EA003637B1 - Новые способы идентификации биомолекул лигандов и мишеней - Google Patents

Abstract

Данное изобретение обеспечивает способы идентификации биологически активных биомолекул. В одном аспекте, биологически активную биомолекулу, такую как РНК или пептид, идентифицируют включением случайных нуклеотидных последовательностей в каркас, состоящий из модулятора активности фермента, трансфоромацией существенно идентичных клеток полученной таким образом конструкцией и скринингом трансформированных клеток для идентификации клеток, в которых был изменен предварительно выбранный фенотипический признак. Затем из фенотипически измененных клеток выделяют рандомизированную ДНК и определяют пептид и/или РНК, кодируемые этой случайной последовательностью. В свою очередь, идентифицируют партнеры взаимодействия, которые являются возможными лекарственными средствами-мишенями, и выделяют их с использованием указанных пептида и/или РНК в качестве части аффинных реагентов. Предпочтительную каркасную молекулу получают из семейства ингибиторов протеаз ингибиторов I картофеля, примером которых является ингибитор трипсина 2А ячменя (CI-2A). Другой аспект относится к идентификации новых ингибиторов ферментов с использованием по существу того же самого подхода, но с проведением специфического скрининга на изменения в активности фермента-мишени. Описаны также способы получения соответствующих трансформирующих и экспрессирующих векторов, а также способы идентификации соединений-примеров и лекарственных средств-мишеней для применения в разработке лекарственных средств. Наконец, данное изобретение включает также в свой объем способ получения лекарственного продукта.

Description

Область изобретения

Данное изобретение относится к новому способу идентификации/получения пептидов или рибонуклеиновых кислот, способных модулировать активность ίη νίνο ферментовмишеней в эукариотических клетках. Более конкретно, данное изобретение не обеспечивает способ идентификации/получения неизвестных до настоящего времени активаторов, а также ингибиторов активности ферментов ίη νίνο в эукариотических клетках. Кроме того, данное изобретение относится к способам идентификации неизвестных взаимодействий (т.е. идентификации мишени и/или лиганда, но также неизвестных до настоящего времени взаимодействий между известными лигандами и известными мишенями). Эти новые способы используют структуры ингибиторов ферментов в качестве каркасов для внутриклеточного представления потенциально биологически активных пептидов или рибонуклеиновых кислот в стабильной форме. Здесь описаны также способы получения неизвестных до сих пор лигандов или мишеней, а также способы получения векторов и трансформированных клеток, несущих генетическую трансформацию, кодирующую эти лиганды и мишени. Наконец, данное изобретение относится к способу получения медицинского продукта, который основан на первоначальной идентификации мишеней или лигандов в соответствии с данным изобретением.

Предпосылки изобретения

Способ Се118стееп™ является способом, который позволяет идентифицировать пептидные последовательности, имеющие биологическую активность ίη νίνο, и который описан в XVО 96/38553. Вкратце, библиотеки случайных пептидов экспрессируют внутриклеточно в эукариотических клетках (например, клетках млекопитающих) таким образом, что одна клетка экспрессирует один единственный или несколько гетерологичных коротких пептидов. Клетки, которые изменяют заранее выбранный фенотип при определенных условиях, могут быть выделены и, следовательно, пептид, который они экспрессируют, может быть идентифицирован. Внутримолекулярный компонент, с которым взаимодействует этот пептид, (молекуламишень), может быть затем получен с использованием, например, аффинных колонок, несущих иммобилизованный синтетический пептид.

Хотя технология Се118стееп™ проявила себя как многообещающая для идентификации новых лекарственных веществ-мишеней, присущей ей проблемой является то, что внутриклеточная среда является относительно враждебной для многих гетерологичных продуктов экспрессии. Другими словами, представляющие интерес пептиды или последовательности нуклеиновых кислот, которые потенциально способны взаимодействовать с важной молекулоймишенью, могут расщепляться или инактивиро ваться внутри клетки до того, как может быть обнаружено какое-либо влияние на фенотип.

Цель изобретения

Целью данного изобретения является обеспечение усовершенствований в технологии Се118стееп™ посредством преодоления вышеупомянутых проблем потенциальной нестабильности экспрессируемых последовательностей. Кроме того, целью данного изобретения является расширение применимости технологии Се118стееп™ для включения в нее также скрининга в прокариотических клетках.

Сущность изобретения

Было описано значительное количество модуляторов ферментативной активности растительного, микробного и эукариотического происхождения, см. ниже.

Поскольку многие природно встречающиеся процессы внутри клеток регулируются ферментами, авторы данного изобретения описывают здесь способ экспрессии больших внутриклеточных библиотек таких модуляторов ферментативной активности, в которых активный сайт указанных модуляторов ферментативной активности был изменен введением фрагментов рандомизированных аминокислотных последовательностей или введением случайных нуклеотидов в специфические участки в активном сайте. Это создает библиотеки возможных модуляторов, способных модулировать активность ряда различных ферментов внутри клеток. Путем экспрессии этих модуляторов в клеточных линиях в соответствии с новым вариантом технологии Се118стееп™ ферментативные регуляторные механизмы внутри индивидуальных клеток указанной клеточной линии будут подвергаться воздействию иначе, приводя к отличным фенотипическим свойствам, таким как, например, устойчивость к гипогликемии, убиванию цитокинами, токсическим соединениям, вирусной инфекции и т.д.

Основным преимуществом применения известных модуляторов ферментативной активности, таких как ингибиторы ферментов, в качестве молекулярных каркасов является то, что многие из них в их нативной форме являются стабильными во внутриклеточной среде. Проблемой использования, например, фрагментов антител в качестве каркасов для внутриклеточного представления случайных пептидов является то, что многие такие фрагменты антител являются чувствительными к протеолитической и восстанавливающей внутриклеточной среде и, следовательно, являются непригодными в качестве внутриклеточных каркасов. С другой стороны, модуляторы ферментативной активности могут, при тщательном конструировании, сохранять их внутриклеточную стабильность и в то же самое время включать в себя случайные последовательности, которые подвергают скринингу на биологическую активность. Кроме того, эффективность такого скрининга на биоло гически активные вещества будет более высокой, чем при использовании нестабильного каркаса (такого как, например, структура скрученной спирали) или вообще без использования каркаса, так как ни одна из рандомизированных последовательностей не будет расщепляться или только очень ограниченное число рандомизированных последовательностей будут расщепляться до того, как они проявят их действия на эти клетки. Наконец, большинство таких модуляторов ферментативной активности имеют активный сайт, который находится в нужном положении для модификации в молекуле, так как этот активный сайт обычно представлен в стабильной конфигурации в отношении данной окружающей среды.

Таким образом, один аспект данного изобретения относится к способу идентификации активного ίη νίνο модулятора активности фермента-мишени, причем этот способ предусматривает стадии (а) приготовления пула экспрессирующих векторов, причем каждый вектор указанного пула содержит, по меньшей мере, один член из библиотеки случайно модифицированных нуклеотидных последовательностей, происходящих из исходной нуклеотидной последовательности, кодирующей исходный пептид или исходную рибонуклеиновую кислоту, который модулирует активность ферментамишени, (Ь) трансформация популяции существенно идентичных клеток вышеуказанными векторами вышеуказанного пула таким образом, чтобы получить трансформированные клетки указанных существенно идентичных клеток, которые захватывают фермент-мишень, (с) культивирования указанных трансформированных клеток в условиях, облегчающих экспрессию указанных случайно модифицированных нуклеотидных последовательностей, (б) исследования указанных трансформированных клеток и выделения трансформированной клетки (клеток), в которых активность ферментамишени является модулированной, и (е) идентификации модулятора посредством определения указанной случайно модифицированной нуклеотидной последовательности указанного вектора, присутствующего в клетке (клетках), выделенных в стадии (б), и/или определения аминокислотной последовательности или последовательности рибонуклеиновой кислоты продукта экспрессии, кодируемого указанной случайно модифицированной нуклеотидной последовательностью.

В этом аспекте данного изобретения обычно предпочтительно, чтобы случайно модифицированная нуклеотидная последовательность состояла из 1) неизменяемой части исходной нуклеотидной последовательности и 2) случайных нуклеотидов. В соответствии с вышеописанным, неизменяемая часть исходной нуклеотидной последовательности предпочтительно кодирует каркасную часть исходного пептида или исходной рибонуклеиновой кислоты, которая служит для стабилизации указанного полипептидного фрагмента или фрагмента рибонуклеиновой кислоты.

Как упоминалось выше, применение в качестве каркасов модуляторов ферментов обеспечивает также экспрессию стабильных биологически активных модуляторов, которые взаимодействуют с другими биомолекулами, иными, чем ферменты. Другими словами, в тех случаях, когда случайные нуклеотиды встраивают в каркасную структуру, результатом будет стабильный продукт экспрессии, активность которого необязательно имеет что-либо общее с модулированием ферментативной активности.

Таким образом, другой частью данного изобретения является способ идентификации модулятора в форме биологически активного полипептидного фрагмента или фрагмента рибонуклеиновой кислоты, который способен определяемо модулировать, ίη νίνο, фенотипический признак в клетке, причем этот способ предусматривает стадии:

(a) приготовления пула экспрессирующих векторов, причем каждый вектор указанного пула содержит, по меньшей мере, один член из библиотеки случайно модифицированных нуклеотидных последовательностей, полученных из исходной нуклеотидной последовательности, кодирующей исходный пептид или исходную рибонуклеиновую кислоту, который модулирует ίη νίνο активность известного фермента, причем случайно модифицированные нуклеотидные последовательности включают в себя неизменяемую часть, кодирующую каркасную часть исходного пептида или исходной рибонуклеиновой кислоты, причем указанная каркасная часть служит для стабилизации указанного фрагмента полипептида или фрагмента рибонуклеиновой кислоты, и случайные нуклеотиды, (b) трансформации популяции существенно идентичных клеток указанными векторами указанного пула таким образом, чтобы получить трансформированные клетки, (c) культивирования указанных трансформированных клеток в условиях, облегчающих экспрессию указанных случайно модифицированных нуклеотидных последовательностей, (б) исследования указанных трансформированных клеток и выделения трансформированной клетки (клеток), в которых предварительно выбранный фенотипический признак модулирован присутствием экспрессируемой случайно модифицированной нуклеотидной последовательности, и (е) идентификации модулятора посредством определения указанной случайно модифицированной нуклеотидной последовательности указанного вектора, присутствующего в клетке (клетках), выделенных в стадии (б), и/или определения аминокислотной последовательности или последовательности рибонуклеиновой ки слоты продукта экспрессии, кодируемого указанной случайно модифицированной нуклеотидной последовательностью. Наконец, данное изобретение относится также к общему использованию внутриклеточно стабильных каркасных белков, рибонуклеотидов или их фрагментов для представления случайных последовательностей в технологии Се118сгееп™. Как упоминалось выше, хотя концепция использования каркасных молекул обсуждалась в прежнем уровне техники, нерешенный вопрос стабильности каркасной системы не исследовался детально.

Стабильность и применимость предполагаемого внутриклеточного каркаса зависит от ряда факторов. Прежде всего, важно, чтобы соответствующая клетка, в которой должен экспрессироваться данный каркас, была способна к экспрессии данной каркасной молекулы в функциональной форме; т.е. в прокариотических системах некоторые эукариотические белки не укладываются правильно, делая, следовательно, применение такого белка непригодным в качестве каркаса в этом типе клетки. Во-вторых, этот каркас должен быть относительно устойчивым в отношении восстанавливающей и каталитической среды внутри интактных клеток. Однако даже когда каркасная молекула является относительно чувствительной к инактивирующей природе внутриклеточной среды, это может быть исправлено, если скорость получения каркасной молекулы является достаточно высокой.

В устойчивом состоянии, внутриклеточная концентрация каркасной молекулы будет функцией, определяемой следующей формулой:

где Яр представляет собой скорость получения каркасной молекулы (моль-с^-1) и Κ,,ι представляет собой константу инактивации для каркасной молекулы (1-с^-1), т.е. скорость инактивации каркасной молекулы определяется δΜ

К1Сзса££о1<1 бь (что, в устойчивом состоянии, конечно, равно Я_р). Другими словами, при оценке пригодности потенциальной каркасной молекулы, в соответствии с данным изобретением, следует испытать, может ли данная молекула сохраняться при достаточно высокой концентрации внутри соответствующей клетки, в которой должен проводиться тест Се118сгееп™.

Таким образом, очень широкий аспект данного изобретения относится к способу идентификации модулятора в форме биологически активного полипептидного фрагмента или фрагмента рибонуклеиновой кислоты, который способен определяемо модулировать, ίη νίνο, фенотипический признак клетки, причем этот способ предусматривает стадии:

(a) приготовления пула экспрессирующих векторов, причем каждый вектор указанного пула содержит, по меньшей мере, один член из библиотеки случайно модифицированных нуклеотидных последовательностей, полученных их исходной нуклеотидной последовательности, кодирующей исходный пептид или исходную рибонуклеиновую кислоту, который является стабильным внутри клетки, причем случайно модифицированные нуклеотидные последовательности включают в себя неизменяемую часть, кодирующую каркасную часть исходного пептида или исходной рибонуклеиновой кислоты, причем указанная каркасная часть служит для стабилизации указанного фрагмента полипептида или фрагмента рибонуклеиновой кислоты, и случайные нуклеотиды, (b) трансформации популяции существенно идентичных клеток указанными векторами указанного пула таким образом, чтобы получить трансформированные клетки, (c) культивирования указанных трансформированных клеток в условиях, облегчающих экспрессию указанных случайно модифицированных нуклеотидных последовательностей, (б) исследования указанных трансформированных клеток и выделения трансформированной клетки (клеток), в которых предварительно выбранный фенотипический признак модулирован присутствием экспрессируемой случайно модифицированной нуклеотидной последовательности, и (е) идентификации модулятора посредством определения указанной случайно модифицированной нуклеотидной последовательности указанного вектора, присутствующего в клетке (клетках), выделенных в стадии (б), и/или определения аминокислотной последовательности или последовательности рибонуклеиновой кислоты продукта экспрессии, кодируемого указанной случайно модифицированной нуклеотидной последовательностью. В этом аспекте данного изобретения продукт экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует внутриклеточно стабильные исходный пептид или исходную рибонуклеиновую кислоту, при продуцировании, по существу, идентичными клетками, присутствует в эффективной концентрации и в функциональном состоянии.

Другими словами, существенно, чтобы пригодность данной каркасной молекулы оценивалась перед проведением стадий технологии Се118сгееп™, для того чтобы иметь подтверждение того, что данная каркасная молекула в немодифицированной форме может экспрессироваться и сохраняться при достаточно высокой концентрации/активности в данной клеточной системе, в которой должен осуществляться способ данного изобретения.

Согласно XVО 96/38553, выделение молекулы-мишени лекарственного средства может быть осуществлено более эффективно, если случайные пептидные последовательности встроены в более крупные полипептиды, функционирующие в качестве каркасов для представления случайных аминокислотных последовательностей. Такие каркасы, возможно, могли бы приводить к взаимодействию с более высокой аффинностью с молекулой-мишенью.

Однако ничего не упоминается об использовании каркасных молекул, произведенных из природно встречающихся белковых ингибиторов ферментов. Ингибирование ферментативной активности такими ингибиторами - в противоположность простому связыванию белкамишени внутри клетки, как предполагается в технологии Се118сгееп™ - является гораздо более эффективным путем для воздействия на внутриклеточные биохимические процессы.

Подробное описание изобретения Определения

Далее будет определен ряд терминов для целей данного описания.

Модулятор обозначает в данном контексте биомолекулу, которая при экспрессии ίη νίνο действует на активность другой биомолекулы в данной клетке. Таким образом, модулятор, по существу, может ингибировать или усиливать активность этой биомолекулы. Кроме того, модулятор может взаимодействовать непосредственно с этой биомолекулой, но может также оказывать непрямое действие, т.е. изменение активности биомолекулы может вызываться изменениями в комплексе биохимических механизмов клетки, изменениями, которые в конечном счете являются результатом присутствия продукта экспрессии рандомизированной последовательности нуклеиновой кислоты.

Случайно модифицированная нуклеотидная последовательность является последовательностью нуклеотидов, которая в ряде положений была подвергнута инсерции или замене нуклеотидами, природа которых не может быть предсказана. Во многих случаях встроенные случайные нуклеотиды или нуклеотидные последовательности будут полностью случайными (например, как следствие рандомизированного синтеза или ПЦР-опосредованного мутагенеза). Однако, как будет видно из приведенного ниже описания, эти случайные последовательности могут также включать в себя последовательности, которые имеют общий функциональный признак (например, реактивность с лигандом продукта экспрессии), или случайные последовательности могут быть случайными в том смысле, что конечный продукт экспрессии является совершенно случайной последовательностью, например, с равномерным распределением различных аминокислот.

Термин существенно идентичные клетки предназначен здесь для обозначения клеток, которые все обнаруживают специфический фенотипический признак таким образом, что из менение в экспрессии указанного признака в одной клетке, обусловленное взаимодействием, вызываемым введением случайных нуклеотидов в соответствии со способами данного изобретения, имеет место также в одной из других существенно идентичных клеток, если они были трансформированы тем же самым вектором. Другими словами, важным параметром для оценки при выборе существенно идентичных клеток в способах данного изобретения является определение, может ли наблюдаемое изменение в проявлении фенотипического признака быть принято как указание на то, что любая другая клетка в этой популяции вела бы себя таким же образом вследствие того же самого изменения. Таким образом, существенно идентичные клетки могут, например, быть клональными клетками или клетками клеточной линии или они могут быть клетками культуры клеток или культуры ткани.

Фенотипическим признаком является наблюдаемый результат определенного состава генов в клетке (генотипа), т. е. свойством клетки (детектируемым химическим, физическим, иммунологическим или другим подходящим способом), который зависит от присутствия одного или нескольких генов и скорости их экспрессии. Таким образом, фенотипический признак может быть любым из ряда различных свойств: активностью фермента, эффектами взаимодействия между рецепторами и лигандами, коэффициентом выживаемости клеток, присутствием или отсутствием антигена, скоростью экспрессии и т.д.

Пептид в данном контексте обозначает как короткие пептиды из 2-10 аминокислотных остатков, олигопептиды из 11-100 аминокислотных остатков, так и полипептиды из более, чем 100 аминокислотных остатков. Кроме того, этот термин включает в себя также белки, т. е. функциональные биомолекулы, содержащие, по меньшей мере, один полипептид; при наличии, по меньшей мере, двух полипептидов эти полипептиды могут образовывать комплексы, могут быть ковалентно связанными или могут быть нековалентно связанными. Полипептид (полипептиды) в белке могут быть гликозилированными и/или липидированными и/или содержать простетические группы.

При использовании термина биологически активная для обозначения молекулы в данном контексте подразумевается, что эта молекула проявляет определяемое действие на живых клетках, т. е. что эта молекула взаимодействует с биологией живой клетки таким образом, что производит эффект, который может распознаваться как изменение фенотипа этой клетки.

Термин ίη νίνο используется здесь для обозначения условий среды внутри живых клеток (т.е. клеток, которые являются метаболически активными и могут поддерживать их жизненно важные функции); живые клетки могут содержаться в культуре или могут присутствовать в природном микроокружении (например, функционируя как часть более крупного многоклеточного организма). Таким образом, термин ίη νίνο относится также к культивированию клеток ίη νίίτο, пока наблюдаемый эффект имеет место в живых клетках.

Трансформация: способ, при помощи которого генетический материал, содержащийся в отдельной клетке, изменяют включением экзогенной ДНК в ее геном.

Трансфекция: поглощение, включение и экспрессия рекомбинантной ДНК клетками.

Трансдукция: перенос генетической трансформации от одной клетки к другой при помощи вирусного вектора.

Термин эффективная часть при применении в контексте с белком, пептидом или рибонуклеиновой кислотой в данном контексте предназначен для обозначения части (например, подпоследовательности или, в случае η-мерного белка, менее-чем-п-мерной молекулы), которая сохраняет желательную функциональность нативной молекулы, из которой произведен данный белок или пептид. Например, в случае С12А, по-видимому, только укороченная форма этой молекулы является необходимой для обеспечения внутриклеточной экспрессии этого активного ингибитора, и, следовательно, укороченная форма этой молекулы составляет эффективную часть С1-2А; см. также примеры ниже.

Если нет иных указаний, нуклеотидные последовательности представлены здесь в направлении 5'^3', а аминокислотные последовательности представлены таким образом, что Νконец находится слева.

Общие свойства способа данного изобретения

В общем, описания в XVО 96/38553 и XVО 97/27212, относящиеся к получению рандомизированных последовательностей, к выбору партнеров слияния (за исключением выбора каркасных молекул) для случайных последовательностей, к выбору и составу нацеливающих последовательностей, к выбору нуклеиновых кислот, подлежащих случайной модификации, к выбору способа рандомизации, к способам введения нуклеиновых кислот в соответствующий тип клеток, к выбору (ретровирусных) векторов (когда это применимо), к способу получения этих векторов, к выбору промоторов, к выбору упаковывающих клеток (когда это применимо), к способам концентрирования инфекционных вирионов из упаковывающих клеток (когда это применимо), к выбору существенно идентичных клеток для применения в этом способе, к типу детектируемых фенотипических изменений, к способу, в котором такое изменение детектируется, к способам выделения фенотипически измененных клеток, к выделению и определению последовательности случайно модифицированных последовательностей, к выделению и характеристике мишени для рандомизированного продукта, к способам скрининга и к выбору применений этих способов, имеют также отношение к целям данного изобретения. Таким образом, описания этих двух патентных заявок включены здесь в качестве ссылки. Однако поскольку обе эти ссылки сфокусированы на использовании этого общего принципа в высших эукариотических клетках, в данном изобретении будут также подробно описаны варианты, касающиеся применения в прокариотических системах, см. ниже. Однако более общая часть двух вышеуказанных описаний, которые без какихлибо трудностей для специалистов могли бы быть применены в контексте прокариотической системы, рассматриваются также как относящаяся к данному изобретению и важным вариантам данного изобретения до тех пор, пока она относится к использованию способов в прокариотических системах.

Обычно является предпочтительным, чтобы трансформированная клетка, которая исследуется в стадии (ά), преимущественно несла (и экспрессировала) одну единственную копию вектора. Путем обеспечения этого, интерпретация изменения в фенотипе этих клеток становится более легкой задачей, тогда как интерпретация фенотипического изменения в клетках, экспрессирующих более одной единственной рандомизированной последовательности, делает неясным, какой из трансформирующих векторов является ответственным за это изменение.

Для гарантии того, что преимущественно один вектор трансформировал каждую из исследуемых клеток, пригодным способом является, например, то, что стадию трансформации (Ь) проводят при таких условиях, что трансформированные клетки являются преимущественно трансформированными или самое большее трансформированиям одним единственным вектором из указанного пула (это может быть достигнуто, например, коррекцией концентрации инфекционных вирионов в вариантах данного изобретения, где трансформацию осуществляют посредством трансдукции), или когда, перед проведением стадии (ά), клетки, трансформированные более чем одним вектором из указанного пула, по существу, исключают из последующих стадий. Эта последняя возможность требует, чтобы можно было определить количество трансформирующих векторов, и это может быть достигнуто включением определяемого маркера в продукт экспрессии, например, флуоресцентного зонда. Другой возможностью является повторный скрининг клеток, проявляющих изменения в фенотипе, с определением тем самым того, трансформирована ли данная клетка более чем одним вектором.

Должно быть понятно, что молекула, выбранная для того, чтобы служить в качестве каркасной молекулы, и в которую в конечном счете вводят случайные последовательности, может быть либо пептидной последовательно стью, либо последовательностью нуклеиновой кислоты, такой как РНК-фрагмент, соответсвующий (антисмысловым образом) мРНК, тРНК или рибозиму. Альтернативно, такой РНК-фрагмент мог бы сам проявлять рибозимную активность, оказывая тем самым непрямое действие на скорость экспрессии других ферментов. Во всяком случае, полученный продукт, т.е. продукт рандомизированной экспрессии, может быть пептидом или рибонуклеиновой кислотой, такой как рибозим.

Одним из важных признаков каркаса является, как упоминалось выше, то, что он является устойчивым к протеолитическому разрушению и/или нечувствительным к восстанавливающей среде, такой как среда, которая обнаруживается внутри клеток.

В предпочтительных вариантах данного изобретения случайные нуклеотиды вводят в часть (части) исходной нуклеотидной последовательности, которая кодирует (которые кодируют) активный сайт (сайты) исходного пептида или исходной рибонуклеиновой кислоты, или часть (части), которая кодирует (которые кодируют) структуру (структуры), блокирующие активный сайт (сайты). Как обсуждалось выше, активный сайт (так же как другие открытые структуры каркаса) должны быть стабильно представлены окружающей среде, чтобы они были способны взаимодействовать с другими биомолекулами. Таким образом, предпочтительно неизменяемая часть этой нуклеотидной последовательности кодирует части исходного пептида или исходной рибонуклеиновой кислоты, в достаточной степени укороченные для поддержания стабильности рандомизированного продукта.

В некоторых вариантах предпочтительно, чтобы неизменяемая часть исходной нуклеотидной последовательности кодировала пептид, который не содержит дисульфидных мостиков. Это обусловлено тем фактом, что дисульфидные мостики не образуются в ядре или в цитозоле. Таким образом, в случаях, когда каркас должен быть в функциональном состоянии, когда он присутствует в ядре или в цитозоле, было бы обычно предпочтительным использовать каркас, который не содержит дисульфидных мостиков или который не использует их для поддержания стабильности и функциональности. С другой стороны, в вариантах, в которых желательным является, чтобы рандомизированный продукт экспрессии был ограничен эндоплазматическим ретикулумом (ЭР) или другим компартментом, допускающим присутствие стабильных дисульфидных связей, перед тем как рандомизированная последовательность предоставляется окружению удовлетворительным образом, желательно, конечно, чтобы неизменяемая часть исходной нуклеотидной последовательности кодировала пептид, имеющий дисульфидные мостики, так как изменения, заключающиеся в об разовании правильно уложенного и функционального каркаса вне таких компартментов, являются относительно малыми.

Должно быть понятно, что случайные нуклеотиды вводят предпочтительно в форме инсерции (вставки) или замены в исходную нуклеотидную последовательность, необязательно в комбинации с делецией (делециями) в исходной нуклеотидной последовательности. Делетированные последовательности в исходном полипептиде могли бы быть, например, частями активного сайта, присутствие которых в неизмененной форме является токсичным или иным образом вредным для трансформированных клеток.

Число введенных случайных нуклеотидов может варьироваться в большой степени, но обычно это число находится между 3 и приблизительно 100. В этом диапазоне предпочтительно введение, по меньшей мере, 5, например, по меньшей мере, 7 или лучше, по меньшей мере, 9-12 случайных нуклеотидов. С другой стороны, предпочтительно вводить самое большее 90, например, самое большее 70-80 случайных нуклеотидов. Наиболее предпочтительное число вводимых рандомизированных нуклеотидов варьирует между 15-60, предпочтительно 20-55 или 25-50 нуклеотидами. Особенно предпочтительные количества случайных нуклеотидов равны 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 и 60 нуклеотидам.

Случайные нуклеотиды вводят в каркас в форме нуклеотидных последовательностей и/или в форме отдельных случайных нуклеотидов, вводимых в специфических сайтах в исходной нуклеотидной последовательности. Вариацией является замена части каркасной последовательности последовательностью, которая сохраняет части каркасной последовательности (например, части, которые являются незаменимыми для стабильности/функциональности), но в которой другие части являются рандомизированными.

