KR20010103560A - 리간드와 표적 바이오분자를 동정하기 위한 새로운 방법 - Google Patents

리간드와 표적 바이오분자를 동정하기 위한 새로운 방법 Download PDF

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토르벤 할키에르
레네 예스페르센
알란 옌센
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추후제출
엠 & 이 바이오테크 에이/에스
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Abstract

본 발명은 생물학적으로 활성적인 바이오분자의 동정방법을 제공한다. 한가지 측면에서, 효소 활성 모듈레이터로 구성된 스캐폴드에 랜덤한 뉴클레오타이드 서열을 인코포레이션시키고 이렇게 얻어진 구조물을 이용해서 실제로 동일한 숙주 세포를 형질전환시켜, 형질전환된 세포를 스크리닝함으로써, 미리 선별시킨 표현형 형질이 변경된 것들을 동정함으로써 RNA 또는 펩타이드와 같은 생물학적으로 활성적인 바이오분자를 동정한다. 이어서 랜덤화된 DNA를 표현형적으로 변경된 세포로부터 분리하고 랜덤 서열에 의해 코딩된 펩타이드 및/또는 RNA를 결정한다. 잠정적인 약물 표적인 상호작용 파트너를 동정해서 펩타이드 및/또는 RNA를 친화 시약으로서 사용하여 동정한다. 바람직한 스캐폴드가 프로테아제 억제제의 감자 억제제 I족으로부터 유도되며 예시된 것은 보리 키모트립신 억제제 2A (CA-2A)이다. 또다른 측면은 실질적으로 동일한 접근방식을 이용하나, 단 표적 효소 활성의 변화를 특이적으로 스크리닝함으로써 신규한 효소 억제제를 동정하는 것에 관한 것이다. 관련된 형질전환 및 발현 벡터의 제조방법과 약물 개발에 이용될 선두 화합물과 약물 표적의 동정법도 제공된다. 마지막으로, 본 발명의 범위에는 의약 제품의 제조방법도 포함된다.

Description

리간드와 표적 바이오분자를 동정하기 위한 새로운 방법{NOVEL METHODS FOR THE IDENTIFICATION OF LIGAND AND TARGET BIOMOLECULES}
CellScreemTM기술은 생체내에서 생물학적 활성을 갖는 펩타이드 서열을 동정하는 방법으로서 WO96/38553에 설명되어 있다. 요약하면, 하나의 세포가 단 하나의 또는 단지 몇개만의 이종적인 짧은 펩타이드들 발현시키도록, 랜덤 펩타이드들의 라이브러리를 진핵 세포 (예컨대 포유류) 내에서 세포내적 (intracellularly)으로 발현시키는 것이다. 특정 조건 하에서 미리 선별된 표현형을 변화시키는 세포들을 분리해서 이들이 발현시키는 펩타이드를 동정할 수 있는 것이다. 이 펩타이드와 상호반응하는 세포내 성분들 (표적 분자)은 예컨대 고정된 합성 펩타이드를 담지하는 친화 컬럼을 이용하여 얻을 수 있다.
비록 CellScreenTM기술이 새로운 약물 표적을 동정하는데 매우 유망한 것으로 나타나긴 했지만, 많은 이종적 발현산물에 대해 세포내 환경이 비교적 적대적이라는 근본적인 문제가 있다. 다시 말해서, 중요한 표적 분자와 잠재적으로 상호반응할 수 있는 흥미로운 펩타이드 또는 핵산 서열들이, 표현형에 대한 어떠한 효과가 검색되기도 전에 세포내에서 분해되거나 불활성화될 수 있다는 것이다.
발명의 목적
본 발명의 한가지 목적은 발현된 서열의 상기한 잠재적인 불안정성 문제를 극복함으로써 CellScreenTM기술을 개선시키는 것이다. 또한, 본 발명은 CellScreenTM기술을 원핵 세포에서의 스크리닝에도 적용될 수 있도록 확장시키는 것을 목적으로 한다.
발명의 요약
식물, 미생물 및 진핵 세포 기원의 상당이 많은 효소 활성 모듈레이터가 예컨대 하기한 바와 같이 설명되어 왔다.
세포 내부에서 자연발생적으로 진행되는 많은 프로세스는 효소에 의해 조절되므로, 본 발명자들은 본 발명에서, 활성 부위내로의 일련의 랜덤화된 아미노산 서열의 도입 또는 특정 부위에 랜덤 뉴클레오타이드의 도입에 의해 효소 활성 모듈레이터의 활성 부위가 변경된 그러한 효소 활성 모듈레이터의 대규모 세포내 라이브러리의 발현방법을 설명한다. 이로부터 세포 내부의 상이한 효소 어레이의 활성을 조절할 수 있는 추정적인 모듈레이터의 라이브러리가 만들어진다. CellScreenTM기술의 이와 같은 신규한 변형법에 따라 이들 모듈레이터들을 세포주 내에서 발현시킴으로써 상기 세포주 내의 개별적인 세포는 서로 다르게 영향을 받아 예컨대 저혈당증, 시토카인 사멸, 독성 화합물, 바이러스 감염등에 대한 내성등, 서로 다른 표현형 특성을 나타내게 될 것이다.
스캐폴드로서 효소 억제제와 같은 공지의 효소 활성 억제제를 사용할 때의 주요한 장점은 이들 중 많은 것들이 그의 본래 형태가 세포내 환경에서 안정적이라는 것이다. 랜덤 펩타이드를 세포내에서 발현시키기 위해 예컨대 항체 단편을 스캐폴드로서 사용할 경우의 문제점은 이러한 많은 항체 단편이 단백질분해 및 환원적인 세포내 환경에 민감함으로 해서 세포내 스캐폴드로서 부적절하다는 것이다. 반대로, 효소 활성 모듈레이터는 정교하게 만들기만 하면, 그의 세포내 안정성을 유지할 뿐만 아니라 생물학적 활성을 위해 스크리닝 되는 랜덤 서열들을 인코포레이션할 수도 있다. 더욱이, 생물학적 활성 물질에 대한 이러한 스크린의 효과는 불안정한 스캐폴드 (예컨대 코일화된 코일 구조)를 사용하거나 또는 스캐폴드를 전혀 사용하지 않은 경우에 비해 탁월할 것이다. 이는, 랜덤 서열들은 세포 내에서 그의 효과를 발휘하기 전에는 전혀 분해되지 않거나, 매우 제한된 수만 분해될 것이기 때문이다. 마지막으로, 이러한 효소 활성 모듈레이터의 대다수는 활성 부위를 갖는데, 이러한 활성 부위는 대개 주위 환경에 대해 안정한 배열로 제공되므로, 분자내 변형을 위해서는 완전한 위치라 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 한가지 측면은 표적 효소 활성의 생체내 활성적인 모듈레이터를 동정하는 방법에 관한 것으로 이 방법은 (a) 각각의 발현 벡터들이, 표적 효소 활성을 조절하는 모(parent) 펩타이드 또는 모 리보핵산을 코딩하는 모 뉴클레오타이드 서열로부터 유도된 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열의 라이브러리로부터의 적어도 한 구성원을 함유하는 것인, 발현 벡터들의 풀을 제조하고, (b) 실질적으로 동일한 세포들의 집단을 상기 풀의 상기 벡터들을 이용해서 형질전환시킴으로써 형질전환된 세포들을 얻고, 여기서 상기 실질적으로 동일한 세포들은 표적 세포를 포함하는 세포들이며, (c) 상기 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열의 발현을 용이하게 하는 조건 하에서 상기 형질전환된 세포들을 배양하고, (d) 상기 형질전환된 세포들을 검사해서 표적 효소의 활성이 조절된 형질전환 세포(들)을 분리해 낸 다음, (e) 상기 (d) 단계에서 분리된 세포(들) 중에 존재하는 상기 벡터의 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열을 결정함으로써/또는 상기 랜덤하게 변형된뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 발현 산물의 아미노산 서열 또는 리보핵산 서열을 결정함으로써 모듈레이터를 동정하는 단계로 이루어진다.
본 발명의 이 측면에서 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열은 1) 모 뉴클레오타이드 서열의 불변부, 및 2) 랜덤 뉴클레오타이드로 구성된다. 잉 ㅘ 관련해서, 모 뉴클레오타이드 서열의 불변부는 상기 폴리펩타이드 단편 또는 리보핵산 단편을 안정화시키는 역할을 하는 모 펩타이드 또는 모 리보핵산의 스캐폴드 부분을 코딩하는 것이 바람직하다.
상기한 바와 같이, 효소 모듈레이터 스캐폴드를 사용하면 효소가 아닌 다른 바이오분자와 상호반응하는 안정하고, 생물학적으로 활성적인 모듈레이터를 발현시킬 수 있다. 즉, 스캐폴드 구조 내로 랜덤 뉴클레오타이드가 삽입되면, 안정한 발현 산물이 결과될 것이며, 그의 활성은 효소 활성 변형과 반드시 관계가 있을 필요는 없다.
따라서, 본 발명의 또 다른 부분은 세포 중에서 생체내 표현형 형질을 검출가능하게 조절시킬 수 있는 생물학적 활성 폴리펩타이드 단편 또는 리보핵산 단편의 형태로 모듈레이터를 동정하는 방법으로서, 이 방법은 다음의 단계들, 즉,
(a) 각각의 발현 벡터들이, 공지된 효소의 활성을 생체내 조절하는 모(parent) 펩타이드 또는 모 리보핵산을 코딩하는 모 뉴클레오타이드 서열로부터 유도된 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열의 라이브러리로부터 적어도 하나를 함유하는 것인, 발현 벡터들의 풀을 제조하고, 여기서, 상기 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열은 다음을 포함하는 것이며,
- 모 펩타이드 또는 모 리보핵산의 스캐폴드 부분을 코딩하는 불변부, 상기 스캐폴드 부분은 상기 폴리펩타이드 단편 또는 리보핵산 단편을 안정화시키는 역할을 함; 및
- 랜덤 뉴클레오타이드
(b) 실질적으로 동일한 세포들을 상기 풀의 상기 벡터들을 이용해서 형질전환시킴으로써 형질전환된 세포들을 얻고,
(c) 상기 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열의 발현을 용이하게 하는 조건 하에서 상기 형질전환된 세포들을 배양하고,
(d) 상기 형질전환된 세포들을 검사해서 표적 효소의 활성이 조절된 형질전환 세포(들)을 분리해 낸 다음,
(e) 상기 (d) 단계에서 분리된 세포(들) 중에 존재하는 상기 벡터의 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열을 결정함으로써/또는 상기 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 발현 산물의 아미노산 서열 또는 리보핵산 서열을 결정함으로써 모듈레이터를 동정하는 단계들로 이루어진다.
마지막으로, 본 발명은 또한 CellScreenTM기술에 있어서 랜덤 서열 프레젠테이션에 있어서의 세포내에서 안정한 스캐폴드 단백질, 리보핵산, 또는 그의 단편의 일반적인 용도에도 관한 것이다. 상기한 바와 같이, 스캐폴드 분자를 이용한 개념이 종래기술에 논의된 바 있기는 하지만, 스캐폴드 시스템의 안정성에 대한 이슈는 문제된 바 없다.
추정적인 세포내 스캐폴드의 안정성과 유용성은 여러가지 인자에 의존한다. 첫번째로, 스캐폴드가 발현될 해당 세포가 스캐폴드 분자를 기능적 형태로 발현시킬 수 있어야만 한다; 즉, 원핵 시스템에서는 몇몇 진행 단백질은 정확하게 폴딩되지 못할 것이므로, 이러한 단백질을 이용하는 것은 그러한 유형의 세포에서 스캐폴드로서 적절치 못한 것이 된다. 둘째로, 스캐폴드는 온전한 세포 내부의 환원적 환경과 촉매적 환경에 비교적 내성이 있어야만 한다. 그러나, 스캐폴드 분자가 세포내 환경의 불활성화 경향에 비교적 민감하다 해도, 스캐폴드 분자의 생산속도가 충분히 높다면 이것은 극복될 수 있다.
정상 상태 (steady state)에서, 스캐폴드 분자의 세포내 농도는 다음 공식의 함수가 될 것이다:
식 중, Rp는 스캐폴드 분자의 생산속도 (moles·s-1)이고 Rd는 스캐폴드 분자의 불활성화 상수 (l·s-1)이며, 스캐폴드 분자의 불활성화 속도는
에 의해 결정된다 (이것은 정상상태에서, Rp와 물론 같다). 다시 말하면, 잠재적인 스캐폴드 분자의 적절성을 평가할 경우, 본 발명에 따르면 CellScreenTM테스트가 수행될 해당 세포 내에서 분자를 충분히 고농도로 유지하는 것이 가능한지를 테스트해야 한다.
따라서, 본 발명의 매우 넓은 측면은 세포의 어떤 표현형 특성 (phenotypic traid)을 생체내에서 검색적으로 조절할 수 있는, 생물학적으로 활성적인 폴리펩타이드 단편 또는 핵산 단편 형태의 모듈레이터를 동정하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 (a) 각각의 발현 벡터들이, 세포내에서 안정한 모(parent) 펩타이드 또는 모 리보핵산을 코딩하는 모 뉴클레오타이드 서열로부터 유도된 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열의 라이브러리로부터 적어도 하나를 함유하는 것인, 발현 벡터들의 풀을 제조하고, 여기서, 상기 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열은 다음을 포함하는 것이며,
- 모 펩타이드 또는 모 리보핵산의 스캐폴드 부분을 코딩하는 불변부, 상기 스캐폴드 부분은 상기 폴리펩타이드 단편 또는 리보핵산 단편을 안정화시키는 역할을 함; 및
- 랜덤 뉴클레오타이드
(b) 실질적으로 동일한 세포들을 상기 풀의 상기 벡터들을 이용해서 형질전환시킴으로써 형질전환된 세포들을 얻고,
(c) 상기 랜덤하게 조절된 뉴클레오타이드 서열의 발현을 용이하게 하는 조건 하에서 상기 형질전환된 세포들을 배양하고,
(d) 상기 형질전환된 세포들을 검사해서 표적 효소의 활성이 조절된 형질전환 세포(들)을 분리해 낸 다음,
(e) 상기 (d) 단계에서 분리된 세포(들) 중에 존재하는 상기 벡터의 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열을 결정함으로써/또는 상기 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 발현 산물의 아미노산 서열 또는 리보핵산 서열을 결정함으로써 모듈레이터를 동정하는 단계들로 이루어진다. 본 발명의 이 측면에서, 세포내에서 안정한 모 펩타이드 또는 모 리보핵산을 코딩하는 핵산 서열의 발현 산물은, 실질적으로 동일한 세포에 의해 생산될 경우, 유효한 농도로, 그리고 기능적 상태로 존재하는 것이다.
다른 말로 표현하면, 변형되지 않은 형태의 스캐폴드 분자가 발현되어 본 발명의 방법이 수행될 세포계 내에서 충분히 높은 농도/활성으로 유지될 수 있는지를 확인하기 위해서는 CellScreenTM기술 단계를 수행하기에 앞서 스캐폴드 분자의 적절성을 평가하는 것이 필수적이다.
WO96/38533에 따르면, 약물 표적 분자의 분리는 랜덤 펩타이드 서열이 랜덤 아미노산 서열의 디스플레이를 위한 스캐폴드로서 기능하는 보다 큰 폴리펩타이드 내로 삽입될 경우 보다 효과적으로 이루어질 수 있다. 이러한 스캐폴드는 아마도 표적 분자와의 보다 높은 친화 작용을 이끌 것이다.
그러나, 효소의 자연발생적인 단백질 억ㅈ제로부터 유도된 스캐폴드의 용도에 대한 언급은 없었다. 이러한 억제제에 의한 효소 활성 억제 - CellScreenTM기술에서 제안된 바와 같은 세포내 표적 단백질의 간단한 결합과 반대로 -는 세포내 생화학적 사건에 영향을 미치는 보다 효율적인 수단이다.
본 발명은 진핵 세포에서 표적 효소의 생체내 활성을 조절할 수 있는 펩타이드 또는 리보핵산의 새로운 동정/제조방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 진핵 세포에서 효소 활성의 생체내 억제제 뿐만 아니라, 이제까지 알려진 바 없던 인핸서의 동정/제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 알려지지 않은 상호작용의 동정방법에 관한 것이기도 하다 (즉 표적 및/또는 리간드의 동정뿐만 아니라 공지의 리간드와 공지의 표적 사이의 이제까지 알려지지 않았던 상호작용의 동정도). 이러한 새로운 방법은 잠재적으로 생물학적으로 활성적인 펩타이드 또는 리보핵산을 안정한 형태로 세포내에서 디스플레이시키기 위해 스캐폴드 (scaffolds)로서 효소 억제제 구조물을 이용한다. 본 발명은 또한 이제까지 알려진바 없었던 리간드와 표적들의 제조방법 뿐만 아니라 이들 리간드와 표적을 코딩하는 유전 정보를 갖고 있는 벡터와 형질전환된 세포들의 제조방법도 개시한다. 마지막으로, 본 발명은 본 발명에 따른 표적 또는 리간드의 초기 동정에 기초한 의약 제품의 제조방법에 관한 것이기도 하다.
도 1: 표시된 pCMVbipep에서 발견된 기능적인 시스-요소를 갖는 pCMVbipep/CI-2A를 도식적으로 표현한 것이다. 맨 위에 pCMVbipep이 도식적으로 그려져 있고, CI-2A cDNA 대역은 각각 pCMVbipepER/CI-2A, pCMVbipepNLS/CI-2A 및 pCMVbipepSL/CI-2A에서의 여러가지 시그날 펩타이드 (SEQ ID NOs: 35-37)의 위치와 함께 그 아래에 확대표시하였다. CI-2A에 부가된 그 외의 엑스트라 아미노산들은 밑줄친 기능에 필요한 필수 아미노산 서열을 1문자 코드로 나타내었다. 약어: 핵 국소화 시그날, NLS (nuclear localization signal); 소포체, ER (endoplasmic reticulum); 분비 리더, SL (secretoric leader); 정체 시그날, RS (retention signal).
도 2: CMVbipep/CI-2A 형질도입된 세포로부터의 총 추출물은 서브틸리신의 프로테아제 활성을 억제할 수 있다. CMVbipep/(NIH-3T3, U2OSmCAT 및 293mCAT) 또는 CMVbipep//CI-2A (NIH-3T3/CI-2A, U2OSmCat/CI-2A, 및 293mCat/IC-2A)로 형질도입된 표시된 세포주로부터의 추출물의 양을 증가시켜가면서 서브티리신과 함께 인큐베이션시킨 다음 잔여 단백질가수분해 활성에 대해 분석하였다. 주어진 추출물 농도에서의 각각의 반응현황을 세번씩 측정하였으며 표시된 속도는 평균값에 기초한 것이다.
도 3: CMVbipep/NLS/CI-2A로부터 유도된, 그러나 CMVbipep/CI-2A 형질도입된 NIH-3T3 세포로부터 유도되지 않은 핵 추출물은 CI-2A 활성을 나타낸다. A) CMVbipep/(-), CMVbipep/CI-2A (CI-2A), 또는 CMVbipepNLS/CI-2A (NLS/CI-2A)로 형질도입된 NIH-3T3 세포로부터의 핵 추출물 2μl 또는 10μl와 함께 서브틸리신을 인큐베이션시킨 다음 단백질 분해 활성에 대해 분석하였다. B) 총 세포 추출물의 양을 0.4 또는 2μl로 한 것을 제외하고 A에서와 동일하게 사용하였다. 주어진 추출물 농도에 있어서의 각각의 반응을 세번씩 측정하고 그의 평균치에 기초해서 속도를 나타내었다.
도 4: pFAB60 구조물을 도식적으로 나타낸 도면이다.
상부 판넬: pFAB60/CI-20은 프레임 내의 5' 말단에 pelB 리더 서열 및 3' 말단에 M13 파지 표면 단백질 III (ΔgIII)의 단편을 코딩하는 결실된 유전자가 삽입된 CI-2A의 절단형 버젼 (truncated version)을 포함한다. pelB 리터는 발현된 융합 단백질을 세균막에 지향시킴으로써 CI-2A/ΔpIII 융합 단백질의 파지 입자 내로의 통합을 용이하게 해준다.
중간 판넬: pFAB60/muCI-2A는MunII 및SalI 제한효소에 대한 인식 부위를 포함하는 CI-2A cDNA를 함유한다.
하부 판넬: pFAB60/muCI-2A_rc는 밑줄쳐진 19개의 무작위적으로 구성된 아미노산 (SEQ ID NO: 38, 잔기 2-20)을 대신해 치환된 아미노산 58-61을 갖는다. 아미노산들을 1문자 코드로 나타냈으며 숫자는 변형되지 않은 CI-2A 아미노산 서열을 가리킨다 (SEQ ID NO:2의 넘버링 참고).
도 5:CI-2A와 CI-2A_rc는 파지 입자의 표면상에 나타내질 수 있다.
항 CI-2A 항체들을 고정시키고 Johansen 등의 1995. Protein Eng. 10, pp. 1063-1067에 설명된 바와 같이 생산 및 정제된 0 또는 5 x 1011개의 파지 입자와 함께 인큐베이션시킨 다음 OD269 측정에 의해 정량하였다. 파지 입자를 지니는 CI-2A_rc 또는 CI-2A 음성 (-) CI-2A를 이용하였다. 유지된 파지 입자들을 고추냉이 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 항 파지 항체에 의해 최종적으로 검색하였다. 나타내어진 결과는 표시된 표준 편차를 갖는 4회의 독립적인 측정의 평균치이다.
도 6:MunII 및SalI 클로닝 부위를 이용한 CI-2A 제공된 라이브러리의 구축.
A)MunII 및SalI에 대한 인식 부위를 커버하는 퇴화된 올리고 (SEQ ID NO: 33, 잔기 21-46)을 단일 확장 반응에서 이중 가닥 형태로 변환시킨다.
B) CI-2A 펩타이드 라이브러리의 변형된 cDNA를 도식적으로 나타내었다.
C) 64 C-말단 아미노산의 3차원 구조. 치환된 아미노산은 흰색으로 표시되어 있고 그 위에 랜덤화 CI-2A 유전자 서열을 나타내었다.
도 7:BamHI 및SalI 클로닝 부위를 이용한 CI-2A 제공된 라이브러리의 구축.
A) 어닐링 후 DNA 폴리머라제를 사용함으로써 확장된 중복 올리고를 이용함으로써 CI-2A cDNA의 5' 부분을 만들 수 있다. 얻어진 단편을BamHI와SalI으로 절단한 다음 pCMVbipep/muCI-2A 내로 접합시켰다.
B) 또 다른 전략은 상류의 정방향 (forward) 프라이머와 함께 PCR에서 랜덤화 올리고를 이용하는 것이다. 여기서도BamHI/SalI 단편을 정제하여 pCMVbipep/muCI-2A내로 접합시킬 수 있다.
실시예 서론
다음에 활성 부위에서 랜덤하게 변형된 스캐폴드 단백질 억제제를 세포내 발현시키기 위해, 본 발명에 따라 적합화시킨 CellScreenTM기술에 있어서 출발점으로서 CI-2A를 이용하는 실시예를 설명하나 이는 단지 설명을 위해 예시된 것이다. 이 실시예는 CI-2A 대신 효소의 다른 적절한 단백질 억제제들도 사용가능하다는 점에서 비 제한적인 것이다. 당업자라면 출발점으로서 효소의 다른 단백질 억제제를 이용함으로써 아래에 예시된 원리를 적용하기 위해 필요한 치환이나 변형을 가할 수 있을 것이다.
정의
다음에 본 발명의 개시 목적을 위해 몇몇 용어들을 정의한다.
본 발명에서 "모듈레이터"라 함은 생체내에서 발현될 경우, 세포내의 다른 바이오분자의 활성에 영향을 미치는 바이오분자를 말한다. 따라서, 모듈레이터는 기본적으로 바이오분자의 활성을 억제 또는 향상시킬 수 있다. 또한, 모듈레이터는 바이오분자와 직접 상호작용할 수 있지만, 그 효과는 간접적일 수 있다. 즉, 바이오분자의 활성 변화는 세포의 생화학적 기구의 변화, 즉, 랜덤화된 핵산 서열의 발현 산물의 존재로 인한 궁극적 결과인 변화에 의한 것이다.
"랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열"은 몇몇 위치에서 뉴클레오타이드들의 삽입 또는 치환이 일어난 뉴클레오타이드 서열로서, 그 성격은 예측할 수 없는 것이다. 많은 경우에 있어서 랜덤 뉴클레오타이드 또는 삽입된 뉴클레오타이드 서열은 "완전히 랜덤 (completely random)"할 것이다 (예컨대 랜덤 합성 또는 PCR-매개 돌연변이 결과로서). 그러나, 다음의 설명으로부터 명료해지는 바와 같이, 랜덤 서열 역시 공통적인 기능특성 (예컨대 발현 산물의 리간드와의 반응성)을 갖는 서열을 포함할 수 있으며 또는 랜덤 서열은 궁극적인 발현 산물이 예컨대 심지어 상이한 아미노산 서열의 분포를 갖는 완전한 랜덤 서열이라는 의미에서 랜덤할 수 있다.
본 발명에서 "실제로 동일한 세포"라 함은 본 발명에 따른 랜덤 뉴클레오타이드 도입에 의해 야기된 상호반응으로 인해 하나의 세포 내에서 특정 표현형 특성의 발현에 있어서의 어떤 변화가, 동일한 벡터로 형질전환된 다른 실제로 동일한 세포들 중 어느 하나에 있어서도 일어나는 방식으로, 모든 세포가 상기 표현형 특성을 나타내는 세포들을 가리킨다. 달리 표현해서, 본 발명의 방법에서 실제로 동일한 세포들을 선택할 때 평가하는 중요한 변수는 어떤 한 세포의 표현형 특성의 발현에 있어서의 관찰된 변화가 그 집단의 다른 세포도 그러한 변화의 결과 동일한 방식으로 행동할 것인지의 여부이다. 그러므로, 실제로 동일한 세포는 예컨대 클론 세포 또는 세포계의 세포일 수 있으며 이들은 세포 배양체 또는 조직 배양체의 세포일 수 있다.
"표현형 특성 (phenotypic trait)"은 한 세포 (유전형) 중의 특정 유전자 조성의 관찰가능한 결과, 즉, 하나 또는 몇몇 유전자의 존재 여부 및 그의 발현률에 의존하는 세포의 특성 (화학적, 물리적, 면역학적 또는 기타 적합한 수단에 의해 검색되는)이다. 따라서, 표현형 특성은 몇가지 상이한 특성들: 효소의 활성, 리셉터와 리간드 사이의 상호반응 효과, 세포 생존률, 항원의 존재여부, 발현률 등 중 하나 일 수 있다.
