JPH06503712A - アシルオキシアシルヒドロラーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４２、前記アシルオキシアシルヒドロラーゼは、番号３５のロイシンから番号５ ７５のヒスチジンまでの第１図のアミノ酸配列：番号３５のロイシンから番号５ ７５のヒスチジンまでの第２図のアミノ酸配列：番号３５のロイシンから番号５ ７５のヒスチジンまでの第３図のアミノ酸配列または番号３５のロイシンから番 号５７５のヒスチジンまでの第４図のアミノ酸配列を含んでなる、請求項３６に 記載の真核生物の細胞。

４３、前記細胞か培養した哺乳動物細胞または酵母菌細胞である、請求項３６に 記載の真核生物の細胞。

４４．前記ＤＮＡ配列かさらに、小さいサブユニットと大きいサブユニットとの 間においてアミノ酸配列（Ｒ１）、−Ｒ２−Ｒ２（ここでＲ１゜Ｒ２およびＲ１ はＬｙｓまたはＡｒｇてあり、そしてｎ＝ｏ、Ｉ、２゜３または４である）を特 徴とする請求項３６に記載の真核生物の細胞。

４５、アシルオキシアシルヒドロラーゼの大きいサブユニットの発現を指令する ために必要な情報を含有する第１　ＤＮＡ構成体およびアシルオキシアシルヒド ロラーゼの小さいサブユニットの発現を指令するために必要な情報を含有する第 ２　ＤＮＡ構成体で形質転換またはトランスフェクションされた真核性宿主細胞 。

４６、前記細胞が培養した哺乳動物細胞または酵母菌細胞である、請求項４５に 記載の真核生物の細胞。

４７、アシルオキシアシルヒドロラーゼの大きいサブユニットの発現を指令する ために必要な情報を含有する第１　ＤＮＡ構成体およびアシルオキシアシルヒド ロラーゼの小さいサブユニットの発現を指令するために必要な情報を含存する第 ２　ＤＮＡ構成体を含有する真核生物の宿主細胞。

４８、前記細胞は培養しだ哺乳動物細胞または酵母菌細胞である、請求項４７に 記載の真核生物の細胞。

４９、次の工程： （ａ）アシルオキシアシルヒドロラーゼの発現を指令するために必要な情報を含 有する第２　ＤＮＡ構成体で形質転換またはトランスフェクションされた培養さ れた真核性宿主細胞を増殖させ：そして（ｂ）前記細胞からアシルオキシアシル ヒドロラーゼを単離する、を含んでなる、アシルオキシアシルヒドロラーゼを生 産する方法。

５０　前記真核性細胞が培養した哺乳動物細胞または酵母菌細胞である、請求項 ４９に記載の方法。

５１、次の工程。

（ａ）アシルオキシアシルヒドロラーゼの分泌を指令するために必要な情報を含 有する第２　ＤＮＡ構成体で形質転換またはトランスフェクションされた真核性 宿主細胞を増殖させ：そして（ｂ）前記細胞からアシルオキシアシルヒドロラー ゼを単離する、を含んでなる、アシルオキシアシルヒドロラーゼを生産する方法 。

５２、前記真核性細胞か、培養した哺乳動物細胞または酵母菌細胞である、請求 項５１に記載の方法。

５３、次の工程： （ａ）アシルオキシアシルヒドロラーゼの大きいサブユニットの発現を指令する ために必要な情報を含有する第１　ＤＮＡ構成体およびアシルオキシアシルヒド ロラーゼの小さいサブユニットの発現を指令するために必要な情報を含有する第 ２　ＤＮＡ構成体で形質転換またはトランスフェクションされた真核性宿主細胞 を増殖させ：そして（ｂ）前記細胞からアシルオキシアシルヒドロラーゼを単離 する、を含んでなる、アシルオキシアシルヒドロラーゼを生産する方法。

５４、前記真核性細胞が、培養した哺乳動物細胞または酵母菌細胞である、請求 項５３に記載の方法。

５５、次の工程： （ａ）アシルオキシアシルヒドロラーゼの大きいサブユニットの分泌を指令する ために必要な情報を含有する第１　ＤＮＡ構成体およびアシルオキシアシルヒド ロラーゼの小さいサブユニットの分泌を指令するために必要な情報を含有する第 ２　ＤＮＡ構成体で形質転換またはトランスフェクションされた真核生物の宿主 細胞を増殖させ：そして （ｂ）前記細胞からアシルオキシアシルヒドロラーゼを単離する、を含んでなる 、アシルオキシアシルヒドロラーゼを生産する方法。

５６　前記真核性細胞か培養した哺乳動物細胞または酵母菌細胞である、請求項 ５５に記載の方法。

５７、＠乳動物に治療的に有効量の組み換えアシルオキシアシルヒドロラーゼを 投与することからなる、グラム陰性バクテリアのセプシスをもつ哺乳動物を処置 する方法。

明細書 アシルオキシアシルヒドロラーゼの製造方法技術分野 本発明は、アシルオキシアシルヒドロラーゼをコードするＤＮＡ配列、アシルオ キシアシルヒドロラーゼの発現を指令することかできるＤＮＡ構成体およびアシ ルオキシアシルヒドロラーゼを生産する方法に関する。

発明の背景 血流または組織の中へのグラム陰性バクテリアの侵入の臨床的結局であるグラム 陰性敗血症は、米国において毎年７１．０００〜３００．０００の症例の頻度で 起こる。敗血症の症例のほぼ４０％は、敗血症の重大でありかつ急速に発生する 合併症である敗血性ショックに関連する。

敗血性ショックは、低血圧、凝固欠乏、呼吸不全および死亡により特徴づけられ る。

グラム陰性バクテリアにより誘発される動物における炎症の応答の複雑な配列は 、これらのバクテリアの外膜の中に存在するリポ多糖類（ＬＰＳ）により誘発さ れる。典型的には、ＬＰＳ分子は０多糖、Ｒ−コアのオリゴ糖および脂質Ａから 成る。脂質Ａの構造は、広範囲のバクテリアの属で高度に保存され、そして一般 にＬＰＳの生物学的活性の大部分の原因となると信じられる。ＬＰＳはある数の 毒性および育苗な炎症性の応答を誘発すると信じられ、そしてマクロファージ、 好中球および内皮細胞を包含するターゲット細胞とバクテリアとに相互作用の原 因となると信じられる。毒性の応答は低血圧、凝固欠乏および死亡を包含するか 、育苗な応答は抗体合成の増加、食細胞の移動および急性期タンパク質の合成を 包含する。

現在のところ、敗血症の危険な状態の集団を免疫化するワクチンは存在しない。

敗血症の現在の処置は、初期の診断および引き続く抗生物質治療に大きく頼って いる。敗血性ショックは、グラム陰性敗血症に関連する症状の急速な開始および 深刻さのために、同時的抗生物質治療で症状的に処置される。現在の処置は、最 良と推定される抗生物質の最初の投与および引き続く血液培養による同定および 抗生物質治療の調整から成る：しかしなから、処置の養生法は毒性作用を誘発し 続けるＬＰＳを不活性化しない。

グラム陰性敗血症のための処置として免疫治療が示唆されている。

Ｚｉｅｇｌｅｒら（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、、　３０７：１２２５−１２ ３０）は、ヒト抗コアＬＰＳ抗血清を使用してランダム化され、コントロールさ れた実験を実施し、免疫血清か菌血性致死率を減少することを証明した。ヒトポ リクローナル抗血清は有意な欠点を有する。さらに、このような調製物の標準化 は困難であり、そしてウィルスの感染、例えば、旧■または肝炎を移す危険が存 在する。モノクローナル抗体調製物を使用して敗血症を処置してきているが、こ のような処置の前動性は明白ではない。

好中球は酵素アシルオキシアシルヒドロラーセ（ＡＯＡＨ）を含有することか示 され、この酵素は第２脂肪酸アシル鎖を除去することによってサルモネラ・ティ フィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のＬＰＳの詣 質Ａ部分を部分的に脱アシル化する（ＨａｌｌおよびＭｕｎｆｏｒｄ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８０：６６７１−６６７５ ．　１９８３）　。ＡＯＡＨは５０．０００および１４．０００〜２０．０００ の見掛けの分子量をもつ２つのジサルファイト結合したサブユニットを含有する ことか示された（ＭｕｎｆｏｒｄおよびＡＯＡＩ（処理したＬＰＳを皮肉注射し 、そして引き続いて未処理ＬＰＳの静脈内注射でチャレンジしたとき、皮膚の皮 肉の注射部位において出血の壊死はほとんどあるいはまったく存在しなかった。

対照的に、未処理しＰＳを最初に注射したウサギは壊死を示した。ＡＯＡＨ処理 したＬＰＳは、ＬＰＳの毒性を１００倍減少するか、β−リンパ球の前糸分裂誘 発の刺激をわずかに１２倍だけ減少することが発見された。Ｍｕｎｆｏｒｄおよ びＨａｌｌ　（米国特許第４．９２９．６０４号）は、ＡＯＡＨかグラム陰性バ クテリアにより引き起こされた敗血性ショックの処置／防止において有用である 有能性かあることを示唆した。

ＭｕｎｆｏｒｄおよびＨａｌｌ（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、前掲）により報 告されるような好中球からのＡＯＡＨの精製はある数の欠点を有する。ＡＯＡＨ は培養したヒト前骨髄法（ｐｒｅｍｙｅｔａｃｙｔ　ｉｃ）細胞系ＨＬ−６０、 並びに末梢血液の単球および好中球から精製されたか、それはほんの微量のタン パク質であり、細胞リゼイトの中でタンパク質の０．００１％より少ない量であ る。この晴製法は労力を必要とする多工程のプロトコルであり、それ自体商業的 に大規模化することができない。もとの活性の７．８％に相当する９、５μｇの ＡＯＡＨの調製物か、１５０リツトルの培地の中で２月の期間にわたって増殖し たほぼ５Ｘ１０”細胞から精製された（ＭｕｎｆｏｒｄおよびＨａｌｌ、前掲） 。さらに、すべてのＨＬ−６０細胞系を誘発してＡＯＡＨを生産することができ るわけでなく、そしてＡＯＡＨの比活性は細胞の継代培養のとき２〜３倍変動す る。末梢血液の好中球および単球からのＡＯＡＨの精製は、感染性因子、例えば 、肝炎ウィルス、Ｉ（［Ｖ−１および他のウィルス性因子を同時に精製する危険 を有し、そして大量の血液の入手可能性は常に保証されるわけはない。

したかって、なかでも、敗血性ショックの処置における治療剤としておよびＬＰ Ｓのワクチンの生産のために有用である、比較的大量のＡＯＡ）Ｉの純粋な調製 物を製造する方法かこの分野において必要とされている。本発明は、組み換えＤ ＮＡ技術を使用し、これによりウィルスの汚染の問題を俳除しそして商業的に可 能な量の生物学的に活性な組み換えＡＯＡＩ（を提供することによって、これら のおよび他の関係する必要１’ｊを満足する。

発明の要約 簡単に述へると、本発明はアシルオキシアノルヒドロラーセ（ＡＯＡＨ）をコー トする単離されたＤＮＡ配列を開示する。本発明の１つの態様において、ＤＮＡ 配列はｃＤＮＡ配列である。本発明のある種の態様は、ヌクレオチド３５４から ヌクレオチド１９７６まての第１図または第３図のＤＮＡ配列、ヌクレオチド３ ８９からヌクレオチド２０１１まての第３図のＤＮＡ配列、またはヌクレオチド １２０からヌクレオチド１７４２まての第４図のＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ 配列を包含する、ＡＯＡ）Ｉをコードする代表的なりＮＡ配列を開示する。本発 明の態様の範囲内において、ＡＯＡＨをコードする代表的なりＮＡ配列は、第１ 図、第２図、第３図または第４図の番号３５のロイシンから番号５７５のヒスチ ジンまでアミノ酸配列をコードする。他の態様において、ＤＮＡ配列はさらにア ミノ酸配列（Ｒ，）−−Ｒ，−Ｒ，（ここでＲ１，Ｒ２およびＲ３はリジン（ｌ ｙｓ）またはアルギニン（ａｒｇ）であり、そしてｎ＝０．１゜２．３または４ である）をコードする。

本発明のなお他の態様において、ＤＮＡ配列はＡＯＡＨの小さいサブユニットを コートする。ある種の面において、ＡＯＡＨの小さいサブユニットをコードする ＤＮＡ配列は、第１図または第２図のヌクレオチド３５４からヌクレオチド７１ ９まてのＤＮＡ配列、第３図のヌクレオチド３８９からヌクレオチド７４８まて のＤＮＡ配列、または第４図のヌクレオチド＋２０からヌクレオチド４７９まで ＤＮＡ配列によりコートされることかできる。他の態様の範囲内において、ＡＯ ＡＨの小さいサブユニットをコートするＤＮＡ配列は、第１図、第２図、第３図 または第４図の番号３５のロイシンから番号１５４のアルギニンまてのアミノ酸 配列をコードする。

本発明の池の態様は、ＡＯＡＨの大きいサブユニットをコードするＤＮＡ配列に 関する。本発明のある種の態様において、ＡＯＡＩＩの大きいサブユニットは、 ヌクレオチド７２０からヌクレオチド１９７６までの第１図または第２図のＤＮ Ａ配列、ヌクレオチド７５５からヌクレオチド２０１１までの第３図のＤＮＡ配 列、またはヌクレオチド４８６からヌクレオチド１７４２までの第４図のＤＮＡ 配列によりコードされることかできる。

本発明の他の態様は、第１図、第２図、第３図または第４図の番号１５７のセリ ンから番号５７５のヒスチジンまでのアミノ酸配列を含んでなるＡＯＡＨの大き いサブユニットをコードするＤＮＡ配列を開示する。

本発明はある種の態様において、ＡＯＡＨの発現を指令するために必要な情報を 含有するＤＮＡ構成体を開示する。本発明の１つの態様において、分泌シグナル のペプチドをコードするＤＮＡ配列はこのＤＮＡ構成体の中に含まれる。ある種 の好ましい態様において、シグナルのペプチドはアミノ酸配列： Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−［１ｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ− Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅ　ｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ｅ　 ｒ−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉ　ｙ　−Ａ　Ｉａ−Ｔｒ　ｐ−Ａ　Ｉａ−５ｅｒ−Ｐｒ ｏ　−Ａ　１ａ−Ａｓ　氏|Ａｓ　ｐ−Ａｓ　ｐ− Ｇｌｎ−９ｅｒｐ−Ｇｌｎ−９ｅｒ−ＡｒまたはＭｅｔ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒ ｏ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｖａ　ｌ−Ａ　１ａ−Ｐｒｏ− Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇ　１ｙ−Ａ　ｌ ａ−Ｔｒ　ｐ−Ａ　I、　ａ である。

本発明は１つの態様の範囲内において、ＡＯＡＨの発現に必要な情報を含有する ＤＮＡ構成体を含有する真核性宿主細胞を開示する。本発明の他の実施態様にお いては、真核性宿主細胞を、ＡＯＡＨの大きいサブユニットの発現を指令するた めに必要な情報を含有する第１　ＤＮＡ構成体およびＡＯＡＨの小さいサブユニ ットの発現を指令するために必要な情報を含有する第２　ＤＮＡ構成体で形質転 換またはトランスフェクションする。ある種の好ましい態様の範囲内において、 真核性宿主細胞は培養した鴫乳動物細胞または酵母菌細胞である。

本発明のなお他の態様において、ＡＯＡＨの発現を指令するために必要な情報を 含有する第２　ＤＮＡ構成体で、あるいはＡＯＡＨの大きいサブユニットの発現 を指令するために必要な情報を含有する第１　ＩＩＮＡ構成体およびＡＯＡＨの 小さいサブユニットの発現を指令するために必要な情報を含有する第２　ＤＮＡ 構成体で形質転換またはトランスフェクションされた真核性宿主細胞を使用して 、ＡＯＡＨを生産する方法を記載する。次いで、そのように形質転換またはトラ ンスフェクションされた真核生物の細胞を、ＡＯＡＨの発現を誘発する条件下に 培養し、次いでこれを細胞または培養物から単離する。

図面の簡単な説明 第１図は、ＡＯＡＨをコードする代表的なヌクレオチド配列および推定されたア ミノ酸配列、Ｃ／２６　ＡＯＡＨｃＤＮＡを示す。小さい矢印は小さいサブユニ ットの推定上の開始点を意味する。大きい矢印は大きいサブユニットの推定上の 開始点を意味する。

第２図は、ＡＯＡＨをコードする代表的なヌクレオチド配列および推定されたア ミノ酸配列、４−３３　ＡＯＡＨｃＤＮＡ、を示す。使用した記号は第１図にお ける通りである。

第３図は、コンセンサスＡＯＡＨのヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸 配列を示す。使用した記号は第１図における通りである。

第４図は、ＡＯＡＨＩ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸 配列を示す。使用した記号は第１図における通りである。

第５図は、プラスミドｐＶＥＧの構成を示す。使用した記号は次の通りである： 　Ｔ７ｐｒｏ　、Ｔ　７プロモーター：Ｔ１およびＴ２、それぞれ、合成および 天然Ｔ７ターミネーター、Ｍ２Ｓ、Ｍ１３遺伝子間領域である。

第６図は、プラスミド９ＶＥＧ’の構成を示す。使用した記号は第５図における 通りであり、そして括弧はベクターの作製中に破壊された制限部位を示す。

第７図は、プラスミドｐＶＥＧＴ　’の構成を示す。使用した記号は第１図にお ける通りであり、そしてｐＡはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｌｌ ｕｓｎｉｇｅｒ）のポリアデニル化配列である。

第８図および第９図は、それぞれ、プラスミドＶＡＰＤｘＲおよびｐＤＶＥＧ　 ’の構成を示す。使用した記号は次の通りである：ｏｒｉ、アデノウィルス５０ −■のマツプ単位の配列；Ｅ、　ＳＶ４０のエンハンサ−：　ＭＬＰ　、アデノ ウィルスの主要後期プロモーター；アデノウィルス２のトリパルタイト（ｔｒｉ ｐａｒｔｉｔｅ）プロモーター；ＳＳ、ｌ系列のＲＮＡスプライス部位：および ｐＡ、　ＳＶ４０のポリアデニル化配列。

第１Ｏ図は、プラスミドｐＲ３４３１の構成を示す。使用した記号は次の通りで ある：　ＳＶ４０ｐｒｏｍ、　４０プロモーター；　ＤＨＰＲ、ジヒドロフオレ ートリダクターゼ遺伝子：　ＳＶ４０ｔｅｒｍ、　、　ＳＶ４０ポリアデニル化 配列：ＭＴ−１、メタロチオネイン−１プロモーター；　４−３３ＡＯＡＨｃＤ ＮＡ、　４−３３ＡＯＡＨｃＤＮＡクローンから誘導された断片；　ＡＯＡＨＩ 　ｃＤＮＡ、　ＡＯＡＨＩ　ｃＤＮＡ。

発明の詳細な説明 本発明を記載する前に、以後使用するある種の用語の定義を記載することは本発 明の理解において助けとなるであろう。

ＤＮＡ構成体、　ＤＮＡ分子、またはこのような分子のクローンであって、ヒト の介在によりそれ以外は天然に存在しない態様で配置された配列を含有するよう に構成されたもの。

分泌シグナル配列：分泌ペプチドをコードするＤＮＡ配列。分泌ペプチドは、細 胞からの成熟ポリペプチドまたはタンパク質の分泌を指令するように作用するア ミノ酸配列である。分泌ペプチドは疎水性アミノ酸のコアにより特徴づけられ、 そして典型的には新しく合成されたタンパク質のアミノ末端に見いだされる。非 常にしばしば、分泌ペプチドは分泌の間に成熟タンパク質から切断される。プロ セシング部位は分泌ペプチド内にコードされるか、あるいは、例えば、リンカ− 配列のｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発または結合により分泌ペプチドに付加され ることかできる。ある種の分泌ペプチドは共同させて使用して、ポリペプチドお よびタンパク質の分泌を指令することかできる。他の分泌ペプチドと組み合わせ て使用することかできる１つのこのような分泌ペプチドは、酵母菌のノくリアー （Ｂａｒｒｉｅｒ）プロテアーゼの第３ドメインである。ここで使用するとき、 用語「分泌ペプチド」は、少なくとも天然に存在する分泌ペプチドの機能的部分 を含む。

分泌ペプチドはプロペプチドを包含してもよく、あるいは包含しなくてもよい。

一般に、プロペプチドはペプチドの翻訳後の修飾を促進するか、あるいはタンパ ク質を特定の細胞小器官にターゲ・ソティングする。ここで使用するとき、分泌 経路はリゾソームおよび液胞の中へのタンパク質の輸送経路、ペリブラスミ・ツ ク空間の中への輸送経路および培地への中へのタンパク質の輸出経路を包含する と理解されたい。

発現ベクター・問題のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の転写および翻訳を 指令する要素を包含するＤＮＡ構成体。このような要素は、プロモーター、エン ハンサ−１転写ターミネータ−およびポリアデニル化シグナルを包含する。ＤＮ Ａ構成体内にこれらの要素か含まれているので、生ずる発現ベクターはコードさ れたポリペプチドの発現および／または分泌を指令するために必要な情報を含有 する。

発現ベクターはさらに、自律的複製によるか、あるいは宿主のゲノムの中への組 み込みにより、肝細胞の中でそれらの複製を提供する遺伝情報を含有する。組み 換えＤＮＡのために普通に使用されている発現ベクターの例は、プラスミドおよ びある種のウィルスであるか、それらは両者の要素を含有することができる。そ れらは、また１または２以上の選択可能なマーカーを含むことかできる。

トランスフェクションまたは形質転換：精製されたＤＮＡの導入によりレセプタ ー細胞または微生物の遺伝子型を安定にかつ遺伝的に変更する方法。これは典型 的にはレセプター生物体の表現型の変化により検出される。用語「形質転換」は 一般に微生物に適用されるが、「トランスフェクション」は一般に多細胞の生物 体から誘導される細胞におけるこの方法を記載するために使用される。

培養した細胞：液体または固体の培地中である数の世代にわたって増殖すること ができる細胞。多細胞の生物体から誘導された細胞の場合において、培養した細 胞はその生物体から単細胞、組織または組織の一部分として分離された細胞であ る。