Случайные нуклеотиды предпочтительно выбраны из группы, состоящей из синтетических, полностью случайных дезоксирибонуклеотидов; синтетических случайных ДНКпоследовательностей, в которых ограничение рандомизации некоторых нуклеотидов вводят таким образом, чтобы ограничить число доступных последовательностей и/или избежать нежелательных стоп-кодонов и/или облегчить введение посттрансляционных модификаций экспрессируемого пептида (пептидов); синтетических случайных ДНК-последовательностей, таких как описанные в (1) или (2), связанных с последовательностью, кодирующей метку для очистки, и - СЭР-кодирующих нуклеотидных последовательностей, выделенных из библиотеки иммунокомпетентных клеток, индуцирован ных против антигена (в этом варианте предпочтительно, чтобы СЭЯ-кодирующие нуклеотидные последовательности кодировали ί.ΌΒ-3пептидные последовательности).

Последний тип рандомизации фактически вводит ограничение случайности, которое гарантирует, что введенные последовательности кодируют узнающий антиген район. Однако хорошо известно, что поликлональный иммунный ответ против антигена состоит из большого числа иммунокомпетентных клеток, которые все взаимодействуют в одним и тем же антигеном (или, возможно, даже с одним и тем же эпитопом), но корреляцию между аминокислотными последовательностями этих СОЯ и узнаванием этого эпитопа (эпитопов) фактически невозможно установить.

Альтернативным путем введения ограничений на случайность последовательностей нуклеиновых кислот, которые в конечном счете тестируются в существенно идентичных клетках, является следующий путь: при приготовлении векторов их используют в 1-ом цикле фагового представления, где эти фаги, трансформированные этими векторами, подвергают пэннингу против библиотеки, содержащей выбранный лиганд. Что касается способа применения СЭЯкодирующих последовательностей, результатом является то, что эти последовательности, которые в конечном счете тестируют в существенно идентичных клетках, являются непредсказуемыми (и, следовательно, случайными), но тем не менее выбранными на основе функционального признака. Опять, отсутствие известной корреляции между последовательностями нуклеиновых кислот и взаимодействием в трехмерном пространстве между продуктом экспрессии и выбранным лигандом имеет следствием то, что тестируемая подгруппа последовательностей все еще является рандомизированной.

В особом варианте вышеуказанного способа, в котором способ данного изобретения комбинируют с фаговым представлением, обе тестсистемы повторяют чередующимся образом, т.е. чередованием между внутриклеточной экспрессией в существенно идентичных клетках и пэннингом фаговой библиотеки.

Для получения регулируемого распределения аминокислот в рандомизированных пептидах, когда модулятор является пептидом, практичным является получение случайных нуклеотидов случайным синтезом кодонов, где определенные кодоны ДНК синтезируются в случайном порядке; подробное описание этого принципа дается в νθ 96/38553, см. в нем пример 1. Предпочтительным вариантом в этом контексте является вариант, в котором относительное количество синтезированных кодонов гарантирует, что все кодируемые аминокислоты будут присутствовать по существу с одинаковой частотой во всех кодируемых полипептидных фрагментах, т.е. что шанс встречаемости одной специфической аминокислоты в пептиде библиотеки является, по существу, таким же, что и для любой другой кодируемой аминокислоты.

Для введения этих рандомизированных фрагментов в векторы, в соответствии с данным изобретением предпочтительно, чтобы эти случайные нуклеотиды вводились в экспрессирующий вектор по принципу сайтнаправленного ПЦР-опосредуемого мутагенеза. Однако квалифицированным специалистам известны и другие возможности, и, например, можно также встраивать в эти векторы библиотеки синтетических случайных последовательностей.

Кроме наличия рандомизированного фрагмента продукта экспрессии, вводимого в каркас в соответствии с данным изобретением, часто является необходимым связывание случайной последовательности с партнером слияния посредством слияния рандомизированной нуклеотидной последовательности с нукле-отидной последовательностью, кодирующей, по меньшей мере, один партнер слияния. Такой партнер слияния может, например, облегчать экспрессию и/или очистку/выделение и/или дополнительную стабилизацию продукта экспрессии.

Для целей очистки партнер слияния может включать в себя метку очистки, такую как Нй₆метка, тус-метка, последовательность-мишень биотинилирования В8Р. ВиА, Ди-метка, 1;κΖ и С8Т. Кроме того, партнер слияния может включать в себя сигнал сортинга или нацеливающую последовательность, см. обсуждения ниже.

В вариантах, в которых модулятор является сам модулятором ферментативной активности, теоретически возможно действовать как на К_м, так и/или на У_тах рассматриваемого фермента. Снижение К_м приводит к меньшей эффективности рассматриваемого фермента до тех пор, пока увеличенная концентрация субстрата требуется для получения 50% максимальной активности этого фермента. Увеличение К_м имеет противоположный эффект. Конечно, воздействие на фермент, которое влияет на У_тах, имеет следствием то, что максимальная возможная интенсивность активности фермента увеличивается (при увеличении У_тах) или уменьшается (при уменьшении У_тах). Во всяком случае, модулятор ферментативной активности будет давать фенотипическое проявление, что активность фермента либо ингибировалась, либо стимулировалась. В этом варианте предпочтительно, чтобы модулятор был ингибитором.

Когда способ данного изобретения приводит в конце концов к идентификации модулятора или его мишени, предпочтительным является установление 3-мерной структуры идентифицированного модулятора, так как это сделает возможными осуществление рационального скрининга лекарственных средств и способы компьютерного моделирования лекарственных средств.

Применение способов данного изобретения в прокариотических системах

Первоначально рассматриваемая технология, описанная в XVО 96/38553, фокусировалась на скрининге в отношении взаимодействий в эукариотических клетках. Однако эта технология применима также в прокариотических системах.

Например, ожидается, что данное изобретение сделает возможной идентификацию неизвестных до настоящего времени взаимодействий в патогенных бактериях, взаимодействий, которые будут применимы в процессе развития новых антибиотиков. Поскольку способы данного изобретения позволяют идентифицировать как новые лигандные пептиды, так и лигандные рибонуклеиновые кислоты, а также молекулымишени для этих лигандов, исследователь обеспечивается необходимыми инструментами для стимулирования компьютерного моделирования лекарственных средств и выполнения традиционного скрининга лекарственных средств, как только такие лиганды и/или мишени были идентифицированы/выделены.

Однако, кроме этого подхода идентификции антибактериальных эффектов и веществ, этот способ открывает доступ к усовершенствованиям промышленных ферментационных процессов. В таких случаях будет, например, возможно идентифицировать биомолекулы, которые являются важными в биохимических путях в молочно-кислых бактериях, и тем самым обеспечить инструменты для получения новых молочных продуктов, таких как сыр, йогурт и другие продукты ферментации молочно-кислых бактерий.

В некоторой степени близким этому подходу является использование способов данного изобретения в скрининге, проводимом на бактериальных культурах, используемых в процессах очистки. В области очистки, например, отработанной воды хорошо известно, что микробиологические культуры (активированный шлам), которые проводят деструкцию органического материала, являются относительно уязвимыми в случае изменений в среде, и, следовательно, обеспечение более сильных штаммов бактерий было бы одним из путей усовершенствования подобных систем. Альтернативно, способ данного изобретения позволил бы также индентификацию/выделение лигандов и мишеней в таких бактериях, которые, при взаимодействии с ними, могут приводить, например, к увеличенной эффективности в деструкции специфических органических или неорганических субстратов.

Таким образом, как должно быть понятно из вышесказанного, данное изобретение является высоко применимым в прокариотических системах.

Для целей применения способа данного изобретения в прокариотических клетках, пред почтительно, чтобы эти прокариотические клетки были бактериями, выбранными из группы, состоящей из ВасШиз зрр. (например, В. апШгаС18, В. зиЬййз и В. сегеиз), С1оз!пбшш зрр. (например, С. Ьо!ийпит, С. бййсйе, С. регГйпдепз и С. 1е1аш), СогупеЬас!егтт зрр. (например, С. б1рП(Нег1ае и С. руодепез), 8!арйу1ососсиз зрр. (например, 8. аигеиз и 8. а1Ь1сапз), 8!гер!ососсиз зрр. (например, 8. рйеитошае, 8. руодепез и 8. ада1асйае), ЕзсйейсЫа сой, 8еггайа тагсезсепз, К1еЬз1е11а зрр. (например, К. рпеитошае), Рго(еиз зрр. (например, Р. тлаЫйз), СйгоЬас!ег зрр. (например, СйгоЬас!ег Ггеипби), 8а1топе11а зрр. (например, 8. 1ур1и, 8. (урЫтипит, 8. зйойтий 1еп и 8. рага1ур1и), 8Ыде11а зрр. (например, 8. буз1еп1епае, 8. Пехпегг 8. Ьоубй и 8. зоппе1), Рзеиботопаз зрр. (например, Р. аегидтоза, Р. рзеибота11е1 и Р. та11е1), Асте!оЬас!ег зрр., Аеготопаз зрр., Р1езютопаз зрр., Уегзйиа зрр. (например, Υ. резйз, Υ. еп!егосоййса и Υ. рзеибо!иЬегси1оз1з), Ргапазейа 1и1агепз1з, У1Ьйо зрр. (например, V. сйо1егае и V. рагайаето1уйсиз), Сатру1оЬас!ег зрр. (например, С. )ещш и С. сой), НейсоЬас!ег ру1огу, Наеторййиз зрр. (например, Н. тПиеп/ае, Н. рагатПиепхае и Н. аедурйиз), Вогбе1е11а зрр. (например, В. рейизз1з, Ό. рагарепизз1з и В. ЬгопсЫзерйса), Вгисейа зрр., №1ззейа зрр. (например, N. доппогйоеае и N. тешпдй1б1з), Тгеропета раШбит, йерЮзрйа т!еггодапз; Воггейа зрр. (например, В. ЬигдбогГег1 зепзи з1пс1о, В. даппи, В. аГхеШ и В. гесиггепйз), Ьедюпейа рпеиторНПа, Ыз!ег1а топосу(одепез, МусоЬас!егтт зрр. (например, М. !иЬегси1оз1з, М. Ьоу1з, М. аГйсапит, М. капзазй и М. 1ергае), Тгеропета раШбит, СЫатуб1а !гасйотайз, Асйпотусез зрр., К1скейз1а зрр. и Мусор1азта зрр. (например, М. рпеитошае).

Этот перечень бактерий включает в себя, следовательно, семейства и виды бактерий, которые участвуют в патологии большого числа заболеваний человека. Из них для промышленной ферментации используются Е. сой и В. зиЬййз; это имеет также место для молочно-кислых бактерий, особенно йасЮсоссиз зрр. и йасЮЬасШиз зрр., и, следовательно, предпочтительно также проводить способы данного изобретения, при их использовании в бактериальных системах, на таких непатогенных видах.

При применении способов данного изобретения в прокариотической системе, очень часто представляет интерес идентификация клеток, которые имеют ослабленный рост или летально повреждаются вследствие присутствия гетерологичного продукта экспрессии в соответствии с данным изобретением. Однако это совершенно не вызывает проблем, так как основным фенотипическим признаком, связанным, например, со смертью бактерий, является отсутствие данной бактерии.

Таким образом, необходимо приспособить экспериментальную программу, которая позволит проводить идентификацию клеток, транс формированных таким образом, что они менее хорошо выживают, чем другие, в других отношениях соответствующие клетки. Одним их преимуществ является то, что экспрессия гетерологичного генетического материала находится под контролем индуцируемого промотора. Таким путем можно размножать колонии клеток, которые были трансформированы генетическим материалом, который при экспрессии является летальным или нарушающим рост для этих клеток. После этого, экспрессия может быть запущена и тщательное исследование размноженных колоний должно выявить те клональные колонии, которые не обнаруживают такого же характера роста, какой наблюдается, например, в нетрансформированном контроле.

Одним из способов для выполнения этого является распределение шпателем трансформированных клеток на чашках со средой для выращивания и оставление этих клеток расти до заранее заданного среднего размера. Распределение клеток должно быть таким, чтобы видимые образующиеся колонии состояли, как правило, из одного отдельного клона клеток. По достижении заданного размера колоний все чашки переносят блоттингом на среду-носитель таким образом, чтобы получить негатив каждой чашки с агаром. После этого индуцируют экспрессию встроенных случайных последовательностей и этим колониям дают опять расти. Чашки обследуют непрерывно или с подходящими интервалами (например, при помощи системы обработки данных цифрового изображения, хорошо известной специалистам). После этого идентифицируют те колонии, которые обнаруживают нарушенный или остановленный рост в сравнении с остальными колониями или с контролями, так как характер роста каждой колонии может быть прослежен автоматизированным путем. Затем эти колонии могут быть идентифицированы и выделены из блота-негатива, и после этого относительно простой процедурой является экстракция генетического материала и определение его последовательности.

В этом контексте, одной представляющей интерес возможностью выбора является превращение устойчивых к антибиотикам бактерий в неустойчивые. Среда для выращивания либо содержит рассматриваемый антибиотик, либо обогащается им во время культивирования, и колонии, которые при индуцировании экспрессии могут быть выявлены как менее устойчивые к лекарственному средству, чем контроли, исследуются далее. Могут быть также испытаны чистые бактерицидные/бактериостатические эффекты. В таком варианте, эти бактерии, например, культивируют в подходящей среде для выращивания. Те колонии, которые после индуцирования экспрессии обнаруживают доказательство пониженного или остановленного роста, исследуются далее: ожидается, что будет продемонстрировано, что некоторые из этих бактериальных клеток несут генетический материал, кодирующий продукт экспрессии, который взаимодействует с новыми (или известными) мишенями для антибактериальных агентов.

Другим, представляющим интерес, фенотипическим признаком является, конечно, превосходящее выживание клеток. В случае применяемых бактерий, представляет интерес идентифицировать мишени, которые будут увеличивать коэффициент выживаемости этих бактерий. Например, бактерии, применяемые в промышленных ферментациях, обычно могут летально повреждаться вследствие их собственного неконтролируемого продуцирования гетерологичных продуктов экспрессии. Если могут быть идентифицированы гены или молекулымишени, которые оказывают положительное действие на выживание таких бактерий, экономический потенциал является огромным, поскольку процесс ферментации будет более экономичным (меньшая необходимость запуска новых ферментации). Подобным образом, бактерии, используемые, например, в очистке сточных вод, могут быть сделаны более устойчивыми к токсичным агентам в их окружающей среде.

Построение эксперимента в этом контексте является относительно простым: трансформированные бактерии просто подвергают потенциально летальным условиям, и только колонии, которые обнаруживают лучшее выживание, выделяют и обследуют (и это в типичном случае будут колонии, которые являются детектируемыми). Таким образом, построение эксперимента, подобное описанному выше для идентификации смерти клеток, не является необходимым.

Наконец, большой группой фенотипических признаков, которые могут быть исследованы, являются признаки, которые могут детектироваться, например, биохимическими или иммунологическими средствами. Ожидается, что способ данного изобретения позволит идентифицировать системы в бактериальных клетках, которые, при должном модулировании, могут сделать эти бактерии более эффективными в качестве продуцентов в промышленной ферментации. Такие фенотипические признаки могли бы быть, например, изменениями в активности ферментов, изменения в плотности рецептора, изменения в скорости экспрессии и т.д.

Особые соображения используются, когда рандомизированный продукт экспрессии слит с партнером слияния, который определяет конечное местоположение продукта экспрессии. Сигнальные последовательности у прокариот являются хорошо известными в данной области, но следует вкратце упомянуть, что известны мембрано-якорные сигналы, и можно также экспортировать продукт экспрессии к периплазматическому пространству бактерий. Наконец, можно также включать сигналы секреции таким образом, чтобы можно было выделить продукт экс прессии из культурального супернатанта. Однако, во многих случаях, конечно, наиболее удобно сохранять продукт экспрессии внутри прокариотической цитоплазмы.

Применение способа данного изобретения в эукариотических системах

Особенно предпочтительным является использование в способе данного изобретения эукариотических клеток в качестве существенно идентичных клеток для скрининга на активные биомолекулы. Таким образом, эти эукариотические клетки могут быть грибковыми клетками, клетками простейших, клетками животных и клетками растений.

Как и в случае для бактерий, ряд грибков являются патогенами в млекопитающих и, следовательно, данная технология будет, параллельно с тем, что было описано выше в отношении антибактериальных агентов, применима для идентификации противогрибковых агентов с использованием патогенных грибков в качестве существенно идентичных клеток в этом способе. Кроме того, грибки (в частности, дрожжевые штаммы), подобно бактериям, также используются в ферментационных процессах (например, в винодельческой и пивоваренной промышленности), и, следовательно, этот способ может быть также использован с использованием таких непатогенных грибков в качестве существенно идентичных клеток, которые трансформированы векторами, посредством чего могут быть получены улучшения в этих штаммах.

Предпочтительными примерами грибков, служащих в качестве эукариотической клетки в способах данного изобретения, являются ΕρίбегторйуЮп κρρ., Тпс1юр11у1оп κρρ., Мкгокрогит κρρ., Сапйба а1Ьюапк, Ρ1ιί1ορ1ιοπ·ι κρρ., СосС1йо1бек 1ттШк, Η^ΙορΕι^™ саρки1аΐит, В1ак1отусек бегтаШйк, Рагасосшбюкек ЬгакШепЧк, С^ксо^ик пеоГогтапк, Л^г^Шик κρρ., 8ассйаготусек сегеу1к1ае, К1ухеготусек 1асБк и Рюша ρΗ^οη^

В противоположность грибковым клеткам, клетки простейших являются только патогенами для человека и других млекопитающих, хотя некоторые простейшие образуют часть биокультур, проводящих биологическую очистку сточных вод. Таким образом, способ данного изобретения рассматривается как применимый в идентификации новых мишеней для агентов против простейших. В этом контексте, предпочтительные клетки простейших, используемые в качестве существенно идентичных клеток в способах данного изобретения, выбраны из группы, состоящей из С1агб1а 1атЬ11а, Тгюйотопак гащпайк, Б1еп1атоеЬа ГгадШк, Т^ипо^та φρ., Ье1кйташа φρ., ЕгИатоеЬа 1ик1о1у1юа, №юд1епа Го\г1еп, АсапЙатоеЬа саЧейат, Нагтапе11а φρ., Порога ЬеШ, С^уρΐοкρο^^ά^ит φρ., Багсосукйк φρ., Тοxορ1акта допбн, Р1актобшт φρ. (например, Р. Га1с^ρа^ит. Р. уДах, Р. та1апае, Р.

кпо\г1ек1 и Р. о\'а1е), ВаЬеЧа φρ. и Ва1апШшт сой.

Клетки растений, в соответствии с данным изобретением, также представляют интерес в качестве эукариотических клеток-мишеней. Клетки растений могут быть клеткой любого растения, которая может быть подвергнута способам генной инженерии, позволяющей экспрессию и рост отдельных клеток. Так, примерами клеток растений, применимых в данном изобретении, являются клетки, полученные, например, из Ыюойапа 1аЬасит (растения табака), А^аЬ^άορк^к йайапа, Вгаккюа Μρ^, Вгаккюа |ипсеа, Мика 8ρ. (растения банана), риса и кукурузы. Лицо с квалификацией в данной области сумеет выбрать подходящие клетки растений в подходящей стадии их жизненного цикла, подходящие векторные системы, а также подходящие способы трансформации. Короткое резюме дается здесь.

Как и другие организмы, клетки растений могут быть трансформированы чужеродной ДНК. Одна из стратегий трансформации растений использует АдгоЬас1егшт иппеГааепк, природно встречающуюся патогенную бактерию растений, которая содержит плазмиду (Т1плазмиду), способную входить в клетки растений и встраивать часть ее генома в хромосомы растений. Т1-плазмида была сконструирована при помощи генной инженерии в качестве вектора для трансформации растений путем включения последовательностей для репликации в Е. со11 и АдгоЬас1егшт, уникальных сайтов рестрикции для встраивания чужеродных генов и селектируемых маркеров.

К сожалению, АдгоЬас1егшт не является эффективной в трансформации однодольных растений, большой группы растений, которые включают в себя все важные для сельского хозяйства злаки. Бобовые, другую важную группу пищевых культурных растений, также трудно трансформировать и регенерировать с использованием АдгоЬас1егшт. Таким образом, была разработана вторая стратегия для трансформации растений, включающая в себя способ генной пушки, в котором ген встраивают в экспрессирующий вектор и наносят на гранулы. Покрытые ДНК гранулы вводят затем с использованием генной пушки в клетки растений, где небольшая фракция поглощается и включается в ДНК. Индивидуальные клетки растений, каллюс, регенерирующие проростки и эмбрионы являются подходящими мишенями в этом способе.

Для определения, действительно ли клетки включили чужеродную ДНК и стали трансгенными, используют репортерные гены, такие как ген СИ8 и ген люциферазы. В любом случае, чужеродные гены могут быть фланкированы промотором растений для возможности экспрессии. Предпочтительным является использование клеток, происходящих из животных. Эти клетки могут быть клетками млекопитающих, клетками членистоногих, такими как клетки насекомых, клетками птиц и клетками рыб. Может быть перечислен ряд причин для использования таких типов клеток, каждый из которых требует соответствующего выбора систем трансформации и экспрессии, условий роста и т.д., причем все они могут быть легко определены и выбраны специалистом в данной области. Достаточно заметить, что, например, некоторые насекомые вызывают огромные проблемы в человеческом обществе (вследствие их прямых повреждающих активностей или вследствие их функций в качестве носителей инфекционных агентов), и, следовательно, способ данного изобретения мог бы дополнять попытки борьбы с такими насекомыми. Что касается млекопитающих, птиц и рыбы, большое число этих животных имеют важное сельскохозяйственное и водохозяйственное значение, где представляет интерес борьба с их заболеваниями.

Согласно данному изобретению, клетки млекопитающих, такие как клетки человека/клеточные клоны или клеточные линии человека, являются наиболее предпочтительными. Это обусловлено тем фактом, что большое число заболеваний человека и других млекопитающих этиологически зависит от молекулярных взаимодействий в живой клетке - таким образом, большой интерес представляет собой обеспечение лекарственных средств или соединений-примеров, взаимодействующих ίη νίνο с биомолекулами, которые играют роль в заболеваниях. Предпочтительными клетками млекопитающих являются клетки яичника Китайского хомячка (СНО), клетки Уего, клетки НеЬа, клетки νΐ38, клетки ВНК, клетки СО8-7 293 и клетки МОСК, все из которых являются хорошо известными в данной области.

Таким образом, тестируемые нуклеиновые кислоты вводят в эукариотические клетки в виде части вектора для скрининга на модуляторы активности фермента-мишени. Под термином вводят в имеют в виду, что эти нуклеиновые кислоты входят в клетки таким образом, что они являются пригодными для последующей экспрессии этой нуклеиновой кислоты. Способ введения в значительной степени диктуется типом клетки-мишени, см. ниже. Примерные, но не ограничивающие изобретение способы включают в себя преципитацию с фосфатом кальция, слияние с липосомами, способ с использованием липофектина®, электропорацию, инфицирование вирусом и т.д.

Случайно модифицированные нуклеиновые кислоты предпочтительно интегрируются в геном клетки-хозяина (например, посредством ретровирусной инфекции клетки-хозяина) или могут существовать временно или стабильно в цитоплазме (т.е. посредством использования традиционных плазмид, использующих стан дартные регуляторные последовательности, селектируемые маркеры и т.д.).

В настоящее время наиболее производительные методологии переноса генов для клеток млекопитающих используют способность сконструированных генной инженерией вирусов, таких как ретровирусы, для обхода природных клеточных барьеров для поглощения экзогенных нуклеиновых кислот.

Этот вектор выбран предпочтительно из группы, состоящей из ретровирусного вектора, вектора-вируса коровьей оспы, аденовирусного вектора, вектора-аденоассоциированного вируса (ААУ), вектора-вируса простого герпеса (Н8У), альфа-вирусного вектора и вектора-вируса лесов Семлики (8еш11к1 ГогеЧ νίπ.15).

Ретровирусная трансдукция

Поскольку многие фармацевтически важные скрининги требуют в качестве мишеней клеток человека или модельных животных, предпочтительными являются ретровирусные векторы, способные трансфицировать такие мишени.

Таким образом, тестируемые нуклеиновые кислоты являются предпочтительно частью ретровирусного вириона, который инфицирует эти клетки. Обычно инфицирование этих клеток является прямым с использованием усиливающего инфицирование реагента полибена. Инфицирование может быть оптимизировано таким образом, что эти клетки преимущественно экспрессируют единственную конструкцию каждая, например, с использованием отношения числа вирусных частиц к числу клеток. Альтернативно, можно отделять скринингом клетки, которые были инфицированы более, чем одним единственным вирионом, например, посредством количественной оценки селектируемого маркера и только. Хорошо известно, что скорость инфицирования происходит согласно распределению Пуассона.

Предпочтительный вариант данного изобретения, в котором существенно идентичными клетками являются эукариотические клетки, предусматривает стадию (а), проводимую путем

1) трансфекции подходящих упаковывающих клеток векторами, которые содержат случайно модифицированные нуклеотидные последовательности и которые способны интегрироваться в вирионы, продуцируемые указанными упаковывающими клетками,

2) культивирования указанных трансфицированных упаковывающих клеток в культуральной среде в условиях, которые облегчают продуцирование упаковывающими клетками вирионов, содержащих случайно модифицированные нуклеотидные последовательности,

3) извлечения и необязательно концентрирования указанных вирионов и

4) трансдукции указанных существенно идентичных клеток этими вирионами.

Таким образом, предпочтительно тестируемые нуклеиновые кислоты вводят в существенно идентичные клетки с использованием ретровирусных векторов. Это применение является хорошо известным в области хелпердефектных упаковывающих клеточных линий, которые способны продуцировать все необходимые белки (дад, ро1 и епу), требующиеся для упаковки, процессинга, обратной транскрипции и интеграции рекомбинантных геномов, см. ниже обсуждение таких клеточных линий. Те молекулы РНК, которые имеют в цис сигнал для упаковки ψ, упаковываются в созревающие вирионы. В эукариотах, ретровирусы являются предпочтительными по ряду причин. Вопервых, из них довольно легко получить производные. Во-вторых, в противоположность опосредованной аденовирусами доставке генов, экспрессия из ретровирусов является долгосрочной (аденовирусы не способны к интеграции). Аденоассоциированные вирусы имеют ограниченное пространство для генов и регуляторных единиц и существует некоторая полемика в отношении их способности к интеграции. Таким образом, ретровирусы обеспечивают в настоящее время наилучший компромисс в связи с долгосрочной экспрессией, генетической пластичностью и стабильной интеграцией, среди прочих признаков. Основным преимуществом ретровирусов является то, что их интеграция в геном хозяина делает возможной их стабильную передачу посредством клеточного деления. Это гарантирует то, что в типах клеток, которые подвергаются множественным независимым стадиям созревания, такого как развитие гемопоэтических клеток, ретровирусная конструкция будет оставаться резидентной (сохраняющейся в геноме) и продолжать экспрессироваться.

Предпочтительные ретровирусные векторы включают в себя векторы, происходящие из ретровируса, выбранного из группы, состоящей из вируса лейкоза-саркомы птиц (АЬ8У), вируса типа С млекопитающих, вируса типа В млекопитающих и лентивируса, а также векторы, происходящие из М8СУ (мышиного вируса стволовых клеток), модифицированного вируса МЕС, и рВАВЕ, и необязательно модифицированные гетерологичными цис-действующими элементами.

Как правило, ретровирусные векторы должны содержать так мало, как это только возможно вирусных последовательностей, чтобы минимизировать потенциальные события рекомбинации. Должны быть сохранены только последовательности, необходимые для упаковки, обратной транскрипции и интеграции, так же как последовательности вирусного промотора, энхансера и полиаденилирования.