본 발명에서 "펩타이드"는 2 내지 10 아미노산 잔기의 짧은 펩타이드, 11 내지 100 아미노산 잔기의 올리고펩타이드, 및 100개를 초과하는 아미노산 잔기의 폴리펩타이드를 모두 포함한다. 또한, 이 용어는 단백질, 즉, 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 기능적인 바이오분자도 포함하는 것으로 한다; 적어도 2개의 폴리펩타이드를 포함할 경우, 이들은 컴플렉스를 형성해서, 공유적으로 결합하거나, 또는 비공유적으로 결합할 것이다. 어떤 단백질 중의 폴리펩타이드(들)은 글리코실화되고/또는 지질화되고/또는 보철기 (prosthetic groups)를 가질 수 있다.
본 발명에서 어떤 분자를 가리킬 때 "생물학적으로 활성적"이라는 용어를 사용하는 것은 문제의 그 분자가 살아있는 세포 내에서 검색가능한 효과를 나타냄을 의미하는 것이다. 즉, 그 분자가 살아있는 세포와 생물학적으로 반응해서 그 세포의 표현형에 어떤 변화로서 인식될 수 있는 효과를 내는 것을 의미한다.
"생체내 (in vivo)"라 함은 살아있는 세포 (즉, 대사적으로 활동적이고 그들의 생명 기능을 유지할 수 있는 세포)내부의 환경 조건을 가리키는 것으로; 살아있는 세포들은 배양중에 유지될 수도 있고 또는 천연적인 장소에 존재할 수도 있다 (예컨대 보다 큰, 다세포 생명체의 일부로서 기능하는). 따라서, "생체내"라는 용어는 관찰되는 효과가 살아있는 세포 내에서 일어나는 한 세포의 생체외 배양도 가리키는 것이다.
"형질전환 (transformation)": 개개의 세포가 지니는 유전 물질이 그 게놈 내로의 외래 DNA의 인코포레이션에 의해 변경되는 프로세스.
"트랜스펙션 (transfection)": 세포에 의한 재조합 DNA의 업테이크, 인코포레이션 및 발현.
"형질도입 (transduction)": 한 세포에서 다른 세포로의 바이러스 벡터에 의한 유전 정보의 이동.
단백질, 펩타이드 또는 리보핵산과 관련해서 사용되는 "유효 부분 (effective part)"라는 용어는 그 단백질 또는 펩타이드가 유도된 천연 분자의 소망되는 기능을 유지하는 부분 (예컨대 서브서열, 또는 n량체 (n-meric) 단백질의 경우, n량 분자보다 작은 부분)을 의미하는 것이다. 예컨대, CI-2A의 경우 세포내적으로 활성 억제제를 발현시키고자 할 때 그 분자의 절단형 (truncated) 형태만이필요한 것으로 보이므로, 그 분자의 절단형 형태가 CI-2A의 유효 부분을 구성하는 것이다: 이에 대해서는 본문의 실시예도 참조.
달리 언급하지 않는 한, 본 명세서에서 뉴클레오타이드 서열은 5'→3' 방향으로 제시되며 아미노산 서열 역시 좌측을 N-말단으로 하여 제시한다.
본 발명 방법의 일반적인 특성
일반적으로 WO96/38533과 WO97/27212는
랜덤 서열의 제조, 랜덤 서열에 대한 융합 파트너의 선택 (스캐폴드의 선택을 제외함), 표적 서열의 선택 및 조성, 랜덤하게 변형될 핵산의 선택, 부작위 방법의 선택, 핵산의 대응 세포 유형으로의 도입 방법, (적용가능한 경우) (레트로바이러스) 벡터의 선택, 벡터의 제조법, 프로모터의 선택, (적용가능한 경우) 패키징 세포의 선택, 패키징 세포 (적용가능한 경우)로부터 감염성 바이러스의 농축법, 이 방법에 사용하기 위한 실제로 동일한 세포의 선택, 검색된 표현형 변화의 유형, 변화를 검색하는 방식, 표현형적으로 변화된 세포의 분리방법, 랜덤하게 변형된 서열들의 분리 및 서열 결정법, 랜덤화 생성물에 대한 표적의 분리 및 특성화, 스크리닝 방법, 적용 방법의 선택에 관계된 것으로 본 발명의 목적과도 연관이 있다.
따라서, 이들 두가지 특허출원의 기재는 본 발명에 모두 참고된다. 그러나, 이들 두 문헌 모두 고등 진핵 세포에 대해 유전원리를 이용하는 것에 촛점이 맞춰진 것이므로, 본 발명의 기재는 원핵 세포 시스템에 대한 구체예도 이하에 상세히 설명할 것이다. 그러나, 당업자들이 별 어려움 없이 원핵세포 시스템에 대해 응용할 수 있는 상기 두문헌의 기재중 보다 일반적인 부분들도 이들이 원핵 세포 시스템에서 이용가능한 방법에 관한 것인 한 본 발명의 타당하고도 중요한 구체예로 간주된다.
(d) 단계에서 오직 하나의 벡터 카피만을 지니는 (그리고 발현하는) 것으로 시험된 형질전환된 세포가 보통 바람직하다. 이에 의해, 세포의 표현형 변화 해석이 훨씬 쉬워지는 반면, 형질전환 벡터가 그 변화에 책임이 있는, 하나가 넘는 랜덤 서열을 발현하는 세포에 있어서의 표현형 변화의 해석은 불명료해지게 된다.
주로 하나의 벡터가 시험된 세포들 각각을 형질전환시켰는지를 확신하기 위해, 예컨대 형질전환된 세포들이 주로 또는 기껏해야 상기 풀로부터의 단일 벡터에 의해 형질전환되는 조건 하에서 단계 (b)를 수행하거나 (이것은 예컨대형질도입에 의해 형질전환이 이루어지는 본 발명의 구체예에서 감염성 바이러스의 농도를 조정함으로써 달성될 수 있다) 또는, 단계 (d)를 수행하기에 앞서, 상기 풀로부터의 두개 이상의 벡터로 형질전환된 세포들을 그 이후의 단계에서 실질적으로 배제시키는 것이 알맞을 것이다. 이 후자의 옵션은 형질전환 벡터의 수를 정량화하는 것이 가능할 것을 요구하며 이는 예컨대 형광 프로브와 같은 발현 산물에 있어서의 검색가능한 마커를 포함시킴으로써 달성할 수 있다. 또 다른 옵션은 표현형에 있어서의 변화를 나타내는 세포들을 재스크리닝함으로써 두개 이상의 벡터가 세포를 형질전환시켰음을 확인하는 것이다.
궁극적으로는 랜덤 서열이 도입될, 스캐폴드가 될 목적으로 선택된 분자들은 펩타이드 서열 또는 mRNA, tRNA 또는 리보자임을 간섭하는 (안티센스-방식으로) RNA 단편과 같은 핵산 서열일 수 있다. 다른 한편, 이러한 RNA 단편은 그 자체로리보자임 활성을 나타낼 수 있으므로 다른 효소의 발현률에 간접적인 영향을 미친다. 어떻든, 결과적인 산물, 즉, 랜덤화 발현 산물은 펩타이드 또는 리보자임과 같은 리보핵산일 수 있다.
상기한 바와 같이, 스캐폴드의 한가지 중요한 특성은 이것이 단백질 분해적인 공격에 대해 안정하고/또는 세포내부에서 발견되는 것과 같은 환원적 환경에 대해 둔감하다는 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서 랜덤 뉴클레오타이드를 모 펩타이드 또는 모 리보핵산의 활성부위(들)을 코딩하는 부분(들) 또는 활성부위(들)과 간섭되는 구조물(들)을 코딩하는 부분(들)에 도입시킨다. 상술한 바와 같이, 활성부위 (스캐폴드의 다른 노출 구조물들 뿐만 아니라)는 다른 바이오분자들과 상호작용할 수 있기 위해서 그 환경에 안정하게 제시될 필요가 있다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열의 불변부가 랜덤화 산물의 안정성을 유지하는데 충분한 모 펩타이드 또는 모 리보핵산의 절단 (truncate) 부분을 코딩하는 것이 바람직하다.
몇몇 구체예에서 모 뉴클레오타이드 서열의 불변부는 디설파이드 다리가 없는 펩타이드를 코딩하는 것이 바람직하다. 이것은 디설파이드 다리가 핵 또는 세포질에서 형성되지 않기 때문이다. 따라서, 스캐폴드가 핵 또는 세포질에 존재할 경우 스캐폴드가 기능적인 상태에 있어야만 하는 경우에는, 디설파이드 다리를 함유하지 않는 스캐폴드를 사용하거나 또는 안정성과 기능성을 유지하기 위해 이들에 의존하지 않는 스캐폴드를 사용하는 것이 일반적으로 바람직할 것이다. 반대로, 랜덤화 발현 산물이 ER이나 또는 안정한 디설파이드 다리의 존재를 허락하는 다른 컴파트먼트로 국한될 것이 소망되는 구체예에서는, 랜덤화 서열을 만족스런 방식으로 주변 환경에 제시하기에 앞서, 모 뉴클레오타이드 서열의 불변부가 디설파이드 다리를 갖는 펩타이드를 코딩하는 것이 물론 소망스러울 것인데, 이는, 그러한 컴파트먼트 위부에서 정확하게 폴딩된 기능적인 스캐폴드를 가질 수 있는 가능성이 상대적으로 작기 때문이다.
랜덤 뉴클레오타이드가 임의로 모 뉴클레오타이드 서열 중의 결실(들)과 조합적으로 모 뉴클레오타이드 서열 내로 삽입 또는 치환 형태로 도입되는 것이 바람직함을 이해할 수 있을 것이다. 모 폴리펩타이드 중의 결실된 서열들은, 변형되지 않은 상태로 존재할 경우 형질전환된 세포들에 있어서 독성적이거나 해가 되는, 예컨대 활성부위의 일부일 수 있다.
도입된 랜덤 뉴클레오타이드의 수는 크게 변할 수 있으나 일반적으로 그 수는 3 내지 약 100이다. 이 범위에서 적어도 5, 예컨대 적어도 7이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 적어도 9-12개의 랜덤 뉴클레오타이드가 도입되는 것이 좋다. 한편, 많아야 90개, 예컨대 많아야 70개 또는 80개의 랜덤 뉴클레오타이드가 도입되는 것이 바람직하다. 도입되는 랜덤화 뉴클레오타이드의 가장 바람직한 수는 15 내지 60개 사이, 바람직하게는 20-55, 또는 25-50개의 뉴클레오타이드이다. 특히 바람직한 랜덤 뉴클레오타이드의 수는 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 및 60개이다.
랜덤 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 서열 형태 및/또는 모 뉴클레오타이드 서열의 특정 부위에 도입된 단일한 랜덤 뉴클레오타이드 형태로 스캐폴드 내로 도입된다. 한가지 변형은 스캐폴드 서열의 일부를 스캐폴드 서열의 일부들을 유지하나 (예컨대 안정성/기능성에 필수적인 부분들) 다른 부분들은 랜덤화된 서열로 치환시키는 것이다.
랜덤 뉴클레오타이드는 다음의 그룹 중에서 선택되는 것이 바람직하다:
- 합성된 완전히 랜덤한 데옥시리보뉴클레오타이드;
- 이용가능한 서열의 수를 제한하고/또는 바람직하지 못한 종결 코돈을 회피하고/또는 발현된 펩타이드(들)의 후-번역적 변형의 도입을 용이하게 하기 위해 몇몇 뉴클레오타이드의 랜덤화가 제한되어 있는 합성된 랜덤 DNA 서열;
- 정제 택 (tag)을 코딩하는 서열에 커플링된 (1) 또는 (2)와 같은 합성된 랜덤 DNA 서열; 및
- 항원에 대한 면역 적격 (immune-competent) 세포의 라이브러리로부터 분리된 CDR 코딩 뉴클레오타이드 서열 (이 구체예에서는 CDR 코딩 뉴클레오타이드가 CDR-3 펩타이드 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것이 바람직하다).
후자 유형의 "랜덤화"는 도입된 서열들이 항원 인식 대역을 코딩하게 해 주는 랜덤성에 실질적인 제한을 가한다. 그러나, 항원에 대한 폴리클로날 면역응답이, 모두 동일한 항원 (또는 아마도 심지어는 동일한 에피토프와)과 반응하나 CDRs의 아미노산 서열과 그 에피토프(들)의 인식 사이의 상관관계를 추론하기는 실제로 불가능한, 많은수의 면역 적격 세포로 이루어져 있다는 것은 잘 알려진 사실이다.
실제로 동일한 세포들 중에서 궁극적으로 테스트되는 핵산 서열의 랜덤성에제한을 가하는 또 다른 방법은 다음과 같다: 벡터 제조시, 선택된 리간드를 함유하는 라이브러리에 대해 패닝된 벡터들에 의해 형질전환된 파지의 1 라운드 디스플레이에 이들을 이용하는 것이 그것이다. CDR 코딩 서열을 사용하는 기술에 있어서, 그 결과는 실제로 동일한 세포에서 궁극적으로 테스트되는 세포들이 "예측불능" (그로 인해 랜덤한)하나, 그럼에도 불구하고 기능적 특성을 기준으로 해서 선별된다는 것이다. 다시 말하면, 발현 산물과 선택된 리간드 사이의 3차원적 공간에서의 상호작용과 핵산 서열간의 공지된 상관관계가 결여됨으로 해서 서열들의 테스트된 서브그룹이 여전히 랜덤하다는 결론이 얻어진다.
본 발명의 방법과 파지 디스플레이가 결합된 상기 기술의 특별한 구체예에서, 두가지 모두의 테스트 시스템을 교대로 반복해서, 실제로 동일한 세포에서의 세포내 발현과 파지 라이브러리의 패닝을 뒤섞는 것이다.
랜덤화된 펩타이드 중에 아미노산을 조절적으로 분포시키기 위해서는, 모듈레이터가 펩타이드인 경우, 정의된 DNA 코돈을 랜덤한 순서로 합성하는 랜덤 코돈 합성에 의해 랜덤 뉴클레오타이드를 제조하는 것이 실제적일 수 있다; 이 원리의 상세한 설명은 WO96/38553에 개시되어 있으며, 예컨대 실시예 1을 참조하면 된다. 이 명세서에서 바람직한 구체예는 합성된 코돈의 상대량이, 코딩된 모든 아미노산이 코딩된 모든 폴리펩타이드 단편에서와 실제로 동일한 빈도로 존재하도록 할 수 있는 양인, 즉, 어떤 특정한 아미노산이 라이브러리 펩타이드 중에 있을 가능성이 그 외의 다른 코딩된 아미노산에 대한 것과 실제로 동일한 양인 경우이다.
랜듬화된 단편들을 벡터 내로 적절히 도입하려 할 경우, 본 발명에 따르면,랜덤 뉴클레오타이드들을 부위 지향된 PCR-매개 돌연변이의 원리에 의해 발현 벡터 내로 도입하는 것이 바람직하다. 그러나, 당업자에게는 다른 옵션들도 알려져 있으며, 예컨대, 벡터 내로 합성된 랜덤 서열 라이브러리를 삽입하는 것도 물론 가능하다.
본 발명에 따라 스캐폴드 내로 발현 산물의 랜덤화 단편들을 도입하는 것과 별도로, 랜덤화 뉴클레오타이드 서열을 적어도 하나의 융합 파트너를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 융합시킴으로써 융합 파트너와 랜덤 서열을 커플링시키는 것이 종종 필요하다. 이러한 융합 파트너는 예컨대 밝현 산물의 발현 및/또는 정제/분리 및/또는 추가적인 안정화를 용이하게 할 수 있다.
정제 목적을 위해, 융합 파트너는 BirA의 BSP 바이오티닐화 표적 서열,His6택, myc 택, flu 택, lacZ 및 GST와 같은 정제 택을 가질 수 있다. 또한, 융합 파트너는 분류(sorting) 시그날이나 표적화 서열을 포함할 수 있다. 이에 대해서는 이하의 설명을 참조하면 된다.
모듈레이터 자체가 효소 활성의 모듈레이터인 구체예에 있어서는, 해당 효소의 Km및/또는 Vmax두가지를 모두 발효시키는 것이 이론상 가능하다. 효소 최대 활성의 50%를 달성하는데 있어서 기질 농도 증가가 요구되는 한, Km의 감소는 해당 효소의 효능을 저하시키기 된다. Km의 증가는 반대 효과를 나타낸다. 물론, Vmax를 초래하는 효소의 간섭은 그 효소의 가능한 최대 활성률이 증가된다는 결과를 갖는다(Vmax가 증가할 경우). 어떻든, 효소 활성의 모듈레이터는 효소 활성이 억제되건 촉진되건, 효소 활성에 표현형적인 결과를 미칠 것이다. 이 구체예에서 모듈레이터는 억제제인 것이 바람직하다.
본 발명의 방법이 방법이 마지막으로 모듈레이터 또는 그의 표적의 동정으로 이어졌을 경우, 동정된 모듈레이터으 3차원 구조를 해명하는 것이 바람직한데, 이는 이러한 해명이 합리적인 약물 스크리닝 또는 컴퓨터 약물 모델링법의 수행을 가능하게 해 주기 때문이다.
본 발명의 방법의 원핵생물계에 있어서의 이용
WO96/38553호에 기재된 본래의 착상된 기술은 진핵생물 세포에 있어서의 상호작용을 스크리닝하는데 촛점이 맞추어져 있었다. 그러나, 이 기술은 원색생물계에도 응용가능하다.
예컨대, 본 발명은 새로운 항생제를 개발하는데 유용할, 병원성 세균에 있어서의 이제까지 알려지지 않았던 상호작용의 동정을 가능하게 해 줄 것으로 기대된다. 본 발명의 방법은 새로운 리간드 펩타이드와 리보핵산 두가지 모두의 동정 뿐만 아니라 이러한 리간드에 대한 표적 분자의 동정도 가능하게 해주기 때문에, 일단 이러한 리간드 및/또는 표적이 동정/분리되기만 하면 조사하는 사람들의 입장에서는 컴퓨터 약물 모델링의 개발 및 전통적인 약물 스크리닝에 필요한 도구가 제공되는 셈이다.
그러나, 항균효과 및 항균물질의 접근과 별도로, 본 발명의 방법은 또한 공업적인 발효 공정의 개선효과도 갖는다. 이러한 경우 예컨대 유산균에 있어서 생화학적 경로에 중요한 바이오분자를 동정하는 것이 가능하게 될 것이므로 치즈, 요구르트, 및 기타 유산균 발효제품과 같은 새로운 유제품의 제조를 위한 도구가 제공되는 것이다.
이러한 접근에 다소 관련있는 것은 정제 공정에 사용된 세균 배양에 대해 행해지는 스크리닝에 있어서 본 발명의 방법을 사용하는 것이다. 예컨대 폐수정제의 기술분야에서는 유기물을 분해하는 미생물의 배양 (활성화 슬러지)이 환경변화에 비교적 취약하기 때문에 이러한 시스템을 개선시키기 위한 한가지 방법이 보다 강건한 세균 균주를 제공하는 것임이 잘 알려져 있다. 한편, 본 발명의 방법은 상호작용시 예컨대 특정 유기 또는 무기 물질의 분해 효능이 증가될 수 있는 그러한 세균에 있어서 리간드와 표적의 분리/동정을 가능케 해 줄 것이다.
상기 설명으로부터 이해되는 바와 같이, 본 발명은 따라서 원핵세포 시스템에서 매우 유용하다.
본 발명의 방법을 원핵세포에서 이용할 목적인 경우, 원핵세포가Bacillus spp. (예컨대B. anthracis, B. subtilis 및 B. cereus), Clostridum spp.(예컨대C. botulinum, C. difficile, C. perfringens, 및 C. tetani), Corynebacterium spp. (예컨대C. diphtheriae, 및 C. pyogenes), Staphylococcus spp.(예컨대S. aureus 및 S. albicans), Streptococcus spp.(예컨대S. pneumoniae, S. pyogenes 및 S. agalactiae), Escherichia coli, Serratia marcescens, Klebsiella spp.(예컨대K. pneumoniae), Proteus spp.(예컨대P. mirabilis), Citrobacter spp.(예컨대Citrobacter freundii), Salmonella spp.(예컨대S. typhi, S. typhimurium, S. shottmulleri 및 S. paratyphi), Shigella spp.(예컨대S. dystenteriae, S. flexneri, S. boydii, 및 S. sonnei), Pseudomonas spp.(예컨대P. aeruginosa, P. pseudomallei, 및 P. mallei), Acinetobacter spp., Aeromonas spp., Plesiomonas spp., Yersinia spp.(예컨대Y. pestis, Y. enterocolitica, 및 Y. pseudotuberculosis), Francisella tularensis, Vibrio spp.(예컨대V. cholerae 및 V. parahaemolyticus), Campylobacter spp.(예컨대C. jejuni 및 C. coli), Helicobacter pyroli, Haemophilus spp.(예컨대H. influenzae, H. parainfluenzae, 및 H. aegyptius), Bordetella spp.(예컨대B. pertussis, B., parapertussis, 및 B. bronchiseptica), Brucella spp., Neisseria spp.(예컨대N. gonnorhoeae 및 N. meningitidis), Treponema pallidum, Leptospira interrogans; Borrelia spp.(예컨대B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii, 및 B. recurrentis), Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Mycobacterium spp.(예컨대 Mm. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, 및 M. leprae), Treponema pallidum, Chlamydia trachomatis, Actinomyces spp., Rickettsia spp., 및 Mycoplasma spp.(예컨대M.pneumoniae) 중에서 선택된 세균인 것이 바람직하다.
상기 세균 목록은 인간에게 많은 질병의 일으키는 병원성과 관련된 세균 집단 및 종들을 포괄한다. 이들 중, E. coli와 B. subtilis 역시 산업적인 발효에 이용된다: 이것은 유산균의 경우에도, 특히 Lactococcus spp.와 Lactobacillus spp.의 경우에 더욱 그러하며 따라서, 세균시스템에 본 발명이 이용될 경우 이러한 비병원성 세균에 대해 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법을 원핵세포계에 이용할 때, 본 발명에 따라 도입된 이종ㅇ적인 발현 산물의 존재로 인해 성장이 저해되거나 치명적인 손상을 입는 세포들을 동정하는 것이 종종 흥미로운 일이다. 그러나, 예컨대 세균의 사멸과 관련된 주요한 표현형 특성은 세균의 부재이므로, 이는 완전히 문제되지 않는 것은 아니다.
따라서 그렇지 않을 경우 다른 세포들에 비해 덜 우수한 생존자로 형질전환된 세포들을 동정할 수 있게 하는 실험적 셋업을 고안할 필요가 있다. 한가지 장점은 이종적인 유전 물질의 발현이 유도가능한 프로모터의 통제하에 있다는 것이다. 이러한 방식으로 발현될 경우 그 세포들에 대해 치사적이거나 또는 성장을 방해하는 유전 물질에 의해 형질전환된 세포들의 콜로니를 확장시키는 것이 가능하다. 그 후, 발현을 스위치 온 시켜서 확장된 콜로니를 주의깊에 시험하여 예컨대 형질전환되지 않은 대조군과 같은 동일 성장 패턴을 따르지 않는 클론들의 콜로니를 밝혀낼 수 있다.
이를 행하는 한가지 방법은 형질전환된 세포들을 성장 배지와 함께 플레이트에 도말하여 소정의 평균 크기까지 세포들을 생장시키는 것이다. 세포의 도말은 육안관찰가능한 콜로니 형성이 일반적으로 세포들의 단일 클론에 대해 이루어지는 방식으로 행한다. 콜로니가 소정의 크기에 도달하면, 담체 배지에 모든 플레이트들을 블로팅시켜 각각의 한천 플레이트의 "네가티브"를 제조한다. 그 후, 삽입된 랜덤 서열 발현을 유도시켜 콜로니를 다시 생장시킨다. 플레이트들을 계속해서 검사하거나 또는 적당한 간격으로 (예컨대 당업자에게 잘 알려진 디지탈 영상 프로세싱 시스템을 이용하는 등) 검사한다. 자동화 방식에서는 각각의 콜로니의 성장 패턴이 추구될 수 있으므로 나머지 콜로니 또는 대조군에 비해 성장이 둔화되거나 멈춘 콜로니들을 동정한다. 이 콜로니들을 동정하여 "네가티브" 블롯으로부터 분리한 후에는 형질전환 유전 물질을 추출하는 것과 그의 서열을 결정하는 것은 비교적 간단한 공정이다.
이와 관련해서 한가지 흥미로운 옵션은 항생제-내성 세균을 비-내성으로 만드는 것이다. 성장 배지는 문제의 항생제를 함유하거나 또는 배양시 그러한 항생제로 보강되며, 발현 유도시 대조군보다 약물에 대한 내성이 덜한 것으로 입증될 수 있는 콜로니들을 더욱 검사한다. 또한 순수한 살균/정균 효과도 시험할 수 있다. 이러한 구체예에서는, 세균을 예컨대 적절한 성장 배지상에서 배양한다. 발현 유도 후 성장이 감소되거나 멈춘 증거를 나타내는 콜로니들을 더욱 시험한다: 세균 세포들 중 몇몇은 항균제에 대해 신규한 (또는 공지의) 표적과 상호작용하는 발현 산물을 코딩하는 유전 물질을 지니는 것으로 입증 될 것이다.
또 다른 흥미로운 표현형 특성이 세포의 탁월한 생존성인 것은 물론이다. 이용가능한 세균을 다룰 때 세균의 생존률을 증가시켜 줄 표적을 동정하는 것이 흥미롭다. 예컨대 공업적인 발효공정에 이용되는 세균은 일반적으로 이종의 발현 산물의 그 자신의 조절되지 않은 생산으로 인해 치명적으로 손상을 입게 된다. 만일 이러한 세균의 생존에 긍정적인 효과를 미치는 유전자 또는 표적 분자가 동정될 수 있으면, 발효 공정을 보다 경제적으로 만들 수 있을 것이므로 (새로운 발효를 개시할 필요가 줄어들므로) 그 경제적인 잠재성은 엄청날 것이다. 마찬가지로, 예컨대 폐수 정제에 이용되는 세균들은 그 환경에서 독성 물질에 대해 내성이 더 많다.
본 명세서의 실험 셋업은 비교적 간단하다: 형질전환된 세균을 잠재적인 치사 조건 하에 놓이게 해서, 탁월한 생존능력을 나타낸 콜로니들만을 분리해서 시험하는 것이다 (그리고 이러한 콜로니들은 일반적으로 검색가능할 것이다). 따라서 세포 사멸을 동정하기 위한 상술한 바와 같은 셋업은 필요치 않다.
마지막으로, 시험될 표현형 특성의 큰 그룹은 예컨대 생화학적 또는 면역학적 수단에 의해 검색될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 적절히 조절될 경우, 세균에 있어서, 그 세균을 공업적 발효에 있어서 보다 효율적인 생산자로 만들 수 있는 시스템을 동정하는 것이 가능할 것으로 기대된다. 이러한 표현형 특성은 예컨대 효소 활성에 있어서의 변화, 수용체 밀도에 있어서의 변화, 발현률에 있어서의 변화등일 수 있다.