前述したように、ＡＯＡＨはほぼ５０ｋＤの大きいサブユニットおよび１４〜２ ０ｋＤの小さいサブユニットから構成された、ジサルファイド結合した２量体で ある。本発明の一部分として開示するように、ＡＯＡＨは現在のＡＯＡＨ精製手 順を時間を消費するかつ費用のかかるものとする微Ｉタンパク質である。（Ｍｕ ｎｆｏｒｄおよびＨａｌｌ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、前掲、は、はぼ２５ ．０００分子／細胞か存在することを示唆する。）　ＡＯＡＨは、ｎＷ　Ｗ　Ａ の３−ヒドロキシテトラデカノイル残基のヒドロキシル基に結合した第２脂肪酸 アシル基鎖を除去する。

本発明はＡＯＡＨをコードする代表的なりＮＡ配列およびアミノ酸配列を開示す る。ＡＯＡＨをコードする配列は、アミノ酸配列の中に小さい変動を生ずる配列 、例えば、遺伝学的多形性、種間の差のためのもの、およびタンパク質の生物学 的活性を実質的に変更しないてアミノ酸のブロックか付加、欠失または置換され ているものを包含する。

他の場合において、組み換えＡＯＡＩ（の配列におけるこのような変化を使用し て、調製物の意図する用途に依存して、ＡＯＡＨの生物学的活性を実質的に減少 または増加することができる。用語「生物学的活性」はＬＰＳから第２脂肪酸ア シル基を除去する能力を意味する。

ＡＯＡＨの生物学的活性は、例えば、米国特許第４．９２９．６０４号（これを ここに引用によって加える）に記載されているように、　３Ｈ−アシル、１４Ｃ −グルコサミン標識したＬＰＳからのトリチウム化脂肪酸の加水分解を測定する ことによってアッセイすることができる。ＡＯＡＨコード配列の中の変化は、天 然ＡＯＡＩ（の生物学的活性の保持に関して、充分に重複的なポリペプチドを生 ずるであろう。

ＡＯＡＨの小さいサブユニットの推定されたアミノ酸配列に基づいて、小さいサ ブユニットとスフィンゴ脂質アクチベータータンパク質（ＳＡＰ）の前駆体との 間に部分的相同性か見いだされる。ＳＡＰは、ＳＡＰ前駆体を４つの小さいサブ ユニットにタンパク質分解的にプロセシングすることによって生産され、スフィ ンゴ脂質の分解においてリソソームのヒドロラーゼの活性のために要求されるコ ファクターである。ＳＡＰ前駆体およびＳＡＰと共に働くリソソームのヒドラー ゼは異なる遺伝子によりコードされている。ＡＯＡＨの小さいサブユニットはま た、硫酸化糖タンパク質ｌ、ヒト肺表面プロティンＢおよびイフ姉表面ブ１コテ インＢに対する顕著な相同性を示す。ＡＯＡＨの小さいサブユニットの配列とこ れらの他のタンパク質との整列は、６つのＳＡＰシスティンのうちの４つかＡＯ ＡＨ配列の中て相手を有することを示す。

ＡＯＡＨの大きいサブユニットの推定されたアミノ酸配列の比較は、大きいサブ ユニットと膵臓リパーゼのコンセンサス必須セリン配列との間の部分的相同性を 説明した。膵臓リパーゼは必須のセリンのいずれかの側の６つの残基に及ぶ必須 のセリン付近における相同性を共有する（Ｍｉｃｋｅｌ　ら１．Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｎ＋、、　２６４：１２８９５−１２９０１．１９８９およびしｏｗｅら 、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６４：２００４２−２００４６．　１９８９ ）。

本発明の目的は、アシルオキシアシルヒドロラーセ（ＡＯＡＨ）をコードするＤ ＮＡ配列を提供することである。本発明の追加の目的は、ＡＯＡＨの大きいサブ ユニットおよびＡＯＡＨの小さいサブユニットをコードするＤＮＡ配列を提供す ることである。また、本発明の目的は、組み換え宿主細胞からＡＯＡＨを製造す る方法を提供することである。本発明の１つの面は、ＡＯＡＨの発現を指令する ことかできるＤＮＡ構成体である。本発明の他の面は、ＡＯＡＨの発現を指令す ることができるＤＮＡ構成体を含有する真核性宿主細胞を得ることである。本発 明は、ＡＯＡＨが好中球の中に見いだされるより実質的に高いレベルで生産され るという利点を提供する。さらに、本発明は、組み換え細胞からＡＯＡＨかいっ そう容易に単離される培地の中へ輸送されるＡＯＡＨを生産するという利点を提 供する。こうして、組み換えＡＯＡＨはそれか好中球の中で、典型的には関連す る分子と別に生産され、これにより、後述するように、実質的に純粋な組み換え ＡＯＡＨの調製を促進することかできる。本発明の他の利点は、培養した組み換 え細胞からＡＯＡＨを生産し、こうしてウィルスの感染の伝播の危険を排除する と同時に、生物学的に活性なＡＯＡＨまたは活性化することかできるＡＯＡＨを 大量に生産する方法を提供するということである。

ＡＯＡＨをコードするＤＮＡ配列はｃＤＮＡおよび／またはゲノムのライブラリ ーから単離することができるが、ＡＯＡＨに対するモノクローナル抗体またはＡ ＯＡＨのアミノ酸配列のためのコードに基づくプローブの混合された族を使用し て、ＡＯＡＨのｃＤＮＡ配列を単離しようとする本発明者らによる最初の試みは 不成功に終わった。開示されたアミノ酸配列のための遺伝コードの高い重複およ び細胞の中に存在するＡＯＡＨか微１であることは、伝統的なｃＤＮＡスクリー ニング法の失敗に寄与すると信しられる。

本発明の１つの面において、ＡＯＡＩＩをコードするポリヌクレオチド配列、ど くにＤＮＡ配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅されたｅ　 Ｄ　Ｎ　Ａ配列から単離される。ｃＤＮＡの調製のためのＲＮＡを単（ＡＴＣＣ ＣＲＬ　２．壜Ｏ）、培養したリンパ腫細胞系、例えば［Ｊ−９３７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ＋５９３）　、末梢血液の単球または好中球、ウサギ、ニワトリ、ブタ、 マウスおよびウソの末梢血液白血球Ｕ−９３７細胞がとくに好ましい。

ＡＯＡＨをコードするＤＮＡ配列を単離する代表的な方法は、ＰＣＲ増幅の使用 を包含する。既知のＡＯＡＨのＤＮＡ配列の不存在下に、合成オリゴヌクレオチ ドブライマーを、コア配列と表示する、ＡＯＡＨの大きいサブユニットのアミノ 末端に由来するアミノ酸配列から設計した。

遺伝コードの高い重複のために、コア配列はＡＯＡＨをコードするＤＮＡの直接 の増幅のためのプライマーの設計のために不適当であった。

この問題を克服するために、高度に縮重性のオリゴヌクレオチドのプライマーを 、コア配列のアミノ末端およびカルボキシ末端の部分から設計した。増幅された ＤＮＡ配列のレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）を促進するために、フランキングクロ ーニング配列、例えば、制限部位をプライマーの中に含めた。これらの縮重性プ ライマーを使用して、Ｌｅｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２３９：１２８８−１２９ １．１９８８、その開示をここに引用によって加える）により記載されている方 法を使用して、Ｕ−９３７のｍＲＮＡから調製した、ランダムプライムドｃＤＮ ＡからのＡＯＡＨをコードする配列を増幅した。生ずる増幅されたＤＮＡ配列を クローニングベクター中にサブクローニングして、コア配列の配列分析を促進し た。適当なりローニングベクターは＋１ｔＪＣ型プラスミドを包含する（Ｍａｒ ｓｈら、Ｇｅｎｅ、　３２：４８１−４８５．　１９８４：Ｍｅｓｓｉｎｇ、　 Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、＋０１：２ｔ−７７゜＋９８３；　Ｙａｎ ｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｏｎｅ、　３３：１０３．　＋９８５）　、好ま しいクローニングベクターはバクテリオファージラムダのクローニングベクター である。とくに好ましいラムダクローニングベクターはλＺＡＰ（Ｓｔｒａｔｇ ｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州うジョラ）および λＨＧ−３（下に記載する）である。

コア配列に相当するオリゴヌクレオチドプローブを合成し、そして１（Ｌ−６０ 細胞からのｍＲＮＡから調製したランダムプライムドｃＤＮＡをブロービングす るために使用した；しかしなから、はぼ８００および９ｏｏｂｐの２つのみの部 分的ｃＤＮＡのクローンか７．２Ｘ１０＠フアージのクローンから単離された。

配列の分析は、２つのクローンかオーバーラッピングしているか、異なる５′末 端を有することを示し、メツセージの異なるスプライシングを示唆した。クロー ンの配列の分析は、ＡＯＡＨの両者のサブユニットか単一の遺伝子によりコード されることを示唆した；しかしなから、ｃＤＮＡは不完全であり、そしてＡＯＡ Ｈのコード配列の３′末端を含有しなかった。

λＧＴＩＩ　ｃＤＮＡライブラリーから部分的のみのｃＤＮＡを得た後、ＰＣＲ 増幅を使用してヒトＡＯＡＨをコードする完全なりＮＡ配列をクローニングした 。簡単に述べると、５′および３　’　ＡＯＡＨ配列をコードするｃＤＮＡをＵ −９３７ポリ（Ａ）　”　ＲＮＡから独立に単離した。３　’　ＡＯＡＨＤＮＡ 配列の増幅のために鋳型として使用するために相補的ｃＤＮＡを調製し、ここで 、クローニング配列、例えば、オリゴ−ｄ　（Ｔ）　）ラクト（ｔｒａｃｔ）に 対して５′に位置する種々の制限部位をコードする配列を含存するオリゴ−ｄ　 （Ｔ）プライマーを使用してサブクローニングを促進した。コア配列の一部分に 相当する配列をコードするプライマーを使用して第２鎖を合成することによって 、オリゴ−ｄ　（Ｔ）プライムトｃＤＮＡから３　’　ＡＯＡＨＤＮＡを増幅す るための鋳型として二本鎖ｃＤＮＡを調製することか好ましいことかある。

５　’　ＡＯＡＨＤＮＡ配列の増幅のための鋳型として使用する二本＠ｃＤＮＡ を、Ｕ−９３７ポリ（Ａ）　”　ＲＮＡから、コア配列の一部分に相当する配列 をコードするアンチセンスプライマーを使用して調製した。生ずるｃＤＮＡを、 Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｃｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　１９８２）により本質的に記載され た方法を使用して、Ｇ−ティリングした。Ｇ−ティルトｃＤＮＡの第２鎖を合成 し、ここでクローニング配列例えばポリ−ｄ（Ｃ）トラックに対して５′の種々 の制限部位をコードする配列を含有するポリ−ｄ　（Ｃ）プライマーを使用して サブクローニングを促進する。

ＡＯＡＨメツセージは稀であるので、５′および３′鋳型を、５′および３　’ 　ＡＯＡＨコード配列をコードするｃＤＮＡについて濃縮した。ｃＤＮＡ調製物 をまず１％の低融点のアルカリ性アガロースゲル上で分別した。３　’　ｃＤＮ Ａを含有するレーンを１２個の０．５ｃｍの断片に切断し、そして５　’　ｃＤ ＮＡを含有するレーンを８個のｌｃ［１１の断片に切断した。

ｃＤＮＡを溶出し、そして増幅した。コア配列の一部分をコードするセンスプラ イマーおよびオリゴ−ｄ　（Ｔ）プライマーの一部分をコードするプライマーを 使用して、３　’　ＡＯＡＨｃＤＮＡを増幅した。アンチセンスコア配列をコー ドするプライマーおよびオリゴ−ｄ　（Ｃ）プライマーの一部分をコードするプ ライマーを使用して、５　’　ＡＯＡＨｃＤＮＡを増幅した。オリゴ−ｄ　（Ｔ ）およびオリゴ−ｄ　（Ｃ）のプライマーかクローニング配列を含有する場合、 好ましいプライマーはクローニング配列をコードするであろう。Ｍａｎｉａｔｉ ｓら（前掲）に本質的に記載されている方法を使用するスロットプロット分析を 、プローブとしてアンチセンスプライマーを使用して各ＰＣＲ反応の一部分につ いて実施した。サザン分析からの証拠は、適当なｃＤＮＡを、３′ＡＯＡＨコ一 ド配列の増幅のためのゲル断片＃３および５　’　ＡＯＡＨコード配列の増幅の ために断片＃４に狭くした。

５′および３　’　ＡＯＡＨコード配列をコードするＤＮＡ配列の増幅のための プライマーは、Ｈａｇｅｎ（同時係属米国特許出願環０７／３２０．１９１号、 これをここに引用によって加える）により本質的に記載されているように設計し た。簡単に述べると、「プライム配列」と呼ぶ配列を含有するプライマーを使用 して、方向的方法で、クローニングベクターの中への増幅されたＤＮＡ配列のサ ブクローニングを促進した。

オリゴヌクレオチドブライマーを式ＸＩＴアＮ、を使用して設計し、ここでＸ、 は３〜約２５ヌクレオチドの長さ、好ましくは約１２〜約１５ヌクレオチドの長 さのデオキシチミジンモノホスフェート（ｄ　（Ｔ）　）以外のデオキシヌクレ オチドモノホスフェートの配列であり、モしてＴアは１または２以上、好ましく は２または３以上のデオキシチミジンモノホスフェートである。Ｎ、は末端のｃ ＤＮＡ配列と同一であるか、あるいはそれに対して相補的であるオリゴデオキシ ヌクレオチドである。３′プライム配列、Ｘ、Ｔアを３′プライムプライマーの ３′配列として使用するために設計し、そして５′プライム配列Ｘ、Ｔ、を５′ プライムプライマーの５′配列として使用するために設計し、ここでＸＩおよび Ｘ、の配列は異なりかつ十分に非相補的であって、効率よいクローニングのため に必要であるようにそれらが互いにアニーリングするのを防止する。さらに、Ｘ ｌおよびＸ２は非回文的である。

２つのプライムプライマー、Ｘ、Ｔ、Ｎ、およびＸ、Ｔ、Ｎ、を３　’　ＡＯＡ Ｈ配列の増幅のために設計し、そして２つのプライムプライマーＸ＋ＴアＮ、お よびＸ、ＴアＮ４を５　’　ＡＯＡＨ配列の増幅のために設計し、ここでＸ、、 Ｘ、およびＴアは上に定義した通りである；Ｎ、はオリゴ−ｄ　（Ｔ）プライマ ーの一部分をコードするオリゴデオキシヌクレオチドである；Ｎ２はコア配列の センス鎖に相当するオリゴデオキシヌクレオチドである；Ｎ、はコア配列のアン チセンス鎖に相当するオリゴデオキシヌクレオチドである：Ｎ４はオリゴ−ｄ　 （Ｃ）プライマーの一部分をコードするオリゴデオキシヌクレオチドである。濃 縮された５′および３′鋳型ｃＤＮＡを、Ｆｒｏｈｍａ口ら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５：８９９８−９００２．１９８８）により 本質的に記載されているように、プライムプライマーを使用して増幅した。

ｄＡＴＰの存在下に７４ＤＮＡポリメラーゼで処置することによって、増幅され たｃＤＮＡ上に付着末端をつくった。処理したｃＤＮＡをゲル精製し、そして増 幅されたｃＤＮＡによりコードされたプライム配列に対して相補的な付着末端を 含有するベクターの中にサブクローニングした。

ＤＮＡインサートを制限分析およびＤＮＡ配列の分析により分析した。

式Ｘ、Ｔ、Ｎ、およびＸ、Ｔ、Ｎ、に従う５′プライムプライマーおよび３′プ ライムプライマーを使用して、全長のｃＤＮＡを増幅した。ここでＸ、、Ｘ、お よびＴア上に定義した通りであり；Ｎ、はＡＯＡＨの５′非翻訳配列のセンス鎖 に相当するオリゴヌクレオチド配列であり；そしてＮ、はＡＯＡＨの３′非翻訳 配列に相当するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列である。プライマーを使用 して断片＃３からｃＤＮＡを増幅した。生ずるＰＣＲ生成物を前述したようにク ローニングベクター中にサブクローニングした。ＰＣＲインサートを制限分析お よびＤＮＡ配列の分析により分析した。ＰＣＲ増幅およびｃＤＮＡライブラリー のスクリーニングにより発生した全長のＡＯＡＨｃＤＮＡおよび部分的ＡＯＡＨ ｃＤＮＡの比較は、ＰＣＲ反応は突然変異を全長のｃＤＮＡの中に組み込んだ。

突然変異は正しい配列を有する鋳型ＤＮＡの断片のＰＣＲ増幅により補正された 。

第１図、第２図および第３図は、ＡＯＡＨをコードする代表的なヌクレオチド配 列を開示している。ｃＤＮＡは２２７７ｂｌ）にわたりそして３４残基の推定上 のｐｒｅ−ｐｒｏ領域および７つのシスティンを含む５７５残基をコードする。

推定されたアミノ酸配列の分析は、残基３６における大きいサブユニットと小さ いサブユニットとの間の推定上の切断部位を示す。

ここにおいて提供されるヒトＡＯＡＨのヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸 配列を使用すると、ＡＯＡＨをコードするゲノムまたはｃＤＮＡの配列をよく知 られている手順に従い他の哺乳動物種から調製されたライブラリーから得ること ができる。例えば、一般に少なくとも約１４ヌクレオチドおよび２５またはそれ 以上のヌクレオチドの長さの、ヒトＡＯＡＨからのオリゴヌクレオチドプローブ を使用して、他の哺乳動物種、例えば、ウサギ目、鳥類、ウシ、ブタ、ネズミな どのＡＯＡＨをコードするＤＮＡ配列を得ることができる。部分的クローンが得 られる場合、エンドヌクレアーゼの切断、結合およびループアウト突然変異誘発 のような技術を使用して、それらを適切なリーディングフレームで接合して全長 のクローンを生成することが必要である。

ＡＯＡＨをコードするＤＮＡ配列を適当な発現ベクターの中に挿入し、次いでこ れを使用して真核生物の細胞をトランスフＩクションした。

本発明の実施において使用するための発現ベクターは、クローニングされたＤＮ Ａの転写を指令するプロモーターおよび転写ターミネータ−を含んでなるであろ う。大きいサブユニットおよび小さいサブユニットをコードするＤＮＡ配列はま た、同一であるか、あるいは異なるプラスミド上で独立に発現させることができ る。

本発明のタンパク質を宿主細胞の分泌経路に向けるために、少なくとも１つの分 泌シグナル配列を問題のＤＮＡ配列に作用可能に連鎖する。好ましい分泌シグナ ルは、次のものを包含する：　ＡＯＡＨの分泌シグナル（ｐｒｃ−ｐｒｏ配列） 、アルファ因子のシグナル配列（ｐｒｅ−ｐｒｏ配列：ＫｕｒｊａｎおよびＨｅ ｒｓｋｏｗｉｔｚ、　Ｃｅ１ｌ　３０：９３３−９４３．　１９８２；Ｋｕｒｊ ａｎら、米国特許第４．５４６．０８２号；　Ｂｒａｋｅ　、欧州特許（ＥＰ） 第１１６，２０１号）、Ｐ）１０５シグナル配列（Ｂｅｃｋら、ＷＯ３６１００ ６３７）、ＢＡＲＩシグナル配列（Ｍａｃｋａｙら、米国特許第４．６１３．５ ７２号：　ＭａｃＫａｙ、　ＷＯ３７／　００２６７０）、５ＵＣ２シグナル配 列（Ｃａｒｌｓｏｎら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　３　：４３９−４４７ ．１９８３）、α−１−抗トリプシンのシグナル配列（Ｋｕｒａｃｈｉら、Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ。

よび組織のプラスミノゲンアクチベーターのシグナル配列（Ｐｅｎｎｉｃａら、 Ｎａｔｕｒｅ、　３０１：２１４−２２１．１９８３）。あるいは、分泌シグナ ル配列は、例えば、Ｈｅ１ｎｊｅ　（Ｆｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ　、、　１３３ ：１７−２１．１９８３：Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

１８４＋９９−１０５．１９８５：Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１４： ４６８３−４６９０．１９８６）により確立されたルールに従い合成することが できる。

分泌シグナル配列は単一に使用することができるか、あるいは組み合わせること ができる。例えば、第１分泌シグナル配列を単一に使用するか、あるいはＢａｒ ｒｉｅｒの第３ドメインをフードする配列（同時係属の普通に譲渡された米国特 許出願第１０４，３１６号、その全体をここに引用によて加える）と組み合わせ て使用することができる。Ｂａｒ口ｅｒの第３ドメインは、問題のＤＮＡ配列の ３′またはＤＮＡ配列に対して５′の適切なリーディングフレームの中にかつ分 泌シグナル配列および問題のＤＮＡ配列の両者と適切な制限断片で配置する、二 とができる。

本発明を実施するとき使用する宿主細胞は、哺乳動物、鳥類、植物、昆虫および 菌類の細胞を包含する。菌類の細胞は、酵母菌（例ルス（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｌ　 １ｕｓ）種、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種）の種を包含し、本発 明の範囲内の宿主細胞として使用することかできる。

酵母菌サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ）の菌株がとくに好ましい。

本発明における使用に適当な酵母菌のベクターは、次のものを包（Ｋａｗａｓａ ｋｉ　ら、米国特許第４．９３１．３７３号、これをここに引用によって加える ）　、ｐＪＤＢ２４９およびｌ）ＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ、　Ｎａｔｕｒｅ　 ２７５：１０４−１０８゜ｌ９７８）およびそれらの誘導体。このようなベクタ ーは一般に、選択マーカーを含み、このマーカーは形質転換体の選抜を可能とす る表現型のアッセイが存在する優性の表現型を示す任意の数の１つであることが できる。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補完し、抗生物質耐 性を提供し、あるいはある細胞か特定の炭素源を利用できるようにするものであ り、そしてＬＥＵ２（Ｂｒｏａｃｈら、前掲）　、ＵＲＡ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｒ ＋ら、Ｇｅｎｅ　８　：１７．１９７９）（Ｓｔｒｕｈｌ　ら、前掲）またはＰ ＯＴＩ（Ｋａｗａｓａｋｉら、前掲）を包含する。他の適当な選択マーカーはＣ ＡＴ遺伝子であり、これは酵母の細胞にクロランフェニコール耐性を与える。

