JPH04504208A - 組換えトリコサンチンおよびコード配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えトリコサンチンおよびコード配列本出願は、共に所有する、共に出願中の 米国特許出願第３３３．１８４号の一部継続出願である。

１、発明の分野 本発明は組換えで生産するトリコサンチン（ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ）およ びそれ故にＤＮＡコード配列に関する。

２、参考文献 Ａｓａｎｏ、　Ｋ、、ら、　Ｃａｒｌｓｖｅｒｇ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ、５１ ：１２９　（１９８６）。

Ｂａｒｂｉｅｒｉ、　Ｌ、、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、　２０３＋５５　（１９ ８２）。

Ｂｕｌｌｏｃｋ、　Ｗ、０．、ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５（４）：３ ７６　（１９８７）。

Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ、Ｓ、Ｂ、、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　 ＵＳＡ、　８４：４３６４　（１９８７）。

Ｃａ５ｅｌｌａｓ、　Ｐ、、ら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７６：５８１ 　（１９８８）。

Ｃｈａｕｄｈａｒｙ、　Ｖ、に、、ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３５：３６９　（ １９８８）。

Ｃｏｌｅｍａｎ、　Ｗ、Ｈ，、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ 、６９６：２３９　（１９８２）。

Ｃｒｏｗｅ、Ｓ、、ら、Ａｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒ ｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、３（２）：１３５　（１９８７）B Ｃｕｍｂｅｒ、Ｊ、Ａ、、ら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、１１２：２０７　（１９８５）。

Ｄｕｎｃａｎ、　Ｒ，Ｊ、Ｓ、、ら、　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８２：６ ８　（１９８３）。

Ｆａｌａｓｃａ、　Ａ、、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、２０７：５０５　（１９８ ２）。

Ｆｕｎａｔｕｓ、　Ｇ、、ら、　Ａｇｒｉｃ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　５２（４ ）：１０９５　（１９８８）。

Ｇａｓｐｅｒｉ−Ｃａｍｐａｎｉ、ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　７６（２）＋１ ７３　（１９７７）。

Ｇｒａｓｓｏ、Ｓ、、ら、　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、６８：１９９　（ １９７８）。

Ｇｕ、　Ｚｉ−ｗｅｉ、ら、　Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍｉｃａ　５ｉｎｉｃａ、４３ ：９４３　（１９８４）。

Ｈａｂｕｋａ、　Ｎ、、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、２６４：６６２９ 　（１９８９）。

Ｈａｌｌｉｎｇ、　Ｋ、Ｃ，、ら、　Ｎｕｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３：８０ １９　（１９８５）。

Ｈｓｕ、Ｋ、Ｃ，、ら、Ａｃｔａ　Ｚｏｏｌ　Ｓｉｎ、２２：１４９　（＋９７ ６）。

）ｔｗａｎｇ、　Ｙ、Ｎ、、　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　Ｔ ｒａｄ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　７F１５４　（１９ ８７）。

ｒｒｖｉｎ、　Ｊ、Ｄ、、　Ａｒｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１ ６９：５２２　（１９７５）。

Ｋａｏ、　Ｈ，、ら、Ａｃｔａ　Ｂｉｏｌ　ＥＸＩ）　Ｓｉｎ、１１：２５３　 （１９７８）。

Ｋｕｏ−Ｐｅｎ、Ｃ，、ら、Ｏｂｓ　ａｎｄ　Ｇｙｎ、５９（４）：４９４　（ １９８２）。

Ｌａｍｂ、Ｆ、１．、ら、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１４８：２６５　（１ ９８５）。

Ｌａｗ、Ｌ、に、、ら、Ｊ　Ｒｅｐｒｏｄ　Ｐｅｒｔ、６９：５９７　（１９８ ３）。

Ｌｉｆｓｏｎ、Ｊ、Ｄ、、ら、５ｃｉｅｎｃｅ、２３２：１１２３　（１９８６ ）。

Ｌｉｎ、Ｊ、Ｙ、、ら、Ｔｏｘｉｃｏｎ、１６：６５３　（１９７８）。

Ｍａｄｄｏｎ、　Ｐ、Ｊ、、ら、Ｃｅ１１．４２：９３　（１９８５）。

Ｍａｒａｇａｎｏｒｅ、Ｊ、Ｍ、、ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅａ　２６２（２４ ）：１１６２８　（１９８７）。

ＭｃＧｒａｔｈ、　Ｌら（１９８９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：２８４４゜Ｍｕｒｒａｙ、　Ｈ，Ｇ、ら、　Ｎｕｃ　 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８：４３２１　（１９８０）。

０ｈｔｓｕｋａ、Ｅ、、ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅａ　２６０（５）：２６０５ 　（１９８５）。

０１ｓｎｅｓ、　Ｓ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２８：４７４　（１９８７）。

０１ｓｎｅｓ、Ｓ、、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｏｘｉ ｎｓ　ａｎｄ　Ｖｉｒｕｓｅｓ中、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８２）、第３章。

Ｐａｎ、　Ｋ、、ら、５ｃｉｅｎｔｉａ　５ｉｎｉｃａ　（シリーズＢ）　３０ （４）：３８６　（１９８７）。

５ｐｒｅａｆｉｃｏ、Ｆ、、ら、［ｎｔ　Ｊ　Ｉｎｖｎｕｎｏｐｈａｒｍｏｃ、 ６（４）：３３５　（１９８３）。

Ｔａｋａｈａｓｈｉ、　Ｙ、、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ、８２：１９３１　（１９８５）。

Ｔａｙｌｏｒ、Ｂ、ら、ＢＲＬ　Ｆｏｃｕｓ、４（３）：４　（１９８２）。

Ｔｉ１１．　Ｍ、Ａ、、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４２：１１６６　（１９８ ７）。

Ｗａｎｇ、Ｙｕ、ら、Ｐｕｒｅ　＆　ＡＩ）Ｉｌｌ　Ｃｈｅａ　５８（５）ニア ８９　（１９８６）。

Ｘｉｏｎｇ、　Ｙ、Ｚ、、ら、Ａｃｔａ　Ｚｏｏｌ　Ｓｉｎ、１１：２３６　（ １９７６）。

Ｘｕｅｊａｎ、　Ｚ、、ら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２１：４７７　（１９８６） 。

Ｙｅｕｎｇ、　Ｈ，Ｗ、ら、Ｉｎｔ　Ｊ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒ ｅｓ、、２７：３２５　（１９８６）。

３、発明の背景 トリコサンチン（ＴｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎＸＴ　ＣＳ　）は、トリコサンチ ン・キリロウィイ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ）の塊根 （ｒｏｏｔ　ｔｕｂｅｒ）から得られる植物タンパク質である。α−トリコサン チン（Ｌａｗ）およびＲａｄｉｘ　トリコサンチン（Ｋｕｏ−Ｐｅｎ）としても 知られているこのタンパク質は、約２５．０００ドルトンの分子量を育する塩基 性の、単鎖タンパク質である。ＴＣＳの不正確なタンパク質配列が報告されてお り（Ｇｕ；　Ｗａｎｇ）、そして分子モデルがＸ線分析法から得られている（Ｐ ａｎ）。

ＴＣＳは無細胞溶解物系におけるタンパク質合成の効力のある阻害剤である（Ｍ ａｒａｇａｎｏｒｅ）。この活性は、ＴＣＳと、リシンのＡ鎖、アブリンＡ＠（ Ｏｌｎｅｓ、１９８２、１９８７）およびモデッシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）（Ｏ Ｉｓｎｅｓ、　１９８２）を含む、多数の別のＲＩＰＳとアミノ酸相同を示すリ ボゾーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）　、および種々の短鎖リボゾーム不活性 化タンパク質、例えばポークライード抗ウィルスタンパク質（ＰＡＰ）　（［ｒ ｖｉｎ）　、種々の別の植物からのＲＩ　Ｐ　ｓ　（Ｃｏｌｅｍａｎ；　Ｇｒａ ｓｓｏ；　Ｇａｓｐｅｒｉ−Ｃａｍｐａｎｉ）および大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１ｔ） 　（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ）からのＳｈｉｇａ様毒素のＡサブユニットとの間で 、観察されるアミノ酸配列における相同性と矛盾がない。

ＴＣ３、またはＴＣ３を含む植物抽出物は、中国においてヒトで流産を起こす剤 として、特にｍｉｄｔｒｉｍｅｓｔｅｒ　（１４週〜２６週）の間で、使用され ている。そういうものとして、該薬剤は、筋肉内、静脈内、または羊膜内経路に よって、一般に約５〜１２ｍｇの間の単一用量で、投与されている。中間期流産 の現象は、胎盤絨毛の選択的破壊に帰せられている。別の研究は、合胞体層に優 先的に影響を及ぼすこと（Ｈｓｕ；　Ｋａｏ）およびｈＣＧの分泌を減じ得るこ と（Ｘｉｏｎｇ）を暗に示している。ＴＣ３はヒトの絨毛癌に抑制効果を有する ことも示されており、そしてこのタンパク質は血液脳関門を通過できるらしい（ Ｈｗａｎｇ）。

最近、ＴＣＳはヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に感染したヒトＴ細胞およびマ クロファージにおいてウィルス発現に選択的抑制性効果を育することが示された 。このことは、当該タンパク質で処理した感染細胞におけるＨｒＶ誘導抗原（Ｈ ＩＶ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ａｎｔｉｇｅｎ）のほぼ完全な阻害、および感染細胞に おけるタンパク質およびＤＮＡ合成の選択的阻害によって立証される。同様の結 果が、ｍｏｍｏｒｃｈａｒｉｎ。

ｂｉｔｔｅｒ　ｍｅｌｏｎ植物の種子から得られる塩基性グリコプロティンにつ いても発見された（Ｆａｌｏｓｉａ：　５ｐｒｅａｆｉｃｏ；　Ｌｉｎ；　Ｂａ ｒｂｉｅｒｉ）　ｏこれらの研究結果、およびＨＩＶ感染の治療のための該２つ のタンパク質の適用は、ｒＨＩＶの選択的阻害方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　５ｅ ｌｅｃｔｉｖｅｌｙ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ＨｍＪに関する米国特許第４．　 ７９５．　７３９号に詳述されている。

特に、ＨＩＶ感染ヒトＴ細胞およびマクロファージにおけるウィルス発現を阻害 するＴＣＳの能力に鑑みて、ヒト治療剤として使用するために、比較的純粋な、 変化しないＴＣ３製剤を製造することが望ましいであろう。Ｔ、　ｋｉｒｉｌｏ ｗｉｉの根からＴＣ３を調製する方法が報告されている（Ｙｕｅｎｇ）。より早 期に発見された既知の方法によって製造される精製ＴＣＳの分析は、このタンパ ク質が、部分的にしか精製されておらず、そして特に、赤血球凝縮性汚染物タン パク質を含むことを示している。［精製されたトリコサンチンおよび精製方法（ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ 　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）　Ｊに関する共に所有する特許出願９．米国出願 第０７／３３３．１８１号、１９８９年４月４日出願、に記載されているより最 近の精製方法は、赤血球凝集タンパク質を含むタンパク質汚染物質がほぼない高 度に精製されたＴＣ３製剤を産する。

さらに、組換えＤＮＡ技術を用いてＴＣＳを生産することが所望されるであろう 。目下、この塊茎根（ｔｕｂｅｒ　ｒｏｏｔｓ）は東洋のある地域からしか入手 できないので、このタンパク質を組換え方法によって合成することは、Ｔ、　ｋ ｉｒｉｌｏｗｉｉの根を新鮮な形で得る困難さを回避するであろう。ＴＣＳの組 換え生産は、異なる地理的領域からの天然の板材料から得られるＴＣＳ中の一部 アミノ酸配列における変動の問題をも回避するであろう。

ＴＣ３の組換え生産は、ＴＣＳの生物活性ペプチド部分、および、例えば増大し た標的細胞特異性を授与する官能基ペプチドと融合した当該タンパク質の生物活 性部分を含む、ＴＣＳのペプチド誘導体の生産をも容易にするであろう。

４、発明の要旨 それ故、本発明の１つの目的は、ＨＩＶ感染ヒトＴ細胞またはマクロファージに おけるウィルス発現を選択的に阻害できる組換えＴＣＳタンパク質を提供するｇ 　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を提供することである。

本発明の未だ別の目的は、このようなＲＩＰｓの遺伝情報を指定する植物由来の ゲノム配列を選択的に増幅するのに役立つ、ＲＩＰｓの離れた（ｓｐａｃｅｄ） アミノ酸領域に相同であるＴＣ３の離れたアミノ酸領域に対応する縮退プライマ ー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｐｒｉｍｅｒ）のセットを提供することである。

コサンチンの官能基特性を持つトリコサンチンタンパク質をコード化しているク ローン化核酸分子を包含する。当該核酸分子は、塩基対４０９〜１１４９が、ト リコサンテス・キリロウィイ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ　ｋｉｒｉｌｏｗｉ ｉ）から単離されるＴＣＳの成熟（ｍａｔｕｒｅ）形をコード化している配列： ３２９　ＡＡＧＴＣＡＡＡＡＡＧ　ＡＴＧ　ＡＴＣＡＧＡ　ＴＴＣＴＴＡ　ＧＴ ＣＣＴＣＴＣＴ　ＴＴＧ　ＣＴＡ　ＡＴＴ　３７２３７３　ＣＴＣＡＣＣｃｒｃ 　ＴＴＣＣＴＡ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　ｃｃｒ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＧＧＣＧ ＡＴ　ＧＴＴ　４１４４１５　ＡＧＣＴ’ＴＣＣＧＴ　ＴＴＡ　ＴＣＡ　ＧＧＴ 　ＧＣＡ　ＡＣＡ　ＡＧＣＡＧＴ　ＴＣＣＴＡＴ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　４５６４５ ７　Ｔ？’ＣＡＴＴ　ＴＣＡ　ＡＡＴ　ＣＴＧ　ＡＧＡＡＡＡ　ＧＣＴ　ＣＴＴ 　ＣＣＡ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＡＧＧ　ＡＡＡ　４９８４９９　ＣＴＧ　’ｒＡＣ ＧＡＴ　ＡＴＣＣＣＴ　ＣＴＧ　Ｔ’ｌ’Ａ　ＣＧＴ　ＴＣＣＴＣＴ　ＣＴＴ　 ＣＣＡ　ＧＧＴ　’ｒＣＴ　５４O ５４１　ＣＡＡ　ＣＧＣＴＡＣＧＣＡ　ＴＴＧ　ＡＴＣＣｋＴ　ＣＴＣＡＣＡ　 ＡＡＴ　ＴＡＣＧＣＣＧＡＴ　ＧＡＡ　５Ｂ２５８３　ＡＣＣＡＴＴ　ＴＣＡ　 ＧＴＧ　ＧＣＣＡＴＡ　ＧＡＣＧＴＡ　ＡＣＧ　ＡＡＣＧＴＣＴＡＴ　ＡＴＴ　 ＡＴＧ　６２４６２５　ＧＧＡ　ＴＡＴ　ＣＧＣＧＣＴ　ＧＧＣＧＡＴ　ＡＣＡ 　ＴＣＣＴＡＴ　’Ｉ’ＴＴ　ＴＴＣＡＡＣＧＡＧ　ＧＣＴ　６６６６６７　Ｔ ＣＴ　ＧＣＡ　ＡＣＡ　ＧＡＡ　ＧＣＴ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＴＡＴ　ＧＴＡ　Ｔ ＴＣＡＡＡ　ＧＡＣＧＣＴ　ＡＴＧ　７０８７０９　ＣＧＡ　ＭＡ　ＧＴＴ　Ａ ＣＧ　ＣＴＴ　ＣＣＡ　ＴＡＴ　ＴＣＴ　ＧＧＣＭＴ　ＴＡＣＧＭ　ＡＧＧ　Ｃ ＴＴ　７５０７５２　ＣＡＡ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＧＣＧ　ＧＧＣＡＡＡ　ＡＴＡ 　ＡＧＧ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＡＴＴ　ＣＣＧ　ＣＴＴ　ＧＣＡ　７９２７９３　 ＣＴＣＣＣＡ　ＧＣＴ　ＴＴＧ　ＧＡＣＡＧＴ　ＧＣＣＡ’？＋ｒＡＣＣＡＣＴ 　ＴＴＧ　ＴＴＴ　ＴＡＣＴＡＣ８３４８３５ＭＣＧＣＣＭＴ　ＴＣＴ　ＧＣＴ 　ＧＣＧ　’ｌ’ｃＧ　ＧＣＡ　ＣＴＴ　ＡＴＧ　ＧＴＡ　ＣＴＣＡＴＴ　ＣＡ Ｇ　８７６８７７　ＴＣＧ　ＡＣＧ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＣＧ　ＡＧＧ 　ＴＡＴ　ＡＡＡ　ＴＴＴ　ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＣＡＡ　９１８９１９　 ＡＴＴ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＣＧＣＧＴＴ　ＧＡＣＡＡＡ　ＡＣＣＴＴＣＣＴＡ　 ＣＣＡ　ＡＧＴ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　９６０９６２　ＡＴＴ　ＡＴＡ　ｋＧＴ　Ｔ ＴＧ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＡＧＴ　ＴＧＧ　ＴＣＴ　ＧＣＴ　ＣＴＣＴＣＣＡＡＧ 　ＣＡＡ　１００２１００３　ＡＴＴ　ＣＡＧ　ＡＴＡ　ＧＣＧ　ＡＧＴ　ＡＣ Ｔ　ＭＴ　ＭＴ　ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＴＴＴ　ＧＭ　ＡＣＴαｒ　１０４４１０４ ５　ＧＴＴ　ＧＴＧ　（−”ＴＴ　ＡＴＡ　ＭＴ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＡＡＣＣＭ 　ＣＧＡ　ＧＴＣＡＴＧ　ＡＴＡ　ＡＣＣ１０８６１０８７ＭＴ　ＧＴＴ　ＧＡ Ｔ　ＧＣＴ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＧＴＡ　ＡＣＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＣＧ　ＴＴ Ｇ　ＣＴＧ　１１２８１１２９　ＣＴＧ　ＡＡＴ　ＣＧＡ　ＭＣＭＴ　ＡＴＧ　 ＧＣＡ　ＧＣＣＡＴＧ　ＧＡＴ　ＧＡＣＧＡＴ　ＧＴＴ　ＣＣＴ　１１７０１１ ７１　ＡＴＧ　Ａ（Ｊ　ＣＡＧ　ＡＧＣＴＴＴ　ＧＧＡ　ＴＧＴ　ＧＧｊｖ　Ａ ＧＴ　ＴＡＴ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＴＡＧ　ＴＧＴ　１２P２ １２１３　ＭＣＴＴＣＭＧ　ＣＴＡ　ＣＧＴ　１２２７の中に含まれている。

