상보적인 데옥시-리보핵산(cDNA)을 합성하고 이로부터 대장균 RNase H, 대장균 DNA 중합 효소 I를 이용하여 두 번째 가닥의 cDNA를 합성한다.

상기 cDNA가 도입된 대장균 형질전환체로부터 생거의 디데옥시 방법에 의한 염기 서열 결정 방법(Sanger, et al., Porc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463(1977))에 의해 PMMV의 외피 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 결정된 뉴클레오티드 서열을 참조하여 PMMV의 외피 유전자를 포함하는 5676번째 뉴클레오티드로부터 6357번째 뉴클레오티드까지(PMMV 외피 유전자의 시스트론은 5686번째-6158번째 뉴클레오티드임)를 클로닝하기 위하여 3'-알단과5'-말단에 상보적인 2가지 올리고뉴클레오티드 PMMV 3' 및 PMMV 5'(5'-CGTTTTAACC ATGGCTTACA CAGT-3')를 합성하고, PMMV RNA를 주형으로서 사용하는 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 PMMV의 외피 유전자를 증폭시킨다.

본 발명의 유전자의 염기 서열은 그에 의해 암호화되는 단백질의 생물학적 특성에 변화가 없는 범위 내에서 적절히 치환, 부가, 삭제할 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터는 상기 외피 유전자의 일부 또는 전부를 포함하며 상기 유전자를 발현시킬 식물 숙주 세포의 종류에 따라 당해분야에 공지된 벡터중 하나를 선택하여 상기 유전자를 포함하도록 공지된 DNA 조작 방법을 적절히 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 PCR의 결과로 생성된 DNA를 그 내부에 있는 NcoI과 제한 효소 인식 부위를 이용하여 절단한 후 발현 조절 가능한 CaMV-35S 프로모터(promoter)-TEV 리더(leader)-CaMV 터미네이터(terminator) 세트가 들어 있는 벡터, 예를 들어 플라스미드 pTRL II(입수처:Dr. James Carrington, Dept. of Biology, Texas A M Univ., 참고문헌:J. Virology 60, 1590-1597(1990))에 도입하여 플라스미드 pOST6002를 제작한다.

아그로박테리움-매개(Agrobacterium-mediate) 형질 전환 방법을 이용하여 유전자를 식물 체내로 도입하기 위해 아그로박테리움 벡터, 예를 들어 pGA580(KCTC 580)에 위의 재조합 벡터에서 PMMV의 외피 유전자를 포함하는 발현 카세트 부위만을 절단하여 도입시켜 플라스미드를 제조하고, 이 플라스미드로 아그로박테리움을 형질 전환시킨다.

상기 형질 전환된 아그로박테리움을 사용하여 아그로박테리움 매개 형질 전환 방법(Robert, B.H., et al., Plant Molecular Biology Manual A42, 1-9(1988))에 따라 식물 세포를 형질 전환시킨 후 상기 형질 전환된 세포를 조직 배양 방법으로 배양하여 완전한 식물체로 성장시킬 수 있다.

이하 본 발명을 다음 실시 예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

한국형 PMMV의 게놈 RNA 분리

0.01M 인산 나트륨 완충액(300㎕)에 용해된 PMMV의 바이러스를 동일 부피(300㎕)의 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(24:24:1) 혼합액과 섞은 후 12,000g로 5분간 원심 분리하여 상층액만을 새로운 미량 원심 분리(microcentrifuge) 튜브로 옮기는 과정을 2번 반복하였다. 마지막에 얻은 상층액에 1/10 부피(30㎕)의 아세트산 나트륨(pH 6.0)과 300㎕의 이소프로판올을 첨가한 후 -70℃에 20분간 두었다. 용액을 12,000g로 10분간 원심 분리한 후 침전물만을 0.5ml의 70% 에탄올로 세척하고 진공 건조시킨 다음 30㎕의 증류수에 녹여 다음의 반응에 사용하였다.

[실시예 2]

한국형 PMMV의 게놈 RNA로부터 cDNA의 합성

실시예1에서 얻은 PMMV의 게놈 RNA로부터 cDNA 합성 키트(TimeSaver cDNA synthesis kit, Pharmacia에서 구입)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

미량 원심 분리 튜브에 5㎕의 PMMV RNA를 놓고 RNase에 오염되지 않은 증류수를 혼합하여 20㎕ 부피로 만든 다음 60℃에서 10분간 반응시킨 후 얼음 위에서 냉각시켰다. 위의 반응물을 역전사효소(murine reverse transcriptase), 소혈청 알부민(BSA), dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 수용액 상태로 녹아 있는 첫 번째 가닥 반응 혼합물(first strand reaction mixes, 구입처:Pharmacia, U.S.A)과 혼합한 후 여기에 1㎕의 디티오트레이톨(DTT) 용액(200mM)과 프라이머로서 cDNA 합성 키트에 포함된 랜덤 헥사머(random hexamer) 1㎕(0.5mg/ml)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.