酵母中での使用に好ましいプロモーターは、次のものを包含する＝１：４１９− ４３４．１９８２：Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４．５９９．３１１号）また はアルこれに関して、とくに好ましいプロモーターは、ＴＰ１１プロモーター（ にａｗａｓａｋｉ　、米国特許第４．５９９．３ｌ１号、１９８６）およびＡＤ Ｈ２−４ｃプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３０４：６５２− ６５４゜１９８３：［ｒａｎｉおよびＫｉｌｇｏｒｅ　、米国特許出願第１８３ ．１３０号、これをここに引用によって加える）Ｔある。発現単位は、また、転 写ターミネータ−を含むことかできる。好ましい転写ターミネータ−はＴＰＩＩ プロモーター（Ａｌｂｅ「およびＫａｗａｓａｋ　ｉ、前掲）である。

酵母に加えて、本発明のタンパク質は糸状菌類、例えば、菌類アスペルギルス属 （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の菌株（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４、９３ ５．３４５号、これをここに引用によって加える）中で発現させることができる 。有用なプロモーターの例は、アスペルギルス・ニガー　（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ ｕｓ　ｎｉｇｅｒ）の解糖系遺伝子に由来するもの、例えば、ＡＤＨ３プロモー ター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ　ら、ＥＭＢＯＪ、４：２０９３−２０９９．１９８５ ）およびｔｐｉＡプロモーターを包含する。適当なターミネータ−の例はＡＤＨ ３ターミネータ−（ＭｃＫｎｉｇｈｔ　ら、前掲）である。このような成分を利 用する発現ユニットは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の染色体 ＤＮＡの中に挿入することかできるベクターの中にクローニングする。

菌類を形質転換する技術は文献においてよく知られており、そして、次の文献に 記載されている：　Ｂｅｇｇｓ（前掲）　、Ｈｉｎｎｅｎら（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５：１９２９−１９３３．１９７８） 、　Ｙｃｌｔｏｎら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１：１７４０−１７４７．１９８４）、およびＲ ｕ５ｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ　３０１：１６７−１６９．１９８３）。宿主細胞 の遺伝子型は、一般に、発現ベクター上に存在する選択マーカーにより補足され る遺伝的欠陥を含有するであろう。特定の宿主および選択マーカーの選択は、当 業者によく知られている。

好ましい実施態様において、糖タンパク質のアスノくラギン連鎖グリコジル化の ために要求される少なくとも１つの遺伝子の中に遺伝的欠陥を含有する酵母宿主 細胞を使用する。好ましくは、酵母の宿主細胞はＭＮＮ９遺伝子の中に遺伝的欠 陥を含存する（係属中の米国特許出願第１１６．０９５号および同第１８９．５ ４７号、これらをここに引用によって加えるに記載されている）。最も好ましく は、酵母の宿主細胞はＭＮＮ９遺伝子の中断を含有する。このような欠陥を育す る酵母宿主細胞は、突然変異および選抜の標準的技術を使用して調製することか できる。Ｂａ１１ｏｕら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５５：５９８６−５９９ １．　１９８０）は、アスパラギン連鎖グリコジル化に影響を与える遺伝子の中 に欠陥をもつ、マンノタンパク質の生合成突然変異体の単離を記載している。

簡単に述べると、突然変異誘発した酵母細胞を、野生型酵母上に存在する外部の マンノース鎖に対して向けられた蛍光化抗体を使用してスクリーニングした。抗 体と結合しなかった突然変異体細胞をさらに特性決定し、そしてこれらの細胞は アスパラギン連鎖したオリゴ糖成分の付加において欠陥を有することが発見され た。異種タンとが好ましく、これはタンパク質分解活性を減少する。

菌類細胞に加えて、培養した哺乳動物細胞を本発明において宿主細胞として使用 できる。本発明における使用に好ましい培養した哺乳動物細胞は、ＣＯ５−１（ ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５０）、　Ｂ）ＩＫ　、および２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１ ５７３　；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、３６：５９−７２．１９ ７７）細胞系を包含する。

好ましいＢＨＫ細胞系はＢＨＫ　５７０細胞系である（アメリカン・タイプ・カ ルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎ）に受け入れ番号ＣＲＬ　１０３１４で寄託された）。さらに 、ある数の他の哺乳動物細胞を本発明において使用することができ、これらは次 のものを包含する：ラットＨｅｐ　［（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６００）、ラットＨ ｅｐ　ＩＩ（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５４８）、　ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣＣＣＬ　１３ ９）　、ヒト肺（ＡＴＣＣＣＣＬ　７５．１）　、ヒトへパトーム（ＡＴＣＣＨ ＴＢ−５２）、　Ｈｅｐ　Ｇ２（ＡＴＣＣＨＢ　８０６５）　、？ウス肝臓（Ａ ＴＣＣＣＣＬ　２９．１）、　ＮＣＴＣ１４６９）（ＡＴＣＣＣＬＬ　９．１） およびＤＵＫＸ細胞（ｌＪｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７７：４２１６−４２２０．１９８０）。

本発明の実施において使用するための哺乳動物の発現ベクターは、クローニング した遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指令することができるプロモーターを包含す るであろう。好ましいプロモーターはウィルス性プロモーターおよび細胞性プロ モーターを包含する。ウィルス性プロモーターは直接前期（ｉｍｏ＋ｅｄｉａｔ ｅ　ｅａｒｌｙ）サイトメガロウィルスプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅ １１．４１：５２１−５３０．１９８５）およびＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂ ｒａｍａｎｉら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１：８５４−８６４．１９８１ ）を包含する。細胞性プロモーターは、マウスのメタロチオネイン−１プロモー ター（Ｐａｌｍｉ　ｔｅｒら、米国特許第４．５７９．８２１号）、マウスＶｋ プロモーター（Ｂｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ　８１　ニア０４１−７０４５゜好ましいプロモーターは、アデノ ウィルス２からの主要後期プロモーター（Ｋａｕｆｍａｎおよび５ｈａｒｐ、　 Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、２：１３０４−１３１９９．１９８２）である。

このような発現ベクターはまた、プロモーターから下流および問題のペプチドま たはタンパク質をコードするＤＮＡ配列から下流に位置する１組の有るＲＮＡス プライス部位を包含することができる。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデ ノウィルスおよび／または免疫グロブリンの遺伝子から得ることができる。また 、問題のコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルが発現ベクターの 中に含有されている。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０からの前期または後 期のポリアデニル化シグナル（Ｋａｕｆｍａｎおよび５ｈａｒｐ　、前掲）、ア デノウィルス５　ＥＩＢ領域およびヒト成長ホルモンの遺伝子のターミネータ− からのポリアデニル化シグナル（ＤｅＮｏｔｏら、Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９：３７１９−３７３０．１９８１）を包含する。実施態 様は、プロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に位置する、非コードウィル スリーダー配列、例えば、アデノウィルス２のトリパルタイトリーダーを含むこ とかできる。好ましいベクターはまた、エンハンサ−配列、例えば、ＳＶ４０エ ンハンサ−およびマウスμエンハンサ−（Ｇｉｌｌｉｅｓ。

Ｃｅ１ｌ、　３３ニア１７−７２８．１９８３）を包含するであろう。発現ベク ターはまた、アデノウィルスＶＡ　ＲＮＡをコードする配列を含むことができる 。

ＡＯＡＨの成熟した２本鎖形態へのプロセシングは、ＡＯＡＨの大きいサブユニ ットおよび小さいサブユニットの間の切断部位を修飾して、前駆体の２本鎖形態 への切断を増強することによって増強することができる。ＡＯＡＩ（のための修 飾された切断部位は、ＡＯＡＨの大きいサブユニットおよび小さいサブユニット の間に位置する。式（Ｒ，）　。

−Ｒｉ−Ｒ’ａのアミノ酸配列を含み、ここでＲ，、Ｒ，およびＲ８はりジン（ Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）であり、そしてｎ＝０〜４の整数である。

２塩基性ジペプチド、例えばＡｒｇ−Ｌｙｓの後の切断および引き続くこれらの アミノ酸の除去によるＡＯＡＨのプロセシングは、サツカロミセス・セレビシア エ（Ｓ　、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＥＸＩおよび／またはＫＥＸ２遺伝子を 宿主細胞の中に導入することによって増強することができる（係属中の米国特許 出願第０７／３１７．２０５号；同第１３０．３７０号；および同第１４４．３ ５７号、および公開された欧州特許（ＥＰ）第３１９．９４４号（これらをここ に引用によって加える）に記載されているように）。

ＫＥＸ２遺伝子は、２塩基性アミノ酸配列の後で切断するエンドペプチダーゼを コードしくＦｕｌｌｅｒら、Ｌｅｉｖｅ編、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：１９８ ６．２７３−２７８．１９８６）；ＫＥＸＩ遺伝子の発現（Ｄｍｏｃｈｏｗｓｋ ａら、Ｃｅ１ｌ　５０：５７３−５８４゜１９８７）はこれらの２塩基性アミノ 酸の引き続く除去を生ずる。ＫＥＸ２をコードするＤＮＡ配列はＡＴＣＣ（マリ イランド州２０８５０ツクビレ、パークロラン叶、　１２３０１）に受け入れ番 号６７５６９で寄託されている。こうして、これらの遺−伝子の一方または双方 で形質転換された培養した真核生物の細胞系は、大きいサブユニットおよび小さ いサブユニットの間の修飾された切断部位を有するＡＯＡＨを発現するために有 用である。プロセシング部位は、例えば、ｉｎ　ＶｉｔｒＯ突然変異誘発により 、大きいサブユニットおよび小さいサブユニットをコードする配列の間に挿入す ることかできる。

クローニングしたＤＮＡ配列は、例えば、リン酸カルシウム仲介トランスフェク ション（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅ１ｌ　１４ニア２５．１９７８；Ｃｏｒｓａｒｏ およびＰｅａｒｓｏｎ、　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７： ６０３．１９８１；　ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ｖｉｒｏｌ ｏｇｙ　５２：４５６．１９７３）により、培養した哺乳動物細胞の中に導入す ることができる。クローニングしたＤＮＡ配列を哺乳動物細胞の中に導入する他 の技術、例えば、エレクトロボレイション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯＪ、１ ：８４１−８４５．１９８２）を使用することもできる。

クローニングしたＤＮＡを組み込んだ細胞を同定するために、選択マーカーを一 般に細胞の中に問題の遺伝子またはｃＤＮＡと一緒に導入する。培養した哺乳動 物細胞において使用するために好ましい選択マーカーは、薬物、例えば、ネオマ イシン、ヒグロマイシンおよびメトトレキセートに対する耐性を与える遺伝子を 含む。選択可能なマーカーは増幅可能な選択マーカーであることができる。好ま しい増幅可能な選択マーカーはＤＨＰＲ遺伝子である。選択マーカーはＴｈｉｌ ｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ、　Ｂｕｔｔｅｒｗ ｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　、　ｖサチュセッツ州ストーンハム、これを ここに引用によって加える）により概観されている。選択マーカーの選択はこの 分野においてよく知られている。

選択マーカーは細胞の中に別々のプラスミド上で問題の遺伝子と同時に導入する ことができ、あるいは同一プラスミド上で導入することができる。同一のプラス ミド上である場合、選択マーカーおよび問題の遺伝子は異なるプロモーターまた は同一のプロモーターのコントロール下に存在することができ、後者の配置はジ ンストロニック（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）メツセージを生成する。この型の構 成体はこの分野において知られている（例えば、ＬｅｖｉｎｓｏｎおよびＳｉｍ ｏｎｓｅｎ１米国特許第４．７１３．３３９号）。また、「キャリヤーＤＮＡ　 Ｊ　として知られている追加のＤＮＡを細胞の中に導入する混合物に添加するこ とは育利であることがある。

トランスフェクションした哺乳動物細胞をある期間の間、典型的には１〜２日間 増殖させて、問題の１または２以上のＤＮＡ配列の発現を開始する。次いで薬物 選択を適用して、安定な態様で選択マーカーを発現している細胞の増殖について 選択する。増殖可能な選択マーカーでトランスフェクションされた細胞について 、薬物の濃度を段階的に増加して、クローニングした配列のコピー数の増加につ いて選択し、これにより発現レベルを増加することができる。

ＡＯＡＨをコードする発現ベクターを植物、鳥類および昆虫の細胞の中に導入す るためのプロモーター、ターミネータ−および方法はこの分野においてよく知ら れている。昆虫細胞中で異種ＤＮＡ配列を発現するベクターとして、例えば、バ キュロウィルスを使用することは、ＡｔｋｉｎＳＯｎら（Ｐｅｓｔｉｃ、Ｓｃｉ 、２８：２１８−２２４．１９９０）により概観されている。植物細胞中で遺伝 子を発現するためのベクターとしてアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を使用することは、５ｉｎｋａｒ ら（Ｊ、Ｂｉｏｓｃｉ、（Ｂａｎｇｌａｏｒｅ）１１：４７−５８．１９８７） 　＋：より概観されている。

次いで、本発明のＤＮＡ構成体を含有する宿主細胞を培養してＡＯＡＨを生産す る。標準的方法に従い、哺乳動物または酵母宿主細胞の増殖のために要求される 栄養を含有する培地の中で細胞を培養する。

種々の適当な培地がこの分野において知られており、そして一般に炭素源、窒素 源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラルおよび成長因子を含む。一般に、増殖培 地は、例えば、薬剤選択、又はＤＮＡ構成体上の選択マーカーにより補完される か又は該ＤＮＡ構成体と同時トランスフェクションされた必須栄養の欠乏により 、該ＤＮＡ構成体を含有する細胞について選択するであろう。

例えば、酵母細胞は、好ましくは、アミノ酸以外の窒素源、無機塩類、ビタミン および必須アミノ酸の補助物質を含んでなる、化学的に定められた培地の中で培 養される。培地のｐＨは好ましくは２より大きくかつ８より小さいｐＨ１好まし くはｐｉ（６，５に維持される。安定なｐ［（を維持する方法は、緩衝化および 、好ましくは水酸化ナトリウムの添加による、一定のｐＨのコントロールを包含 する。好ましい緩衝化剤はコハク酸およびビス−トリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）（ Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、　、ミゾリー州セントルイス）を包含する 。アスパラギン連鎖グリコジル化のために要求される遺伝子の中に欠陥を育する 酵母細胞は、好ましくは、浸透圧安定剤を含有する培地の中で増殖する。好まし い０、ＩＭ−１，５Ｍ、好ましくは０．５Ｍまたは１．０Ｍの濃度で培地の中に 補助されたソルビトールである。培養した哺乳動物細胞は一般に、商業的に入手 可能な血清含有または血清不含の培地の中で培養する。使用する特定の細胞系の ために適当な培地の選択は当業者のレベルの範囲内である。

本発明により生産されたＡＯＡＨは、ＡＯＡＨに対して向けられた抗体を使用す る抗体カラムアフィニティークロマトグラフィーにより精製する、：とかできる 。追加の精製は、普通の化学的精製手段、例えば、なかでも、液体クロマトグラ フィー、勾配遠心分離およびゲル精製により達成することができる。タンパク質 の精製法はこの分野において知られており（一般に、５ｃｏｐｅｓ、　Ｒ，、Ｐ ｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａ、ｔｉｏｎ。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　、ニューヨーク（１９８２）を参照のこと、 これを、二二に引用によって加える）、そしてここに記載する組み換えＡＯＡ＋ （の精製に適用することかできる。さらに、米国特許第４．９２９．６０４号に 記載されている精製のプロトコルを参照のこと。少なくとも約５０％の実質的に 純粋な組み換えＡＯＡＨが好ましく、少なくとも約７０〜８０％がより好ましく 、そして９５〜９９％またはそれ以上の均質性はとくに製剤学的使用のために最 も好ましい。必要に応じて、いったん部分的にまたは均質に精製されると、次い で組み換えＡＯＡＨを治療学的に使用することができる。

本発明の組み換えＡＯＡＨ分子またはその医薬組成物は、ヒトを包含する哺乳動 物に投与して、グラム陰性バクテリアの感染の毒性に関連する種々の状態を処置 するために有用である。例えば、グラム陰性バクテリアの感染はそれ自体普通の 抗生物質で処置することができるが、ここに記載するＡＯＡＨ調製物を使用して 、散在性脈管内の凝固および前述したような他の感染のごとき感染に関連するＬ ＰＳ毒性を処置または防止することができる。

医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のために、非経口的、局所的、 経口的または局所的投与が意図される。好ましくは、医薬組成物は非経口的に、 すなわち、静脈内、皮下にまたは筋肉内に投与される。こうして、本発明は、許 容される担体、好ましくは水性担体中に溶解した組み換えＡＯＡＨ分子の溶液を 含んでなる、非経口的投与のための組成物を提供する。種々の水性担体、例えば 、水、緩衝化された水、０．４％の生理食塩水、０．３％のグリシン、２０〜３ ０％のグリセロールなどを使用することができる。これらの組成物は普通のよく 知られた滅菌技術により滅菌することができる。生ずる水溶液を使用のために包 装するか、あるいは無菌的条件下に濾過および凍結乾燥することができ、凍結乾 燥した調製物を投与前に無菌の水溶液と組み合わせる。組成物は生理的条件に近 似させるために要求される、医薬として許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節 剤および緩衝剤、浸透圧調節剤なと、例えば、酢酸す（・リウム、乳酸す１・１ １ウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなとを９存する、−と かできる。、＝わらの配合物中の組み換えＡＯＡＨの濃度は、広（：、４″なわ ち、約０．０５％から、通常少なくとも約１重１％より低くから、１５または２ ５重量０６まで変化する、二とができ、そして特定の選択し、た投与のモードに 従い、主として流体の体積、粘度なとにより選択されるでちろう。非経口的に投 与可能な化合物を調製する実際のブラ法は既知であるか、あるいは当業者にとっ て明らかであり、そして、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃ ｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ　、第１６版、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ ｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルベニア州イートン（１９８２）　（これをこ−に 引用によって加える）より詳細に記載されている。

組み換えＡＯＡＨ分子を含有する組成物は予防的および／または治療的処置のた めに投与することができる。治療的適用において、組成物は既にグラム陰性バク テリアの病気に悩む患者に、その病気および合併症を治癒するか、あるいはそれ らに関連するＬＰＳの毒性の作用を少なくとも部分的に阻止するために十分な量 で投与される。これを達成するために適切な量は「治療的有効な投与量」と定義 される。この使用のために有効な量は、グラム陰性の感染のひどさおよび患者の 全体的状態に依存するであろうが、一般に約ｌμｇ〜約ＩＯμｇの組み換えＡＯ ＡＨ／７０ｋｇの体重の範囲である。本発明の物質は一般に重大なバクテリア性 の病気の状態、すなわち、生命を脅かすか、あるいは潜在的に生命を脅かす場合 において使用することができることを心に留めなくてはならない。このような場 合において、本発明により可能とされた外来性物質の最小化および組み換えＡＯ ＡＨの特異性にかんがみて、実質的に過剰のこれらの組み換えＡＯＡＨ組成物を 投与することが可能でありかつ処置する医者は望ましいと感するであろう。

予防的適用において、組み換えＡＯＡＨを含有する組成物はグラム陰性の病気に 対して感受性であるか、あるいはそうでなければその危険にある患者に投与して 、患者自身の抗バクテリア／抗１、ＰＳの能力を増強する。このような量は「予 防的に有効投与量」であると定義される。この使用において、正確な量は再び患 者の健康状態に依存する。

組成物の１回まｔ：は多数回の投与は、処置する医者により選択される投与量の レベルおよびパターンで実施することかできる。いずれの場合においても、医薬 配合物は患者を有効に処置するために十分な量の本発明の組み換えＡＯＡＨを提 供する。

以下の実施例を要約すると、実施例１はクローニングベクターおよび発現の構成 を記載する。実施例２はヒトＡＯＡＨをコードするＤＮＡ配列のクローニングを 記載する。実施例３は哺乳動物細胞の中のＡＯＡＨの発現を記載する。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明は限定 しない。

実施例 制限エンドヌクレアーゼおよび他のＤＮＡ修飾酵素（例えば、Ｔ４ポリヌクレオ チドキナーゼ、仔ウシアルカリ性ホスファターゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（ク レノー断片）、Ｔ４ポリヌクレオチドリガーゼ）をベーリンガー・マンハイム・ バイオケミカルス（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌｓ）、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ　ＬａｂｏｒａｔｏｉｅｓＸＢＲＬ）およびニュー・イングランド・ バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手し、そして 、特記しない限り、製造業者の指示に従い使用した。

オリゴヌクレオチドをアプライド・バイオラステムス（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ ｙｓｔｅｍｓ）３８０Ａ型ＤＮＡ合成装置で合成し、そして変性ゲル上のポリア クリルアミドゲルの電気泳動により精製した。大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞を 、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、−Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２　、これをここに引用によって加える）によるか、 あるいはＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｊｎｇ：ＡＬａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ、第２版、１９８８、これをここに引用によって加える）に より記載されているように形質転換した。Ｍ２ＳおよびｐＵＣクローニングベク ターおよび宿主菌株はＢＲＬから入手した。