랜덤화 발현 산물이 발현 산물의 최종 위치를 결정하는 융합 파트너에 융합되는 경우 특별한 사항이 고려된다. 원핵생물 중의 시그날 서열은 기술분야에 잘 알려져 있지만, 막-앵커링 (anchoring) 시그날이 알려져 있음과, 발현 산물을 세균의 주변세포질 공간으로 내보내는 것도 가능함을 언급하고자 한다. 마지막으로, 분비 시그날을 포함시킴으로써 배양 상등액으로부터 발현 산물을 분리하는 것이 가능하다. 그러나, 많은 경우에 있어서는 원핵세포의 세포질 내부의 발현 산물을 유지하는 것이 가장 타당한 것은 물론이다.
본 발명의 방법의 진핵생물계에 있어서의 이용
활성 바이오분자를 스크리닝 하기 위해 실제로 동일한 세포로서 진핵생물 세포를 이용하는 것이 본 발명의 방법에서 특히 바람직하다. 따라서, 이러한 진핵 세포들은 진균 (곰팡이) 세포, 원생생물 세포, 동물 세포 및 식물세포일 수 있다.
세균의 경우에서와 마찬가지로 많은 진균이 포유류에 있어서 병원체이기 때문에 본 기술은 상술한 항균제에 대해 서술된 바와 마찬가지로 이 방법에서 실제로 동일한 세포로서 병원성 진균을 이용함으로써 항진균제를 동정하는데 유용할 것이다. 또한, 진균 (특히 효모 균주)은 세균과 마찬가지로 발효 공정에도 이용되고 (예컨대 와인 및 양조 산업), 따라서 이 방법은 이러한 비-병원성 진균을 벡터에 의해 형질전환된 실제로 동일한 세포로서 이용함으로써 이러한 균주의 개선이 달성될 수 있다.
본 발명의 방법에서 진핵생물 세포로서의 진균의 바람직한 예로는Epidermophyton spp., Trichophyton spp., Microsporum spp., Candida albicans, Philiphora spp., Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus spp., Saccharomyces cerevisiae, Klyveromyces lactis,및Piccia pastoris를 들 수 있다.
비록 몇몇 원생동물 세포는 생물학적 폐수 정화를 수행하는 바이오배양체의 일부를 형성하기도 하지만, 원생동물 세포는 진균 세포와 달리, 인간과 기타 포유류에 대해 온리 병원체 역할만 할 뿐이다. 본 발명의 방법은 따라서 항원생동물 제제를 위한 새로운 표적을 동정하는데 유용할 것으로 여겨진다. 본 명세서에서 본발명의 방법에서 실제로 동일한 세포로서 사용되는 바람직한 원생동물 세포는Giardia lamblia, Trichomonas vaginalis, Dientamoeba fragilis, Trypanosoma spp., Leishmania spp., Entamoeba histolytica, Naegleria fowleri, Acanthamoeba castellani, Harmanella spp., Iospora belli, Cryptosporidium spp., Sarcocystis spp., Toxoplasma gondii, Plasmodium spp.(예컨대P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. knowlesi, 및 P. ovale), Babesia spp.및Balantidium coli를 들 수 있다.
본 발명에 따라 식물 세포도 표적 진핵생물 세포로서 흥미롭다. 식물 세포로는 단일 세포 발현 및 성장을 가능케 하는 유전공학적 기술이 이용될 수 있는 식물 세포이면 어느 것이든 무방하다. 따라서,Nicotiana tabacum(담배 식물), Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Brassica juncea, Musa sp.(바나나 식물), 쌀, 및 옥수수 등은 본 발명에 유용한 식물 세포의 예이다. 식물 유전공학 분야의 당업자라면 그들의 라이프 사이클의 적절한 단계 중에 적절한 식물 세포, 적절한 벡터 시스템 및 적절한 형질전환법을 선택할 수 있을 것이다. 이를 다음에 요약하였다:
다른 생명체로서, 식물 세포를 외래 DNA로 형질전환시킬 수 있다. 식물의 형질전환의 한가지 전략은 식물 세포에 들어가서 식물 염색체 내로 자신의 게놈의 일부를 삽입할 수 있는 플라스미드 (Ti 플라스미드)를 함유하는 자연발생적인 식물 병원성 박테리아인Agrobacterium tumefaciens를 이용하는 것이다. Ti 플라스미드는E. coli와Agorobacterium내에서의 복제를 위한 서열, 삽입 외래 유전자에 대한 독특한 제한효소 부위, 및 선별가능한 마커를 포함시킴으로써 식물 형질전환을 위한 벡터가 되도록 조작되었다.
불행히도,Agrobacterium은 농업적으로 중요한 곡물을 모두 망라하는 단자엽식물을 형질전환시키는데 있어서는 그다지 효과적이지 않다. 또 다른 중요한 식량작물인 콩과 식물 역시 Agrobacterium을 이용해서 형질전환 및 재생시키는 것이 어렵다. 따라서, 식물의 형질전환을 위해, 유전자를 발현 벡터 내로 삽입해서 비드 상에 코팅시키는 Gene Gun을 이용하는 두번째 전략이 개발되기에 이르렀다. DNA-코팅된 비드들을 유전자 총을 이용해서 식물 세포 내로 도입하면, 여기서 작은 분획들이 테이크업 되어 DNA 내로 인코포레이션된다. 개개의 식물 세포, 유합조직, 새싹 및 배들이 모두 이 기술에서 적절한 표적이 된다.
세포들이 실제로 외래 DNA를 인코포레이션해서 트랜스제닉화되었는지 알아보기 위해, GUS 및 루시페라제 유전자와 같은 리포터 유전자를 이용한다. 이 모든 경우에 있어서 외래 유전자를 발현시키기 위해 식물 프로모터에 의해 외래 유전자를 플랭킹시켜야만 한다.
동물로부터 유래된 세포를 이용하는 것이 바람직하다. 이 세포들은 포유류 세포, 곤충 세포와 같은 절족동물 세포, 조류 세포 및 물고기 세포일 수 있다. 이러한 세포를 사용하는데는 몇가지 이유가 있는데, 이들 각각은 합리적인 형질전환 및 발현계, 성장조건 등을 요구하고, 모두 당업자가 쉽게 측정 및 선택할 수 있다. 예컨대 어떤 곤충이 인간 사회에 커다란 문제를 일으켜서 (곤충의 직접적인 상해 활동이나 또는 이들의 감염물질을 보유하는 벡터로서의 기능에 의해) 본 발명의 방법이 이러한 곤충을 통제하기 위한 시도에 도움이 된다는 것을 상기하면 충분하다. 포유류, 조류 및 어류의 많은 것들이 질병 방제가 중요시되는 농업 및 어업에 중요하다.
본 발명에 따라 인간 세포/세포 클론 또는 인간 세포주와 같은 포유류 세포가 가장 바람직하다. 이는 인간과 다른 포유류에 있어서 다수의 질병과 관련된 병인학이 살아있는 세포 내에서의 분자간 상호작용에 의존하기 때문이다. - 따라서 생체내에서 질병에 있어서 어떤 역할을 하는 바이오분자와 상호작용하는 약물이나 선도 화합물을 제공하는 것이 그토록 중요한 것이다. 바람직한 포유류 세포는 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포, VERO 세포, HeLa 세포, WI38 세포, BHK 세포, COS-7 293 세포, 및 MDCK 세포를 들 수 있으며 이들은 모두 기술분야에 잘 알려져 잇다.
표적 효소 활성의 모듈레이터를 스크리닝 하기 위해 벡터의 일부로서 로서 후보가 되는 핵산을 진핵세포 내로 도입시킨다. "도입시키다"라는 표현은 본 발명에서 핵산의 후속적 발현에 적합한 방식으로 핵산을 세포 내로 집어넣는다는 것을 의미하는 것이다. 도입 방법은 표적화된 세포 유형에 의해 크게 좌우된다. 이에 관해서는 다음 설명을 참조하면 된다. 예컨대, CaPO4침전, 리포좀 융합, lipofectin, 전기영동, 바이러스 감염 등의 방법이 있으며 이에 한정되지 않는다.
랜덤하게 변형된 핵산은 숙주 세포 게놈 내로 통합되거나 (예컨대 숙주 세포의 레트로바이러스 감염 수단에 의해) 또는 세포질 내에서 잠정적으로 또는 안정하게 존재하는 것이 바람직하다 (즉 표준 조절 서열, 선별 마커 등을 이용하는 전통적인 플라스미드의 이용을 통해서).
현재, 포유류 세포에 대해 가장 효과적인 유전자 전달방법은 레트로바이러스와 같은 조작된 바이러스의 능력을 십분 이용해서 천연 세포 장벽을 우회해서 외인성 핵산 업테이크를 수행하는 것이다.
벡터는 레트로바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 (AAV: adeno associated virus) 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 벡터, 알파 바이러스 벡터 및 셈리키 포레스트 바이러스 벡터를 사용하는 것이 바람직하다.
레트로바이러스 형질도입
약학적으로 중요한 많은 스크리닝이 인간 또는 모델 포유류 세포 표적을 필요로 하기 때문에 이러한 표적을 트랜스펙션시킬 수 있는 레트로바이러스 벡터가 바람직하다.
따라서, 후보가 되는 핵산은 세포를 감염시키는 레트로바이러스 비리온의 일부인 것이 바람직하다. 일반적으로, 세포의 감염은 감염-촉진 시약 폴리벤(polybene)의 사용에 대해 직접적으로 대응한다. 감염수준은 예컨대 바이러스 입자 대 세포 수의 비율을 이용해서 세포가 주로 하나의 구조물만을 발현하도록 최적화시킬 수 있다. 다른 한편, 예컨대 선별 마커만을 정량적으로 평가함으로써 두개 이상의 단일 비리온으로 감염된 세포들을 "스크린 아웃" 하는 것이 가능하다. 감염률은 중독 분포 (Poisson distribution)을 따른다는 것이 잘 알려져있다.
실제로 동일한 세포가 진핵세포이고 따라서 단계 (a)를 포함하는 본 발명의 바람직한 한 구체예는
1) 적절한 패키징 세포를, 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 패키징 세포에 의해 생산되는 비리온 중에서 통합가능한 벡터로 형질전환시키고,
2) 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 비리온의 패키징 세포에 의한 생산을 용이하게 하는 조건 하에서 배양 배지에서 상기 형질전환된 패키징 세포를 배양한 다음,
3) 상기 비리온을 회수하고 임의로 농축시켜서
4) 상기 실제로 동일한 세포들을 비리온으로 형질도입시킴으로써 수행된다.
따라서 레트로바이러스 벡터를 이용해서 실제로 동일한 세포 내로 후보가 되는 핵산을 도입하는 것이 바람직하다. 재조합 게놈의 패키징, 가공, 역전사 및 통합에 요구되는 필요한 모든 단백질 (gag, pol, 및 env)를 생산할 수 있는 헬퍼-결여 패키징 세포주의 용도는 기술분야에 잘 알려져 있다.cis형태로 Ψ 패키징 시그날을 갖는 RNA 분자들을 성숙해가는 비리온 내로 패키징시킨다. 진핵세포에서는 몇가지 이유로 레트로바이러스들이 바람직하다. 우선, 이들의 파생은 매우 쉽다. 둘째로 아데노바이러스-매개 유전자 전달과 달리, 레트로바이러스로부터의 발현은 장기간이다 (아데노바이러스는 통합하지 않는다). 아데노-관련 바이러스는 유전자와 조절 유닛을 위한 공간이 제한되어 있고 통합과 관련한 이들의 능력에 어떤 문제가 있다. 따라서 다른 어떠한 특성보다도 장기간의 발현, 게놈 유연성 및 안정함통합의 관점에서 현재 레트로바이러스가 가장 유망하다. 레트로바이러스의 주요한 장점은 이들의 숙주 게놈내로의 통합이 세포 분할을 통해 이들을 안정하게 전달시켜준다는 것이다. 이는 조혈세포 프로그레션과 같이 복수의 독립적인 성숙 단계를 수행하는 세포 유형에 있어서, 레트로바이러스 구조물이 계속 남아 있어서 지속적으로 발현할 수 있도록 해준다.
바람직한 레트로바이러스 벡터에는 조류의 백혈병-육종 바이러스 (Avian Leukosis-Sarcoma Virus :ALSV), 포유류 타잎 C, 포유류 타잎 B, 및 렌티바이러스 중에서 선택된 레트로바이러스로부터 유도된 벡터뿐만 아니라 MSCV (murine stem cell virus:쥐의 간세포 바이러스), 변형된 MFG 바이러스 및 pBABE로부터 유도된 벡터, 및 임의로 이종적인 시스-활성 요소에 의해 변형된 것들이 포함된다.
일반적으로, 레트로바이러스 벡터는 잠재적인 재조합을 최소화시키기 위해 가능한 한 적은 바이러스 서열을 함유해야 한다. 바이러스 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 서열과 함께 패키징, 역전사 및 통합에 필요한 서열들만이 유지되어야 한다.
레트로바이럿 DNA 구조물 골격에서 랜덤 뉴클레오타이드의 라이브러리를 만들 수 있는데, 이는 예컨대 WO97/27212에 설명된 바와 같다. 기술분야에 잘 알려진 기술 (Eckstein, Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, IRL Press At oxford University Press, 1991)을 이용한 표준 올리고뉴클레오타이드 합성은 후보 모듈레이터의 랜덤 부분을 만들어낸다; 올리고뉴클레오타이드 라이브러리는 상업적으로 구입할 수 있다. 109개 까지의 독특한 서열로 이루어진 라이브러리를 이러한 DNA qorqhsdptj tnlqrp aksemf tn dlTek. 움 라이브러리를 만든 후, 라이브러리를 첫번째 프라이머 내로 클로닝시킨다. 첫번째 프라이머는 레트로바이러스 구조물 내로 삽입되는 "카세트" 역할을 한다. 첫번째 프라이머는 일반적으로 예컨대 요구되는 조절 서열 (예컨대 번역, 전사, 프로모터 등), 융합 파트너 및 스캐폴드 분자(들), 제한 엔도뉴클레아제 (클로닝 및 서브클로닝) 부위, 종결 코돈 (바람직하게는 모든 세개의 리딩 프레임에 있어서), 두번째 스트랜드 프라이밍을 위한 상보성 대역 (바람직하게는 마이터 결실로서 종결 코돈 대역의 말기에 또는 랜덤 대역에서 삽입이 일어날 수 있다) 등을 비롯한 여러가지 요소들을 함유한다.
이어서 두번째 프라이머를 첨가하는데, 이 두번째 프라이머는 첫번째 프라이머를 프라이밍시키기 위한 일부 또는 전체의 상보적 대역과 서브클로닝을 위한 두번째 독특한 제한효소 부위를 위한 필요 서열을 임의로 포함한다. DNA 폴리머라제를 첨가하여 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드를 만든다. 후술되는 바와 같이 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드를 적절한 서브클로닝 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고 표적 레트로바이러스 벡터 내로 서브클로닝시킨다.
이러한 방식으로 프라이머는 각각 효소 모듈레이터를 코딩하는 유전 물질로부터 유도된 스캐폴드 서열 내에 서로 다른 랜덤 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 단편들의 라이브러리를 만든다. 이어서 본 발명에 참조된 Kitamura, PNAS U.S.A. 92:9146-50 (1995)에 개략된 바와 같이 접합 산물을 E. coli와 같은 세균 내로 형질전환시키고 얻어진 라이브러리로부터 DNA를 준비한다.
적절한 레트로바이러스 벡터는 어떠한 수로도 이용될 수 있다. 일반적으로 레트로바이러스 벡터는 다음을 포함할 수 있다: 바이시스트론 오페론을 허락함으로 해서 일정하게 높은 수준으로 펩타이드를 발현하는 세포의 선별을 매우 용이하게 해주는 내부 리보좀 엔트리 부위 (IRES: internal ribosome entry sites)의 통제 하에 선별가능한 마커 유전자; 및 5'-LTR (long terminal repeat)에 대해 센스 또는 안티-센스 방향으로 위치하는 두번째 유전자의 발현을 추진하는 프로모터. 적절한 선별 유전자는 녹색 형광 단백질과 같은 자기 형관 마커, lacZ과 같은 효소 마커, CD8과 같은 표면 단백질 뿐만 아니라, 네오마이신, 블라스토시딘, 블레오마이신, 퓨로마이신 및 하이그로마이신 내성 유전자를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
레트로바이러스는 유도가능하거나 또는 구성적인 프로모터를 포함할 수 있다. 예컨대, 선별 프로세스 중 특정 단계에서만 펩타이드 발현을 유도해야할 필요가 있는 상황이 있다. 예컨대, 어던 경우 전-감염성 (pro-inflammatory) 시토카인을 제공하기 위한 계획에 있어서는 그 펩타이드의 유도 발현이 포함되어야 한다. 이는, 과-발현된 전-감염성 약물이 장기간의 관점에서 세포 성장에 해를 미칠 수 있다는 예상때문이다. 다라서, 이러한 상황에서는 구성적인 발현이 바람직하지 못하며, 펩타이드는 표현형이 요구될 때 선별 과정의 단계 중에서만 턴온시킨 다음 펩타이드를, 프로듀서 세포의 장기간 생존을 확실히 하기 위해 또는 그런 효과를 위해 레트로바이러스 발현을 턴 오프시킴으로써 셧 다운시킨다. 유도가능하고 구성적이기도한 많은 수의 프로모터가 당업자에게 알려져 있다.
또한, 표적 세포내에서 단일 벡터의 통합 후 레트로바이러스 삽입물의 유도가능한 발현을 허여하기 위해 레트로바이러스 벡터를 배치하는 것이 가능하다; 중요한 것은 전체 시스템을 단일 레트로바이러스 내에 함유시키는 것이다. 3'LTR 인핸서/프로모터 레트로바이러스 결실 돌연변이의 자기-불활성화 (SIN: Self-Inactivating) 특성이 통합된 Tet-유도성 레트로바이러스가 고안된 바 있다 (Hoffmann 외, PNAS U.S.A. 93;5185 (1996)). 세포 중에서 이 벡터의 발현은 테트라사이클린 또는 기타 활성 동족체의 존재하에서는 실제로 검색불가능하다. 그러나, Tet의 부재하에서는, 인큐베이션 48시간 이내에 최대 수준으로 발현되어, 유도가능한 레트로바이러스를 내는 세포의 전체 집단의 발현이 균일하게 증가되는데, 이는, 감염된 세포 집단에서 발현이 균일하게 조절되고 있음을 가리키는 것이다. 이와 유사한 관련 시스템은, Tet 존재 하에서 이것이 DNA를 결합하여, Tet의 부재하에서는 제거되도록 변이된 Tet DNA-결합 대역을 이용한다. 이들 시스템은 모두 적합하다.
본 발명에 따라, 가장 바람직한 벡터 (실시예 1에 설명되어 있음)은 쥐의 Akv 레트로바이러스, 포유류 타잎 C 레트로바이러스 (NCBI taxonomy Id #11791)에 기초한 것이다. Akv 바이러스는 이 분야에서 널리 사용되는 Moloney 레트로바이러스와 상동성이 높다. 이들 바람직한 벡터들의 디자인을 간단히 설명하면 다음과 같다:
- 벡터들은 전사가 플라스미드로부터 추진된 경우 (트랜스펙션에서처럼) 강력한 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터로부터의 발현을 허락하는 키메릭 5' LTR을 함유한다.
- 패키징 시그날의 하류에 다재다능한 폴리링커가 존재한다. 이것은 스캐폴드 분자의 일부인 펩타이드 라이브러리를 이 위치에 삽입하는 것을 가능케 한다.
- 폴리링커의 바로 하류는 뇌막심근염 (EMC: encephalomyocarditis) 바이러스 또는 SV-40 바아ㅣ러스로부터 유래하는 내부 프로모터로부터 유도된 내부 리보좀 엔트리 부위 (IRES; internal robosomal entry site)이다. 이로 인해, CAP 독립적 (IRES) 또는 CAP 의존적 (soqn vmfhahxj) 방식으로 하류 발현 카세트로부터의 효과적인 번역이 가능해진다.
- 몇몇개의 상이한 마커 유전자들이 하류 발현 카세트내로 클로닝되어 왔다. 예컨대 Neo 및 Nygro, ㄸㅎ례 와 같은 형광 단백질 또는 ΔNGFR와 같은 표면 단백질과 같은 항생제 내성 유전자. 상이한 마커들을 함유하는 벡터의 이용가능성은 약물 처리, 플로우 시토메트리 또는 자기 비드 분리를 이용하여 형질도입된 세포들의 선별을 가능케한다.
- SV40 내부 프로모터를 함유하는 벡터 중에서 또는 바이시스트론 벡터 중에서 어떠한 스캐폴드 단백질 또는 마커도 결합될 수 있다.
상기 사실들을 고려할 때, 레트로바이러스 벡터는 랜덤 DNA 서열의 PCR-기초 생산을 용이하게 하도록, 동일한 않은 말단을 갖는 것이 바람직하다. 또한 이들 동일하지 않은 말단들은 동일하지 않은 프로모터들을 갖는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 레트로바이러스 벡터는 CMV 프로모터, RSV 프로모터, SV-40 프로모터, Tk프로모터, MT 프로모터와 같은 5'-LTR, 또는 Tet 또는 Ecdysone과 같은 유도가능한 시스템 중에서 바아ㅣ러스 프로모터를 대체하는 이종의 프로모터를 함유한다.
특히 적합화된 레트로바이러스 트랜스펙션 시스템 (패키징 세포)은 PE501 (US 4,861,719호), Bosc23 (WO94/19478), Ψ2 (R.Mulligan/D.Baltimore), GP+E86 (US 5,278,056), PhoenixEco (WO 97/27212), PA317 (US 4,861,719), GP+AM12 (US 5,278,056), DA(ampho), (WO 95/10601, WO92/05266), Bing (Wo94/19478), FLYA13 (Wo97/08330), ProPak (SyStemix로부터 구입가능), CRIP (R. Mulligan), ΨAM (R. Mulligan/D. Baltimore), Phoenix-Ampho (Wo 97/27212), PG13 (Targeted Genetics), H9 (293GPG) (D. Ory, M. Sadelain, R. Mulligan, J. Schaffer), 및 EcoPack (Clonetech)이다.
레트로바이러스 형질도입은 바이러스 엔벨롭 당단백질과 숙주 세포 표면 수용체 사이의 상호작용에 의존한다. 레트로바이러스 유전자 전달을 위해 이제까지 가장 널리 이용되어온 수용체들은 환경영양성 (ecotropic) 수용체 (쥐의 (murine) 및 쥐 (rat) 세포에 한정된)와 양영양성 (amphotropic) 수용체 (불멸화 세포주와 원시 포유류 세포주 두가지 모두에 널리 분포되어 있는)이다. 환경영양성 바이러스나 양영양성 바이러스 중 어느 하나를 생산하기 위한 패키징 세포들이 여러가지 존재한다. 또한, GALV (Gibbon Ape Laukemia Virus 당단백질) 또는 VSV G (Vesicular Stomatitis Virus G 당단백질) 중 어느 하나를 갖는 레트로바이러스 입자를 슈도타이핑하는 패키징 세포들 역시 최근 개발되었다.
이제까지 대부분의 패키징 세포주들은 Ψ2 및 GP+86 (환경영양성) 세포주와같은 NIH-3T3 세포와 PA317, GP+AM12 및 CRIP (양영양성 ) 세포주에 기초하였다. 이들은 널리 이용되어왔고 그 능력도 뛰어났으며, 특히 안정한 프로듀서 세포주들을 만들때 탁월하였다. 그러나, NIH-3T3에 기초한 패키징 세포주는 바이러스가 일과성 (transient) 트랜스펙션으로부터 제조될 경우에는 비교적 작은 역가를 나타내었다. 지난 수년간 매우 잘 트랜스펙션가능한 293 세포주 (인간의 배 신장 세포)에 기초한 몇몇 패키징 세포주들이 개발되었다. 여기에는 본 발명의 영역에서 수행능력이 우수한 것으로 입증된 환경영양성 세포주인 Bosc23 세포주 (Pear 외, 1993)과 Clontech 사의 EcoPack 세포주가 포함된다. 293 기초 세포주의 장점은 불과 48시간만에 일과성 트랜스펙션으로부터 매우 높은 역가 (177이하의 감염 유닛/ml, IU/ml)를 갖는 바이러스 상등액이 생산될 수 있다는 것이다. 라이브러리 상황에서는 일과성 트랜스펙션이 바람직한데, 이는 일과성 트랜스펙션이 상이한 통합 부위로부터의 발현에 의해 도입된 어떠한 편견 없이, 모든 라이브러리 구성원에게 동등하게 잘 발현될 기회를 주기 때문이다.
유전자 요법과 관련된 프로젝트에 있어서는 잘 특성화된 안정한 패키징 세포주를 갖는 것이 매우 중요하다. 그러나 본 발명의 목적에 있어서는, 라이브러리가 항상 일과성 트랜스펙션으로부터 제조되고 안정한 "프로듀서 세포주"가 수립되지 않나 또는 수립될 필요가 없으므로 그렇게 잘 정의된 세포주를 사용할 필요가 ㅇ벗다. 따라서 본 발명에 의해 조사된 비-쥐 (non-murine) 세포 내로의 유입으르 위한 또 다른 전략은 예컨대 Vesicular Stomatitis Virus (VSV G 단백질)로부터의 환경영양성 패키징 세포주에서 생산되는 바이러스들을 슈도타이핑하기 위한 이종적인 바이러스 엔벨롭 당단백질을 사용하는 것이다. 레트로바이러스의 VSV G 슈도타이핑은 두가지 주요한 이유에서 흥미롭다. 첫째로, VSV G에 대한 세포표면 수용체가 포스파티딜세린 및 강글리오사이드와 같은 도처에 존재하는 막 성분이라는 사실이다. 따라서 VSV G를 이용한 슈도타이핑은 비리온에게 광범위한 영양성을 부여해준다. 둘째로, VSV G 단백질이 일단 비리온 내로 통합되면 매우 안정하다는 것이다. 이것은 부피 단위 당 바이러스 역가를 10에서 100배로 증가시킬 수 있는 단계인 초-원심분리에 의한 바이러스 상등액의 농축을 가능케 하기 때문에 중요하다.