위 반응 산물 전체를 두 번째 가닥 반응 혼합물(second strand reaction mixes:대장균 RNase H, 대장균 DNA 중합 효소 I 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP의 혼합물)가 함유되어 있음)에 옮긴 후 12℃에서 30분간, 이어서 22℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 65℃에서 10분간 가열하여 위의 반응을 끝낸 후 100㎕의 페놀:클로로포름(1:1(v/v))을 첨가하여 1분간 원심 분리한 다음 cDNA를 포함하는 수성층(100㎕)만을 cDNA 합성 키트에 포함되어 있는 스펀 칼럼(spun column)을 이용하여 정제하였다. 정제한 cDNA를 플라스미드 p블루스크립트(pBluescript)에 연결하기 위해 제한 효소 인식 부위가 내재되어 있는 EcoRI/NotI 어댑터(adaptor) 0.5㎕, PEG(polyethylene glycol) 완충액 30㎕, 20mM ATP 1㎕ 및 10 단위 리가제 1㎕와 혼합하고 16℃에서 1시간 배양한 후 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 끝내고 얼음 위에서 냉각시켰다. 반응물에 1㎕의 70mM ATP와 1㎕의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(polynucleotide kinase)(10단위)를 혼합한 후 37℃에서 30분간 배양하였다.

위 반응 산물을 65℃에서 10분간 가열하여 반응을 끝낸 후 140㎕의 페놀:클로로포름(1:1(v/v))을 첨가하여 1분간 원심 분리한 다음 cDNA를 포함하는 수성층(100㎕)만을 cDNA 합성 키트에 포함되어 있는 스펀 칼럼을 이용하여 정제하였다.

EcoRI과 NotI 제한 효소로 미리 절단된 플라스미드 p블루스크립트에 EcoRI/NotI 어댑터가 붙은 cDNA를 삽입하기 위해 상기의 스펀 칼럼 용출액 15㎕, 연결 반응 완충액(66mM 트리스-HC1(pH 7.6), 0.1mM 스퍼미딘(spermidine), 6.6mM MgCl₂, 10mM DTT, 150mM NaCl) 10㎕, PEG 완충액 6㎕, EcoRI과 NotI 제한 효소로 미리 절단된 프라스미드 p블루스크립트 100ng, 3mM ATP 1㎕ 및 T4 DNA 리가제 1㎕(10 단위)를 모두 혼합한 후(최종 부피:35㎕), 16℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

상기 반응 산물을 이용하여 염화 칼슘 방법(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pp 250-251(1982))에 의해 50㎕/ml의 엠피실린을 함유한 LB 고체 배지(1리터당 박토-트립톤 10g, 박토아가 16g)에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양한 후 재조합 플라스미드를 포함하는 콜로니 10개를 선별하였다.

상기 10개의 콜로니로부터 알칼리 용해 방법(Maniatis 등, 상기 문헌 pp 368-369 참조)에 의해 플라스미드를 분리하고, CsCl 농도구배 초원심분리 방법(Maniatis등, 상기 문헌 pp93-94 참조)에 의해 정제하였다. 상기와 같이 분리 정제한 플라스미드를 EcoRi 및 NotI 제한 효소로 절단한 후 아가로스 젤 전기영등하여 PMMV RNA로부터 합성한 cDNA 절편이 플라스미드 내에 삽입된 것을 확인하였다. 상기 cDNA 절편의 크기는 500bp부터 2kbp로 다양하게 나타났다. 생거의 디데옥시 방법에 의한 염기 서열 결정 방법으로 플라스미드 p블루스크립트의 상용 프라이머를 이용하여 합성된 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. cDNA의 양 말단으로부터 대략 15개의 뉴클레오티드 서열을 확인한 결과 알론소(E. Alonso) 등에 의해 보고된 PMMV의 뉴클레오티드 서열과 유사한 것으로 나타났다.

따라서 한국형 PMMV의 오피유전자만을 클로닝하기 위해 다음의 실험을 실시하였다.