実施例１ クローニングベクターおよび発現ベクターの構成Ａ、　ｐＶＥＧの構成 前のエンドヌクレアーゼ消化なしにクローニングしたｃＤＮＡの転写を可能とす るために、バクテリオファージエフ転写ターミネータ−をクローニングベクター に添加した。推定上のＴ７ＲＮＡ転写ターミネータ−の配列は、バクテリオファ ージＴ′の遺伝子１０と遺伝子ｔｉとの間に存在し、Ｄｕｎｎおよび５ｔｕｄｉ ｅｒ（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１６６：４７７−５３６．１９８３）により開示 されている。第５図に示すように、４つの合成オリゴヌクレオチドをこの配列か ら設計し、そしてベクターｏＧＥＭ−１（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ、ライス コンシン州マディソン、から入手した）、すなわちバクテリア由来複製の起点、 アンピシリン耐性遺伝子およびＴ７プロモーターを多重クローニング部位に隣接 して含有するプラスミド、の中に結合した。末端のホスフェートを、標準的条件 下に（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴ ＰをもつオリゴヌクレオチドＺＣ７７６およびＺＣ７７７の５′末端に付加した 。（これらおよびここにおいて言及する他のオリゴヌクレオチドの配列を表１に 示す。）インキュベーション後、キナーゼを６５°Ｃにおいて１０分間加熱して 殺した。２５０ｇのオリゴヌクレオチドＺＣ７７５および２５ｎＨＨのオリゴヌ クレオチドＺＣ７７６を６５℃において１５分間インキュベーションすることに よってアニーリングし、次いで５００　ｍｌの水の中で室温に冷却させた。オリ ゴヌクレオチドＺＣ７７７およびＺＣ７７８を同様にアニーリングした。アニー リングしたオリゴヌクレオチドを使用するまで一２０°Ｃで貯蔵した。ベクター ｐＧＥＭ−１をＰｓｔｌおよびＨｉｎｄｒＩＩで消化し、そして線状化したベク ターのＤＮＡをアガロースゲルの電気泳動により精製した。次いで、合成Ｔ７タ ーミネーター（アニーリングしたＺＣ７７５，ＺＣ７７６、ＺＣ７７７およヒＺ ｃ７７８）ヲｐＧＥＭ−１ノ中１：クローニングした。２５ｎｇのベクター＋ア ニーリングしたオリゴヌクレオチドＺＣ７７５／ＺＣ７７６およびＺＣ７７７／ ＺＣ７７８を１０μ１（７）反応混合物の中で混合した。１４℃において一夜結 合した後、ＤＮＡをコンピテント大腸菌（Ｌ　ｃｏｌｉ）ＪＭ８３の中に形質転 換し、そして形質転換された細胞をアンピシリン耐性について選択した。プラス ミドＤＮＡをアルカリ性溶菌手順（Ｂｉｒｎｂｏｉ［ｌｌおよびＤｏｌｙ、　Ｎ ｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、７：　１５１３−１５２３゜１９７９）により選 択した形質転換体から調製した。これらの試料からのＤＮＡの一部分をＰｓｔｒ およびＨｉｎｄｌｌｌで切断し、そして４％のポリアクリルアミドゲル上で分析 して、８０ｂｐのＰｓｔｌ−Ｈｉｎｄｌ［Ｉ断片を放出するクローンを同定した 。他の診断的切断、例えば、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔｌも行った。ｐＧＥＭＴと 表示する単離物の１つは、制限分析によりＴ７ターミネーターの断片を含有する ことが示された。

表１ ＺＣ５２５ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＴ ＺＣ５２６ＧＡＴ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＴＣＣＺＣ５５３ＡＡＴ　ＴＧＡ　ＴＡＧ 　ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＣＴＴ　ＡＣＴ　ＧＣＡＺＣ５５４ＧＴＡ　ＡＧＣＧＧＣＣ ＧＣＴＡＴ　ＣＺＣ７７５ＧＣＴ　ＡＧＣＡＴＡ　ＡＣＣＣＣＴ　ＴＧＧ　ＧＧ ＣＣＴＣＴＡＡ　ＡＣＧＧＴ　ＣＴ ＺＣ７７６ＣＴＣＡＡＧ　ＡＣＣＣＧＴ　ＴＴＡ　ＧＡＧ　ＧＣＣＣＣＡ　ＡＧ Ｇ　ＧＧＴＴＡＴ　ＧＣＴ　ＡＧＣＴＧＣＡ ＺＣ７７７ＴＧＡ　ＧＧＧ　ＧＴＴ　ＴＴＴ　ＴＧＣＴＧＡ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　 ＧＡＡ　ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡ ＺＣ７７８ＡＧＣＴＴＧ　ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＣＡＴ　ＡＧＴ　ＴＣＣＴＣＣＴＴ Ｔ　ＣＡＧＣＡＡ　ＡＡＡ　ＡＣＣＣ ＺＣ１７５０ＡＧＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＺ Ｃ１７５１ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＧＴＧ　ＣＴＣＴＧＴ　ＣＡＡ　ＧＺＣ１７５２Ｇ ＡＴ　ＣＣＴ　ＴＧＡ　ＣＡＧ　ＡＧＣＧＣＡ　ＧＺＣ２０６３ＧＡＴ　ＣＣＡ 　ＡＡＣＴＡＧ　ＴＡＡ　ＡＡＧ　ＡＧＣＴＺＣ２０６４ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＣＴ Ａ　ＧＴＴ　ＴＧＺＣ２４６５ＡＣＡ　ＧＡＣＴＧＴ　ＴＣＣＡＴＡ　ＧＣＴ　 ＡＡＴ　ＴＴＡ　ＡＴＴ　ＴＴＣＴＧＧ　ＣＡＧ　ＡＴ ＺＣ２４８７ＧＡＣＴＣＧ　ＡＧＴ　ＣＧＡ　ＣＡＴ　ＣＧＡ　ＴＣＡ　ＧＴＴ 　ＴＴＴ　ＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴ ＺＣ２４８８ＧＡＣＴＣＧ　ＡＧＴ　ＣＧＡ　ＣＡＴ　ＣＧＡ　ＴＣＡ　ＧＣＣ ＣＣＣＣＣＣＣ ＺＣ２４８９ＧＡＣＴＣＧ　ＡＧＴ　ＣＧＡ　ＣＡＴ　ＣＧＡ　ＴＣＡ　０表１ 　（つづき） ＺＣ２６３１ＡＧＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＣＣＡＴＧ　ＧＡＡ　 ＣＡＧ　ＴＣＴＧＴＧ　ＣＣＡ　ＴＴＣＡＡＡ　ＧＡＴ　ＧＴＺＣ２６３２ＧＡ ＣＡＧＡ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＴＣＧ　ＡＣＴ　ＣＧＡ　ＧＴＣＧＡＣＡ ＴＣＧＡＴ　ＣＡＧ ＺＣ２６３３ＡＧＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＧＡ　ＣＴＣＧＡＧ　 ＴＣＧ　ＡＣＡＴＣＧ　ＡＴＣＡＧ ＺＣ２７０３ＧＡＣＡＧＡ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＡＡＴ　ＴＣＧ　ＡＧＣＡＣＡ　 ＣＡＧ　ＣＡＴＴＧＣＡＣＡ　ＧＴＣＧＴ ＺＣ２７０４ＡＧＧ　ＧＡＧ　ＡＣＣＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＴＣＣＡＧ　ＣＴＣＴ ＴＴ　ＧＴＧＴＧＴ　ＧＧＣＴＣＴ　Ｃ ＺＣ３０７４ＡＣＴ　ＴＧＧ　ＧＡＡ　ＴＴＣＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴ　ＧＣ Ａ　ＧＴＣＣＣＣＣＴＧ　ＧＡＡ　Ａ ＺＣ３０７５ＴＴＴ　ＡＣＡ　ＡＡＡ　ＣＴＣＧＡＧ　ＡＧＴ　ＧＴＧＺＣ３０ ７６ＣＡＣＡＣＴ　ＣＴＣＧＡＧ　ＴＴＴ　ＴＧＴ　ＡＡＡ　ＣＡＧ　ＡＡＣＡ ＣＴＧ ＺＣ３０７７ＡＡＣＡＴＧ　ＧＧＡ　ＴＣＣＡＴＴ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＧＴＧ　 ＧＧＡ　ＡＴＴＡＴＧ　ＡＴＧ　ＣＴＴ　ＣＡＧ　ＡＧＴ　ＣＴＧ　ＣＡＴ　Ｇ ＡＣＺＣ３０７８ＣＣＣＡＡＴ　ＧＧＡ　ＴＣＣＣＡＴ　ＧＴＴ　ＡＴＴ　ＴＴ Ｇ　ＴＡＴ　ＧＧＣＴＴＡ　ＣＣＡ　ＧＡＴ ＺＣ３０７９ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＴＧＧ　ＴＣＧ　ＡＣＧ　ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＣＡ Ｇ　ＴＧＣＣＣＧＣＴ ＺＣ３２０２ＴＴＡ　ＡＴＴ　ＴＴＣＴＧＧ　ＣＡＧ　ＡＴＣＴＴＧ　ＧＣＣＺ Ｃ３２０３ＴＡＧ　ＧＧＴ　ＧＴＧ　ＴＡＣＴＡＧ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＣＴＧプ ラスミドｐＡＲ２５２９（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ、５６　：　１２５ −１３５．　１９８７）からの天然Ｔ７ターミネーターをプラスミドｐＧＥＭＴ に添付した。ブラスミドｐＧＥＭＴをＢａｍＨおよびＢｇｌＩＩで消化した（第 ５図）　、　ｐＡＲ２５２９からのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ　ターミネータ−断 片をアガロースゲルの電気泳動により精製した。ターミネータ−断片をＢａｍＨ ｌ消化したｐＧＥＭＴに結合し、そしてＤＮＡをコンピテント大腸菌（Ｅ、ｃｏ ｌｉ）　ＬＭ１０３５細胞の中に形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーを 一夜の増殖のための５ｍｌの培養物の中に接種した。アルカリ性溶菌手順により 調製されたプラスミドＤＮＡを、ＢａｍＨＩ−Ｓａｉｌ消化および８％のポリア クリルアミドゲル上の電気泳動により、適切なターミネータ−の向きについてス クリーニングした。１３０　ｂｐのＢａｍＨＩ−３ａｌ　Ｉ断片の存在により証 明されるように、ターミネータ−を正しい向きに含有するクローンを選択し、そ して匹ＥＭＴＴと命名した（第５図）。

Ｍ１３ファージのタンパク質の存在下に一本鎖ＤＮＡとしてｐＧＥＭＴＴをパッ ケージング可能とするために、ｐＵｃ３８２　（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉ ｎｇ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５３　：　３−１１．１９８７に記載さ れているように、ｐＵＣ］、１ｇおよび１１９に類似する）からの、Ｍ１３遺伝 子間領域をｐＧＥＭＴＴに付加したく第５図）。プラスミドｐＧＥＭＴＴをＦｓ ｐ［およびＮａｒＩで消化し、モしてＴ７プロモーターおよび転写ターミネータ −を含有する断片を精製した。プラスミドｐＵＣ３８２をＦｓｐｉおよびＮａｒ ｌで消化し、そしてアンピシリン耐性遺伝子およびＭ１３遺伝子間領域を含有す るをコードする断片をゲル精製した。次いで、これらの断片をＴ４ＤＮＡリノｊ 〜ゼの存在下に一緒に結合した。結合したＤＮＡをコンピテント（Ｅ、ｅｏｌｉ ）　ＬＭｉ０３５細胞の中に形質転換した。１２のアンピシリン耐性コロニーか らのプラスミドＤＮＡをアルカリ性溶菌法により調製し、そしてＤＮＡをＡｖａ 　Ｉで消化することによってスクリーニングした。適当な構成体は、２４３０ｂ ｐの１つおよび７０９　ｂｐの他のものの、２つのノくンドを与えた。１つのこ のような単離物を選択し、モしてｐＶＥＧと命名した。

Ｂ、　ｐＤＶＥＧ　’の構成 プライム配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを、ＢａｍＨＩ部位とＥｃｏ Ｒ［部位との間においてｐＶＥＧに付加した（第６図）。プラスミドｐＶＥＧＧ 　ＢａｍＨＩおよびＥｅｏＲＩで消化し、そしてベクターの断片をゲル精製した 。９６ｎｇの各オリゴヌクレオチドＺＣ１７５１およびＺＣ１７５２を、４．５ μｌの１０ｍＭのトリスｐＨ７，５、２０ｍＭのＭｇＣ１ｇおよびｌ０ｍＭのＮ ａＣ１の中で６５°Ｃにおいて２０分間アニーリングし、次いてこの混合物を３ ０分かけて室温に冷却した。アニーリングしたオリゴヌクレオチドをＴ４ＤＮＡ リガーゼでｐＶＥＧベクター断片に結合し、次いでコンピテント大腸菌（Ｅ、　 ｃｏｌｉ）　ＬＭ１０３５細胞の中に形質転換した。−夜増殖させてコロニーを 発生させた後、フィルターのリフトを寒天プレート上のコロニーから取った。フ ィルターを０Ｐ標識したオリゴヌクレオチドＺＣ１７５２でブロービングした。

コロニーのすべては陽性であった。

プラスミドＤＮＡを１２のコロニーから増殖した培養物から調製した。

プラスミドＤＮＡを５ｓｔｌの消化によりスクリーニングして、ｐＶＥＧのＥｏ Ｒ１部位とＢａｍ８１部位との間の５ｓｔ１部位の不存在を評価した。プラスミ ドＤＮＡのすべての１２はＳｓｔ［消化について陰性であった。これらの１２の 単離物の１つを選抜し、そしてｐＶＥＧ’　と命名した。

アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉ　１ｌｕｓ）のアルコールデヒドロゲナーゼ ｃＤＮＡから誘導されたポリアデニル化配列をｐＶＥＧに付加した。第７図に示 すように、プラスミドｐＭＯ９８（公開された欧州特許出願（ＥＰ）第２７２． ２７７号に開示されており、そしてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ ョンに受け入れ番号５３４２８で受託された）を叶ａ［およびＢａｍＨＩで消化 し、そしてほぼ１５０　ｂｐのポリ（Ａ）断片をアガロースゲルの電気泳動によ り精製した。この断片は非常にわずかのフランキングｃＤＮＡをもつほとんどの ポリ（Ａ）配列を含有した。

ｐＶＥＧの中へのポリ（Ａ）　ｃＤＮＡ断片をクローニングするために、ｐＶＥ ＧをＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで消化し、そして３．４ｋｂのベクター断片をゲ ルｍ製した。ベクターおよびポリ（Ａ）断片をＴ４ＤＮＡリガーセと一緒に結合 Ｉ２て、ベクターｐＶＥＧＴを生成した（第７図）、。

プライム配列をコードする合成オリゴヌクレオチドをｐＶＥＧＴに付加した。こ れを達成するため（ご、ｐＶＥＧＴをＮｏｔｌおよび５ｓｔｌて消化し、ぞして ポリ（Ａ）断片および２つのＴ７転写ターミネータ−を含有する３７０１）ｐの 断片をアガロースゲルの電気泳動により精製した。プラスミドｐＶＥＧ　’をＮ ｏｔ［およびＢａｍＨＩで消化し、そして３．２ｋｂのベクター断片をゲル精製 した。アニーリングしたとき、ＢａｍＨＩ−３ｓｔ［アダプターを形成した２つ のオリゴヌクレオチド（ＺＣ２０６３およびＺＣ２０６４）を合成した。２つの オリゴヌクレオチドを個々にキナーゼ処理しそしてアニーリングし、そして直線 化したベクターおよびポリ（Ａ）−ターミネータ−断片と結合した。ｐＶＥＧＴ 　’　（第３図）と表示する生ずるベクターは、Ｔ７ＲＮＡ転写プロモーター、 プライム配列によりフランキングしたＥｅｏＲＩ　クローニング部位、ポリ（Ａ ）トラクト、および２つのＴ７ＲＮＡプロモーターを含有した。

Ｃ，ＤＶＥＧの構成 哺乳動物の発現ベクターｐＶＡＰＤＢａｍ８（第８図）すなわちアデノウィルス に基づくベクターは、方向性クローニング特性を有する哺乳動物細胞のベクター の構成のための出発物質であった。このベクターの重要な要素は、アデノウィル ス由来複製起点、ＳＶ４０エンノ−ンサー、アデノウィルスの２つの主要後期プ ロモーターおよびトリパルタイトリーダー配列、１対のＲＮＡスプライス部位、 クローニング部位、およびポリ（Ａ）付加配列である。当業者は理解するように 、これらの要素は種々の源から得ることができ、そして特定の出発物質およびこ こに記載する操作を便利さのために選択した。ＥｃｏＲＩ　クローニングしたｃ ＤＮＡの発現ベクターの中へのサブクローニングを促進するだめに、ＥｅｏＲＩ 　クローニング部位をｐＶＡＰＤＢａｍ８に付加した。

ベクターをまず修飾して、プライム配列をＢｃ１１部位に挿入することかできる ようにした。認識配列内のメチル化された部位の不存在を必要とする、Ｂｃｌｌ による消化のためにｐＶＡＰＤＢａｍ８を調製するため（修飾マイナスおよび制 限マイナス）の中に形質転換した。生ずるプラスミドｐＶＡＰＤＢａｍ８−１を Ｂｅｌ［で消化した。２つのキナーゼ処理しそしてアニーリングしたオリゴヌク レオチドＺＣ５２５およびＺＣ５２６により形成したアダプターをＢａ１ｌ消化 したベクターと結合した。この構成体をつくるために、２つのアダプターを平滑 末端結合し、次いで二重のアダプターをＢｅ１ｌクロ一ニング部位の中に結合し 、ＢｃｌＩによりフランキングされた２つのＥｃｏＲ１部位を有するベクターを 生成しなくてならなかった。このベクターをＶＡＰＤＲと命名した（第８図）。

このベクターの復製のウィルス由来付近の他のＥｃｏＲ１部位を除去するために 、ＶＡＰＤＲをＸｈｏ　ＩおよびＰｖｕｌで消化し、そしてスプライス部位およ びポリアデニル化配列を含有する２１２ｋｂの断片をゲル精製した。同様なベク ターｐＤＸ（公開された欧州特許出願ＢＰ２７６、８４６号に開示されており、 そして第８図に示されている）から、複製のアデノウィルス由来、ＳＶ４０エン ハンサ−およびアデノウィルスの主要後期プロモーターを含有する１、　７ｋｂ のＸｈｏ　［−Ｐｖｕ　Ｉ断片をゲル精製した。

これら２つの断片を一緒にＴ４ＤＮＡリガーゼで結合して、ベクターＶＡＰＤｘ Ｒを生成した（第８図）。

次いでＭ１３遺伝子間領域をＶＡＰＤｘＲに加えた。プラスミドｐＶＥＧをＰｖ ｕ［ＩおよびＮａｒｌで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、次い でＢａｍＨＩ　リンカ−をＴ４ＤＮＡリガーゼとともに添加した。結合生成物を ＢａｍＨ［で消化し、そしてＤＮＡ断片をゲル精製した。ＶＡＰＤｘＲをＢａｍ ＨＩで完全に消化し、そしてＢｃｌＩで部分的に消化した。アデノウィルスの発 現ユニットを含存するＢｃ　ｌ　Ｉ−ＢａｍＨＩをゲル精製した。ｐＶＥＧおよ びＶＡＰＤＸＲからの断片を結合し、そしてコンピテントＬＭ１０３５細胞の中 に形質転換した。この構成体を遺伝子開領域の正しい向きについてスクリーニン グした。所望の向きは、主要な後期のプロモーターにより合成されたＲＮＡに・ 関してアンチセンスの極性の一本鎖ＤＮＡを提供するであろう。この配置を育す る構成体をｐＰＶＥＧと命名した（第９図）。

プライム配列をｐＰＶＥＧに添加し、このプラスミドをＥｃｏＲ［で消化した（ 第９図）。オリゴヌクレオチドＺＣＩ７７３およびＺＣ１７７４をアニーリング することによって構成されたプライム配列を、ＥｃｏＲＩ消化したベクターに結 合した。結合したＤＮＡをＤＨ５αＦ３細胞（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃ ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｉｅｓから入手した）の中にエレクトロボレイシヨンし、 そして細胞をプレートした。コロニーのプロットが得られ、そして標識したＺＣ １７７３およびＺＣ１７７４をブロービングした。プラスミドＤＮＡを陽性のコ ロニーから調製し、そしてＸＬ−１青色細胞（ＳｔｒａｔｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎ ｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した）（これはＭ２Ｓの感染のために要求されるテ トラサイクリン耐性Ｆ′を含有する）の中にエレクトロボレイシヨンした。プラ スミドＤＮＡをテトラサイクリンおよびアンピシリンの両者に対して耐性である コロニーから調製した。ＥｃｏＲ１部位付近の領域を、二本鎖ジデオキシ鎖停止 ＤＮＡ配列分析により配列決定した。プライム配列の正しき向きをもつ構成体を 選抜し、そしてｐＤＶＥＧ　’　と命名した。

Ｄ、λＨＧ３の構成 プラスミドｐＧＥＭＴを、次のようにしてλＧＴＩＩの中にサブクローニングし て、クローニングしたＤＮＡ配列のレスキューおよび分析を促進した。ラムダＧ ＴＩＩ　ＤＮＡをＥｃｏＲｆで消化し、そして末端のホスフェートを仔ウシアル カリ性ホスファターゼで処置して除去した。プラスミドＶＡＰＤｘＲ（実施例Ｉ Ｄ）をＰｓｔｌで消化し、そしてゲル精製した。

オリゴヌクレオチドＺＣ５５４およびＺＣ５５３を、アニーリングしたとき、内 部のＮｏｔ［部位をもっＥｃｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　［アダプターを形成するように 設計した。上のＺＣ５５４およびＺＣ５５３をキナーゼＤ処理し、アニーリング し、そして線状化されたＶＡＰＤｘＲベクターに結合した。結合生成物をゲル精 製し、モしてＥｃｏＲＩ消化したラムダＧＴＩＩに結合した。結合混合物をパッ ケージングし、そして大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｙ１０８８細胞上にプレート した。ＶＡＰＤＸＲベクターを含有するファージを、ＥｃｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　１ アダプターを含有するニック翻訳し、ゲル精製したＶＡＰＤｘＲのＤＮＡを使用 して、プラーク精製した。１つのこのような単離物をλＧＨ４と呼ぶ。プラスミ ド９ＧＥＭＴをλＧＨ４のＮｏｔ１部位の中に挿入した。ラムダＧＨ４をＮｏｔ ４で消化して線状化し、そして仔つシアルカリ性ボスファターゼで処理した。プ ラスミドｐＧＥＭＴ（実施例ＩＡ）をＮｏｔ［で消化して線状化した。線状化し たλＧＨ４および線状化したｐＧＥＭＴを一緒に結合し、パッケージングし、そ して大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｙ１０８８細胞上にプレートした。ｐＧＥＭＴ を含有するクローンを、プローブとしてニック翻訳したｐＧＥＭＴを使用してプ ラーク精製した。この構成体をＮｏｔｒで消化して評価し、モしてλＨＧ３と表 示した。