Библиотека случайных нуклеотидов может быть генерирована в каркасе ретровирусной конструкции ДНК, как в общем описано, на пример, в \νϋ 97/27212. Стандартный синтез олигонуклеотидов генерирует случайную часть предполагаемого модулятора с использованием способов, хорошо известных в данной области (см. Ескбет, О11допис1еоббек апб Апа1одиек, А РгасИса! Арргоасй, 1КБ Ргекк А1 ОхГогб Ишуег814у Ргекк, 1991); библиотеки олигонуклеотидов могут быть коммерчески доступными. Библиотеки до 10⁹ уникальных последовательностей могут быть легко генерированы в таких ДНКкаркасах. После генерирования этой ДНКбиблиотеки библиотеку клонируют в первый праймер. Первый праймер служит в качестве кассеты, которую встраивают в ретровирусную конструкцию. Первый праймер обычно содержит ряд элементов, в том числе, например, необходимые регуляторные последовательности (например, регуляторные последовательности трансляции, транскрипции, промоторы и т.д.), партнеры слияния и каркасную молекулу (молекулы), сайты рестрикционной эндонуклеазы (рестриктазы) (клонирования и субклонирования), стоп-кодоны (предпочтительно во всех трех рамках считывания), районы комплементарности для праймирования второй цепи (предпочтительно в конце района стоп-кодона, так как в этом случайном районе могут иметь место делеции или инсерции) и т. д.

Затем добавляют второй праймер, который обычно состоит из части или из всего района комплементарности для праймирования первого праймера и необязательно необходимых последовательностей для второго уникального сайта рестрикции для субклонирования. Добавляют ДНК-полимеразу для получения двухцепочечных олигонуклеотидов. Двухцепочечные олигонуклеотиды расщепляют подходящими субклонирующими рестриктазами и субклонируют в ретровирусные векторы-мишени, описанные ниже.

Таким образом эти праймеры создают библиотеку фрагментов, каждый из которых содержит случайную нуклеотидную последовательность в каркасной последовательности, полученной из генетического материала, кодирующего модулятор фермента. Затем эти продукты лигирования трансформируют в бактерии, такие как Е. сой, и из полученной библиотеки получают ДНК, как описано в общих чертах в работе Кйатига, ΡΝΑ8 и.8.А. 92:9146-50 (1995), включенной здесь в качестве ссылки.

Можно использовать любое число подходящих ретровирусных векторов. Обычно ретровирусные векторы могут включать в себя: гены селектируемого маркера под контролем внутренних сайтов вхождения рибосом (1КЕ8), что делает возможным бицистронные опероны и, следовательно, значительно облегчает отбор клеток, экспрессирующих пептиды при однородно высоких уровнях; и промоторы, запускающие экспрессию второго гена, помещенные в смысловой или антисмысловой ориентации относительно 5'-ЬТЯ (длинного концевого повтора). Подходящие селектируемые гены включают в себя, но не ограничиваются ими, гены устойчивости к неомицину, бластоцидину, блеомицину, пуромицину и гигромицину, а также самофлуоресцентные маркеры, такие как зеленый флуоресцентный белок, ферментные маркеры, такие как 1;·κΖ. и поверхностные белки, такие как СЭ8, и т.д.

Эти ретровирусы могут включать в себя индуцируемые или конститутивные промоторы. Например, имеются ситуации, в которых необходимо индуцировать экспрессию пептидов только во время определенных фаз процесса отбора. Например, схема для обеспечения провоспалительных цитокинов в некоторых случаях должна включать в себя индуцированную экспрессию этих пептидов. Это объясняется тем, что имеется некоторое ожидание, что сверхэкспрессия провоспалительных лекарственных средств может быть в долгосрочном периоде вредной для роста клеток. Поэтому, в этой ситуации конститутивная экспрессия является нежелательной, и синтез этого пептида включается только во время той фазы процесса отбора, когда требуется этот фенотип, и затем этот пептид исключается выключением ретровирусной экспрессии для подтверждения эффекта или гарантии долгосрочного выживания клеток-продуцентов. Квалифицированному специалисту известно большое количество как индуцируемых, так и конститутивных промоторов.

Кроме того, можно сконструировать ретровирусный вектор, чтобы сделать возможной индуцируемую экспрессию ретровирусных вставок после интеграции единственного вектора в клетки-мишени; важно, чтобы вся система содержалась внутри единственного ретровируса. Те!-индуцируемые ретровирусы были сконструированы включением самоинактивирующегося признака (δΙΝ) ретровирусного делеционного мутанта 3'-ЬТЯ энхансер/промотор (НоГГтапп е! а1., ΡΝΑδ υ.δ.Ά. 93:5185 (1996)). Экспрессия этого вектора в клетках является фактически неопределяемой в присутствии тетрациклина или других активных аналогов. Однако, в отсутствие Те! экспрессия включается до максимума в пределах 48 ч после индукции, с однородно увеличенной экспрессией всей популяции клеток, которые захватывают индуцируемый ретровирус, что указывает на то, что экспрессия регулируется однородно в популяции инфицированных клеток. Подобная, родственная система использует мутированный Те! ДНКсвязывающий домен, так что он связывал ДНК в присутствии Те! и удалялся в отсутствие Те!. Любая из этих систем является пригодной.

Согласно данному изобретению, наиболее предпочтительные векторы (описанные в примере 1) основаны на мышином ретровирусе Λ1<ν, ретровирусе типа С млекопитающего (идентификационный номер 11791 NСВI таксономии). Вирус Α1<ν имеет высокую гомологию с ретровирусом Молони, обычно используемым в этой области. Краткое описание конструкции этих предпочтительных векторов является следующим:

Эти векторы содержат химерный 5'-ЬТЯ, делающий возможной экспрессию от сильного промотора цитомегаловируса (СМУ), когда транскрипция запускается из плазмиды (как при трансфекциях). После интеграции этого вектора в геном хозяина транскрипция запускается из ретровирусного ЬТЯ (как при трансдукциях).

Гибкий полилинкер присутствует ниже по ходу транскрипции (справа) от сигнала упаковки. Это делает возможной инсерцию пептидных библиотек, являющуюся частью каркасной молекулы, в этом положении.

Сразу же справа от полилинкера находится внутренний сайт вхождения рибосом (1ЯЕ8), происходящий из вируса энцефаломиокардита (ЕМС), или внутренний промотор, происходящий из вируса 8У-40. Это делает возможной эффективную трансляцию от расположенной справа экспрессионной кассеты либо САРнезависимым (1ЯЕ8) образом, либо САРзависимым (внутренний промотор) образом.

Несколько различных маркерных генов могут быть клонированы в эту расположенную справа (ниже по ходу транскрипции) экспрессионную кассету. Например, гены устойчивости к антибиотикам, такие как №о и Нудго, гены флуоресцентых белков, таких как ЕСРВ, или поверхностных белков, таких как ΔΝΟΕΒ. Доступность векторов, содержащих различные маркеры, делает возможной селекцию трансдуцированных клеток с использованием либо обработки лекарственными средствами, проточной цитометрии, либо разделения при помощи магнитных бус (гранул).

Любой каркасный белок или маркер может быть объединен в бицистронном векторе или в векторе, содержащем внутренний промотор 8У40.

Таким образом, ввиду вышесказанного, предпочтительным является, чтобы ретровирусный вектор имел неидентичные концы, так чтобы облегчить генерацию на основе ПЦР случайных последовательностей ДНК. Кроме того, предпочтительно, чтобы эти неидентичные концы содержали неидентичные промоторы. Особенно предпочтительный ретровирусный вектор содержит гетерологичный промотор, заменяющий вирусный промотор в 5'-ЬТЯ, такой как промотор СМУ, промотор В8У, промотор 8У40, промотор ТК, промотор МТ или индуцируемую систему, такую как Те! или Есбукопе.

Особенно хорошо пригодными ретровирусными системами трансфекции (упаковывающими клетками) являются РЕ501 (υδ 4 861 719), Во§с23 (νθ 94/19478), ψ2 (Я. МцШдап/ϋ. ВаШтоге), 6Ρ+Ε86 (υδ 5 278 056), РйоешхЕсо (АО 97/27212), РАЗ 17 (И8 4 861 719),

СР+АМ12 (И8 5 278 056), ЭА(атрЬо) (АО 95/10601, АО 92/05266), Втд (АО 94/19478), ЕЬУА13 (АО 97/08330), РгоРак (доступный из 8у81еш1х), СВ1Р (В. МиШдап), ψАМ (В. МиШдап/Ό. ВаШтоте), РНоешх-АшрНо (АО 97/27212), РС13 (Тагде!еб Оепейсз), Н9 (293СРС) (Ό. Огу, М. 8ас1е1ат. В. МиШдап, 1. 8сПаГГег) и ЕсоРаск (С1опе!есй).

Ретровирусная трансдукция зависит от взаимодействия между гликопротеинами оболочки вируса и рецепторами поверхности клетки-хозяина. Несомненно, двумя наиболее часто используемыми рецепторами для доставки ретровирусных генов являются экстренный рецептор (ограниченный мышиными и крысиными клетками) и амфотропный рецептор (широко распространенный как на иммортализованных клеточных линиях, так и на эмбриональных клетках млекопитающих). Существует большое число упаковывающих клеточных линий для генерирования либо экотропных, либо амфотропных вирусов. Кроме того, недавно были разработаны упаковывающие клеточные линии, которые псевдотипируют ретровирусные частицы либо САБУ (гликопротеином вируса лейкоза гиббона), либо У8У С (гликопротеином вируса С везикулярного стоматита).

До недавнего времени большинство упаковывающих клеточных линий основывались на клетках ΝΙΗ-3Τ3, таких как линии ψ2 и СР+86 (экотропные) и РА317, СР+АМ12 и СВ1Р (амфотропные). Их использовали интенсивно и они работали хорошо, в частности, при получении стабильных линий-продуцентов. Однако упаковывающие клеточные линии на основе ΝΙΗ-3Τ3 дают относительно низкие титры при генерировании вируса из временной трансфекции. На протяжении последних нескольких лет были разработаны несколько упаковывающих клеточных линий на основе высокотрансфицируемой линии клеток 293 (клеток почек эмбрионов человека). Они включают в себя клеточную линию Во§с23 (Реаг е! а1., 1993), экотропную клеточную линию, которая, как было показано, работает очень хорошо в границах данного изобретения, а также клеточную линию ЕсоРаск из С1опе1ес11. Преимуществом линий на основе 293 является то, что очень высокие титры (до 10⁷ инфекционных единиц/мл, МЕ/мл) вирусного супернатанта могут быть получены из временных трансфекции всего лишь за 48 ч. В ситуации библиотеки временные трансфекции являются предпочтительными, так как это дает всем членам библиотеки шанс быть одинаково хорошо экспрессированными, без какой-либо неодназначности, вводимой экспрессией от различных сайтов интеграции.

Наличие доступа к хорошо охарактеризованным стабильным упаковывающим клеточным линиям является решающим для связанных с генной терапией проектов, однако, для целей данного изобретения не является необходимым использование таких хорошо определенных линий, так как эти библиотеки всегда будут получать из временных трансфекции и нет необходимости получения стабильной линиипродуцента. Альтернативной стратегией для достижения вхождения в немышиные клетки, которое исследовали авторы данного изобретения, является, таким образом, использование гетерологичного гликопротеина вирусной оболочки для псевдотипирования вирусов, получаемых в экотропных упаковывающих клеточных линиях, например, гликопротеина из вируса везикулярного стоматита (белка С У8У). У8У С-псевдо-типирование ретровирусов представляет интерес по двум причинам. Во-первых, рецепторы клеточной поверхности для У8У С являются вездесущими мембранными компонентами, такими как фосфатидилсерин и ганглиозиды. Таким образом, псевдотипирование при помощи У8У С придает широкий тропизм вирионам. Во-вторых, белок У8У С является чрезвычайно стабильным, как только он включается в вирионы. Это является важным, так как это позволяет концентрировать вирусный супернатант при помощи ультрацентрифугирования, стадии, которая может увеличивать вирусные титры на единицу объема в 10-100 раз.

Белок У8У С является высокофузогенным (обладает высокой способностью к слиянию) и, вследствие этого, проявляет цитотоксичность в культуре ткани. Поэтому невозможно получить упаковывающие клетки, которые конститутивно экспрессируют У8У С. Для обхода этой проблемы были разработаны индуцируемые системы (Огу е! а1., 1996). Однако поскольку ретровирусные библиотеки Се118сгееп™ получают с использованием временных трансфекций, очень простой альтернативой является временная трансфекция У8У С, вместе с библиотекой, в экстренную упаковывающую клеточную линию, такую как Во§с23. Этот подход позволяет получать вирусные супернатанты широкого тропизма и с высокими титрами, до того как в культуре наблюдается тяжелая токсичность. С использованием этого способа авторы данного изобретения испытывали панель не-мышиных линий клеток-мишеней на способность к трансдукции и получали рутинно титры до 10⁷ ИЕ/мл вирусных супернатантов.

Недавно сообщенной альтернативой псевдотипированию У8У С является псевдотипирование гликопротеином оболочки вируса лимфоцитарного хориоменингита (ЬСМУ) (см. МйеБс е! а1., 1999, 1. У1го1. 73:6114-6116). Эта альтернатива включена также в качестве варианта данного изобретения.

После получения в упаковывающих клетках, концентрирование вируса может быть выполнено следующим образом. Обычно ретровирусы титруют нанесением содержащего ретро вирус супернатанта на индикаторные клетки, такие как ΝΙΗ-3Τ3, и затем измерением процента клеток, экспрессирующих фенотипические последствия инфицирования. Концентрацию вируса определяют умножением процента клеток, инфицированных вирусом, на фактор разведения, принимая во внимание число клетокмишеней, доступных для получения относительного титра. Если ретровирус содержит репортерный ген, такой как ΗκΖ. то инфицирование, интеграцию и экспрессию рекомбинантного вируса измеряют гистологическим окрашиванием на экспрессию 1;κΖ или проточной цитометрией (ЕАС8). Обычно ретровирусные титры, получаемые даже из самых лучших клетокпродуцентов, не превышают 10⁷ на мл, если только концентрирование не выполняют на относительно дорогом или экзотическом оборудовании. Однако авторы считают, что такие большие частицы, как ретровирус, не будут перемещаться очень далеко посредством брауновского движения в жидкости, гидроаэродинамические предсказания показывают, что большая часть этого вируса никогда не приходит в контакт с клетками для инициирования инфекции. Однако, если клетки выращивают или помещают на поверхность пористого фильтра и ретровирусу дают проходить через эти клетки при постепенном гравиметрическом протекании, все время может эффективно поддерживаться высокая концентрация вируса вокруг клеток. Таким образом наблюдали в 10 раз более высокую инфекционность путем инфицирования клеток на пористой мембране, давая супернатанту вируса протекать через них. Это должно давать титры 10⁹ после концентрирования.

После выделения/концентрирования вируса существенно идентичные клетки-мишени трансдуцировали с использованием способов, хорошо известных в данной области.

В применениях, когда эффекторные молекулы с онкогенным потенциалом присутствуют в конкретной библиотеке, важно использовать ретровирусные супернатанты, которые являются неинфекционными для человека. В этих случаях, в представляющую интерес клеткумишень может быть введен экотропный рецептор и вирусы могут быть получены с использованием экотропной системы. Экотропный рецептор представляет собой переносящий катионную аминокислоту белок (тСАТ), который, как было показано, придает чувствительность к инфицированию экстренным вирусом (А1Ьп11оп е1 а1., 1989). Экспрессия этого рецептора в различных клетках человека, в том числе лимфоцитах, была документирована в литературе (Ηίΐοδΐιί е1 а1., 1998). Авторы этого изобретения показали, что введение тСАТ, как стабильной трансфекцией, так и трансдукцией (с использованием ретровирусного вектора, кодирующего тСАТ) давала клетки-мишени, которые явля ются высоковосприимчивыми к инфекции генерируемыми Вакс23 вирионами.

Таким образом, обсужденные выше клеточные линии и другие способы получения ретровируса применимы для получения вируса временной трансфекцией. Этот вирус может либо использоваться непосредственно, либо использоваться для инфицирования другой клетки-продуцента ретровируса для расширения библиотеки.

Партнеры слияния

Как упоминалось выше, часто является желательным слияние продукта экспрессии, по меньшей мере, с одним партнером слияния, которое облегчает экспрессию и/или очистку/выделение и/или дополнительную стабилизацию продукта экспрессии.

В эукариотах партнер слияния часто является сигналом сортинга или нацеливающей последовательностью. Такой сигнал сортинга будет находиться в форме сигнального пэтча или сигнального пептида. Хорошо известной функцией сигнала сортинга является осуществление экспорта экспрессируемого пептида в эндоплазматический ретикулум, в аппарат Гольджи, в лизосомы, в секреторные пузырьки, в митохондрии, в пероксисомы или в ядро. Конечно, возможными функциями являются также экспорт в мембрану или из клетки. Предпочтительно, сигнал сортинга или нацеливающая последовательность выбраны из группы, состоящей из сигнала ядерной локализации (ΝΣδ), такого как Рго-куъ-клъ-куъ-Агд-клъ-Угй (ΝΣδ большой Т-антиген 8У40), А1а-Агд-Агд-Агд-Агд-Рго (ΝΣδ рецептор-β ретиноевой кислоты человека), С1и-С1и-Уа1-С1п-Агд-Еу8-Агд-С1п-Еу8-Ееи (№кВ р50), С1и-С1и-Еу8-Агд-Еу8-Агд-ТЬг-ТугС1и (№кВ р65) и А1а-Уа1-Еу8-Агд-Рго-А1а-А1аТЬг-Еу8-Еу8-А1а-С1у-С1п-А1а-Еу8-Еу8-Еу8-ЕеиАкр (ΝΕδ нуклеплазмин Хегюрш);

мембраносвязывающей (якорной) последовательности, такой как полученные из ί.Ό8, 1САМ-2, 1Ь-8, СЭ4 и ЬГА-1, и последовательности липидирования, такой как последовательность миристилирования или пальмитоилирования;

лизосомного сигнала сортинга, такого как последовательность лизосомной деградации и последовательность лизосомной мембраны;

последовательности митохондриальной локализации, такой как последовательность митохондриального матрикса, последовательность митохондриальной внутренней мембраны, последовательность митохондриального межмембранного пространства и последовательность митохондриальной наружной мембраны; и последовательности локализации в эндоплазматическом ретикулуме, такой как последовательность из калретикулина (КЭБЬ) и последовательность из белка аденовируса Е3/19К (ΕυΕδΚΚδΕΙΌΕΚΚΜΡ);

пероксисомной последовательности, такой как последовательность пероксисомного матрикса из люциферазы;

последовательности фарнезилирования, такой как Ь№РВЕ86Р6СМ8СКСУЬ8;

последовательности геранилгеранилирования, такой как ΕΊΈΡΤΟΡΤΚΝΟ^8Ν;

последовательности расщепления, такой как ΚΤΛΕΟΩΙΟΝ; и секреторной сигнальной последовательности, такой как секреторные сигналы из 1Ь-2, гормона роста, препроинсулина и белка НА вируса гриппа.

Модуляторы-ферменты, применимые в данном изобретении

В данной области продемонстрировано существование многочисленных эффективных пептидных модуляторов активности ферментов. Особенно хорошо охарактеризованы ингибиторы ферментов. Неограничительные примеры, включенные здесь в качестве ссылки, перечислены ниже:

Семейство ВРТ1/Кипй/ ингибиторов протеаз

Ингибитор трипсина поджелудочной железы (ΒΡΤΙ) из Вок 1аигик;

Ингибитор трипсина селезенки из Вок Ишгик;

Легкая цепь ингибитора интер-альфатрипсина (бикунин) из Вок Ишгик, Ното кар1епк, Мепопек ипдшси1аШк, Мекоспсетк аигаШк, Мик тикси1ик, 8ик ксгоГа, Р^иго^^ек рй-Иекка и Ва11ик ηο^νед^сик, соответственно;

Ингибитор интер-альфа-трипсина из Есцшк саЬа11ик, О\зк апек и Сарга Ыгсик, соответственно;

Ингибитор А трипсина гемолимфы из

Мапйиса кеxίа;

Ингибитор В трипсина гемолимфы из

Мапйиса кеxίа;

Ингибитор трипсина молозива из Вок ίаигик;

Трипстатин из Вайик

Ингибитор протеиназы из Тасйур1еик Ιιϊάеηίаίик;

Ингибитор сывороточной основной протеазы из Вок Ишгик;

Ингибитор химотрипсина 8С1-111 из ВотЬух топ;

Ингибитор сериновой протеазы мужской добавочной железы из ЭгокорНИа Шпейпк;

Ингибитор протеазы 5 II из Апетоша ки1саίа;

Ингибиторы химотрипсина 8С1-1 и 8С1-11 из ВотЬух топ;

Ингибиторы протеиназы 8ΗΡΙ и 8ΗΡΙ-2 из 81о1сйас11к йейаШйик;

Изоингибитор К из Нейх ротайа;

Ингибитор трипсина IV из ВаШагИйик тасго0ас1у1ик;

Ингибиторы IX и νΐΙ^ щелочной протеазы яда из Випдагик ГакааШк;

Ингибиторы I и III щелочной протеазы яда из ^рега аттοάуίек аттοάуίек;

Ингибитор II щелочной протеазы яда из ЭаЬо1а гиккеШ йатепйк, НетасйаШк йаетасйа1ик и №ца шуеа, соответственно;

Ингибиторы В и Е щелочной протеазы яда из Оепйгоакр1к ро1у1ер1к ро1у1ер1к;

Ингибитор химотипсина яда из №ца пфа;

Ингибиторы I и К щелочной протеазы яда из Оепйгоакр1к ро1у1ер1к ро1у1ер1к;

Ингибитор К щелочной протеазы яда из

Оепйгоакр1к аηдикί^серк;

Ингибитор трипсина яда из Епк1осор1нк тастайош и Νφη пфа, соответственно;

Ингибитор протеазы из 8агсорйада Ьи11а1а;

Ингибитор пути тканевого фактора из Ното кар1епк, Огус1о1адик сишси1ик и Ваник погсоответственно;

Ингибитор 2 пути тканевого фактора из Ното кар1епк;

Ингибитор плазмина/трипсина матки из 8ик ксгоГа;

Нексин II протеазы (фрагмент амилоидного белка А4 болезни Альцгеймера) из Ното кар1епк, Мик тикси1ик, ВаИик иог^'ед1сик, Масаса Гакс1си1апк и Масаса ти11аίа, соответственно;

Амилоидный белок 2 из Ното кар1епк и Вайнк пог^'ед1сик, соответственно и

Орнитодорин из ОгшШойогок тοиЬаίа, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Серпиновое семейство ингибиторов протеаз

Ингибиторы альфа-1-протеиназы (альфа-1антитрипсинов) из Есщик саЬа11ик, Мик тикси1ик, С'Шза рогсе11ик, ОгусЮ1адик сишсиШк, Вок 1аигик, СЫпсЫПа νίΠίώοη, О1йе1рЫк тагкир1а1ек νίΓ^ίηίапа, Ното кар1епк, Масгорик еидепи, Мик сагой, Ρар^ο апиШк, 8ик ксгоГа, ВаИик поггедюик и О\зк апек, соответственно;

Альфа-1-антихимотрипсин из Ното кар1епк;

Антитромбин III из Ното кар1епк, Вок 1аигик, Мик тикси1ик, О\зк апек, МекоспсеШк аигаШк и Са11ик да11ик, соответственно;

Ингибитор альфа-2-плазмина (альфа-2антиплазмин) из Вок 1аигик, Ното кар1епк и Мик тикси1ик, соответственно;

Бомапин (ингибитор протеазы 10) из Ното кар1епк;

Контрапсин из Мик тикси1ик и С'Шза рогсе11ик;

Контрапсин-подобные ингибиторы протеаз из ВаИик погтедюик;

Ингибитор фактора ХПа из Вок Ишгик;

Полученный из глии нексин (нексин I протеазы) из Ното кар1епк, Мик тикси1ик и ВаИик по^ед^ик, соответственно;

Кофактор II гепарина из Ното кар1епк, Мик тикси1ик, Огус1о1адик сишсиШк и ВаИик поп-едС сик, соответственно;

Белок теплового шока 47 кДа (ингибитор сериновой протеазы 16) из Мик тикси1ик и Са1

1ик да11ик, соответственно; С1-ингибитор из Ното кар1епк;

Ингибитор эластазы лейкоцитов из Есцшк саЬа11ик, Ното кар1епк и 8ик ксгоГа, соответственно;

Ингибитор протеина С из Ното кар1епк;

Каллистатин из Ното кар1епк;

Калликреинсвязывающий белок из Мик тикси1ик и Кайик погуедкик, соответственно;

Маспин из Ното каркпк, Мик тикси1ик и Кайик погуедкик, соответственно;

Ингибитор-1 активатора плазминогена из Вок 1аигик, Ното каркпк, Мик тикси1ик, Мик1е1а У1коп и Кайик погуедкик, соответственно;

Ингибитор-2 активатора плазминогена из Ното каркпк, Мик тикси1ик и Кайик погуедкик, соответственно;

Нейросерпин из Ното каркпк, Мик тикси1ик и Са11ик да11ик;

Цитоплазматические антипротеиназы 1, 2 и 3 из Ното каркпк;

Антитрипсин из ВотЬух топ, соответственно;

Антихимотрипсины I и II из ВотЬух топ;

Аласерпин из Мапбиса кех!а;

Ингибитор 2.1 сериновой протеазы из Кайик погуедкик;

Ингибитор 1 сериновой протеиназы из поксвируса (вируса группы оспы) коров, поксвируса кроликов, поксвируса свиней, вируса коровьей оспы и вируса оспы, соответственно;

Ингибитор 2 сериновой протеиназы из поксвируса кроликов, вируса коровьей оспы и вируса оспы, соответственно;

Ингибитор 3 сериновой протеиназы из вируса коровьей оспы и вируса оспы, соответственно;

Серпин 1 из вируса миксомы;

Ингибитор сериновой протеиназы из На1осупбба гогеШ;

1се-ингибитор из вируса коровьей оспы (ингибитор тиоловой протеазы);

а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Кага1-семейство ингибиторов протеаз:

Ингибиторы акрозина из Вок 1аигик, Ното каркпк, 8ик ксгоГа и Масаса Гакски1апк, соответственно;

Ингибитор эластазы из Апетоша ки1са!а;

Овоингибитор из Са11ик да11ик;

Родниин из Кбобшик ргойхик;

Секреторный ингибитор трипсина поджелудочной железы из Кайик погуедкик, АпдиШа апдиШа, Вок 1аигик, Сашк ГашШапк, Ното каркпк, 8ик ксгоГа и Оу1к апек, соответственно;

Секреторный ингибитор II трипсина поджелудочной железы из Кайик погуедкик;

Двуголовчатый ингибитор протеазы (подчелюстной железы) из Сашк ГатШапк, бебк кбуек1пк са1ик, Ме1ек те1ек, РапШега 1ео и Уи1рек уи1рек, соответственно;

Ингибитор трипсина из Наксупбба гогеШ; Ингибитор триптазы из Нйибо тебкшабк;

Секреторный гликопротеин предстательной железы из Мик тикси1ик;