本発明の核酸はニ ード化する塩基対３４０〜４０８： （ｅ）　（ａ）に加えて、Ｔ、　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉからのＴＣＳの成熟形のカ ルボキシ末端延長部分をコード化する塩基対１１５０〜１２０６．および（ｄ） 融合タンパク質（ｆｕｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）に細胞表面認識特性を授与する りガントペプチドを持つ融合タンパク質をコード化する、リガンドペプチドコー ド配列に接合されたＴＣＳコード配列 を含み得る。

本発明は、発現ベクターと結合したＴ、　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉからのＴＣＳのた めのコード配列をも包含する。１つの好ましい発現ベクター構築物は、プロモー ター、リボゾーム結合部位、ＴＣＳのアミノ末端コドンに隣接して置かれたＡＴ Ｇ開始コドン、および成熟ＴＣ３のカルボキシ末端コドンに隣接して置かれた終 止コドンを含む。

別の面において、本発明は、反復プライマー開始ストランド伸長法（ｒｅｐｅａ ｔｅｄｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　５ｔｒａｎｄ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ）によって、Ｔ、　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉＤＮＡからの、ＴＣＳの第一および第二 の離れた領域の遺伝情報を指定するゲノムフラグメントを選択的に増幅するのに 役立つプライマー混合物を含む。このプライマー混合物は、センスストランド縮 退プライマーの第一のセット、およびアンチセンスプライマーの第二のセットを 含み、そしてそこで各セットは、それぞれ、既知のトリコサンチンアミノ酸配列 の第一および第二領域に対応する可能なコード配列の実質的に全てを含む。すな わち、各縮退プライマーセットは、対応するアミノ酸領域のコード配列とハイブ リッド形成をするのに有効である少な（とも１つのプライマー種を含む。

好適な実施態様において、第一および第二のプライマーセット中のプライマーは 、それぞれ、第一および第二コード領域にハイブリッド形成をすることが意図さ れており、それらは、アミノ酸配列において、種々のＲＩＰｓ、例えばリシンＡ 鎖、アブリンＡ鎖、ポークライード抗ウィルスタンパク質、およびオオムギリボ ゾーム阻害剤中の第一および第二アミノ酸配列に相同するＴＣＳアミノ酸配列を コード化する。２つのプライマーセットは、反復プライマー開始ストランド伸長 法によって、対応するＲＩＰｓのためのゲノムコード配列を得るために使用さＡ ｓｐ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈａ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔ ｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　ＶａｌＰｈｅ工ｌａ　Ｓａｒ 　ｘｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　ＬｙＩ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ 　Ａｒｇ　ＬＹＳ　Ｌｅｕ　ＴｙｒＡｌｌｌｐ工１ｅ　Ｐｒｏ　Ｘｒ＠ｕ　Ｌｅ ｕ　Ａｒｑ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ａｒｑ 　Ｔｙｒ　Ａｌ■ Ｌｅｕ　工１ｅ　ＨＬｓ　Ｌｅｕ　Ｔｂｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　 ＧＬｕ　Ｔｌｕ−工１ｅ　Ｓｉｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　工１ｅＡｓｐ　Ｖａｌ　Ｔ ｈｒ　入Ｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　工１ａ　Ｍｌ！ｔ　ＧＩＹ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　 ｘｌａ　Ｇａｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　５ｅ■ Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｓａｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　 Ｇｌｕ　入１ａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　ＰｈｅＬｙｌ；　Ａｓｐ　 ｘｘａ　Ｍｅｔ　ｐＮｘｑ　ＬＹＳ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ 　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｇ撃■ Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ’Ｇｌｙ　Ｌｙｓ工１ｅ　Ａ ｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ工１ｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＸ、ｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌ ａ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　Ａｌａ工１ｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ 　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　ＡｌａＡｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　 ＡＡＡ　Ｌａｕ　Ｍｌ！ｔ　Ｖａｌ　１Ｌｅｕ工１ｅ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ 　Ｓｅｒ　Ｇｌ■ Ａｌａ　入１ａ　Ａｒｇ　Ｔｙｔ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　工１＊　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　 Ｇｉｎ　工ｌｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　入５ｐＬｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐ ｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｘ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　工１ｅ　工ｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌ ｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ＴｒｐＳｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙ ｓ　Ｇｉｎ　工１ｅ　Ｇｉｎ　工ｌｅ　Ａｌａ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　ｘｓｎ　ｘｓ ｎ　Ｇｌｙ　ＧｉｎＰｈｅ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ 　工ｍｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ 工ｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　八ｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ｖａｌ　Ｖａｌ　 Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　工ｌｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＬｅｕ　Ａｓｎ　Ａ ｒｇ　Ａｓｎ　ｋｓｎ　Ｍｅｔ　Ａｈａを持つ成熟トリコサンチンの官能基特性 を有する組換えトリコサンチンタンパク質は、同様に、本発明の一部を形成して いる。

組換えＴＣＳタンパク質はさらに、配列：Ｍｅｔ工ｌｅ　Ａｘｑ　Ｐｈｅ　Ｌｅ ｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ工１ｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔ、ｅ ｕ　Ｐｈｅ　ＬｅｕＴｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ を有するアミノ末端延長部分： および／または配列： Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　ｋｓｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　 Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｃｙ！ｌ　Ｇｌｙ　５ａ■ Ｔｙｒ　Ａｌａ　！ｌ＠ を有するカルボキシ末端延長部分を含み得る。

本発明はさらに、トリコサンテス（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ）から得られる ＴＣＳの官能基特性を持つトリコサンチンタンパク質を製造するための組換え方 法を包含する。この組換え方法は、ＴＣＳタンパク質をコード化するＤＮＡ配列 を発現ベクターに挿入し、このベクターを用いて適当な宿主を形質転換させ、そ して当該ベクターによって発現された組換えタンパク質を単離することを包含す る。

本発明はさらにトリコサンテス・キリロウイイ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ　 ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ）のりボゾーム不活性化タンパク質多重遺伝子族のいくつか の独特の要素（ｍｅｍｂｅｒｓ）のための核酸およびタンパク質コード配列を含 む。

本発明のこれらのおよび別の目的ならびに特徴は、本発明の以下の詳細な説明が 、添付の図面と共に読まれる時に、より完全に明白になるであろう。

以下の術語は、本明細書において使用される時に次の意味を有する：「トリコサ ンチンタンパク質（ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）　Ｊは、Ｔ 、　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉから得られるα−トリコサンチンと少なくとも約９０％ のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質である。

トリコサンチンタンパク質は、それが、（ａｌＨＩＶ感染Ｔ細胞または単球／マ クロファージにおけるＨＩＶ抗原の発現を選択的に阻害する能力、および／また は（ｂ）タンパク質合成阻害活性を育するならば、トリコサンチン（Ｔｒｉｃｈ ｏｓａｎｔｈｅｓ）から得られるトリコサンチンの官能基特性を育する。

得るための、および細菌発現系において成熟ＴＣＳタンパク質を発現するための 方法を記載する。

Ａ、ＴＣＳアミノ酸配列 ＴＣＳは、「精製されたトリコサンチンおよび精製方法（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｔ ｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔ ｉｏｎ）　Ｊに関する共に所育する特許出願、米国出願第０７／３３３．１８１ 号、１９８９年４月４日出願、に詳述され、そして実施例１に概説されている新 規方法によって精製された。このタンパク質は、ＨＰＬＣおよびゲル電気泳動分 析によって判断すると、少なくとも約９８％純粋であった。

精製したトリコサンチンの一部アミノ酸配列を、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅｓと契約してＹａｌｅ　［Ｊｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　５ｃ ｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅで決定した。この配列は、以前に公表された 配列（下行）と共に第１図に示されている（上行）。２つの配列の間の変動を、 二重に下線を引くことによって注意している。

第１図から理解されるように、本配列は、公表された配列と実質的に異なる。

公表された配列と比較して、最も重要なのは、本ＴＣ３配列は、位置番号６９で １０個のアミノ酸のブロックがなくそして位置番号２２２で２１個のアミノ酸の 付加的な配列を含むことである。本配列は、結晶化ＴＣ３に関するＸ線回折デー タと厳密に一致し、そしてＸ線回折データと以前に公表されたＴＣ３Ｃ１０間の 不一致を解明する。特に２１個のアミノ酸の付加を含む、この新しい配列は、よ り早期に公表された配列よりも、多数のＲＩＰＳ、例えばリシンＡＭおよびアブ リンＡＭ（以下参照）と大きい配列相同性を同様に提供する。

記載した工程を略述している。使用した実際の手順は、実施例２に示されている 配列の選択的増幅を実施するために設計された反応混合物中で少なくとも２セツ トの縮退プライマーと混合する。縮退プライマーのセットを調製する際、ＴＣＳ の２つの離れたアミノ酸領域をコード配列ターゲツティングのために選択した。

選択した２つのアミノ酸配列は、第１図にオーバーラインされており、モしてＡ と示した配列について３５−ｍｅｒ縮退プライマーとそしてＢと示した配列につ いて３２−ｍｅｒ縮退プライマーと関連がある。縮退プライマーの各セットを、 少なくとも１つのプライマー配列が、対応するアミノ酸配列の遺伝情報を指定す るＤＮＡ配列とハイブリッド形成をするのに有効であるように設計した。デオキ シイノシンヌクレオチドを、扱いやすい複雑さの２０のヌクレオチドよりも長い プローブを生成するために取り込んだ（Ｏｈｔｓｕｋａ；　Ｔａｋａｈａｓｈｉ ）。２つのプライマーセットの一方が、１つのコード領域のアンチセンスストラ ンドとのハイブリッド形成のために設計され、そして他方のプライマーセットは 、第二のコード領域のセンスストランドとのハイブリッド形成のために設計され る。

３５−ｍａｒに対応するプライマーセットは１２８の異性体を含みそして、括弧 内に置かれた塩基は混合物を示しモして■はイノシンである一般配列：Ｆ− ＧＡ（Ａ、Ｇ）ＧＣ工ＧＣ工Ｍ　（Ａ、　Ｇ）　ＴＡ　（Ｃ，Ｔ）　ＧＴＴＴＴ 　（Ｃ，Ｔ）　ＡＡ　（Ａ、　Ｇバ込（ｃ、’ｒ）ｃ（工ＡsＧ （Ａ、Ｃ）Ｇ　−３’ からなる。このセットは、ＭＰＱＰ−１と呼称され、モしてＴＣＳコード領域の アンチセンスストランドに結合するために設計された。ＭＰＱＰ−２およびＭＰ ＱＰ−３と呼称される別の２つのプライマーセットは、各々、１２８の異性体か らなりそして共に３２−ｍｅｒの全ポテンシャルコード配列を含みそして、それ ぞれ次の一般配列： ５’−ＣＧ（Ｃ，Ｔ）ＴＴＩＣＣＩＡＴ（Ｃ，Ｔ）ＴＧ（Ｃ，Ｔ）ＴＧ（Ｃ，Ｔ ）ＴＣ工八へ（入、Ｇ）ＡＡ（Ｃ，τ）７丁（Ａ、ＧＩＴＡ　−３’ および ５’−ＣＴ（Ｃ，Ｔ）ＴＴＩＣＣＩＡＴ（Ｃ，ＴＩＴＧ（Ｃ，ＴＩＴＧ（Ｃ，Ｔ ）ＴＣＩＡ’ｌ’（Ａ、Ｇ）Ｍ（Ｃ，Ｔ）ＴＴ（Ａ、Ｇ）ＴＡ　−３’ からなる。それらは、ＴＣＳコード領域のセンスストランドに結合するために設 計され、そして一般に、ＭＰＱＰ−２／−３と呼称されるプライマー混合物にお いて使用された。ＤＮＡ増幅反応は、商業的に供給される供給キット（Ｐｅｒｋ ｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）を用いてそして実施例２に略述したような、製 造業者によって提供された方法に従って、反復プライマー開始ストランド伸長法 によって行われた。ＤＮＡ増幅工程の生産物を、アガロースゲル電気泳動によっ て、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、エチジウムプロミド螢光 および／またはオートラジオグラフィーによって検出して、単離した。約２５５ の塩基対の主生産物が検出された。

第３Ａおよび３Ｂ図は、増幅した材料のＤＮＡ配列、および両方向における３つ の読み枠に全てに対応するアミノ酸配列を示している。下線を引いた翻訳は、Ｔ Ｃ３中のアミノ酸１２８から１６３までに相同する配列を示している。この配列 は、当該領域内で、増幅され得ると予言されモしてＴＣＳまたはＴＣ３様コード 領域が増幅されることが確認された。サザーンプロット分析を、植物組織から調 製されたＤＮＡに関して行い、全ＤＮＡ背景（ｂａｃｋｇｒｏｊｎｄ）における ＴＣ３遺伝子の組織および複雑さを判断した。サザーンプロットを、１Ｐ−標識 ＭＰＱＰ−１およびＭＰＱＰ−２／−３を用いて別々に綿密に調べた。この結果 （示さず）は、いくつかのＴＣ３関連遺伝子が存在するかもしれないこと、およ び植物ゲノムの総体的複雑さが、哺乳類ゲノムに類しておりそして標準λ−ファ ージバンクを用いて有効に選別され得ることを示唆した。第２図に略述した方法 と連続した関連で、上からの増幅したコード配列をプローブとして使用して、Ｔ ＣＳコード配列を含むｌまたはそれ以上のＴ、　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉゲノムライ ブラリークローンを同定した。ゲノムライブラリークローンを、実施例２に概説 したように、慣用的に調製しそして綿密に調べた。クローニング系の製造業者に よって供給されたプロトコールに従って、２つの明らかに陽性のプラークを選び 取り、増幅しそしてプラスミドに変換した。ｐＱ２　ＬＤと呼称された一方のク ローンは、約４ｋｂの挿入断片を含んでおり；ｐＱ３０Ｅと呼称されたもう一方 のものは、約０．６ｋｂの挿入断片を含んでいた。Ｉ）Ｑ２１Ｄベクターは、Ａ ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１２３ ０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州 、　２０８５２に寄託されており、そしてＡＴＣ１６７９０７によって識別され ている。部分的な配列分析は、４ｋｂの挿入断片が、第１図において植物由来の ＴＣＳについて示された同一のアミノ酸配列を実質的に有するタンパク質の遺伝 情報を指定した配列を含んでいることを示した。０．６ｋｂの挿入断片は、植物 由来のＴＣＳに相同するが同一ではないペプチドをコード化する配列を含むこと が見出された。ｐＱ２１Ｄの挿入断片のための完全な配列が決定されそして、Ｔ ＣＳの対応するアミノ酸配列と一緒に、第４図に示されている。この図において 見出されるように、該配列は、２つの保存的な変化（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ 　ｃｈａｎｇｅ）−−アミノ酸位置２１１のＳｅｒの代わりのＴｈｒおよび位置 ２２４のＴｈｒの代わりのＭｅｔを除いて、植物由来のＴＣＳの配列と一致した 連続アミノ酸配列を含むタンパク質をコード化している。２つの配列の間の軽微 な相違は、おそらく異なるＴ、　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ株の間の変動に関連がある であろう。精製したＴＣＳは、中国の広東州からのＴ、　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉの 根から得られたニゲツムＤＮＡは、韓国からのＴ、　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉの葉か ら得られた。