Ｅ、哺乳動物の発現ベクターＺｅｍ２２９Ｒの構成ベクターＺｅｍ２２９ＲＩ！ 第１０図に示すようにＺｅｍ２２９から構成した。プラスミドＺｅ＋ｎ２２９は ｐａｃｔｓに基づく発現ベクターであり、マウスメタロチオネイン−ｌプロモー ターｔｏｓＶ４０転写ターミネータ−との間にクローニングしたＤＮＡの挿入の ための独特ＢａｍＨ１部位、ＳＶ４０の早期のプロモーターを含有する発現ユニ ット、マウスジヒドロフオレートリダクターゼ遺伝子、およびＳＶ４０ターミネ ータ−を含有する。

Ｚｅｍ２２９をＥｃｏＲ［による部分的消化、ＤＮＡポリメラーゼ■　（クレノ ー断片）およびｄＮＴＰにより平滑末端化および再結合により修飾して２つのＥ ｃｏＲ１部位を欠失した。生ずるプラスミドをＢａｍＨＩで消化し、次いて線状 化されたプラスミドをＢａｍＨｉＥｃｏＲＩアダプターと結合すると、独特Ｅｃ ｏＲ［クローニング部位か生成した。生ずるプラスミドをＺｅｍ２２９Ｒと表示 した。

実施例２ ＡＯＡＨをコードするＤＮＡ配列のクローニングＡ、　ＡＯＡＨのアミノ酸配列 ＡＯＡＨをＤＭＳＯ処理したＨＬ−６０細胞から精製し、そしてマウスを免疫化 するために使用した。抗体を誘発するために、はぼ純粋なＡＯＡＨをレンチルレ クチン−セフｙローズ（ＳｅｐｈａｒｏｓｅＸＰｈａｒｍａｃｉａ）に吸着させ 、そして生ずる複合体をマウスに腹腔内注射した。マウスの牌細胞をＳＰ／　２ 　ｍ胞と融合した後、生ずるハイブリドーマを活性消耗アッセイによりＡＯＡＨ に対する抗体の生産についてスクリーニングした。溶液からＡＯＡＨ活性を消耗 した１つのモノクローナル抗体はまた、ウェスタンプロット分析でＡＯＡＨの５ ０ｋＤのサブユニットに結合した。

次いで、純粋なＡＯＡＨのサブユニットを２−メルカプトエタノールで還元して 分離し、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、５０ｋＤのバンドを膜上にブ ロッティングし、そしてＮ末端のアミノ酸配列をアミノ酸のマイクロ配列分析に より決定した。表２に示す２９アミノ酸をコア配列と表示した。

Ｘｘｘ　ＡｓｐＩｌｅ　Ｘｘｘ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａ ｌａ　Ｌｙｓ　［１ｅＸｘｘ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌ ａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　ＸＸＸ　ＶａｌＰｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ 　Ｖａｌ２つの合成ペプチドをコア配列の一部分から合成した（Ｃｙｓ　Ａｌａ Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　ｌｌｅ　 Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　ＭｅｔＧｌｕ　Ｇｉｎ　閃Ｃｙｓ　 Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　 Ｉｌｅ　ＧｌｙＧｌｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ）。

キーホールリンペットヘモシアニンを各ペプチドのＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａのト リブレットのＣｙｓ残基を介してペプチドに、Ｇｒｅｅｎら、Ｃｅ１１．２８　 ：　４７７−４８７．１９８２）に本質的に記載されているによりカップリング した。ペプチドで免疫化したウサギからの血清は、また、ウェスタン分析により ５０ｋＤのタンパク質を固定した。

Ｂ、コア配列の増幅 用して単離した。簡単に述べると、ｌμｇのＨＬ−６０ポリ（Ａ）″ＲＮＡを、 合１５ｍ１ノ５ｍＭ（Ｄ　ト’）　ス９Ｈ７，０、０，０５ｍＭＩ）ＥＤＴＡＯ ）中に希釈し、６５°Ｃに３分間加熱し、氷水の中で急冷し、そして６μｇ／μ ｌのランダムブライ７−　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ　、ニュージャーシイ州ピッツバーグ）を含有するＩＯμＩの５０＋ｎ ＭのトリスＩ（Ｃ１，ｐＨ８，３゜７５ｍＭのＫＣＩ　、１０ｍＭのＤＴＴ、３ ｍＭのＭｇＣ１ｔ　、５００　ａＭのｄＮＴＰ、０．５　μＣｉ／μｌのα’　 ”Ｐ−ｄＡＴＰの中で逆転写した。この反応を４５°Ｃにおいて５分間予備イン キュベーションし、そして２０Ｕ／μｍのＭＭＬＶ　（Ｈ−）逆転写酵素（Ｂｅ ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｉｅｓから入手した）に添 加した。インキュベーションを４２℃において１時間続けた。インキュベーショ ン後、ＴＣＡ沈澱性のカウントを決定した。１μｍの反応混合物を５００μｍの １００μｇのキャリヤーＲＮＡを含有する水に添加した。ＤＮＡを５００μｌの ２０％のＴＣＡで沈澱させた。この試料の１００μｍを直接計数して反応におけ る合計の計数を決定した。ＴＣＡ試料の残部をガラスフィルター上に集め、そし て１０％のＴＣＡで洗浄し、そして計数した。この合成は２５０　ｎｇのＤＮＡ を生じた。

９０μｌの１ｍＭのＥＤＴＡ、　１．２　ＨのＫＯＨを反応試料の残部に添加し た。

試料を６５°Ｃにおいて１５分間インキュベーションしてＲＮＡを加水分解した 。プライマーおよび小さい分子をアルカリ性セファローズ６Ｂカラムのクロマト グラフィーにより除去し、１ｍｌの使い捨てピペットの中の５０ｍＭのＫＯＨ、 Ｏ，ｌ　ｍＭのＥＤＴＡの中に注いだ。（このカラムは使用前に５０力ラム体積 の緩衝液で洗浄した。）空隙体積中のｃＤＮＡを集め、そして５μｇのキャリヤ ーとしてのカキグリコーゲンの添加後、エタノール沈澱させた。ランダムプライ ムドｃＤＮＡを５０μＩの１０ｍＭのトリスｐＨ７，４、１０ｍＭのＮａＣ１， および０．１ｍＭのＥＤＴＡの中に再懸濁させた。

開示した配列の末端の部分に相当しかつさらにサブクローニングを促進するよう に末端のＥｃｏＲ１部位をコードする配列を含有する、縮合オリゴヌクレオチド を設計しそして合成した。センスコアプライマーの族、ＺＣ２３８８（表３）お よびアンチセンスコアプライマーの族、ＺＣ２２９５（表３）を使用して、Ｌｅ ｅら（前掲）に本質的に記載されている方法に従いｃＤＮＡを増幅した。４２ｎ ｇのランダムプライムドｃＤＮＡを１００　μｍの反応混合物の中にＩＸＰＣＲ 緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒｃｅｔｕｓ　１／−ウオーク）　、２００　 ａＭのｄＮＴＰ、　４００ピコモルのＺＣ２３８８゜４００ピコモルのＺＣ２２ ９５およ２．５ＵのＴａｑｌを含有する反応混合物に添加した。鉱油のオーバー レイを反応混合物に添加し、モしてＰＣＲ反応を表４に示す条件下に実施した。

表３ ＺＣ２３８８〜センスコアプライマーの族２３７−１２５６の族 ＥｃｏＲＩ　Ａ　Ａ　Ａ ＣＣＣＡ ＴＣＡＧＡＡＴＴＣＧＴＧＴＴＧＧＣＧＡＡＧＡＴＴＴ ＺＣ２２９５−アンチセンスコアプライマーの族２６マー、１２８の族 ＥｃｏＲ［ＡＡ ＴＧＣＣ ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＡＣＡＴＣＣＴＴＡＡＡＧＧＧＧＡＣＴ ＺＣ２３８９−１２８の１７マーのプローブの族Ａ ＴＣＣＡＡ ＡＡＡＣＴＧＧＣＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＴ ＺＣ２２９８−１６の２６マーの■−プローブの族Ａ、ＡＡ　Ａ ＣＡＧＡＡＧＡＴ　ＩＡＡＧ　ＩＴ　ＩＧＣＩＡＴＧＧＡＧＣＡ表４ ９４°Ｃで３分間 ３０°Ｃて２分間　３サイクル ７２°Ｃて４分間 ９４°Ｃで２分間 ５５℃で２分間　４０サイクル ７２°Ｃで４分間 最後のサイクル後、試料を１００μｍのクロロホルムで抽出して油のオーバーレ イを除去した。５μｇのカキグリコーゲンおよび４μＩ（７）０．５ＭのＥＤＴ Ａを添加し、試料をフェノール−クロロホルムで抽出した。増幅したＤＮＡをエ タノール沈澱させ、そして６０μＩの水の中に再懸濁させた。

再懸濁した増幅したＤＮＡをλＨＧ−３のＥｃｏＲ［部位の中にクローニングし た。これを達成するために、増幅したＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、そして消化 物を４％ヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）アガロースＴＢＥゲル上で展開した。紫外 線の証明は約７１ヌクレオチドにおいて淡いバンドを明らかにした。このバンド をＮＡ−４５紙（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）上に電気泳 動させ、そして６５°Ｃにおいて４００　μｍの１．５ＭのＮａＣｌ、　１０ｍ ＭのトリスＩ）８７．４および０．１ｍＭのＥＤＴＡの中で２０分間インキュベ ーションした。５μｇのカキグリコーゲンの添加後、試料を３回フェノール−ク ロロホルム抽出し、そしてエタノール沈澱させた。ＤＮＡを１０μｌの水の中に 再懸濁させた。

ＥｃｏＲＩで消化しそして仔ウシアルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化したλ ＨＧ−３と、ＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡを結合した。結合混合物を室温において ２時間インキュベーションした。ギガバック・プラス（Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｐｌ ｕｓ）パッケージング混合物（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ　ＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅ ｍｓ、　Ｉｎｃ、、カリフォルニア州うジョラ）を添加し、そして室温において ２時間インキュベーションした。インキュベーション後、２２５μＩの３Ｍ緩衝 液（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲）を添加し、そしてこの溶液をおだやかに渦形成 した。３０μｌのクロロホルムを添加し、そして試料をおだやかに渦形成した。

２分の遠心分離後、水性相をｌ／に本質的に記載されている方法により調製した 。被覆ＰＣＲプライマーの間の配列を同定するプローブの２つのオリゴヌクレオ チドの族を設計した。プローブの族、ＺＣ２３８９およびＺＣ２２９８は、１７ マーの１２８オリゴヌクレオチドの族および２６７−の１６オリゴヌクレオチド の族から成り、それぞれ、最も不明確な位置にイノシンをもっていた（表３）。

これらのオリゴヌクレオチドをキナーゼ処理し、そして重複プラークのリフトを 各プローブの族でブロービングした。６つの陽性のプラークをそれ以上の分析の ために選択した。

プレートのリゼイトを各単離物から調製し、そしてラムダＤＮＡをＨｅ１ｍ５ら （ＤＮＡ、４　：３９．１９８５）に本質的に記載されている方法により得た。

λベクターの中に存在するプラスミドを、Ｈａｇｅｎ（前掲）に本質的に記載さ れている「λ−ポツプＪと呼ぶ方法により解放した。簡単に述べると、λ単離物 をＮｏｔｌで消化し、これは完全なｐＧＥＭＴプラスミドを遊離した。Ｎｏｔ［ 消化したＤＮＡを室温において５時間給合し、次いでリガーゼを６５°Ｃにおい て１０分間加熱変性した。結合混合物をフェノール−クロロホルム抽出し、エタ ノール沈澱させ、そＢｉｏｃｈｅｍ、、　１１４　：　１９３．１９８１）に本 質的に記載されている方法により調製した。コア断片のＤＮＡ配列を、二本鎖プ ラスミドＤＮＡについてジデオキシ鎖停止法により、ベクターの配列のプライマ ーを使用して決定した。ＤＮＡ配列の翻訳は、推定されたアミノ酸配列（表５） がコアＡＯＡＨアミノ酸配列と同一である、すなわち、それぞれ、Ｃｙｓおよび Ｓｅｒをもつ位置１３および２３（表２）に未知のアミノ酸を供給することを示 した。

Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　［ｌｅ　 Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｍｅｔ５’　ＧＴＴ　ＴＴＧ　ＧＣＣＡＡＧ　ＡＴＣ ＴＧＣＣＡＧ　ＡＡＡ　ＡＴＴ　ＡＡＡ　ＴＴＡ　ＧＣＴ　ＡＴＧｌ　１０　２ ０　３０ Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ＶａｌＧ ＡＡ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　ＴＴＣＡＡＡ　ＧＡＴ　ＧＴ　３’Ｃ ８部分的ｃＤＮＡクローンの単離 部分的ＡＯＡＨｃＤＮＡのクローンを、ＤＭＳＯ刺激したＨＬ−６０細胞のＲＮ Ａから調製したｃＤＮＡライブラリーから得た。このライブラリーのためのＲＮ Ａ鋳型を、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒＹ、　１８　：　５２ ９４−５２９９．１９７９）に本質的に記載されている方法により調製した。ポ リ（Ａ）　−ＲＮＡをオリゴ−ｄ　（Ｔ）カラムに２回通過させて選抜した。ラ ムダｇｔｌｌライブラリーを、このＲＮＡから、インビトロゲ・インコーホレー テッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｉｎｃ、）の「ラムダ・ライブラリー（Ｌａｍ ｄａ　Ｌｉｂｒａｒｉａｎ）Ｊキットおよび製造業者の指示の変更を使用して調 製した。簡単に述べると、二本鎖ｃＤＮＡを、５μｇの２回選択したポリ（Ａ） ′″ＲＮＡおよび製造業者の記載した指示を使用して合成した。ｃＤＮＡをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＥｃｏＲＩアダプターを添加し、そしてｃ ＤＮＡを製造業者か記載するようにリン酸化した。リン酸化後、ｃＤＮＡを２回 フェノール−クロロホルム抽出した。ｃＤＮＡの大きさで選抜し、そして１０ｍ ＭのトリスｐＨ７，４、１５０ｍＭのＮａＣ１および０．１ｍＭのＥＤＴＡと平 衡化した１、１ｍｌのセファローズ６Ｂ−ＣＬカラムのクロマトグラフィーによ り、組み込まれなかったプライマーを除去した。ｃＤＮＡを含有する空隙体積の 分画をプールし、そしてｃＤＮＡをエタノール沈澱させた。ｃＤＮＡをＥｃｏＲ Ｉ消化した脱リン酸化ラムダｇｔｌｌ　（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、）に結合 した。ＤＮＡをギガパック・プラス（Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｐｌｕｓ）ノく・ｙケ ージング混合物（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使 用してパッケージングし、そして大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｙ１０８８細胞上 にプレートした。

１％のバックグラウンドをもつ１３．３Ｘ　１０”の独立の単離物を含有する、 プレートのリゼイトのライブラリーを調製した。ライブラリーのアクチン陽性は ０．３４％であった（Ｈａｇｅｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６　：３ ４０、１９８８）。プレートのリゼイトのライブラリーをクロロホルムの上で４ °Ｃにおいて貯蔵した。

ライブラリーをＡＯＡＨｃＤＮＡクローンについてスクリーニングするために、 ７．２ＸＩＯ’のファージを含有する重複フィルターのリフトを調製した。フィ ルターを放射線標識したＺＣ２４６５（これはコア配列から設計した）でブロー ビングした。このプローブを３７°Ｃにおいて２０％のウルリッヒ（Ｕｌｌｒｉ ｃｈ）のハイブリダイゼーション緩衝液（Ｕｌｌｒｉｃｈら、ＥＭＢＯＪ、、３ 　：　３６１−３６４．１９８４）の中でハイブリダイゼーションし、そして２ 　ｘｓｓｃ　：　Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲）の中で５０°Ｃにおいて洗浄した 。重複リフト上に現れた２つの潜在的陽性をプラーク精製し、そしてクローン１ ．１およびクローン２．１と表示した。これらの標識したクローンからのｃＤＮ ＡインサートをｐＤＶＥＧ　’の中にサブクローニングし、そして二本鎖ジデオ キシ鎖停止ＤＮＡ配列の分析により配列決定した。クローン１．１および２．１ のｃＤＮＡインサートの配列の分析は、２つのクローンかオーバーラッピングし ているか、不完全であり、そして５′末端付近に異なる配列および異なるコード 能力を含有することを示した。

Ｄ、３’ＡＯＡＨコ一ド配列の増幅のための３′鋳型ｃＤＮＡの調製オリゴ−ｄ 　（Ｔ）　、　Ｘｈｏｌ、　５ａｌｌおよびＣ１ａ［プライマーをコートするよ うに設計した。２Ｃ２４８７を利用するＵ−９３７ポリ（Ａ）　”ＲＮＡ　（表 １）から、相補的ＤＮＡを合成した。２μｍの水中の１ａｇのＵ−９３７ポリ（ Ａ）−が濃縮したＲＮＡを２μｍのトリスｐＨ７，０、０，１ｍＭのＥＤＴＡと 混合し、６５°Ｃにおいて３分間加熱し、そして氷°水中で急冷した。２μｍの ５×緩衝液（５０ｍＭのトリスＨＣＩ　、　ｐＨ８，３、１０ｍＭのＤＴＴ、３ ｍＭのＭｇＣ１２）を０．５μ＋の１０ｍ１ＪのｄＮＴＰ、１　μｍの５ピコモ ル／μｌのＺＣ２４８７，１，Ｏｕ　ｌの水および０．５ｍｌの５μｃｉ／μｌ のａ　３２Ｐ−ｄＡＴＰと混合した。ＲＮＡ溶液を反応混合物に添加し、モして ４５°Ｃにおいて５分間予備インキュベーションした。予備インキュベーション 後、１μｌの２００単位／μｌのＭＭＬＶ　（Ｉ（−）逆転写酵素を添加し、そ して試料を４５°Ｃにおいて１時間インキュベーションした。インキュベーショ ン後、１μｍの０．５ＭのＥＤＴＡおよび１μｌの５ＮのＫＯＨを試料に添加し 、そしてＲＮＡを６５°Ｃにおいて１５分間インキュベーションすることによっ て加水分解した。

Ｅ、５’ＡＯＡＨコ一ド配列の増幅のための５′鋳型ｃＤＮＡの調製ＡＯＡ！（ コード配列の５′部分に対して相補的なりＮＡを、Ｆｒｏｈｍａｎら（前掲）に 本質的に記載されている方法により調製した。表４に示すコア配列のヌクレオチ ド８〜４０に相当するアンチセンス配列をエンコードするオリゴヌクレオチドの プライマーＺＣ２４８７を利用して、Ｕ−９３７ポリ（Ａ）ＲＮＡから相補的Ｄ ＮＡを合成した。２μｌの水中の１ａｇのポリ（Ａ）が濃縮したＲＮＡを２ｍｌ の１０ｍＭのトリスｐ８７．０＋０．１ｍＭのＥＤＴＡと混合し、６５°Ｃにお いて３分間加熱し、そして氷水中で急冷した。２μｌの５×緩衝液を０．５μｌ の１０ｍＭのｄＮＴＰ、ｌ　／、ｃ　Ｉの５ピコモル／μｍのＺＣ２６３４，１ ，０μｌの水および０．５μｍの５μＣ４／μｍのα３２Ｐ−ｄＡＴＰと混合し た。ＲＮＡの溶液を反応混合物に添加し、モして４５°Ｃにおいて５分間予備イ ンキュベーションした。予備インキュベーション後、１μｌの２００単位／μｌ のＭＭＬＶ　（Ｈ−）逆転写酵素を添加し、そして試料を４５°Ｃにおいて１時 間インキュベーションした。インキュベーション後、ｌμｌの０．２５ＭのＥＤ ＴＡおよび２９０μｍの５ＮのＫＯＨを試料に添加し、モしてＲＮＡを６５℃に おいて１５分間インキュベーションすることによって加水分解した。

製造業者が記載した条件を使用して５０ｍＭのＫＯＨおよび０．１ｍＭのＥＤＴ Ａの存在下に、セントリコン・スペシャル（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　Ｓｐｅｃｉａ ｌ）ＹＭ−１００限外濾過装置を通す限外濾過により、ｃＤＮＡ試料からプライ マーを除去した。濾過後、ＤＮＡを５μｇのカキグリコーゲンの助けによりエタ ノール沈澱させた。ＤＮＡを５．７μｌの８２０の中に再懸濁させた。５．７μ ｍのＤＮＡを０．３μｌの水、２μｌの５ＸＴｄＴ緩衝液（１００ｍＭのカリウ ム力コジレート、ｐＨ７，２，２ｍＭのＣａＣ１ｔ　、０．２　ｍＭのＤＴＴ　 、１　ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）およびｌμｌの１ｍＭのｄＧＴＰと混合することに よって、ＤＮＡをＧ−テイル形成した。１５°Ｃにおいて５分間予備インキュベ ーションした後、３８．５単位の末端のデオキシヌクレオチジルトランスフエラ ーゼ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈから入手した）を反応混 合物に添加した。さらに３分間インキュベーションし、そして９０μｍの２００ 　ｍＭのＮａＣＩ　＋　２０ｍＭのトリスｐＨ８，３を添加して反応を停止させ た。ＤＮＡをエタノール沈澱させ、エタノールで洗浄し、そして２０μＩの水の 中に再懸濁させた。