Овомукоид (третий домен) из АЬита р1р11е, Аеруробшк агГакапик, АГгорауо сопдепкЦ А1есЮпк сбикаг, А1ес1опк гиГа, Апак рбИугбупсбок, Сб1оербада рк1а, Суапосбеп суапор!ега, Шосбеп _]иЬа1а, Табогпа габ.)аб, Ьорбопейа креси1апо1бек, Апак сарепк1к, А1х да1егки1а1а, А1х кропка, 8агк1б1огшк те1апо!ок, А1оросбеп аедурйаса, Мегдик сиси11а!ик, Апббгда поуаебо11апб1ае, Апкег апкег апкег, Апкег шбкик, Апкегапак кеп-арабиай!, АгЬогорбба Югциео1а, Агдиыапик агдик, Ау1буа атепсапа, №йа гиб па, Ва1еапса рауошпа, ВатЬикко1а 1богаска, Вопака итЬе11ик, Вгап!а сапабепкЦ Апкег сападкик, СаШрер1а кс.|иата1а сак1аподак1гк, СаШрер1а кс.|иата1а ра1бба, Сагробасик техкапик, Сагрососсух гепаи1б1, Сакиапик сакиапик, Сакиапик Ьеппейг Сегеоркк поуаебо11апб1ае, Сбаипа сбауапа, Сбаипа 1огс.|иа1а, Са11ик да11ик, Сбгуко1орбик атбегкбае, Сбгуко1орбик р1с1ик, Спсик аегидшокик, Со б пик уйдббапик, Согуик а1Ьик, Согуик топеби1а, СоксогоЬа соксогоЬа, Со!игшх бе1едогдиег Со1игшх со!игшх )аропка, СгоккорШоп сгоккорШоп, Судпик а!гаШк, Судпик о1ог, Охуига ]ата1сепк1к, Охшга У1йа!а, Суйопух тоШе/итае, Иасе1о поуаедшпеае, Иепбгосудпа агЬогеа, Иепбгосудпа агсиа!а, Иепбгосудпа аиΐишпа1^к, Иепбгосудпа Ысо1ог, Иепбгосудпа еуЮпг Иепбгосудпа У1биа1а, Иготашк поуаебобапб1ае, Еибго11йа е1едапк, бгапсобпик аГег сосци, бгапсобпик егскеШ, бгапсобпик Гга особ пик, б га особ пик ропбкепапик, бибса а1га, Са1бпи1а сб1огорик, Са1бга11ик аик1габк, Са11ик уапик, Сеососсух саИГогшапик, Сгик сагипси1а1ик, Сгик )аропепк1к, Сгик У1р1о, Ап1бгоро1бек упдо, Сипа дина, Сийега рисбегат, Сурк соргоШегек, Ро1уЬого1бек габ1а!ик, Ас.|ш1а аибах, Шсгокуйек топасбик, НабаееШк а1Ькб1а, Набак!иг бгбик, Батик пб|Ьипбик, Багик таппик, Уапебик крбгокик, Бе1роа осе11а1а, Борбига бибуегг БорбоПух сабГогпка, БорбоПух датЬеШ, Борбига 1дпйа, Борбига б1агб1, Борбига 1еисоте1аиа, Медаробшк Ггеусте!, Ме1еадпк да11орауо, Адпосбапк осе11а!а, ШШоргос1а стегаксепк, Шбюргос1а регбкапа, Штаба текадпк, АсгуШит уиЙигшит, Шсбсогах пусбсогах, Ор1к!босотик боа/ί п, ОгеогПх рк1ик, Ойабк уе!и1а, Рауо спк!а1ик, Рауо тибсик, Репе1оре _)асс.|иаси, Репе1оре кирегсШапк, Регбпх регбпх, РбаШпик со1сбкик со1сбкик, Рбаыапик уегкко1ог, Рба1асгосогах ки1сток1пк, Робагдик к1пдо1бек, Ро1ур1ес1гоп Ька1сага1ит, Ро1ур1ес1гоп етрбаиит, Ро1уЬогик р1апсик, Рудоксебк абебе, Рба1асгосогах а1Ь1уейег, Кбеа атегкапа, РЮгоспеиба репиаΐа, КбупсбоШк шГексепк, Ко11и1ик гои1гои1, 8су!бгорк иоνаебо11аиб^ае, 8рбешксик битЬо1бб, 81ги!бк сате1ик, 8угтайсик ш1кабо, 8у^шайсик гееуеки, Тбгатик та) о г, Тигбик теги1а, Тигшх куКайса, Тутраписбик сир1бо, СеШгосегсик игорбак1апик, Тгадорап Ь1у1бл,

Тгадорап саЬой, Тгадорап ка1уга, Тгадорап !еттшскл, Ьорйорйогик 1тре)апик, СгоккорШоп аигйит, СгоккорШоп тап!сйшгсит, Ьорйига еб\уагбкг Ьорйига пус!йетега, Ьорйига кЮпйоер Рисгак1а тасго1орйа, Са!геик таШсйи, 8угтайсик еШой, 8угтайсик йит1ае, 8угтайсик коеттегппдй, Ьадорик 1еисигик и Уи1!иг дгурйик, соответственно, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Семейство ингибиторов протеаз, включающее в себя ингибиторы трипсина сои (Киηΐΐζ):

Ингибитор аспарагиновой протеиназы из

8о1апит !иЬегокит;

Ингибиторы катепсина И из 8о1агшт !иЬегокит;

Индуцируемый поранением ингибитор аспарагиновой протеиназы из 8о1апит !иЬегокит;

Предшественник ингибитора 3 химотрипсина из Ркорйосагрик !ейадопо1оЬик;

Ингибитор трипсина из Абепаййега ратоп1па;

Ингибитор трипсина из Ргокорк1к |и11Пога;

Ингибитор трипсина из Егу1йппа саГГга;

Ингибитор трипсина из Егубшпа 1айкк1та;

Ингибитор химотрипсина из Егубшпа тапеда!а;

Ингибиторы трипсина 1А, 1В и 2 из Ркорйосагрик !ейадопо1оЬик;

Ингибитор трипсина/химотрипсина из А1осак1а тасгоггйпха;

Ингибитор трипсина из Α1όίζζίη _)ийЬ1тккт; Ингибитор трипсина из Асааа сопГика; Ингибиторы трипсина А, В и С из 61усте тах;

Ингибиторы трипсина КТ11 и КТ12 из 61усте тах;

Ингибитор сериновой протеиназы латекса из Санса рарауа;

Ингибитор цистеиновой протеиназы РСР1

8.3 из 8о1апит !иЬегокит и

Ингибиторы 1 и 2 типа ингибиторов ΚιιπίΙζ (РК1-1) из 8о1апит !иЬегокит, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Семейство ингибиторов протеаз типа ингибиторов I картофеля

Ингибитор трипсина/субтилизина из АтагапНик саиба!ик;

Ингибитор субтилизина из Мотогбюа сйагапйа;

Индуцированный поранением ингибитор Ι протеиназы из Ьусорегасоп екси1еп!ит, Ьусорегк1соп регит!апит и 8о1апит !иЬегокит, соответственно;

Ингибиторы субтилизина Ι и ΙΙ из Р1 акео1ик апдЫапк;

Ингибитор I протеиназы из 8о1апит !иЬегокит;

Ингибитор 2А химотрипсина (С1-2А) из Ногбеит тиЦаге;

Ингибитор 2В химотрипсина (С1-2В) из Ногбеит тиЦаге;

Ингибитор 1А химотрипсина (С1-1А) из Ногбеит тиЦаге;

Ингибитор 1В химотрипсина (С1-1В) из Ногбеит тиЦаге;

Ингибитор 1С химотрипсина (С1-1С) из Ногбеит тиЦаге; Ингибитор I химотрипсина, субъединицы а, Ь и с из 8о1апит !иЬегокит;

Ингибитор субтилизина из УШа ГаЬа;

Чувствительный к этилену ингибитор протеиназы из Ьусорегккоп екси1еп!ит;

Ингибиторы протеиназы Ι-А и Ι-В из Мсойапа !аЬасит;

Эглин С из Н1гибо тебттайк;

Ингибитор трипсина и фактора Хагемана из СисигЬйа тах1та;

Ингибитор трипсина МС'Ч-3 из Мотогбка сйагапйа и

Ингибитор Ι трипсина из Мсойапа ку1тек!пк, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Вотетап-Ыгк-семейство ингибиторов протеаз

Ингибиторы протеаз типа Во\утап-Вйк из АгасЫк йуродаеа, Со1х 1асйгута-)оЬ1, Рйакео1ик апди1апк, 61усте тах, Тййсит аекйтит, АгасЫк йуродаеа, Рйакео1ик тиЦапк, 8е!апа йайса, Иойсйок ахШапк, Ьопсйосагрик саракка, Οιύζπ кайта, Ногбеит тиЦаге, МебЫадо кси!е11а!а, Рйакео1ик аигеик, Рйакео1ик 1ипа!ик, У1аа апдикйГойа, УШа ГаЬа и У1дпа ипдшси1а!а, соответственно, и

Индуцированные поранением ингибиторы трипсина из Мебюадо кайта и Ζеа таук, соответственно, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Семейство 8(|иахК ингибиторов протеаз

Ингибитор эластазы из Мотогбка сйагапйа;

Ингибиторы Ι, ΙΙ и ΙΙΙ трипсина из Ьадепапа 1еисап!йа;

Ингибитор трипсина Ι из Сйгийик тиЦапк;

Ингибиторы Ι, ΙΙΙ и ГУ трипсина из СисигЬ1!а тахта;

Ингибиторы Ι и ΙΙ трипсина из ЬиГГа суйпбпса;

Ингибиторы Ι и ΙΙ трипсина из Мотогбка сйагапйа;

Ингибитор Ι трипсина из Мотогбка герепк;

Ингибитор трипсина ΙΙ из Вгуоша бюка;

Ингибиторы трипсина ПВ и РУ из Сисит1к кайтик;

Ингибитор трипсина ΙΙ из ЕсЬайшт е1а!егтт;

Ингибиторы трипсина Ι, ΙΙ и ΙΙΙ из Сисит1к те1о таг. Сопотоп;

Ингибиторы трипсина II и III из СисигЬйа реро и

Ингибитор трипсина А из Мотогйка скагапйа, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Семейство ингибиторов субтилизина 81гер1ошуее8 (881)

Ингибитор субтилизина из З1гер1отусек а1Ьодпкео1ик; Белок-1, подобный ингибитору субтилизина, из З1гер1отусек сасаор

Ингибитор трипсина 8ΊΊ2 из З1гер1отусек 1оп§1крогик;

Белок-2, подобный ингибитору субтилизина, из З1гер1отусек гаскек

Белок-3, подобный ингибитору субтилизина, из З1гер1отусек соексо1ог;

Белок-4, подобный ингибитору субтилизина, из З1гер1отусек 1ауепйи1ае;

Белок-8, подобный ингибитору субтилизина, из З1гер1отусек \пдйиае;

Ингибитор протеазы ЗГО-УЗ из 81гер1оуегйсШшт еигос1Й1сн5;

Ингибитор протеазы 8ГЬ-У1/8ГЬ-У4 из 81гер1оуегйс111шт Гкп'орегкюик;

Ингибитор протеазы ЗВ-У5 из 81гер1оуегйсШшт 1и1еоуег11сШа1и8;

Ингибитор протеазы ЗВ-У2 из 81гер1оуегйсШшт огшоср

Ингибитор 2С' щелочной протеазы из З1гер1отусек дпкеотсагпаШк;

Ингибитор протеазы из З1гер1отусек 1ίνίйапк и

Плазминострептин из З1гер1отусек апййЬппо1уйсик, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Семейство ВошЬух ингибиторов протеаз

Ингибитор Б грибковой протеазы (БИ-Б) из ВотЫх топ, а также ингибиторы, гомологичные ему, выделенные из других источников, чем ВотЬух топ.

Ингибиторы теар-типа Роиг-йЬиИтйе Соге (с четырьмя дисульфидными связями в коре) протеиназ

Антилейкопротеиназа 1 из Ното кар1епк и Мик тикси1ик, соответственно;

Элафин из Ното кар1епк и Зик ксгоГа, соответственно, и Хелонианин (ингибитор основной протеазы) из красной морской черепахи, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Гирудиновое семейство ингибиторов протеаз

Гирудины из Ннийо шейкшаИк и НпийР папа таш11еп818, соответственно, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Ингибиторы фактора Ха

Антистазин из НаетеШепа оГйстаИк, НаетеШепа дкШапн, Шгийо тейктайк, Ннийо шрроша и Нуйга тадшрарШа1а, соответственно, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Семейство ингибиторов трипсина Азеапз

Ингибиторы химотрипсина/эластазы из Аксапк киит и Ингибитор трипсина из Аксапк киит, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем Аксапк киит.

Цистатиновое семейство ингибиторов протеаз

Ингибиторы 1 и 2 цистеиновой протеиназы лейкоцитов из Зик ксгоГа;

Стефины 1, 2 и 3 из Мик тикси1ик;

Цистатины А1, А5, А8 и В из Зик ксгоГа;

Цистатины А и В из Вок 1аигик;

Стефин С из Вок 1аигик;

Цистатин В из О\1к апек;

Цистатины А, С, Ό, М, 8Ν, З и ЗА из Ното кар1епк;

Цистатины В и С из Мик тикси1ик;

Цистатины С и З из Вайик попсщсик;

Цистатины С из Масаса ти1айа и За1тш ксшгеик, соответственно;

Цистатин альфа (ингибитор эпидермальной тиоловой протеиназы) из Вайик погуещсик;

Цистатин В (ингибитор тиоловой протеиназы печени) из Ното кар1епк и Вайик пог\'ещсик, соответственно;

Цистатин (ингибитор тиоловой протеиназы молозива) из Вок 1аигик;

Цистатины из Са11ик да11ик и СоШгшх со1игшх _)арошса, соответственно;

Цистатин из Сурппик сагрю;

Цистатин из В1йк апеШак;

Цистатин I из 2еа таук;

ОризацистатинИ из Огуха каШ'а;

Оризацистатин-П из Огуха каШ'а;

Цистатин А из НейаШкик аппиик;

Цистатин В из Нейап1йик аппиик;

Цистатин из У1дпа ипдшси1а!а;

Онхоцистатин из Опскосегса νо1νи1ик;

Ингибитор цистеиновой протеиназы из

Зо1апит 1иЬегокит;

Цистатин ^СИ-З из \У1к1епа йойЬипйа;

Цистатин из С1усше тах и

Кининогены из Вок 1аигик, Ното кар1епк и Вайик погеедкик, соответственно, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Калпаиновое семейство ингибиторов цистеиновых протеаз

Калпастатин из Вок 1аигик, Сегсорйкесик аейпорк, Ното кар1епк, Мик тикси1ик, Зик ксгоГа, Огус1о1адик сишси1ик, Вайик поп'едюик и О\1к апек, соответственно, а также ингибиторы, го мологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Тканевый ингибитор семейства металлопротеиназ

Ингибитор 1 металлопротеиназы из Вок (аигик, Ното кар1епк, Мик тикси1ик, Рарю супосерНайк, 8ик ксгоГа, Огус!о1адик сишсШик, Ва!!ик погуедюик и Оу15 апек, соответственно;

Ингибитор 2 металлопротеиназы из Вок !аигик, Ното кар1епк, Мик тикси1ик, Ва!!ик поггедюик и Са11ик да11ик, соответственно, и

Ингибитор 3 металлопротеиназы из Вок !аигик, Ното кар1епк, Мик тикси1ик, Ва!!ик поггедюик и Са11ик да11ик, соответственно, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Ингибиторы карбоксипептидазы А

Ингибитор карбоксипептидазы А из Аксапк киит, а также ингибиторы, гомологичные ему, выделенные из других источников, чем Аксапк киит.

Ингибиторы металлокарбоксипептидазы

Ингибиторы металлокарбоксипептидазы из ЬусорегкШоп екси1еп!ит и 8о1апит !иЬегокит, соответственно, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента

Ингибитор ангиотензин-превращающего фермента из ТЬиппик а1Ьасагек;

Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента из ВоЛгорк шки1апк;

Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента из ВоШгорк _)агагаса;

Ингибитор ангиотензин-превращающего фермента из Адк1к!гобоп ПаНк Ь1от1юГП;

Ингибитор ангиотензин-превращающего фермента из Адк1к!гобоп Пайк ра11ак и

Ингибитор ангиотензин-превращающего фермента из У1рега акр1к, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Ингибиторы протеаз, не принадлежащие к конкретному семейству Экотин из ЕксЬепсЫа сой;

Ингибитор металлопротеиназ из 8!гер!отусек шдгексепк;

Ингибитор протеиназ из ЕгАша сЬгукапЛетЕ

Ингибитор протеиназ из Ркеиботопак аегидтока;

Ингибитор 3 протеазы А из 8ассЬаготусек сегеуыае;

Ингибиторы 1 и 2 протеазы В из 8ассЬаготусек сегеуыае;

Ингибитор Р1-3 основного пепсина из Аксапк киит;

Внутриклеточный ингибитор протеиназ из

ВасШик киЬ!Шк;

Ингибитор протеиназ РТ1 из 8о1апит !иЬегокит;

Ингибитор протеиназ РТ1-1 из 8о1апит !иЬегокит;

Ингибитор протеиназ НА из 8о1апит !иЬегокит;

Ингибитор протеиназ 11В из 8о1апит !иЬегокит;

Ингибиторы протеиназ А и В из 8адШапа кадбиГоНа;

Ингибитор протеиназ из 8о1апит те1опдепа;

Ингибитор трипсина из Вгаккюа парик;

Ингибитор трипсина 2 из 8тар1к а1Ьа;

Ингибитор трипсина из 2еа таук;

Ингибитор трипсина из 8тар1к агуепык;

Ингибитор трипсина из Тпс1юкап111ек кШ1о\уп;

Индуцированный поранением ингибитор ΙΙ протеиназы из Ьусорегккоп екси1еп!ит;

Ингибиторы протеазы ЬСМ1 I и РМР-Э2 из Ьосик!а пидгаЮпа;

Ингибитор протеазы из ВасШик Ьгеу1к;

Мариностатины С-1, С-2 и Ό из А1!еготопак кр. И

Ингибитор протеазы хозяина из бактериофага Т4, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Семейство ингибиторов альфа-амилазы/ трипсина злаков

Ингибитор альфа-амилазы/трипсина СМ1 из ТгШсит аекйуит;

Ингибитор альфа-амилазы/трипсина СМ2 из ТгШсит аекйуит;

Ингибитор альфа-амилазы/трипсина СМ3 из ТгШсит аекйуит;

Ингибитор альфа-амилазы/трипсина СМ16 из ТгШсит аекйуит;

Ингибитор альфа-амилазы/трипсина СМ17 из ТгШсит аекбуит;

Ингибитор альфа-амилазы 0.19 из ТгШсит аекШтпп;

Ингибитор альфа-амилазы 0.28 из ТгШсит аекШтпп;

Ингибитор альфа-амилазы 0.53 из ТгШсит аекШтпп;

Ингибитор альфа-амилазы ΑΌΛΙ-3 из ТгШсит аеШуит;

Ингибитор альфа-амилазы/трипсина СМА из Ногбеит уи1даге;

Ингибитор альфа-амилазы/трипсина СМВ из Ногбеит уи1даге;

Ингибитор альфа-амилазы/трипсина СМС из Ногбеит уи1даге;

Ингибитор альфа-амилазы/трипсина СМО из Ногбеит уи1даге;

Ингибитор альфа-амилазы СМЕ из Ногбеит уи1даге;

Ингибитор альфа-амилазы ВМА1-1 из Ногбеит уи1даге;

Ингибитор альфа-амилазы ΒΩΛΙ-1 из Ηογбеит уи1даге;

Ингибитор альфа-амилазы/трипсина из Е1еикте ^гасат и

Ингибитор трипсина/фактора Х11а из Ζеа таук, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Ингибитор альфа-амилазы/трипсина, гомологичный тауматину

Ингибитор альфа-амилазы/трипсина из Ζеа таук, а также ингибиторы, гомологичные ему, выделенные из других источников, чем Ζеа таук.

Семейство ингибиторов альфа-амилазы/ субтилизина

Ингибитор альфа-амилазы субтилизина из ^Меит уи1даге; Ингибитор альфа-амилазы субтилизина из Тпбсит аекбгит и Ингибитор альфа-амилазы субтилизина из Огухае кабое, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Ингибиторы альфа-амилаз насекомых

Небольшой белковый ингибитор альфаамилаз 1, 2 и 3 насекомых из δο^дйит Ь^сο1ο^ ιηί1ο, а также ингибиторы, гомологичные ему, выделенные из других источников, чем δοΓ§1ιιιιη 6Κο1ογ ιηί1ο.

Ингибиторы альфа-амилаз млекопитающих, полученные из видов 8кгеркошуеез

Ингибитор альфа-амилазы НА1М I из δΙΐΌρΙοιη\^κ ^Γί^οκροκπκ;

Ингибитор альфа-амилазы РА1М I из δΙΐΌρΙοιη\^κ ο1^νасеον^^^б^к;

Ингибитор альфа-амилазы НА1М II из δΙΐΌρΙοιη\^κ ^Γί^οκροκπκ;

Ингибитор альфа-амилазы РА^ II из δΙΐΌρΙοιη\^κ ο1^νасеον^^^б^к;

Ингибитор альфа-амилазы АВ3688 из δΙΐΌρΙοιη\^κ аи^еοΓас^еπк;

Ингибитор альфа-амилазы Ζ-2685 из δΙΐΌρΙοιη\^κ госНе! и

Ингибитор альфа-амилазы НОЕ-467А из δΙΐΌρΙοιη\^κ кепбае, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Ингибиторы трегалазы

Ингибитор трегалазы из Репр1апека атепсапа, а также ингибиторы, гомологичные ему, выделенные из других источников.

Ингибиторы полигалактуроназы

Ингибиторы галактуроназы из ΡНакеο1ик νи1да^^к и Ругик а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Ингибиторы фукозилтрансферазы

Фуктинины из Яаккик а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников.

Ингибиторы протеинкиназы С

14-3-3-белок бета/альфа из Вοк каигик, О\зк апек, Ηοтο кар1епк и Яаккик соответственно;

14-3-3-белок эпсилон из Мик тикси1ик, О\зк апек, Ηοтο кар1епк и Яаккик соответственно;

14-3-3-белок эта из Вοк каигик, Мик тикси1ик и Яаккик соответственно;

14-3-3-белок гамма из Вοк каигик, О\зк апек и Яаккик соответственно;

14-3-3-белок дзета/дельта из Вοк каигик, Мик тикси1ик, О\зк апек, Ηοтο кар1епк и Яаккик соответственно;

Белок Ншк из Вοк каигик, Яаккик

Ηοтο кар1епк, Мик тикси1ик и ОгусЮкщик сишси1ик, соответственно, и

Цинксвязывающий белок 14 кДа из Вгаккка щпсеа и Ζеа таук, соответственно, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Ингибиторы цАМФ-зависимой протеинкиназы

Ингибитор цАМФ-зависимой протеинкиназы (формы из мышц/головного мозга) из Ηοтο кар1епк, ОгусЮкщик сишси1ик, Мик тикси1ик и Яаккик соответственно, и

Ингибитор цАМФ-зависимой протеинкиназы (формы из яичка) из Мик тикси1ик и Яаккик соответственно, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Ингибитор циклический нуклеотидфосфодиэстеразы

Ингибитор циклический нуклеотидфосфодиэстеразы из Ο^νο^1ίιιιη бй^беит, а также ингибиторы, гомологичные ему, выделенные из других источников.

Ингибиторы протеинфосфатазы

Ингибитор 1 протеинфосфатазы из Ηοтο кар1епк, ОгусЮкщик сишси1ик и Яаккик соответственно;

Ингибитор 2 протеинфосфатазы из Ηοтο кар1епк, ОгусЮ1адик сишси1ик и Яаккик соответственно;

Ингибитор ПРР2А термостабильной протеинфосфатазы 2а из Вοк каигик и Ηοтο кар1епк, соответственно, и

Ингибитор фосфатазы ЯАРА из ВасШик киЬкШк, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

ТСИ/МК86-семейство ингибиторов диссоциации СИР (ГДФ)

Ингибитор диссоциации СИР (ГДФ) секреторного пути из δассйа^οтусек сегегыае;

Ингибитор альфа диссоциации ЯаЬ СИР из Вοк каигик, Ηοтο кар1епк, Мик тикси1ик и Яаккик соответственно;

Ингибитор бета диссоциации КаЬ СОР из Воз !ашиз, Ното зар1епз, Миз тизси1из и Кайиз погуедкиз, соответственно;

Ингибитор 1 диссоциации Кйо СОР из Воз (аигиз, Ното зар1епз, СаепогйаЬбйгз е1едапз и Са\аа рогсе11из, соответственно;

Ингибитор диссоциации Кйо СОР из 8ассйаготусез се^еν^з^ае;

Ингибитор 2 диссоциации Кйо СОР из Ното зар1епз и Миз тизси1из, соответственно, и

Ингибитор диссоциации Кйо СОР из Миз тизси1из, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Ингибиторы АТФ-азы

Ингибиторы митохондриальной АТФ-азы из Воз (аигиз, СаепогйаЬбШз е1едапз, Р1сЫа )аб1пл, 8из зсгоГа, Кайиз пог^'ед1сиз и 8ассйаготусез сеге\аз1ае, соответственно, и

Ингибитор натрий/калий-АТФ-азы из 8из зсгоГа, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Ингибиторные белки фосфолипазы А2

Аннексии I из Воз (аигиз, Ното зар1епз, Миз тизси1из, 8из зсгоГа, Кайиз пог^'ед1сиз, Огус!о1адиз сишси1из, Са\аа си(1еп, Са11из да11из и Со1итЬа Ιίνίη, соответственно;

Аннексии III из Ното зар1епз и Кайиз погνед^сиз, соответственно;

Аннексии V из Ното зар1епз, Миз тизси1из, Кайиз поггедюиз и Са11из да11из, соответственно;

Утероглобулин из Огус!о1адиз сишсШиз и Ьериз сарепз1з, соответственно, и

Ингибитор фосфолипазы А2 из Тпшегезигиз Г^оу^зз, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Ингибиторы рибонуклеазы

Вагз(аг из Васй1из ату1о1й|иеГас1епз;

Ингибитор рибонуклеазы из Ното зар1епз, 8из зсгоГа и Кайиз пог^'ед1сиз, соответственно, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников, чем упомянутые конкретно здесь.

Ингибиторы РНК-полимеразы

Ингибиторы бактериальной РНКполимеразы из бактериофагов Т3 и Т7, а также ингибиторы, гомологичные им, выделенные из других источников.

Ингибиторы нуклеаз присоединения ДНК

Белок компетентности I из ВасШиз зиЬййз, а также ингибиторы, гомологичные ему, выделенные из других источников.

Ингибиторы бета-лактамазы

Ингибитор бета-лактамазы из 8(гер(отусез с1аνи1^де^из, а также ингибиторы, гомологичные ему, выделенные из других источников.

К этому списку ингибиторов ферментов могут быть добавлены функционально родственные ингибиторы, такие как ингибитор транспорта кальция семиналплазмин (семенной плазмин) из Воз (аигиз и Миз тизси1из, соответственно, а также ингибиторы, гомологичные ему, выделенные из других источников.

К приведенному выше перечню пригодных каркасных молекул для применения в данном изобретении, должны быть добавлены другие агенты, влияющие на активность ферментов. Одним представляющим интерес кандидатом является тиоредоксин.

Все перечисленные выше каркасные молекулы могут быть заменены эффективной частью полной молекулы.