VSV G 단백질은 매우 퓨소제닉 (fusogenic)해서 그 결과 조직 배양에서 세포독성을 나타낸다. 따라서, VSV G를 구조적으로 발현하는 패키징 세포를 수립하는 것은 불가능했었다. 이 문제를 풀기 위해, 유도가능한 시스템이 개발되었다 (Ory외, 1996). 그러나, CellScreenTM레트로바이러스 라이브러리가 일과성 트랜스펙션으로부터 생산되므로, 매우 간단한 대안책은 라이브러리와 함께 일과적으로 VSV G를 BOSc23과 같은 환경영양성 패키징 세포주 내로 트랜스펙션하는 것이다. 이러한 접근방식은 배양체 중에 심각한 독성이 관찰되기 전에 광범위한 영양성과 높은 영가를 갖는 바이러스 상등액이 생산될 수 있도록 해준다. 이 방법을 사용해서, 비-쥐 표적 세포주의 패널을 형질도입가능성 (transducability)을 테스트하고, 본 발명자들은 107IU/ml 이하의 역가를 갖는 바이러스 상등액을 일상적으로 달성할 수 있었다.
VSV G의 슈도타이핑에 대한 최그 보고된 대안책은 Lymphocytic Chorimeningitis Virus (LCMV)의 엔벨롭 당단백질을 이용한 슈도타이핑이다 (Miletic외, 1999, J. Virol. 73; 6114-6116). 이 대한 역시 본 발명의 한가지 구체예로서 포함된다.
패키징 세포에서의 생산 후, 바이러스의 농축은 다음과 같이 수행할 수 있다: 일반적으로, NIH-3T3 세포와 같은 인디케이터 세포 상에 레트로바이러스-함유 상등액을 도포함으로써 레트로바이러스를 적정한 다음, 감염의 표현형 결과를 발현하는 세포의 백분률을 측정한다. 사용된 희석배수와 감염된 세포 백분률을 곱해서 바이러스의 농도를 구하고 이를 상대적인 적정가를 얻는데 이용가능한 수를 측정하는데 고려한다. 레트로바이러스가 lacZ와 같은 리포터 유전자를 함유하면, lacZ 발현에 대한 조직학적 염색 또는 플로우 시토메트리 (FACS)를 이용해서 재조합 바이러스의 감염, 통합 및 발현을 측정한다. 일반적으로, 가장 뛰어난 프로듀서 세포로부터 발생된 레트로바이러스 역가도 비교적 고가의 또는 특이한 기구를 사용해서 농축하지 않는 한, ml 당 177을 mf 넘지는 않는다. 그러나, 레트로바이러스만큼 큰 입자들은 액체 중에서 브라운 운동에 의해 그다지 멀리까지 이동하지 않을 것으로 믿어지며, 유체역학에 따른 예측은 많은 바이러스가 감염 개시를 위해 세포에 접촉하지 않을 것임을 보여준다. 그러나, 만일 세포가 다공성 필터 표면 상에서 생육하거나 그 위에 놓이게 되고 레트로바이러스가 점진적인 중력측정 흐름에 의해 세포를 통과하도록 허여되면, 고농도 바이러스를 세포 주변에서 항상 효과적으로 유지할 수 있다. 따라서, 다공성 멤브레인 상에서 감염세포에 의한 10배까지 높은 감염성과 레트로바이러스 상등액이 이들을 통과해서 흐르는 것이 관찰되었다. 이것은 농축 후 109의 역가를 가능케하는 것이다.
바이러스의 분리/농축 후, 기술 분야에 잘 알려진 방법에 의해 실제로 동일한 표적 세포들을 형질도입한다.
라이브러리 내에 온코진 잠재성을 갖는 이펙터 분자가 존재할 경우의 응용에 있어서는 인간에 대해 비-감염성인 레트로바이러스 상등액을 이용하는 것이 중요하다. 이러한 경우 환경영양성 수용체는 목적하는 표적 세포 내로 안정적으로 도입되리 수 있고 바이러스들은 환경영양성 시스템을 이용해서 생산될 수 있다. 환경영양성 수용체는 양이온계 아미노산 전달 단백질 (mCAT; cationic amino acid transporter protein)으로서, 환경영양성 바이러스 감염에 대해 민감성을 부여하는데 충분한 것으로 나타났다 (Albritton외, 1989). 임파구를 비롯한 여러가지 인간 세포에 있어서의 이 수용체의 발현이 많은 문헌을 통해 발표되어 왔다 (Hitoshi외, 1998). 본 발명자들은 안정한 트랜스펙션과 형질도입 (mCAT를 코딩하는 레트로바이러스 벡터를 이용해서)의 두가지 모두에 의한 mCAT의 도입이 Bosc23 생산 비리온에 의한 감염에 매우 민감함 표적 세포들을 생산해냄을 입증하였다.
따라서, 위에서 설명한 세포주들 및 레트로바이러스 생산을 위한 기타의 방법들은 일과성 트랜스펙션에 의한 바이러스 생산에 유용하다. 바이러스는 직접 사용할 수도 있고 또는 라이브러리를 확장시키기 위해 또 다른 레트로바이러스 프로듀서 세포를 감염시키는데 이용할 수도 있다.
융합 파트너
상기한 바와 같이, 발현 산물의 발현 및/또는 정제/분리 및/또는 추가의 안정화를 용이하게 해주는 적어도 하나의 융합 파트너와 발현 산물과의 융합이 종종 요망되고 있다.
진핵생물에 있어서, 융합 파트너는 종종 소팅(sorting) 시그날 또는 표적화 서열이다. 이러한 소팅 시그날은 시그날 패치 또는 시그날 펩타이드 형태가 될 것이다. 소팅 시그날의 잘 알려진 기능은 발현된 펩타이드를 소포체 내로, 골지체 내로, 라이소좀 내로, 분비낭 내로, 미토콘드리아 내로, 퍼옥시좀 내로, 또는 핵 내로 배출시키는 것이다. 물론, 막 또는 세포의 외부로의 배출도 가능하다. 바람직하게는 소팅 시그날 또는 표적화 서열을 다음 중에서 선택하는 것이 바람직하다:
- Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val (SV40 라지 T 항원 NLS), Ala-Arg-Arg-Arg-Arg-Pro (인간 레티노인산 수용체-β NLS), Glu-Glu-Val-Gln-Arg-Lys-Arg-Gln-Lys-Leu (NFkB p50), Glu-Glu-Lys-Arg-Lys-Arg-Thr-Tyr-Glu (NFkB p65), 및 Ala-Val-Lys-Arg-Pro-Ala-Ala-Thr-Lys-Lys-Ala-Gly-Gln-Ala-Lys-Lys-Lys-Lys-Leu-Asp (Xenopus 뉴클레오플라스민 NLS) 중에서 선택된 핵 국소화 시그날 (NLS: nuclear localization signal);
- CD8, ICAM-2, IL-8, CD4, 및 LFA-1로부터 유도될 것들과 같은 막 앵커링 서열, 및 미리스틸화 또는 팔미토일화 서열과 같은 지질화 서열;
- 라이소좀 분해 서열 및 라이소좀 막 서열과 같은 라이소좀 소팅 시그날;
- 미토콘드리아 매트릭스 서열, 미토콘드리아 내막 서열, 미토콘드리아 막간 공간 서열, 및 미토콘드리아 외막 서열과 같은 미토콘드리아 국소화 서열; 아데노바이러스 E3/19K 단백질 (LULSRRSFIDEKKMP)로부터의 서열 및 칼레티큘린 (KDEL)로부터의 서열과 같은 소포체 국소화 서열;
- 루시페라제로부터의 퍼옥시좀 매트릭스 서열과 같은 퍼옥시좀 서열;
- LNPPDESGPGCMSCKCVLS와 같은 파네실화 서열;
- LTEPTQPTRNQCCSN과 같은 제라닐제라닐화 서열;
- RTALGDIGN과 같은 파괴 서열; 및
- IL-2, 성장 호르몬, 프리프로인슐린, 및 인플루엔자 HA 단백질로부터의 분비 시그날과 같은 분비 시그날 서열.
본 발명에 유용한 효소 모듈레이터
효과적인 펩타이드 효소 활성 모듈레이터가 많이 존재한다는 것이 기술적으로 입증된 바 있다. 특히 효소 억제제는 잘 특성화되어 있다. 다음에 본 발명에 참조된 모든 실시예들을 들었으나 이에 한정되는 것은 아니다:
프로테아제 억제제의 BPTI/Kunitz족
Bos taurus로부터의 췌장 트립신 억제제 (BPTI);
Bos taurus로부터의 비장 트립신 억제제;
Bos taurus,Homo sapiens,Meriones unguiculatus,Mesocricetus auratus,Mus musculus,Sus scrofa,Pleuronectes platessa및Rattus norvegicus로부터의 인터-알파-트립신 억제제 라이트 체인 (bikunin);
Equus caballus,Ovis aries및Capra hircus로부터의 인터-알파-트립신 억제제;
Manduca sexta로부터의 헤모림프 트립신 억제제 A;
Manduca sexta로부터의 헤모림프 트립신 억제제 B;
Bos taurus로부터의 초유 트립신 억제제;
Rattus norvegicus로부터의 트립스타틴;
Tachypleus tridentatus로부터의 프로테나제 억제제;
Bos taurus로부터의 혈청 염기성 프로테아제 억제제;
Bombyx mori로부터의 키모트립신 억제제 SCI-III;
Drosophila funebris로부터의 남성 억세서리 글랜드 세린-프로테아제 억제제;
Anemonia sulcata로부터의 프로테아제 억제제 5 II;
Bombyx mori로부터의 키모트립신 억제제 SCI-I 및 SCI-II;
Stoichactis helianthus로부터의 프로테이나제 억제제 SHPI 및 SHPI-2;
Helix poratia로부터의 이소인히비터 K;
Radianthus macrodactylus로부터의 트립신 억제제 IV;
Bungarus fasciatus로부터의 독 염기성 프로테아제 억제제 IX 및 VIIIB;
Vipera ammodytes ammodytes로부터의 독 염기성 프로테아제 억제제 I 및 III;
Daboia russelli siamensis,Hemachatus haemachatus및Naja nivea로부터의독 염기성 프로테아제 억제제 II;
Dendroaspis polylepis polylepis로부터의 독 염기성 프로테아제 억제제 B;
Dendroaspis angusticeps로부터의 독 염기성 프로테아제 억제제 K;
Eristocophis macmahoni및Naja naja로부터의 독 트립신 억제제;
Sarcophaga bullata로부터의 프로테아제 억제제;
Homo sapiens,Oryctolagus cuniculus및Rattus norvegicus로부터의 조직 인자 경로 억제제;
Homo sapiens로부터의 조직 인자 경로 억제제 2;
Sus scrofa로부터의 자궁 플라스민/트립신 억제제;
Homo sapiens,Mus musculus,Rattus norvegicus,Macaca fascicularis및Macaca mulatta로부터의 프로테아제 넥신 II (알츠하이머씨 병 아밀로이드 A4 단백질의 단편);
Homo sapiens및Rattus norvegicus로부터의 아밀로이드 단백질 2; 및
Ornithodoros moubata로부터의 오르니토도린
및 상기 명시된 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
프로테아제 억제제의 세르핀족 (Serpin family)
Equus caballus,Mus musculus,Cavia porcellus,Oryctolagus cuniculus,Bos taurus,Chinchilla villidera,Dedelphis marsurpiales virginiana,Homo sapiens,Macropus eugenii,Mus caroli,Papio anubis,Sus scrofa,Rattus norvegicus, 및Ovis aries로부터의 알파-1-프로테이나제 억제제 (알파-1-안티트립신);
Homo sapiens로부터의 알파-1-안티키모트립신;
Homo sapiens,Bos taurus,Mus musculus,Ovis aries,Mesocricetus auratus, 및Gallus gallus로부터의 안티트롬빈 III;
Bos taurus,Homo sapiens, 및Mus musculus로부터의 알파-2-플라스민;
Homo sapiens로부터의 보마핀 (프로테아제 억제제 10);
Mus musculus및Cavia porcellus로부터의 콘트랍신;
Rattus norvegicus로부터의 콘트랍신-유사 프로테아제;
Bos taurus로부터의 팩터 XIIa 억제제;
Homo sapiens,Mus musculus및Rattus norvegicus로부터의 글리아 (Glia) 유도된 넥신 (프로테아제 넥신 I)
Homo sapiens,Mus musculus,Oryctolagus cuniculus및Rattus norvegicus로부터의 헤파린 코-팩터 II;
Mus musculus및Gallus gallus로부터의 47kDa 열 충격 단백질 (세린 프로테아제 억제제 J6);
Homo sapiens로부터의 C1-억제제;
Equus caballus,Homo sapiens및Sus scrofa로부터의 백혈구 엘라스타제 억제제;
Homomo sapiens로부터의 단백질 C 억제제;
Homomo sapiens로부터의 칼리스타틴;
Mus musculus및Rattus norvegicus로부터의 칼리크레인-결합 단백질;
Homo sapiens,Mus musculus및Rattus norvegicus로부터의 마스핀;
Bos taurus,Homo sapiens,Mus musculus,Mustela vison, 및Rattus norvegicus로부터의 플라스미노겐 활성화제 억제제-1;
Homo sapiens,Mus musculus및Rattus norvegicus로부터의 플라스미노겐 활성화제 억제제-2'
Homo sapiens,Mus musculus및Gallus gallus로부터의 뉴로세르핀;
Homo sapiens로부터의 세포질 안티프로테이나제 1, 2 및 3;
Bombyx mori로부터의 안티트립신;
Bombyx mori로부터의 안티키모트립신 I 및 II;
Manduca sexta로부터의 알라세르핀;
Rattus norvegicus로부터의 세린 프로테아제 억제제 2.1;
소의 천연두 바이러스, 토끼의 천연두 바이러스, 돼지의 천연두 바이러스, 백시니아 바이러스 및 발리올라 바이러스로부터의 세린 프로테이나제 억제제 1;
토끼의 천연두 바이러스, 백시니아 바이러스 및 바리올라 바이러스로부터의 세린 프로테이나제 억제제 2;
백시니아 바이러스 및 바리올라 바이러스로부터의 세린 프로테이나제 억제제 3;
믹소마 바이러스로부터의 세르핀 1;
Halocynthia roretzi로부터의 세린 프로테이나제 억제제;
소의 천연두 바이러스로부터의 아이스 (Ice) 억제제 (티올-프로테아제 억제제);
및 상기 명시된 것 이외의 다른 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
프로테아제 억제제의 카짤족 (Kazal family):
Bos taurus,Sus scrofa, 및Macaca fascicularis로부터의 아크로신 억제제;
Anemonia sulcata로부터의 엘라스타제 억제제;
Gallus gallus로부터의 오보억제제;
Rhodnius prolixus로부터의 로드니인;
Rattus norvegicus,Anguilla anguilla,Bos taurus,Canis familiaris,Homo sapiens,Sus scrofa및Ovis aries로부터의 췌장 분비 트립신 억제제;
Rattus norvegicus로부터의 췌장 분비 트립신 억제제 II;
Canis familiaris,Felis silvestris catus,Meles meles,Panthera leo, 및Vulpes vulpes로부터의 더블-헤디드 (double-headed) 프로테아제 억제제 (하악선);
Halocynthia roretzi로부터의 트립신 억제제;
Hirudo medicinalis로부터의 트립타제 억제제;
Mus musculus로부터의 전립선 분비 당단백질;
Aburria pipile,Aepypodius
Syrmaticus soemmerringii, Lagopus leucurus,및Vultur gryphus로부터의 오보뮤코이드 (세번째 대역),
및 상기 명시된 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
프로테아제 억제제의 대두 트립신 억제제 (Kunitz) 족:
Solanum tuberosum으로부터의 아스파르트산 프로테이나제 억제제;
Solanum tuberosum으로부터의 카뎁신 D 억제제;
Solanum tuberosum으로부터의 상처-유도된 아스파테이트 프로테이나제 억제제;
Psophocarpus tetragonolobus로부터의 키모트립신 억제제 3 전구체;
Adenanthera pavonina로부터의 트립신 억제제;
Prosopsis juliflora로부터의 트립신 억제제;
Erythrina caffra로부터의 트립신 억제제;
Erythrina latissima로부터의 트립신 억제제;
Erythrina fariegata로부터의 키모트립신 억제제;
Psophocarpus tetragonolobus로부터의 트립신 억제제 1A, 1B, 및 2;
Alocasia macrorhiza로부터의 트립신/키모트립신 억제제;
Albizzia julibrissin로부터의 트립신 억제제;
Acasia confusa로부터의 트립신 억제제;
Glycine max로부터의 트립신 억제제 A, B 및 C;
Glycine max로부터의 트립신 억제제 KTI1 및 KTI2;
Carica papaya로부터의 라텍스 세린 프로테이나제 억제제;
Solanum tuberosum으로부터의 시스테인 프로테이나제 억제제 PCPI 8.3;
Solanum tuberosum으로부터의 Kunitz-형 억제제 1 및 2 (PKI-1);
및 상기 명시된 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
감자 억제제 I족 (프로테아제 억제제);
Amaranthus caudatus로부터의 트립신/서브틸리신 억제제;
Momordica charantia로부터의 서브틸리신 억제제;
Lycopersicon esculentum, Lycopersicon peruvianu 및 Solanum tuberosum로부터의 상처-유도된 프로테이나제 억제제;
Phaseolus angularis로부터의 서브틸리신 억제제 I 및 II;
Solanum tuberosum로부터의 프로테이나제 억제제 I;
Hordeum vulgare로부터의 키모트립신 억제제 2A (CI-2A);
Hordeum vulgare로부터의 키모트립신 억제제 2B (CI-2B);
Hordeum vulgare로부터의 키모트립신 억제제 1A (CI-1A);
Hordeum vulgare로부터의 키모트립신 억제제 1B (CI-1B);
Hordeum vulgare로부터의 키모트립신 억제제 1C (CI-1C);
Solanum tuberosum로부터의 키모트립신 억제제 I, a, b 및 c;
Vicia faba로부터의 서브틸리신 억제제;
Lycopersicon esculentum으로부터의 에틸렌-응답 프로테이나제 억제제;
Nicotiana tabacum로부터의 프로테이나제 억제제 I-A 및 I-B;
Hirudo medicinalis로부터의 에글린 C;
Cucurbita maxima로부터의 Hageman 팩터 및 트립신 억제제;
Momordica charantia로부터의 트립신 억제제 MCI-3; 및
Nicotiana sylvestris로부터의 트립신 억제제 I;
및 상기 명시된 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
프로테아제 억제제의 보우만 버크족 (Bowman-Birk family):
Arachis hypogaea,
unguiculata로부터의 보우만-버크형 프로테아제 억제제; 및
상기 명시된 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
스쿼시 억제제 족:
Momordica charactia로부터의 엘라스타제 억제제;
Lagenaria leucantha로부터의 트립신 억제제 I, II 및 III;
Citrullus vulgaris로부터의 트립신 억제제 I;
Cucurbita maxima로부터의 트립신 억제제 I, III 및 IV;
Luffa cylindrica로부터의 트립신 억제제 I 및 II;
Momordica charantia로부터의 트립신 억제제 I 및 II;
Bryonia dioica로부터의 트립신 억제제 II;
Cucumis sativus로부터의 트립신 억제제 IIB 및 IV;
Ecballium elaterium으로부터의 트립신 억제제 II;
Cucumis melo var. Conomon으로부터의 트립신 억제제 I, II 및 III;
Cucurbita pepo로부터의 트립신 억제제 A;
및 상기 명시한 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
스트렙토마이세스 서브틸리신 억제제 (SSI)족:
Streptomyces albogriseolus로부터의 서브틸리신 억제제;
Streptomyces cacaoi로부터의 서브틸리신 억제제-유사 단백질-1;
Streptomyces longisporus로부터의 트립신 억제제 STI2;
Streptomyces rochei로부터의 서브틸리신 억제제-유사 단백질-2;
Streptomyces coeli-color로부터의 서브틸리신 억제제-유사 단백질-3;
Streptomyces lavendulae로부터의 서브틸리신 억제제-유사 단백질-4;
Streptomyces virginiae로부터의 서브틸리신 억제제-유사 단백질-8;
Streptoverticillium eurocidicus로부터의 프로테아제 억제제 SIL-V3;
Streptoverticillium flavopersicus로부터의 프로테아제 억제제 SIL-V1/SIL-V4;
Streptoverticillium luteoverticillatus로부터의 프로테아제 억제제 SIL-V5;
Streptoverticillium lorinoci로부터의 프로테아제 억제제 SIL-V2;
Streptomyces griseoincarnatus로부터의 알칼리성 프로테아제 억제제 2C';
Streptomyces lividans로부터의 프로테아제 억제제;
Streptomyces antifibrinolyticus로부터의 플라스미노스트렙틴;
및 상기 명시한 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
프로테아제 억제제의 Bombyx족 (Bombyx family)
Bombyx mori로부터의 진균 프로테아제 억제제 F (FPI-F), 및 Bombyx mori 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
Wap-형 '4-디설파이드 코어' 프로테이나제 억제제
Homo sapiens및Mus musculus로부터의 항류코프로테이나제 1;
Homo sapiens및Sus scrofa로부터의 엘라핀 (elafin);
홍해 거북으로부터의 첼로니아닌 (염기성 프로테아제 억제제) 및 상기 명시된 것 이외의 소스로부터 분리된 동족 억제제.
프로테아제 억제제의 히루딘족
Hirudo medicinalis및Hirudinaria manilluensis로부터의 히루딘, 및 상기명시된 것 이외의 소스로부터 분리된 동족 억제제.
팩터 Xa 억제제
Haementeria officinalis, Haementeria ghilianii, Hirudomedicinalis, Hirudo nipponia및hydra magnipapillata로부터의 항스타틴 밍 상기 명시된 것 이외의 소스로부터 분리된 동족 억제제.
아스카리스 트립신 억제제족
Ascaris suum으로부터의 키모트립신/엘라스타제 억제제 및Ascaris suum으로부터의 트립신 억제제 및Ascaris suum이외의 다른 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
프로테아제 억제제의 시스타틴족
Sus scrofa로부터의 백혈구 시스테인 프로테이나제 억제제;
Mus musculus로부터의 스테핀 (stefins) 1, 2 및 3;
Sus scrofa로부터의 시스타틴 (cystatins)A1, A5, A8 및 B;
Bos taurus로부터의 시스타틴 A 및 B;
Bos taurus로부터의 스테핀 C;
Ovis aries로부터의 시스타틴 B;
Homo sapiens로부터의 시스타틴 A, C, D, M, Sn, S 및 SA;
Mus musculus로부터의 시스타틴 B 및 C;
Rattus norvegicus로부터의 시스타틴 C 및 S;
Macaca mulatta 및 Saimiri sciureus로부터의 시스타틴 C;
Rattus norvegicus로부터의 시스타틴 알파 (상피 티올 프로테이나제 억제제);
Homo sapiens 및 Rattus norvegicus로부터의 시스타틴 B (간의 티올 프로테이나제 억제제);
Bos taurus로부터의 시스타틴 (초유의 티올 프로테이나제 억제제);
Gallus gallus 및 Coturnix coturnix japonica로부터의 시스타틴;
Cyprinus carpio로부터의 시스타틴;
Bitis arientas로부터의 시스타틴;
Zea mays로부터의 시스타틴 I;
Oryza sativa로부터의 오리자스타틴-I;
Oryza sativa로부터의 오리자스타틴-II;
Helianthus annuus로부터의 시스타틴 A;
Helianthus annuus로부터의 시스타틴 B;
Vigna unguicalata로부터의 시스타틴;
Onchocerca volvulus로부터의 온코시스타틴;
Solanum tuberosum로부터의 시스타틴 프로테이나제 억제제;
Wisteria floribunda로부터의 시스타틴 WCPI-3;
Glycine max로부터의 시스타틴;
Bos taurus, Homo sapiens 및 Rattus norvegicus로부터의 키니노겐스;
및 상기 명시한 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
시스테인 프로테아제 억제제의 칼파인족 (calpain family)
Bos taurus, Cercopithecus aethiops, Homo sapiens, Mus musculus, Sus scrofa, Oryctolagus cuniculus, Rattus norvegicus, 및 Ovis aries로부터의 칼파스타틴 (calpastatin) 및 상기 명시된 것 이외의 소스로부터 분리된 동족 억제제.