テイルしたｃＤＮＡの第２鎖の合成のために、２０μｌのＧ−ティルトＤＮＡを ４７μｍの水、ｌＯμｌのｌ０ＸＰＣＲ緩衝液（−ＭｇＣ１ｚ）　（５００ｍＭ のＮａＣｌ　、　１００ｍＭのトリス−Ｃ１，ｐＨ８，３（室温において）、０ ．１％のゼラチン、１６μｍの１．２５ｍＭのｄＮＴＰ、４　μｌの５０ｍＭの ＭｇＣＩｚ　、５ピコモルのＺＣ２４８８（これはポリ−ｄ　（Ｃ）　、　Ｘｈ ｏｌ、　５ａｌｔ、　Ｃ１ａｌプライマーをコードする）と混合した。試料を９ ４°Ｃにおいて５分間インキュベーションした後、５単位のＴａｑ　［を添加し 、そして油のオーバーレイを添加した。４０°Ｃにおいて５分間インキュベーシ ョンし、そして７２°Ｃにおいて１５分間インキュベーションした。１μｌの２ ５０　ｍＭのＥＤＴＡを添加して反応を停止させ、そして試料をクロロホルムで 抽出して油のオーバーレイを除去した。５μｇのカキグリコーゲンを添加し、そ して試料をエタノール沈澱させた。

Ｆ、５′および３′鋳型ＣＤＮＡ（７）濃縮５′および３′鋳型ｃＤＮＡをアル カリ性ゲル電気泳動により分別し、そして各ゲルの分画からのＤＮＡをＰＣＲ増 幅して、増幅可能なＡＯＡＨコード配列を含有するゲル断片を同定した。等しい 体積の２×アル力リ性配合色素（６０ｍＭのＮａＯＨ，４ｍＭのＥＤＴＡ、　２ ０％のグリセロール、および６０容量％のブロモレゾール紫、水で飽和した）を ３′鋳型ｃＤＮＡに添加した。５′鋳型ｃＤＮＡの中の１／２のＩＩＮＡを同様 に電気泳動のために調製し、そして試料のＤＮＡを１％の低融点のアルカリ性ア ガロースゲル上で分別した（　３０ｍＭのＮａＯＨ＋　２　ｄのＥＤＴＡ中の１ ％の低融点のアガロース）電気泳動後、アガロースゲルを、３　’　ｃＤＮＡに ついて７．０００〜７００のＤＮＡを表す１２−０．５ｃｍの断片、および５　 ’　ｃＤＮＡについて８−１ｃｍの断片に切断した。ゲルの断片を６５°Ｃにお いて溶融した。３′鋳型ｃＤＮＡを含有する溶融したゲル断片を３　’　ｃＤＮ Ａについて４００μｍの水で希釈した。５　’　ｃＤＮＡを含有する溶融したゲ ル断片を直接使用した。

ＰＣＲ増幅は、Ｆｒｏｈｍａｎら（前掲）に本質的に記載されているように、３ 　’　ｃＤＮＡについてゲル断片１〜１２および５　’　ｃＤＮＡについてゲル 断片２〜６を使用して実施した。１０μｍの断片１−１２からの３′鋳型ｃＤＮ Ａの各々を、ｔｏμｔのＩＱＸＰｃＲ緩衝液（−ｈｃｌｚ）　、　５７μｍの水 、１６μｍの１．２３ｍＭのｄＮＴＰ、２　μｌの５０ｍＭのＭｇＣ１ｚ　、２ 　ｕ　Ｉの５ピコモル／μｌのＺＣ２４６９（コア配列のヌクレオチド１−２２ をエンコードする）および２μｌの５ピコモル／μｌのＺＣ２４８９（Ｘｈｏｆ −ＳａｌＩ−Ｃ１ａｌアダプタ一配列をエンコードする）と混合した。ｌμｌの 断片２〜６からの５′鋳型ｃＤＮＡの各々を、１０μｍのｌ０ＸＰｃＲ緩衝液（ −触Ｃ１ｔ）　。

６６μｌの水、１６μｍの１．２５ｍＭのｄＮＴＰ、２　ａ　Ｉの５０ｍＭのＭ ｇＣｌ２．　２　ｕ　１の５ピコモル／μｌのＺＣ２６３４および２μｌの５ピ コモル／μｍのＺＣ２６３３と混合した。５単位のＴａｑ　ｌＤＮＡポリメラー ゼを各混合物に最初の９４℃の変性期間の間に添加し、そして鉱油のオーバーレ イを添加し、そして混合物を表６に記載する条件に従い増幅した。

表６ ９４℃で１分間 ５０°Ｃで２分間 ７２°Ｃて３分間 ４０サイクル ９４°Ｃて１分間 ６５°Ｃで２分間 ７２℃で４分間 ９４℃で２分間 ７２°Ｃで４分間 １サイクル ７２°Ｃて４分間 増幅後、１０μｍのＰＣＲ反応の各々を、２μｌの５×配合色素（０，４５Ｍの トリス、０．４５Ｍのホウ酸、０．０１ＭのＥＤＴＡ、　５０％のグリセロール 、０．１３％のキシレンシアツール、および０．１３％のブロモフェノールブル ー）の添加後、０．８％のアガロースゲル上で電気泳動した。ゲルを臭化エチジ ウムのインターカレーションによる可視化および紫外線証明および引き続くスロ ットプロット分析により分析した。３′ＰＣＲ生成物は臭化エチジウムの染色に よりわずかの小さいノくンドを示したか、キナーゼ処理したアンチセンスプロー ブ（ＺＣ２４７０）を使用してスロットプロット分析により明らかなように、そ れらのいずれも問題のＤＮＡバンドであることは証明されなかった。スロツトプ ロット分析のパターンは、最大のハイブリダイゼーション可能なノ（ンドかほぼ １５００ヌクレオチドであることを示した。１５００ヌクレオチドのバンドは、 ３０００ヌクレオチドに対する鋳型ｃＤＮＡを含有する、ゲル断片＃３から最も 優勢であった。断片＃３から溶出されたＤＮＡをすべての追加の実験において使 用して、３　’　ＡＯＡＨコード配列を得た。

５　’　ＰＣＲ生成物から生成したＰＣＲ生成物の分析は、臭化エチジウムの染 色によりＤＮＡバンドを明らかにしなかった。ＡＯＡＨｃＤＮＡクローン１．１ のランダムプライムド５　’　ＥｃｏＲ［−Ｘｈｏｒ断片を使用するサザン分析 は、ゲル断片＃４からの約７００ヌクレオチドにおける）１イブリダイゼーシヨ ン可能なバンドを明らかにした。

ＺＣ２４６９およびＺＣ２４８９を使用する断片＃３からのＴＵＮＡの増幅は、 少量の望ましいＤＮＡ断片を時々生成した：しかしながら、より小さし１ハイブ リダイゼーシヨン可能なバンドはしばしば唯一のＰＣＲ生成物であった。同様に 、所望の５　’　ＡＯＡＨのＰＣＲ生成物を再現性よく得ることは困難であった 。最後に、ＰＣＲ生成物は、プライマーの中に含有されている制限部位を介して クローニングするであろう。したがって、「プライム」配列（［［ａｇｅｎ、同 時係属中の米国特許出願第０７／３２０．１９１号、これをここに引用によって 加える、に記載されている）をプライマーに添加し、そして増幅後のＰＣＲ生成 物のクローニングを促進した。

Ｃ１５′および３　’　ＡＯＡＨコード配列の増幅断片＃３からのＤＮＡをオリ ゴヌクレオチドＺＣ２６３１およびＺＣ２６３２を使用して増幅した。３′反応 混合物を次のようにして調製した。ｌμｌの断片＃３からのＤＮＡを１０μｍの ｌ０ＸＰｃＲ緩衝液（−ＭｇＣ１ｚ）　１７６μｍの水、１６μｍ０１．２５ｍ ＭのｄＮＴＰ、２　ｕ　１の５０ｍＭのＭｇＣ１ｚ、２　ｔｔ　Ｉの５ピコモル ／μｌのＺＣ２６３ｉ　（５’プライムセンスプライマー）および５ピコモル／ μｌのアダプター配列の３′に接合したプライム配列をコードする２Ｃ２６３２ の各々と混合した。

断片＃４からのＤＮＡをオリゴヌクレオチドＺＣ２６３３およびＺＣ２６３４を 使用して増幅した。５′反応混合物を次のようにして調製した。１μｍのゲル断 片＃４から（７）　ＤＮＡを１０４ｍのｌ０ＸＰＣＲ緩衝液（−ＭｇＣ１２）。

７６μｍの水、１６μｌの１．２５ｍＭのｄＮＴＰ、２　μｌの５０ｍＭのＭｇ Ｃ１ｔ、２　ｕ　１の５ピコモル／μｌのＺＣ２６３３（５’プライムーアダプ ターブライマー）および５ピコモル／μｍのＺＣ２６３４（３’プライムーアン チセンスブライマー）と混合した。５単位のＴａｑ　ｌＤＮＡポリメラーゼおよ び鉱油のオーバーレイを、第１サイクルの９４℃の変性工程の間に試料に添加し た。反応混合物を表７に記載する条件に従い増幅した。

表７ プライムプライマーを使用する５′および３′配列を増幅する条件４０サイクル ： ９４゛Ｃで２分間 ７２℃で４分間 １サイクルニ ア２°Ｃで４分間 増幅後、ｌＯμｌの各試料をアガロースゲルの電気泳動により分析した。ゲルの 分析は、３′生成物について１５００ヌクレオチドにおける小さなバンドおよび ８００において主要なバンドを明らかにした。

５　’　ＤＮＡの増幅は、ｌラウンドのレース給食、ＤＮＡをクローニングする ために十分な量の５　’　ＰＣＲ生成物を生成しなかった。サブクローニングの ために十分な５　’　ＰＣＲ生成物を生成するために、最初の増幅反応からのｌ ＯμｌのＤＮＡを、表４に記載する条件を使用して、４０サイクルの間両増幅し た。増幅後、試料のすべてをクロロホルムで抽出し、次いでフェノール／クロロ ホルム抽出した。ＤＮＡをセントリコ・スペシャルＹＭ１００マイクロ濾過装置 で濾過し、次いでキャリヤーとしてカキグリコーゲンを使用してエタノール沈澱 させた。

ＰＣＲ生成物を水の中に再懸濁させた。

二本鎖ＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼでｄＡＴＰの存在下に処理して、ベクタ ーｐＶＥＧＴ　’の中に存在するプライム配列に対して相補的な一本鎖プライム 配列を生成することによって、ＰＣＲ生成物をサブクローニングした。ＰＣＲ生 成物の各々をｌμｌの１０ＸＴ４緩衝液、１μｍの１ｍＭのｄＡＴＰ、１　ｕ　 Ｉの５０ｍＭのＤＴＴおよび■単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼと混合した。反応 混合物を１５°Ｃにおいて１時間インキュベーションした。ポリメラーゼを６５ °Ｃにおいて１５分間加熱変性した。

Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのカット−バックＰＣＲ生成物を０．８％の低融点のア ガロースゲルの中で電気泳動させ、そして１５００ｂｐおよび８００ｂｐのバン ドをゲル精製した。カット−バックしたＤＮＡをカット−バックしたｐＶＥＧＴ 　’と結合した。プラスミドＤＮＡを形質転換体からＨｏｌ＋ｎａｓおよびＱｕ ｉｇｌｅｙ（前掲）に本質的に記載されている方法により調製した。ＥｃｏＲＩ 制限分析によりプラスミドＤＮＡの分析は、１５００ｂｐの３　’　ｃＤＮＡを 含有する６クローンおよび８００　ｂｐの５　’　ｅＤＮＡを含有する５クロー ンを明らかにした。これらのクローニングのＤＮＡ配列の分析により、クローン がコア配列とオーバーラツプするＤＮＡ配列を含有することが確認され、そして １．１および１．２　ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列との比較により、２２９０ ｂｐの全長の配列が確立された。

Ｈ，全長のＡＯ，ＡＨｃＤＮＡの増幅 ５′および３′クローンからの配列から設計したオリゴヌクレオチドのプライマ ーを使用して、断片＃３からのＤＮＡのＰＣＲ増幅により、全長のｃＤＮＡを発 生させた。第１図のヌクレオチド３８〜６１の配列の５′末端に接合したプライ ム配列をコードするオリゴヌクレオチドＺＣ２７０３、および第１図のヌクレオ チド２１７５〜２ｚ９８に相当するアンチセンス配列の３′末端に接合したプラ イム配列をコードするオリゴヌクレオチドＺＣ２７０４を、２つの別々の系列の ＰＣＲ反応において使用して、２つの独立に誘導されたＡＯＡＨクローンを得た 。１つの反応において、１μｍの断片＃３を１００μｌの体積のＰＣＲ反応（１ ×Ｔａｑ［ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）、　 ２００ｍＭのｄＮＴＰ。

０．２５μＭの各プライマー、２２．５単位／　ｕ　ＭＯＰｒＯｍｅｇａ　Ｂｉ ｏｔｅｃｈのＴａｑｌＤＮＡポリメラーゼ）の中で表８に記載する条件下に増幅 した。

１０４ｍの前述の反応を、前述と同一の条件下に、増幅の第２ラウンドにかけた 。生ずるＰＣＲ生成物をＣと表示した。第２反応において、１０μｌの断片＃３ を前述と同一の条件下にＰＣＲ増幅の３０サイクルの２ラウンドのための出発鋳 型として使用したが、ただしＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈのＴａｑ　ｌＤＮＡ ポリメラーゼを４５単位／μｍの濃度で使用した。

生ずるＰＣＲ生成物を４と表示した。

表８ 全長のＡＯＡＨｃＤＮＡを増幅するための条件３０サイクル： ９４℃で２分間 ７２℃で４分間 １サイクルニ ア２℃で４分間 室温に冷却する 前述したようにＰＣＲの２ラウンド後、試料Ｃおよび４をクロロホルムで抽出し て油のオーバーレイを除去した。１００μＩの２０ｍＭのトリスｐＨ８，３＋２ ０（ｌ　ｍＭのＮａＣｌ　＋　２０ｔｎＭのεＤＴＡを添加し、そしてこの溶液 をフェノール−クロロホルムで抽出した。プライマーをＰＣＲ生成物から、アミ コン・セントリコ・スペシャル（Ａｍｉｃｏｎ　ＣｅｎｔｒｉｃｏｎＳｐｅｅｉ ａｌ）　ＹＭ１００限外濾過装置で製造業者が記載するように溶離液として水を 使用して、限界濾過することによって除去した。５μｇのカキグリコーゲンを添 加して、そしてＤＮＡをエタノール沈澱させた。

ＰＣＲ生成物およびＥｅｏＲ［直線化ｐＤＶＥＧ（実施例ＩＣ）をＴ４ＤＮＡポ リメラーゼを使用してエクソヌク［／アーゼ処理して、プライム配列を露出した 。実施例２Ｇに記載されているように、ＰＣＲ生成物を１０４ｍのＴ４ＤＮＡ４ ＤＮＡポリメラーゼいて処理した。１時間後、試料を６５°Ｃにおいて１５分間 インキュベーションしてポリメラーゼを不活性化した。ＤＮＡを０．８％の低融 点のアガロースゲル上で電気泳動させ、そして増幅したＤＮＡをゲル精製した。

カット−バックしたＰＣＲ生成物の各々をカット−バックしたｐＤＶＥＧに結合 した。

ＤＮＡを大腸菌（Ｅ、　ｃｏＨ）　ＤＨ５ｃｒＦ”細胞（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｉｅｓ）の中にエレクトロボレイシヨンし、そ してプレートした。プラスミドＤＮＡを調製し、そしてＤＮＡを制限エンドヌク レアーゼ分析により分析した。Ｃからの１つのクローンおよび４からの１つのク ローンを選択し、そしてＣ／２６および４−３３と表示した。クローンＣ／２６ および４−３３をジデオキシ連鎖停止法により配列決定した。

Ｃ／２６および４−３３の配列を、それぞれ、第１図および第２図に示す。

■、コンセンサスＤＮＡの構成 ＰＣＲ合或は、ＤＮＡ合成のサイクル数および条件に依存して、変異を増幅した ＤＮＡの中に組み込むことができるので、コンセンサス配列を確立することにつ いて厳格であることが必要であった。２つの全長のＰＣＲクローンの配列、５　 ’　ＡＯＡＨのＰＣＲ生成物、２つの３′ＡＯＡＨ生成物、および２つの部分的 ｃＤＮＡクローンを比較することによって、コンセンサスＡＯＡＨｃＤＮＡ配列 が第３図に示すように確立された。配列の比較により、クローン４−３３　（第 ２図）は３つのＰＣＲ誘発された３つのアミノ酸の変化を生ずる突然変異を青し 、そしてクローンＣ／２６　（第１図）は９つのＰＣＲ誘発された７つのアミノ 酸の変化を生ずる突然変異を育することが示された。

次の最も少ない（３つ’）　ＰＣＲ誘発変異を育するＡＯＡＨ４−３３クローン （第２図）から、ＡＯＡＨをコードするコンセンサスＤＮＡ配列を構成した：位 置６０１におけるＡ→Ｇ１セリン１１７をアスパラギンに変化する；位置１４４ ４におけるＡ→Ｇ１アルギニン３９８をグルタミンに変化する：位置１５０５に おけるＴ→Ｃ１セリン４１８をロイシンに変化する。

これらの障害を次のようにして補正して、ＡＯＡＨＩ　と呼ぶコンセンサスＤＮ Ａ配列を構成した（第４図）。

ＰＣＲ鋳型調製のための標準的プロトコルおよびＰＣＲ反応条件に従った（Ｉｎ ｎｉｓ、　Ｇｅ１ｆａｎｄ、　５ｎｉｎｓｋｙおよびＷｈｉｔｔｅ、　Ｔ、　Ｊ 、纏、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９９ ０）　ａ詳しくは、ＰＣＲ鋳型はクローンＺｅｍ２２９Ｒ−４−３−３の２．２ ｋｂのＥｃｏＲｒ断片であった（実施例３）。

第１０図に示すように、オリゴヌクレオチドＺＣ３０７４（ｆｆｌ乳動物のコン センサスリポソーム結合部位（ヌクレオチド配列ＣＣＡＣＣをコードする）を、 ５ａｉｌおよびＥｃｏＲ［部位が先行する、開始メチオニンのちょうど上流に挿 入し、そして第２図のヌクレオチド２５２−２６９をエンコードするセンスプラ イマー）、およびＺＣ３０７５（ヌクレオチド５７６−５９６に相当しそしてＸ ｈｏ　１部位を位１５８４に挿入するアンチセンスプライマー）を合成し、そし て４−３３ＤＮＡを増幅するために使用した。増幅後、ＤＮＡをＥｃｏＲｒおよ びＸｈｏＩで消化して、第４図のヌクレオチド２−３４８をコードする３４６　 ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ　［断片を単離した。

クローン４−３３の位置６０１および１４４４における突然変異（第２図）を、 ＰＣＲ増幅により、オリゴヌクレオチドＺＣ３０７６（第１図のヌクレオチド５ ７６−６０７に相当し、位置５８４にサイレント突然変異をつくることによって Ｘｈｏ　［部位をつくり、そして位置６０１における突然変異を補正する、セン スオリゴヌクレオチドのプライマー）、およびＺＣ３０７７（第１図のヌクレオ チドに相当し、位置１，４８１．１４８２および１４８３にサイレント突然変異 をつくることによって位！１４８１にＢａｍＨ１部位をつくり、そして位置１４ ４４における突然変異を補正するアンチセンオリゴヌクレオチドのスプライマー ）を使用して補正した。第１Ｏ図に示すように、４−３３ＤＮＡの２．２ｋｂの ＥｃｏＲＩ断片を、オリゴヌクレオチドＺＣ３０７６および３０７７を使用して ＰＣＲ増幅した。増幅されたＤＮＡをＸｈｏｌおよびＢａｍＨＩで消化して、第 ４図のヌクレオチド３４９−１２４５をコードする８９７　ｂｐのＸｈｏ　ｌ− Ｂａｍ１（Ｉ断片を単離した。

クローン４−３３の位置１５０５における突然変異をＰＣＲ増幅により補正した 。第１Ｏ図に示すように、オリゴヌクレオチドＺＣ３０７８（第２図のヌクレオ チド１４７３−１５１１に相当し、ＺＣ３０７７と同一のＢａｍＨＩ部位を挿入 しそして第２図の位置１５０５における突然変異を補正するセンスプライマー） 、およびＺＣ３０７９（第２図のヌクレオチド１９６７−１９９９に相当しそし て５ａｌｒおよびＥｃｏＲ１部位を停止コドンの直ぐ下流に挿入するアンチセン スプライマー）を使用して、４−３３ＤＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡをＢ ａｎ＋ＨＩおよび５ａｌＩで消化して、第４図のヌクレオチド１２４６−１７５ ２をコードする５０７ヌクレオチドのＢａｍＨ［−５ａｉｌ断片を単離した。

ＰＣＲ生成物を第１０図に示すようにｐＵｃ１８の中にサブクローニングした。

第４図のヌクレオチド２−２４８をコードするＡＯＡＨの５′配列を含んでなる ＥｃｏＲｒ　ＸｈｏＩ断片、および、位置３６７および１２１０　（それぞれ、 第１図の位置６０２および１４４４に相当する）に補正された配列を有する第４ 図のヌクレオチド３４９−１２４５に相当するＡＯＡＨ配列を含んでなるＸｈｏ ｌ−ＢａｍＨＩ断片を、−緒に、εｃｏＲＩ−ＢａＩＤＨ［消化したＩ］ＵＣｌ ３と結合した。生ずるプラスミドは配列分析により確認された。正しいインサー トを育するクローンをＥｃｏＲ［およびＢａｍＨＩで消化して、第４図の位置２ −１２４５に相当するＡＯＡＨ配列を含んでなるＥｃｏＲＩ−Ｂａｍｔ（Ｉ断片 を単離した。別の反応において、位置１２７０　（第１図の位置１５０４に相当 する）に補正された配列を育する第４図のヌクレオチド１２４６−１７５２に相 当するＡＯＡ＋（配列を含んでなる、ＢａｍＨＩ−３ａｔ　［断片を、ＢａｍＨ Ｉ−５ａｌ　Ｉ消化したｐＵＣ１８に結合した。

上の結合のＡＯＡＨ特異的部分か配列の分析により確認された後、部分的ＡＯＡ ＨｃＤＮＡを第１０図に示すように哺乳動物の発現ベクターの中で再アセンブリ ングした。第４図のヌクレオチド１２４６−１７５２に相当するＡＯＡＨ配列を 含んでなるＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、正しいインサートを存するプラスミ ドのクローンから単離した。ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨｒ断片およびＢａｍＨ［−Ｅ ｃｏＲＩ断片を、結合により、ＥｃｏＲＩ線状化したＺｅｍ２２９Ｒと接合した 。第４図からのＡＯＡＨＩ配列を含有する生ずるプラスミドをｐＲ３４３１と表 示した（第１０図）。