Свойства каркасной молекулы

Поскольку библиотека пептидов предположительно может достигать любого компартмента клетки, выгодно, чтобы каркасный белок ингибитора фермента не был слишком большим и чтобы он был стабильным, например, к протеолитическому разрушению и нечувствительным к восстанавливающей среде в эукариотических клетках. Таким образом, его функционирование предпочтительно не должно зависеть от образования дисульфидных связей, так как они не образуются в цитозоле или ядре таких клеток. Кроме того, каркасный белок должен содержать одну или несколько обнаженных петель, в которые пептиды могут быть встроены без заметного изменения структуры или стабильности данного белка. На основе этого ингибитор 2А химотрипсина (см. обсуждение ниже) является подходящим каркасом, но и другие каркасы, такие как приведенные ниже примеры, могли бы также использоваться.

Члены библиотеки пептидов, введенные в клетки-мишени, могут вызывать изменение фенотипа клеток-мишеней либо прямым, либо непрямым (трансдоминантным) взаимодействием. Однако способ данного изобретения не только делает возможной идентификацию последовательности пептида или рибонуклеиновой кислоты, которая ответственна за прямое или опосредованное действие на фенотип, но также позволяет очистить, выделить и идентифицировать молекулу-мишень, с которой взаимодействует этот пептид.

В данном описании полученный из ячменя ингибитор 2А химотрипсина использовали в качестве примера, в основном потому, что этот белок очень хорошо охарактеризован и является чрезвычайно стабильным. Однако должно быть понятно, что применение этого ингибитора фермента в примерах никаким образом не должно ограничивать объем данного изобретения.

Ингибитор 2А химотрипсина из ячменя принадлежит к большому семейству гомологичных ингибиторов протеаз, обнаруживаемых главным образом в растениях. Это семейство включает в себя ингибиторы химотрипсина ячменя 1А, 1В, 2А и 2В, ингибитор I картофеля, индуцированный поранением ингибитор I томатов, чувствительный к этилену ингибитор томатов, ингибитор I плодов диких томатов, ингибитор субтилизина из конских бобов, ингибитор субтилизина из фасоли угловатой (адзуки), ингибитор трипсина/фактора Хагемана из тыквы, ингибитор горькой тыквы, специфический для протопластов ингибитор трипсина из Мсойапа кП^'е^пк, ингибитор субтилизина из табака, ингибитор трипсина/субтилизина из щирицы (амаранта) и ингибитор канавалии мечевидной. Единственным членом этого семейства ингибиторов, который является ингибитором нерастительного происхождения, является ингибитор эглин С эластазы/катепсина С, получаемый из пиявок.

Ингибитор 2А химотрипсина (С1-2А) был первоначально очищен из эндосперма обогащенного лизином ячменя ΗίρΐΌΚ, и было показно, что он является прочно связывающим ингибитором микробных субтилизинов Карлсберга и Ново, а также химотрипсина. Ν-концевой аминокислотный остаток в С1-2А имеет защищенную аминогруппу, так как прямое секвенирование аминокислот было безуспешным. Однако большая часть аминокислотной последовательности С1-2А была определена на уровне белка. Кроме того, было показано, что С1-2А, очищенный из ячменя, процессируется на Ν-конце либо во время синтеза и накопления в эндосперме, либо в процессе очистки. Отсутствие 17 Νконцевых аминокислотных остатков не влияет на образование комплекса С1-2А с субтилизинами. Путем объединения результатов аминокислотного секвенирования и секвенирования кДНК было установлено, что С1-2А состоит из 83 аминокислотных остатков в единственной полипептидной цепи, не содержащей дисульфидных связей. Блокированным (защищенным) Ν-концевым аминокислотным остатком является серии. Было определено, что реакционноактивным сайтом в С1-2А является пептидная связь Ме159-С1и60, и было показано, что остатки в районе 11е56-Агд62 участвуют в межмолекулярных контактах между ингибитором и протеазой.

Трехмерные структуры не находящегося в комплексе С1-2А, а также С1-2А, находящегося в комплексе с субтилизином Νονο, известны из рентгеновской кристаллографии. Трехмерная структура С1-2А была также определена при помощи ЯМР-спектроскопии, показавшей, что реакционно-активная петля С1-2А является динамической. С1-2А состоит из одной α-спирали, стыкующейся с четырьмя β-цепями. Поверхно стная петля простирается поперек свободной стороны этого листа и состоит из восьми остатков: С1у54-Туг61. В противоположность большинству ингибиторов ферментов, С1-2А не содержит дисульфидных связей, а также сайтов гликозилирования. В определенных структурах, найдены только 64 С-концевых аминокислотных остатка (Ь20-С83); этот укороченный вариант сохраняет функциональность нативного белка. Сравнение комплексированной формы с двумя некомплексированными формами С1-2А выявляет небольшие различия. Наиболее явным различием является то, что петля реакционноактивного сайта, по-видимому, имеет менее упорядоченную структуру в не находящихся в комплексе формах, чем в комплексированной форме. Трехмерную структуру С1-2А в комплексе с субтилизином Νονο сравнивали также с трехмерной структурой эглина С в комплексе с субтилизином Карлсберга. Эти два гомологичных ингибитора имели очень сходные вторичные и третичные структуры.

Рекомбинантные варианты укороченного на Ν-конце С1-2А (С1-2А (Ь20-С83)) и С1-2А с Ν-концевым А^-Рго-удлинением широко использовали для исследования укладки и стабильности С1-2А. Структура С1-2А в комплексе с субтилизином Νονο обнаружила, что число межмолекулярных контактов между ингибитором и протеазой в районе Р4-Р1 (11е56-Ме159) этого ингибитора является гораздо большим, чем в районе Р1'-Р3' (С1и60-Агд62).

Дополнительные аспекты изобретения

После идентификации модулятора в соответствии с подробно описанными способами данного изобретения, обычно представляет интерес обеспечение его в больших количествах для целей дальнейшего исследования и разработки, в том числе возможной идентификации молекулы-мишени, с которой физически взаимодействует этот модулятор.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает также способ получения способного к репликации экспрессирующего вектора, причем этот способ предусматривает стадии идентификации модулятора с использованием способов данного изобретения и затем выделения или синтеза последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует этот модулятор, и конструирования реплицируемого экспрессирующего вектора, содержащего оперон, который содержит, в 5'-3'-направлении и в функциональной связи, 1) промотор для запуска экспрессии этой последовательности нуклеиновой кислоты, 2) необязательно нуклеотидную последовательность, кодирующую лидерный пептид, 3) последовательность указанной нуклеиновой кислоты и 4) сигнал терминации.

Такие способы широко известны в области генной инженерии и молекулярной биологии. Квалифицированный специалист найдет соот ветствующее руководство, например, в 8атЬгоок, I; ВгИксЕ ЕЕ, МашаЕк Т. 1989. Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 2иЕ ЕЕ., Со1Е 8рпп§ НагЬог ЕаЬогаЮгу. Со1Е 8рпп§ НагЬог, Ν.Υ.

В этой части данного изобретения предпочтительно, чтобы промотор был индуцируемым; хотя конститутивные промоторы не исключаются. В зависимости от выбора клеткихозяина, предназначенной для несения и экспрессии вектора, промотор выбирают из группы, состоящей из бактериального промотора, грибкового промотора, такого как промотор дрожжей, и промотора млекопитающего. Вектор может быть в форме плазмиды, фага, космиды, минихромосомы или вируса, опять-таки в зависимости от выбора клетки-хозяина и других соображений, применяемых для конкретного случая. Однако, наиболее предпочтительно, чтобы экспрессирующий вектор был способен интегрироваться в геном подходящей клеткихозяина, так как в этом случае экспрессия в ней будет более стабильной во времени, чем в случае нехромосомной трансформации клеткихозяина.

Хорошо известные векторные системы основаны на бактериальной плазмиде рВК.322, λфаге и дрожжевой плазмиде ΥΚρ7, но квалифицированному специалисту известны и другие пригодные и осуществимые возможности выбора.

После обеспечения подходящего экспрессирующего вектора, как описано выше, предпочтительно, чтобы модулятор получали трансформацией подходящей клетки-хозяина экспрессирующим вектором, полученным, как описано выше. Такой клеткой-хозяином может быть бактериальная клетка (например, Е. соЕ, ВасШик киЬЕЕк или любая другая подходящая бактериальная клетка-хозяин), грибковая клетка (например, дрожжевая клетка, такая как 8ассНаготусек сегеу1К1ае или Рюс1а ракЮпк) или клетка растения, насекомого или млекопитающего (которая может быть любой из клеток или типов клеток, обсужденных выше для использования в качестве по существу идентичных клеток в способе данного изобретения).

После обеспечения линии клетокпродуцентов, как описано выше, теперь можно получать модулятор данного изобретения путем выращивания трансформированной клетки, полученной, как описано выше, в культуральной среде в условиях, которые облегчают экспрессию этой клеткой случайно модифицированной нуклеотидной последовательности, и затем сбора продукта экспрессии из клетки и/или культуральной среды. Альтернативно, модулятор может быть получен посредством химического синтеза модулятора на основе последовательности, определенной в стадии (е). В том случае, когда модулятор является пептидом, могут быть использованы хорошо известные способы пеп тидного синтеза в твердой или жидкой фазе, и также, если модулятор является рибонуклеиновой кислотой, способы его синтетического получения являются легко доступными.

Важная часть данного изобретения относится к выделению/идентификации биомолекулмишеней, на которые направлен модулятор, идентификация, выделение и получение которого описано выше. Таким образом, важная часть данного изобретения относится к способу выделения и/или идентификации биомолекулымишени, предусматривающему обеспечение модулятора в соответствии со способами, описанными здесь, и затем использование этого модулятора в качестве аффинного лиганда в стадии аффинной очистки таким образом, чтобы выделить биомолекулу-мишень из подходящей пробы. Стадией аффинной очистки может быть, например, стадия аффинной хроматографии, стадия аффинной масс-спектрометрии или стадия иммунной копреципитации. Однако может быть использован любой подходящий способ выделения/очистки на основе аффинности.

Альтернативно, модулятор может быть использован в качестве зонда в отношении библиотеки кДНК, полученной, по существу, из идентичных клеток или в качестве наживки в ди- или тригибридной системе (бактериальной, грибковой системе или системе млекопитающего).

Предпочтительно, чтобы биомолекуламишень была пептидом или нуклеиновой кислотой, так как это делает возможным также определение ее последовательности.

Потенциальным применением такой биомолекулы-мишени является использование ее в программе разработки лекарственных средств. Для этой цели часто является ценным выяснение или получение информации о 3-мерной структуре биомолекулы-мишени (с использованием доступных способов, например, рентгенографических исследований, ЯМР-анализа, кольцевого дихроизма и т.д.).

После выделения биомолекулы-мишени, как описано выше, данное изобретение делает возможным рациональный выбор химического соединения для применения в качестве возможного лекарственного средства-кандидата в разработке лекарственных средств, причем данный способ предусматривает стадии:

испытания библиотеки химических соединений на взаимодействие с биомолекулоймишенью, которая была выделена Ее иоуо в соответствии со способами данного изобретения, и отбора соединений, которые взаимодействуют в значительной степени с этой биомолекулой-мишенью.

Таким идентифицированным кандидатом на лекарственное средство может быть соединение-пример или само соединение-кандидат на лекарственное средство. Под термином со единение-пример в данной заявке подразумевают соединение, которое само непригодно в качестве лекарственного средства, но которое проявляет ряд свойств, которые представляют интерес в точки зрения медицинской терапии. Причиной того, что такое соединение-пример является непригодным, могут быть токсичность, неподходящие фармакокинетические или фарма-кодинамические свойства, трудности в получении и очистке и т.д. В таких случаях, это соединение-пример используют в качестве модели для бе поуо синтеза других химических соединений, которые конструируют таким образом, чтобы они были близкими активной части этого соединения-примера в трехмерной (3Ό) структуре и распределении заряженных, полярных и неполярных групп.

Этот подход может быть уточнен первоначальной идентификацией членов библиотеки при помощи способов компьютерного моделирования лекарственных средств, основанных на структуре или основанных не на структуре. Подходящие основанные не на структуре способы описаны в патенте США 5 307 287 и патенте США 5 025 388 (способ, известный как СоМЕА). Альтернативой является НА8Ь (гипотетическая решетка активного сайта; программное обеспечение гипотез). Оба эти способа основаны на 3Б-О8ЛЕ. Пригодный подход на основе структуры описан, например, в XV О 95/06293.

Наконец, очень важная часть данного изобретения касается способа получения лекарственного продукта, причем этот способ предусматривает стадии:

a) выбора химического соединения при помощи вышеописанных способов данного изобретения,

b) проведения преклинических испытаний с этим химическим соединением для оценки его пригодности в качестве лекарственного продукта,

c) вступления, если химическое соединение признано пригодным в стадии Ь), в клинические испытания с использованием этого химического соединения для получения разрешения выхода на рынок для лекарственного продукта, включающего в себя это химическое соединение в качестве фармацевтически активного вещества, и

б) при получении разрешения выхода на рынок, смешивания данного химического соединения с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или разбавителем и маркетинга полученного таким образом лекарственного продукта.

Другими словами, данное изобретение включает в себя способ разработки лекарственного продукта, предусматривающий, что модулятор, идентифицированный в соответствии со способом данного изобретения, служит в качестве соединения-примера в фазе разработки, или способ, в котором биомолекула-мишень, выделенная/идентифицированная в соответствии с данным изобретением, служит в качестве зонда взаимодействия в отношении предполагаемых лекарственных средств-кандидатов в фазе обнаружения лекарственного средства.

Вышеописанные способы должны, конечно, учитывать все необходимые требования для удовлетворения стандартов ССР и СМР. Во всяком случае, этот способ полностью зависит от первоначального обеспечения модулятора, идентифицированного в соответствии с данным изобретением.

Подписи к чертежам

Фиг. 1. Схематическое представление ρСМVЬ^ρеρ/СI-2А с указанными функциональными цис-элементами, обнаруженными в ρСМVЬ^ρеρ.

Сверху представлено схематическое представление ρСМVЬ^ρеρ, а район кДНК С1-2А расширен в иллюстрациях ниже, показывающих положение различных сигнальных пептидов (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:35-37), присутствующих в ρСМVЬ^ρеρΕК/СI-2А, ρСМVЬ^ρеρN^8/СI-2А и ρСМVЬ^ρеρ8^/СI-2А, соответственно. Дополнительные аминокислоты, присоединенные в С12А, написаны в однобуквенном коде с подчеркнутыми незаменимыми аминокислотными последовательностями, необходимыми для функции. Аббревиатуры: сигнал ядерной локализации, ΝΣ8; эндоплазматичский ретикулум, ЕК; секреторная лидерная последовательность, 8Ь; сигнал удерживания, КБ.

Фиг. 2. Общие экстракты из трансдуцированных СМVЬ^ρеρ/СI-2А клеток способны ингибировать протеазную активность субтилизина.

Субтилизин инкубировали с увеличивающимися количествами экстрактов из указанных клеточных линий, трансдуцированных либо Ε\1\Εΐ]Κ'ρ (МН-3Т3, И208тСАТ и 293тСАТ), либо (ШН-3Т3/С1-2А,

И2О8тСАТ/С1-2А и 293тСАТ/С1-2А), и затем оценивали на остаточную протеолитическую активность. Каждую реакцию с указанной концентрацией экстракта определяли в трех повторностях и представленные скорости основаны на средних величинах.

Фиг. 3. Ядерный экстракт из трансдуцированных СМVЬ^ρеρN^8/СI-2А клеток ШН-3Т3, но не из трансдуцированных СМVЬ^ρеρ/СI-2А клеток МН-3Т3, проявляет активность С1-2А.

A) Субтилизин инкубировали либо с 2, либо с 10 мкл ядерного экстракта из клеток ШН3Т3, трансдуцированных либо СМVЬ^ρеρ (-), 0771)1)^/01^ (С1-2А), либо СМVЬ^ρеρN^8/ С1-2А (ХЪ8/С1-2А) и затем оценивали на протеолитическую активность.

B) Как для А, за исключением того, что использовали 0,4 или 2 мкл общего клеточного экстракта. Каждую реакцию с указанной концентрацией экстракта определяли в трех по вторностях и представленные скорости основаны на средних величинах.

Фиг. 4. Схематическое представление конструкций рРАВ60.

Верхняя панель: рРАВ60/С.Ч-2А содержит укороченный вариант СР2А, который встроен в рамке считывания с лидерной последовательностью ре1В на 5'-конце и делетированным геном, кодирующим фрагмент белка III поверхности фага М13 (АдШ), на З'-конце. Лидер ре1В направляет экспрессируемый слитый белок к бактериальной мембране, облегчая включение слитого белка СМА/АрШ в фаговые частицы.

Средняя панель: рРАВ60/тиСЧ-2А содержит кДНК СР2А, включающую в себя сайты узнавания для рестриктаз МипП и 8а1Р

Нижняя панель: рВАВ60/тиСЧ-2А_гс имеет аминокислоты 58-61 вместо подчеркнутых 19 случайно составленных аминокислот (8Е0 ГО N0:38, остатки 2-20). Эти аминокислоты показаны в однобуквенных кодах и цифры относятся к немодифицированной аминокислотной последовательности С.Ч-2А (срав. нумерацию в 8Е0 ГО N0:2).

Фиг. 5. С.Ч-2А и С'Ч-2А_гс могут быть выставлены на поверхности фаговых частиц.

Антитела против С.Ч-2А иммобилизовали и инкубировали с 0 или 5 х 10¹¹ фаговых частиц, полученных и очищенных согласно 1ойапзеп е( а1., 1995, Рго!еш Епд. 10, рр. 1063-1067, и их определяли количественно измерением 0Ό₂₆₉. Использовали С'Ч-2А-отрицательные (-), С.Ч-2А или С'Ч-2А_гс несущие фаговые частицы. Удержанные фаговые частицы в конце концов детектировали с использованием антител против фага, конъюгированных с пероксидазой хрена. Представленные результаты являются средними величинами из 4 независимых измерений с указанным стандартным отклонением.

Фиг. 6. Конструирование представленной С.Ч-2А библиотеки с использованием клонирующих сайтов Миш и 8а1Р

A) Вырожденный олигонуклеотид (олиго) (8Е0 ГО N0:33, остатки 21-46), охватывающий сайты узнавания для МиШ и 8аП, превращают в двухцепочечную форму в одной реакции удлинения.

B) Схематическое представление модифицированной кДНК пептидной библиотеки С'Ч2А.

C) Трехмерная структура 64 С-концевых аминокислот. Замененные аминокислоты показаны в виде белых участков с последовательностью рандомизированного гена С.Ч-2А над ними.

Фиг. 7. Конструирование представленной С.Ч-2А библиотеки с использованием клонирующих сайтов ВатШ и 8а1Р

А) 5'-часть кДНК С.Ч-2А может быть приготовлена с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов, которые после отжига удлиняют с использованием ДНК-полимеразы. Затем полученный фрагмент может быть расщеплен ВатШ и 8аП перед лигированием в рСМАЫрер/тиСР2А.

В) Другой стратегией является применение рандомизированного олигонуклеотида в ПЦР вместе с расположенным выше по ходу транскрипции прямым праймером. И в этом случае фрагмент ВатШ/ЗаП может быть очищен и лигирован в рСМАЫрер/тиСМА.

Предисловие к примерам

Далее, данное изобретение иллюстрируется посредством примера, в котором С.Ч-2А использовали в качестве исходной точки для способа Се118сгееп™, приспособленного в соответствии с данным изобретением таким образом, чтобы сделать возможной внутриклеточную экспрессию каркасного белкового ингибитора, который случайным образом модифицирован в активном сайте. Этот пример не является ограничивающим, в том смысле, что другие подходящие белковые ингибиторы ферментов могли бы быть использованы вместо С.Ч-2А. Квалифицированный специалист может легко выполнить необходимые замены и модификации, необходимые для применения принципов, приведенных в примерах ниже, с использованием других белковых ингибиторов ферментов в качестве исходной точки.

Пример 1. Материалы и способы.

1-а. Конструирование рСМАЫрер/СМА.

Гибридная плазмида 5788 п.н. рСМАЫрер (последовательность которой представлена в 8Е0 ГО N0:39 и которая показана схематически на фиг. 1 с СР2А, встроенной справа от сигнала упаковки) состоит из происходящей из АКV ретровирусной вставки, которая была клонирована в клонирующий вектор рИС-19. Эта ретровирусная вставка содержит химерный 5'-ЬТК (длинный концевой повтор), делающий возможной экспрессию от сильного промотора цитомегаловируса (СМУ) при запуске транскрипции из этой плазмиды. После интеграции этого вектора в геном хозяина транскрипция запускается от ретровирусного ЬТК. Гибкий полилинкер присутствует ниже по ходу транскрипции (справа) от сигнала упаковки. Это делает возможной инсерцию пептидных библиотек в этом положении. Непосредственно справа от полилинкера находится внутренний сайт вхождения рибосом ДКЕ8), происходящий из вируса энцефаломиокардита (ЕМС) (Коо е( а1. 1992, фиг. 2А-С). Это делает возможной эффективную трансляцию от этой расположенной справа экспрессионной кассеты САР-независимым ДКЕ8) образом. Маркерный ген №о находится в расположенной справа экспрессионной кассете.

рСМАЫрер включает в себя химерный промотор/энхансер СМУ и Акт. Он был сконструирован из векторных плазмидных конструкций РИТ 649 (САУЕА, 1ои1оизе РКА^Е) и АкгВ|Рер (Оисй е( а1., неопубликованные данные, описанные ниже). АкгВ|Рер расщепляли

ЕсоВ1 и АкЛ и фрагмент 2779 п.н. от положения 3293-5670 до 401 выделяли и лигировали с фрагментом 543 п.н., содержащим положения 44-548 энхансера/промотора СМV. Этот фрагмент получали ПЦР-амплификацией продукта расщепления ЕсоШ и АкЛ ΡυΤ 649 с использованием следующих двух праймеров: 66ΤСА66ААΤΤСΤСС66ААΤΤ66СΤА6ССΤ А6А6ΤСС6ΤΤАСАΤААСΤ (8ЕС) ГО ^:40) и 6А66АСΤ66С6С6СС6А6Τ6Τ6666ΤΤСΤΤ АСССΤΤΤΤΤАΤА6АССΤСССАСС6ΤАСАС6 ССТ (8Еф ГО NО:41). Полученный фрагмент расщепляли АкЛ и лигировали с фрагментом АкЛ ΛкνΒ^Ρер (фрагмент от положения 828 до 3293).

ΛкνΒ^Ρер конструировали расщеплением рВ12ео-№о ГОисй еί а1., В|о1есйп1циек, 1999, 26(6): 1032-4, 1036) ВатН и 8ίπΕ Фрагмент от 1708-6054 до 1240 лигировали с фрагментом ДНК, полученным удлинением двух олигонуклеотидов. Этими олигонуклеотидами были: А6АΤСΤСС6А66ССΤ666АСССΤΤС6ААΤΤС6ΤΤААСΤ6АΤСААС6С6ΤΤСΤА6АСΤАС АΤ66С66СС6С6Τ6ΤΤΤ (8ЕС) ГО ^:42) и 66666АΤССА6А6СΤС6А6СΤΤΤ6АААААС АС6С66СС6ССАΤ6 (8 ЕС) ГО N0:43). После удлинения и перед лигированием этот фрагмент ДНК расщепляли ВатШ и 81и1. Эта операция удаляет ген 2ео в рВ12ео-№о и замещает их полилинкером.

Для конструирования рСМУЫрер/СМА 2 мкг рСМУЫрер расщепляли ВатШ/Хйоф как описано в А-5. Фрагмент 5778 п.н. очищали затем из 0,8% агарозного геля в соответствии с А7. Фрагмент кДНК СЕ2А, кодирующий аминокислоты 21-83 (срав. нумерацию аминокислот в 8Еф ГО NО:2) белка СЕ2А дикого типа, слитые с находящимся в рамке считывания стартовым кодоном метионина, амплифицировали с использованием ПЦР из произведенной из риС 19 плазмиды, содержащей фрагмент, кодирующий белок СЕ2А дикого типа (срав. нумерацию нуклеотидов в 8Еф ГО NО:1) (любезный подарок от доктора Ш 6. С1аикеп, №уо Шгйю А/8, Эептагк) - этот фрагмент кДНК включает в себя последовательность нуклеотидов 8Еф ГО NО:1, где нуклеотиды 249, 252 и 279 представляют собой Т, С и Т, соответственно. Условия ПЦР в этих 4 проводимых реакциях были такими, какие описаны в А-3, с использованием следующих праймеров: С666АΤССАΤ6АА6АСА6Τ 66ССА6А6 (8ЕС) ГО N0:3) и С6СΤС6А6ΤСА 6СС6АСССТ6666АССТ (8 ЕС) ГО N3:4), которые фланкируют описанный район СЕ2А с сайтами узнавания для ВатШ и ХйоЕ Эту реакционную смесь использовали для 15 трехступенчатых циклов 94°С в течение 1 мин, 60°С в течение 30 с, 72°С в течение 30 с с последующей очисткой амплифицированного фрагмента ДНК, как описано в А-3, с объемом элюции 100 мкл. Затем очищенный фрагмент ДНК расщепляли (см. раздел А-5) и очищали (см. раздел А

7) с использованием 40 единиц ВатШ и XйοI с 120 мкл в качестве конечного объема реакции. Этот фрагмент лигировали в расщепленную ΒатΗI/XйοI рСМУЫрер (см. раздел А-1) и подтверждали ДНК-секвенированием (раздел А-8) с использованием специфического для рСМШо рер праймера СΤ6ΤАΤСΤ66С66СΤСС6Τ66 (8ЕС) ГО ^:5).

1-Ь. Конструирование ртСАΤIВЕ8йуд.

Для трансдукции не мышиных клеток ретровирусными векторами, собранными из упаковывающей клеточной линии Вокс, конструировали вектор (ртСАΤIВЕ8йуд), кодирующий экстренный рецептор. кДНК тСАТ получали из

р.1ЕТ (А1Ьпйоп е1 а1. (1989) Се11 57, рр. 659-666) и встраивали в рШЕ8Нйуд (С1οηΤесй) с получением ртСАΤIВЕ8йуд. Это выполняли расщеплением р^ЕΤ в 1х буфере для рестриктазы ЕсοВI вместе с 2 единицами/мкл ЕсοВI (см. раздел А5). Выступающие 5'-концы продукта расщепления ЕсоВ1 достаивали с использованием полимеразы Кленова в соответствии с протоколом изготовителя (Νονν Епд1апй Вю1аЬк). После инкубирования в течение 1 ч пробу очищали экстракцией смесью фенол/СНС1₃ (см. раздел А-4) с последующим расщеплением 20 единицами ВатШ в реакционном объеме 20 мкл (см. раздел А-6) и очищали на 1,0% агарозном геле (см. раздел А-7). Этот фрагмент лигировали во фрагмент 5699 п.н. ΒатΗI/ΒкίXI рIВЕ8йуд, полученный в виде фрагмента тСАТ, за исключением того, что тупые концы происходили из сайта ВбЕХЕ После лигирования и трансформации полученные положительные клоны выделяли и подтверждали ДНК-секвенированием (раздел А-9) с использованием следующих праймеров АСА6СΤ66СССΤС6СА6АС (8 ЕС) ГО ^:6), СССАСΤ6СΤΤАСΤ66СΤΤАΤ (8 ЕС) ГО ^:7), Τ6666СΤ6САС6ΤСАΤΤΤ6 (8ЕС) ГО ^:8), Τ6Τ6СΤАС66С6А6ΤΤΤ66Τ (8ЕС) ГО ^:9), 66ΤΤС6Τ6ААА66СΤССАΤΤ (8ЕС) ГО ^:10) и 6АААΤ6ΤΤСАСААΤΤА6СССΤ6 (8ЕС) ГО N3:11).

1-с. Конструирование рСМVЬ^рерN^8/СI2А.