これらの保守的な配列変動は、官能基的に同等のトリコサンチンタンパク質を生 じる、株関連のＤＮＡ配列の変化を説明している。成熟した植物由来のＴＣＳの アミノ酸配列（第１図）および第４図中のＤＮＡによってコード化されたものと の比較は、ＴＣＳが、アミノおよびカルボキシの両末端で翻訳後処理（ｐｏｓｔ −ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を受ける分泌タンパク 質としておそらく生産されることを示す。特に、３４０から４０８までのヌクレ オチドは、配列：ａｃｔ　ＺＬｅ　ｘｒｇ　Ｐｈ台′ｘＡｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　シｕ工ｌ會Ｌ＠ｕτｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕｒｈｒ　Ｔ ｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇａｙを有する推定上の分泌シグナル ペプチドの遺伝情報を指定している。

第１０図から理解できるように、トリコサンチンコード配列のこれらの最初の２ ３のアミノ酸は、分泌シグナルの特徴的な疎水性を有する。従って、この配列を コード化している核酸は、当該配列が相同分泌シグナルを提供するであろうから 、植物細胞中でトリコサンチンタンパク質を発現する時に有用であろう。さらに 、非相同発現系（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔ ｅｍ）において生産される、５゜先導配列を保持する組換えトリコサンチンタン パク質は、アッセイにおける基質として使用されて先導配列プロセッシング酵素 活性を同定することができる。２３のアミノ酸配列それ自体は、抗原として使用 されて、例えば、植物細胞におけ１１５０から１２０６までのヌクレオチドは、 成熟タンパク質中に存在しない推定上のカルボキシ末端延長部分の遺伝情報を指 定しており、そしてそれは、配列： 入Ｌａ　Ｍｅｔ　入ｓｐ　Ａｓｐ　入ｓｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　 Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　５ｅｒＴＹ！−Ａｌａ　！ ｌａ を育している。

アミノ末端延長部分について上述したように、カルボキシ末端延長部分も同様に 植物細胞中でのトリコサンチンタンパク質の発現に有用であろう。カルボキシ末 端延長部分の役割はまだ決定されていないが、このペプチドは、細胞分泌の前の ペプチドのリボゾーム阻害活性をなくする作用をするかもしれない：この配列を 保有するトリコサンチンタンパク質、またはこの配列の変化は、このタンパク質 延長部分の機能を明確に定めるのに有用であろう。同様に、カルボキシ末端配列 それ自体は、抗原として使用されて、例えば、植物細胞中の生体内タンパク質成 熟工程を調査する抗体を発生させることができる。

−面によれば、本発明は、トリコサンチン（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ）から 得られるＴＣＳの官能基特性を有するトリコサンチンタンパク質をコード化する 核酸を包含する。核酸は好ましくは、配列の塩基対４０９〜１１４９がＴ、　ｋ ｉｒｉｌｏｗｉｔからの成熟ＴＣ３の遺伝情報を指定している、第４図に示す配 列を有する。本発明の核酸は： （ａ）　Ｔ、　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉからの成熟トリコサンチンをコード化する塩 基対４０９〜１１４９； （ｂ）　（ａ）に加えて、Ｔ、　ｋｊｒｉｌｏｗｉｉからのトリコサンチンの成 熟形の推定上のアミノ末端延長部分をコード化する塩基対３４０〜４０８：（Ｃ ）　（ａ）に加えて、Ｔ、　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉからのトリコサンチンの成熟形 の推定上のカルボキシ末端延長部分をコード化する塩基対１１５０〜１２０６． および（ｄ）　融合タンパク質上に細胞表面認識特性を授与するりガントペプチ ドを有する融合タンパク質をコード化する、リガンドコード配列と接合したＴＣ Ｓコード配列 を含み得る。

Ｃ１発現組換えＴＣＳタンパク質 組換えＴＣＳを、上記ＴＣＳコード配列を用いて、第４図および第５図に略述し た、そして実施例５に記載した工程に従って生産した。第５図と関連して、上か らのプラスミドｐＱ２１Ｄを旦且旦Ｒ１およびＮｃｏｌを用いて消化し、その際 ＴＣ３のための完全なコード配列を含む］、２ｋｂのフラグメント挿入断片を遊 離させた。このＴＣＳコードフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩで予め 消化したプラスミドｐＫＫ２３３−２にクローン化した。複製後、ｐＱ２１Ｄ／ ’Ｉ）ＫＫ２３３−２と呼称された組換えプラスミドを２つの試料に分けた。一 方の試料を、旦ｃｏＲＩおよびＳａユｊで消化し、そして第２の試料をＳａ上■ およびＮｃ旦■で消化して旦ｃｏＲＩ／５ａｌＩアミノ部分フラグメントおよび 旦ａｌｌ／Ｎｃｏｌカルボキシ部分フラグメントを生成した。第５図に説明した ように、２つのフラグメントを、部位特異的変異誘発のためにＭ１３ファージベ クターにクローン化し、成熟ＴＣＳコード配列のアミノ末端にＡＴＧ開始コドン を含むＮｃｏＩ部位、そして成熟配列のカルボキシ末端の後ろにＨｉｎｄＩＩＩ クローニング部位に加えて二重のＴＡＡ翻訳終止配列を置いた。

当該修飾配列を、変異誘発したクローンから切り取り、そして、ＮｃｏＩ部位の 中に含まれるＡＴＧ開始コドンの前に同様に適切に置かれたりボゾーム結合部位 の前に適切に置かれた合成ｔｒｐ／Ｉａｃプロモーターを含むＩ）ＫＫ２３３− ２発現ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に共にクローン化した。い（つかのクロ ーンが確認されそして正しい向きで修飾された挿入断片を含むことが確かめられ た。修飾領域のＤＮＡ配列が、ｐＱＲ１９と呼称される１つのクローンについて 直接確かめられた。

より一般的に、ｐＱＲ１９発現ベクターは、適当な宿主におけるＴＣ３発現のた めの発現ベクターの中に有効に置かれたＴＣＳコード配列の適例となる。好適な 実施態様において、そしてｐＱＲ１９によって例示されたされたように、発現ベ クター構築物は、プロモーター、リボゾーム結合部位、および成熟ＴＣ３のアミ ノ末端コドンの前にかつに隣接して置かれたＡＴＧ開始コドン、および成熟ＴＣ ３のカルボキシ末端コドンの後にかつに隣接して置かれた終止コドンを含む。

組換えＴＣＳ　（ｒＴＣ３）の発現のために、プラスミドｐＱＲ１９および類似 のクローンを、合成エニ２−よａＣプロモーターの調節のために１ａｃｌｑを運 ぶ適当な大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）宿主株中で増殖させた（ｐｒｏｐａｇａｔｅ ）　ｏ宿主株ＸＬ−ＩＢ　１　ｕ　ｅ　（ＢｕｌＬｏｃｋ）が使用された。その 適切な遺伝子型は、ｒｅ旦Ａ１．　ｅｎｄＡＩ、ｇｙｒＡ９６．旦ｔｉ、ｈｓｄ Ｒ１７（ｒｋ＋、ｍｋ＋）、５ｕｐＥ４４、二匹Ａ１．λ−１Ｌ匹−［Ｆ’、ｐ ｒｏＡＢ、お匹１ｑＺΔＭ１５゜Ｔｈ１Ｏ（ｔｅｔＪ］である。プロモーター活 性の誘発は、５ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド（ｉｓｏｐｕｒ ｏｐｙｌ　ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ））を添加することによってなし遂 げられ得る。実施例３に記載した培養条件下で、ｐＱＲ１９および同様のプラス ミドを運ぶ細胞を誘発しそして、選択した細胞密度で、当該細胞を取り出しそし て音波処理によって粉砕する。全細胞原料の、５分間で１５，０００×ｇで小球 形にした材料の、そして５分間１５．ＯＯＯＸｇで溶液状態で残った材料のアリ コートを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってそして次にＷｅＳｔｅｒｎ プロット分析によって分析した。ＷｅＳｔｅｒｎプロットを、ラビットの抗ＴＣ ８血清を用いて綿密に調べた。

結果は、ｐＱＲ１９／ＸＬ　１−ｂ　１　ｕ　ｅ誘発細胞からの全細胞および可 溶性細胞フラクション中に真正ＴＣＳと共に泳動する（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｅ） 免疫反応性生産物を示したが、同一細胞からの不溶性フラクション中でも、ｐＫ Ｋ２３３−２　（ベクター）／ＸＬＩ−ｂｌｕｅ誘発細胞、すなわちＴＣＳコー ド挿入断片のないｐＫＫ２３３発現ベクターを含む細胞からのいかなるフラクシ ョン中でも示さなかった。

ＴＣＳコード配列を含む、そして適当な細胞宿主中でｒＴＣＳを発現するｐＱＲ １９発現ベクターは、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ ｅｃｔｉｏｎに寄託されておりそしてＡＴＣＣＮα６７９０８によって識別され る。清澄にした細胞抽出物材料を、実施例１に記載した工程を用いて分別し、そ の際、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上でＣｏｏｍａｓｓｉｅブルーを用いるゲ ルバンド染色法によって判断されるように、９０％より高い純度を有するｒＴＣ Ｓを産した。約９ｍｇの精製したｒＴＣＳが９リツトルの培養から得られた。

生産されたｒＴＣＳタンパク質は、第４図に示したアミノ酸配列から得られるｒ ＴＣＳタンパク質の適例となる。より一般的に、本発明のｒＴＣＳタンパク質は 、上述したように、成熟ＴＣＳのための完全なアミノ酸配列を含む組換えタンパ ク質、および配列： Ｍ１工１ｅ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｌａ ｕ工１ｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　ｌ’ｈｅ　Ｌｅｕτｈｒ　丁ｈｒ　Ｐｔｏ 　入１ａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙを育するアミノ末端延長部分および／または 配列：入１ａ　Ｍｅセ入ｓｐ　入ｓｐ　Ａｓｐ　ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｔｈ ｒ　Ｇｉｎ　Ｓａｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　５ｅｒＴｙｒ入１＆　 工１ｅ を有するカルボキシ末端延長部分を含む組換えＴＣＳタンパク質を含む。

従って、本発明はさらに、トリコサンチン（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ）から 得られるトリコサンチンの官能基特性を有するトリコサンチンタンパク質を生産 するための組換え方法を包含する。この方法は、当該タンパク質をコード化する ＤＮＡ配列を発現ベクターに挿入し、そのベクターで適当な宿主を形質転換し、 そしてそのベクターによって発現された組換えタンパク質を単離する工程を含む 。

１つの好適な実施態様において、発現ベクターはｐＱＲ１９でありそして宿主上 で引用した米国特許第４．７９５．７３９号に既に記載されているように、Ｔ、 　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉから得られるＴＣＳは、ＨＩＶ感染Ｔ細胞および単球／マ クロファージ中での、ＨＩＶ抗原発現の、効力のあるそして選択的な阻害剤であ る。ＨＩＶ感染Ｔ細胞中でのＨＩＶ特異抗原の発現に対するｒＴＣＳの阻害効果 は次のように証明され得る。急性のＨＩＶ感染ヒトＴ細胞を、変化する濃度のｒ ＴＣＳで処理した。４日培養の後、無細胞培養上溝中に存在するＨＩＶｐ２４抗 原の量を、商業的に入手できる抗原捕獲イムノアッセイ（ａｎｔｉｇｅｎ　ｃａ ｐｔｕｒｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙＸＣｏｕｌ　ｔｅｒ）を用いて定量した。

阻害を、処理した培養および未処理の培養に関する結果を比較することによりめ た。

実施例４Ａ中に詳述されたウィルス阻害研究は、植物生産ＴＣＳの阻害活性を上 述のｒＴＣＳタンパク質と比較した。第６図中のプロットは、植物由来ＴＣ３（ クローズド・ボックス）および上述したように生産したｒＴＣＳ　（オーブン・ ボックス）の培養濃度の関数としてｐ２４ＨＩＶ抗原生産の阻害率を示している 。見出されるように、両タンパク質は、より高いタンパク質濃度で同一レベルの 阻害を実質的に与えるが、植物由来のタンパク質は最も低いタンパク質濃度でよ り有効である。

同様に、上述したように、植物生産ＴＣ３は、無細胞溶解物系におけるタンパク 質合成の効力のある阻害剤である。植物生産ＴＣ３およびｒＴＣＳの両方のタン パク質合成阻害特性を、実施例４Ｂに略述したように、ラビット網赤血球溶解物 系において比較した。第７図におけるプロットは、ラビット網赤血球形中の植物 由来ＴＣＳ　（クローズド・ボックス）およびｒＴＣＳ　（オーブン・ボックス ）の濃度の関数として、１Ｈ−ロイシン取込みの阻害率を示す。このプロットは 、植物生産および組換えＴＣＳの両方が実質的に同一の特異的タンパク質合成阻 害活性を有することを示している。

構造−機能関係を明らかにすることに向けられた、α−ＴＣ３の変異分析を容易 にし、モしてＨＩＶ複製の遮断における作用のα−ＴＣ３機構の理解を改善する ために、α−ＴＣＳのための合成遺伝子を構成した（実施例６、第１４図）。

当該合成遺伝子は、２０〜９０ｂｐ間隔で配置された独特の制限部位を含み（第 １１図）、従って、カセット置換による変異の簡便な導入を可能にする。合成遺 伝子のための核酸配列を、成熟α−トリコサンチンタンパク質配列の一部アミノ 酸配列に対応する核酸コドンを割り当てる（ａｓｓｉｇｎ）ことにより創造した 。従って、合成遺伝子の翻訳生産物は、成熟α−トリコサンチン（α−ＴＣＳ） タンパク質配列に対応している。

エネルギーを最小にしたα−ＴＣ３のための分子モデルが、−次アミノ酸配列を リシンＡＭ、関連したＲＩＰのための既知の結晶学上の構造に適合させることに よって生成されている。このモデルによっておよびリシンＡＭおよび別のＲＩＰ ｓを用いたペプチド配列相同アラインメントによって案内されて、推定上の活性 部位のくぼみに存在するＲＩＰ不変残基が決定さた。２つのこれらの部位、α− ＴＣＳペプチド配列のＧ１ｕ１６０およびＡｒｇ１６３は、ａ−ＴＣＳの翻訳阻 害および抗ＨＩＶ−１複製活性に対するそれらの関係を評価するために修飾され ている。これらの変異は、Ｇ１ｕ１６０およびＡｒｇ１６３を、それぞれＡｓｐ およびＬｙｓに変えた。これらの改変の一方または両方を含むタンパク質を大腸 菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）中で発現し、そしてほぼ９５％の均一性になるまで精製し た（実施例６）。これらの変異によるタンパク質と、合成遺伝子から作られた未 修飾り球系における試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）翻訳を阻害するそしてＨＴＶ −１感染Ｔ細胞におけるｐ２４抗原の生産を減するそれらの能力について、比較 した。

未修飾タンパク質と比較した時、二重に修飾された変異体（ＤＫ　１２）は、試 験管内翻訳の阻害でほとんど３１ｏｇの、より低い活性であること（第１５図） およびｐ２４生産阻害で１１０ｇより高い、より低い活性であることがわかった 。単修飾変異体は、ＤＫ１２およびＫＱＳに対して、翻訳およびｐ２４生産の両 方の阻害について、中間の活性を示した。付加的な変異によるタンパク質が生産 されておりそれはα−ＴＣ３分子中の別のＲＩＰ不変残基の機能を調査すること を可能にするであろう。

上述した合成遺伝子は、α−トリコサンチンタンパク質の変異体を生成する道具 を提供する。これらのタンパク質を、野性型タンパク質のりボゾーム阻害および ／またはＨＩＶ−１阻害活性に影響を及ぼすより低い活性のおよびより高い活性 の変異体について、上述したように、選別することができる。

Ｆ、ＴＣ３融合タンパク質 別の面において、本発明は、融合リガンド／ＴＣＳタンパク質を形成するために そのアミノまたはカルボキシ末端でリガンドペプチドと融合したＴＣＳを含む。

融合したタンパク質を構成するＴＣＳは、上述したように、好ましくはｒＴＣＳ またはその生物活性部分である。

ＴＣＳをＨＩＶ感染ヒト細胞におけるウィルス発現を阻害するために使用する場 合、当該タンパク質を有利には、ＨＩＶ感染細胞の表面に存在するＨＩＶ関連ｇ ｐ１２０抗原に対する特異的結合を示す可溶性ＣＤ４ペプチドと、またはＨＩＶ 特異的細胞表面抗原に対する特異的なモノクロナール抗体と融合し得る。