実施例３ 培養した哺乳動物細胞の中でＡＯＡＨの発現Ａ、補補動動物発現ベクター２ｅｍ ２２９Ｒ−Ｃ／２６およびＺｅｍ２２９Ｒ−４−３３の構成 プラスミドＣ／２６および４−３３の中に含有されるＡＯＡＨｃＤＮＡを、哺乳 動物の発現ベクターＺｅ＋ｎ２２９Ｒの中にサブクローニングした。プラスミド Ｃ／２６および４−３３はＥｃｏＲｒで消化してＡＯＡＨｃＤＮＡを単離した。

プラスミドＺｅｍ２２９ＲをＥｃｏＲＩにより消化により線状化し、そしてウシ アルカリ性ホスファターゼで処理して再環化を防止した。Ｃ／２６および４−３ ３からのｃＤＮＡの各々を線状化されたＺｅｍ２２９Ｒと結合した。プロモータ ーに関して正しい向きにＣ／２６および４−３３インサートを有するプラスミド のクローンを、それぞれＺｅ＋ｎ２２９Ｒ−Ｃ／２６およびＺｅｍ２２９Ｒ−４ −３３と表示した。プラスミドＺｅｍ２２９Ｒ−Ｃ／２６およびＺｅｍ２２９Ｒ −４−３３は、アメリカン・タイプ・フルチャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍ ｅｒｉｃａ口ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（米国マリイラ ンド州ロックビレ）に大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）の形質転換体として受託された 。

Ｂ９合成シグナル配列を含有するアシルオキシアシルヒドロラーゼのＤＮＡ配列 の構成 実施例２．１に記載するようにｐＵｃ１８の中にサブクローニングされた部分的 ５′コンセンサスＤＮＡ配列を、さらに修飾して、ｖａｎ　Ｈｅ１ｎｊｅ（前掲 ）に記載されているルールを使用して設計したアミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａ ｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌａをもつ天然ｐｒｅ配列の一部分（以後ＰＧＡＷＡと呼ぶ） と置換した。さらに、合成リーダーをｐｒｏ配列の不存在下および存在下に構成 した。実施例２．１に記載するｐＵｃ１８の中にＥｃｏＲｌ−ＢａｍＨＩインサ ートとして存在する部分的５′コンセンサスＡＯＡＨのＤＮＡ配列をＥｃｏＲＴ で消化して、はぼ１．２５ｋｂの断片を単離した。２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片 の一部分を、オリゴヌクレオチドブライマーＺＣ３２０２およびＺＣ３２０３を 使用して増幅した（表９）。２μｍの水中のほぼ５０−１００μｇのＥｃｏＲｒ 断片を、５０ピコモルの各プライマー、８μｌの１．２５ｍＭの各ヌクレオチド 三リン酸を含有する溶液、５μｌのＩＯＸセタス（Ｃｅｔｕｓ）緩衝液および２ ．５単位のＴａｑｌポリメラーゼと混合した。反応混合物を蒸留水で５０μｍの 最終体積にした。反応混合物を９４°Ｃで１分、４０℃で１分および７２℃で２ 分の２サイクルおよび引き続＜９４℃で１５秒、５５°Ｃで１５秒および７２℃ で２分の２０サイクルにかけた。最後のサイクルに引き続いて、７２℃において ７分間インキュベーションした。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、そしてＳｐｃ［お よびＢｇｌｌｌで消化した。生ずる３６５　ｂｐの断片をゲル精製した。

ＴＴＡ　ＡＴＴ　ＴＴＣＴＧＧ　ＣＡＧ　ＡＴＣＴＴＧ　ＧＣＣＺＣ３２０３ ＴＡＧ　ＧＧＴ　ＧＴＧ　ＴＡＣＴＡＧ　ＴＧＧ　ＴＧＴ　ＣＴＧＣ３１１２ ＣＧＡ　ＡＴＴ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＴＧＣＡＧＴ　ＣＣＣＣＣＴ　ＧＧＡ　ＡＡ Ａ　ＴＣＣＴＴＡＣＧＧ　ＴＧＧ　ＴＧＣＣＴＣＴＡＴ　ＴＣＴ　ＴＧＣＴＣＣ ＴＧＴ　ＣＴＣＣＡＣ３１１３ ＧＧＣＧＣＣＴＧＧ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＣＡ　ＧＣＣＡＡＣＧＡＴ　ＧＡＣＣ ＡＧ　ＴＣＣＡＧＧ　ＣＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＧ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　ＣＡＣＡＣ ＣＴＧＴ　ＧＴＡ　ＧＧＧＴＧＴ　ＧＴＡ Ｃ３１１４ ＣＴＡ　ＧＴＡ　ＣＡＣＡＣＣＣＴＡ　ＣＡＣＡＧＧ　ＴＧＴ　ＧＣＣＣＡＴ　 ＴＣＧ　ＡＧＡＧＧＣＴＧＧ　ＧＣＣＴＧＧ　ＡＣＴ　ＧＧＴ　ＣＡＴ　ＣＧＴ 　ＴＧＧ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＡＡＧＣＣＡ Ｃ３１１５ ＧＧＣＧＣＣＴＧＧ　ＡＧＡ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＧＡＡ　ＴＡＧ　ＡＧ Ｇ　ＣＡＣＣＡＣＣＧＴ　ＡＡＧ　ＧＡＴ　ＴＴＴ　ＣＣＡ　ＧＧＧ　ＧＧＡ　 ＣＴＧ　ＣＡＴ　ＧＧＴ　ＧＧＡ　ＡＴＴＣＧＡ　ＧＣＴ Ｃ３１１６ ＣＴＡ　ＧＡＡ　ＧＴＧ　ＧＴＡ　ＧＡＡ　ＧＡＡ　ＡＧＡ　ＧＡＡ　ＧＣＧ　 ＡＣＡ　ＴＴＴ　ＧＴＴＣＡＣＴＣＣＣＧＧ　ＴＴＴ　ＴＧＧ　ＣＣＡ　ＡＣ３ １１７ ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＧＧＣＣＡＡ　ＡＡＣＣＧＧ　ＧＡＧ　ＴＧＡ　ＡＣＡ　ＡＡ Ｔ　ＧＴＣＧＣＡＴＣＴ　ＣＴＴ　ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＡＣＣＡＣＴ　Ｔ表９（続 き） Ｃ３１１８ ＣＴＡ　ＧＴＡ　ＣＡＣＡＣＣＣＴＡ　ＣＡＣＡＧＧ　ＴＧＴ　ＧＣＣＣＡＴ　 ＴＣＧ　ＡＧＡＧＡＧ　ＣＣＣＡ Ｃ３１１９ ＧＧＣＧＣＣＴＧＧ　ＧＣＴ　ＣＴＣＴＣＧ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　ＣＡＣＡＣＣＴ ＧＴ　ＧＴＡＧＧＧ　ＴＧＴ　ＧＴＡ オリゴヌクレオチドのアダプターを、ｐｒｏ配列と共にＰＧＡＷＡを有、するｐ ｒｅ配列をコードするように設計した。オリゴヌクレオチドＺＣ３１１２，ＺＣ ３１１３，ＺＣ３１１４およびＺＣ３１１５（表９）を、アニーリングしたとき 、ｐｒｏ配列と共にＰＧＡＷＡをコードする５ｓｔＩ−３ｐｅ［アダプターをコ ードするように設計した。オリゴヌクレオチドＺＣ３Ｘ　１３およびＺＣ３１１ ５（表９）を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ 　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ虹・１且！、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９　：これをここに引用によって加える）に本 質的に記載されている方法によりキナーゼ処理したウキナーゼを加熱不活性化し 、そしてキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドＺＣ３１１ ２およびＺＣ３１１４（表９）と混合した。反応混合物を６５°Ｃに加熱し、そ してこの混合物を室温に１＃間冷却することによって、オリゴヌクレオチド混合 物をアニーリングした。１５２ｂｐのＳｓｔ［〜Ｓｐｅ！アダプターをポリアク リルアミドゲルの電気泳動により精製した。オリゴヌクレオチドＺＣ３１１２， ＺＣ３１１９，ｚＣ３１１５および２Ｃ３１１８（表９）を、７　ニー　ＩＪ　 ：）グしたとき、ｐｒｏ配列を伴わないＰＧＡＷＡ配列をコードする５ｓｔｌ− ５ｐｅＩアダプターをコードするように設計した。オリゴヌクレオチドＺＣ３１ １９およびＺＣ３１１５（表９）を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前掲）に本質的に記 載されている方法によりキナーゼ処理した。キナーゼを加熱不活性化し、そして キナーゼ処理したすりゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドＺＣ３１１２および ７Ｃ３１１８（表９）と混合した。反応混合物を６５°Ｃに加熱し、そしてこの 混合物を室温に１時間冷却することによって、オリゴヌクレオチド混合物をアニ ーリングした。Ｈ９ｂｌ）の５ｓｔＩ−５ｐｅｌアダプターをポリアクリルアミ ドゲルの電気泳動により精製した。

ｐＵｃ１８の中にＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩとしてサブクローニングした部分的５ ′コンセンサスＡＯＡＨのＤＮＡ配列（実施例２．■）を、はぼ１２５０ｂｐの ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片として単離し、そしてＥｅｏＲＩ−ＢａｍＨ（消化 したｐｌｃ１９Ｈの中にサブクローニングした。生ずるプラスミドをＢｇｌ［＋ および５ｓｔｌて消化して線状化した。線状化されたＢｇｌ［［および５ｓｔＩ 断片をＳｐｅｌ−Ｂｇｌ　ＩｆのＰ（Ｊ発生した断片と、およびｐｒｏ配列をも たないＰＧＡＷＡをコードすルＺＣ３１１２：　ＺＣ３１１９／ＺＣ３１１５： 　ＺＣ３１１８７ダブターあルイハｐｒｏ配列をもツＰＧＡＷＡをコードするＺ Ｃ３１１２：　ＺＣ３１１３／ＺＣ３１１５：　ＺＣ３１１４アダプターと結合 して、それぞれ、１）ＣＣ−４−ｐｒｏ＃４またはｌＩＣＣ−３＋ｐｒｏ＃１と 表示するプラスミドを発生させた。プラスミドｐＣＣ−４−１）ｒｏ＃４および ｐＣＣ−３＋ｐｒｏ＃１をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、はぼｌ。２ ５ｋｂの断片を単離した。３′コンセンサスＡＯＡＨのＤＮＡ配列が、実施例２ ．　Ｔに記載しかつ第１Ｏ図に示すＢａＩＩＩＨＩ　−５ａ　Ｉ　Ｉサブクロー ンからＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片として得られた。ｐＣＣ−４−ｐｒｏ＃４お よびｐＣＣ−３＋ｐｒｏ＃　ｌからのＥｃｏＲｉＢａｍＨＩ断片の各々を、３′ コンセンサスＡＯＡＨ配列をコードするＢａｍＨ［−ＥｃｏＲｒ断片とともに、 ＥｃｏＲ［の消化により線状化されたＺｅｍ２２９Ｒの中にサブクローニングし た。ｐＺｅｍ２２９Ｒ中にｐｒｏ配列をもたないＰＧＡＷＡを含有するｐｒｅ配 列を含有する、完全なＡＯＡＨｃＤＮＡ配列を含んでなるプラスミドをｐＲＳ４ ３３と表示し、そしてｐ２ｅｍ２２９Ｒ中にｐｒｏ配列をもつＰＧＡＷＡを含有 するρ「ｅ配列を含有する、完全なＡＯＡＨｃＤＮＡ配列を含んでなるプラスミ ドをｐＲＳ４３２と表示した。

Ｃ，ＡＯＡＨの小さいおよび大きいサブユニットの配列の間にタンパク質分解切 断配列を含有するアシルオキシアシルヒドロラーゼのＤＮＡ配列の構成 プラスミドｐＣＣ−４−９ｒｏ＃４およびｐＣＣ−３＋ｐｒＯ＃１の中に存在す るｃＤＮΔ配列の各々を修飾して、小さいおよび大きいサブユニットの配列の間 にタンパク質分解切断配列を挿入した。プラスミド９ＣＣ−４−９ｒｏ＃４およ び［１ＣＣ−３４ｐｒｏ＃１の各々をＥＣ０ＲＩおよびＢｇｌｌＩで消化しで、 ベクターを含有する断片を単離した。プラスミドｐＣＣ−４−ｐｒｏ＃４をＥｃ ｏＲｌおよびＸｂａ　Ｉで消化して４３３ｂｐの断片を単離し、そしてｐＣＣ− ３＋ｐｒｏ＃１をＥｅｏＲｌおよびＸｂａｌで消化して４６６１）！１を単離し た。タンパク質分解切断シグナルＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇをコードする Ｘｂａ［−８ｇｌｌｌアダプター（配列　配列：１２）を形成するように設計お よび合成された、オリゴヌクレオチドＺＣ３１１６およびＺＣ３１１７（表９） をキナーゼ処理し、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（前掲）に本質的に記載されてい る方法によりアニーリングした。ｐＣＣ−４−９ｒｏ＃４のＥｃｏＲｌ−Ｂｇｌ 　ＩＩ断片、ｐＣＣ−４−ｐｒｏ＃４の４３３ｂｐのＥｅｏＲＩ−Ｘｂａｒ断片 およびＺＣ３１１６／ＺＣ３１１７アダプター（表９）を結合した。生ずるプラ スミドをＰＧＡＷＡ−Ｐｒｏ＋ＲＲＫＲと表示した。Ｉ）ＣＣ−３＋ｌ１ｒＯ＃ ｌの４６６ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ　ＩＩ断片、ｐＣＣ−３＋ｐｒｏ＃１の４ ６６ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ断片およびＺＣ３１１６／ＺＣ３１１７アダプ ターを結合した。生ずるプラスミドをＰＧＡＷＡ＋Ｐｒｏ＋ＲＲＫＲと表示した 。プラスミドＰＧＡＷＡ−Ｐｒｏ＋ＲＲＫＲおよびＰＧＡＷＡ＋Ｐｒｏ＋ＲＲＫ Ｒの各々をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ＡＯＡＨコード配列を単離 した。３′コンセンサスＡＯＡＨＤＮＡ　配列は、実施例２．Ｉに記載しかつ第 １Ｏ図に示すＢａｏ＋Ｈｒ−Ｓａ、Ｉ　ｒサブクローンからＢａｒｎＨＩ−Ｅｃ ｏＲＩ断片として得られた。ＰＧＡＷＡ−Ｐｒｏ＋ＲＲＫＲおよびＰＧＡＷＡ＋ Ｐｒｏ＋ＲＲＫＲからのεｃｏＲｉＢａｍＨＩ断片の各々を、３′コンセンサス ＡＯＡＨＤＮＡ配列をコードするＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片およびＥｃｏＲＩ で消化して線状化したｐＺｅｍ２２９Ｒと結合した。合成ｐｒｅ配列、ｐｒｏ配 列およびタンバク質分解切断配列をもつＡＯＡＨコード配列を含んでなるプラス ミドをｐＲＳ４３４と表示した。合成ｐｒｅ配列およびタンパク質分解切断配列 をもつか、ｐｒｏ配列を欠如するＡＯＡＨコード配列を含んでなるプラスミドを ＰＲＳ４３５と表示した。

Ｄ、　１１１１乳動物細胞の中のＡＯＡＨｃＤＮＡの発現プラスミドＺｅｍ２２ ９Ｒ−Ｃ／２６およびＺｅｍ２２９Ｒ−４−３３を、ＢＨＫ細胞（アメリカン・ タイプ・カルチャー・コレクションに受け入れ番号１０３１４で受託された）の 中に、Ｃｈｅｎら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６　：６３２：１９８６） に本質的に記載されている方法によりトランスフェクションした。トランスフェ クションした細胞を３日間増殖した後、１０ｍ１の培地を各トランスフェクシヨ ンのために陰性の対照から取り、そして４℃において貯蔵した。トランスフェク ション体および陰性の対照をトリプシン処理し、モして１０ａ＋１の培地の中に 再懸濁させ、そして計数した。細胞を遠心分離し、そして培地を廃棄した。細胞 の沈澱物を１ＸＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水、Ｓｉｇｏ＋ａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏ、、ミゾリー州セントルイス）＋０．１％のトリトンＸ−１００ ＋１０１ＭのＰｌｉｌＳＦの中に１×ｌＯ＠細胞／１００μｌの濃度に再懸濁し た。再懸濁した細胞を室温において１０分間溶解し、そしてリゼイトを１０．０ ００ｒｐｍでマイクロフーグで４°Ｃにおいて１０分間遠心分離した。上澄み液 を取り出し、そして氷上に配置した。

二重反復実験の使用済み培地の試料および二重反復実験のリゼイトの上澄み液を 、ＭｕｎｆｏｒｄおよびＨａｌｉ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２３４：２０３−２０ ５゜１９８６）に本質的に記載されている方法により、ＡＯＡＨ活性について測 定した。簡単に述べると、ｌＯＯμｌの培地またはリゼイトを、ｌμｌの”Ｃ／ 　”Ｈ−ＬＰＳ基質を含有する４００μｌの反応緩衝液、１）ｒｃ１９Ｈ４，６ （１，２５ｍｇ／ｍ１（７）ＢＳＡ　、０．６２５　％ｃ７）　トリトンＸ−１ ００、１８７，５ｍＭのＮａＣ１，６，２５−のＣａＣ１ｔ　・ＬＯ，２５ｍＭ のトリス−塩基、１２．５ｍＭのクエン酸）に添加した。反応混合物を３７°Ｃ においてほぼ１６時間インキュベーションした。インキュベーション後、１ｆｆ ｌＩの冷１００％エタノールを添加し、そしてこの混合物を渦形成し、そして氷 上で４５分間冷却した。試料を４℃において１０．　ｏｏｏｒｐｍで１０分間遠 心分離した。

各試料から１ｍｌの上澄み液を取り出し、そしてガラスのシンチレーションバイ アルの中で凍結乾燥した。５ｎ＋１のオプチフルアー（Ｏｐｔｉｆｌｕｏｒ）シ ンチレーション液体（Ｐａｃｋａｒｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ、　、イリ ノイ州ダウナーズグローブ）を添加し、そしてトリチウムチャンンネルで２分間 計数した。このアッセイの結果を表１０に示す。

表ＩＯ 陽性対照− 精製したＡＯＡＨのｌμｌのＩ：１００希釈物　２７９９陰性対照： 反応緩衝液　１８４ 陰性対照： ＢＨＫ５７０細胞の培地　２４１ 陰性対照： ＢＨＫ５７０細胞　１８４ Ｚｅｍ２２９Ｒ−Ｃ／２６の培地　１９３Ｚｅｍ２２９Ｒ−Ｃ／２６の細胞　４ ５０Ｚｅｍ２２９Ｒ−４−３３の培地　１９３Ｚｅｍ２２９Ｒ−４−３３の細胞 　２８６６表９に示すように、Ｚｅ＋ｕ２２９Ｒ−Ｃ／２６およびＺｅｍ２２９ Ｒ−４−３３のトランスフェクション体はＡＯＡＨ活性を含有し、Ｚｅｍ２２９ Ｒ−Ｃ／２６　トランスフェクション体はＺｅｍ２２９Ｒ−４−３３トランスフ ェクション体の活性のわずかの１８％のみを育した。

プラスミドＺｅｍ２２９Ｒ−４−３３およびｐＲｓ４３１の各々を、前述したよ うに、リン酸カルシウム沈澱によりＢＨＫ５７０細胞の中にトランスフェクショ ンした。トランスフェクション体を溶解し、そしてリゼイトを本質的に前述した ように活性について測定した。表１１に示すように、２ｅｍ２２９Ｒ−４−３３ およびｐＲｓ４３１のトランスフェクション体の両者はＡＯＡＨ活性を育し、ｐ Ｒｓ４３１１−ランスフエクション体は第４図のコンセンサスＡＯＡＨ配列を発 現し、２ｅｍ２２９Ｒ−４−３３トランスフェクション体の２倍より大きい活性 を育した。

解放されたＨ３−脂肪酸、 試料　ｄｐｍ／ｍｇ細胞タンパク質 Ｚｅｍ２２９Ｒ−４−３３細胞　２０３６ｐＲｓ４３１細胞　４９７３ Ｚｅｍ２２９Ｒ−４−３３トランスフェクション体から精製した組み換えＡＯＡ Ｈを使用するＬＰＳの脱アシル化を、ＡＯＡＨ処理されそして標識されたＬＰＳ から解放されたトリチウム化脂肪酸の最大％として、米国特許第４、９２９．６ ０４号（これをここに引用によって加える）に本質的に記載されているプロトコ ルにより測定した。

生合成的に標識したＬＰＳを、Ｚｅｍ２２９Ｒ−４−３３）ランスフェクション した細胞の抽出物の中に含有される酵素で脱アシル化した。トランスフェクショ ンされたＤＮＡを含有しない細胞の抽出物を、対照として同一の条件下にＬＰＳ とインキュベーションした。インキュベーション後、反応混合物をクロロホルム ／メタノールで抽出し、そしてクロロホルム抽出物（これは２Ｈ−脂肪酸を含有 した）を計数した。

Ｚｅｍ２２９Ｒ−４−３３でトランスフェクションした細胞の抽出物によりＬＰ Ｓから解放された３Ｈの放射能の百分率の計算は、脂肪酸のほぼ２７％が除去さ れたことを示した：トランスフエクションしない細胞の抽出物は２％より少なく 除去した。脱アシル化のこのレベルは、ＬＰＳの中の脂肪族アシル鎖のわずかに １／３がＡＯＡＨにより切断に対して感受性のあるという事実と一致する。さら に、同一実験において、大過剰の精製した好中球のＡＯＡＨはＬＰＳからトリチ ウム化脂肪酸の２７％を解放した。