Олигонуклеотид, кодирующий сигнал ядерной локализации большого Т-антигена 8ν40, присоединяли в рамке считывания к Ν-концу укороченного варианта СЕ2А, расположенного в рСМ^трер/СМА (фиг. 1). Это конструирование выполняли при помощи ПЦР (см. раздел А2) с использованием 25 пмоль СΛΛСΛΤСΤАΤ66С66СС6САССАААААА6АА6 А6ААА66ΤА66АΤССАΤ6АА6АСА6А6Τ (8 ЕС) ГО ^:12) и С6СΤС6А6ΤСА6СС6АСС СΤ6666АССΤ (8ЕС) ГО ^:13) в качестве праймеров и рСМ^трер/СМА в качестве матрицы. Эту реакцию проводили в двух повторностях и использовали в 25 циклах, состоящих из 94°С в течение 1 мин, 45°С в течение 1 мин, 72°С в течение 1 мин. Раствор осаждали этанолом перед очисткой ДНК-фрагмента 250 п.н. с использованием 2% агарозного геля (см. раздел А-7). Концы этого фрагмента приводили в порядок добавлением 20 единиц Вд1П и ХПо1 и 6 мкл ΝΕ-буфера 3 к 60 мкл реакционного объема (см. раздел А-6), содержащего 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (Νο\ν Епд1апб В1о1аЬк). Продукты расщепления разделяли на 2% агарозном геле и затем очищали фрагмент 240 п.н. (см. раздел А-7) с объемом элюции 50 мкл. Этот фрагмент в конце лигировали в расщепленную ВатШ/ХМ рСМУЫрер (см. конструирование рСМУЫрер/С1-2А) и подтверждали ДНК-секвенированием (см. А-8).

1-б: Конструирование рСМУЫрер8Ь/С12А и рСМУЫрерЕВ/С1-2А.

Секреторный лидер (8Ь) амплифицировали при помощи ПЦР с использованием рВареРиго, содержащего сигнальный пептид тяжелой цепи иммуноглобулина человека (Веегй е! а1. (1994) б. Вю1. СПет. 269, рр. 2393123936) в качестве матрицы и 25 пмоль САА САТСТАТССАСТССАТСТСССССАТСС (8ЕС) ΙΌ ^:14) и САССАТССАСААТСАССС ССССТАССАС (8 ЕС) ΙΌ ^:15) в качестве праймеров. Условия реакции были такими же, какие описаны в конструировании рСМУЫрер№8/С1-2А. Амплифицированный продукт 74 п.н. после экстракции смесью фенол/СНС1₃ (см. раздел А-4) расщепляли ВатН1 и ВдШ, как описано в разделе А-5, за исключением того, что реакция включала в себя 1 мкл/мл бычьего сывороточного альбумина (Νονν Епд1апб В1о1аЬк). После расщепления фрагмент 68 п.н. очищали с использованием 3% плавящегося при низкой температуре агарозного геля (см. раздел А-6) с получением в результате объема 30 мкл.

Расщепленный ВатН1 вектор рСМУЫрер/С1-2А готовили по существу, как описано для конструирования рСМУЫрер/С1-2А, за исключением того, что 10 единиц кишечной фосфатазы теленка (Воейппдег МаппНеип) присутствовали во время последнего часа инкубационного периода. Затем очищенный фрагмент, содержащий секреторный лидер, лигировали в расщепленную ВатН1 рСМУЬ1рер/С1-2А (как описано в разделе А-1) с получением рСМУЫрер8Ь/С1-2А. Положительные клоны подтверждали ДНК-секвенированием (раздел А-8) с использованием СТСТАТСТССССССТССС ТСС (8ЕЦ ΙΌ NО:16) в качестве праймера.

Конструирование рСМУЬ1рерЕВ/С1-2А (фиг. 1) проводили присоединением сигнала удерживания к С-концу С1-2А в контексте рСМУЫрер8Ь/С1-2А. Сигнал удерживания присоединяли в рамке считывания с последовательностью С1-2А при помощи ПЦР с использованием

СТААТСТАСАСТАСАССТССТССТТС ТАСТССТССАСССССАСССТССССАССТС (8 ЕС) ΙΌ ^:17) и ССССАТССАТСААСАС АСАСТССССАСАС (8ЕС) ΙΌ ^:18) в качестве праймеров и рСМУЫрер/С^А в качестве мат рицы. Фрагмент 237 п.н. расщепляли ХЬа1 вместо Х1ю! и лигировали в расщепленную ΒашΗI/XЬаI рСМVЬ^рер8^/СI-2А, полученный в виде расщепленной ВатШ/ХМ рСМУЫрер. Все параметры реакции были аналогичны описанным для конструирования рСМУЫрер№8/СЬ2А.

1-е: Конструирование рСМУЫрер/тиСГ 2А.

Две молчащие мутации вводили в последовательность СТ2А 5-ступенчатой ПЦРпроцедурой. Первая ПЦР производила замену С¹⁹²^А (см. нумерацию в 8ЕЦ ΙΌ NО:1) и этот продукт после очистки использовали в качестве обратного праймера для амплификации кодирующего района СГ2А в рСМУЫрер/СМА. Этот С¹⁹²^А-мутированный фрагмент использовали в качестве матрицы для введения второй мутационной замены т³’№С (см. нумерацию в 8ЕЦ ΙΌ NО:1) с получением тем самым ПЦРпродукта, включающего в себя ранее введенную мутацию. Этот продукт с двумя мутациями использовали в качестве прямого праймера для амплификации рамки считывания, определенной рСМУЫрер/СМА. Все ПЦР проводили в двух повторностях и по существу выполняли, как описано в разделе А-2 с 25 циклами 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с и 72°С в течение 30 с. Продукты объединяли перед очисткой. В первой ПЦР использовали 50 нг рСМУЫрер/СГ2А в качестве матрицы с 50 пмоль следующих праймеров ССССССТТАТТССА АССССС (8 ЕС) ΙΌ ^:19) и СТСССССТССС ТАСААТТСТСАССАТСС (8 ЕС) ΙΌ ^:20). Продукт 248 п. н. очищали с использованием набора для очистки р^цшск РСВ рцпйсайоп к1! (см. раздел А-2) с объемом элюции 50 мкл (ПЦР продукт 1). Вторая ПЦР состояла из 12,5 мкл ПЦР-продукта 1 и 50 пмоль СТСТАТС ТССССССТСССТСС (8ЕС) ΙΌ ^:21) в качестве праймера с 50 нг рСМУЫрер/СМА в качестве матрицы. Всю реакционную смесь наносили на 2% агарозный гель и очищали продукт 448 п. н., как описано в разделе А-6 (ПЦР-продукт 2). Затем этот продукт использовали в качестве матрицы в третьей ПЦР, которая, кроме 12,5 мкл ПЦР-продукта 2, состояла из 50 пмоль СТСТАТСТССССССТСССТСС (8 ЕС) ΙΌ ^:22) и ССАСТТТСТССАСАААСАСССССА ССССАТССАТСССАТАТТСС (8 ЕС) ΙΌ ^: 23), приводящей к амплификации фрагмента 248 п.н. (ПЦР-продукт 3). Этот фрагмент очищали, как и ПЦР-продукт 2, перед использованием 12,5 мкл в качестве прямого праймера вместе с 50 пмоль ССССССТТАТТСС ААССССС (8 ЕС) ΙΌ ^:24) и 50 нг рСМУЫрер/СГ2А в качестве матрицы. ДНК-фрагмент 448 п.н. с двумя мутациями после очистки на геле ПЦР-амплифицировали с использованием 50 пмоль ССССССТТАТТССААССССС (8 ЕС) ΙΌ ^:25) и СТСТАТСТССССССТСССТС

С(ЬЕО ГО NО:26). Этот амплифицированный фрагмент с двумя мутациями встраивали в рСМУЫрер, описанную для конструирования рСМУЫрер/СМА.

1-£: Конструирование рΕаЬ60/СI-2А и рΕАВ60/тиСI-2А.

Фрагмент кДНК СИ2А, который кодирует аминокислоты 21-83 белка дикого типа, встраивали в фагмидный вектор рЕАВ60 (ФНапкеп ек а1., 1995, Ргокет Еп§. 10, рр. 1063-7). Фрагмент кДНК С.Ч-2А амплифицировали при помощи ПЦР с использованием рСМАЫрер/СМА в качестве матрицы с 10 пмоль праймеров

АТТТССТАССТССАСААССАССААТСС САСТСААСАСАСАСТССССАСАСТТСС (δΕ(') II) ^:27) и АТААСААТССССССС СССССАСССТССССАССТСССС (δΕ(') ГО NО:28) в 4 реакциях, проводимых в условиях, сходных с условиями, описанными для конструирования рСМАЫрер/С^А. Очищенный фрагмент 237 п.н. и 2 мкг рΕΛВ60 расщепляли параллельно с использованием 10 единиц ΝΜ и Νο6 в 50 мл 1 х ΝΕ-буфера 4, содержащего 1 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (см. разделы А-5 и А-6). Затем расщепленные фрагменты 225 и 4655 п.н. очищали с использованием 1% агарозного геля и лигировали друг с другом (см. раздел А-7 и А-1, соответственно). Правильность инсерции в конце концов подтверждали ДНК-секвенированием с использованием САСАСАССАААСТАТСА (δ ЕС) ГО NО:29) в качестве праймера (см. раздел А-8). Идентичный подход использовали для конструирования рΕАВ60/тиСI-2А, за исключением того, что рСМАЫрер/тиСМА использовали в качестве источника кДНК СИ2А.

1-§. Конструирование рΕаЬ60/тиСI-2А_^с.

Замену аминокислот 59-62 в полноразмерной последовательности СИ2А 19-мерной случайно составленной аминокислотной последовательностью выполняли в контексте рСМУЫрер/тиСМА и модифицированный СИ2А переносили затем в рЕАВ60 согласно процедуре, описанной для конструирования рΕΛВ60/СI-2А. Кодирующий район для этой аминокислотной последовательности получали из синтетического олигонуклеотида (олиго), который амплифицировали при помощи ПЦР. Четыре параллельные реакции выполняли с использованием 12,5 пмоль СТСССССТСССТАСААТТСТССТСС ССТАСАТССАССССССААТАСТСАТСААС СТСААСАТТАССССАСССАААСТАСССАТТСАТССССТСССССТСТТТСТССАСАААСТСС (δΕΟ ГО NО:30) в качестве матрицы с 50 пмоль праймеров ССАСТТТСТССАСАААСАСССССАС (δΕ(') ГО ^:31) и ТСТС ССССТСССТАСААТТС (δΕ(') ГО ^:32). Эти реакции использовали для 25 циклов 94°С в течение 2,5 мин, 45°С в течение 2 мин и 72°С в течение 2 мин со всеми остальными условиями, описанными в разделе А-2. Продукт очищали экстракцией смесью фенол/СНС1 з и растворяли в 30 мкл стерильной Н₂О. Для облегчения встраивания в тиСМА, к 5 мкл этого фрагмента добавляли 20 единиц Мий (Вοейπηде^ МаппНе1т), 5 мкл 10 х δи^еСик-буфера М (Вοей^^ηде^ МаппНепи) и стерильную Н₂О для доведения объема до 50 мкл и инкубировали при 37°С в течение 4 ч. После добавления 6 мкл 10 х буфера для рестриктазы δа1I инкубацию продолжали в течение 4 ч. Очистку фрагмента 89 п.н. проводили с использованием 2,5% низкотемпературного агарозного геля (см. раздел А-6). Получение расщепленной Миш^ай рСМАЫрер/тиСЬ 2А было в принципе сходным с описанной выше процедурой. Четыре мкг рСМАЫрер расщепляли 30 единицами МшИ в 150 мкл реакционной смеси с последующим добавлением 30 единиц δηΗ в 50 мкл 4 х буфера для рестриктазы δа1I и очищали в 1% геле, как описано в разделе А-7. Процедуры лигирования и подтверждения выполняли так же, как описано для конструирования рСМАЫрер/СМА.

1-Н. Конструирование библиотеки.

Вырожденный олигонуклеотид ТСТСССС СΤСССΤАСААΤΤСNNNNΚNNΚNNΚNNΚNN ΚNNΚNNΚNNΚСССАΤΤСАΤССССΤССССС ТСТТТСТССАСАААСТСС (δΕ(') ГО ^:33) превращали в двух-цепочечную форму при помощи реакции удлинения. Этот олигонуклеотид смешивали с 3-кратным избытком ССАСТТТС ТССАСАААСАСССССАС (δΕ(') ГО ^:34) в 1х буфере δире^Τа^ (Ьм/уте ΤесНπο1οβ^ек Ькб.), содержащем 8 единиц δире^Τа^ полимеразы (Ьи/уше ΤесНπο1οβ^ек Ькб.) и 0,2 мМ бЭТР. Нагревание этой смеси до 94°С в течение 1 мин с последующими нагреванием при 45°С в течение 2 мин проводили для гарантии достаточного отжига между олигонуклеотидами перед изменением температуры на 55°С в течение 45 мин для увеличения активности полимеразы. После завершения реакции пробу экстрагировали смесью фенол/СНС13 перед расщеплением 1/3 этого продукта 100 единицами ΕсοЯI и δа1I в 100 мкл 1х буфера для ΕсοЯI, содержащего 1 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (см. раздел А-6). Полностью расщепленный ДНК-фрагмент 56 п.н. очищали на 2% низкотемпературном агарозном геле (см. раздел А-6) и лигировали (см. раздел А-1) в расщепленный Миш^ай рСМАЫрер/тиСМА, описанный в примере 1-§. Случайно выбранные колонии секвенировали, как описано для конструирования рСМУЫрер/СЬ2А.

1-1. Определение субтилизина.

Клеточные экстракты разбавляли до указанных количеств в 10 мкл ЗФР и добавляли к 25 мкл 0,1 М Трис/НС1 рН 8,6, содержащего 5 х 10^-8 М субтилизин Карлсберга (δίβίικι). После инкубирования при 25°С в течение 30 мин, добавляли 25 мкл 0,1 М Трис/НС1 рН 8,6, содержащего 5 мМ №сукцинил-А1а-А1а-Рго-Рйе-пнитроанилид (δίβ^ν-ι) и превращение субстрата прослеживали путем измерения поглощения при

405 нм каждые две минуты, пока реакция не истощалась.

1-). Клеточные линии и условия культивирования.

Все клетки культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ИМЕМ), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку или 10% сыворотку новорожденного теленка, 1% Б-глутамин и 50 мкг/мл смеси пенициллин/стрептомицин, и инкубировали в стандартных условиях культуры клеток.

Клетки 293тСАТ и клетки И208тСАТ получают из 293 (АТСС № СКЬ-1573) и И208 (АТСС № НТВ-96) стабильной трансфекцией ртСАТ/ШЕ8-Еуд. Клетки 293 трансфицировали по способу копреципитации кальцием, описанным для трансфекции упаковывающих клеток Вокс, и клетки И208 трансдуцировали с использованием набора для трансфекции Еидеие в соответствии с протоколом изготовителя (ВоеЕпидег МаииЕет). Стабильные трансфектанты отбирали культивированием в присутствии 150200 мкг активного гигромицина В/мл (81дта). После трансдукции 293тСАТ или И208тСАТ ретровирусными векторами отбор проводили в 0,6 мг/мл или 0,4 мг/мл генитицина (С1ЬсоВКЕ), соответственно.

Мышиную линию клеток МН-3Т3 (АТСС № СКЕ-165) после трансдукции ретровирусными векторами культивировали в присутствии 0,6 мг/мл генитицина.

1-к. Трансдукция клеток №Н-3Т3, 293тСАТ и И208тСАТ.

Для получения ретровирусных векторных частиц полученные из рСМУЫрер конструкции трансфицировали в упаковывающую клеточную линию Вокс с использованием способа СаРО₄копреципитации. Упаковывающие клетки ВО8С (известные также как клетки ВО8С23, см. XV О 94/19478) разбавляли до 5 х 10⁵ клеток/см² за день перед трансфекцией и промывали один раз в полной ИМЕМ за 2 ч перед трансфекцией. Копреципитированные СаРО4 смеси готовили разбавлением 10 мг рСМУЫрер или полученной из рСМУЫрер конструкции с 10 мг ДНК спермы лосося в 450 мл ЕЕН₂О и добавлением 50 мл 2,5 М СаС1₂. Эти растворы медленно добавляли к 500 мл 2х забуференному НЕРЕ8 солевому раствору рН 7,05 (280 мМ №С1, 1,5 мМ №₂НРО₄, 50 мМ НЕРЕ8/№ОН рН 7,05) при осторожном встряхивании с последующими двумя-пятью минутами инкубирования при 25°С перед добавлением этого преципитата к приготовленным клеткам ВО8С. После 24 ч инкубации клетки промывали дважды в ЗФР (137 мМ №С1, 2,7 мМ КС1, 8,3 мМ №₂НРО₄, 1,4 мМ КН2РО4) и культивировали далее в 10 мл ИМЕМ, содержащей добавки, в течение дополнительных 24 ч. Среды от трансформированных клеток ВО8С собирали и разбавляли в 10-10⁵ раз в полной ИМЕМ, включающей в себя 6 мг/мл Полибрена (8щта). Реципиентные клет ки, которые высевали при 10⁴ клеток/см² и инкубировали при стандартных условиях культуры клеток в течение 24 ч в полной ИМЕМ, экспонировали в вирус-содержащей среде 24 ч при стандартных условиях. После этого инкубационного периода трансдуцированные клетки промывали дважды в ЗФР и инкубировали в полной ИМЕМ, включающей в себя генетицин.

1-1. Приготовление общих клеточных экстрактов.

СМУЫрер/С1-2А или СМУЫрертрансдуцированные клетки МН-3Т3 собирали из двух колб с конфлюэнтными клетками Т175 инкубированием с 5 мл 0,5х раствора трипсинЭДТА (61ЬсоВКЬ)/чашка. Извлеченные клетки разбавляли 1:1 в полной ИМЕМ и затем собирали центрифугированием, промывали дважды в 10 мл полной ИМЕМ и дважды в 1 мл ЗФР. Наконец, эти клетки суспендировали в 100 мкл ЗФР. Клетки делали проницаемыми тремя циклами замораживания в жидком азоте и оттаиванием путем инкубирования при 37°С и затем центрифугировали при 20000хд в течение 15 мин для удаления клеточного дебриса. Для инактивации эндогенной протеазной активности экстракты инкубировали при 65°С в течение 15 мин и повторно центрифугировали.

1-т: Приготовление ядерных экстрактов.

Использовали две колбы приблизительно на 80% конфлюэнтых клеток Т-175 каждой клеточной линии. Клетки собирали добавлением 3 мл раствора трипсин-ЭДТА (61ЬсоВКЬ) в каждую колбу с последующим центрифугированием 6 мл клеточных суспензий. Все следующие реакции проводили при 4°С с использованием охлажденных растворов. Собранные клетки промывали в 10 мл полной ИМЕМ, 10 мл ЗФР и 2 раза в 1 мл ЗФР. После последней промывки клетки суспендировали в 1 мл лизисного буфера №40 (10 мМ Трис/НС1 рН 7,4, 10 мМ №С1, 3 мМ МдС1₂ и 0,5% №-40), осторожно перемешивали и инкубировали на льду в течение 5 мин. Затем эти клетки собирали центрифугированием при 500хд при 4°С в течение 5 мин и суспендировали в 1 мл буфера №-40 и ядра немедленно собирали повторением центрифугирования. Белки экстрагировали из ядер суспендированием в 50 мкл низкосолевого буфера (20 мМ НЕРЕ8 рН 7,9, 25% глицерин, 0,02 М КС1, 1,5 мМ МдС1₂, 0,2 мМ ЭДТА), с последующим добавлением 50 мкл высокосолевого буфера (низкосолевой буфер, дополненный 1 М КС1). После 30 мин инкубирования на льду ядерный экстракт осветляли центрифугированием при 20000д в течение 30 мин. Супернатанты хранили при -20°С.

1-и. Электрофорез в ПААГ-ДСН и Вестерн-блоты.

Пробы наносили с 1/4 объема ДСН-буфера для нанесения ^ОУЕХ), содержащего 1/10 объема 1М дитиотрейтола, и нагревали при 95°С в течение 2 мин перед нанесением на 461

12% градиентный ДСН-гель для Νιι-ПААГэлектрофореза (ΝΟνΕΧ) в 1 х МЕБ-буфере (ΝΟνΕΧ) и проводили электрофорез при постоянном токе 40 мА. Гели уравновешивали в буфере для блоттинга (10 мМ СНАРБ^аОН рН 11,0, 10% метанол, 0,5% ДСН) в течение 5 мин перед перенесением этих белков на 0,2 мкм мембрану ОЬййгап ВА-Б 83 (Бсй1екйег & Бс1ое11) посредством полусухого блоттинга в течение 70 мин. Мембране давали высохнуть на воздухе перед блокированием в течение 1 ч при комнатной температуре в ЕСЬ-буфере (50 мМ Трис/НС1 рН 7,4, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ ЭДТА, 0,5% желатин, 0,1% ИР-40). После блокирования ЕСЬ-буфер заменяли кроличьей сывороткой против С1-2А, разведенной 1:1000 в ЕСЬ-буфере, и инкубирование продолжали в течение 1 ч. Затем мембрану промывали 3 раза, каждый раз инкубированием в течение 20 мин в ЕСЬбуфере, перед добавлением разбавленной 1:5000 конъюгированной с пероксидазой хрена козьей антикроличьей сыворотки (Бако) в ЕСЬ-буфере и инкубировали и промывали, как описано выше. Развитие сигнала проводили с использованием усиленного хемолюминесцентного набора в соответствии с протоколом изготовителя (Атегкйат-Рйагтас1а).

1-о. Получение поликлональных антител против С1-2А, иммунопреципитация.

Кроликов иммунизировали 100 мкг полноразмерного рекомбинантного С1-2А (любезный подарок от доктора 1Ь С. С1аикеп, Νονο Νογ6κ А/Б, Бептагк) в полном адъюванте Фрейнда (Б1дта) и проводили бустер-иммунизации 4 раза с интервалами 3 недели инъекцией 50 мкг С12А, приготовленного в неполном адъюванте Фрейнда. Ответную реакцию в виде антител против С1-2А детектировали при помощи ЕЫБА с рекомбинантным С1-2А, иммобилизованным на Мах1-БогЬ-планшете (Мшс). Нескольким разведениям С1-2А-сыворотки давали связываться и затем детектировали при помощи конъюгированной с пероксидазой хрена козьей антикроличьей сыворотки (Бако). Все реакции проводили, как описано в примере 1-р. Белок А, содержащий гранулы сефарозы СЬ-4В (Рйагтас1а Вю1есй), предварительно промывали в буфере для разведения (ЗФР, включающий в себя 0,1% Тритон Х-100, 0,1% бычий сывороточный альбумин), перед добавлением 40 мкл объема гранул к 100 мкл собранной среды вместе с 10 мкл антитела против С1-2А. Смеси вращали при 4°С в течение 1 ч с последующими 3 промывками в буфере для разведения. Гранулы суспендировали в 2х буфере для разведения с ДСН и проводили электрофорез в ДСН-ПААГ перед детектированием С1-2А при помощи вестернблоттинга (пример 1-п).

1-р. ЕЫБА.

Очищенное свиное антикроличье поликлональное антитело (Бако) разводили до 120 нг/мл в 0,1 М NаНСΟз ρН 8,5 перед добавлени ем аликвот 50 мкл в каждую лунку Мах1БогЬпланшета (Липс) и инкубировали при 4°С в течение ночи. Планшет промывали 3 раза в промывном буфере ЕЫБА (0,01% пирофосфат, 500 мМ №С1, 0,1% Тритон Х-100) и в каждую лунку добавляли 50 мкл кроличьей сыворотки против С1-2А, разведенной 1:200 в буфере для связывания (ЗФР, дополненный 0,5% бычьим сывороточным альбумином, 0,5% Твином-20, 10% глицерином). После 1 ч инкубирования при комнатной температуре эту процедуру промывания повторяли и указанное число фаговых частиц добавляли в буфере для связывания. Фаговым частицам давали взаимодействовать в течение 1 ч при комнатной температуре перед промыванием планшета 10 раз в промывном буфере ЕЫБА. Связанные фаговые частицы детектировали с использованием конъюгированных с пероксидазой хрена антифаговых антител (Рйагтас1а Вю1есй) посредством процедур связывания и промывания, описанных выше. В конце концов пероксидазу хрена анализировали с использованием ОРБ-таблеток в соответствии с протоколом изготовителя (Бщта).

Стандартные реакции:

А-1. Лигирование и трансформация ЕксйепсЫа сой посредством электропорации:

нг вектора;

мкл фрагмента (содержащего концентрацию фрагмента, приводящую к отношению 10:1 фрагмент: вектор) 2 мкл 10 х Т4-ДНК-лигазного реакционного буфера (Νον Епд1апб Вю1аЬк);

300 единиц ДНК-лигазы Т4 (Νον Епд1апб Вю1аЬк);

Стерильная Н2О для доведения объема до 20 мкл;

198 циклов, состоящих из 30°С в течение 30 с и 10°С в течение 30 мин, затем 16°С в течение ночи.

Продукты лигирования трансформировали в Е. сой электропорацией:

мкл реакции лигирования диализовали против 2 мл стерильной Н2О;

мкл диализованной реакции лигирования смешивали с 25 мкл компетентной Е. сой в 0,1 см-кювете для электропорации (Вю-Наб) и подвергали кратковременному воздействию 2 кВ;

добавление 1 мл БОС-среды (20 г бактотриптона, 5 г дрожжевого экстракта/ 0,5 г №С1, 0,19 КС1, растворенные в 950 мл Н₂О и доведенные до рН 7,0 при помощи №1ОН и дополненные 50 мл 20% глюкозы и МдС1₂ до конечной концентрации 10 мМ перед использованием);

инкубирование при 37°С в течение 0,5-1 ч перед посевом штрихом (штриховкой) 50 мкл200 мкл на ЬВ-чашки (100 мл ЬВ (10 г бактотриптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г №С1, Н₂О до 1 л), содержащие 1,5 г агара и 50 мг/мл карбенициллина).

Компететные в отношении электропорации клетки Е. сой готовили, как описано ниже:

ночную культуру использовали для инокуляции 37°С ЬВ для получения ОИ₆₀₀ 0,020;

культуру инкубировали при 37°С, пока ОИ₆₀₀ не становилось 0,8-1,0, и затем охлаждали на льду;

охлажденную культуру собирали центрифугированием;

собранные бактерии суспендировали в 300 мл 10% охлажденного на льду раствора глицерина повторение центрифугирования;

стадии суспендирования и центрифугирования повторяли дважды;

бактерии суспендировали в 50 мл 10% охлажденного на льду раствора глицерина и повторно собирали центрифугированием;

бактерии суспендировали в охлажденном на льду буфере с 10% глицерином до конечной плотности 6-12 х 10¹² клеток/мл и хранили при -80° в виде аликвот.

А-2. Полимеразные цепные реакции с использованием Тас.|Со1б™

100 нг матрицы;

пмоль указанных праймеров, если нет других указаний;

мкл 10 х реакционного буфера Тас.|Со1б™ (Регкт Е1тег);

мкл раствора МдС1₂ для Тас.|Со1б™ (Регкт Е1тег);

0,4 мкл 25 мМ б№ТР (бСТР, бСТР, бАТР и бТТР);

0,4 мкл 5 единиц/мкл Тас.|Со1б™ (Регкт Е1тег);

стерильная Н2О до 50 мкл.

Все реакции инициировали 10 мин при 95°С и после указанных циклов выдерживали при 72° в течение 4 мин.