[실시예 3]

한국형 PMMV의 게놈 RNA로부터 외피 유전자의 증폭

실시예1에서 얻은 PMMV의 게놈 RNA로부터 외피 유전자를 클로닝하기 위하여 실시예2에서 얻은 외피 유전자의 3'-말단 및 5'-말단 뉴클레오티드 서열을 참조하여 하기의 뉴클레오티드 서열을 갖는 3'-말단 및 5'-말단에 대응하는 올리고뉴클레오티드(프라이머)를 합성하였다:

PMMV의 게놈 RNA 0.5㎕(8㎕)을 65℃에서 10분간 가열한 후 얼음에서 냉각시켰다. PMMV RNA로부터 첫 번째 가닥의 cDNA를 합성하기 위해 미량 원심 분리 튜브에 PMMV RNA ㎕, 10단위 역전사효소(murine reverse transcriptase; BRL, U.S.A) 1㎕, 20mM dNTP 1㎕, 0.1M DTT 및 프라이머 PMMV 3' 0.5㎕을 넣고 혼합한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 완료후 RNA-cDNA 복합체(duplex)를 90℃에서 5분간 가열한 다음 냉각시켰다.

두 번째 가닥의 cDNA를 합성하기 위해 RNA-cDNA 복합체 5㎕를 10배 중합 효소 연쇄 반응 완충액 5㎕, dNTP 혼합액(dATP, dCTP, dGTP, dTTP가 각각 20mM) 1㎕, 프라이머 PMMV 3' 1㎕(40pmol), 프라이머 PMMV 5' 1㎕(40pmol), 벤트(vent) 중합 효소(Stratagene, U.S.A) 0.5㎕(2.5 단위)와 함께 0.5ml PCR 튜브에서 섞은 후 증류수로 최종 부피를 50㎕로 조정하였다. 그 위에 미네랄 오일(50㎕)을 아래층의 용액과 섞이지 않도록 조심스럽게 첨가한 후 온도 순환기(thermal cycler; MJ research Inc., U.S.A)를 사용하여 94℃에서 5분 동안 반응시킨 후, 94℃, 1분; 55℃, 30초;72℃, 30초;72℃, 15분 사이클을 15회 반복함으로써 PCR을 수행하였다.

PCR로 증폭된 PMMV의 외피유전자를 0.7%의 아가로스젤상에서 전기영동하여 확인한 결과 약 0.67bp 크기의 PMMV의 외피 유전자가 합성되었음을 확인하였다.

상기의 PCR 생성물을 동일 부피의 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(24:24:1)과 혼합한 후, 12,000g으로 5분간 원심 분리하여 상층액만을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮기는 과정을 2번 반복하고 1/10 부피의 아세트산 나트륨(pH 6.0)과 2배 부피의 에탄올로 첨전시킨 후 건조시켰다.

[실시예 4]

플라스미드 pOST6002의 제작 및 대장균(E.coli)의 형질 전환

실시예3에서 얻은 PMMV의 외피 유전자 50ng을 NcoI으로 절단하고 NcoI으로 절단된, Dual CaMV-35S 프로모터-TEV 리더의 일부-35S 터미네이터를 가지고 있는 플라스미드 pTRL II (J. Virology 60, 1590-1597(1990)) 200ng과 혼합하였다. 상기 혼합물에 T₄ DNA 리가제 1단위, 10배 농도 연결 반응 완충용액(0.5M 트리스(pH 7.4), 0.1M MgCl₂, 0.1M 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT), 10mM 스퍼미딘(spermidine), 1mg/ml 우형 혈청 알부민(BSA)) 2㎕, 10mM ATP 2㎕를 첨가한 후 증류수로 최종 부피를 20㎕로 조정하였다. 상기 혼합물을 16℃에서 15시간 동안 반응시켜 플라스미드 pTRL II의 NcoI 인지 부위 사이에 외피 유전자가 삽입되도록 하였다. 제작된 플라스미드를 pOST6002로 명명하고 이를 이용하여 염화 칼슘 방법에 의해 대장균 DH5a(Gibco-BRL, U.S.A)를 형질 전환시켰다. 플라스미드 pOST6002로 형질 전환된 대장균 DH5a는 1994년 10월 17일자로 한국과학기술연구원 유전 공학 연구소 부설 유전자 은행에 기탁 번호 제 KCTC 8626P호로서 기탁하였다. 상기 형질 전환체를 50㎕/ml의 앰피실린을 함유한 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하여 재조합 벡터를 포함하는 콜로니를 선별하였다.