融合ＴＣＳタンパク質は、化学的共役（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によってまた は組換え技術によって形成され得る。前者の用法において、ペプチドおよびＴＣ Ｓは、共有付着のための慣用のカップリング剤によって修飾される（ｍｏｄｉｆ ｙ）。可溶性ＣＤ４をＴＣＳにカップリングするための１つの典型的な方法にお いて、組換えＣＤ４（ｒＣＤ４）を、Ｎ−スクシンイミジル−８−アセチルチオ アセタート（Ｄｕｎｃａ、ｎ）を用いて誘導体に変え（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅ） 、その際チオール化（ｔｈｉｏｌａｔｅｄ）　ｒ　ＣＤ　４を産する。次に当該 活性化ＣＤ４化合物を、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ビリジルジチオ）プロ ピオナート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔ ｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）（Ｃｕｍｂｅｒ）で誘導体に変えたＴＣＳと反 応し、ジスルフィド結合を通じて接合した融合タンパク質を生産する。

別の方法として、組換えＴＣＳ　（ｒＴＣＳ）をシスティン残基を用いて調製し てｒＴＣＳを活性リガンドにジスルフィドカップリングさせることができ、その 際従ってカップリング反応を簡単にする。ｒＴＣＳの生産のために使用されるＴ Ｃ３発現発現パターンー特異的変異誘発の標準方法に従って内部のまたは末端の システィンコドンを挿入するために修飾され得る。

好ましい方法において、当該融合タンパク質は、発現ベクターを用いて組換えで 調製され、その際、融合タンパク質のコード配列がＴＣＳコード配列に接合され る。第８図は、融合ＴＣＳ／ＣＤ４タンパク質のための典型的な発現ベクターの 構造を図解している。

手短に言えば、有効にｇｐ１２０を結合し得る、成熟ＣＤ４ペプチドの最初の− ジに挿入し次いで、−重鎖形にある当該ベクターをプライマー突然変異誘発にさ らす。つまり、ＣＤ４遺伝子のアミノ末端部分は、プライマーＭＰＩＯＩ（５’ 　−ＣＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＧＣ；ＧＡＡＡＣＡＡＡＧ　−３°）で修飾 される：そして遺伝子のカルボキシ部分はプライマーＭＰ１０２　（５’　−て 修飾される。これらの修飾は、第８図に説明されているように、成熟ＣＤベプ果 の組換えを、ＣＤ４配列挿入断片の適切な向きについて制限分析によって確認す る。

上述したように形成した、そして第８図にｐＱＲ／ＣＤ４と呼称される発現ベク ターは、（ａｌＮ　ｃ　ｏ　１部位の中に含まれるＡＴＧ開始コドンの前に同様 に適切に置かれたりボゾームの結合部位の前に適切に置かれた合成ｔｒｐ／ｌａ ｃプロモーター、（ｂ）ＣＤ４コ一ド配列、（Ｃ）１０プロリン残基の遺伝情報 を指定するスペーサー、それはＣＤ４およびＴＣＳＣＳタンバク分を一定の間隔 をおいて並べている、（ｄ）成熟ＴＣ３のためのコード配列および（ｅ）成熟Ｔ Ｃ３のカルボキシ末端コドンに隣接して置かれた終止コドンを含む。当該方法は 一般に、前に記載したように、可溶性ＣＤ４を、プソイドモナス・エキソトキシ ンＡ（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｅｘｏｔｏｘｉｎＡ）のドメイン２および３に 融合する際に使用される方法に続く。

プラスミドｐＱＲ１９／ＣＤ４を、上述したような融合ＴＣＳタンパク質の発現 について分析する。手短に言えば、発現ベクターを、所望の細胞密度までＩＰＴ Ｇ誘発条件下で適当な細菌宿主中で培養する。この細胞を取り出し、音波処理に よって粉砕し、そして細胞材料を遠心分離により清澄にする。清澄にした材料を 、（ａ）ＣＤリガンド結合活性を確認するために、ｇｐ１２０抗原への結合、お よび（ｂ）ＴＣ３酵素活性を確認するために、リボゾーム阻害活性、について試 験する。当該タンパク質は、必要であれば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動分 離および／またはＨＰＬＣクロマトグラフィーによる付加的な精製を用いて、モ レキュラーシーブおよびイオン交換クロマトグラフィ一方法によって精製される ことができる。

上述したことから、別のリガンド／ＴＣＳ包含融合タンパク質がどのように調製 され得るかが認識されるであろう。上記融合に関する１つの変化は、融合タンパ ク質におけるＣＤ４および７０３分子の位置を交換することである。

ＩＩｌ、）リコサンテス・キリロウィイ・マキシム（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅ ｓ　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉＭａｘｉｍ）中の多重遺伝子族から誘導されるリボゾー ム不活性化タンパク質のゲノムクローニング ２つの■型すボゾーム不活性化タンパク質（ＲＩ　Ｐ’）が、植物のトリコサン テス・キリロウィイーｖキシム（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｓ　ｋｉｌｉｌｏｗ ｉｉ　Ｍａｘｉｍ）から単離されている：（１）塊根から単離されたα−トリコ サンチン（Ｌａｗ、　Ｙｅｕｎｇ）　；および（２）種子から単離されたトリコ キリン（ｔｒｉｃｈｏｋｉｒｉｎＸＣａｓｓｅｌａｓ）　ｏ上述したように、α −トリコサンチンに関連した、Ｉ）Ｑ２１ＤおよびｐＱ３０Ｅと呼称される、２ つのクローン化配列が、Ｔ、　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉのゲノムから単離されている 。ｐＱ３０Ｅのための完全な長さのクローンを単離する努力において、５ｐｅｌ λＺＡＰ　Ｔ　Ｉゲノムライブラリーを構成した（実施例７）。このライブラリ ーを、クローンｐＱ３０Ｅからの完全なＥｃｏＲＩ挿入断片を用いて（第１６図 ）低い緊縮（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件下で綿密に調べた。陽性のハイブリッ ド形成反応によって同定された２１のクローン化挿入断片の中（実施例７）、異 なる制限消化パターンを示す５つのクローンを、完全なりＮＡ配列分析のために 選択した；これらのクローン化挿入断片の中の２つは同一の配列を有していた。

ｐＱ２、ｐＱ３、ｐＱ１２およびｐＱ２４と呼称される、４つの独特のクローン 化挿入断片も同様に同定された；それぞれの挿入断片は推定上の完全な長さのＲ ＩＦタンパク質をコード化していた（第１７図〜第２０図）。

ＤＮＡ配列およびタンパク質アラインメント分析は、挿入コード配列が、部分群 （ｓｕｂ−ｇｒｏｕｐｓ）間で５８％〜７５％、そして各部分群内で〉９０％の 範囲にあるアミノ酸配列類似点を育する３つの部分群に分かれていることを示し た（第２１図）。ｐＱ２１Ｄとの比較およびアラインメントにより、当該挿入コ ード配列は次の特徴を含む：１）各挿入断片配列は、２３のアミノ酸の推定上の シグナルペプチド、および１１０または１９のアミノ酸からなるカルボキシ末端 延長部分を有する前プロタンパク質（ｐｒｅ−ｐｒｏ　ｐｒｏｔｅｉｎ）をコー ド化している；２）各挿入断片配列は、ＲＩＰｓについて特育であるアミノ酸残 基を含んでいる；３）対応するタンパク質は、０および４の間に効力のあるＮ一 連結グリコシル化部位を所有しそして９．６〜９．９の推定された（ｃａｌｃｕ ｌａｔｅｄ）ｐ　Ｉ’　ｓを育している；４）タンパク質の予測された大きさは 、２４７〜２４８のアミノ酸残基である；そし、て、５）このタンパク質は、ス プライシングされていない（ｕｎｓｐｌ　１ｃｅｄ）メツセージから翻訳されて いるｍ−クローンのいずれにも介在配列は存在しない。

上に提供したデータから、トリコサンテス・キリロウイイ・マキシムのゲノムは 、多重りボゾーム不活性化タンパク質をコード化する多重遺伝子族を含むことこ の多重遺伝子族のメンバーのコード配列は、例えば、トリコサンナス中の遺伝子 族の付加的なメンバーを同定するためにまたは別の植物中の相同遺伝子を同定す るためにプローブとして使用されることができる。多重遺伝子群コード配列に対 応するタンパク質は、細菌発現系中で発現され得ることができ（α−トリコサン チンについて上述したように）、そして当該タンパク質は（１）当該タンパク質 のりボゾーム不活性化および抗ＨＩＶ−Ｔ特性を調査する、および、（２）トリ コサンデス組織中のタンパク質の発現パターンを調査するために使用され得る抗 体を生成するために使用されることができる。

第２２図は、トリコサンテス・キリロウイイのりボゾーム不活性化タンパク質多 重遺伝子族の表示である。各部位でのアミノ酸残基の縦の欄は、その族の既知の 遺伝子の全てのコード配列の比較に基づいて、その部位での容認できる置換を示 している（実施例７、第２１図）。例えば、第２２図において、最初のアミノ酸 残基はＭであり、ＩまたはＮが続き、Ｒが続き、Ｆが続き、Ｌ、　Ｐ、またはＳ が続くなどである。核酸コード配列は、第２２図から引き出されるタンノくり質 コード配列について決定されることができそしてプローブまたは合成遺伝子が、 α−ＴＣＳのための段落ＩＩ−Ｅにおいて、上述した選択されたタンノくり質コ ード配列のために合成されることができる。当該プローブは、例えば、トリコサ ンナス中のりボゾーム不活性化タンパク質遺伝子族の付加的なメンバーを同定す るためにまたは別の植物中の相同遺伝子を同定するために使用され得る。当該合 成遺伝子は、選択されたタンパク質コード配列を組換えで発現するために使用さ れ得る二次にこのタンパク質のりボゾーム不活性化および抗ＨＩＶ−Ｉ特性が調 査さ上述したように、ＴＣＳのコード配列を、ＴＣＳコード領域の選択的増幅に よって、ゲノムＤＮＡ中のＴＣＳコード配列の離れたコード領域に結合するため の縮退プライマーのセットを用いて、得た。この段落は、種々のＲＩＰｓのため のコード配列の選択的増幅のために縮退プライマーのこのようなセ・ソトを使用 することを記載している。

適当なプライマーのセットを選択する際、ＴＣＳおよびｌまたはそれ以上のＲＩ Ｐｓのアミノ酸配列を、配列相同の領域、即ち、アミノ酸配列が同一であるかま たはせいぜいｌまたは２のアミノ酸残基によって異なる領域について調査する。

一般的に、調査される領域の長さは、総体的な複雑さが増大されるにもかかわら ず、より長いオリゴヌクレオチドブライマーが好ましいことが認識されるとはい え、少なくとも約７つのアミノ酸、即ち、少なくも約２０のヌクレオチドを含む べきである。

第９図は、ＴＣＳ　（、最上行）、およびその配列が公表されている３つのＲＩ ＰＳの完全なアミノ酸配列を示している。ＲＩＰｓはリシンＡ鎖（ｒ　ｉ　ｃＡ 　：Ｌａｍｂ）、アブリンＡ１１ｌ　（ａ　ｂ　ｒ　Ａ　；　Ｆｕｎａｔｓｕ） およびオオムギタンパク質合成阻害剤（Ｂ　Ｐ　Ｓ　Ｔ　；　Ａｓａｎｏ）、お よびＭｉｒａｂｉｌｌｉｓ抗ウィルスタンパク質つＭ　Ｉ　ＲＡ　：Ｈａｂｕｋ ａ）である。当該アミノ酸は、慣用の一文字コードによって示されている。４つ のタンパク質の間でのアミノ酸の一致には陰がつけられている。

この図から理解されるように、各々少なくとも７つのアミノ酸を含む、いくつか の領域が存在し、それは、当該タンパク質の間のアミノ酸配列相同の高い度合い 、すなわち７のアミノ酸位置の中の少なくとも約４において一致している配列を 示している。ＴＣＳ、リシンＡおよびアブリンＡ鎖は全て双子葉植物から得られ 、そしてオオムギ阻害剤は単子葉植物から得られるので、オオムギタンパク質合 成阻害剤と比べて、ＴＣＳ、リシンＡ鎖およびアブリンＡ鎖の間の相対的により 大きい相同は、おそらく進化的な分岐を反映しているであろう。

第９図における上方の行中のアミノ酸６３〜７０からの配列を考慮すると、アブ リンＡｌｌのためのアミノ酸配列−−ＧＩＤＶＴＮＡＹ−−は、対応するＴＣＳ およびリシンＡ鎖配列と、各々２つのアミノ酸のみによって異なり、そしてそれ 故プライマーセットの設計のための育望な選択である。この配列領域の欠点は、 リシンＡ鎖中のロイシン残基（Ｌ）の存在が、この配列中のその点での６重の縮 重（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）を導入することである。しかしながら、この問題は 、イノシン（■）が各コドン中の第３のおよび／または第１の位置において使用 されて縮重を減するならば、禁止的でない。同じ６３〜７０のアミノ酸領域にお けるアブリン配列は、対応するＴＣＳと、第一の位置におけるアラニンからグリ シンへの置換によって、異なる。Ｇ　（Ｇ、　Ｃ）　Ｎ配列、但しＮは４つのヌ クレオチド全てである、がアラニンおよびグリシンコドンの両方でハイブリッド 形成をするであろうから、当該プライマーをこの位置で付加的な２重の縮重にし てＴＣＳおよびアブリンコード配列の両方を包含する（ｅｎｃｏｍｐａｓｓ）こ とができる。アブリン配列は同様にＴＣＳ配列と、第７の位置におけるバリンか らアラニンへの置換によって異なる。この位置での付加的な２重の縮重によって 、全ての可能なバリンおよびアラニンコドン、すなわち、Ｇ　（Ｃ，Ｔ）Ｎの原 因となると推定され得る。

同様に、この領域中のアブリン配列は、対応するりシンＡ鎖配列と、第一のアミ ノ酸位置での同一のアラニンからグリシンへの置換によって異なる。さらに、ア ブリン配列は、リシン配列と、第二の位置におけるイソロイシンからロイシンへ の置換によって異なる。ＩＴＩ配列は、イソロイシンおよびロイシンコドンの全 てとハイブリッド形成をするであろうから、プライマー縮重はこの位置で標準化 され得る。好ましくは、別の５つのアミノ酸位置を縮重にして、対応するゲノム コード領域に結合するプライマーの特異性を最善の状態にする。最終のプライマ ーセットの中のプライマーの全数は、より複雑な混合物が使用され得るとはいえ 、約１６〜１２８の間が好ましい。当該プライマーは、商業的に入手できる器具 を用いて慣用的に合成される。

アミノ酸配列においてＲＩＰｓに相同するＴＣＳの別の領域からの縮退プライマ ーの第二のセットが同様に構成される。

この２つのプライマーセットは、選択した植物源からのゲノムＤＮＡ中に存在す るＲＩＰコード配列を選択的に増幅するための方法において宵月であり、その際 、反復プライマー開始核酸増幅を用いる。−例として、アブリンＡ鎖のためのコ ード配列を増幅するために、実施例２に略述したように、Ａｂｒｕｓ　ｐｒｅｃ ａｔｏｒｉｕｓからのゲノムＤＮＡを単離し、そしてこのプライマーセット、４ つのデオキシヌクレオシドトリホスファート全て、およびポリメラーゼと混合す る。プライマー結合およびストランド延長のサイクルを繰り返した後、実施例２ に記載した手順に従って、材料をゲル電気泳動によって分別しそして増幅したフ ラグメントを、例えば、エチジウムプロミド染色によってまたはオートラジオグ ラフィーによって同定する。特異的プライマーセットの選択が、増幅するフラグ メントの大きさの範囲を予示するであろうから、ＲＩＰ遺伝子から増幅したフラ グメントは、大きさによって同定され得る。ＲＩＰｓのための遺伝子は、いかな る介在配列をも含まないと思う（Ｍａｉｌｉｎｇおよび本出願）。

次いで増幅材料を、植物源、例えば、Ａｂｒｕｓ　ｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓから のゲノムＤＮＡから調製されるゲノムライブラリークローンを検出するための（ 放射能標議）プローブとして使用する。同定したライブラリークローンを、上述 したように、完全なＲＩＰコード配列を含むフラグメントについて分析する。あ るいは、当該コード配列のアミノおよびカルボキシ部分を含む重複ゲノムライブ ラリーフラグメントを結合して完全なコード配列を生産することができる。次に このコード配列の特性を、上で概説したように試験してリボゾーム阻害特性およ び／または抗ウイルス特性を決定する。さらに、これらの核酸コード配列をプロ ーブとして使用して付加的なＲＩＰ配列を同定することができる。