메탈로프로테이나제족의 조직 억제제
Bos taurus, Homo sapiens, Mus musculus, Papio cynocephalus, Sus scrofa, Oryctolagus cuniculus, Rattus norvegicus, 및 Ovis aries로부터의 메탈로프로테이나제 억제제 1;Bos taurus, Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus,및Gallus gallus로부터의 메탈로프로테이나제 억제제 2; 및
Bos taurus, Homo sapiens, Rattus norvegicus, 및 Gallus gallus로부터의 메탈로프로테이나제 억제제 3
및 상기 명시한 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
카르복시펩티다제 A 억제제
Ascaris suum으로부터의 카르복시펩티다제 A 억제제 및Ascaris suum이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
메탈로카르복시펩티다제 억제제
Lycopersicon esculentum및Solanum tuberosum으로부터의 메탈로카르복시펩티다제 억제제, 및 상기 명시한 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
안지오텐신-전환 효소 억제제
Thunnus albacares로부터의 안지오텐신-전환 효소 억제제;
Bothrops insularis로부터의 안지오텐신-전환 효소 억제제;
Bothrops jararaca로부터의 안지오텐신-전환 효소 억제제;
Agkistrodon halys blomhoffi로부터의 안지오텐신-전환 효소 억제제;
Agkistrodon halys pallas로부터의 안지오텐신-전환 효소 억제제;
Vipera aspis로부터의 안지오텐신-전환 효소 억제제;
및 상기 명시된 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
특정족에 속하지 않는 프로테아제 억제제
Escherichia coli로부터의 에코틴(ecotin);
Streptomyces nigrescens로부터의 메탈로프로테이나제 억제제;
Erwinia chrysanthemi로부터의 프로테이나제 억제제;
Pseudomonas aeruginosa로부터의 프로테이나제 억제제;
Saccharomyces cerevisiae로부터의 프로테아제 A 억제제 3;
Saccharomyces cerevisiae로부터의 프로테아제 B 억제제 1 및 2;
Ascaris suum로부터의 메이저 펩신 억제제 PI-3;
Bacillus subtilis로부터의 세포내 프로테이나제 억제제;
Solanum tuberosum로부터의 프로테이나제 억제제 PTI;
Solanum tuberosum로부터의 프로테이나제 억제제 PCI-I;
Solanum tuberosum로부터의 프로테이나제 억제제 IIA;
Solanum tuberosum로부터의 프로테이나제 억제제 IIB;
Sagittaria sagittifolia로부터의 프로테이나제 억제제 A 및 B;
Solanum melongena로부터의 프로테이나제 억제제;
Brassica napus로부터의 트립신 억제제;
Sinapis alba로부터의 트립신 억제제 2;
Zea mays로부터의 트립신 억제제;
Sinapis arvensis로부터의 트립신 억제제;
Trichosanthes kirilowii로부터의 트립신 억제제;
Lycoperison esculentum로부터의 상처-유도 프로테이나제 억제제 II;
Locusta migratoria로부터의 프로테아제 억제제 LCMI I 및 PMP-D2;
Bacillus brevis로부터의 프로테아제 억제제;
Alteromonas sp.로부터의 마리노스타틴스 C-1, C-2 및 D; 및
박테리오파지 T4로부터의 숙주 프로테아제 억제제;
및 상기 명시한 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
곡류의 알파-아밀라제/트립신 억제제족
Triticum aestivum로부터의 알파 아밀라제/트립신 억제제 CM1;
Triticum aestivum로부터의 알파 아밀라제/트립신 억제제 CM2;
Triticum aestivum로부터의 알파 아밀라제/트립신 억제제 CM3;
Triticum aestivum로부터의 알파 아밀라제/트립신 억제제 CM16;
Triticum aestivum로부터의 알파 아밀라제/트립신 억제제 CM17;
Triticum aestivum로부터의 알파 아밀라제 억제제 0.19;
Triticum aestivum로부터의 알파 아밀라제 억제제 0.28;
Triticum aestivum로부터의 알파 아밀라제 억제제 0.53;
Triticum aestivum로부터의 알파 아밀라제 억제제 WDAI-3;
Hordeum vulgare로부터의 알파 아밀라제/트립신 억제제 CMA;
Hordeum vulgare로부터의 알파 아밀라제/트립신 억제제 CMB;
Hordeum vulgare로부터의 알파 아밀라제/트립신 억제제 CMC;
Hordeum vulgare로부터의 알파 아밀라제/트립신 억제제 CMD;
Hordeum vulgare로부터의 알파 아밀라제 억제제 CME;
Hordeum vulgare로부터의 알파 아밀라제 억제제 BMAI-1;
Hordeum vulgare로부터의 알파 아밀라제 억제제 BADI-1;
Eleusine coracana로부터의 알파 아밀라제/트립신 억제제; 및
Zea mays로부터의 트립신/팩터 XIIa 억제제;
및 상기 명시한 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제
타우마틴 (thaumatin)에 동족적인 알파-아밀라제/트립신 억제제
Zea mays로부터의 알파-아밀라제/트립신 억제제 및Zea mays이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
알파-아밀라제/서브틸리신 억제제족
Hordeum vulgare로부터의 알파 아밀라제/서브틸리신 억제제;
Triticum aestivum로부터의 알파 아밀라제/서브틸리신 억제제; 및
Oryzae sative로부터의 알파 아밀라제/서브틸리신 억제제;
및 상기 명시한 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제
곤충의 알파-아밀라제의 억제제
Sorghum bicolor milo로부터의 곤충의 알파-아밀라제 1, 2 및 3의 소형 단백질 억제제, 및Sorghum bicolor milo이외의 다른 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
Streptomyces종으로부터 유도된 포유류의 알파-아밀라제의 억제제
Streptomyces griseosporeus로부터의 알파-아밀라제 억제제 HAIM I;
Streptomyces olivaceoviridis로부터의 알파-아밀라제 억제제 PAIM I;
Streptomyces griseosporeus로부터의 알파-아밀라제 억제제 HAIM II;
Streptomyces olivaceoviridis로부터의 알파-아밀라제 억제제 PAIM II;
Streptomyces aureofaciens로부터의 알파-아밀라제 억제제 AI-3688;
Streptomyces rochei로부터의 알파-아밀라제 억제제 Z-2685; 및
Streptomyces tendae로부터의 알파-아밀라제 억제제 HOE-467A;
및 상기 명시한 것 이외의 다른 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
트레할로스 억제제
Periplaneta americana로부터의 트레할로스 억제제 및 다른 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
폴리갈락투로나제 억제제
Phaseolus vulgaris 및 Pyrus communis로부터의 폴리갈락투로나제 억제제 및 상기 명시된 것 이외의 다른 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
푸코실트랜스퍼라제 억제제
Rattus norvegicus로부터의 푹티닌(fuctinins) 및 다른 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
단백질 키나제 C 억제제
Bos taurus, Ovis aries, Homo sapiens, 및 Rattus norvegicus로부터의 14-3-3- 단백질 베타/알파;
Mus musculus Ovis aries, Homo sapiens, 및 Rattus norvegicus로부터의 14-3-3- 단백질 엡실론;
Bos taurus, Mus musculus 및 Rattus norvegicus로부터의 14-3-3- 단백질 에타;
Bos taurus, Ovis aries, 및 Rattus norvegicus로부터의 14-3-3- 단백질 감마;
Bos taurus, Mus musculus, Ovis aries, Homo sapiens, 및 Rattus norvegicus로부터의 14-3-3- 단백질 제타/델타;
Bos taurus, Rattus norvegicus, Homo sapiens, Mus musculus 및 Oryctolagus cuniculus로부터의 힌트 단백질; 및
Brasicca juncea 및 Zea mays로부터의 14kDa 아연-결합 단백질; 및
상기 명시한 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
cAMP-의존성 단백질 키나제 억제제
Homo sapiens, Oryctolagus cuniculus, Mus musculus및Rattus norvegicus로부터의 cAMP-의존성 단백질 키나제 억제제 (근육/뇌 형태), 및
Mus musculus및Rattus norvegicus로부터의 cAMP-의존성 단백질 키나제 억제제 (고환 형태)
및 상기 명시한 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
사이클릭 뉴클레오타이드 포스포디에스테라제 억제제
Dictyostlium discoideum으로부터의 사이클릭 뉴클레오타이드 포스포디에스테라제 억제제 및 다른 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
단백질 포스파타제 억제제
Homo sapiens, Oryctolagus cuniculus,및Rattus norvegicus로부터의 단백질 포스파타제 억제제 1;
Homo sapiens, Oryctolagus cuniculus,및Rattus norvegicus로부터의 단백질 포스파타제 억제제 2;
Bos taurus 및 Homo sapiens로부터의 열-안정성 단백질 포스파타제 억제제 2a; 및
Bacillus subtilis로부터의 포스파타제 RAPA 억제제;
및 상기 명시한 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
GDP 해리 억제제의 TCD/MRS6족
Saccharomyces cerevisiae로부터의 분비 경로 GDP 해리 억제제;
Bos taurus, Homo sapiens, Mus musculus,및Rattus norvegicus로부터의 Rab GDP 해리 억제제 알파;
Homo sapiens, Mus musculus,및Rattus norvegicus로부터의 Rab GDP 해리억제제 베타;
Bos taurus, Homo sapiens, Caenorabditis elegans및Cabia porcellus로부터의 Rho GDP-해리 억제제 1;
Saccharomyces cerevisiae로부터의 Rho GDP-해리 억제제;
Homo sapiens,및Mus musculus로부터의 Rho GDP-해리 억제제 2; 및
Mus musculus로부터의 Rho GDP-해리 억제제;
및 상기 명시한 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
ATPase 억제제
Bos taurus, Caenorhabditis elegans, Pichia jadinii, Sus scrofa, Rattus norvegicus,및Saccharomyces cerevisiae로부터의 미토콘트리아 ATPase 억제제; 및Sus scrofa로부터의 소듐/포타슘 ATPase 억제제,
및 상기 명시한 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
포스포리파제 A2 억제 단백질
Bos taurus, Homo sapiens, Mus musculus, Sus scrofa, Rattus norvegicus, Oryctolagus cuniculus, Cavia cutleri, Gallus gallus및Colomba livia로부터의 아넥신 I (annexin I);
Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, 및 Gallus gallus로부터의 아넥신 V;
Oryctolagus cuniculus 및 Lepus capensis로부터의 유테로글로불린; 및
Trimeresurus flavoviridis로부터의 포스포리파제 A2 억제제;
및 상기 명시한 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
리보뉴클리아제 억제제
Bacillus amyloliquefaciens로부터의 바르스타 (barstar);
Homo sapiens, Sus scrofa 및 Rattus norvegicus로부터의 리보뉴클리아제 억제제, 및 상기 명시한 것 이외의 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
RNA 폴리머라제 억제제
박테리오파지 T3 및 T7로부터의 세균성 RNA 폴리머라제 억제제 및 다른 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
DNA-엔트리 뉴클리아제 억제제
Bacillus subtilis로부터의 반응적격 (competence) 단백질 J 및 다른 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
베타-락타마제 억제제
Streptomyces clavuligerus로부터의 베타-락타마제 억제제 및 다른 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제.
상기 효소 억제제 목록에는Bos taurus및Mus musculus로부터의 칼슘 전달 세미날플라스민과 같은 기능적으로 관련된 억제제 뿐만 아니라, 다른 소스로부터 분리된 이들의 동족 억제제도 부가될 수 있다.
본 발명에서 사용될 적합한 스캐폴드 분자의 상기 목록에 효소 활성에 영향을 미치는 다른 제제들을 추가하여야 한다. 한가지 흥미로운 후보는 티오레독신이다.
상기 수록된 모든 스캐폴드 분자들은 전체적인 분자의 유효한 일부분에 의해 대체될 수 잇다.
스캐폴드 분자의 특성
펩타이드 라이브러리는 아마도 세포의 모든 컴파트먼트에 달할 수 있을 것이므로, 스캐폴드 효소 억제제 단백질이 너무 크지 않고, 예컨대 진핵세포 내부의 환원적 환경에 둔감하며 단백질가수분해 공격에 대해 안정한 것이 이롭다. 따라서, 이들은 이러한 세포의 세포질 또는 핵 내에서 형셩되지 않으므로 디설파이드 다리의 형성에 의존적이지 않은 것이 바람직하다. 또한 스캐폴드 단백질은 단백질의 구조나 안정성을 크게 변화시키지 않으면서 펩타이드가 삽입될 수 있는 하나 이상의 노출된 루프를 함유하여야 한다. 이에 기초해서 키모트립신 억제제 2A (하기 내용 참조)가 적절한 스캐폴드이긴 하지만 하기와 같은 기타의 스캐폴드 역시 이용될 수 있다.
표적 세포 내로 도입된 펩타이드 라이브러리의 구성원은 직접 또는 간접 (트랜스도미넌트) 상호작용에 의해 표적 세포의 표현형 변화에 영향을 미칠 수 있다. 그러ㅏ, 본 발명의 방법은 표현형에 대한 직접 또는 간접적인 영향에 책임이 있는 펩타이드 또는 리보핵산 서열의 동정을 가능하게 해 줄 뿐만 아니라, 펩타이드와 상호작용하는 표적 분자의 정제, 분리 및 동정도 가능케 한다.
본 명세서에서 보리-유도된 키모트립신 억제제 2A가 예시적으로 사용되었는데, 이는 주로 이 단백질이 매우 잘 특성화 되어 있고 극히 안정하기 때문이다. 그러나, 실시에에서 이 효소를 사용한 것으로서 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다.
보리의 키모트립신 억제제 2A는 식물에서 주로 발견되는 동종 프로테아제 억제제의 큰 집단이다. 이 집단은 보리의 키모트립신 억제제 1A, 1B, 2A 및 2B, 감자의 억제제 I, 상처-유도된 토마토 억제제 I, 에틸렌-응답성 토마토 억제제, 야생형 토마토 과실 억제제 I, 광범위한 콩류로부터의 서브틸리신 억제제, 아주키(adzuki) 콩 서브틸리신 억제제, 호박 트립신/Hageman 팩터 억제제, 호리병방 (bitter gourd) 억제제, Nicotiana sylvestris로부터의 원형질-특이적 트립신 억제제, 담배의 서브틸리신 억제제, 애머랜스(amaranth) 트립신/서브틸리신 억제제 및 비치 카나발리아 서브틸리신 억제제를 포함한다. 이 억제제 집단 중 식물에 기원한 것이 아닌 유일한 구성원은 거머리 엘라스타제/카뎁신 G 억제제 에글린 C이다.
CI-2A는 본래 고-리신 보리 Hiproly의 내배유로부터 정제된 것으로 키모트립신은 물론 미생물의 서브틸리신 Carlsberg 및 Novo의 억제제에 단단히 결합된 것으로 나타났다. CI-2A에서 N-말단 아미노산 잔기는 차단된 아미노기를 갖는데 이는 직접적인 아미노산 시퀀싱이 성공적이지 못했기 때문이다. 그러나, CI-2A의 아미노산 잔기의 대부분은 단백질 수준에서 결정되었다. 또한, 보리로부터 정제된 CI-2A는 내배유 중에서 합성 및 저장 중에 또는 정제 단계에서 N-말단적으로 프로세싱되는 것으로 나타났다. 17 N-말단 아미노산 잔기가 부재한다고 해서 CI-2A와 서브틸리신의 복합체 형성에 영향을 받지는 않는다. 아미노산 시퀀싱과 cDNA의 시퀀싱 결과를 종합해 볼 때 CI-2A는 디설파이드 결합을 함유하지 않는 단일 폴리펩타이드 사슬 중에 83개의 아미노산 잔기로 구성된 것으로 추정되고 있다. 블로킹된 N-말단아미노산 잔기는 세린이다. CI-2A 중의 반응성 부위는 Met59-Glu60 펩타이드 결합인 것으로 결정되었으며 Ile56-Arg62 대역 중의 잔기들이 억제제와 프로테아제 사이의 분자간 접촉에 관여하는 것으로 입증되었다.
서브틸리신 Novo와 복합화된 CI-2A의 3차원 구조뿐만 아니라 복합화되지 않은 CI-2A의 3차원 구조도 X-선 크리스탈로그래피에 의해 알려져 있다. CI-2A의 3차원 구조 역시 NMR 스펙트로스코피에 의해 밝혀졌는데, 이는 CI-2A의 반응성 루프가 다이나믹하다는 것을 나타내주고 있다. CI-2A는 4개의 β-가닥에 대해 도킹된 하나의 α-헬릭스로 구성되어 있다. 루프 표면은 시트의 모든 방향으로 뻗어있고 8개의 잔기: 즉 Gly54-Tyr61로 구성되어 있다. 대부분의 효소 억제제와 반대로, CI-2A는 글리코실화 부위 뿐만 아니라 디설파이드 결합을 갖지 않는다. 결정된 구조들 중에서, 64C-말단 아미노산 잔기만이 정의되었다 (L20-G83); 절단된 이 버젼은 본래의 단백질의 기능을 간직하고 있다. CI-2A의 복합화되지 않은 2가지 형태와 복합화된 형태를 비교하면 몇가지 차이가 있다. 가장 주목되는 차이는 반응성 부위 루프가 복합화된 형태에 비해 복합화되지 않은 형태에서 덜 정리된 구조를 갖는 것으로 보인다는 점이다. 서브틸리신 Novo와 복합된 CI-2A의 3차원 구조를 서브틸리신 Carlsberg와 복합된 에글린 C의 3차원 구조와도 비교하였다. 이 2개의 동종 억제제들은 2차원 구조 및 3차원 구조가 매우 유사하다.
N-말단이 절단된 CI-2A (CI-2A(L20-G83) 및 N-말단 Asp-Pro 확장된 CI-2A의 재조합 변형물들은 CI-2A의 폴딩과 안정성을 연구하는데 널리 이용되어 왓다. 서브틸리신 Novo와 복합된 CI-2A의 구조는 이 억제제의 P4-P1 대역 (Ile56-Met59) 중의억제제와 프로테아제 사이의 분자간 접촉부위의 수가 P1'-P3' 대역 (Glu60-Arg62)의 그것보다 훨씬 많음을 보여주었다.
본 발명의 또 다른 측면들
본 발명의 상기한 방법에 따라 동정된 모듈레이터에 있어서 모듈레이터와 물리적으로 상호작용하는 표적 분자의 가능한 동정을 비롯해서 추가의 연구와 개발의 목적에서 이들을 다량으로 제공하는 것이 관심을 끌고 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 모듈레이터를 동정하는 단계와, 후속적으로
- 모듈레이터를 코딩하는 핵산 서열을 분리 또는 합성하고,
- 5'-3' 방향 및 작동가능한 결합으로 1) 핵산 서열의 발현을 추진하기 위한 프로모터, 2) 리더 펩타이드를 코딩하는 임의의 뉴클레오타이드 서열, 3) 핵산 서열, 및 4) 종결 시그날을 포함하는 오페론을 함유하는 복제가능한 발현 벡터를 엔지니어링하는 단계를 포함하는, 복제가능한 발현 벡터의 제조방법에 관한 것이기도 하다.
이러한 방법은 유전공학 및 분자생물학 분야에 널리 알려져 있다. 당업자라면 예컨대 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. "Molecular cloning; A Laboratory manual", 2판, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.에서 적절한 지침을 찾을 수 있을 것이다.
본 발명의 이 부분에서 프로모터는 유도가능한 것이 바람직하다; 그러나 구성적인 (constitutive) 프로모터가 배제되는 것은 아니다. 벡터를 담지해서 발현할숙주 세포의 선택에 따라, 프로모터를 세균성 프로모터, 효소 프로모터와 같은 진균성 프로모터 및 포유류 프로모터 중에서 선택한다. 벡터는 플라스미드, 파지, 코스미드, 미니염색체, 또는 바이러스 형태일 수 있으며, 이 역시 숙주 세포 및 특정한 경우 고려하여야 할 사항에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포의 게놈 내로 통합되리 수 있는 것이 가장 바람직한데, 이는 그래야만 그 안에서의 발현이 숙주 세포의 비-염색체 형질전환의 경우보다 시간의 경과와 더불어 더 안정할 것이기 때문이다.
잘 알려진 벡터 시스템은 세균성 플라스미드인 pBR322, λ-파지 및 효모 플라스미드 YRp7에 기초하지만 기타의 적당하고 합리적인 선택가능성도 당업자에게 알려져 있다.
상기에서 개략적으로 설명한 바와 같이 적절한 발현 벡터를 선택한 후에, 상기한 바와 같이 제조한 발현 벡터로 적절한 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 모듈레이터를 제조하는 것이 바람직하다. 이러한 숙주 세포는 세균 (예컨대 E. coli, Bacillus subtilis, 또는 기타 적합한 세균 숙주 세포), 진균 (예컨대 Saccharomyces cerevisiae 또는 Piccia pastoris와 같은 효모), 또는 식물, 곤충 또는 포유류 세포 (본 발명의 방법에서 "실제로 동일한 세포"로 사용하기에 적합한 상기한 모든 세포 또는 세포-종류일 수 있다)일 수 있다.
상술한 바와 같이 프로듀서 세포주를 제공한 후에는 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열을 세포가 발현하기 용이하게 하고 이어서 세포 및/또는 배양배지로부터 발현 산물을 수확하도록 하는 조건 하에서 배양 배지 중에서 상기한 바와 같이 제조된 형질전환된 세포를 성장시킴으로써 본 발명의 모듈레이터를 제조하는 것이 가능하다. 다른 한편, 모듈레이터는 (e) 단계에서 결정된 서열에 기초해서 화학합성 수단에 의해 모듈레이터를 합성함으로써 생산될 수도 있다. 모듈레이터가 펩타이드인 경우, 잘 알려진 고상- 또는 액상 펩타이드 합성 기술도 이용가능하며 모듈레이터가 리보핵산이면, 그의 합성적 생산 역시 쉽게 이용가능하다.
본 발명의 한가지 중요한 부분은 그의 동정, 분리 및 제조가 상기 설명된 바와 같은 모듈레이터에 관련된 표적 바이오분자의 분리/동정에 관한 것이다. 따라서 본 발명의 한가지 중요한 부분은 표적 바이오분자의 분리 및/또는 동정방법에 관한 것으로, 이 방법은 본문에 설명된 방법에 따라 모듈레이터를 제공한 다음 친화 정제 단계에서 친화 리간드로서 이 모듈레이터를 이용해서 적절한 샘플로부터 표적 바이오분자를 분리해내는 것을 포함한다. 친화 정제 단계는 예컨대 친화 크로마토그래피 단계, 친화 질량 스펙트로메트리 단계, 또는 공-면역침전단계일 수 있다. 그러나, 친화-기초한 분리/정제에 적합한 방법이면 어떠한 것이든 이용될 수 있다.
다른 한편, 모듈레이터는 이중- 또는 삼중-하이브리드 시스템 (세균, 진균 또는 포유류의)에서 실제로 동일한 세포로부터 유도된 cDNA 라이브러리에 대한 프로브로서 또는 베이트 (bait)로서 이용될 수도 있다.
표적 바이오분자는 펩타이드 또는 핵산인 것이 바람직한데 이는 이것이 그의 서열 결정도 가능케 해주기 때문이다.
이러한 표적 바이오분자의 잠재적인 이용은 약물-개발 프로그램에 이를 이용하는 것이다. 이 목적을 위해 표적 바이오분자의 3차원 구조에 대한 정보를 해독하거나 얻는데 이것이 종종 유용하다 (예컨대 X-선 회절 연구, NMR 분석, 서큘라 이색성 (circular dichroism)등과 같은 이용가능한 방법을 이용함으로써).
상술한 바와 같이 표적 바이오분자를 분리하면, 본 발명에 따라 약물 개발에 있어서 잠정적인 약물 후보로서 이용가능한 화학적 화합물의 합리적인 선별이 가능해진다. 이 방법은
- 본 발명의 방법에 따라de novo분리된 표적 바이오분자와의 상호반응에 대해 화학적 화합물의 라이브러리를 분석하고,
- 표적 바이오분자와 현저하게 상호반응하는 화합물을 선별하는 단계를 포함하여 이루어진다.
이렇게 동정된 약물 후보는 선도 화합물 또는 그 자체로 약물 후보가 될 수 있다. 본 발명에서 "선도 화합물 (lead compound)"라 함은 그 자체로서는 약물로서 적합하지 않지만 의학치료적 관점에서 볼 때 흥미로운 특성들을 여러개 나타내는 화합물을 의미한다. 선도 화합물이 적절하지 않은 이유로는 독성, 부적절한 약동학 또는 약력학적 특성, 그의 제조 및 정제의 곤란성 등을 들 수 있다. 이러한 경우, 선도 화합물은 3차원 구조 및 전하를 띤 극성 및 비극성기의 분포에 있어서 선도 화합물의 활성 부분과 관련이 있게 되도록 고안된 다른 화학적 화합물들의de novo합성을 위한 모델로서 이용된다.
이러한 접근방식은 구조에 기초한 또는 구조에 기초하지 않은 컴퓨터 약물-모델링 방법에 의해 라이브러리의 구성원을 초기에 동정함으로써 더 정밀화시킬 수 있다. 구조에 기초하지 않은 적절한 방법이 US 5,307,287 및 US 5,025,388에 설명되어 있으며 이 방법은 CoMFA로 알려져 잇다. 또 다른 대체방법은 HASL (Hypothetical Active Site Lattice; Hypothesis Software)이다. 이들 두가지 방법은 모두 3D-QSAR에 기초한다. 구조에 기초한 그럴듯한 한가지 접근방식으로 예컨대 WO95/06293에 기재된 방법이 있다.
마지막으로, 본 발명의 매우 중요한 부분은 의약 제품의 제조방법에 관한 것으로, 이 방법은
a) 상술한 본 발명의 방법에 의해 화학적 화합물을 선별하고,
b) 그 화학적 화합물의 의약 제품으로서의 적합성을 조사하기 위해 그 화합물에 대해 전-임상적 테스트를 수행하고,
c) 상기 화학적 화합물이 (b)단계에서 적합한 것으로 고려될 경우, 상기 화학적 화합물을 약학적 활성 물질로서 포함하는 의약 제품에 대한 시판 허가를 얻기 위해 상기 화학적 화합물을 이용한 임상 시도에 들어간 다음,
d) 시판 허가가 떨어지면, 상기 화학적 화합물을 약학적으로 허용되는 담쳬, 부형제 또는 희석제와 혼합하여 이렇게 얻어진 의약 제품을 판매하는 단계를 포함하여 이루어진다.
즉, 본 발명은, 본 발명의 방법에 따라 동정된 모듈레이터가 개발상 (development phase)에서 선도 화합물 역할을 하거나 또는 본 발명의 방법에 따라 분리/동정된 표적 바이오분자가 약물 발견상 (drug discovery phase)에서 잠정적인 약물 후보에 대응하는 상호작용 프로브 역할을 하는 방법에 의한, 의약 제품의 개발방법도 포괄하는 것이다.
몰론, 상술한 방법에는 GCP 또는 GMP 기준을 만족하기 위해 필요한 모든 요구사항이 고려되어야만 한다. 어떻든, 이 방법은 본 발명에 따라 동정된 모듈레이터를 초기에 제공하는데 전적으로 의존하는 것이다.
실시예 1
재료 및 방법
1-a: pCMVbipep/CI-2A의 구축
5788 bp 하이브리드 플라스미드 pCMVbipep (그 서열은 SEQ ID NO:39에 나타내었으며 하류에 패키징 시그날이 삽입된 CI-2A와 함께 도 1에 도시되어 있다)은 pUC-19 클로닝 벡터 내로 클로닝된 AKV 유도된 레트로바이러스 삽입물로 구성되어 있다. 이 레트로바이러스 삽입물은 플라스미드로부터 전사가 추진되면 강력한 시토메칼로바이러스 (CMV) 프로모터로부터의 발현을 허락하는 키메릭 5' LTR을 함유한다. 벡터를 숙주 게놈 내로 통합시킨 다음, 레트로바이러스 LTR로부터 전사를 추진한다. 패키징 시그날의 하류에는 다재다능한 폴리-링커가 존재한다. 이것은 이 위치에 펩타이드 라이브러리의 삽입을 가능케 해준다. 폴리링커의 바로 하류에는 뇌심금염 (EMC: encephalomyocarditis) 바이러스로부터 유도된 내부 리보좀 엔트리 부위 (IRES: internal ribosomal entry site)가 있다 (Koo 외, 1992, 도 2A-G).하류의 발현 카세트에서 Neo 마커 유전자가 발견된다.
pCMVbipep은 키메릭 CMV와 Akv 프로모터/인핸서를 포함한다. 이것은 벡터 플라스미드 구조물인 PUT 649 (CAYLA, Toulouse France) 및 AkvBiPep (Duch외, 미공개. 이하 설명됨)으로부터 구축되었다. AkvBiPept을 EcoRI과 AscI로 절단하고 5670을 거쳐 3293부터 401까지의 2779bp 단편을 CMV 위치 44 내지 548의 인핸서/프로모터를 함유하는 543 bp 단편 내로 접합시켰다. 다음의 2개의 프라이머를 이용해서 PUT 649의 EcoRI과 AscI 절단물을 PCR 증폭시킴으로써 상기 단편을 얻었다:
얻어진 단편을AscI로 절단하고 AkvBiPep (위치 828부터 3293까지의 단편)의AscI 단편에 접합시켰다.
pBiZeo-Neo (Duch외, Biotechniques, 1999, 26(6):1032-4, 1036)을BamHI 및StuI으로 절단하여 AkvBiPep을 구축하였다. 2개의 올리고뉴클레오타이드로 확장시켜 만들어진 DNA 단편에 1708부터 6054를 거쳐 1240까지의 단편을 접합시켰다. 이 올리고뉴클레오타이드들은
이었다. 확장 후 접합전에, DNA 단편을BamHI 및StuI으로 절단하였다. 이 조작에 의해 pBiZeo-neo 중의 Zeo 유전자가 제거되고 이를 폴리링커가 대체하게 된다.
pCMVbipep/CI-2A를 만들기 위해, 2μg pCMVbipep을BamHI/XhoI으로 A-5에 설명된 바와 같이 절단시켰다. A-7에 따라 0.8% 아가로스 겔로부터 5778 염기상 단편을 정제하였다. 인 프레임 메티오닌 개시 코돈에 융합된 야생형 CI-2A 단백질의 아미노산 21-83 (SEQ ID NO:2의 아미노산 넘버링)을 코딩하는 CI-2A cDNA 단편을 야생형 CI-2A 단백질(SEQ ID NO:1의 뉴클레오타이드 넘버링)을 코딩하는 단편을 함유하는 pUC 19유래의 플라스미드로부터 PCR에 의해 증폭시켰다 (Dr. IB G. Clausen, Novo Nordic A/S, Denmark로부터 기증받음) - cDNA 단편은 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 서열을 포함하여, 여기서 뉴클레오타이드 249, 252, 및 279는 각각 T, C, 및 T이다. 수행된 4가지 반응에 있어서의 PCR 조건은,BamHI 및XhoI에 대한 인식 부위를 갖는 CI-2A의 특정 대역을 플랭킹하는 다음의 프라이머들, 즉 CGGGATCCATGAAGACAGTGGCCAGAG (SEQ ID NO: 3) 및 CGCTCGAGTCAGCCGACCCTGGGGACCT (SEQ ID NO: 4)을 이용하는 A-3에 설명된 바와 같았다. 반응 혼합물을 94℃에서 1분, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초로 된 3단계 사이클로 15회 처리한 후 이어서 A-3에 설명된 바와 같이 증폭된 DNA 단편을 100μL 용출 부피로 정제하였다. 최종 반응 부피 120μL로 하여BamHI과XhoI 40 유닛을 이용해서, 정제된 DNA 단편을 (섹션 A-5 참조) 절단하고 정제하였다 (섹션 A-7 참조). 이 단편을 BamHI/XhoI 절단된 pCMVbipep (섹션 A-1 참조) 내로 접합시키고 pCMVbipep 특이적인 프라이머 CTGTATCTGGCGGCTCCGTGG (SEQ ID NO:5)를 이용해서 DNA 시퀀싱 (섹션 A-8 참조)을 확인하였다.