プラスミドｐＲｓ４３１によりトランスフェクションした細胞を最初の１０μＭ のメトトレキセートおよび最後に２５μＭのメトトレキセートを含有する培地の 中で段階的に増幅した。ｐＲｓ４３１でトランスフェクションした哺乳動物細胞 から生産されたＡＯＡＨをトリプシンを使用してｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性化した。

血清不含培地（表１２）の中で５日間増殖させたｐＲ３４３１）ランスフエクシ ョンした細胞から生産されたＡＯＡＨを、ｌＯμＩの２０μｇ／ｍｌのトリプシ ン（Ｓｉｇｍａ、ミゾリー州セントルイス）および８０μｍの緩衝液（１ｘＰＢ Ｓ（Ｓｉｇｍａ　、ミゾリー州セントルイス）＋０．１％のトリトンＸ−１００ ）を使用済み血清不含培地の１０μｌの了りコートへ添加することによって、活 性化した。反応混合物３０°Ｃで２０分間インキュベーションした。インキュベ ーション後、４００μｍの活性アッセイ混合物（表１０）および２μｇの’　Ｈ −ＬＰＳを各試料に添加した。反応混合物を３７′Ｃにおいて１時間インキュベ ーションした。インキュベーション後、反応混合物１μｌの冷エタノールの添加 で沈澱させた。沈澱物を遠心により除去し、そして上澄み液を計数した。結果は 、トリプシン活性化したＡＯＡＨが未処理ＡＯＡＨより１０〜３０倍大きい活性 を有することを示した。

表１２ ５　ｍｌ　２９．３ｍｇ／　ｍｌのＬ−グルタミン５　ｍｌ　１００ｍＭのピル ビン酸ナトリウム１２．５ｍｌ　ＩＭのヘペス ５００　ｕ　１　１０ｍｇ／ｍｌのインスリン１ｍ１５ｍｇ／ｍｌのフェツイン ５０００μｍ　１０ｍｇ／ｌｌ１ｌのトランスフェリン３７５μｍ　４μｇ／ｌ のセレン ５ｍｌ　１００　ＸＰＳＮ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ　、マリイランド州ガイダーバ ーグ） ５００μｍ　１ａ＋Ｍのメトトレキセート成分を５００μｌのダルベツコの最小 イーグル培地に添加する。４°Ｃにおいて貯蔵する。

２００ｍＭのトリス−クエン酸塩緩衝液２、４２　ｇ　トリス塩基 ２．１ｇ　クエン酸塩 固体を蒸留水中に溶解し、そして最終体積を１００ｍにする。

活性アッセイ緩衝液 ５００ｍｇ　ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ　、ミゾリー州セントルイス）２、５ｍｌ　） リドンＸ−１００ ４，５ｇ　ＮａＣｌ ０．３６７　ｇ　ＣａＣ１ｇ　・２Ｈ＊０２００ｄのトリスクエン酸塩緩衝液中 に溶解し、そして最終体積を４００　ｍｌにする。

プラスミドｐＲＳ４３２．　ｐＲＳ４３３．　ｐＲＳ４３４およびｐＲＳ４３５ の各々を、前述したように、ＢＨＫ細胞の中にトランスフェクションした。選抜 したＩ・ランスフェクシ３ン体およびそれらの使用済み培地を、前述の方法を使 用して、ＡＯＡＨ活性について測定し、そして各トランスフェクション体は活性 なＡＯＡＨを生産することが示された。

以上から明らかなように、本発明の特定の態様を例示の目的でここにおいて記載 したが、本発明の本質および範囲を逸脱しないで種々の変更か可能である。した がって、本発明は添付する請求の範囲により以外限定されない。

ＦＩＧ、ＩＡ。

ＦＩ６．　２Ａ。

ＦＩ６．　２！３゜ ＦＩＧ、３Ｂ。

ＦＩＧ、３Ｃ ＦＩＧ、４１３゜ ＦＩＧ、４Ｃ。

矛 曹 （Ｅｃｏ　ＲＩ） ｃｏＲＩ ＦＩＧ　？ ＦＩＧ、８゜ ＦＩＧ、　９゜ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成５年３月１２日

Claims (57)

【特許請求の範囲】
1. １．アシルオキシアシルヒドロラーゼが小さいサブユニットおよび大きいサブユ ニットを含んでなる、前記アシルオキシアシルヒドロラーゼをコードする単離さ れたＤＮＡ配列。
2. ２．前記ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列である、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ 配列。
3. ３．前記ＤＮＡ配列が、ヌクレオチド３５４からヌクレオチド１９７６までの第 １図のＤＮＡ配列、ヌクレオチド３５４からヌクレオチド１９７６までの第２図 のＤＮＡ配列、ヌクレオチド３８９からヌクレオチド２０１１までの第３図のＤ ＮＡ配列、またはヌクレオチド１２０からヌクレオチド１７４２までの第４図の ＤＮＡ配列を含んでなる、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
4. ４．前記アシルオキシアシルヒドロラーゼが、番号３５のロイシンから番号５７ ５のヒスチジンまでの第１図のアミノ酸配列；番号３５のロイシンから番号５７ ５のヒスチジンまでの第２図のアミノ酸配列；番号３５のロイシンから番号５７ ５のヒスチジンまでの第３図のアミノ酸配列、または番号３５のロイシンから番 号５７５のヒスチジンまでの第４図のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記 載のＤＮＡ配列。
5. ５．前記ＤＮＡ配列がさらに小さいサブユニットと大きいサブユニットとの間に おいてアミノ酸配列（Ｒ１）ｎ−Ｒ２−Ｒ３（ここでＲ１，Ｒ２およびＲ３はＬ ｙｓまたはＡｒｇであり、そしてｎ＝０，１，２，３または４である）をコード する、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
6. ６．アシルオキシアシルヒドロラーゼの小さいサブユニットをコードする単離さ れたＤＮＡ配列。
7. ７．前記ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列である、請求項６に記載の単離されたＤＮＡ 配列。
8. ８．前記ＤＮＡ配列が、ヌクレオチド３５４からヌクレオチド７１３までの第１ 図のＤＮＡ配列、ヌクレオチド３５４からヌクレオチド７１３までの第２図のＤ ＮＡ配列、ヌクレオチド３８９からヌクレオチド７４８までの第３図のＤＮＡ配 列、またはヌクレオチド１２０からヌクレオチド４７９までの第４図のＤＮＡ配 列を含んでなる、請求項６に記載のＤＮＡ配列。
9. ９．前記アシルオキシアシルヒドロラーゼの小さいサブユニットが、番号３５の ロイシンから番号１５４のアルギニンまでの第１図のアミノ酸配列；番号３５の ロイシンから番号１５４のアルギニンまでの第２図のアミノ酸配列；番号３５の ロイシンから番号１５４のアルギニンまでの第３図のアミノ酸配列、または番号 ３５のロイシンから番号１５４のアルギニンまでの第４図のアミノ酸配列を含ん でなる、請求項６に記載のＤＮＡ配列。
10. １０．アシルオキシアシルヒドロラーゼの大きいサブユニットをコードする単離 されたＤＮＡ配列。
11. １１．前記ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列である、請求項１０に記載の単離されたＤ ＮＡ配列。
12. １２．前記ＤＮＡ配列が、ヌクレオチド７２０からヌクレオチド１９７６までの 第１図のＤＮＡ配列、ヌクレオチド７２０からヌクレオチド１９７６までの第２ 図のＤＮＡ配列、ヌクレオチド７５５からヌクレオチド２０１１までの第３図の ＤＮＡ配列、またはヌクレオチド４８６からヌクレオチド１７４２までの第４図 のＤＮＡ配列を含んでなる、請求項１０に記載のＤＮＡ配列。
13. １３．前記アシルオキシアシルヒドロラーゼが、番号１５７のセリンから番号５ ７５のヒスチジンまでの第１図のアミノ酸配列；番号１５７のセリンから番号５ ７５のヒスチジンまでの第２図のアミノ酸配列；番号１５７のセリンから番号５ ７５のヒスチジンまでの第３図のアミノ酸配列または番号１５７のセリンから番 号５７５のヒスチジンまでの第４図のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１０に 記載のＤＮＡ配列。
14. １４．次の作用可能に連鎖した要素： 転写プロモーター； アシルオキシアシルヒドロラーゼが小さいサブユニットおよび大きいサブユニッ トからなる、前記アシルオキシアシルヒドロラーゼをコードする単離されたＤＮ Ａ配列；および転写ターミネーター； を含んでなるＤＮＡ構成体。
15. １５．前記ＤＮＡ構成体が、さらに、前記アシルオキシアシルヒドロラーゼをコ ードするＤＮＡ配列に作用可能に連鎖した少なくとも１つの分泌シグナル配列を 含む、請求項１４に記載のＤＮＡ構成体。
16. １６．前記分泌シグナル配列が、アシルオキシアシルヒドロラーゼの分泌シグナ ル配列、組織プラスミノゲンアクチベーターの分泌シグナル配列、α−２プラス ミン阻害因子の分泌シグナル配列、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＡＲ１の分泌シグナル配列、また はサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ）ＭＦα１の分泌シグナル配列を含んでなる、請求項１５に記載のＤＮＡ 構成体。
17. １７．前記ＤＮＡ構成体が、さらに、前記ＤＮＡ配列に作用可能に連鎖したＢサ ッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅ）ＢＡＲ１遺伝子のＣ−末端のドメインをコードするＤＮＡ配列を含む、請 求項１６に記載のＤＮＡ構成体。
18. １８．前記分泌シグナル配列が、アミノ酸配列【配列があります】 をコードする、請求項１５に記載のＤＮＡ構成体。
19. １９．前記ＤＮＡ配列がさらに小さいサブユニットと大きいサブユニットとの間 においてアミノ酸配列（Ｒ１）ｎ−Ｒ２−Ｒ３（ここでＲ１，Ｒ２およびＲ３は ＬｙｓまたはＡｒｇであり、そしてｎ＝０，１，２，３または４である）をコー ドする、請求項１４に記載のＤＮＡ構成体。
20. ２０．前記ＤＮＡ配列が、ヌクレオチド３５４からヌクレオチド１９７６までの 第１図のＤＮＡ配列、ヌクレオチド３５４からヌクレオチド１９７６までの第２ 図のＤＮＡ配列、ヌクレオチド３８９からヌクレオチド２０１１までの第３図の ＤＮＡ配列、またはヌクレオチド１２０からヌクレオチド１７４２までの第４図 のＤＮＡ配列を含んでなる、請求項１４に記載のＤＮＡ配列。
21. ２１．前記アシルオキシアシルヒドロラーゼが、番号３５のロイシンから番号５ ７５のヒスチジンまでの第１図のアミノ酸配列；番号３５のロイシンから番号５ ７５のヒスチジンまでの第２図のアミノ酸配列；番号３５のロイシンから番号５ ７５のヒスチジンまでの第３図のアミノ酸配列、または番号３５のロイシンから 番号５７５のヒスチジンまでの第４図のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１４ に記載のＤＮＡ配列。
22. ２２．次の作用可能に連鎖した要素： 転写プロモーター； アシルオキシアシルヒドロラーゼが小さいサブユニットをコードする単離された ＤＭ配列；および 転写ターミネーター； を含んでなるＤＮＡ構成体。
23. ２３．前記ＤＮＡ構成体が、さらに、前記アシルオキシアシルヒドロラーゼをコ ードするＤＮＡ配列に作用可能に連鎖した少なくとも１つの分泌シグナル配列を 含む、請求項２２に記載のＤＮＡ構成体。
24. ２４．前記分泌シグナル配列が、アシルオキシアシルヒドロラーゼの分泌シグナ ル配列、組織プラスミノゲンアクチベーターの分泌シグナル配列、α−２プラス ミン阻害因子の分泌シグナル配列、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＡＲ１の分泌シグナル配列、また はサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ）ＭＦα１の分泌シグナル配列を含んでなる、請求項２３に記載のＤＮ Ａ構成体。
25. ２５．前記ＤＮＡ構成体は、さらに、前記ＤＮＡ配列に操作的に連鎖したＢサッ カロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ）ＢＡＲ１遺伝子のＣ−末端のドメインをエンコードするＤＮＡ配列を含む、 請求項２４に記載のＤＮＡ構成体。
26. ２６．前記分泌シグナル配列が、アミノ酸配列【配列があります】 をコードする、請求項１５に記載のＤＮＡ構成体。
27. ２７．前記ＤＮＡ配列が、ヌクレオチド３５４からヌクレオチド７１３までの第 １図のＤＮＡ配列、ヌクレオチド３５４からヌクレオチド７１３までの第２図の ＤＮＡ配列、ヌクレオチド３８９からヌクレオチド７４８までの第３図のＤＮＡ 配列、またはヌクレオチド１２０からヌクレオチド４７９までの第４図のＤＮＡ 配列を含んでなる、請求項２２に記載のＤＮＡ構成体。
28. ２８．前記アシルオキシアシルヒドロラーゼの小さいサブユニットが、番号３５ のロイシンから番号１５４のアルギニンまでの第１図のアミノ酸配列；番号３５ のロイシンから番号１５４のアルギニンまでの第２図のアミノ酸配列；番号３５ のロイシンから番号１５４のアルギニンまでの第３図のアミノ酸配列、または番 号３５のロイシンから番号１５４のアルギニンまでの第４図のアミノ酸配列から なる、請求項２２に記載のＤＮＡ構成体
29. ２９．次の作用可能に連鎖した要素： 転写プロモーター； アシルオキシアシルヒドロラーゼの大きいサブユニットをコードするＤＮＡ配列 ； 転写ターミネーター； を含んでなるＤＮＡ構成体。
30. ３０．前記ＤＮＡ構成体がさらに、前記アシルオキシアシルヒドロラーゼをコー ドするＤＮＡ配列に作用可能に連鎖した少なくとも１つの分泌シグナル配列を含 む、請求項２９に記載のＤＮＡ構成体。
31. ３１．前記分泌シグナル配列が、アシルオキシアシルヒドロラーゼの分泌シグナ ル配列、組織プラスミノゲンアクチベーターの分泌シグナル配列、α−２プラス ミン阻害因子の分泌シグナル配列、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＡＲ１の分泌シグナル配列、また はサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ）ＭＦα１の分泌シグナル配列を含んでなる、請求項３０に記載のＤＮ Ａ構成体。
32. ３２．前記ＤＮＡ構成体がさらに、前記ＤＮＡ配列に作用可能に連鎖したＢサッ カロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ）ＢＡＲ１遺伝子のＣ−末端のドメインをエンコードするＤＮＡ配列を含む、 請求項３１に記載のＤＮＡ構成体。
33. ３３．前記分泌シグナル配列が、アミノ酸配列【配列があります】 をコードする、請求項３０に記載のＤＮＡ構成体。
34. ３４．前記ＤＮＡ配列が、ヌクレオチド７２０からヌクレオチド１９７６までの 第１図のＤＮＡ配列、ヌクレオチド７２０からヌクレオチド１９７６までの第２ 図のＤＮＡ配列、ヌクレオチド７５５からヌクレオチド２０１１までの第３図の ＤＮＡ配列、またはヌクレオチド４８６からヌクレオチド１７４２までの第４図 のＤＮＡ配列を含んでなる、請求項２９に記載のＤＮＡ配列。
35. ３５．前記アシルオキシアシルヒドロラーゼが、番号１５７のセリンから番号５ ７５のヒスチジンまでの第１図のアミノ酸配列；番号１５７のセリンから番号５ ７５のヒスチジンまでの第２図のアミノ酸配列；番号１５７のセリンから番号５ ７５のヒスチジンまでの第３図のアミノ酸配列または番号１５７のセリンから番 号５７５のヒスチジンまでの第４図のアミノ酸配列を含んでなる、請求項２９に 記載のＤＮＡ配列。
36. ３６．次の作用可能に連鎖した要素： 転写プロモーター； アシルオキシアシルヒドロラーゼの小さいサブユニットをコードする単離された ＤＮＡ配列；および 転写ターミネーター； を含んでなるＤＮＡ構成体を含有する培養された真核性宿主細胞。
37. ３７．前記ＤＮＡ構成体がさらに、前記アシルオキシアシルヒドロラーゼをコー ドするＤＮＡ配列に作用可能に連鎖した少なくとも１つの分泌シグナル配列を含 む、請求項３６に記載の真核生物の細胞。
38. ３８．前記分泌シグナル配列が、アシルオキシアシルヒドロラーゼの分泌シグナ ル配列、組織プラスミノゲンアクチベーターの分泌シグナル配列、α−２プラス ミン阻害因子の分泌シグナル配列、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＡＲ１の分泌シグナル配列、また はサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ）ＭＦα１の分泌シグナル配列を含んでなる、請求項３７に記載の真核 生物の細胞。
39. ３９．前記ＤＮＡ構成体がさらに、前記ＤＮＡ配列に作用可能に連鎖したＢサッ カロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ）ＢＡＲ１遺伝子のＣ−末端のドメインをコードするＤＮＡ配列を含む、請求 項３８に記載の真核生物の細胞。
40. ４０．前記分泌シグナル配列が、アミノ酸配列【配列があります】 をコードする、請求項３６に記載の真核生物の細胞。
41. ４１．前記ＤＮＡ配列が、ヌクレオチド３５４からヌクレオチド１９７６までの 第１図のＤＮＡ配列、ヌクレオチド３５４からヌクレオチド１９７６までの第２ 図のＤＮＡ配列、ヌクレオチド３８９からヌクレオチド２０１１までの第３図の ＤＮＡ配列、またはヌクレオチド１２０からヌクレオチド１７４２までの第４図 のＤＮＡ配列を含んでなる、請求項３６に記載の真核生物の細胞。
42. ４２．前記アシルオキシアシルヒドロラーゼは、番号３５のロイシンから番号５ ７５のヒスチジンまでの第１図のアミノ酸配列；番号３５のロイシンから番号５ ７５のヒスチジンまでの第２図のアミノ酸配列；番号３５のロイシンから番号５ ７５のヒスチジンまでの第３図のアミノ酸配列または番号３５のロイシンから番 号５７５のヒスチジンまでの第４図のアミノ酸配列を含んでなる、請求項３６に 記載の真核生物の細胞。
43. ４３．前記細胞が培養した哺乳動物細胞または酵母菌細胞である、請求項３６に 記載の真核生物の細胞。
44. ４４．前記ＤＮＡ配列がさらに、小さいサブユニットと大きいサブユニットとの 間においてアミノ酸配列（Ｒ１）ｎ−Ｒ２−Ｒ３（ここでＲ１，Ｒ２およびＲ３ はＬｙｓまたはＡｒｇであり、そしてｎ＝０，１，２，３または４である）をコ ードする、請求項３６に記載の真核生物の細胞。
45. ４５．アシルオキシアシルヒドロラーゼの大きいサブユニットの発現を指令する ために必要な情報を含有する第１ＤＮＡ構成体およびアシルオキシアシルヒドロ ラーゼの小さいサブユニットの発現を指令するために必要な情報を含有する第２ ＤＮＡ構成体で形質転換またはトランスフェクションされた真核性宿主細胞。
46. ４６．前記細胞が培養した哺乳動物細胞または酵母菌細胞である、請求項４５に 記載の真核生物の細胞。
47. ４７．アシルオキシアシルヒドロラーゼの大きいサブユニットの発現を指令する ために必要な情報を含有する第１ＤＮＡ構成体およびアシルオキシアシルヒドロ ラーゼの小さいサブユニットの発現を指令するために必要な情報を含有する第２ ＤＮＡ構成体を含有する真核生物の宿主細胞。
48. ４８．前記細胞は培養した哺乳動物細胞または酵母菌細胞である、請求項４７に 記載の真核生物の細胞。
49. ４９．次の工程： （ａ）アシルオキシアシルヒドロラーゼの発現を指令するために必要な情報を含 有する第２ＤＮＡ構成体で形質転換またはトランスフェクションされた培養され た真核性宿主細胞を増殖させ；そして（ｂ）前記細胞からアシルオキシアシルヒ ドロラーゼを単離する、を含んでなる、アシルオキシアシルヒドロラーゼを生産 する方法。
50. ５０．前記真核性細胞が培養した哺乳動物細胞または酵母菌細胞である、請求項 ４９に記載の方法。
51. ５１．次の工程： （ａ）アシルオキシアシルヒドロラーゼの分泌を指令するために必要な情報を含 有する第２ＤＮＡ構成体で形質転換またはトランスフェクションされた真核性宿 主細胞を増殖させ；そして（ｂ）前記細胞からアシルオキシアシルヒドロラーゼ を単離する、を含んでなる、アシルオキシアシルヒドロラーゼを生産する方法。
52. ５２．前記真核性細胞が、培養した哺乳動物細胞または酵母菌細胞である、請求 項５１に記載の方法。
53. ５３．次の工程： （ａ）アシルオキシアシルヒドロラーゼの大きいサブユニットの発現を指令する ために必要な情報を含有する第１ＤＮＡ構成体およびアシルオキシアシルヒドロ ラーゼの小さいサブユニットの発現を指令するために必要な情報を含有する第２ ＤＮＡ構成体で形質転換またはトランスフェクションされた真核性宿主細胞を増 殖させ；そして（ｂ）前記細胞からアシルオキシアシルヒドロラーゼを単離する 、を含んでなる、アシルオキシアシルヒドロラーゼを生産する方法。
54. ５４．前記真核性細胞が、培養した哺乳動物細胞または酵母菌細胞である、請求 項５３に記載の方法。
55. ５５．次の工程： （ａ）アシルオキシアシルヒドロラーゼの大きいサブユニットの分泌を指令する ために必要な情報を含有する第１ＤＮＡ構成体およびアシルオキシアシルヒドロ ラーゼの小さいサブユニットの分泌を指令するために必要な情報を含有する第２ ＤＮＡ構成体で形質転換またはトランスフェクションされた真核生物の宿主細胞 を増殖させ；そして （ｂ）前記細胞からアシルオキシアシルヒドロラーゼを単離する、を含んでなる 、アシルオキシアシルヒドロラーゼを生産する方法。
56. ５６．前記真核性細胞が培養した哺乳動物細胞または酵母菌細胞である、請求項 ５５に記載の方法。
57. ５７．哺乳動物に治療的に有効量の組み換えアシルオキシアシルヒドロラーゼを 投与することからなる、グラム陰性バクテリアのセプシスをもつ哺乳動物を処置 する方法。