より一般的に、本発明のこの面は、プライマー混合物およびＲＩＰコード配列を 選択的に増幅するために当該混合物を使用する方法を包含する。このプライマー 混合物は、センスストランド縮退プライマーの第一のセット、およびアンチセン スプライマーの第二のセットを含み、その際、各々のセットは、ＲＩＰｓ、特に 双子葉植物からのＲＩＰｓとアミノ酸相同の領域をコード化するＴＣ３中の対応 するコード配列とハイブリッド形成をするのに有効である少なくとも１つのプラ イマー配列を含む。

リボゾーム不活性化タンパク質の増幅したゲノム配列を得さえすれば、この配列 を、所望のＲＩＦ’コード配列を含むゲノムライブラリーフラグメントのための プローブとして使用することができる。次いで、これらのゲノムフラグメントか ら発現したタンパク質生産物を、ＴＣＳについて上述したようなりボゾーム阻害 活性および／または抗ウィルス活性について試験することができる。この方法を 使用して、既知のＲＩＰｓを生産する植物からのコード配列を得ること、および 同様に未だ未知のＲＩＰまたはＲ１様タンパク質をコード化する遺伝子の存在の ために別の植物を選別することができることが認識されるであろう。

次の実施例は、上述した天然のコード配列および組換えタンパク質を得てそして 立証するために使用する種々の方法を説明している。これらの実施例は、本発明 の詳細な説明するが決して限定することが意図されていない。

Ｔ、　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ塊根を中華人民共和国の広東州から入手した。Ｔ、　 ｋｉｒｉｌｏｗｉｉの葉を韓国から入手しそして集めてそして輸送のためにドラ イアイス上でただちに凍結した。次いで、試料を一７０℃で貯蔵した。

ＱＡＥ　Ｚｅｔａｐｒｅｐ　（商標）アニオン交換カートリッジおよびＳＰ　Ｚ ｅｔａｐｒｅｐ（商標）カチオン交換カートリッジはＡＭＰ　Ｃｕｎｏ　Ｃｏｒ ｐ、　（Ｍｅｒｉｄａｎ、コネチカット州）によって供給された：そして　Ｐｅ ｔ　１ｉｃｏｎ限外濾過膜（１０，０００ＭＷカットオフ）は、Ｍｉｌｌｉｐｏ ｒｅ　Ｃｏｒｐ、　（Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ｖサチューセッツ州）から供給された 。

Ｍｌ　３重ＭＰ１８およびＭｌ　３重ＭＰｌ　９は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　 Ｂｉｏｌａｂｓ　（Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチューセッツ州）から入手した。λ− ＺａｐＨ（商標）クローニングベクター系は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　（Ｌａ　 Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）によって供給された。

発現ベクターＰＫＫ２３３−２およびそのＩＰＴＧ誘発性大腸菌宿主株、ＸＩｊ −ｂｌｕｅは、それぞれ、Ｐｈａｒｍａｅｉａ　（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　＝ ：ｘ−シャーシー州）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ　（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、カリ フォルニア州）から入手した。制限酵素は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ ａｂｓ　（Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ｖサチューセッツ州）またはＰｒｏｍｅｇａ　（ Ｍａｄｔｓｏｎ、ウィスコンシン州）から入手した。ＤＮＡプライマー開始増幅 試薬は、Ｐｅｒｋｉ　ｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ　（Ｎｏｋｗａｌｋ、　：Ｉ ネチカット州）から入手した。

合成オリゴヌクレオチドブライマーは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ　Ｃｙｃｌｏｎｅま たはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０Ｂ機器のいず れかを用いて、慣用の自動ホスホラミジット（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉ　ｔ ｅ）方法によって調製された。

核酸の調製および処置方法、および本明細書において使用された組換えＤＮＡ技 術は、広く容認および適用されそして一般にＡｕ５ｕｂｅｌ、　Ｆ、Ｍ、　ら（ 編集者）　”Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ”　第１巻および第２巻、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏ ｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８８）およびＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、ら 、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂ盾窒■ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、”　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２によって参照されているＴＣＳの精製は、共に所存 する、共に出願中の米国出願第０７／３３３．１８ｐＨ＝８．０に調整した通常 の生理的食塩水（ｏ、９％ＮａＣ１）中でＴ、　ｋｉｒｉｌ匣豆の均一化した塊 根を一晩抽出することによって得た。この抽出物を、遠心分離によって清澄にし そしてこの清澄にされた材料を、カートリッジの形で商業的に供給されるＱＡＥ 　Ｚｅｔａｐｒｅｐ　（商標）アニオン交換樹脂に通した。このイオン交換段階 を、ＴＣ３精製を高めるのに有効であると認められている、低いイオン強度、す なわち低い伝導率で行い、そして特に、赤血球凝集素汚染物質を除去した。

低い伝導率の緩衝液は、２０ｍＭのリン酸塩、ｐＨｓ、Ｏであった。

アニオン交換樹脂からのフロースルーを、ｐＨおよびイオン強度に関して調整し 、そして好ましくは、カチオン交換樹脂上のクロマトグラフィーによりさらにタ ンパク質精製するのに先立って、濃縮した。濃縮段階を、１０，０００分子量濾 過膜を用いた限外濾過によって行い、その際、低分子量の汚染物質が大部分ない 溶液を生じた。

５０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ６，０緩衝液で平衡化した処理されたフロースルー材 料を、平衡化したＳＰ　Ｚｅｔａｐｒｅｐ（商標）カチオン交換樹脂に適用し、 そしてこのカラムを、溶出プロフィールがベースライン値に達するまで、緩衝液 （１５〜２０容積）で大規模（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ）に洗浄した。大規模な 洗浄は、特に、エントドキシおよび高分子量りボポリサッカリド（Ｌ　Ｐ　Ｓ） を含む、緩く結合した材料を除去した、そして高い純度のＴＣＳを達成するため には必要である。

ＴＣＳが、６０ｍＭのＮａＣ１を含む５０ｍＭリン酸塩緩衝液、ＰＨ６，０で溶 出することにより、その時、カラムから、高度に精製した形で溶出されて、結合 ＴＣ３を樹脂から遊離した。精製したＴＣＳタンパク質は、Ｉ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ プロフィールおよびＳＤＳゲル電気泳動上の染色パターンによって証明されたよ うに、少なくとも約９８％純粋であった。

実施例２ ＴＣＳコード配列を含むクローン化ゲノムフラグメントの調製匣■の葉から単離 した。手短に言えば、凍結した組織を、ドライアイス上に保った乳鉢および乳棒 を用いて細かい粉末に粉砕した。次いで、β−メルカプトエタノールを、最初の 容積の２％に添加し、等容積の熱い２×抽出緩衝液（２％セチルトリメチル−ア ンモニウムプロミド（ＣＴＡＢ）、１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃ１，ｐＨ８，０，２ ０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１．４Ｍ　ＮａＣ１）が続いた。

このスラリーを、温度が５０℃に達するまで、５５℃の水浴中で静かに攪拌した 。次にこのスラリーを適当な遠心分離びんに移しそして等容積のクロロホルム： イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出した。相分離を、遠心分離によっ て達成した。ｌ／１０容積の１０％ＣＴＡＢを添加しそして抽出を繰り返した上 部の水性相を別の容器に取り、そして等容積の沈澱緩衝液（１％ＣＴＡＢ。

５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃ１，ｐＨ８，０，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ）を添加することに よってＤＮＡを沈澱してナトリウム濃度を０．３５Ｍに下げた。

当該ＤＮＡを集めそして冷７０％エタノール、０．１Ｍ酢酸ナトリウムで洗浄し て当該ＤＮＡをナトリウム塩に変換し、９５％の冷エタノールによる洗浄が続い た。次いで、ＤＮＡは乾燥され、そしてｆｏｍＭＴｒｉｓ−Ｃ１，ｐＨ７，５， １ｍＭ　ＥＤＴＡ中で再溶解され得た。さらに汚染物質を取り除くため、ＤＮＡ をＣＴＡＢから、等容積（最初の）の２×抽出緩衝液を添加することによって再 沈澱し、２容積の（最初の）ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１ｍＭ 　ＥＤＴＡ）。

ｐＨ８，０が続いた。ＤＮＡをもう一部ナトリウム塩に変換し、上述のようにエ タノールで洗浄し、乾燥い、モしてＴＥ緩衝液、ｐＨ８，０中に溶解した。５ｍ ｇより多い高分子量ＤＮＡが、約３５ｇの組織から得られた。

プローブ配列の３つの縮退セットを、２つの別のコード配列に対応して合成した 。第一のＤＮＡ配列は、３５−ｍａｒでありそして第１図においてオーバーライ ンされかつＡと示されたタンパク質配列を包含し、そして第二の配列は、３２− ｍａｒでありそしてこの図においてオーバーラインされかっＢと示されたタンパ ク質配列を包含する。プローブセットを、慣用の自動化方法によって商業的に入 手できる機器を用いてそして製造業者の指示に従って調製した。（Ｂｉｏｓｅａ ｒｃｈ、　Ｓａｎ　Ｒａｆａｅｌ、カリフォルニア州、およびＡｐｐｌｉｅｄ　 Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｐｏ５ｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、カリフォルニア州）。デオ キシイノシンヌクレオチドを、扱いやすい複雑さの２０ヌクレオチドよりも長い プローブを生成するために取り込んだ（Ｏｈｔｓｕｋａ；　Ｔａｋａｈａｓｈｉ ）。ＭＰＱＰ−］と呼称される、３５−ｍａｒに対応するセンスストランドプロ ーブセットは１２８の異性体を含んでいた。ＭＰＱＰ−２およびＭＰＱＰ−３と 呼称される、第二および第３のアンチセンスストランドセットは、各々１２８の 異性体を含みモして３２−ｍｅｒｓであった。

ＤＡＮ増幅反応を、友復プライマー開始ストランド伸長法によって、（ａｌ上述 したように単離した１〜２マイクログラムのＴ、　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉＤＮＡ、 　（ｂ）プライマーとしテノ、１Ｐ−標１１＆ＭＰＱＰ−１およヒ等モルノ、未 標ｍＭＰＱＰ−２および−３の混合物、（Ｃ）４つのデオキシヌクレオシドトリ ホスファート全て、および（ｄ）Ｔ旦ポリメラーゼを含む反応混合物中で行った 。約２０回の熱サイクル（ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｉｎｇ）を行い、その際、製 造業者（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ、　Ｎｏｒｗａｌｋ、　コネチ ヵット州）からの指示に概説されたように、慣用のＤＮＡ増幅反応条件を用いた 。

同様のＤＮＡ増幅反応を、未標識プライマーセットを用いて行った。

ＤＮＡ増幅段階の生産物を、３％Ｎｕｓｉｅｖｅ、　１％ＭＥアガロース（Ｓｅ ａｋｅｍ（商標）。

ＦＭＳ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州）上 で分別しそしてエチジウムプロミドで染色した。約２５５塩基対の主生産物を検 出した。この材料を同様に５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動上で分別しそし てオートラジオグラフィーによってバンドを検出し、同様の結果を得た。両方の 場合において、増幅された材料とは別のＤＮＡはほとんど検出されなかった。

増幅したＤＮＡを、溶出によってポリアクリルアミドゲルから回収し、エタノー ル沈澱が続いた。１つのこのような調製物の１部、約１００ナノグラム、をＤＮ Ａ配列分析のために取り出した。３０ｎｇの未標識ＭＰＱＰ−１に加えて当該Ｄ ＮＡ試料を１０μｍのＴＥ　（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，１ｍＭ 　ＥＤＴＡ）に溶解しそして５分間で１００°Ｃに加熱して二本鎖フラグメント を変性させた。この混合物をドライアイス上で急速凍結して鋳型（ｔｅｍｐｌａ ｔｅ）が徐冷再対合（ａｎｎｅａｌ　ｉｎｇ）することを防いだ。２μｍの５　 Ｘ　５ｅｑｕｅｎａｓｅ配列決定緩衝液（ＵＳＢ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、 　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）を添加しそして当該プライマーを３７℃で５分 間鋳型に徐冷再追合させた。次いで製造業者によって供給された標準配列決定プ ロトコールを続けた。

得られたＤＮＡ配列および３つの読み枠金てへのその翻訳が、第３Ａ図（センス ストランドのための）においておよび第３Ｂ図（相補的ストランドのための）に おいて示されている。

そして、標準ライブラリークローニングベクター、この場合、ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅのＬａｍｂｄａ−Ｚａｐ　ＩＩ（商標）系（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、カリフォル ニア州）にクローニングした。プローブとして使用するために、上からの増幅し た２５５−ｂｐフラグメントをラドンブライミング（ｒａｄｏｎ　ｐｒｉｍｉｎ ｇ）　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍキット、Ｉｎｄｉａｎａｐｏ ｌｉｓ。

インディアナ州）によって放射能標識した。

約０．５〜１．０ＸＩＯ＠のプラークを、■Ｐ−放射能標識２５５−ｂｐプロー ブで綿密に調べた。２つの明らかに陽性のプラークを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅに よって供給されたプロトコールに従って、選び取り、増幅しそしてプラスミドに 変換した。ｐＱ２１Ｄと呼称された一方のクローンが、完全なＴＣＳコード配列 を含む約４ｋｂの挿入断片を含んでいた：　ｐＱ３０Ｅと呼称された他方も、約 ０．　６ｋｂの挿入断片を含んでいた。

ＴＣＳコード領域を含むｐＱ２１Ｄの領域を、標準の二本鎖配列方法によって、 汎用の配列プライマーおよび独特の合成オリゴヌクレオチドブライマーを、必要 とされる時に用いて、配列決定した。ＴＣＳコード領域のみを含むより小さいサ ブクローンを、ｐＱＤ２１Ｄからの１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ　〜Ｎｃａｌフラグ メント（第４図）をＩ）ＫＫ２３３−２にサブクローニングすることによって生 成した。結果として得られる組換えプラスミドをｐＱＤｌ　２Ｄ／ｐＫＫ２２３ −２実施例２からのｐＱ２１Ｄ／ｐＫＫ２３３−２クローニングベクターを２つ のむ５ａｉｌ〜ＮｃｏＩ（平滑）フラグメントを遊離した。２つのフラグメント をの方法に従って行った。

ファージ一本ＭＤＮＡを、標準方法を用いてプライマー変異誘発にさらした。

遺伝子のアミノ部分（Ｍ１３ＭＰ１９ベクター中）をプライマーＱＮｃｏＮ（５ “−ＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＴＧＴＴＡＧＣ−３’　）で修飾した ：そして遺伝子のカルボキシ部分をプライマーＱＴｅｒｌ（５°−ＣＧＡＡＡＣ ＡＡＴＡＴＣ；ＧＣＡＴＡＡＴＡＡＡＧＣＴＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧ　−３°）で 修飾した。第５図に説明されているように、これらの修飾は、成熟ＴＣＳＣＳタ ンバク列配列初にＡＴＧ開始コドンを含むＮｃｏ１部位そして成熟配列のカルボ キシ末端の後ろにＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位に加えて二重のＴＡＡ翻訳終 止配列を置いた。

プロモーターを含むプラスミドである。それは商業的に供給されている（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ）。

いくつかのクローンを特徴づけそして修飾挿入断片を含むことを立証した。修飾 領域のＤＮＡ配列を、直接的に、ｐＱＲ１９と呼称されたものについて立証した 。

プラスミドｐＱＲ１９および類似のクローンを、大腸菌宿主株、ＥＬｌ−ｂｌｕ ｅの中で増殖させた（ｐｒｏｐａｇａｔｅ）。当該味の著しい特徴は、それがＦ ′エビソＩＰＴＧを添加することによってリプレッション（ｒｅｐｒｅｓｓｉｏ ｎ）からブロックされる。

プラスミドＩ）ＱＲ１９およびもう１つの単離体（ｉｓｏｌａｔｅ）を、ＴＣＳ の発現について分析した。先ず、プラスミドの維持を選択するために、培養株を 、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンで補ったＬｕｒｊａブイヨン培地中で、ＩＰ ＴＧを添加する前の、。。ナノメートルで測定したＡ、。。が０．　７になるま で、培養し、次いで４時間増殖させた。これらの条件は、発現の高いレベルを生 じなかった。

次に、培養株を、５ｍＭのＩＰＴにを含む１００μｍ／ｍｌのアンピシリンを加 えたＬｕｒｉａブロス中に接種し、そして飽和密度になるまで一晩増殖させた（ ｐＱＲ１９／ＸＬＩ−ｂｌｕｅ誘発細胞）。当該誘発細胞を、遠心分離によって 集め、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８，５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ中に、約１ ０Ａ＊ｅ。

単位／ｍｌの濃度で再懸濁しそして音波処理によって粉砕した。アリコートを取 りそして１５．０００ｘｇで５分間遠心分離して不溶性成分から可溶性のものを 分離した。

不溶性の、小球形にされた材料を、音波処理緩衝液に再懸濁して最初のアリコー トと同一の容積にした。各フラクションの試料を１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥ上に流 す。試料の１セツトを、全タンパク質についてＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅで 染色した；試料のもう１つの１セツトを、ＷｅＳｔｅｒｎ分析のためにプロット （ｂｌｏｔ）シて、段落■Ｉに論じた結果を得た。