В отношении очистки ПЦР-продуктов см. раздел А-3.

А-3: ПЦР с использованием ДНКполимеразы Уеп!™:

100 нг матрицы;

пмоль указанных праймеров, если нет других указаний;

мкл 10х реакционного буфера ДНКполимеразы Уеп!™ (Νο\ν Епд1апб Вт1аЬк)

0,4 мкл 25 мМ б№ГР;

0,4 мкл 5 единиц/мкл ДНК-полимеразы Уеп!™ (Νον Епд1апб Вт1аЬк);

стерильная Н₂О до 50 мкл;

все реакции инициировали 1 мин при 94°С и после указанной программы циклов выдерживали при 72° в течение 4 мин.

Амплифицированные фрагменты ДНК очищали экстракцией смесью фенол/СНС13 с последующим осаждением этанолом, если размер был менее 100 п.н. В ином случае использовали набор для очистки продуктов ПЦР О!Ао.|шск™ (О|адеп). Набор для очистки продуктов ПЦР использовали в соответствии с протоколом изготовителя с объемом элюции 50 мкл.

А-4. Экстракция смесью фенол/СНС1₃:

объем пробы доводили, по меньшей мере, до 200 мкл стерильной Н₂О;

добавление 1 объема фенола рН 6,7 (от поставщика);

смешивали интенсивно и центрифугировали;

добавление 1 объема фенол/СНС1₃ 1:1 к водной фазе;

повторение процедуры смешиванияоткручивания;

добавление 1 объема СНС13 к водной фазе;

повторение процедуры смешиванияоткручивания;

к водной фазе добавляли 1/10 объема 3 М №1Ас рН 6,0 и 2,5 объема охлажденного до -20°С 96% этанола;

центрифугировали при 20000хд в течение 20 мин, заменяли супернатант 70% этанолом, и повторяли центрифугирование в течение 2 мин;

после высушивания ДНК на воздухе ее растворяли в стерильной Н2О.

А-5. Получения векторов.

Плазмидную ДНК, используемую для получения векторов, очищали с использованием колонок О|адеп тах1 ргер в соответствии с протоколом изготовителя (О|адеп). Все используемые рестриктазы и их реакционные буферы приобретали из №\ν Епд1апб Вю1аЬк, если нет иных указаний:

мкг-10 мкг векторной ДНК;

приблизительно 5-10 единиц указанных рестриктаз на мкг плазмидной ДНК;

1/10 конечного объема 10 х буфера для рестриктазы ВатШ, если нет иных указаний;

стерильная Н₂О до указанного конечного объема;

инкубирование при 37°С, пока не достигалось полное расщепление;

65°С в течение 20 мин;

Очистка полученного расщеплением фрагмента, как описано в А-7.

А-6. Получение фрагментов.

Как для получения вектора (см. А-5), за исключением количества ДНК и того, что очистку расщепленных фрагментов ДНК, меньших, чем 100 п.н., выполняли с использованием плавящейся при низкой температуре агарозы. К срезу агарозы добавляли 300 мкл 0,3 М №1Ас, рН 6,0, и инкубировали при 65°С до полного расплавления агарозы с последующими экстракцией смесью фенол/СНС1₃ и осаждением этанолом (см. А-4) для очистки этой ДНК.

А-7. Экстракция гелей с использованием набора для очистки О|адеп де1 рипПсабоп кб:

к пробам добавляли 1/6 объема буфера для нанесения ДНК (60% глицерин, 0,025% бромфеноловый синий, 0,025% ксилолцианол);

наносили на агарозный гель в 1 х ТВЕ (89 мМ Трис-борат, 89 мМ кислая форма бората, 2 мМ ЭДТА);

после достижения удовлетворительного разделения ДНК экстрагировали с использова нием набора для экстракции гелей О1адеп в соответствии с протоколом изготовителя с объемом элюции 50 мкл, если нет иных указаний.

А-8. Секвенирование ДНК.

Секвенирование всех ДНК проводили с использованием набора для секвенирования ДНК В1дПуе™ ΐе^ш^ηаΐо^ сус1е кес.|иепстд (Регк1п Е1тег) с применением программы из 25 циклов, состоящей из 96°С в течение 10 с, 50°С в течение 5 с и 60°С в течение 4 мин. Количество ДНК было 0,2-0,5 мкг с 3,2 пмоль указанных праймеров. Краситель В1дОуе™ разбавляли в два раза в соответствии с рекомендацией изготовителя. После завершения программы циклов ДНК осаждали этанолом и интенсивно промывали 70% этанолом перед анализами с использованием секвенатора АВI рпкт 310 (Регкш Е1тег).

Пример 2. Экспрессия СН2А в клетках млекопитающего.

Потенциальная каркасная молекула для внутриклеточного представления (презентации) пептидных библиотек, экспрессируемых в ретровирусных векторах, используемых в технологии Се11Зсгееп™, не должна оказывать значимых действий ни на цикл репликации ретровирусов, ни на жизнеспособность трансдуцированных клеток млекопитающего. Кроме того, этот каркас должен сохранять стабильную структуру кора для гарантии конформационно ограниченного предоставления пептидов. Для испытания, удовлетворяет ли С.Ч-2А этим требованиям, авторы изобретения сконструировали рСМУЫрер/СМА (см. пример 1-а и фиг. 1). Эту экспрессионную конструкцию С.Ч-2А временно трансфицировали параллельно с рСМУЫрер в упаковывающие клетки ВОЗС для получения вирусных частиц для трансдукции клеток МН3Т3, 293тСАТ и И20ЗтСАТ (пример 1-к). Титры, полученные трансдукцией этими двумя вирусными векторами, были одинаковыми, указывая на то, что экспрессионная единица С4-2А не мешает упаковке и инфекционности вируса.

Общие клеточные экстракты готовили из трансдуцированных клеток МШ-3Т3, 293тСАТ и И20ЗтСАТ и анализировали на присутствие С4-2А при помощи вестерн-блоттинга с получением прямого доказательства экспрессии С4-2А (примеры 1-1 и 1-п) . Кроличья сыворотка против СН2А, индуцированная против С4-2А дикого типа, узнавала белок со свойствами миграции, которые соответствовали свойствам миграции, ожидаемыми для белка СН2А, экспрессируемого из рСМУЫрер/СМА. Даже удлиненная экспозиция вестерн-блота не выявила какихлибо полос со сходными свойствами подвижности в экстрактах, полученных из трансдуцированных рСМУЫрер клеток, что, следовательно, свидетельствует о том, что растворимый С4-2А экспрессируется СМУЫрер/СМА и испытанные клеточные линии являются толерантными к нему.

Интересно, что специфическая полоса СМУЫрер/СМА с несколько меньшей подвижностью воспроизводимо детектировалась вестерн-блотами. Природа этой полосы в настоящее время неизвестна. Эта уменьшенная подвижность согласуется со слабой вторичной модификацией, такой как фосфорилирование, хотя экспериментального доказательства этого не имеется. Другими более тривиальными и менее вероятными объяснениями могли бы быть использование не-консенсусного стартового кодона или то, что стоп-кодон С4-2А дает утечку, вызывая тем самым появление удлиненного белка С4-2А. Авторы изобретения в настоящее время проводят работу по более детальной характеризации продуктов экспрессии с использованием Ν-концевого секвенирования аминокислот и масс-спектрометрии.

Стойко конформационно ограниченная (заключенная в контекст каркаса) презентация пептидной библиотеки требует, чтобы структура этого каркаса была стабильной в конкретном окружении. Поскольку С4-2А природно обнаруживается в семенах ячменя, переход к среде в клетках млекопитающего мог бы влиять на кинетику укладки и, следовательно, на стабильность С4-2А. Ингибирующая протеазы активность СН2А обеспечивает простой способ определения функциональности (пример 1-1), которая отражает количество нативно уложенного СТ-2А.

Увеличивающиеся количества общих клеточных экстрактов, используемых для вестернблотов, предынкубировали с субтилизином перед измерением остаточной активной протеазы путем добавления хромогенного субстрата (фиг. 2). Присутствие 0,1-2 мкл экстракта из трансдуцированных СМУЫрер/СМА клеток полностью блокировало активность субтилизина. В противоположность этому, при увеличении количества экстрактов из СМУЫрер-трансдуцированных клеток до 10 мкл не наблюдали действий на активность субтилизина. Этот результат доказывает, что уменьшение активности субтилизина, наблюдаемое при использовании экстрактов из СМУЫрер/СМА-транс-дуцированных клеток, обусловлено экспрессией С4-2А. Кроме того, наблюдение, что СН2А, экстрагированный из клеток млекопитающего, является функциональным, предполагает наличие нативной структуры в этих клетках, что является подтверждением того, что составленная случайным образом пептидная библиотека будет представлена посредством С4-2А в конформационно ограниченным образом. Путем сравнения количества СН2А-содержащего экстракта, требующегося для ингибирования субтилизина, со стандартной кривой, построенной на основе очищенного СЛ-2А, может быть получена грубая оценка концентрации активного С4-2А. Это позволяет затем рассчитать клеточную концентрацию. Посредством этого расчета авторы оцени вают содержание С1-2А в испытуемых клеточных линиях как содержание порядка мкМ.

Объединенное доказательство из экспериментов, описанных выше, предполагает, что С12А является переносимым в качестве внутриклеточно локализованного белка в клетках млекопитающих при достаточной концентрации для проявления биологической активности. Кроме того, явно выраженная активность С1-2А, обнаруженная в клеточных экстрактах, свидетельствует о нативной конформации, делающей возможной конформационно ограниченное представление (презентацию) пептидов из района петли.

Пример 3. Экспрессия слитых белков С12А с определенной субклеточной локализацией.

Ряд биологических реакций являются ограниченными определенными клеточными компартментами. Для увеличения возможности отбора пептидов, которые препятствуют таким типам реакций, авторы изобретения сливали с С1-2А аминокислотные последовательности, которые, как было показано, в других контекстах направляют слитый белок к определенным субклеточным местам локализации. Добавляли сигналы, опосредующие локализацию либо в эндоплазматическом ретикулуме, либо в ядре, для испытания, могла быть или не могла быть достигнута ограниченная локализация С1-2А.

Сигнал ядерной локализации из большого Т-антигена вируса 8У-40 сливали с Ν-концом С1-2А, что приводило к образованию конструкции рСМУЫрерЖ8/С1-2А (фиг. 1 и пример 1с). Клетки ΝΙΗ-3Τ3 трансдуцировали произведенными из СМУЫрерЖ-8/С1-2А. СМУЫрер/ С1-2А и СМУЫрер ретровирусными частицами. Вестерн-блоттинг и тест активности субтилизина (см. пример 1-1 и 1-п) использовали затем для анализа содержания С1-2А в общих экстрактах и ядерных экстрактах, полученных из всех трансдуцированных клеточных линий. Ни общие экстракты, ни ядерные экстракты, полученные из трансдуцированных СМУЫрер клеток, не были способны предотвращать протеазную активность субтилизина, что согласуется с результатами, описанными в примере 2. В противоположность этому, как ядерные экстракты, так и общие экстракты, полученные из

СМУЫрерЖ8/С1-2А, блокировали ингибирование протеазной активности субтилизина, тогда как только общий экстракт СМУЫрер/С1-2А проявлял активность С1-2А (фиг. 3) . Вестернблоттинг обнаружил равное количество С1-2А в общих экстрактах из клеток, трансдуцированных СМУЫрер/С1-2А и СМУЫрерЖ8/С1-2А, что свидетельствует об одинаковом уровне экспрессии. В соответствии с тестом активности, количество С1-2А, обнаруженное в ядерных экстрактах вестерн-блоттингом, было, по меньшей мере, в 10 раз более высоким для Ж8/С1-2А, чем для С1-2А. Таким образом, два независимых типа анализа подтверждают, что присутствие

Ж-8 приводит к увеличенной концентрации Ж.8/С'Ч-2А в ядре.

Локализация в эндоплазматическом ретикулуме требует нацеливания на этот компартмент и затем продолжающегося удерживания. Для достижения этого, конструкция рСМУЫрерЕР/С1-2А содержит секреторный лидерный (8Ь) пептид и пептид удерживания, слитые с Νконцом и С-концом С1-2А, соответственно, (фиг. 1 и пример 1-6). Для возможности оценки функциональности сигнала удерживания, готовили конструкцию рСМУЫрер8Ь/С1-2А, которая содержала только секреторный лидерный пептид (фиг. 1 и см. пример 1-6). Клетки ΝΙΗ3Τ3 трансдуцировали этими ретровирусными векторами вместе с СМУЫрер и СМУЫрер/С12А. Эти конструкции позволяют исследовать активность как лидерного пептида, так и сигнала удерживания путем определения количеств белка С1-2А, секретируемого в клеточные среды. После замены сред секретируемый белок С1-2А детектировали в различных временных точках посредством объединенной процедуры иммунопреципитации-вестерн-блоттинга (см. 1о). 8Ь/С1-2А обнаруживали после 3 ч инкубирования и его количество значительно увеличивалось во время периода инкубации. В противоположность этому, ЕК/С1-2А не детектировался до 5,5 ч инкубирования и после этого детектировался на уровне, сравнимом с уровнем, продуцируемым клетками, трансдуцированными СМУЫрер/С1-2А. Таким образом, С1-2А, обнаруживаемый в средах из двух клеточных линий СМУЫрер/С1-2А и СМУЫрерЕК/С1-2А, обусловлен, вероятно, гибелью клеток, а не активной секрецией. Резюмируя, можно сказать, что присутствие лидерного пептида увеличивало секрецию С1-2А, но эта секреция значимо задерживалась добавлением сигнала удерживания КОЕЬ. Объединенные данные предполагают, что С1-2А, экспрессируемый из СМУЫрерЕР/С1-2А, становится перемещенным в эндоплазматический ретикулум.

Путем определения субклеточной локализации пептидной библиотеки, может быть значительно увеличена вероятность выделения активных пептидов, препятствующих реакциям, которые, как известно, являются ограниченными в прохождении такими местоположениями. В дополнение к примерам, описанным выше, можно было бы также нацеливать С1-2А в другие местоположения, такие как клеточная мембрана, митохондрии, лизосомы и т.д.

Пример 4. Представление (презентация) С1-2А на фаговых частицах.

Технологию фагового представления использовали с момента ее открытия интенсивно для скрининга пептидных библиотек. Фаговое представление может быть использовано в комбинации с Се118сгееп™ для обогащения пептидной библиотеки для связующих веществ, например, для неочищенных клеточных экстрак тов или целых клеток и снижения тем самым числа пептидов, которые должны обрабатываться в системах биологического скрининга. Таким образом, авторы изобретения испытывали применимость презентации СЧ-2А на поверхности фаговых частиц встраиванием СЧ-2А в фагмиду рРАВ60 (фиг. 4 и Чойапзеп е( а1. (1995), Рго!ет Епд. 10, рр. 1063-1067). Присутствие СЧ-2А на поверхности полученных из рРАВ60/СI-2А фаговых частиц подтверждали с использованием как анализа ЕЫ8А, так и теста на субтилизин (пример 1-о и 1-ί) . В анализе ЕЫ8А иммобилизованные кроличьи поликлональные антитела против СЧ-2А удерживали фаговые частицы, произведенные из рРАВ60/СI-2А, при уровнях, на несколько порядков величин более высоких, чем СМА-негативные фаговые частицы (фиг. 5). В соответствии с этим результатом, активность субтилизина могла ингибироваться только произведенными из рРАВ60/СВ2А фаговыми частицами. Эти два эксперимента демонстрируют, что СЧ-2А мог быть представлен на поверхности фага и, следовательно, удовлетворяет признакам, необходимым для каркасного белка как в технологии фагового представления, так и в технологии Се118сгееп™.

Район петли СЧ-2А будет интенсивно модифицированным в ситуации, когда пептидная библиотека представлена СЧ-2А. Для имитации такой ситуации и испытания, могут ли продуцироваться фаговые частицы, презентирующие такие модифицированные молекулы СЧ-2А, авторы изобретения заменили 4 аминокислоты, расположенные в районе петли, 19-мерным, составленным случайным образом пептидом с образованием таким образом рРАВ60/СЧ-2А_гс (фиг. 4 и пример 1-д). При анализе при помощи ЕЫ8А получали значимый сигнал, хотя он был слегка пониженным в сравнении с фаговыми частицами, несущими немодифицированный СГ2А (фиг. 5). Эта вариация могла бы быть обусловлена присутствием важного сайта узнавания антител в районе петли. В заключение, можно сказать, что тот факт, что фаговые частицы, представляющие модифицированный СЧ2А, генерировали сигнал, сравнимый с сигналом, полученным для фаговых частиц, содержащих рРАВ60/СЧ-2А, предполагает, что СЧ-2А может быть представлен независимо от аминокислотного состава в районе петли.

Пример 5. Конструирования представляющих СЧ-2А пептидных библиотек.

Для облегчения замены аминокислот, находящихся в петле СЧ-2А, сайты узнавания для МипЧ и 8аИ вводили в кДНК СЧ-2А в рСМУЫрер/СЧ-2А посредством молчащего мутагенеза (введения молчащих мутаций) для генерирования рСМУЬ|рер/тиСЧ-2А (пример 1-е). Присутствие этих сайтов расщепления делает возможной процедуру конструирования библиотеки не на основе ПЦР. В этой процедуре синтетический олиго, который включает в себя рандоми зированный район, превращают в двухцепочечную форму перед клонированием в сайты МиηI/8а1I (фиг. 6). Возможность получения пептидной библиотеки с использованием этой процедуры испытывали лигированием в малом масштабе с последующим секвенированием ограниченного числа случайным образом выбранных клонов. Из 8 секвенированных клонов все содержали вставку случайного олиго и ни одна из вставок не кодировала идентичные пептиды. Это предполагает, что перенесение многообразия из синтетических олиго в биологически активную форму является возможным при применении этой стратегии.

Применение сайт МипЧ для генерирования пептидных библиотек ограничивает часть района петли в СЧ-2А, которая может становиться замененной. Для использования всего района петли для презентации пептидов предполагается создание комплементарной пептидной библиотеки с использованием более 5'-локализованного сайта расщепления ВатЫ, находящегося в рСМАЫрер. В этом случае, фрагмент ДНК, который содержит этот рандомизированный район, может быть генерирован либо способом не на основе ПЦР, либо способом на основе ПЦР, как показано на фиг. 7. Это позволяет определить 5'-границу рандомизированного района на основе теоретических рассмотрений.

Эти две объединенные стратегии клонирования позволяют конструировать представленные СЧ-2А библиотеки, которые различаются способом, при помощи которого эти пептиды представлены. Такие различные библиотеки, вероятно, дополняют друг друга в отношении взаимодействий с возможными молекуламимишенями. Таким образом, скрининг различных типов библиотек будет увеличивать число возможных идентифицированных молекулмишеней.

Пример 6. Обсуждение СЧ-2А в качестве каркасной молекулы в технологии Се118сгееп™.

Как продемонстрировано в примере 2, СЧ2А может быть экспрессирован в функциональной форме в клетках млекопитающих. Таким образом, относительно несложно предвидеть разработку функциональной системы для презентации рандомизированных пептидных последовательностей с использованием СЧ-2А в качестве каркаса. Для направления СЧ-2Акаркаса в различные компартменты клетки, были сконструированы ретровирусные векторы, несущие различные лидерные последовательности. Могут быть получены данные, представленные в примере 3, иллюстрирующие определенную локализацию СЧ-2А.

В частности, ядро и эндоплазматический ретикулум являются компартментами, в которых происходят некоторые специфические реакции, такие как регуляция транскрипции и укладка рецепторов. Такие процессы являются очевидными мишенями для пептидных антаго71 нистов. Внутриклеточная толерантность к С.Ч-2А в клетках млекопитающих и способность С.Ч-2А к транслокации в ядро и эндоплазматический ретикулум позволяют резонно предположить, что С.Ч-2А может быть нацелен и в другие компартменты и внутриклеточные органеллы.

С.Ч-2А представляет собой чрезвычайно стабильный белок, который имеет то преимущество, что он является небольшим, не имеет дисульфидных мостиков, не имеет сайтов гликозилирования и имеет петлю из 8 аминокислот, выступающую из структуры кора (центральной части) (Масрйа1еп С.А. е! а1. (1983) I. Мо1. Вю1. 168, рр. 445-447). Было показано, что встраивание 7, 9, 11 и 13 остатков между Ме!40 и 61и41 (соответствующими Ме!59 и С1и60 в нативной молекуле) в С.Ч-2А имеет минимальное действие на стабильность и скорости укладки этого белка. Кроме того, было обнаружено, что С.Ч-2А укладывается через взаимодействия ключевых остатков в С-концевом домене этого белка, независимо от аминокислот, находящихся в районе петли (Октагк Р. (1993) Вюсйет. 32, 1100711014, Ьабитег А. 6. апб Регкй! А.Я. (1997) I. Мо1. Вю1. 273, рр. 330-337). Таким образом, эта петля, по-видимому, пригодна для инсерции (вставки) случайных остатков, что и является целью данного изобретения. Как описано в примере 4, замена 4 аминокислот в районе петли 19-мерным случайно составленным пептидом действительно не влияла значимо на способность этого модифицированного С.Ч-2А быть представленным на поверхности фага. Этот результат коррелирует с прежними данными, показывающими, что укладка коровой структуры С.Ч-2А независима как от размера, так и от аминокислотной последовательности района петли.

Одним из важных признаков данного изобретения является то, что пептиды выбраны на основе биологической активности, проявляемой в клетках млекопитающего. Это подразумевает, что стабильность применяемого каркаса должна быть независимой от образования дисульфидных мостиков. Поскольку в структуре С.Ч-2А не присутствуют дисульфидные мостики, стабильность и скорость укладки С.Ч-2А должны быть независимыми от окислительно-восстановительного потенциала растворителя. Экстракция активного С.Ч-2А из клеток млекопитающих предполагает, что С.Ч-2А способен приобретать нативную структуру во внутриклеточной среде, что является основным требованием каркасной молекулы Се118стееп™.

Ν-концевых аминокислотных остатков не имеют какой-либо известной функции для укладки С.Ч-2А (Эе Рга! 6ау 6. е! а1., (1994), Ргос. №И. Асаб. 8ск 91, рр. 10943-10946 и присутствующие в ней ссылки). Так как они должны быть способны выполнять неспецифические взаимодействия во время скрининга и выделения мишени, авторы решили использовать более короткую версию из 64 аминокислот С.Ч-2А.

Кроме того, этот ограниченный размер увеличивает доступность этого пептида/белка С.Ч-2А для карманов связывания, что может увеличивать число возможных мишеней и тем самым вероятность выделения пептидных антагонистов.

Способность С.Ч-2А быть экспонированным на поверхности фаговых частиц была ясно продемонстрирована данными, представленными в примере 4. Технология фагового представления (фаговой презентации) позволяет отбирать пептиды, которые взаимодействуют с любым иммобилизованным компонентом (компонентами). Это могут быть неочищенные клеточные экстракты, содержащие рецепторы мембраны или частично очищенный материал, содержащий активность, против которой желателен пептидный антагонист. В настоящее время большее разнообразие может быть обработано при помощи фагового представления вследствие различия в физическом размере фаговой частицы и клетки млекопитающего. Путем уменьшения пептидной библиотеки до пула, содержего только пептиды, которые способны взаимодействовать с потенциальными молекуламимишенями, фактическое многообразие, которое должно быть обработано внутри клеток, может быть значительно снижено.

Для того чтобы иметь возможность выделить С!-2А-каркас и тем самым молекулумишень, с которой он связывается - из выбранных клеток, пептидная метка должна быть слита с Ν-концом укороченного С.Ч-2А. В настоящее время авторы изобретения рассматривают следующие метки: Н1к-метку, §!тер-метку или РЬАС-метку. Однако может быть также использована иммунная копреципитация с использованием антитела против С.Ч-2А. Альтернативно биохимическим способам, для идентификации мишеней, которые взаимодействуют с выбранными пептидами, будут также применимы генетические подходы, такие как ди- или тригибридные системы дрожжей или млекопитающих.