1-b: pmCATIREShyg의 구축
Bosc 패키징 세포주로부터 수확된 레트로바이러스 벡터로 비-쥐 세포의 형질도입을 가능케하기 위해 환경영양성 수용체를 코딩하는 벡터 (pmCATIREShyg)를 만들었다. mCAT cDNA를 pJET (Albritton 외, (1989) Cell 57, pp 659-666)로부터 얻어서 pIRESHyg (CloneTech) 내로 삽입하여 pmCATIREShyg를 얻었다. 이것은 2 유닛/μl EcoRI과 함께 1 x EcoRI 제한 효소 완충액 중에서 pMET를 절단함으로써 수행하였다 (섹션 A-5 참조). EcoRI 절단의 5' 오버행 (overhangs)을 제조업자의 프로토콜 (New England Biolabs)에 따라 Klenow 폴리머라제를 이용해서 충전시켰다. 1시간 동안 인큐베이션시킨 후 샘플을 페놀/CHCl3로 추출하고 (섹션 A-4 참조) 이어서 20μl의 반응 부피 중 20유닛의 BamHI에 의한 절단 (섹션 A-6 참조) 1.0% 아가로스 젤 상에서 정제하였다 (섹션 A-7 참조) 블런트 말단이 BstXI 부위로부터 유래된 것을 제외하고 mCAT 단편으로서 제조된 pIREShyg의 5699 염기쌍 BamHI/BstXI 단편 내로 이 단편을 접합시켰다. 접합 및 형질전환 후, 양성 클론 이벤트들을 분리하고다음의 프라이머 즉, ACAGCTGGCCCTCGCAGAC (SEQ ID NO:6), CCCACTGCTTACTGGCTTAT (SEQ ID NO: 7), TGGGGCTGCACGTCATTTG (SEQ ID NO: 8), TGTGCTACGGCGAGTTTGGT (SEQ ID NO: 9), GGTTCGTGAAAGGCTCCATT (SEQ ID NO: 10) 및 GAAATGTTCACAATTAGCCCTG (SEQ ID NO: 11)를 이용해서 DNA 시퀀싱 (섹션 1-9 참조)에 의해 확인하였다.
1-c: pCMVbipepNLS/CI-2A의 구축
SV-40 라지 T 항원 핵 국소화 시그날을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 프레임 내에 pCMVbipep/CI-2A에 위치하는 절단형 CI-2A 버젼의 N-말단에 첨가하였다 (도 1). GAAGATCTATGGCGGCCGCACCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGGATCCATGAAGACAGAGT (SEQ ID NO: 12) 및 CGCTCGAGTCAGCCGACCCTGGGGACCT (SEQ ID NO: 13) 25 pmol을 프라이머로서 사용하고 pCMVbipep/CI-2A를 템플레이트로서 사용해서 PCR (섹션 A-2 참조)에 의해 제조를 수행하였다. 이 반응을 두번 수행하고 94℃에서 1분, 45℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 이루어진 사이클을 25회 수행하였다. 용액을 2% 아가로스 겔을 이용해서 250 염기쌍 DNA 단편을 정제하기 전에 에탄올침전시켰다 (섹션 A-7 참조). BglII 및 XhoI 20 유닛 및 6μl NEBuffer 3을 1mg/ml 소의 혈청 알부민 (New England Biolabs)을 포함하는 60μl부피의 반응액에 첨가함으로써 (섹션 A-6 참조) 단편의 말단을 트리밍시켰다. 절단 산물을 2% 아가로스 젤 상에 분리하고 240 염기쌍 단편을 50μl 용출 부피로 정제하였다. 이 단편을 BamHI/XhoI 절단 pCMVbipep (pCMVbipep/CI-2A의 구조 참조) 내로 최종적으로 접합시켜서 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다 (A-8 참조).
1-d: pCMVbipepSL/CI-2A 및 pCMVbipepER/CI-2A의 구축
템플레이트로서 인간의 임뮤노글로불린 헤비 체인 시그날 펩타이드 및 프라이머로서 25pmol의 GAAGATCTATGGACTGGATCTGGCGCATCC (SEQ ID NO: 14)와 GAGGATCCAGAATGAGCGCCGGTAGCAG (SEQ ID NO: 15)를 함유하는 pBapePuro를 이용해서 분비 리더 (SL)을 증폭시켰다 (Beerli외, (1994) J. Biol. Chem. 269, pp23931-23936). 반응 조건은 pCMVbipepNLS/CI-2A의 구축시 설명된 것과 유사하였다. 증폭된 74 염기쌍 산물을 페놀/CHCl3추출 (섹션 A-4 참조)시킨 후, 반응물이 1μl/ml 소의 혈청 알부민 (New England Biolabs)를 포함하는 것을 제외하고 섹션 A-5에 설명된 바와 같이BamHI 및BglII로 절단하였다. 절단 후, 68개의 염기쌍 단편을 30μl 부피를 갖는 3% 저용융 아가로스 겔 (섹션 A-6 참조)을 이용해서 정제시켰다. 인큐베이션 기간의 마지막 시간동안 송아지 내장 포스파타제 (Boehringer Mannheim) 10단위가 존재한 것을 제외하고 pCMVbipep/CI-2A의 구축시와 동일한 방법으로 BamHI 절단된 pCMVbipep/CI-2A 벡터를 제조하였다. 이어서 단편을 함유하는 정제된 분비 리더를 BamHI 절단된 pCMVbipep/CI-2A (섹션 A-1에 설명된 바와 같이) 내로 접합시켜 pCMVbipepSL/CI-2A를 만들었다. 프라이머로서 CTGTATCTGGCGGCTCCGTGG (SEQ ID NO: 16)을 이용해서 DNA 시퀀싱에 의해 양성 클론을 확인하였다 (섹션 A-8).
pCMVbipepSL/CI-2A 콘텍스트 내의 C-말단에 정체 시그날을 부가함으로써 pCMVbipepER/CI-2A (도 1)를 제조하였다.
을 프라이머로서 이용하고 템플레이트로서 pCMVbipep/CI-2A를 이용하여 PCR에 의해 CI-2A 서열과 함께 정체 시그날을 프레임 내로 부가하였다. XhoI 대신 XbaI을 이용해서 237개의 염기쌍 단편을 절단하고 BamHI/XhoI 절단된 pCMVbipep으로서 제조된 BamHI/XbaI 절단된 pCMVbipepSL/CI-2A 내로 접합시켰다. 모든 반응 변수들은 pCMVbipepNLS/CI-2A의 제조의 경우 설명된 바와 같다.
1-e: pCMVbipep/muCI-2A의 구축
5단계 PCR 공정에 의해 CI-2A 서열 내로 2개의 사일런트 돌연변이를 도입하였다. 첫번째 PCR은 C192 →A로 교환시켰고 (SEQ ID NO: 1의 넘버링), 그 생성물을 정제시킨 후 pCMVbipep/CI-2A 중의 CI-2A 코딩 대역의 증폭을 위한 역 프라이머로서 이용하였다. 이 C192→ A 변이된 단편들을 T300→ C의 2번째 돌연변이 치환을 도입하기 위한 템플레이트로서 사용함으로써 (SEQ ID NO:1의 넘버링) 앞서 도입된 돌연변이를 포함하는 PCR-산물을 얻었다. 이 이중으로 돌연변이된 단편을 정방향 (forward) 프라이머로서 사용해서 pCMVbipep/CI-2A 정의된 리딩 프레임을 증폭시켰다. 모든 PCR은 두번씩 수행하고 기본적으로는 섹션 A-2에 설명된 바와 같은 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 사이클을 25회 수행하였다. 생성물을 정제하기 전에 모았다. 최초 PCR에서는, 50 ng의 pCMVbipep/CI-2A를 템플레이트로서, CCGGCCTTATTCCAAGCGGC (SEQ ID NO: 19)와 CTGCCGGTGGGTACAATTGTGACCATGG (SEQ ID NO: 20) 50 pmol을 프라이머로서 사용하였다. 50μl 부피의 용리액 (PCR-산물 1)를 이용해서 QIAquick PCR 정제 키트 (섹션 A-3 참조)를 이용해서 248 염기쌍 산물을 정제하였다. 두번째 PCR은 12.5μl의 PCR-산물 1과 프라이머로서 50 pmol의 CTGTATCTGGCGGCTCCGTGG (SEQ ID NO: 21) 및 템플레이트로서 50 ng의 pCMVbipep/CI-2A로 구성되었다. 완결된 반응물을 2% 아가로스 겔 상에 로딩하고 섹션 A-6에 설명된 바와 같이 448개의 염기쌍 산물을 정제하였다 (PCR-산물 2). 이 산물을 12.5μl PCR-산물 2에 더해, 50 pmol의
를 포함하는 세번째 PCR에서 템플레이트로서 사용해서 248 염기쌍 단편을 증폭시켰다 (PCR 산물-3). 50pmol의 CCGGCCTTATTCCAAGCGGC (SEQ ID NO: 24) 및 템플레이트로서 50ng의 pCMVbipep/CI-2A와 함께 정방향 프라이머로서 12.5μl을 이용하기에 앞서 이 단편을 PCR-산물 2로서 정제하였다. 이중으로 돌연변이된 448 DMA 단편을 겔 정제시킨 후 50 pmol의 CCGGCCTTATTCCAAGCGGC (SEQ ID NO: 25)와 CTGTATCTGGCGGCTCCGTGG (SEQ ID NO: 26)을 이용해서 PCR 증폭시켰다. pCMVbipep/CI-2A의 구축을 위해 상기 pCMVbipep 내로 상기 증폭된 이중 돌연변이된 단편을 삽입하였다.
1-f: pFab60/CI-2A 및 pFAB60/muCI-2A의 구축
야생형 단백질의 아미노산 21-83을 코딩하는 CI-2A cDNA의 단편을 파지미드 벡터 pFAB60 내로 삽입하였다 (Johansen외, 1995, Protein Eng. 10, pp 1063-7). pCMVbipep/CI-2A 제조시 설명된 것과 유사한 조건 하에서 수행된 4회의 반응을 통해 프라이머로서 10pmol의
및 템플레이트로서 pCMVbipep/CI-2A를 이용해서 PCR에 의해 CI-2A cDNA 단편을 증폭시켰다. 1μg/ml 소의 혈청 알부민을 포함하는 1 x NEBuffer 4 50ml 중 10 유닛의 NheI 및 NotI을 이용하여 정제된 237 염기쌍 단편과 2μg pFAB 60을 평행하게 절단하였다 (섹션 A-5 및 A-6 참조). 절단된 225 및 4655 염기쌍 단편들을 1% 아가로스 겔을 이용해서 후속적으로 정제하고 서로에게 (섹션 A-7 및 A-1 참조) 접합시켰다. 정확한 삽입은 프라이머로서 CACACAGGAAACTATGA (SEQ ID NO: 29)를 이용해서 DNA 시퀀싱에 의해 최종적으로 확인하였다 (헥션 A-8 참조). CI-2A cDNA 소스로서 pCMVbipep/muCI-2A를 사용한 것을 제외하고 pFAB60/muCI-2A를 제조하는데 동일한 접근방식을 이용하였다.
1-g: pFAb60/muCI-2A_rc
완전한 길이의 CI-2A 서열 중 아미노산 59 내지 62의 랜덤하게 구성된 19-mer 아미노산 서열에 의한 치환을 pCMVbipep/muCI-2A의 내용으로 수행하고 변형된 CI-2A를 pFAB60/CI-2A 구축을 위한 동일한 공정에 따라 pFAB60으로 이동시켰다.아미노산 서열에 대한 코딩 대역을 PCR에 의해 증폭된 합성 올리고로부터 얻었다. 4개의 평행 반응을 수행하였다. 템플레이트로서 12.5pmol의
와 프라이머로서 50 pmol의 CGAGTTTGTCGACAAAGAGGCGGAC (SEQ ID NO: 31) 및 TCTGCCGGTGGGTACAATTG (SEQ ID NO: 32)을 사용해서 4개의 동등 반응을 수행하였다. 다른 모든 반응조건은 섹션 A-2에 설명된 것과 동일하게 하고 94℃에서 2.5분, 45℃에서 2분, 및 72℃에서 2분간의 사이클을 25회 적용하여 반응을 수행하였다. 페놀/CHCl3추출에 의해 생성물을 정제하고 30μl 멸균 H2O에 용해시켰다. muCI-2A내로의 삽입을 용이하게 하기 위해, 5μl의 단편에 20 유닛의 MunI (Boehringer Mannheim), 5μl 10 x SureCut 완충액 M (Boehringer Mannheim) 및 멸균 H2O를 부피 50μl이 될때까지 보강시켜 37℃에서 4시간 인큐베이션시켰다. 6μl 10 x SalI 제한효소 완충액과 3μl H2O를 20유닛의 SalI과 함께 첨가한 후 4시간 더 인큐베이션시켰다. 2.5% 저온 아가로스 겔을 이용해서 89 염기쌍 단편의 정제를 수행하였다 (섹션 A-6 참조). MunI/SalI 절단된 pCMVbipep/muCI-2A의 제조는 상기 설명된 공정과 원칙적으로 유사하였다. 섹션 A-7에 설명된 바와 같이 4μg pCMVbipep을 150 μl 반응물 중 30 유닛의 MunI로 절단시킨 다음 50μl 4 x SalI 제한효소 완충액 중 30 유닛의 SalI을 첨가하고 1% 겔을 이용해서 정제시켰다. 접합과 확인 공정은 pCMVbipep/CI-2A의 제조시 설명된 바와 같이 수행하였다.
1-h: 라이브러리 구축
변성된 올리고
을 확장 반응에 의해 이중가닥 형태로 전환시켰다. 8 유닛의 SuperTaq 폴리머라제 (Enzyme Technologies Ltd) 및 0.2mM dNTP를 포함하는 1 x SuperTaq 완충액 (Enzyme Technologies Ltd.) 중에서 상기 올리고를 3배 과량의 CGAGTTTGTCGACAAAGAGGCGGAC (SEQ ID NO: 34)와 혼합하였다. 폴리머라제 활성을 증가시키기 위해 온도를 55℃에서 45분간 변화시키기에 앞서 올리고간의 어닐링이 충분히 일어나도록 94℃에서 1분, 이어서 45℃에서 2분간 혼합물을 가열하였다. 반응이 종결된 후, 샘플을 페놀/CHCl3로 추출한 후 1μg/ml 소 혈청 알부민을 포함하는 100μl의 1 x EcoRI 완충액 중에서 100 유닛의 EcoRI 및 SalI을 이용해서 생성물의 1/3을 절단하였다 (섹션 A-6 참조). 2% 저온 아가로스 겔 상에서 완전히 절단된 56 염기쌍의 DNA 단편을 정제하고 (섹션 A-6 참조) 실시예 1-g에 설명된 MunI/SalI 절단된 pCMVbipep/muCI-2A 내로 접합시켰다 (섹션 A-1 참조). 랜덤하게 선택된 콜로니들을 pCMVbipep/CI-2A의 제조시 설명된 바와 같이 시퀀싱하였다.
1-i: 서브틸리신 분석
세포 추출물을 10μl PBS 중에 지시된 양까지 희석하고 5x10-8M 서브틸리신 칼스버그 (Sigma)를 함유하는 0.1M Tris/HCl pH 8.6을 25μl까지 첨가하였다. 25℃에서 30분간 인큐베이션한 후 5mM N-석시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Nitroanilide (Sitma)를 함유하는 25μl 0.1M Tris/HCl pH 8.6을 첨가하고 매 2분마다 반응물이 고갈할 때까지 405 nm에서 흡광도를 측정하여 기질전환시켰다.
1-j: 세포주 및 배양 조건
모둔 세포주들을 10% 소의 태아 혈청 또는 10% 새로 태어난 송아지 혈청, 1%L-글루타민 및 50μg/ml 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 Dulbeco's 변형 Eagle's 배지 (DMEM)에서 배양한 다음 표준 세포 배양 조건 하에서 인큐베이션시켰다.
pmCAT/IRES-hyg에 의해 안정하게 트랜스펙션시킴으로써 293mCAT 세포와 U20SmCAT 세포를 293 (ATCC# CRL-1573) 및 U2OS (ATCC# HTB-96)으로부터 유도한다. Bosc 패키징 세포의 트랜스펙션시 개략된 칼슘 공침법에 의해 293 세포들을 트랜스펙션시키고 제조업자의 프로토콜 (Boehringer Mannheim)에 따라 Fugene 트랜스펙션 키트를 이용해서 U2OS 세포들을 형질도입하였다. 150 -200 μg 활성 하이그로마이신 B/ml (Sigma)의 존재 하에 배양시킴으로써 안정한 트랜스펙턴트들을 선별하였다. 293mCAT 또는 U2OSmCAT를 레트로바이러스 벡터로 형질도입시킨 후 각각 0.6mg/ml 또는 0.4 mg/ml의 제니티신 (GibcoBRL)로 선별을 이동시켰다.
쥐의 NIH-3T3 세포주 (ATCC# CRL-165)는 0.6mg/ml 제니시틴의 존재 하에 레트로바이러스 벡터를 이용해서 형질도입시켰다.
1-k: NIH-3T3, 293mCAT, 및 U20SmCAT 세포의 형질도입
레트로바이러스 벡터 입자의 제조를 위해, pCMVbipep 유도된 구조물을 CaPO4공침법을 이용해서 BOSC 패키징 세포주 내로 트랜스펙션시켰다. BOSC 패키징 세포 (BOSC23 세포라고도 알려져 있음 WO94/19478 참조)를 트랜스펙션하기 전날 5x105세포/cm2로 희석하고 트랜스펙션하기 2시간 전에 완전 DMEM으로 세척하였다.pCMVbipep 또는 pCMVbipep 유도된 구축물 10mg을 450 ml ddH2O 중의 연어 정자 DNA 10mg으로 희석하고 50ml의 2.5M CaCl2를 첨가함으로써 CaPO4공침 혼합물을 준비하였다. 이 용액들을 살살 흔들면서 500ml의 2 x HEPES-완충염수 pH 7.05 (280mM NaCl, 1.5mM Na2HPO4, 50mM HEPES/NaOH pH 7.05)에 서서히 첨가한 다음 침전물을 준비된 BOSC 세포에 첨가하기에 앞서 25℃에서 2 내지 5분간 인큐베이션시켰다. 24시간 인큐베이션시킨 후, 세포들을 PBS (137 mM NaCl, 2.7mM KCl, 8.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)에서 2회 세척하고, 보충물을 포함하는 10ml DMEM 중에서 추가로 24시간 배양하였다. 트랜스펙션된 BOSC 세포로부터의 배지를 수집해서 6mg/ml Polybrene (Sigma)를 포함하는 완전 DMEM 중에서 10 내지 105배로 희석하였다. 104세포/cm2로 도말된 수용체 세포를 완전 DMEM 배지 중에서 24시간 동안 표준 세포 배양 조건 하에서 인큐베이션시킨 다음, 표준 조건 하 24시간 동안 바이러스-함유 배지에 노출시켰다. 이 인큐베이션 기간이 끝난 후, 형질도입된 세포들을 PBS 중에서 2회 세척하고 제네티신을 함유하는 완전 DMEM 중에서 인큐베이션시켰다.
1-l: 총 세포 추출물의 제조
CMVbipep/CI-2A 또는 CMVbipep 형질도입된 NIH-3T3 세포들을 5ml의 0.5 x Trypsin-EDTA 용액 (GibcoBRL)/플레이트와 함께 인큐베이션시킴으로써 2개의 컨플루언트 T175 세포 플라스크로부터 수확하였다. 회수된 세포들을 완전 DMEM 중에 1:1로 희석한 후 원심분리에 의해 수집한 다음 10ml 완전 DMEM 중에서 2회 세척하고 1 ml PBS 중에서 2회 세척하였다. 마지막으로, 세포들을 100 μl PBS 중에 현탁시켰다. 세포들을 액체 질소 중에서 냉동시킨 다음 37℃에서 해동시키는 단계를 3회 반복함으로써 투과될 수 있도록 하고 이어서 20000 x g에서 15분간 원심분리하여 세포 잔사를 제거하였다. 내인성 프로테아제 활성을 불활성화시키기 위해, 추출물을 65℃에서 15분간 인큐베이션시킨 다음 다시 원심분리하였다.
1-m: 핵 추출물의 제조
각 세포주들의 거의 80% 컨플루언트 T-175 세포 플라크스 2개를 이용하였다. 각각의 플라스크에 3ml의 Trypsin/EDTA 용액 (GibcoBRL)을 첨가한 다음 6ml 세포 현탁액을 원심분리함으로써 세포들을 수확하였다. 다음의 모든 반응둘은 차게 식힌 용액을 이용해서 4℃에서 수행하였다. 수확된 세포들을 10ml 완전 DMEM, 10ml PBS로, 그리고 1ml PBS 중에서는 2회 세척하였다.세포들을 마지막으로 세척한 후 1ml NP40 용균 (lysis) 완충액 (10mM Tris/HCl pH 7.4, 10mM NaCl, 3mM MgCl2및 0.5% NP-40)에 현탁시킨 다음 부드럽게 혼합하고 얼음과 함께 5분간 인큐베이션시켰다. 이어서 세포들을 500 x g에서 4℃에서 5분간 원심분리하여 수집하고 1ml NP-40 완충액 중에 현탁시킨 다음 원심분리를 반복함으로써 핵을 직접 수확하였다.핵을 50μl 저염분 완충액 (20mM HEPES pH 7.9, 25% 글리세롤, 0.02M KCl, 1.5mM MgCl2, 0.2mM EDTA) 중에 현탁시킨 다음 50μl 고염분 완충액 (저염분 완충액에 1 M KCl을 보강한 것)을 첨가함으로써 핵으로부터 단백질을 추출하였다. 얼음과 함께 30분간 인큐베이션시킨 후, 핵 추출물을 20000 x g에서 30분간 원심분리시킴으로써 맑게만들었다. 상등액을 -20℃에서 보관하였다.
1-n: SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯
샘플을 1/10 부피의 1M 디티오트레이톨을 포함하는 ¼ 부피의 SDS-로딩된 완충액 (NOVEX)으로 보강하고 1 x MES 완충액 (NOVEX) 중에서 NuPage (NOVEX) 4-12% 구배 SDS-겔 상에 로딩하기 전에 95℃에서 2분간 가열한 다음 40mA의 일정한 전류 하에 수행하였다. 70분간 반건조 블로팅에 의해 단백질을 0.2μm Obitiran BA-S 83 멤브레인 (Schleicher & Schoell)으로 이동시키기에 앞서 블로팅 완충액 (10mM CHAPS/NaOH pH 11.0, 10% 메탄올, 0.5% SDS) 중에서 5분간 평형시켰다. 실온, ECL-완충액 (50mM Tris/HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 0.5% 젤라틴, 0.1% NP-40) 중에서 1시간 동안 블로킹시키기 전에 멤브레인을 공기 건조시켰다. 블로킹시킨 후, ECL-완충액을 ECL-완충액 중에 1:1000으로 희석된 항 CI-2A 토끼 혈청으로 대체시키고 계속해서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 멤브레인을 ECL-완충액 중에 1:5000배로 희석된 호스 래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 염소의 항 토끼 혈청 (Dako)를 첨가하기 전에 ECL-완충액 중에서 20분간 인큐베이션시키는 방식으로 3회 세척하였다. 제조업자의 프로토콜 (Amersham-Pharmacia)에 따라 개선된 화학발광 키트를 이용해서 시그날의 발달을 수행하였다.
1-o: 항 CI-2A 폴리클로날 항체의 생산, 면역침전
완전 Freunds 보조제 (Sigma) 중 100μg의 완전한 길이의 재조합 CI-2A (Novo Nordic A/S의 Dr. Ib G. Clausen이 기증)로 토끼를 면역시키고 불완전 Freunds 보조제 중에 조성된 50μg CI-2A를 주사함으로써 3주일 간격으로 4회 부스트시켰다. MaxiSorb 플레이트 (Nunc) 상에 고정된 재조합 CI-2A를 이용하여 ELISA에 의해 항 CI-2A 응답을 검색하였다. CI-2A 혈청을 몇차례 희석해서 호스 래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 염소의 항 토끼 항체 (Dako)와 결합시키게 해서 검색하였다. 모든 반응은 1-p에 설명된 바와 같이 수행하였다.