感染したＴ細胞におけるＨＩＶ複製の選択的阻害を媒介する（ｍｅｄｉａｔｅ） 　ｒ　Ｔ　Ｃ８の能力を、精製した植物由来の材料と並行に、評価した。ＣＤ４ ＋　Ｔ細胞系統ＶＢ　（Ｌｉｆｓｏｎ、　１９８６）の細胞にＨＩＶ−１を、滴 定した（ｔｉｔｅｒｅｄ）凍結保存ＨＩＶ−１ウィルスストック（ウィルス単離 体ＨＩ　Ｖ−１ｏｖ　（Ｃｒｏｗｅ、　１９８７））のアリコートと共に３７℃ で１時間インキュベートすることにより接種した。洗浄後、細胞を１ｍｌあたり １．１１ＸＩＯ″に再懸濁し、そしてこのサスペンションの０．９ｍｌを２４ウ エル培養平板の多数のウェル中にプレートした。次いで、０．１ｍｌ容積の連続 的稀釈度の精製した植物由来のＴＣＳおよびｒＴＣＳを、所望の最終濃度のＩＯ Ｘで添加して所望の濃度のＴＣＳを含む培養培地１．Ｏｍｌ中１×Ｉθ″細胞を 含む１．０ｍｌ培養を生じた。増湿した５％ＣＯ，／空気雰囲気中３７℃で４日 間培養した後、培養上清を取り出しそして処理かつ制御培養におけるウィルス複 製を、商業的に入手できる捕獲イムノアッセイキットを用いて製造業者の指示に 従ってＨＩＶｐ２４抗原含有物を測定することによってアッセイした（Ｃｏｕｌ ｔｅｒ、　１（ｉａｌｅａｈ、フロリダ）。第６図に示したように（クローズド ・ボックス）、別の所で報告された観察（米国特許第４，７９５，７３９号）と 一致して、Ｔ、　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉの塊根から明白に均一になるまで精製され た植物由来のＴＣＳは、この急性感染アッセイ系において、濃度依存様式でＨＩ Ｖ複製を阻害した。大腸菌において生産されそして明白に均一になるまで精製さ れたｒＴＣＳの生物学的活性（オーブン・ボックス）は、ＨＩＶ複製を阻害する ためのアッセイ系において０．００５μｇ／ｍｌより高いＴＣＳ濃度で並行して 試験された時、天然生産物の活性と実質的に区別できた。より低い濃度で、ｒＴ ＣＳは、植物由来のタンパク質よりも僅かに低い特異活性を示すように思われる 。

Ｂ、試験管内における無細胞翻訳の阻害リボゾームを不可逆的に不活性にし、そ れによってタンパク質合成を阻害する、ＴＣＳの能力を、例えば、リボゾームお よび種々の本質的な補助因子源としてのラビット網赤血球溶解物調製物、ｍＲＮ Ａ鋳型およびアミノ酸からなる、部分的に明らかにされている無細胞系を用いて 、試験管内翻訳の標準化アッセイにおいて慣用的に測定する。放射能標識アミノ 酸を反応混合物中で使用することは、遊離アミノ酸前駆体の、トリクロロ酢酸沈 澱性タンパク質への取り込みの定量を可能にする。

第７図に示されたように、大腸菌において生産されそして明らかに均一になるま で精製されたｒＴＣＳのタンパク質合成阻害活性は、植物由来のＴＣＳの活性と 区別できる。

実施例５ トリコサンチンコード配列のためのバイトロバシーインデックス計算（ｈｙｄｒ ｏｌｌａＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ　ＰＣ／ＧＥＮＥ（商標）ソフトウェ アパッケージからの５ＯＡＰプログラムを使用して、第１０図のｈｙｄｒｏｐａ ｔｈｉｃｉ　ｔｙプロットを生成した。５ＯＡＰプログラムは、その配列に沿っ てタンパク質のｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉ　ｔｙをプロットするＫｙｔｅらの方 法を使用する。計算のために使用された間隔は、１１アミノ酸であった。

第１０図において、プロットの疎水性側は、正の値の範囲に対応しそして親水性 の側は、負の値の範囲に対応している。

トリコサンチン配列の最初の２３のアミノ酸は次の通りである：Ｍｅｔ工１ｅ　 紅ｑ　Ｅ’ｈ＠　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌ＠ｕ工ｌｅ　Ｌ ｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ＬａｕＴｂｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ妃、ａ　Ｖａｌ 　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ。

第１０図から理解できるように、この配列は高い程度の疎水性を有する。配列コ サンチンから得られるタンパク質は、α−ＴＣ３について決定されている一次配 列と比較してα−ＴＣＳタンパク質コード配列中に２つの保守性（ｃｏｎｓｅｒ ｖａｔｉｖｅ）アミノ酸変化を含んでいた。この実施例は、植物材料から単離さ れたα−トリコサンチンタンパク質の一次アミノ酸配列を表すために選択される コドンに基づく、合成遺伝子のα−トリコサンチン遺伝子のための核酸コード配 列の構造を開示する。この実施例はさらにα−トリコサンチンをコード化する遺 伝子の変異対立遺伝子（ｍｕｔａｎｔ　ａｌｌｅｉｅｓ）の創造を開示する。

（ｉ）プラスミド、細菌株、試薬および酵素の源Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　（商標 ）は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　・カリフォルニア州）か ら購入した。；ｐＡｃＹｃ１８４　（ＡＴＣＣｎｏ；３７０３３）は、Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉ ｌｌｅ、メリーランド州から入手した。発現プラスミド、ｐＫＫ２３３−２は、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ　（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、二、−シャーシー州）から入手 した。形質転換のために使用される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ ）株は、ＢＲＬ　（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）からのＤＨ５ （Ｆ−、ｒｅｃＡｌ、　ｅｎｄＡｌ、　ｈａｄＲ１７（ｒ　＊　ｒａ　＊”　） 、　５ｕｐＥ４４．λ−，ｔｈｉ　−１，ｇｙｒＡ、　ｒｅＬＡｌンおよびＳｔ ｒａｔａｇｅｎｅからのＸ　Ｌ　１−Ｂｌｕｅ（ｒｅｃＡｌ、　ｅｎｄＡｌ、　 ｇｙｒＡ９６．　ｔｈｉ、　ｈｓｄＲ１７（ｒ　ｋｍ　ｈ　”　）、　５ｕｐＥ ４４．　ｒｅｌＡ）、λ−P Ｌａ（、（Ｆ’、　ｐｒｏＡＢ、　Ｌａｃｌ＠ＺΔＭ１５．　ＴｎｌＯ（ｔｅｒ ′］〕を含む。ＪＭ　Ｉ　０５　（ｔｈｉ。

ｒｅｓＬ、ｅｎｄん　５ｂｃＢ１５．　ｈｓｄＲ４，Δ　（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ ）、（Ｆ’、ｔｒａＤ３６．　ｐｒｏＡＢ、１ａｃｌ＠ＺΔＭ１５））を、合成 遺伝子の発現のために使用した。ＬＢ培地（Ｍａｎｉａｔｉｓら）を、細菌の増 殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）のために使用した。発現は、グルコースまたはグ リセロース（０，２％）チアミン（２μｇ／ｍｌ）、カサミノ酸（ｃａｓａｍｉ ｎｏ　ａｃｉｄ）　（ＣＡＡ）（０，３％）、ＩＰＴＧ　（５ｍＭ）　、および アンピシリン（ｌｏｏμｇ／ｍｌ）の補足を含むＭ９培地（Ｍａｎｉａｔｉｓら ）の中で行われた。

制限エンドヌクレアーゼは、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ　（Ｇａｊｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）またはＰｒｏ ｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ　（Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）のいずれかか ら購入した：この酵素は、製造業者の勧告に従って使用された。Ｔ４ＤＮＡリガ ーゼは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉ ｎｃ、　（ＩＢＩ　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、　：７ネチカツト州）から購入した。

Ｈｌｌ、Ｍｌｕｌ、５ａｌＩ、Ａａｔｌｌ、および５ａｃＴを、合成遺伝子にお いて見られる順序で含む、８０塩基対（ｂ　ｐ）ポリリンカー（ｐｏｌｉｌｉｎ ｋｅｒ）　（第１１図）を構成した。これらの部位を使用して個々の合成核酸フ ラグメントをクローニングしそして組み立てて（ａｓｓｅｍｂｌｅ）連続する配 列にした。ポリリンカーの一方の末端はＢａｎ　Ｉ張出しくｏｖｅｒｈａｎｇ） を含みそして他方の末端はＸｂａｌ張出しを含みｐＡＣＹＣｌ　８４へのクロー ニングを容易にした。

クロラムフェニコール耐性（Ｃｍ”　）ベクター、ｐｐｓ２ｏｏを、クロラムフ ェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含むｐＡＣＹＣｌ　８４の１９ ０商標）に存在するポリリンカーを上述の合成ポリリンカーと置換することによ って構成した。これらの特別のベクターを使用することの関連性（ｒｅｌｅｖａ ｎｃｅ）は、それらが適合性（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ’）レブリフンを含むこと である：従って、両方のベクターが同一の細胞中で安定に維持され得る。プラス ミドの構成において使用される適合性レブリフンは、ｐＰｓ３００を構成する際 におよび分かれた、合成りＮＡフラグメントを以下に記載したように完全な遺伝 子に縮合する際に利用されたｐＰｓ３００の構成は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ 商標）およびｐＰｓ２００の両方をＫｐｎＩで消化し、線状プラスミドを結合し 、コンピテント大腸菌ＤＨ５細胞を連結反応混合物で形質転換し、そしてアンピ シリンおよびクロラムフェニコールの両方を含むＬＢ平板上で二重に耐性のクロ ーンを選択することを伴う二当該プラスミドを、陽性のクローンから単離しそし て５ａｃＩで消化して結合プラスミドの向きを決定しそしてポリリンカー配列が 交換された２つの新たなプラスミドを生成した。２つのベクター成分が正しい向 きで結合された（第１２Ａ図）、即ち、互いに本質的に逆の２づのポリリンカー 配列を有し、並列していない（第１２Ｂ図）ものを選択した。選択したプラスミ ドの中の１つの５ａｃｌ消化物を稀釈しそして個々の成分を連結反応によって環 状にした（ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｅ）。コンピテントＤＨ５細胞への形質転換と 同時に、異なる（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）プラスミドを運ぶ細胞を、Ａｐ”　Ｃ ｍ’またはＣｍ”　Ａｐ”　（アンピシリン耐性／クロラムフェニコール感受性 またはクロラムフェニコール耐性／アンピシリン感受性）であるように選択した 。これらの処理から結果として得られたプラスミドは合成ポリリンカー（ｐＰ３ ３００）を運ぶｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）およびｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ （商標）ポリリンカーを運ぶＣｍ１１である。

（ｉｉｉ）フラグメントクローニング 第１１図に示した配列に対応する合成遺伝子フラグメントを、ＡＢＩ３８０ＢＤ ＮＡ合成器でシアノエチルホスホラミジット化学を用いて合成しそしてＨａｍｉ ｌｔｏｎ　Ｃｏｍｐａｎｙから購入したＰＲＰ−３カラム上でトリチル化精製（ ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｔｒｉｔｙｌａｔｅｄ）　シた。

相補的合成オリゴヌクレオチドを、１μｍあたり１０ピコモルでｌ　ＯｍＭ　Ｔ ｒｉｓ、ｐＨ８：　１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ　；　１０ｍＭ　ＮａＣ１中で混合し た。これらの混合物を１分間で１００℃に加熱し、次いで徐冷再対合のために室 温に徐々に冷却した。

合成オリゴヌクレオチドフラグメントの、ポリリンカーへの好結果の連結反応は 、１　’ｕ’　１あたり１０’Ｏｎｇの最終ＤＮＡ１ｍ度で、２０〜４０×モル 過剰の徐冷再対合したオリゴヌクレオチドを必要とする。連結反応は、室温で２ 時間または１６度で一晩行われた（Ｍａｎｉａｔｉｓら）。連結反応混合物を使 用してコンピテントＤＨ５門たはＸＬ’ｌ”−Ｂｌｕｅ細胞を直接的に形質転換 した。形質転換細胞を、アンピシリンまたはクロラムフェニコールのいずれかを 含むＬＢ上で選択した。

選択した形質転換細胞から得られたプラスミドを、２つの方法のうちの一方によ って挿入断片の存在のために選別した：挿入断片フラグメントに含まれる開裂部 位を有する制限酵素を用いた消化：まｈは、挿入断片の外側に位置する部位を有 する制限酵素を用いた消化から生成されたフラグメント部位の比較。候補挿入断 片を含むプラスミドを、挿入ＤＮＡの核酸配列決定により変異または欠失につい てさらに検査した。

各クローン化合成フラグメントの配列決定は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｔ７　（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）およびＵＳ　Ｂ　（Ｕ　Ｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　 Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、オハイオ州）　５ｅｑｕｅｎａｓｅＣ商標）Ｋｉｔｓを用 いて二本鎖プラスミドＤＮＡに関して行われた。反応は、次の変化を伴って、実 質的に製造業者の勧告に従って行われたニブラスミド変性を、室温の代わりに８ ５℃で行い、そしてマイクロ力価平板（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅｓ） に含まれる試料を、３７°Ｃに予備加熱する代わりに、標識化反応の付加の前に 氷上で冷却した。

たいていのフラグメントはほとんどまたは全（欠失を有していなかった。しかし ながら、Ｂｓ　ｓＨＩ　Ｔ−Ｍｌｕ　Ｔセグメントは、ｐＰｓ３００にクローン 化された時に、縮合に所望されているのと反対の向きにあるかまたはその配列は 修飾および／または欠失を有しているかのいずれかであった。この問題をうまく 避けるために、当該フラグメントをｐＰｓ２０ｏにクローニングした。この挿入 断片を含むプラスミドを選別によって同定し、そしてこの挿入断片を配列決定し た。

正確な配列を有する４つのプラスミドが単離された。

（ｉｖ）クローン化遺伝子フラグメントの縮合オリゴヌクレオチドを結合してト リコサンチンタンパク質コード配列に対応する合成配列にすることを容易にする ため、合成オリゴヌクレオチドフラグメントを各タイプのベクター（ｐＰｓ２０ ０またはｐＰｓ３００）に別々にクローニングした。プラスミド／フラグメント 結合を、合成遺伝子中で互いに隣接するべきであるオリゴヌクレオチドフラグメ ントを連結反応によって結合して、形質転換、およびＬＢ−アンピシリン平板か らＬＢ−クロラムフェニコール平板またはＬＢ−クロラムフェニコール平板から ＬＢ−アンピシリン平板へのレプリカブレーティングによって選択され得るハイ ブリッドプラスミドにし得るように、選択した。この選択は、上述したｐＰｓ２ ００からｐＰＳ３００に合成ポリリンカーを移動するためにｉ用される方法に続 く。

第１３図は、クローン化遺伝子フラグメントの縮合のための一般化された図式的 ダイアグラムを示している。合成フラグメントの末端での数字は、制限酵素部位 に対応している。この図は、上述のプラスミドを用いてフラグメント３〜４をフ ラグメント４〜５に接合しそして各プラスミド中部位４で切断することを説明し ている。次いでこれらの単切断プラスミドを結合してそして正確な向きで接合し た２つの配列を有するプラスミドを選択する。次いでこのプラスミドを、接合し たフラグメントを運ぶプラスミドを生成するであろう制限部位で開裂し、そして それは所望の薬剤耐性標識（Ｃｍ’またはＡｐ′のいずれか）を有する。この制 限酵素消化物を稀釈しそしてこのフラグメントを自己結合して所望のプラスミド を生成する。

ＴＣ３合成遺伝子の構成の次の記載は第１３図と関連して同様に読解され得る。

２つの合成遺伝子フラグメントを接合するために、各クローンを、各合成フラグ メントの末端に共通した開裂部位を育する制限酵素で切断し、従って線状プラス ミドを生じた。これらの線状プラスミドを結合して、コンピテントＤＨ５に形質 転換し、そしてクロラムフェニコールおよびアンピシリンの両方に対するそれら の耐性によって選択した。プラスミドを、クロラムフェニコール（Ｃｍ’　）オ よびアンピシリン（Ａｐ”）耐性であるいくつかの候補から単離した。これらの プラスミドを、制限酵素消化を用いて分析して２つの合成フラグメントのお互い に対する向きを決定した。正確なフラグメントの向きを育するプラスミド（この 中で２つの遺伝子フラグメントは互いに接合されている）を同定した。