상기 콜로니로부터 알칼리 용해 방법에 따라 플라스미드를 분리하고, CsCl 농도구배 초원심분리 방법(Maniatis 등의 문헌, pp93-94)에 의해 정제하였다. 상기와 같이 분리, 정제한 플라스미드를 NcoI 제한 효소로 절단한 후 아가로스 젤 전기영동하여 PMMV 외피 유전자 절편이 플라스미드내에 삽입된 것을 확인하였다.

[실시예 5]

플라스미드 pOST6002에 포함된 PMMV 외피 유전자의 뉴클레오티드 서열 결정상기의 PMMV 3' 및 PMMV 5' 올리고뉴클레오티드를 프라이머로하여 생거의 디데옥시 방법에 의해 플라스미드 pOST6002에 포함되어 있는 PMMV의 외피 유전자의 뉴클레오티드 서열을 확인하였고, 그 결과를 제1도에 나타내었다. PMMV의 외피 유전자가 도입된 상기 플라스미드를 pOST6002로 명명하였으며, 그의 구조를 제2도에 나타내었다.

[실시예 6]

플라스미드 pPMMV/cp의 제조 및 아그로박테리움(Agrobacterium) LBA4404의 형질 전환

상기의 실시예2에서 제작된 플라스미드 pOST6002에 포함된 발현 카셋트(Dual CaMV-35S 프로모터-TEV 리더의 일부-PMMV의 외피 유전자-35S 터미네이터)를 식물 체내로 도입 가능한 형태의 플라스미드 pGA580(KCTC 580)에 삽입시키기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

플라스미드 pGA580 200ng을 HindIII로 절단한 후, 역시 HindIII로 절단한 플라스미드 pOST6002 50ng과 혼합하고, T4 DNA 리가제 1 단위, 10배 농도 연결 반응 완충용액 2㎕ 및 10mM ATP 2㎕를 첨가한 후 증류수를 가하여 최종 부피를 20㎕로 조정하였다. 상기 혼합물을 16℃에서 15시간 동안 반응시켜 플라스미드 pGA580의 HindIII 인지 부위들 사이에 PMMV의 외피 유전자를 포함하는 발현 카셋트가 삽입되도록 하였다.

제작된 플라스미드를 이용하여 염화 칼슘 방법에 의해 대장균 DH5a를 형질 전환시키고 형질전환제를 13㎕/ml의 테트라사이클린을 함유한 LB 고체 배지에 도포하여 37℃에서 16시간 동안 배양한 후 재조합 벡터를 포함하는 콜로니를 선별하였다.

상기 콜로니로부터 알칼리 용해 방법에 의해 플라스미드를 분리하고, CsCl 농도구배 초원심 분리 방법에 의해 정제하였다. 상기와 같이 부닐정제한 플라스미드를 HindIII 제한 효소로 절단한 후 아가로스젤 전기영동하여 PMMV의 외피유전자 절편이 플라스미드 pGA580 내에 삽입된 것을 확인하였다. PMMV 외피유전자가 도입된 상기 플라스미드를 pPPMV/cp로 명명하였으며 그의 구조를 제3도에 나타내었다.

상기 플라스미드를 이용하여 동결-해동(freeze-thaw)방법(S.B. Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, pp:PMAN-A3/7(1988))에 의해 아그로박테리움 LBA4404(Clontech Laboratories Inc., U.S.A, Cat. No. 6027-01)를 형질전환시켰다. 상기 형질전환체를 13㎕/ml의 테트라사이클린을 함유한 YEP 고체 배지(리터당 박토-트립톤 10g, 박토-아가 16g, 효모 추출물 15g)에 도말하여 30℃에서 16 시간 동안 배양한 후 제조합 벡터를 포함하는 콜로니를 선별하였다.

상기 콜로니로부터 아그로박테리움 플라스미드 퀵-스크린(quick-screen) 방법(Plant Molecular Biology Manual, PMAN-A3/9∼10(1988))에 의해 플라스미드를 분리하였다. 상기와 같이 분리정제한 플라스미드를 HindIII 제한효소로 절단한 후 아가로스 젤 전기영동하여 PMMV의 외피유전자 절편이 플라스미드 pGA580 내에 삽입된 것을 확인하였다.

Claims (4)

1. 하기 뉴클레오티드 서열을 갖는 한국형 페퍼 마일드 모틀 바이러스(PMMV)의 피단백질 유전자:
2. 제1항의 유전자에 의해 암호화되는 하기 아미노산 서열을 갖는 단백질:
3. 제1항의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pOST6002(KCTC 8626P)
4. 제1항의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 pPMMV/cp.