세파로스 CL-4B 비드 (Pharmacia Biotech)를 함유하는 단백질 A를 희석 완충액 (0.1% Triton X-100, 0.1% 소의 혈청 알부민을 포함하는 PBS)으로 미리 세척하고 항 CI-2A 항체 10μl와 함께 수확된 배지부피가 100μl가 되도록 40μl의 비드를 첨가하였다. 혼합물을 4℃에서 1시간 회전시키고 희석 완충액으로 3회 세척하였다. 비드를 2 x SDS 로딩 완충액에 현탁시키고 웨스턴 블롯에 의해 CI-2A가 검색되기 전에 SDS-PAGE를 수행하였다 (실시예 1-n 참조).
1-p: ELISA
정제된 돼지의 항 토끼 폴리클로날 항체 (Dako)를 0.1M NaHCO3pH 8.5 중 120ng/ml로 희석하고 MaxiSorb 플레이트 (Nunc)의 각 웰에 50 μl 분주액을 첨가한 다음 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. 플레이트를 ELISA 세척 완충액 (0.01% 파이로포스페이트, 500mM NaCl, 0.1% Triton X-100)으로 3회 세척하고 결합 완충액 (0.5% 소의 혈청 알부민, 0.5% Tween-20, 10% 글리세롤이 보강된 PBS) 중 1:200으로 희석된 토끼의 항 CI-2A 혈청 50μl을 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션시킨 후 세척 단계를 반복하고 나타난 파지 입자의 수를 결합 완충액에 첨가하였다. 파지 입자를 실온에서 1시간 동안 반응시키고 플레이트를 ELISA 세척 완충액에서 10회 세척하였다. 상술한 바와 같이 결합 및 세척 단계에 의해 호스 래디쉬 퍼옥시다제 컨쥬게이트된 항 파지 항체 (Pharmacia biotech)를 이용함으로써 결합된 파지 입자를 검색하였다. 마지막으로 호스 래디쉬 퍼옥시다제를 제조업체의 프로토콜 (Sigma)에 따라 OPD-정제를 이용해서 검색하였다.
표준 반응:
A-1: 전기영동에 의한Escherichia coli의 접합 및 형질전환
- 30 ng 벡터
- 2μl 단편 (단편: 벡터 사이에 10 : 1의 관계를 결과시키는 농도로 단편을 함유함)
- 2μl 10 x T4 DNA 리가제 반응 완충액 (New England Biolabs)
- 300 단위의 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs)
- 부피를 20μl로 조정하기 위한 멸균 H2O
- 30℃에서 30초간, 그리고 10℃에서 30분간, 이어서 16℃에서 하룻밤으로 이루어진 사이클 198회
접합 산물을 전기영동에 의해E. coli내로 형질전환시켰다:
- 2 ml의 멸균 H2O에 대해 접합 반웅물 10μl를 투석하였다.
- 투석된 접합 반응물 2μl를 0.1 cm 전기영동 큐벳 중에서 25μl의 컴피턴트E.coli와 혼합하고 2kV로 펄스시켰다.
- 1 ml의 SOC-배지를 첨가하였다 (950 ml의H2O 중에 용해된 20g Bacto-Tryptone, 5g 효모 추출물, 0.5g, NaCl, 0.19 KCl, 사용전 NaOH에 의해 pH7.0으로 조정되고, 최종 농도 10mM이 되도록 50 ml의 20% 글루코스와 MgCl2가 보강됨)
- LB 플레이트 (1.5g의 한천과 50 mg/ml의 카르베니실린을 포함하는 100 ml LB (10 g Bacto-Tryptone, 5g 효모 추출물, 5g NaCl, 1L되는 양의 H2O)) 상에 50 ~ 200 μl 스트리킹하기에 앞서 37℃에서 0.5 ~ 1시간 인큐베이션시켰다.
전기영동 컴피턴트 E. coli 세포는 다음과 같이 제조하였다:
- 0.020 미만의 OD600값을 달성하기 위해 하룻밤 배양시킨 배양체를 사용해서 37℃ LB를 접종하였다.
- 배양체르 OD600값이 0.8-1.0 사이가 될 때까지 37℃에서 인큐베이션시킨 다음 얼음으로 식혔다.
- 식혀진 배양체를 원심분리에 의해 수확하였다.
- 수확된 세균을 10% 얼음 냉각된 글리세롤 용액 300 ml에 현탁시켰다.
- 원심분리를 반복하였다
- 현탁 및 원심분리 단계를 2회 반복하였다.
- 세균을 50 ml의 10% 얼음 냉각된 글리세롤 용액에 현탁시키고 원심분리에 의해 재수집하였다.
- 세균을 10% 얼음 냉각된 글리세롤 완충액 중에 최종 밀도가 6~12 x 1012세포/ml가 되도록 현탁시키고 -80℃에서 분주액 형태로 보관하였다.
A-2: TaqGoldTM을 이용한 폴리머라제 연쇄 반응
- 100 ng 템플레이트
- 달리 언급되지 않은 한 10 pmol의 특정된 프라이머,
- 5μl 10 x TaqGoldTM반응 완충액 (Perkin Elmer)
- TaqGoldTM(Perkin Elmer)를 위한 3μl MgCl2용액
- 0.4μl 25 mM dNTP (dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP)
- 0.4μl 5 유닛/μl TaqGoldTM(Perkin Elmer)
- 50 μl 되도록 하는 멸균 H2O
- 모든 반응은 95℃에서 처음 10분간 수행한 다음 72℃에서 4분간 특정 사이클을 수행하였다.
- PCR 산물의 정제에 관해서는 섹션 A-3을 참조하면 된다.
A-3: VentTMDNA 폴리머라제를 이용한 PCR
- 100 ng 템플레이트
- 달리 언급되지 않은 한 특정된 프라이머 10 pmol,
- 5μl 10 x VentTMDNA 폴리머라제 반응 완충액 (New England Biolabs)
- 0.4μl 25 mM dNTP
- 0.4μl 5 유닛/μl VentTMDNA 폴리머라제 (New England Biolabs)
- 50 μl 되도록 하는 멸균 H2O
- 모든 반응은 94℃에서 처음 1분간 수행한 다음 72℃에서 4분간 특정 사이클 프로그램을 수행하였다.
증폭된 DNA 단편을 페놀/CHCl3추출물에 의해 정제한 다음 만일 크기가 100 염기쌍 미만이면 에탄올 침전을 수행하였다. 그렇지 않으면, QIAquickTMPCR-정제 키트를 사용하였다 (Quigen). 용리액 부피을 50μl로 해서 제조업자의 프로토콜에 따라 PCR-정제 키트를 사용하였다.
A-4: 페놀/CHCl3추출.
- 멸균 H2O를 이용해서 샘플 부피를 적어도 200μl로 조정하였다.
- 1배 부피의 페놀 pH 6.7 (공급자)의 첨가.
- 잘 혼합하고 원심분리한다.
- 수성상에 1배 부피의 페놀/CHCl31:1 용액을 첨가
- 혼합-스핀 공정 반복
- 수성상에 1배 부피의 CHCl3첨가
- 혼합-스핀 공정 반복
- 수성상에 1/10배 부피의 3M NaAc pH 6.0과 2.5배 부피의 -20℃ 96% 에탄올 보충.
- 20,000 x g에서 20분간 원심분리하고 상등액을 70% 에탄올로 대체시킨 다음 2분간 원심분리 반복
- DNA를 공기 건조시킨 다음 멸균 H2O에 용해시켰다.
A-5: 벡터 제조
벡터 제조에 이용된 플라스미드 DNA를 제조업자의 프로토콜 (Qiagen)에 따라 Qiagen 맥시 프렙 컬럼으로 정제하였다. 사용된 모든 제한효소들과 이들의 반응 완충액은 달리 명시하지 않는 한 New England Biolabs로부터 구입한 것이었다.
- 5μg-10μg 벡터 DNA
- 플라스미드 DNA의 표시된 제한효소 pr.μg 약 5 내지 10 단위
- 달리 언급하지 않는 한 10x BamHI 제한 효소 최종 부피 1/10
- 표시된 최종 부피가 되도록 하는 멸균 H2O
- 완전히 절단될때까지 37℃에서 인큐베이션
- 65℃에서 20분
- A-7에 설명된 바와 같이 절단된 단편을 정제
A-6: 단편 제조
DNA 양을 제외한 벡터 제조 (A-6 참조) 및 100 염기쌍보다 작은 절단된 DNA 단편 정제는 저융점 아가로스를 이용해서 수행하였다. 아가로스 슬라이스를 0.3M NaAc 300μl, pH 6.0으로 보강하고 아가로스가 완전히 용융될 때까지 65℃에서 인큐베이션시킨 다음 페놀/CHCl3추출시키고 에탄올 침전 (A-4 참조)하여 DNA를 정제하였다.
A-7: Qiagen 겔 정제 키트를 이용한 겔 추출
- 샘플을 1/6 부피의 DNA 로딩된 완충액 (60% 글리세롤, 0.025% Bromphenol blue, 0.025% Xylen Cyanol)에 첨가함.
- 1 x TBE (89mM Tris-Borate, 89mM Boratic acid, 2mM EDTA) 중의 아가로스 겔 상에 로딩시킴.
- 만족스러울 정도로 분리가 이루어진 후 달리 명시되지 않은 한 50μl의 용리액 부피를 이용해서 제조업체의 프로토콜에 따라 Qiagen 겔 추출 키트를 이용해서 DNA를 추출하였다.
A-8: DNA 시퀀싱
모든 DNA 시퀀싱은 96℃에서 10초, 50℃에서 5초, 및 60℃에서 4분으로 이루어진 25 사이클 프로그램을 이용해서 DNA 시퀀싱 키트 BigDyeTM터미네이터 사이클 시퀀싱 (Perkin Elmer)에 의해 수행하였다. 지정된 프라이머 3.2 pmol의 경우 DNA량은 0.2 내지 0.5μg이었다. 제조업체의 어드바이스에 따라 BigDyeTM을 2회 희석하였다. 사이클 프로그램 수행 후, DNA를 에탄올 침전시키고 70% 에탄올로 철저하게 세척한 다음 ABI 프리즘 310 시퀀싱 기기 (Perkin Elmer)를 이용해서 분석하였다.
실시예 2
포유류 세포에서의 CI-2A의 발현
CellScreenTM기술에 이용된 레트로바이러스 벡터로부터 발현된 펩타이드 라이브러리의 세포내 프레젠테이션을 위한 잠재적인 스캐폴드는 레트로바이러스 복제사이클이나 형질도입된 포유류 세포의 생존성에 어떠한 심각한 영향도 끼쳐서는 안된다. 또한, 스캐폴드는 강제적인 (constrained) 펩타이드 프레젠테이션을 확실히 하기 위해 안정한 코어 구조를 유지해야만 한다. CI-2A가 이러한 요구사항을 만족하는지 알아보기 위해 본 발명자들은 pCMVbipep/CI-2A를 구축하였다 (실시예 1-a 및 도 1 참조). CI-2A 발현 구조물은 BOSC 패키징 세포 내로 일과성으로 트랜스펙션된 pCMFbipep을 이용해서 병행하여 NIH3T3, 293mCAT, 및 U20SmCAT 세포 (실시예 1-k)의 형질도입을 위한 바이러스 입자를 생산한다. 2개의 바이러스 벡터를 이용한 형질도입에 의해 얻어진 역가는 CI-2A 발현 유닛이 바이러스 패키징 및 감염을 간섭하지 않음을 가리키고 있다.
NIH-3T3, 293mCAT, 및 U20SmCAT 세포로부터 총 세포 추출물을 제조하고 웨스턴 블롯에 의해 CI-2A의 존재여부를 분석하여 CI-2A 발현의 직접적인 증거를 얻었다 (실시예 1-l 및 1-n). 야생형 CI-2A에 대해 야기된 토끼의 항 CI-2A 혈청은 CMVbipep/CI-2A로부터 발현된 CI-2A 단백질에 대해 기대되는 것에 해당하는 이동 특성을 갖는 단백질을 인식하였다. 웨스턴 블롯의 과도 노출도 pCMVbipep 절단형 세포로부터 유도된 추출물에서의 유사한 이동 특성을 갖는 밴드를 전혀 드러내지 않았으므로 이는 가용성 CI-2A가 CMVbipep/CI-2A에 의해 발현되고 테스트된 세포주에 의해 관용된 것임을 가리키는 것이다.
흥미롭게도, 약간 낮은 이동성을 갖는 CMVbipep/CI-2A 특이 밴드는 웨스턴 블롯에 의해 재생적으로 검출되었다. 이 밴드의 본질은 현재로서는 확실치 않다. 비록 실험적으로 증명된 바는 아니지만, 저하된 이동성은 포스포릴화와 같은 약간의 이차적인 변형과도 일치한다. 기타의 보다 사소하고 덜 논리적인 설명으로는 비-컨센서스 (non-consensus) 개시 코돈을 이용한다거나 또는 CI-2A 종결 코돈이 누출적임으로 해서 확장된 CI-2A 단백질을 야기한다는 것을 들 수 이싸ㄷ. 본 발명자들은 N-말단 아미노산 시퀀싱과 질량 스펙트로메트리에 의해 보다 상세한 발현 산물의 특성화를 진행중에 있다.
스캐폴드 컨텍스트에 있어서 펩타이드 라이브러리의 일관된 강제적인 프레젠테이션은 스캐폴드의 구조가 주어진 환경에서 안정할 것을 요구한다. CI-2A는 보리의 종자에서 자연적으로 발견되므로, 포유류 세포 내부에서 환경으로의 이동은 폴딩 동력학에 영향을 미쳤을 수 있고 그에 따라 CI-2A의 안정성에도 영향을 미칠 수 있을 것이다. CI-2A의 프로테아제 억제 활성은 자연적으로 폴딩된 CI-2A의 양을 반영해주는, 기능에 대한 간단한 분석법을 제공해준다 (실시예 1-i). 웨스턴 블롯에 사용되는 총 세포 추출물의 양을 증가시키면서 서브틸리신과 함께 예비-인큐베이션시킨 다음 색원체 (chromogenic) 기질을 첨가함으로써 잔류 프로테아제 활성을 측정하였다 (도 2). CMVbipep/CI-2A형질도입된 세포로부터의 추출물이 0.1 ~ 2μl 존재하면 서브틸리신 활성이 완전히 블로킹되었다. 이와 대조적으로, CMVbipep 형질도입된 세포로부터의 추출물의 양을 10μl까지 증가시키자 서브틸리신 활성에 아무런 영향도 안 주는 것으로 관찰되었다. 이 결과는 CMVbipep/CI-2A 형질도입된 세포로부터의 추출물을 이용해서 관찰된 서브틸리신 활성의 감소가 CI-2A의 발현에 기인한 것임을 입증해준다. 더욱이, 포유류 세포로부터 추출된 CI-2A가 기능적이라는 관찰은 랜덤 펩타이드 라이브러리를 뒷받침해주는, 세포 내부의 천연 구조가 강제적인 방식으로 CI-2A에 의해 제공될 것임을 시사하는 것이다. 서브틸리신을 억제하는데 필요한 CI-2A 함유 추출물의 양과 정제된 CI-2A 상에 기초한 표준 곡선을 비교함으로써, 활성 CI-2A 농도의 대략적인 평가가 가능하였다. 이는 또한 세포 농도의 산출도 가능케해준다. 이를 수행함으로써, 본 발명자들은 테스트된 세포주에서의 CI-2A 함량이 μM 범위인 것으로 평가하였다.
상기의 실험들을 종합해서 고려하면 CI-2A가 생물 활성을 나타내는데 충분한 농도로 포유류 세포 중의 세포내 위치한 단백질로서 관용될 수 있음을 시사하는 것이다. 또한, 세포 추출물 중에 발견된 현저한 CI-2A 활성은 루프 대역으로부터의 강제된 펩타이드 제공을 가능케하는 천연의 배열을 가리켜준다.
실시예 3
정의된 서브세포 국소화 (subcellular localization)를 이용한 CI-2A 융합 단백질의 발현
몇몇 생물학적 반응은 세포내 소정의 구획(compartment)내로 국한된다. 이러한 유형의 반응을 간섭하는 펩타이드의 선별가능성을 높이기 위해 본 발명자들은 그렇지 않으면 융합 단백질을 가리키는 것으로 나타났을 CI-2A에 대한 아미노산 서열을 소정의 서브세포 국소화에 융합시켰다. 소포체나 핵 중 어느 하나에 대한 국소화 매개 시그날을 첨가하여 CI-2A의 제한된 국소화가 달성될 수 있는지를 테스트하였다.
SV-40 라지 T-항원으로부터의 핵 국소화 시그날을 CI-2A의 N-말단에 융합시킴으로써 pCMVbipepNLS/CI-2A 구축물을 얻었다 (도 1 및 실시예 1-c). NIH-3T3 세포를 CMVbipepNLS/CI-2A, CMVbipep/CI-2A, 및 CMVbipep 유도된 레트로바이러스 입자로 형질도입시켰다. 형질도입된 모든 세포주로부터 제조된 핵 추출물과 총 추출물 중의 CI-2A 함량을 분석하기 위해 웨스턴 블로팅 및 서브틸리신 활성 분석법 (실시예 1-i 및 1-n 참조)을 이용하였다. CMVbipep 형질도입된 세포로부터의 총 추출물이나 핵 추출물은 그 어느 것도 서브틸리신의 프로테아제 솰성을 간섭하지 못했는데, 이는 실시예 2에 설명된 결과와 일치하는 것이다. 이와 대조적으로, CMVbipepNLS/CI-2A 블로킹된 것으로부터 유도된 핵 추출물과 총 추출물은 두가지 모두 서브틸리신의 프로테아제 활성을 억제한 반면, CMVbipep/CI-2A의 경우에는 총 추출물만 CI-2A 활성을 나타내었다 (도 3). 웨스턴 블로팅 시험 결과 CMVbipep/CI-2A와 CMVbipepNLS/CI-2A 형질도입된 세포들로부터의 총 추출물 중에 동량의 CI-2A가 존재하는 것으로 밝혀졌고, 이는 따라서 유사한 발현 수준을 가리키는 것이다. 활성 시험과 잘 부합되게, 웨스턴 블로팅에 의해 핵 추출물 중에서 검출된 CI-2A의 양은 CI-2A의 경우에 비해 NLS/CI-2A의 경우 적어도 10배 더 많았다. 따라서, 이들 두가지 독립적인 유형의 분석결과는 NLS의 존재가 핵 중 NLS/CI-2A의 농도를 증가시키는 결과를 초래하였음을 뒷받침해준다.
소포체 국소화는 이 구획을 표적화시킨 다음 계속적으로 정체 (retention)시킬 것을 요구한다. 이를 달성하기 위해, pCMVbipepER/CI-2A 구조물은 분비 리더 (SL: secretoric leader) 및 각각 CI-2A의 N-말단과 C-말단에 융합된 정체 펩타이드를 함유한다 (도 1 및 실시예 1-d). 정체 시그날의 기능을 평가할 수 있도록, 분비 리더 펩타이드만을 함유한 pCMVbipepSL/CI-2A 구축물을 만들었다 (도 1 및 실시예 1-d 참조). NIH-3T3 세포를 CMVbipep 및 CMVbipep/CI-2A와 함께 이들 레트로바이러스 벡터 내로 형질도입시켰다. 이 구축물은 세포 배지로 분비된 CI-2A 단백질의 양을 측정함으로써 리더 펩타이드와 정체 시그날 두가지 모두의 활성을 조사하는 것을 가능케해준다. 배지 교환 후, 면역침전법과 웨스턴 블롯 공정을 함께 이용함으로써, 분비된 CI-2A 단백질을 여러 시점에서 검출하였다 (1-o 참조). SL/CI-2A는 3시간 인큐베이션 후에 검출되었으며 인큐베이션 기간 동안 현저하게 증가하였다. 이와 대조적으로, ER/CI-2A는 인큐베이션한지 5.5 시간 이전까지는 검출되지 않았고 따라서 CMVbipep/CI-2A 형질도입된 세포에 의해 생산된 것과 필적할만한 수준에 불과하였다. CMVbipep/CI-2A 및 CMVbipepER/CI-2A의 두가지 세포주로부터의 배지에서 발견된 CI-2A는 따라서 활성 분비가 아닌 세포 사멸에 기인한 것 같다. 요약하면, 리더 펩타이드의 존재는 CI-2A의 분비를 증가시키지만, 이 분미는 KDEL 정체 시그날 첨가에 의해 현저히 지연되었다. 이상의 데이타를 종합하면 CMVbipepER/CI-2A로부 발현된 CI-2A는 소포체로 전위 (translocated)된 것으로 추정된다.
펩타이드 라이브러리의 세브세포적 국소화를 정의함으로써 그의 발생이 이러한 국소화로 국한된 것으로 알려진 반응을 간섭하는 활성 헵티드들을 분리할 수 있는 가능성이 현저히 증가될 수 있다. 상기한 실시예들에 더해서, CI-2A를 예컨대 세포막, 미토콘드리아, 라이소좀등과 같은 다른 위치에 표적화시킬 수도 있다.
실시예 4
파지 입자상의 CI-2A 디스플레이
파지 디스플레이 기술은 처음 발견된 이래 펩타이드 라이브러리를 스크리닝하는데 널리 사용되어오고 있다. 파지 디스플레이를 Cell ScreenTM과 병용하면 예컨대 조질의 세포 추출물이나 전 세포에 대한 결합제에 대한 펩타이드 라이브러리를 강화시킬 수 있음으로 해서 생물학적 스크리닝 시스템에서 조작될 필요가 있는 펩타이드의 수를 줄일 수 있다. 본 발명자들은 따라서 CI-2A를 pFAB60 파지미드 내로 삽입함으로써 파지 입자의 표면 상의 CI-2A 디스플레이의 적용가능성을 테스트하였다 (도 4 및 Johansen외 (1995), Protein Eng. 10, pp 1063-1067). pFAB60/CI-2A 유도된 파지 입자의 표면상의 CI-2A의 존재는 ELISA 분석과 서브틸리신 분석법 두가지 모두에 의해 입증되었다 (실시예 1-o 및 1-i). ELISA 분석에서는, 고정된 토끼의 항 CI-2A 폴리클로날 항체가 pFAB60/CI-2A로부터 유도된 파지 입자들을 CI-2A 음성 파지 입자들보터 몇승 더 높은 수준으로 보유하였다 (도 5). 서브틸리신 활성은 pFAB60/CI-2A 유도된 파지 입자에 의해서만 억제될 수 있었는데 이는 상기 결과와 일치하는 것이다. 이들 두가지 실험 결과는 CI-2A가 파지 표면 상에서 디스플레이 될 수 있고 따라서 파지 디스플레이 및 CellScreenTM기술의 두가지 모두에서 스캐폴드 단백질에 요구되는 특성들을 만족함을 명백히 입증해주는 것이다.
펩타이드 라이브러리가 CI-2A에 의해 제시되는 경우 CI-2A의 루프 대역은 집중적으로 변형될 것이다. 이 상황을 모방하기 위해 그리고 이러한 변형된 CI-2A 단백질을 제공하는 파지 입자가 생산될 수 있는지 테스트하기 위해 본 발명자들은 루프 대역에 위치하는 4개의 아미노산을 19mer의 랜덤하게 구성된 펩타이드로 교환함으로써 pFAB60/CI-2A_rc를 제조하였다 (도 4 및 실시예 1-g). ELISA에 의해 분석하자, 비록 변형되지 않은 CI-2A를 지니는 파지 입자와 비교해서 감소된 것이긴 하나, 유의적인 시그날이 얻어졌다 (도 5). 이러한 변화는 루프 대역에 중요한 항체 인식 부위가 존재하는데 기인한 것일 수 있다. 결론적으로, 변형된 CI-2A를 디스플레이하는 파지 입자가 pFAB60/CI-2A 함유 파지 입자에 대해 얻어진 것에 필적할 만한 시그날을 생산했다는 사실은 CI-2A가 루프 대역 중의 아미노산 조성과 독립적으로 디스플레이될 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 5
CI-2A 제공된 펩타이드 라이브러리의 구축
CI-2A의 루프 대역에 위치하는 아미노산의 교환을 용이하게 하기 위해, 사일런트 돌연변이에 의해 pCMVbipep/CI-2A 중의 CI-2A cDNA 내로 MunI 및 SalI에 대한 인식 부위를 도입해서 pCMVbipep/muCI-2A를 제조하였다 (실시예 1-e). 절단 부위의 존재는 비-PCR 기초 라이브러리 구축 공정을 가능케 한다. 이 공정에서는, 랜덤화 대역을 포함하는 합성 올리고가 MunI/SalI 부위 내로 클로닝 되기에 앞서 이중가닥 형태로 전환된다 (도 6). 이 공정을 이용해서 펩타이드 라이브러리를 제조하는 것이 적절한가의 여부를 소규모 접합 및 이어서 제한된 수의 랜덤하게 선택된 클론을 시퀀싱함으로써 테스트하였다. 시퀀싱된 클론 8개 모두가 랜덤 올리고의 삽입물을 함유하였으며 삽입물 어느것도 동일한 펩타이드를 코딩하지 않았다. 이는 이 전략을 이용하면 합성 올리고로부터 생물학적 활성 형태로의 변화의 전달이 가능함을 시사하는 것이다.
펩타이드 라이브러리 제조를 위해 MunI 부위를 이용하면 치환될 수 있는 CI-2A 중의 루프 대역 부분이 제한된다. 펩타이드 제공을 위한 완전한 루프 대역을 이용하기 위해서, pCMVbipep 중에 위치하는 보다 많은 5'-위치 BamHI 절단 부위를 이용함으로써 상보적인 펩타이드 라이브러리를 만드는 방안이 고려되었다. 이 경우, 랜덤화 대역을 함유하는 DNA 단편을 도 7에 개략된 바와 같이 PCR에 기초한 방법으로든 PCR에 기초하지 않은 방법으로든 합성하는 것이 가능하다. 이는 이론에 기초하여 정의된 랜덤화 대역의 5'-경계 (5'-border)를 가능케해준다.
이들 2가지 클로닝 전략을 결합시키면 펩타이드를 제공하는 방식으로 갈라지는 CI-2A 제공된 라이브러리를 구축하는 것이 가능하다. 이러한 서로다른 라이브러리들은 가능한 표적 분자와의 상호반응과 간련해서 서로서로를 보완해준다. 상이한 유형의 라이브러리를 스크리닝하면 따라서 동정된 가능한 표적 분자의 수를 증가시킬 수 있을 것이다.