次に、当該プラスミドを、接合したフラグメントの一方の末端にそして組換えプ ラスミドの中に存在する融合したポリリンカー配列において・単切断を導入する 制限酵素で消化する（例えば第１３図に示された組換えプラスミドの中の部位３ で切断する）ことによって、接合したフラグメントを１つのベクターに分離した 。結果として得られる２つのプラスミド断片を自己結合し、従って無傷なポリリ ンカー領域を保存し、そして細菌に形質転換する。結合したフラグメントを含む プラスミドを、その薬剤耐性に基づいて選択した。結合したフラグメントをＣｍ １またはＡ　ｐｌプラスミドに分離するかの選択は、それを次に結合するべきプ ラスミドの中の選択標識の性質に依る。例えば、２つのフラグメントを結合して Ｃｍ１プラスミドの中で増殖させるならば、それらは、ＡＰＲプラスミドにおい て結合されそして増殖される２つのフラグメントを結合する次のラウンドにおい て接合される。隣接したフラグメントおよびフラグメントの対を、異なる抗生物 質耐性を有するベクターにクローニングすることによって、トリコサンチン遺伝 子を、８つのクローンから１つのクローンに至るまで逐次に容易に縮合した。

第１４図は、α−ＴＣＳのための合成遺伝子をクローン化しそして縮合するため に必要とされる工程の概要を示している。合成遺伝子および個々の断片の側面に 配置されている制限部位の線状の記述が、一番上の中央に示されている。第１４ 図に示されたこれらの側面制限部位は、第１１図に肉太印刷で示された制限部位 に対応している。この図の残りを通じて、関連した制限部位は、適当でかつ便利 な一文字省略形で同様に言及されている。陽性サブクローンのための選別の際に 使用される合成フラグメントの中に含まれる独特の制限部位も同様に示されてイ ル。使用した２つのべ’）９＋、ｐＰｓ２００　（Ｃｍ”）およびｐＰＳ３００ （Ａｐ”　）は、それぞれ、図の一番上の左および一番上の右に描かれている。

第１４図は、ｐＰｓ２００またはｐＰｓ３００のいずれかに個々の合成フラグメ ントをクローニングし続いて２つのサブクローンを、２つの遺伝子断片が正確に 接合されている単一のプラスミドに結合することが描かれているフローチャート を示している。一番上から第３番目の列において、サブクローンが結合され得る ２つの二者択一の向きの例が、以後の連結反応のための正確な向きの選択と一緒 に示されている。簡潔さのために、二重耐性プラスミドから１つのベクター成分 を除去して、融合遺伝子配列を第二成分の一部として残す自己連結反応は示され ていない。最終の遺伝子融合は、ｐＰｓ２００　（Ｃｍ’）の中に配置されてい るように示されるが、それは、ｐＰｓ２００成分を除去するために代わりの制限 消化および連結反応を用いるとｐＰｓ３００　（Ａｐ’）の中に同様に配置され た。

（Ｖ）大腸菌における合成トリコサンチンの発現合成トリコサンチン遺伝子の構 成が完了した後、遺伝子のコード領域を、発現ベクターｐＫＫ２３３−２にクロ ーニングしてゲノムクローンのために前に記載したのと類似の構成を与えた。ｐ Ｐｓ２００からのＮｃｏｌ〜５ａｃｌ（平滑に修復されたＫｌｅｎｏｗ）遺伝子 フラグメントを、上述した２つのプラスミドクローニングアプローチを用いて、 Ｎｃｏｌ〜Ｈｉｎｄｒｌｌ（平滑に修復されたＫｌｅｎｏｗ）からのｐＫＫ２３ ３−２に配置した。当該フラグメントをｐＫＫ２３３−２にサブクローン化する ために別の、より標準的な方法が同様に使用され得ることが同様に認識されるべ きである（Ｍａｎｉａｔｉｓら）。ｐＫＱＳと呼称される、結果として得られた プラスミドを、上述したように、先ず、大腸菌株ＸＬ−ＩＢ１ｕｅに形質転換し た。それを、合成ＴＣＳコード配列を発現するｐＫＫ２３３−２の中でプロモー ターを調節するためのＩａｃｒ＠を同様に運ぶ別の株、ＪＭ１０５に同様に形質 転換した。後者の形質転換細胞は、ＸＬ−ＩＢ１ｕｅ形質転換細胞よりもより良 好な成長特性を示しそしてタンパク質の発現および１産のために選択された。

合成遺伝子を発現するため、ｐＫＱＳ／ＪＭＩ　Ｏ５形質転換細胞を、０．　２ ％グルコース、（０，２％）チアミン（２μｇ／ｍｌ）、カサミノ酸（ＣＡＡ） （０，３％）、ｒＰＴＧ　（５ｍＭ）　、およびアンピシリン（ｌｏｏμｇ／ｍ ｌ）で補なわれたＭ９培地（Ｍａｎｉａｔｉｓら）の中で３７℃で飽和密度にな るまで増殖させた。

（ｖｉ））リコサンチン変異体の構成 真核リボゾームに対して触媒活性を有すると思われるトリコサンチンの領域の機 能を研究するために、トリコサンチンコード配列の変異体を試験管内で構成した 。先ず、位置１６０でグルタミン酸をそして位置１６３でアルギニンをそれぞれ アスパラギン酸およびリシンに変化させた二重変異体を作った。これらの変異は 、合成遺伝子のＢｓｓＨＩＩ−Ｍｌｕｌフラグメントを、ｐＫＱＳにおいて、グ メントと置換することによって行われた。

５ｐｅ１部位は、この新たなフラグメントの挿入の選別を容易にするために含ま れていた。この新たな配列は、ＤＮＡ配列決定により確認された。

ＧＡＧＴＡＣＧＮフ７ＡＡＧＴＴτＣＡＴＧＡＴＣＡＣＴＧＣＧＡＣＧ’ｌテ！ ”ｌ’ＡＴＧＴＴτＡＡＧＴＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡｓｐ　Ｌｙｓ 変異コード配列を含むプラスミドを、変異フラグメント挿入断片の存在、向きお よび数について選別した。正確な変異を含むクローン、ＤＫ１２を、上述したよ うにｐＫＱＳのために発現させた。

各アミノ酸変異の、二重変異体の総体的効果に対する寄与をめるために、グルタ ミン酸からアスパラギン酸への置換またはアルギニンからりシンへの置換のいず れかが行われた単一変異体を構成した：これらの変異コード配列は、それぞれ、 ＤｌおよびＫＩＯと命名された。

（ｖｉｉ）変異タンパク質の精製 一晩の培養株を遠心分離により取り出し、そして細胞を氷冷した１００ｍＭＴｒ ｉｓ、ｐＨ８，５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ中に再懸濁する。この細胞を音波処理によ って粉砕した二次いで不溶性材料および未粉砕の細胞を１０，０００Ｘｇで１０ 分間遠心分離することによって除去した。上溝を３容積の水で稀釈し、そしてそ の伝導率を、それが２ｍｍｈｏより低いことを確実にするために、測定した。試 料のｐＨを希ＮａＯＨで８．５に再調整し、そしてこの溶液をｌＯ，ｏｏＯｘｇ で再遠心分離して不溶性のタンパク質、細胞破片および付加的な細菌を除去した 。

Ａ　５０　ＱＡＥ　５ｅｐｈａｄｅｘイオン交換樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）か らなるカラムを０゜ＩＮのＨＣＩ、次にＩＭのＮａＣ１で活性化し、そして１０ 　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ、　ｐ　Ｈ８，５で大規模に洗浄して平衡化した。稀 釈試料をカラムの上に１分あたり２〜３ｍｌの速度で載せそしてフロースルー材 料を集める。次いでフロースルーのｐＨを希ＭＣＩで６．０に調整しそしてこの 溶液をｉｏ、ｏｏｏｘｇで遠心分離して不溶性タンパク質を小球形にした。次い でこのフロースルー材料を、０．ＩＮのＮａＯＨおよびＩＭのＮａＣ１で活性化 されているＣ２５またはＣ３０ＳＰＳｅｐｈａｄｅｘカラム上に載せ、そしてｐ Ｈ６，０で２０ｍＭリン酸塩緩衝液で平衡化した。試料の添加の後、当該カラム をｐＨ６，０で２０ｍＭＩＪン酸塩緩衝液で大規模に洗浄した。

変異トリコサンチンタンパク質を、２００ｍＭのＮａＣ１を含む２０ｍＭリン酸 塩緩衝液で、または標準リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＧｉｂｃｏＸｌ　４０ｍ Ｍ　Ｎａｃｌ）で溶出した。溶出した試料を、試験管内翻訳およびＨＩＶ阻害ア ッセイのための準備において０．２４μ低タンパク質結合フィルター（Ｍｉｌｌ ｅｘ　ＨＶ、　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州） に通して濾過することにより滅菌した。

ＳＤＳゲル電気泳動に基づいて、変異トリコサンチンタンパク質の相同は、一般 に約９５％であった。タンパク質収量は、一般に０．５〜１．０ｍｇ／細胞培養 ラビッう網赤血球系における試験管内翻訳（ＩＶＴ）を阻害するおよびＨＩＶ− １感染Ｔ細胞中でのｐ２４抗原の生産を減する能力について、単離した変異タン パク質を、未修飾トリコサンチンタンパク質（ＫＱＳ）（同様に大腸菌において 発現される）と比較した（上記実施例４および米国特許！４，８６９．９０３号 に記載されているアッセイ）。二重変異タンパク質（ＤＫ１２）は、未修飾タン パク質と比較して、試験管内翻訳の阻害でほとんど３　ｌｏｇｓのより低い活性 であり（第１５図）そしてｐ２４生産の阻害でｆｌｏｇより高い、より低い活性 であることがわかった。単修飾変異体は、ＩＶＴ（第１５図）およびｐ２４抗原 の生産の両方の阻害についてＤＫ１２およびＫＱＳに対して中間的な活性を示し た。

この実施例は、α−トリコサンチン核酸コード配列に対して相同性を育するトの クローニングを開示する。

第二のゲノムＤＮＡライブラリーを、旦且旦■制限バンク（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅ ｄ　ｂａｎｋ）としてλＺＡＰＩＩベクター系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）におい て生成したニゲツムＤＮＡを実施例２で上述したように調製した。Ｔ、　ｋｉｒ ｉｌｏｗｉｉからの５ｐｅｌ消化ゲノムＤＮＡを、λＺＡＰＩ　Ｉの商業的に入 手できるアームに結合した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、カリ フォルニア州）。この結合混合物を、Ｇｉｇａｐａｃｋ　ｇｏｌｄ（商標Ｘｍｃ ｒ−；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてパッケージングしそしてＮＭ５５４　（ ｍｃｒ−；　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手できる）宿主を用いてプレートした （ｐｌａｔｅ）。完全なバッキング反応をプレートシた。プラークの形成の後に 、ＤＮＡを、綿密に調べる（ｐｒｏｖｉｎｇ）ために直接ニトロセルロースフィ ルターに移動した：均一でないプラークの増殖から得られるファージクローンの 表現が変わることを避けるために、フィルターリフトの前にバンクを増幅しなか った。ゲノムＤＮＡバンクサイズは、約１．５Ｘ１０修であった。ニトロセルロ ースフィルターを、ランダムプライミングによって放射能標識したｐＱ３０のＥ ｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ挿入断片（即ち、第１６図に示された配列）を用いて綿密 に調べた（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。フィルターを２×ＳＳ Ｃを用いて５０°Ｃで（即ち、低い緊縮条件下で）洗浄した。２２のクローンが 、３次のプラークおよび再調査を通じて、陽性のハイブリッド形成反応を証明し た。これらの中、２１のファージクローンを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標Ｘ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、製造業者の指示によって）プラスミドクローンとして救 い出した。救い出した至情化の組合せを用いて分析した。２１のプラスミドの中 から、１１の異なる制限酵素消化パターンが観察された。

予備の二本鎖核酸配列決定反応が、１１の群の各々からの代表的なプラスミドの 挿入断片に関して、次のプライマー：１）Ｑ２１Ｄの挿入断片から得られる、＃ ４７７−ＣＧＡＴＡＣＡＴＣＣＴＡＴＴＴＴＴＴＣＡＡＣＧ、 ｐＱ３０Ｅの挿入断片から得られる、＃６２４−ＣＡＴＣＴＣＴＧＡＧＧＡＡＣ ＡＡＴＣおよび ＃ｌ　５４６−ＣＴＴＡＴＡＴＣＡＴＴＡＴＧＡＣＴＣＣＡＡＡＧ：および新た なりローン、クローン＃３から得られる、＃３ＡＳ−ＴＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴ ＧＡＣＴＣＣＡＡＡＧＣ１ ＃３ＢＡＳ−ＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＣ，および＃３ＣＡ Ｓ−ＣＣＴＣＣ；ＡＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＴＡＧＴを用いて、行われた。最後 の３つのプライマーは、プライマー＃４７７を用いてクローン＃３のために決定 された配列から得られた。

１１プラスミド挿入断片の中の１０が、配列データを生じた：５つの挿入断片は 著しく異なる配列を与えることが明らかでありそして詳細な配列分析のために選 択された。

配列決定が、上述のプライマーを用いてなし遂げられそして、さらに、プライマ ーを、それが得られる配列データに基づいて生成した。ＴＣ３様タンパク質をコ ード化するＤＮＡ配列およびいくつかの側面配列を、各々のクローンについて決 定した。最終的な結果は、挿入断片２４（第１７図）および挿入断片４０が同胞 （ｓｉｂｌｉｎｇｓ）であること、そして挿入断片２４（第１７図）および挿入 断片２（第４８図）は、そのコード配列は同一であるが３′側面配列が僅かなヌ クレオチド相違を含むために、対立遺伝子から得られると思われることを示して いた。挿入断片３（第１９図）および挿入断片１２（第２０図）は独特でありそ して独特なタンパク質をコード化している。第１７図〜第２０図は、各独特なり ローンについて決定されたＤＮＡ配列のタンパク質コードストランドを示してい る。核酸は、参考のために配列上に番号をつけられている。この配列において生 じる独特の制限部位は、配列の上にオーバーラインされておりそして制限酵素名 によって示されている。当該クローンは、コード領域における種々の制限酵素消 化プロフィールによってさらに区別できかつ認識できる。

第１６図は、ｐＱ３０Ｅの挿入によってコード化された翻訳タンパク質を説明し ている。第１７図〜第２０図は、α−トリコサンチンに相同な推定上の前プロタ ンパク質である当該配列によってコード化された翻訳タンパク質である。アミノ 酸は、便宜のためにタンパク質配列の下に番号がつけられている。推定上の分泌 シグナルペプチドは、負の番号によって示されている（以下参照）。分泌される プロタンパク質は、正の番号が付けられている。

挿入断片２．　３．　１２．の、および２１Ｄ（α−トリコサンチン）および３ ゜（実施例２において言及されている部分クローンの配列）の核酸配列に対応す るタンパク質配列のアラインメントが第２１図に示されている。当該タンパク質 は、その相同に基づいて３つの主要なグループに置かれている：　２１／＋　２ 　：　２／３０：および３゜第２１図に関して＝（１）サブグループの中で異な るアミノ酸配列に影がつけられている：そして、（２）推定上の分泌シグナルペ プチド配列および推定上のカルボキシ末端延長ペプチドに下線がつけられている 。挿入断片２，３゜１２および３０配列のための推定上の分泌およびカルボキシ 延長配列は、クローン２１Ｄ（α−トリコサンチン）の翻訳タンパク質配列をも つそれらの翻訳タンパク質配列のアラインメントによって、そしてＴｅ３のため の既知の成熟タンパク質配列のその後の比較から推測される。推定上のシグナル ペプチドは、比較されるタンパク質について非常に相同であるが、カルボキシ延 長部分はそれらの配列において著しく異なる。

第２２図は、Ｔ、　ｋｉｒｉｌｏｗｉｉの上述のＲＩＰ遺伝子族によってコード 化されたタンパク質の比較をも説明している。この図は、参考として、クローン ｐＱ２からの挿入断片のタンパク質コード配列を使っている。別の４つの既知の ＲＩＰペプチド配列を、第２１図のために上述したように一直線にする：縦の欄 は、この配列アラインメントに基づいて、各部位で可能なアミノ酸置換を示して いる。アミノ酸の省略が生じている部位は、星印（★）によって示されている。

ハイフンは、スペースの印をつけかつより容易なカラムアラインメントを糾酌す るためにのみ使用される。

本発明は、特定の方法および組成に関連して開示されているが、当業者にとって 、拳法の種々の変更および応用をどのように本発明からはずれずになし得るかは 明らかであろう。

ＪＪＰ　ＶＪＩＩ　ｓ＠ｘＷｂａ　Ａｒｇ　Ｌａ１ＩＧｌｙ　ｈｌＡ　？ｈ１− ］ａｒ　ｍａｒ　Ｔ７’ｒ　ａｌｙ　Ｖａｎ　Ｐｈｓ　Ｘ工浴@ｓｓｒ　ＡＪＥ Ｉ” Ａ＃ｐＶａユＳａｔＰｈｍＡｘグｔａｕｊ・ｒａよｙムユ−グｔυｊｓａｇｓａ ｇＪＭ７）−ｒａよｙＦａ！７７１１１Ｘ↓＃ｇｅｔ１１ＲＬｅａＡＭＬＹ＠Ａ ｌａｍｕｍＡＪＩ！Ｉａｍム！”Ｗｚ７ｓｋｕ？ｙｒＡｓｐｕ＠ｍＸａｕＬａｕ ＪＢ＠！？ｍ”ム＠ｕ＄ＺＦ＃ム１にａ＠１ＪＰＰ２ａ１ｏＧよ””ｔＬ）’Ｉ ＩＬｏｕｔｒｒＡ＃Ｐ五ｆ蕎ＬＰｒｏニーｕＬ五＝Ａｘマ’ＪＭＭａｒ工１・ｈ ｘｑ　Ｏｌｕ　Ｂａｔｈ工Ｌ＠　しｋｕ　Ｇｌｙシ１ｍ　Ｐａ　ＡＬａ　シ喝ａ ａｐ　ｍａｒ　ＡＬａ　ＸＬｍ　±ｌ筺−、−＋ａB ｉｌＭＬａｒｙ　６Ｌｕ　Ａ＃Ｊｌ　１１８　ＪＰＪ”ロ　諏　Ｇｕｙ　ｚ・ｕ 　ｐｒｙ　ａよａ　ｍ　Ａｍｐ　ｓｅｘ　Ａｈａ　ｘよ−デ■秩@Ｔｈｅ　ｈａ 　Ｉｈａ ゲノムＤＮＡ 選択的に増幅された フラグメント（〜２５０塩基対） 精製したＴＣＳコーディング フラグメント（２５５塩基対） ３２Ｐ標識　配列 日９．３Ａ Ｌ逗Ｌｌ　ＩＱ Ｑ＆Ａ　τ記−μｍ五ｍ ｐＱ２１Ｄ／ｐＫＫ２３３−２ アミノ部分　カルボキシ部分 コーディング領域　コーディング領域 ＣＤ４ バイトロバシー・インデックス ３Ｈ−ロイシン取込み 阻害％ １　αλ入グＴα入　αλＡ＾八τＴへＣτＣテ　α＾ＧＧＣα入を入λＣ！ζ λｃ：Ａτム入λＡλＣ４ユ４４０ぽ眉＝℃ｙ詰計ズにぼαにに＝０１戚入ぼα 込■℃８５２１！　’！！’Ｗ　Ｊａ　Ａ（コＬ’Ｅτ　ｃ’ｚ　為ＩＪ　入入 Ｃ入λｒ　ｃ’ｘ　ｃｅλ為λ！ｒＧ（？　αＧ為・ムλλ　２５コＰｈｓ　ｎ ＠＝ｓａｒシ氏社７ｈｍＪｖｍシｍｕ　ｍ　Ａａ　Ａｉｍ　ＧＩＹ！、７ｍ２５ ４　ＧＴＯ？？ｅ　為１７１２人　ｃｅ’ｒｃ−λ　〒Ｍ　ｃ’ｒｒ　ｃａｗ　 ｘ　ｍ　’ｒｃｃ　為ＧＯテＣ＾　２９５’！ｊａｍ　Ｐｈｓ　Ａｓｎ　Ｈａ　 ’１！ｐｘ℃シμ−屯シ’Ｉｎ　Ｘ”ｒｏ　ｍａｒ　ＪＬＩＪＬ　（、ｊｌａｒ 　５ｍ５０６Ｍゴａｃｔ　ｚπαｔλＩＱに１詰儲Ｃ寞℃増α＝＝−πＣＣ５４ ７ｎ　Ａｉｍ　Ａｌａ　ＧＡＹ−Ｇｌｕ　ｈｘｔｚ　ｈｘｐ　Ｂａｒ　：ｎ・ｐ ｒｏ　論ＧＡＹ　Ｘ’ｍ５４８コα℃世−一纜α＝績’ｒｅｃｘ−ツＳ口Ｓ］ぽ 口ＣＣ５８９Ｌ　ＡＩＪｌシＢ　遍ψｊａｒ　Ｊｕａ二・Ｂａｒ−シ屯’Ｐｙ　 Ｈｌｓ　？ｌτ遍ヤ５９０　ＴＣＣＪｉＡＡ　Ｇｅｅ　Ｇｅｅ　Ｇｅｅ　ＧＣＯ （４−Ｃ！！！’ｌ：　Ｇ’！！ｌ　ＪＬＭ　ｆｆｉ口５ｈＣＣ６３１ｓａｗ− 紅１に１に１に１に１１シ屯Ｖ社ｎ・ｎ・蟲−６３２Ａ（！　Ｇｅｅ　Ｗ　Ｇ（ ！！’　ＴＣ入入Ｇ入！！τ　＾λ入Ｔλ！＾で！　１人ＧムＡ＾　αλλ入ｎ 　ｇ７３τｈｒＪｕＪＩ　Ｇｌｕ、Ａｌａ　１１＠ｘ　八ｒｇ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ 　ＴＹｒ　工１ａ　Ｇｌｕ　ＬＦ　Ｇｌｕ　工１龜１１００　Ｎｄ１−ニー１１ ５０ 〒〒テ！＾Ｃ入で〒ｍλテテλ＾入〒テ　τム’ｒｃｃａ＾Ｃ＾ｃｃｒｃτ為＾ ＾Ｃ！テ！＾ＬＴＣｎＴ＾＾島ｌｉｅ＾！Ｇ！ｉｃＡｍへｉ＾！＾＾ｃ！＾ｃＧ ！α入λＭλ！Ｇ！ＬＷ門ツシ−−で！テ＾轟＾為１ＭＭ−一　陣）ン〉　神− −−閃叩ａ　−−４薫□關１１１１１１１１１　Ｗ−ロ　−１Ｉ＊　―ｏ−Ｈ６ ＣＩＣＩ　ＣＩ　−認−１−ｘ　μ４ｍｇ４　＠＠ａｓｔａｔａ　＞＞＞＞＞　 ＣＫｊＣｌ　６　ｔｇａｇｗｗｉ＆ｉＪａ＋鋺　〉（シシ＞　ｈａｍｓ−冨冨シ ー−減滅に　属　寓＝雪冨沖關１　＠−沖−鵬赫−１１＾−６６１１１６ｍ　− 一りＯ＠−■　Ｉ−ＩＩ＋１１＋ｌｌ−１−一一一−４４鴫−−−４−↓ｈ−− −−−−　沖沖−−−トド−１１１論（鴫−−−一　−−−４１ａ＋ｍｃａ−ｓ ｅ　謔謔１ｍｍ　＞＞　＞　４４４　ｗｓｏｗ　Ｉａ　４４！１１＋！−〜＋Ｏ ＋　−ｔ＊　−ロ　１　−ＮＩＯｌ　１−ＩＮＩＯ，１，、ｎＮ１ｏｌ　ｍｆｌ ｌ＋　−１１１１へ−ｆｆＭ　Ｍ　ｌ’ｌｌ＋ｍ　ＭＭ　Ｍ　〜−〜−ｎ　〜− 〜ＦＩＭ　へ−〜ｎ円　〜−■ｎ　〜−〜ｉ−−エ蓼−ｋ＋＋＋ｌ　、１ｌｌｌ 　ｌ’Ｗ＋＋＋＋　＋＋＋　、Ｍ　□デ、１補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年１０月３日

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＩＶ感染Ｔ細胞または単球／マクロファージにおけるヒト免疫不全ウイル ス（ＨＩＶ）抗原発現を阻害する能力を有するトリコサンチンタンパク質をコー ド化するクローン化核酸。
2. ２．当該核酸分子が、塩基対４０９〜１１４９が、トリコサンテス・キリロウィ イ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓｋｉｒｉｌｏｗｉｉ）から単離されたトリコサ ンチンの成熟形をコード化している配列： 【配列があります】 の中に含まれている、請求の範囲第１項の核酸。
3. ３．塩基対４０９〜１１４９から得られるそしてトリコサンテス・キリロウィイ からの成熟トリコサンチンをコード化している、請求の範囲第２項の核酸。
4. ４．さらに、（ａ）ＴＣＳの成熟形の中に存在しないアミノ末端延長部分をコー ド化している塩基対３４０〜４０８；および（ｂ）ＴＣＳの成熟形の中に存在し ないカルボキシ末端延長部分をコード化している塩基対１１５０〜１２０６から なる群から選択される配列を含む、請求の範囲第３項の核酸。
5. ５．塩基対４０９から１１４９までを延長しそしてさらにプロモーター、リボゾ ーム結合部位、および塩基対４０９の前にかつに隣接して置かれているＡＴＧ開 始コドン、および塩基対１１４９の後にかつに隣接して置かれている終止コドン を含む発現ベクターを含む、請求の範囲第１項の核酸。
6. ６．（ａ）ＨＩＶ感染Ｔ細胞または単球／マクロファージにおいてヒト免疫不全 ウイルス（ＨＩＶ）抗原発現を阻害する能力を有するトリコサンチンタンパク質 をコード化している核酸；および （ｂ）プロモーター、リボゾーム結合部位、および位置４０９でアミノ末端コド ンの前にかつに隣接して置かれているＡＴＧ開始コドン、および位置１１４９で カルボキシ末端コドンの後にかつに隣接して置かれているカルボキシ末端コドン の後にかつに隣接して置かれている終止コドンを含む発現ベクター。
7. ７．当該核酸が、トリコサンテス・キリロウィイ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓ ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ）から単離されたトリコサンチンの成熟形をコード化してい る配列：【配列があります】 の中に含まれている、請求の範囲第６項の発現ベクター。
8. ８．発現ベクターが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターであり、そしてコード 配列が、ＡＴＧ開始コドンを含むＮｃｏＩ部位でベクター中のリボゾーム結合部 位に接合されており、そしてベクター中のＨｉｎｄＩＩＩ部位でその反対末端で 接合されている、請求の範囲第６項の発現ベクター。
9. ９．反復プライマー開始ストランド伸長法によって、トリコサンテス・キリロウ ィイからのトリコサンチンタンパク質の第一および第二領域の遺伝情報を指定し ている選択的に増幅されたゲノムフラグメントを得る際に使用するための、当該 第一トリコサンチン領域のためのコード配列を含むゲノムフラグメントのアンチ センスストランドでハイブリッド形成をするのに有効である少なくとも１つのプ ライマー種を含む縮退プライマーのセンスストランドセット、および当該第ニト リコサンチン領域のためのコード配列を含むゲノムフラグメントのセンスストラ ンドとハイブリッド形成をするのに有効である少なくとも１つのプライマー種を 含む縮退プライマーのアンチセンスセットを含むプライマー混合物。
10. １０．（ｉ）当該第一および第二トリコサンチンタンパク質領域が、アミノ酸配 列において、それぞれ、植物リボゾーム阻害タンパク質の中の第一および第二の 離れた領域に相同しておりそして（ｉｉ）当該プライマー混合物が、当該リボゾ ーム阻害タンパク質の遺伝情報を指定しているゲノムフラグメントを選択的に増 幅するために同様に使用され符る、請求の範囲第９項のプライマー混合物。
11. １１．Ｔ．ｋｉｒｉｌｏｗｉｉ組織からゲノムＤＮＡを得、第一トリコサンチン 領域のためのコード配列を含むゲノムフラグメントのアンチセンスストランドと ハイブリッド形成をするのに有効である少なくとも１つのプライマー種を含む縮 退プライマーのセンスストランドセットを提供し、第ニトリコサンチン領域のた めのコード配列を含むゲノムフラグメントのセンスストランドとハイブリッド形 成をするのに有効である少なくとも１つのプライマー種を含む縮退プライマーの アンチセンスセットを提供し、ゲノムフラグメント、プライマーの２つのセット 、４つのデオキシヌクレオシドトリホスファート全て、およびＤＮＡポリメラー ゼを含む増幅混合物を調整し、そして 当該増幅混合物の反復プライマー開始ストランド伸長法によって、両方のコード 領域のコード配列を含むゲノムフラグメントを選択的に増幅することを含む、ト リコサンテス・キリロウィイ（Ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓｋｉｒｉｌｏｗｉｉ ）からのトリコサンチンの第一および第二領域の遺伝情報を指定する領域を含む ゲノムフラグメントを選択的に増幅する方法。
12. １２．このようなリボゾーム不活性化タンパク質を生産する植物源からゲノムＤ ＮＡを得、 アミノ酸配列においてこのようなリボゾーム不活性化タンパク質の１つの領域に 相同するトリコサンテス・キリロウィイ（ＴｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓＫｉｒｉ ｌｏｗｉｉ）から単離されるトリコサンチンの領域の遺伝情報を指定するＤＮＡ 配列にハイブリッド形成をするのに有効である少なくとも１つのプライマー種を 含む縮退プライマーのセンスストランドセットを提供し、アミノ酸配列において このようなリボゾーム不活性化タンパク質の第二の領域に相同するトリコサンテ ス・キリロウィイ（ＴｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｅｓＫｉｒｉｌｏｗｉｉ）から単離 されるトリコサンチンの第二の領域の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列にハイブリ ッド形成をするのに有効である少なくとも１つのプライマー種を含む縮退プライ マーのアンチセンスストランドセットを提供し、当該ゲノムフラグメント、プラ イマーの２つのセット、４つのデオキシヌクレオシドトリホスファート全て、お よびＤＮＡポリメラーゼを含む増幅混合物を調製し、そして 増幅混合物の反復プライマー開始ストランド伸長法によって、当該リボゾーム不 活性化タンパク質のコード配列を含むゲノムフラグメントを選択的に増幅する、 ことを含む、植物リボゾーム不活性化タンパク質のためのゲノムコード配列を得 るための方法。
13. １３．（ａ）ＨＩＶ感染Ｔ細胞または単球／マクロファージにおいてヒト免疫不 全ウイルス（ＨＩＶ）抗原発現を阻害する能力を有する；（ｂ）トリコサンテス ・キリロウィイから得られるα−トリコサンチンと共に配列中に対応する組換え 生産トリコサンチンタンパク質を含む；そして（ｃ）トリコサンチン・キリロウ ィイ植物材料から単離されたトリコサンチンと関連した汚染物資の含まない トリコサンチン組成物。
14. １４．配列： 【配列があります】 を含む請求の範囲第１３の組換え生産タンパク質。
15. １５．配列のアミノ末端に付着して、ＨＩＶ感染細胞の表面に存在するＨＩＶ関 連のｇｐ１２０抗原に特異結合を示す、可溶性ＣＤ４ペプチドをさらに含む、請 求の範囲第１４項の組換え生産タンパク質。
16. １６．配列のカルボキシ末端に付着して、ＨＩＶ感染細胞の表面に存在するＨＩ Ｖ関連のｇｐ１２０抗原に特異結合を示す、可溶性ＣＤ４ペプチドをさらに含む 、請求の範囲第１４項の組換え生産タンパク質。
17. １７．配列 【配列があります】 を有するカルボキシ末端延長部分をさらに含む、請求の範囲第１４項の組換え生 産タンパク質。
18. １８．配列 【配列があります】 を有するアミノ末端延長部分をさらに含む、請求の範囲第１４項の組換えタンパ ク質。
19. １９．（ａ）ＨＩＶ感染Ｔ細胞または単球／マクロファージにおいてヒト免疫不 全ウイルス（ＨＩＶ）抗原発現を阻害する能力を有する；（ｂ）配列 【配列があります】 の中に含まれる核酸によってコード化される組換え生産トリコサンチンタンパク 質を含む；そして （ｃ）トリコサンチン・キリロウィイ植物材料から単離されるトリコサンチンと 関連する汚染物質を含まない トリコサンチン組成物。
20. ２０．当該タンパク質をコード化しているＤＮＡ配列を発現ベクターの中に挿入 し、 適当な宿主をベクターで形質転換し、 そして当該ベクターによって発現された組換えタンパク質を単離する、ことを包 含するトリコサンテスから得られるトリコサンチンの官能基特性を有するトリコ サンチンタンパク質を生産するための組換え方法。
21. ２１．発現ベクターがｐＱＲ１９でありそして宿主が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で ある、請求の範囲第２０項の方法。
22. ２２．当該ＤＮＡ配列が、トリコサンテス・キリロウィイから単離されるトリコ サンチンの成熟形をコード化している配列：【配列があります】 の中に含まれる、請求の範囲第２０項の方法。
23. ２３．欄の中のアミノ酸がそのアミノ酸残基のために代わりの選択でありそして 星印がその残基でアミノ酸を省略する選択の自由を表している次のアミノ酸配列 ： 【配列があります】 によって定められる群から選択されるタンパク質配列をコード化しているヌクレ オチド配列を有するクローン化核酸。
24. ２４．欄の中のアミノ酸がそのアミノ酸残基のための代わりの選択でありそして 星印がその残基でアミノ酸を省略する選択の自由を表している次のアミノ酸配列 ： 【配列があります】 によって定められる群から選択されるタンパク質配列をコード化しているヌクレ オチド配列を有するクローン化核酸。