실시예 6
CellScreenTM기술에 있어서 스캐폴드로서의 CI-2A에 관한 토론
실시예 2에서 입증된 바와 같이, CI-2A는 포유류 세포에서 기능적 형태로 발현될 수 있다. 따라서 스캐폴드로서 CI-2A를 이용하는 랜덤화 펩타이드 서열을 디스플레이하기 위한 기능성 시스템의 수립을 모색하는 것은 비교적 복잡하지 않다. CI-2A 스캐폴드를 세포의 상이한 구획에 지향시키기 위해, 여러가지 리더 서열들을 갖는 레트로바이러스 벡터들을 구축하였다. 실시예 3에 제시된 데이타는 CI-2A에대해 정의된 국소화가 얻어질 수 있음을 가리킨다. 특히 핵과 소포체는 전사 조절과 수용체 폴딩과 같은 몇몇 특이적인 반응이 일어나는 장소이다. 이러한 프로세서는 펩타이드 안타고니스트에 대한 명백한 표적들이다. 포유류 세포에서의 CI-2A에 대한 세포내 관용성과 핵 및 소포체로의 CI-2A의 전위 능력은, 소망될 경우, CI-2A가를 다른 구획과 세포네 소기관으로 표적화시킬 수 있을 것으로 추정하는 것을 합리화시켜준다.
CI-2A는 작고, 디설파이드 다리, 글리코실화 부위를 갖지 않고 코어 구조로부터 돌출된 8개의 아미노산 루프를 갖는다는 장점을 갖는 매우 안정한 단백질이다 (Macphalen C.A.외, (1983) J. Mol. Biol. 168, pp 445-447). CI-2A 중 Met40과 Glu41 (천연 분자의 Met59 및 Glu60에 해당) 사이에 7, 9, 11 및 13 잔기를 삽입하면 이 단백질의 안정성과 폴딩률에 최소한의 영향이 끼쳐지는 것으로 나타났다. 또한, CI-2A는 루프 대역에 위치하는 아미노산과는 무관하게, 이 단백질의 C-말단 영역 중의 핵심 잔기들의 상호반응을 통해 폴딩하는 것으로 밝혀졌다 (Osmark P. 외, (1993) Biochem. 32, 11007-11014, Ladurner A.G. 및 Fersht A. R (1997) J. Mol. Biol. 273, pp 330-337). 따라서 이 루프는 본 발명의 목적인 랜덤 잔기의 삽입에 적합한 것으로 보인다. 실시예 4에서 설명된 바와 같이, 루프 대역 내의 4개의 아미노산을 19-mer의 랜덤하게 구성된 펩타이드로 치환해도 이 변형된 CI-2A가 파지 표면 상에 디스플레이될 수 있는 능력에는 이렇다할 영향이 미쳐지지 않았다. 이 결과는 CI-2A 코어 구조의 폴딩이 루프 대역의 크기와 그의 아미노산 서열과 무관함을 나타내는 이전의 데이타와 연관된 것이다.
본 발명의 한가지 중요한 특징은 펩타이드들을 포유류 세포 내에서 발휘되는 생물학적 활성에 기초해서 선별한다는 것이다. 이는 적용된 스캐폴드의 안정성이 디설파이드 다리 형성과 무관하여야 함을 암시하는 것이다. CI-2A 구조 내에는 디설파이드 다리가 존재하지 않으므로 CI-2A의 안정성과 폴딩률은 용매의 산화환원 전위에 독립적이어야 한다. 포유류 세포로부터의 활성 CI-2A의 추출은 CellScreenTM스캐폴드에 있어서, CI-2A가 주요한 요구사항인 세포내 환경에서 천연적인 구조를 채택할 수 있음을 시사하는 것이다.
N-말단의 19개 아미노산 잔기는 CI-2A의 폴딩에 있어서 어떠한 알려진 기능도 갖지 않는다 (De Prat Gay G. 외 (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. 91, pp 10943-10946 및 본문의 참조문헌 등). 이들은 스크리닝 및 표적 분리시 비특이적인 상호반응을 수행할 수 있을 가능성이 있으므로 본 발명자들은 CI-2A의 보다 짧은 64 잔기 버젼을 이용하기로 결정했다. 또한, 제한된 크기는 가능한 표적의 수를 증가시키는 결합 포켓에 대한 펩타이드/CI-2A 단백질의 접근가능성을 증가시키고 이에 따라 펩타이드 안타고니스트의 분리가능성도 증가된다.
CI-2A의 파지 입자의 표면서의 노출능력은 실시예 4에 제시된 데이타에 의해 명백히 입증되었다. 파지 디스플레이 기술은 여하한 고정된 성분(들)과 상호반응하는 펩타이드의 선별을 가능케해준다. 이것은 조질의 세포 추출물, 막 함유 수용체 또는 그의 활성에 대응해서 펩타이드 안타고니스트가 소망되는 부분적으로 정제된 물질일 수 있다. 현재, 포유류 세포와 파지 입자의 물리적인 크기가 상이함으로 해서 파지 디스플레이에 의해 보다 높은 다양성이 조작가능하다. 잠재적인 표적 분자와 상호작용할 수 있는 펩타이드만을 함유하는 풀로 펩타이드 라이브러리를 감소시킴으로써 세포 내부에서 조작될 필요가 있는 실제적인 다양성을 크게 감소시킬 수 있다.
선별된 세포로부터 CI-2A 스캐폴드를 분리하기 위해 - 그에 따라 그것이 결합하는 표적 분자를 분리하기 위해 - 펩타이드 택을 절단형 CI-2A의 N-말단에 융합시킨다. 본 발명자들은 현재 다음의 택을 고려하고 있다: His-tag, Strep-tag 또는 FLAG-tag. 그러나, 항 CI-2A 항체를 이용한 공-면역침전법도 이용될 수 있다. 다른 한편, 생화학적 방법에 더해, 선별된 펩타이드와 상호반응하는 표적을 동정할 수 있을 것이다. 선별된 펩타이드와 상호반응하는 표적을 동정하기 위해 효모 또는 포유류의 2- 또는 3가지 하이브리드 시스템과 같은 유전학적 접근방식이 적용될 것이다.

Claims (59)

  1. (a) 각각의 발현 벡터들이, 표적 효소 활성을 조절하는 모(parent) 펩타이드 또는 모 리보핵산을 코딩하는 모 뉴클레오타이드 서열로부터 유도된 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열의 라이브러리의 적어도 한 구성원을 함유하는 것인, 발현 벡터들의 풀을 제조하고,
    (b) 실질적으로 동일한 세포들의 집단을 상기 풀의 상기 벡터들을 이용해서 형질전환시킴으로써 형질전환된 세포들을 얻고, 여기서 상기 실질적으로 동일한 세포들은 표적 세포를 포함하는 세포들이며,
    (c) 상기 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열의 발현을 용이하게 하는 조건 하에서 상기 형질전환된 세포들을 배양하고,
    (d) 상기 형질전환된 세포들을 검사해서 표적 효소의 활성이 조절된 형질전환 세포(들)을 분리해 낸 다음,
    (e) 상기 (d) 단계에서 분리된 세포(들) 중에 존재하는 상기 벡터의 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열을 결정함으로써/또는 상기 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 발현 산물의 아미노산 서열 또는 리보핵산 서열을 결정함으로써 모듈레이터를 동정하는 단계를 포함하여 구성되는, 표적 효소 활성의 생체내 활성적인 모듈레이터를 동정하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열이 1) 모 뉴클레오타이드 서열의 불변부, 및 2) 랜덤 뉴클레오타이드로 구성된 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 모 뉴클레오타이드 서열의 불변부가 상기 폴리펩타이드 단편 또는 리보핵산 단편을 안정화시키는 역할을 하는 모 펩타이드 또는 모 리보핵산의 스캐폴드 부분을 코딩하는 것인 방법.
  4. (a) 각각의 발현 벡터들이 공지된 효소의 활성을 생체내 조절하는 모(parent) 펩타이드 또는 모 리보핵산을 코딩하는 모 뉴클레오타이드 서열로부터 유도된 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열의 라이브러리로부터의 적어도 한 구성원을 함유하는 것인, 발현 벡터들의 풀을 제조하고, 여기서, 상기 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열은 다음을 포함하는 것이며,
    - 모 펩타이드 또는 모 리보핵산의 스캐폴드 부분을 코딩하는 불변부, 상기 스캐폴드 부분은 상기 폴리펩타이드 단편 또는 리보핵산 단편을 안정화시키는 역할을 함; 및
    - 랜덤 뉴클레오타이드
    (b) 실질적으로 동일한 세포들을 상기 풀의 상기 벡터들을 이용해서 형질전환시킴으로써 형질전환된 세포들을 얻고,
    (c) 상기 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열의 발현을 용이하게 하는 조건 하에서 상기 형질전환된 세포들을 배양하고,
    (d) 상기 형질전환된 세포들을 검사하여, 미리 선별된 표현형 특성이 조절됨으로 해서 상기 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열의 발현 산물이 생물학적으로 활성적인 형질전환들 세포(들)을 분리해 낸 다음,
    (e) 상기 (d) 단계에서 분리된 세포(들) 중에 존재하는 상기 벡터의 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열을 결정함으로써/또는 상기 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된 발현 산물의 아미노산 서열 또는 리보핵산 서열을 결정함으로써 모듈레이터를 동정하는 단계들을 포함하여 구성되는, 세포 중에서 생체내 표현형 특성을 검출가능하게 조절시킬 수 있는 생물학적 활성 폴리펩타이드 단편 또는 리보핵산 단편의 형태의 모듈레이터를 동정하는 방법
  5. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 실제로 동일한 세포가 원핵 세포인 방법.
  6. 제 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 실제로 동일한 세포가 진핵 세포인 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 진핵 세포가 진균 세포, 원생동물 세포, 동물 세포 및 식물 세포 중에서 선택되는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 동물 세포가 포유류 세포, 곤충 세포와 같은 절족동물 세포, 조류 세포, 및 어류 세포 중에서 선택되는 방법.
  9. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, (d) 단계에서 검사된 형질전환된 세포들이 주로 벡터의 단일 복제물을 지니는 것인 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 세포들이 주로 상기 풀로부터의 단일 벡터에 의해 형질전환되거나 대부분 형질전환되도록 하는 조건 하에서 상기 형질전환 단계 (b)를 수행하거나 또는 (d) 단계를 수행하기에 앞서, 상기 풀로부터의 두가지 이상의 벡터로 형질전환된 세포들은 그 이후의 단계에서 실질적으로 배제시키는 방법.
  11. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 모듈레이터가 펩타이드인 방법.
  12. 제 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 모듈레이터가 RNA 단편과 같은 핵산 단편인 방법.
  13. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 모듈레이터가 단백질 분해 공격에 대해 안정하고/또는 환원 분위기에 대해 민감하지 않은 방법.
  14. 제 2항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 모 펩타이드 또는 모 리보핵산의 활성 부위(들)을 코딩하는 모 뉴클레오타이드 서열의 부분(들) 내로, 또는 활성 부위(들)을 간섭하는 구조(들)을 코딩하는 부분(들) 내로 랜덤 뉴클레오타이드들을도입하는 방법.
  15. 제 2항 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열의 불변부가 안정성을 유지하는데 충분한 모 펩타이드 또는 모 리보핵산의 절단 부분 (truncated parts)을 코딩하는 방법.
  16. 제 2항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 모 뉴클레오타이드 서열의 불변부가 디설파이드 다리가 없는 펩타이드를 코딩하는 방법.
  17. 제 2항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 모 뉴클레오타이드 서열의 불변부가 디설파이드 다리를 갖는 펩타이드를 코딩하는 방법.
  18. 제 2항 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 랜덤 뉴클레오타이드가 모 뉴클레오타이드 서열 내로 삽입 또는 치환 형태로 도입되고 이 때 모 뉴클레오타이드 서열의 결실(들)이 임의로 수반되는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 도입된 랜덤 뉴클레오타이드의 수가 3 내지 약 100개 범위인 방법.
  20. 제 2항 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서, 랜덤 뉴클레오타이드가 뉴클레오타이드 서열이고/또는 모 뉴클레오타이드 서열 중의 특정 부위에 도입된 단일의 랜덤 뉴클레오타이드인 방법.
  21. 제 2항 내지 20항 중 어느 한 항에 있어서, 랜덤 뉴클레오타이드가 다음중에서 선택되는 방법:
    - 합성된 완전히 랜덤한 데옥시리보뉴클레오타이드;
    - 이용가능한 서열의 수를 제한하고/또는 바람직하지 못한 종결 코돈을 회피하고/또는 발현된 펩타이드(들)의 후-번역적 변형의 도입을 용이하게 하기 위해 몇몇 뉴클레오타이드의 랜덤화가 제한되어 있는 합성된 랜덤 DNA 서열;
    - 정제 택 (tag)을 코딩하는 서열에 커플링된 (1) 또는 (2)와 같은 합성된 랜덤 DNA 서열; 및
    - 항원에 대한 면역 적격 (immune-competent) 세포의 라이브러리로부터 분리된 CDR 코딩 뉴클레오타이드 서열.
  22. 제 21항에 있어서, CDR 코딩 뉴클레오타이드 서열이 CDR-3 펩타이드 서열을 코딩하는 방법.
  23. 제 20항 내지 22항 중 어느 한 항에 있어서, 정의된 DNA 코돈이 랜덤한 순서로 합성되는 랜덤 코톤 합성법에 의해 랜덤 뉴클레오타이드를 제조하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 합성된 코돈의 상대적인 양이, 코딩된 모든 아미노산이 코딩된 모든 폴리펩타이드 단편 내에서 실제로 동일한 빈도로 존재하도록 하게 해주는 양인 방법.
  25. 제 2항 내지 24항 중 어느 한 항에 있어서, 랜덤 뉴클레오타이드가 위치 지향된 PCR-매개 돌연변이의 원리에 의해 발현 벡터 내로 도입되는 방법.
  26. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내에서 모듈레이터가 적어도 하나의 기질에 대한 표적 효소의 KN값을 감소 또는 증가시키는 방법.
  27. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내에서 모듈레이터가 적어도 하나의 기질에 대한 표적 효소의 Vnax값을 감소 또는 증가시키는 방법.
  28. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 모 펩타이드 또는 모 리보핵산이 표적 효소 활성 억제제인 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 억제제가 BPTI/Knitz족 프로테아제 억제제, 세르핀족 프로테아제 억제제, Kaza족 프로테아제 억제제, 대두 트립신 억제제 (Kunitz)족 프로테아제 억제제, 감자 억제제 I족 구성원, Bowman-Birk족 프로테아제 억제제, 스쿼시 억제제족 구성원, wap-형 '4-디설파이드 코어' 프로테이나제 억제제, 히루딘족 프로테아제 억제제, 팩터 Xa 억제제, Ascaris 트립신 억제제족 구성원, 시스타틴족 프로테아제 억제제, 칼파인족 시스테인 프로테아제 억제제, 메탈로프로테이나제족 구성원의 조직 억제제, 카르복시펩티다제 A 억제제, 메탈로카르복시펩티다제 억제제, 안지오텐신-전환 효소 억제제, 곡물의 알파-아밀라제/트립신 억제제족 구성원, 타우마틴과 동족적인 알파-아밀라제/트립신 억제제, 알파/아밀라제/서브틸리신 억제제족 구성원, 곤충의 알파-아밀라제 억제제, Streptomyces종으로부터 유도된 포유류의 알파-아밀라제 억제제, 트레할라제 억제제, 폴리갈락투로나제 억제제, 퓨코실트랜스페라제 억제제, 단백질 키나제 C 억제제, cAMP-의존성 단백질 키나제 억제제, 시클릭 뉴클레오타이드 포스포디에스터라제 억제제, 단백질 포스파타제 억제제, TCD/MRS6족 GDP 해리 억제제, ATPase 억제제, 포스포리파제 A2 억제 단백질, 리보뉴클리아제 억제제, RNA 폴리머라제 억제제, DNA 엔트리 뉴클리아제 억제제, 및 베타-락타마제 억제제 중에서 선택되는 방법.
  30. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 실제로 동일한 세포가 포유류 세포이고 벡터는 레트로바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 (AAV: adeno associated virus) 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV: herpes simplex virus) 벡터, 알파 바이러스 벡터 또는 셈리키 포레스트 바이러스 (semliki forest virus) 벡터 중에서 선택되는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 벡터가 레트로바이러스계인 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 이종의 시스-작용 엘리먼트에 의해 임의로 변형된, 조류의 백혈병-육종 바이러스 (ALSV: Avian Leukosis-Sarcoma Virus), 포유류 타잎 C, 포유류 타잎 B, 및 렌티바이러스 (Lentivirus) 중에서 선택된 레트로바이러스로부터 유도된 것인 방법.
  33. 제 31항 또는 제 32항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 동일하지 않은 말단 (non-identical ends)을 함유하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 동일하지 않은 말단이 동일하지 않은 프로모터를 함유하는 방법.
  35. 제 31항 내지 34항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 CMV 프로모터, RSV 프로모터, SV-40 프로모터, TK 프로모터, MT 프로모터, 또는 Tet 또는 엑디손 (Ecdysone)과 같은 유도가능한 시스템과 같이 5'-LTR 중에서 바이러스 프로모터를 대체하는 이종의 프로모터를 함유하는 방법.
  36. 제 31항 내지 35항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 단계가
    1) 적절한 패키징 세포를, 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고상기 패키징 세포에 의해 생산되는 비리온 내로 통합가능한 벡터로 형질전환시키고,
    2) 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 비리온의 패키징 세포에 의한 생산을 용이하게 하는 조건 하에서 배양 배지에서 상기 형질전환된 패키징 세포를 배양한 다음,
    3) 상기 비리온을 회수하고 임의로 농축시켜서
    4) 상기 실제로 동일한 세포들을 비리온으로 형질도입시킴으로써 수행되는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 패키징 세포가 PE501, Bosc23, Ψ2, GP+E86, PhoenixEco, PA317, GP+AM12, DA(ampho), Bing, FLYA13, Propak, CRIP, ΨAM, Phonix-Ampho, PG13, H9 (293GPG), 및 EcoPack 중에서 선택되는 방법.
  38. 제 31항 내지 37항 중 어느 한 항에 있어서, 비리온은 생산된 비리온에게 광범위한 영양요구성을 부여해주도록, 환경영양성 패키징 세포주에 의해 생산된 슈도타이핑된 레트로이러스이거나, 또는 환경영양성 비리온에 의한 형질도입이 가능하도록, 실제로 동일한 세포 내로 환경영양성 수용체가 도입된 방법.
  39. 제 38항에 있어서, 환경영양성 수용체가 형질도입 수단에 의해 실제로 동일한 세포내로 도입된 방법.
  40. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열이 적어도 하나의 융합 파트너를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 커플링되는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 융합 파트너가 발현 및/또는 정제/분리 및/또는 발현 산물의 추가적인 안정화를 용이하게 해주는 역할을 하는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 융합 파트너가 His6 tag, myc tag, BirA의, BSP 바이오티닐화 표적 서열, flu tag, lac Z 및 GST와 같은 정제 택을 포함하는 방법.
  43. 제 40항 또는 41항에 있어서, 융합 파트너가 소팅 (sorting) 시그날 또는 표적화 서열인 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 소팅 시그날이 시그날 패치 또는 시그날 펩타이드인 방법.
  45. 제 43항 또는 44항에 있어서, 소팅 시그날이 발현된 펩타이드를 세포외로 또는 세포막 내로 배출시키거나, 또는 실제로 동일한 세포가 진핵세포인 경우, 소포체 내로, 골지체 내로, 라이소좀 내로, 분비낭 내로, 미토콘드리아 내로, 퍼옥시좀 내로, 또는 핵 내로 배출시키는 방법.
  46. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서, 동정된 모듈레이터의 3-차원 구조를 규명하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  47. 제 1항 내지 46항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의한 모듈레이터의 동정 단계와 다음의 단계, 즉
    i) 모듈레이터를 코딩하는 핵산 서열을 분리 또는 합성하고
    ii) 5'-3' 방향으로 작동가능한 결합으로, 1) 핵산 서열의 발현을 추진하기 위한 프로모터, 2) 임의로 리더 펩티드를 코딩하는 뉴클레오타이드, 3) 핵산 서열 및 4) 임의로 종결 시그날을 함유하는 오페론을 함유하는 복제가능한 발현 벡터를 엔지니어링하는 단계를 포함하여 구성되는, 복제가능한 발현 벡터의 제조방법.
  48. 제 47항에 따라 제조된 발현 벡터로 적당한 숙주 세포를 형질전환시키는 다단계를 포함하는, 제 1항 내지 46항 중 어느 한항에서 정의된 모듈레이터를 코딩하는 핵산 서열을 갖는 형질전환된 세포의 제조방법.
  49. I) 랜덤하게 변형된 뉴클레오타이드 서열에 의한 발현을 용이하게 해주는 조건 하에서 제 48항의 방법에 따라 제조된 형질전환된 세포를 배양 배지 중에서 배양하고,
    II) 세포 및/또는 배양 배지로부터의 발현 산물을 수확하거나, 또는
    Ia) 제 1항 내지 46항 중 어느 한 항의 방법에 따른 모듈레이터를 동정한 다음,
    Ib) (e) 단계에서 결정된 서열에 기초해서 화학합성 수단에 의해 모듈레이터를 합성하는 단계를 포함하여 구성되는, 제 1항 내지 46항 중 어느 한항에서 정의된 바와 같은 모듈레이터를 제공하는 방법.
  50. 제 49항의 방법에 따라 모듈레이터를 제공한 다음, 친화 정제 단계에서 친화 리간드로서 상기 모듈레이터를 사용함으로써 적절한 샘플로부터 표적 바이오분자를 분리하는 단계를 포함하여 구성되는, 표적 바이오분자의 분리 및/또는 동정 방법.
  51. 제 50항에 있어서, 친화 정제 단계가 친화 크로마토그래피 단계, 친화 질량 스펙트로메트리 단계, 또는 공-면역침전 단계인 방법.
  52. 제 48항의 방법에 따라 펩타이드 모듈레이터를 제공한 다음, 실제로 동일한 세포로부터 유도된 cDNA 라이브러리에 대한 프로브로서 상기 모듈레이터를 사용하거나 또는 2중- 또는 3중- 하이브리드 시스템에서 베이트 (bait)로서 모듈레이터를 사용하는 단계를 포함하여 구성되는 표적 바이오분자의 분리 및/또는 동정방법.
  53. 제 50항 내지 52항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 바이오분자가 펩타이드 또는 핵산인 방법.
  54. 제 53항에 있어서, 펩타이드의 아미노산 서열을 결정하거나 또는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  55. 제 50항 내지 54항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 바이오분자의 3차원 구조를 규명하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  56. - 제 50항 내지 55항 중 어느 한 항의 방법에 따라 de novo 분리된 표적 바이오분자와 상호반응하는 화학적 화합물의 라이브러리를 분석하고,
    - 표적 바이오분자와 현저하게 상호반응하는 화합물들을 선별하는 단계를 포함하여 구성되는, 약물 개발시 잠정적인 약물 후보로서의 화학적 화합물을 선별하는 방법.
  57. 제 56항에 있어서, 구조에 기초한 또는 구조에 기초하지 않은 컴퓨터 약물 모델링에 의해 라이브러리의 구성원을 초기 동정할 때, 화학 합성에 의해 화학적 화합물의 라이브러리를 제공하는 방법.
  58. A) 제 56항 또는 57항에 따른 방법에 의해 화학적 화합물을 선별하고
    B) 그 화학적 화합물의 의약 제품으로서의 적합성을 조사하기 위해 그 화합물에 대해 전-임상적 테스트를 수행하고,
    C) 상기 화학적 화합물이 (B)단계에서 적합한 것으로 고려될 경우, 상기 선도 화합물을 약학적 활성 물질로서 포함하는 의약 제품에 대한 시판 허가를 얻기 위해 상기 화학적 화합물을 이용한 임상 시도에 들어간 다음,
    D) 시판 허가가 떨어지면, 상기 화학적 화합물을 약학적으로 허용되는 담쳬, 부형제 또는 희석제와 혼합하여 이렇게 얻어진 의약 제품을 판매하는 단계를 포함하여 구성되는, 의약 제품의 제조방법.
  59. 제 1항 내지 46항 중 어느 한 항의 방법에 따라 동정된 모듈레이터가 약물 개발상에서 선도 화합물 역할을 하거나 또는 제 50항 내지 55항 중 어느 한 항에 따라 분리/동정된 표적 바이오분자가 약물 개발상에서 잠정적인 약물 후보 동정을 위한 상호반응 프로브 역할을 하는, 의약 제품의 개발방법.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6455247B1 (en) 1996-01-23 2002-09-24 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for screening for transdominant effector peptides and RNA molecules
US6365344B1 (en) 1996-01-23 2002-04-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for screening for transdominant effector peptides and RNA molecules
AU2001234980A1 (en) 2000-02-09 2001-08-20 Genvec, Inc. Methods of preparing and using a viral vector library
CA2439303A1 (en) * 2001-02-22 2002-09-06 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Methods for identifying peptides which modulate a biological process
US6872544B2 (en) 2001-09-25 2005-03-29 Kemin Consumer Care, L.C. Raw material selection and analysis for the isolation of proteinase inhibitor II from whole potatoes
JP4834554B2 (ja) 2003-11-06 2011-12-14 ジェネンコー・インターナショナル・インク 糸状菌におけるプロテアーゼ抑制剤及びその変異体の発現
WO2005046710A2 (en) * 2003-11-06 2005-05-26 Genencor International, Inc. Tgf-beta binding and supported peptides
WO2006131749A2 (en) * 2005-06-10 2006-12-14 Medical Research Council Scaffold
US8043830B2 (en) * 2008-02-01 2011-10-25 The Regents Of The University Of California Biotin-ligase system for secretion of biotinylated protein
CA2740197A1 (en) * 2008-10-15 2010-04-22 Danisco Us Inc. Modified variant bowman birk protease inhibitors
US7772181B2 (en) 2008-10-15 2010-08-10 Danisco Us Inc. Personal care compositions comprising modified variant Bowman Birk Protease Inhibitors
US7803902B2 (en) 2008-10-15 2010-09-28 Danisco Us Inc. Modified variant bowman birk protease inhibitors
CN103808945B (zh) * 2014-03-12 2016-02-10 山东农业大学 一种j亚群禽白血病免疫胶体金抗体检测试纸条
US10876109B2 (en) 2015-04-24 2020-12-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods of identifying biologically active random peptides in prokaryotic cells and libraries of prokaryotic cells expressing candidate biologically active random peptides
US10801023B2 (en) * 2015-04-24 2020-10-13 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods of identifying biologically active random peptides in plants and libraries of plants expressing candidate biologically active random peptides
WO2016172445A2 (en) * 2015-04-24 2016-10-27 The University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods of identifying biologically active random peptides in plants and libraries of plants expressing candidate biologically active random peptides

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2222879A1 (en) * 1995-06-02 1996-12-05 M&E Biotech A/S A method for identification of biologically active peptides and nucleic acids
US6455247B1 (en) * 1996-01-23 2002-09-24 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for screening for transdominant effector peptides and RNA molecules
WO1998032880A1 (en) * 1997-01-23 1998-07-30 Immusol Incorporated Gene functional analysis and discovery using randomized or target-specific ribozyme gene vector libraries

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