Список последовательностей <ХХ0> МбЕ ВхоСесЪ А/5

На1к1ег, ТогЬеп безрегзеп, Ьепе бепзеп, А11ап <120> Новые способы идентификации биомолекул лигандов и мишеней <130> 21129 РС 1 <140>

<141>

<160> 43 <170> ₽аСепС1п Уег. 2.1 <210> 1 <211> 451 <212> ДНК <213> Ногбеит уи1даге <220>

<221> СПЗ <222> (85)..(339) <220>

<221> таС_рерЪ1<1е <222> (88)..(336) <220>

<221> т1зс_£еаСиге <222> (249) <223> <3 обозначает С или Т <220>

<221> шхэс_£еасиге <222> (252) <223> А обозначает Аилис <220>

<221> ш.5С_£еаЬиге <222> (279) <223> С обозначает СилиТ <400> 1 саССааасед асдасаедас адеесаадас сесасадсса саСсддсдаС сгааСсадСс 60

Ссасаддаад сдадсдСаас аадд аСд адС Сса дСд дад аад аад ссд дад 111

МеС Зег Зег Уа1 С1и Ьуз Ьуз Рго С1и

-1

1

5

дда

дрд

аас

асе

дде

дсс

ддс

дас

сдС

сас

аас

сСд

аад

аса

дад

Сдд

159

С1у

Уа1

АЗП

ТЫ

СХу

АХа

СХу Азр

Агд

ΗΪ3

Азп

Ьеи

Ьуз

ТЫ

С1и

Тгр

10

15

20

сса

дад

ид

дед

ддд

ааа

Ссд

дед

дад

дад

дсс

аад

аад

дед

асе

сед

207

Рго

СХи

Ьеи

Уа1

СХу

Ьуз

Зег

УаХ

СХи

СХи

АХа

Ьуз

ьуз

УаХ

Не

Ьеи

25

30

35

40

сад

дас

аад

сса

дад

дед

саа

асе

аСа

дСС

сСд

ссд

дед

ддд

аса

асе

255

С1п

Азр

Ьуз

Рю

61 и

АХа

СХп

Не

1Хе

УаХ

Ьеи

Рго

Уа1

СХу

ТЫ

Не

45

50

55

дед

асе

асд

даа

сас

едд

аСс

дас

сдс

дСс

сдс

сСс

еес

дсс

дас

ааа

303

УаХ

ТЬг

мес

СХи

Туг

Агд

Не

Азр

Агд

УаХ

Агд

Ьеи

РЬе

УаХ

Азр

Ьуз

60

65

70

сСс

дас

аас

асе

дсс

сад

дсс

ссс

адд

дсс

ддс

Сад

еаадсССдад

34 9

Ьеи

Азр

Азп

Не

А1а

С1п

УаХ

Рю

Агд

УаХ

СХу

80 адссадссед ссдседдсдс дсасдсаесд садсССсасс аСсСсССссе ддсеаСадса 409 адаССдадаС ССаСаааеса СаСасааСаа дадССдсСдс дд 451 <2Х0> 2 <211> 84 <212> РКТ <213> Ногбеит уиХдаге <400> 2

МеС Зег Зег УаХ С1и Ьуз Ьуз Рго С1и С1у УаХ Азп ТЬг СХу АХа СХу

1

5

10

15

Азр

Агд

Нхз

АЗП

Ьеи

Ьуз

ТЬг

СХи

Тгр

Рго

СХи

Ьеи

Уа1

С1у

Ьуз

Зег

20

25

30

Уа1

СХи

СХи

А1а

Ьуз

Ьуз

УаХ

11е

Ьеи

СХп

Азр

Ьуз

Рго

С1и

АХа

С1п

35

40

45

ХХе

Не

Уа1

Ьеи

Рго

УаХ

СХу

ТЬг

11е

УаХ

ТЬг

Мес

СХи

Туг

Агд

Не

50

55

60

Азр

Агд

УаХ

Агд

Ьеи

РЬе

УаХ

Азр

Ьуз

Ьеи

Авр

Азп

Не

АХа

СХп

УаХ

65

70

75

80

Рго Агд УаХ СХу <210> 3 <211> 27 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 3 сдддаессаС даадасадСд дссадад 27 <210> 4 <211> 28 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 4 сдсСсдадСс адссдасссС ддддассС 2В <210> 5 <211> 21 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400>

сСдСаСсСдд сддсессдСд д 21 <210> б <211> 19 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> б асадсСддсс сесдсадас 19 <210> 7 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 7 сссасСдсСС аседдсССаС 20 <210> 8 <211> 19 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 8

Сддддседса сдСсаШд 19 <210> 9 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 9 едСдсеасдд сдадСССдде 20 <210> 10 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 10 ддсесдсдаа аддсСссаСС 20 <210> 11 <211> 22 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 11 даааЕдЕЕса сааЕЕадссс Ед 22 <210> 12 <211> 60 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 12 даадаЕсЕаЕ ддсддссдса ссаааааада ададаааддЕ аддаЕссаЕд аадасададЕ 60 <210> 13 <211> 28 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 13 сдсЕсдадЕс адссдасссЕ ддддассЕ 28 <210> 14 <211> 30 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 14 даадаЕсЕаЕ ддасЕддаЕс ЕддсдсаЕсс 30 <210> 15 <211> 28 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 15 даддаЕссад ааЕдадсдсс ддЕадсад 28 <210> 16 <211> 21 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 16 сЕдЕаЕсЕдд сддсЕссдЕд д 21 <210> 17 <211> 55 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400 17 сЕааЕсЕада сЕасадсЕсд ЕссЕЕдЕадЕ ссЕсдаддсс дасссЕдддд ассЕд 55 <210> 18 <211> 29 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400 18 сдддаЕссаЕ даадасадад Еддссадад 29 <210 19 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400 19 ссддссЕЕаЕ Ессаадсддс 20 <210> 20 <211> 28 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400 20 сЕдссддЕдд дЕасааЕЕдЕ дассаЕдд 28 <210 21 <211> 21 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400 21 сЕдЕаЕсЕдд сддсЕссдЕд д 21 <210> 22 <211> 21 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400 22 сЕдЕаЕсЕдд сддсЕссдЕд д 21 <210 23 <211> 44 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 23 сдадЕЕЕдЕс дасааададд сддасдсдаЕ сдаЕдсдаЕа ЕЕсс 44 <210 24 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <22О>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400 24 ссддссЕЕаЕ Ессаадсддс 20 <210> 25 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Описание синтетической последовательности; Синтетический ДНК-праймер <400 25 ссддссЕЕаЕ Ессаадсддс 20 <210 26 <211> 21 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 26 сЕдЕаЕсЕдд сддсЕссдЕд д 21 <210 27 <211> 54 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Описание синтетической последовательности:

ΊΊ

Ί8

Синтетический ДНК-праймер · <400> 27 аЕЕЕдсЕадс сдсасаасса дсааЕддсас Едаадасада дСддссадад ЕЕдд 54 <210> 28 <211> 37 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <22О>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 28 аЕаадааЕдс ддссдсдссд асссЕдддда ссЕдддс 37 <210> 29 <211> 17 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 29 сасасаддаа асЕаЕда 27 <210> 30 <211> 115 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 30 сЕдссддСдд дСасааЕСдЕ дсЕдсдсЕас аЕддассдсд сааЕадЕдаЕ даасдЕдаас 60 аЕСадсдсас дсааасЕасд даЕСдаЕсдс дЕссдссЕсЕ ЕЕдЕсдасаа асссд 115 <210> 31 <211> 25 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <22О>

<223> Описание синтетической последовательности:

Синтетический ДНК-праймер <4 00> 31 сдадЕССдСс дасааададд сддас 25 <210> 32 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 32

СсСдссддСд ддСасааССд 20 <210> 33 <211> 83 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический вырожденный олигонуклеотид <400> 33

ЕсЕдссддСд ддЕадааЕСс пплпкппкпп кппкппкппк ппкппксдда ЕЕдаСсдсдЕ 60 ссдссЕсЕЕЕ дЕсдасааас Бед 83 <210> 34 <211> 25 <212> ДНК <213> синтетическая последовательность <22О>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> 34 сдадЕЕЕдЕс дасааададд сддас 25 <210> 35 <211> 12 <212> РАТ <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Фрагмент, составляющий сигнал ядерной локализации <400> 35

Мес А1а АХа Рго Ьуз Ьуз Ьуз Агд Ьуз УаХ 01у Зег 15 10 <210> 36 <2Н> 21 <212> РАТ <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Фрагмент, составляющий сигнал секреции <400> 36

МеС Азр Тгр Не Тгр Агд Не Ьеи РЬе Ьеи УаХ СХу А1а А1а ТЬг СХу 15 10 15

АХа ΗΪ3 Зег СХу Зег <210> 37 <211> В <212> РАТ <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Фрагмент, составляющий последовательность удерживания <400> 37

Ьеи СХи Азр Туг Ьуз Азр С1и Ьеи

5 <210> 38 <2Н> 23 <212> РАТ <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: Фрагмент, составляющий случайную вставку <400> 38

УаХ Ьеи Агд Туг Мес Азр Агд АХа Не УаХ МеС Азп УаХ Азп Не Зег

10 15

А1а Агд Ьуз Ьеи Агд Не Азр <210> 39 <211> 5788 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>

<223> Описание синтетической последовательности: гибридная кольцевая плазмида <400> 39

ЕсдсдсдЕЕЕ сддЕдаЕдас ддЕдаааасс СсЕдасасаЕ дсадсгсссд дадасддЕса 60 садсССдСсС дСаадсддаС дссдддадса дасаадсссд Есадддсдсд ЕсадсдддСд 120 СБддсдддСд СсддддсСдд сССаасСаСд сддсаЕсада доадассдса ссдададЕдс 180 ассаЕаЕдсд дСдСдаааСа ссдсасадаЕ дсдЕааддад ааааЕассдс аЕсаддсдсс 240 асссдссаСБ саддсЕдсдс аасЕдЕЕддд аадддсдаЕс ддБдсдддсс ЕсЕЕсдсЕаЕ 300 СасдссадсС ддсдаааддд ддаСдСдсСд сааддсдаЕЕ аадСБдддСа асдссадддС 360 ЕЕЕсссадЕс асдасдССдС аааасдасдд ссадСдааСЕ сСссддааЕЕ ддсСадссСа 420 дадЕссдЕЕа саЕаасЕЕас ддЕаааЕддс ссдссЕддсЕ дассдсссаа сдасссссдс 480 ссаССдасдС сааСааСдас дЕаЕдЕЕссс аСадСаасдс сааСадддас ЕЕЕссаЕЕда 540 сдЕсааЕддд ЕддадСаЕСЕ асддСааасС дсссасЕЕдд садЕасаЕса адЕдЕаЕсаЕ 600 аЕдссаадЕа сдсссссЕаЕ СдасдСсааЕ дасддЕаааЕ ддсссдссЕд дсаЕЕаЕдсс 660 садЕасаЕда ссЕЕаЕддда сЕЕЕссЕасЕ ЕддсадЕаса ЕсЕасдЕаЕЕ адЕсаЕсдсЕ 720 аЕЕассаЕдд ЕдаЕдсддЕЕ ЕЕддсадЕас аЕсааЕдддс дЕддаЕадсд дЕЕСдасЕса 780 сддддаЕЕЕс саадСсЕсса ссссаЕЕдас дЕсааЕддда дЕЕЕдЕЕЕЕд дсассааааЕ 840 саасдддасЕ ЕЕссааааЕд ЕсдЕаасаас ЕссдссссаС ЕдасдсаааЕ дддсддЕадд 900 сдЕдСасддЕ дддаддЕсЕа ЕааааадддЕ аадаасссса сасЕсддсдс дссадЕссЕс 960 сдаЕадасЕд адЕсдсссдд дЕасссдЕдЕ аЕссааЕааа дссЕЕЕЕдсЕ дЕЕдсаЕссд 1020 ааЕсдЕддЕс ЕсдсЕдаЕсс Егдддадддг сСссЕсадад СдаЕЕдасЕд сссадссЕдд 1080 дддЕсЕЕЕса ЕСЕдддддсЕ сдЕссдддаЕ ЕЕддадассс ссдсссаддд ассассдасс 1140 сассдЕсддд аддЕаадсЕд дссадсдаСс дЕЕЕЕдЕсЕс сдЕсЕсЕдЕС ЕЕСдСдсдЕд 1200 ЕдЕдЕдЕдЕд ЕдссддсаЕс ЕасЕЕЕЕЕдс дссЕдсдЕсЕ даЕЕсЕдЕас ЕадЕЕадсЕа 1260 асЕадаЕсЕд ЕаСсЕддсдд сЕссдЕддаа даасЕдасда дЕЕсдЕаЕЕс ссдассдсад 1320 сссЕдддада сдСсСсадад дсаСсддддд ддддаЕссад адсЕсдадсЕ ЕЕдаааааса 1380 сдсддссдсс аЕдЕадЕсЕа даасдсдЕЕд аЕсадЕЕаас дааЕЕсдаад ддЕсссаддс 1440 сЕсддадаЕс СдддсссаСд сддссдсссс сЕаасдЕЕас Еддссдаадс сдсЕЕддааЕ 1500 ааддссддЕд ЕдсдЕЕЕдЕс ЕаЕаЕдСЕаС СЕЕссассаЕ аЕЕдссдЕсЕ ЕЕЕддсааЕд 1560 Едадддсссд дааассСддс ссЕдСсСЕсС ЕдасдадсаЕ ЕссЕаддддЕ сЕЕЕссссЕс 1620 Есдссааадд ааЕдсааддЕ сЕдЕСдааЕд ЕсдЕдаадда адсадЕЕссЕ сЕддаадсЕЕ 1680 сЕЕдаадаса аасаасдЕсЕ дЕадсдассс ЕЕЕдсаддса дсддаасссс ссассЕддсд 1740 асаддСдссЕ сЕдсддссаа аадссасдЕд ЕаЕаадаЕас ассЕдсааад дсддсасаас 1800 сссадЕдсса сдЕЕдЕдадЕ ЕддаЕадЕЕд ЕддааададЕ саааЕддсЕс ЕссЕсаадсд 1860 ЕаСЕсаасаа ддддсСдаад даЕдсссада аддЕасссса ЕЕдСаЕддда ЕсЕдаЕсЕдд 1920 ддссссддсд сасаСдсСЕС асаЕдСдЕЕЕ адЕсдаддЕЕ аааааасдес Еаддсссссс 1980 даассасддд дасдСддСЕС СссССЕдааа аасасдаЕЕд ссдсдЕдЕдд ссссдаасас 2040 сдадсдассс ЕдсадссааЕ аЕдддаЕсдд ссаЕЕдааса адаЕддаЕЕд сасдсаддЕЕ 2100 сЕссддссдс ЕЕдддЕддад аддсЕаЕЕсд дсЕаЕдасЕд ддсасаасад асааЕсддсЕ 2160 дсЕсЕдаЕдс сдссдЕдЕЕс сддсЕдЕсад сдеаддддед сссддЕЕсЕЕ ЕЕЕдЕсаада 2220 ссдассЕдсс сддЕдсссЕд ааСдаасСдс аддасдаддс адсдсддсЕа ЕсдЕддсЕдд 2280 ссасдасддд сдккссккдс дсадскдкдс ддскдскакк дддсдаадкд ссддддсадд адааадкакс саксакддсС дакдсаакдс дсссакксда ссассаадсд ааасаксдса дксккдксда ксаддакдак скддасдаад ксдссаддск сааддсдсдс акдсссдасд сскдсккдсс даакаксакд дкддаааакд ддскдддкдк ддсддассдс каксаддаса адсккддсдд сдаакдддск дассдскксс сдсадсдсак сдссккскак сдсскксккд аккдкааакс асдкдаакаа аадаккккак асссскксак ааддсккадс садскааскд аСассададс кдакдккскс адааааасаа ассдддаска дддссаааса ддакакскдк аадаасадак ддкссссада аасадададд дакакскдкд дксаадсаск адддссссдд акадскаааа саасаасадк кксаададас ссддддакса ассссаадсс ксакккааас сссдсдскка ккдскдссеа дскскакааа дксскссдак адаскдадкс дсссдддкас сакссдаакс дкддксксдс кдакссккдд аддсакдсаа дсккддсдка аксакддкса сксасааккс сасасаасак асдадссдда кдадкдадск аасксасакк ааккдсдккд скдксдкдсс адскдсакка акдааксддс дддсдскскк ссдскксскс дсксаскдас дсддкаксад сксасксааа ддсддкаака ддааадааса кдкдадсааа аддссадсаа скддсдкккк кссакаддск ссдсссссск сададдкддс дааасссдас аддаскакаа сксдкдсдск сксскдкксс дассскдссд ксдддаадсд кддсдскккс ксаакдскса дкксдсксса адскдддскд кдкдсасдаа кссддкааск аксдксккда дкссаасссд дссаскддка асаддаккад сададсдадд кддкддсска аскасддска саскадаадд ссадккасск ксддааааад адккддкадс адсддкддкк кккккдкккд саадсадсад даксскккда ксккккскас ддддкскдас аккккддкса кдадаккакс аааааддакс адккккааак саакскааад какакакдад аксадкдадд сасскакскс адсдакскдк сссдксдкдк адакааскас дакасдддад акассдсдад асссасдскс ассддсксса адддссдадс дсадаадкдд ксскдсааск кдссдддаад скададкаад кадкксдсса дскасаддса ксдкддкдкс асдсксдксд саасдаксаа ддсдадккас акдакссссс ддксскссда ксдккдксад аадкаадккд дссдсадкдк каксасксак ддккакддса дсаскдсака акксксккас кдксакдсса кссдкаадак дсккккскдк даскддкдад касксаасса адксаккскд адаакадкдк акдсддсдас сдадккдскс ккдсссддсд ксаакасддд акаакассдс дссасакадс адааскккаа аадкдсксак саккддаааа сдккскксдд ддсдааааск сксааддакс ккассдскдк кдадакссад кксдакдкаа 5460 сссасксдкд сасссааскд акскксадса ксккккаскк ксассадсдк ккскдддкда 5520 дсааааасад дааддсаааа кдссдсаааа аадддаакаа дддсдасасд дааакдккда 5580 акасксакас кскксскккк ксаакаккак кдаадсаккк аксадддкка ккдксссакд 5640 адсддакаса какккдаакд какккадааа аакааасааа каддддкксс дсдсасаккк 5700 ссссдаааад кдссасскда сдкскаадаа ассаккакка ксакдасакк аасскакааа 5760 аакаддсдка ксасдаддсс сккксдкс 5788 ксдасдккдк саскдаадсд ддаадддаск аксксскдкс аксксасскк дсксскдссд ддсддскдса СасдсккдаС ссддскассг ксдадсдадс асдкасксдд акддаадссд адсаксаддд дсксдсдсса дссдааскдк дсдаддакск сдксдкдасс сакддсдакд дссдсккккс кддакксакс даскдкддсс кадсдккддс касссдкдак аСкдскдаад ксдкдсккка сддкаксдсс дсксссдакк асдадккскк скдасккаад асаакадаад Ссадкккаса дааададддд ддаакдааад садкаасдсс аккккдсаад дсакдддааа даасааддаа дкасададад дскддааадк ддссаадсас кадддссссд дсссадддсс скддааадка ссдддаскад ддссааасад сссадддсса адаасадакд дкссссадаа ссадаааскд ксксааддкк ссссадакда каассаакса дсксдсккск сдсккскдка аадддкаада ассссасаск сддсдсдсса ссдкдкаксс аакааадсск кккдскдккд дадддксксс ксскекдксд сксдасскдс кадскдкккс скдкдкдааа Скдккакссд адсакааадк дкааадссСд дддкдсскаа сдсксаскдс ссдсккксса дксдддааас саасдсдсдд ддададдсдд кккдсдкакк ксдскдсдск сддксдкксд дскдсддсда сддккаксса садааксадд ддакаасдса ааддссадда ассдкааааа ддссдсдккд дасдадсакс асаааааксд асдсксаадк адакассадд сдкккссссс кддаадсксс сккассддак асскдкссдс скккскссск сдскдкаддк аксксадккс ддкдкаддкс ссссссдккс адсссдассд скдсдсскка дкаадасасд асккаксдсс аспддсадса какдкаддсд дкдскасада дкксккдаад асадкакккд дкакскдсдс кскдскдаад ксккдакссд дсааасааас сассдскддк аккасдсдса дааааааадд аксксаадаа дсксадкдда асдааааскс асдккааддд кксасскада кссккккааа ккааааакда кааасккддк скдасадкка ссаакдскка скаккксдкк сакссакадк кдсскдаскс ддсккассак скддссссад кдскдсаакд дакккаксад саакааасса дссадссдда ккакссдсск ссакссадкс каккааккдк дккаакадкк кдсдсаасдк кдккдссакк кккддкакдд скксакксад скссддкксс акдккдкдса ааааадсддк кадскссккс

2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 <210> 40 <211> 48 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <22О>

<223> Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <40О> 40 ддкеаддаак кскссддаак кддскадсск ададкссдкк асакааск <210> <211> <212> <213>

ДНК

Синтетиская последовательность <22О> <223>

Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400>

даддаскддс дсдссдадкд кддддккскк асссккккка кадасскссс ассдкасасд 60 сск 63 <210> 42 <211> 76 <212> ДНК <21Э> Синтетическая последовательность <22 0>

<223> Описание синтетической последовательности:

Синтетический ДНК-праймер <40О> 42 адакскссда ддсскдддас сскксдаакк сдккааскда ксаасдсдкк скадаскаса 60 кддсддссдс дкдккк 76 <210>

<211> <212> <213>

ДНК

Синтетическая последовательность <22О> <223>

Описание синтетической последовательности: Синтетический ДНК-праймер <400> дддддаксса дадсксдадс кккдааааас асдсддссдс сакд

Claims (53)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1) трансфекции подходящих упаковывающих клеток векторами, которые содержат случайно модифицированные нуклеотидные последовательности и которые способны интегрироваться в вирионы, продуцируемые указанными упаковывающими клетками,

1. Способ идентификации модулятора в форме биологически активного полипептидного фрагмента, который способен определяемо модулировать ш у1уо фенотипический признак в клетке, причем указанный способ предусматривает стадии (a) приготовления пула экспрессирующих векторов, причем каждый вектор указанного пула содержит, по меньшей мере, один член из библиотеки случайно модифицированных нуклеотидных последовательностей, полученных из исходной нуклеотидной последовательности, кодирующей исходный пептид, который непосредственно модулирует ш у1уо активность известной протеазы, причем случайно модифицированные нуклеотидные последовательности включают в себя неизменяемую часть, кодирующую каркасную часть исходного пептида, причем указанная каркасная часть служит для стабилизации указанного полипептидного фрагмента и является резистентной к протеолитическому разрушению и/или является нечувствительной к восстанавливающей среде, и случайные нуклеотиды, (b) трансформации популяции существенно идентичных клеток указанными векторами указанного пула таким образом, чтобы получить трансформированные клетки, (c) культивирования указанных трансформированных клеток в условиях, способствующих экспрессии указанных случайно модифицированных нуклеотидных последовательностей, (Е) исследования указанных трансформированных клеток и выделения трансформированной клетки (клеток), в которых предварительно выбранный фенотипический признак является модулированным, что свидетельствует о том, что продукт экспрессии указанной случайно модифицированной нуклеотидной последовательности является биологически активным, и (е) идентификации модулятора посредством определения указанной случайно модифицированной нуклеотидной последовательности указанного вектора, присутствующего в клетке (клетках), выделенной в стадии (Е), и/или определения аминокислотной последовательности продукта экспрессии, кодируемого указанной случайно модифицированной нуклеотидной последовательностью.

2) культивирования указанных трансфицированных упаковывающих клеток в культуральной среде в условиях, которые способствуют продуцированию упаковывающими клетками вирионов, содержащих случайно модифицированные нуклеотидные последовательности,

2. Способ по п.1, где существенно идентичные клетки являются прокариотическими клетками.

3) выделения и необязательно концентрирования указанных вирионов и

3. Способ по п.1, где существенно идентичные клетки являются эукариотическими клетками.

4) трансдукции указанных существенно идентичных клеток этими вирионами.

4. Способ по п.3, где эти эукариотические клетки выбраны из группы, состоящей из гриб ковых клеток, клеток простейших, клеток животных и клеток растений.

5. Способ по п.4, где клетки животных выбраны из группы, состоящей из клеток млекопитающих, клеток членистоногих, таких как клетки насекомых, клеток птиц и клеток рыб.

6. Способ по любому из предыдущих пунктов, где трансформированные клетки, исследуемые в стадии (ά), преимущественно несут одну единственную копию вектора.

7. Способ по п.6, где стадию трансформации (Ь) проводят в таких условиях, что эти трансформированные клетки трансформируются преимущественно или трансформируются самое большее одним единственным вектором из указанного пула или где перед проведением стадии (ά) клетки, трансформированные более чем одним вектором из указанного пула, по существу, исключаются из последующих стадий.

8. Способ по любому из предыдущих пунктов, где случайные нуклеотиды вводят в часть (части) исходной нуклеотидной последовательности, которая кодирует (которые кодируют) активный сайт (сайты) исходного пептида, или часть (части), которая кодирует (которые кодируют) структуру (структуры), которая блокирует активный сайт (сайты).

9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где неизменяемая часть этой нуклеотидной последовательности кодирует укороченные части каркасной части исходного пептида, достаточные для поддержания стабильности.

10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где неизменяемая часть исходной нуклеотидной последовательности кодирует пептид, который не содержит дисульфидных мостиков.

11. Способ по любому из пп.1-9, где неизменяемая часть исходной нуклеотидной последовательности кодирует пептид, содержащий дисульфидные мостики.

12. Способ по любому из предыдущих пунктов, где случайные нуклеотиды вводят в виде вставки или замены в исходную нуклеотидную последовательность, необязательно в комбинации с делецией (делециями) в исходной нуклеотидной последовательности .

13. Способ по п.12, где число случайных нуклеотидов, которые вводят, находится в диапазоне от 3 до приблизительно 100.

14. Способ по любому из предыдущих пунктов, где случайные нуклеотиды являются нуклеотидными последовательностями и/или отдельными случайными нуклеотидами, введенными в специфических сайтах в исходную нуклеотидную последовательность.

15. Способ по любому из предыдущих пунктов, где случайные нуклеотиды выбраны из группы, состоящей из синтетических, полностью случайных дезоксирибонуклеотидов;

синтетических случайных последовательностей ДНК, в которых ограничение рандомизации некоторых нуклеотидов вводят таким образом, чтобы ограничить число доступных последовательностей и/или избежать нежелательных стоп-кодонов и/или облегчить введение посттрансляционных модификаций экспрессируемого пептида (пептидов);

синтетических случайных последовательностей ДНК, таких как описанные в (1) или (2), связанных с последовательностью, кодирующей метку для очистки и кодирующих СОВ. нуклеотидных последовательностей, выделенных из библиотеки иммунокомпетентных клеток, индуцированных против антигена.

16. Способ по п.15, где кодирующие СОВ нуклеотидные последовательности кодируют пептидные последовательности СОВ-3.

17. Способ по любому из пп.14-16, где случайные нуклеотиды получают случайным синтезом кодонов, где определенные кодоны ДНК синтезируются случайным образом.

18. Способ по п.17, где относительное количество синтезированных кодонов гарантирует, что все кодируемые аминокислоты будут присутствовать существенно с одной и той же частотой во всех кодируемых полипептидных фрагментах.

19. Способ по любому из предыдущих пунктов, где случайные нуклеотиды вводят в экспрессирующий вектор по принципу сайтнаправленного ПЦР-опосредованного мутагенеза.

20. Способ по любому из предыдущих пунктов, где исходный пептид является ингибитором активности известной протеазы.

21. Способ по п.20, где ингибитор выбран из группы, состоящей из ингибитора протеаз семейства ΒΡΤI-Киη^ίζ, ингибитора протеаз семейства серпинов, ингибитора протеаз семейства Кахак ингибитора протеаз семейства ингибиторов трипсина сои (ΚιιηίΙζ), члена семейства ингибиторов I картофеля, ингибитора протеаз семейства Во\утап-В|гк, члена семейства ингибиторов ксцтй, ингибитора протеиназ тар-типа Роиг-й1ки1ййе Соге (с четырьмя дисульфидными связями в коре), ингибитора протеаз семейства гирудинов, ингибитора фактора роста Ха, члена семейства ингибиторов трипсина Аксапк, ингибитора протеаз семейства цистатинов, ингибитора цистеиновых протеаз семейства калпаинов, члена семейства тканевых ингибиторов металлопротеиназ, ингибитора карбоксипептидазы А, ингибитора металлокарбоксипептидазы и ингибитора ангиотензин-превращающего фермента.

22. Способ по п.21, где исходный пептид является членом семейства I ингибиторов картофеля.

23. Способ по п.22, где исходный пептид является ингибитором 2А химотрипсина (С'.Ч2А).

24. Способ по любому из предыдущих пунктов, где существенно идентичные клетки являются клетками млекопитающих и вектор выбран из группы, состоящей из ретровирусного вектора, вектора-вируса коровьей оспы, аденовирусного вектора, вектора-аденоассоциированного вируса (ААУ), вектора-вируса простого герпеса (Ηδν), альфа-вирусного вектора и вектора-вируса лесов Семлики (ЬетЫл Югекк уйик).

25. Способ по п.24, где вектор является ретровирусным вектором.

26. Способ по п.25, где ретровирусный вектор происходит из ретровируса, выбранного из группы, состоящей из вируса лейкозасаркомы птиц (Λ^δV), вируса типа С млекопитающих, вируса типа В млекопитающих и лентивируса, и необязательно модифицирован цисдействующими элементами.

27. Способ по п.25 или 26, где ретровирусный вектор имеет неидентичные концы.

28. Способ по п.27, где неидентичные концы содержат неидентичные промоторы.

29. Способ по любому из пп.25-28, где ретровирусный вектор содержит гетерологичный промотор, заменяющий вирусный промотор в 5’-ЬТЯ (длинном концевом повторе), такой как промотор СМ^ промотор ЯδV, промотор δν40, промотор ТК, промотор МТ или индуцируемую систему, такую как Тек или Εсбукοηе.

30. Способ по любому из пп.25-29, где стадию (а) проводят путем

31. Способ по п.30, где упаковывающие клетки выбраны из группы, состоящей из РЕ501, Вοкζ23, ψ2, СΡ+Ε86, ΡНοеπ^xΕсο. РА317, СР+АМ12, ^Λ(атр11ο). В1п§, ЕЬУА13, Ргорак, СИПЕ ψΛМ, Р^шх-Атр^, РС13, Η9 (293СРС) и ΕсοΡаск.

32. Способ по любому из пп.25-31, где вирионы представляют собой псевдотипированный ретровирус, продуцируемый экотропной упаковывающей клеточной линией таким обра зом, чтобы придать широкий тропизм продуцируемым таким образом вирионам, или где экотропный рецептор был введен в существенно идентичные клетки таким образом, чтобы сделать возможной трансдукцию экстренными вирионами.

33. Способ по п.32, где экотропный рецептор был введен в существенно идентичные клетки посредством трансдукции.

34. Способ по любому из предыдущих пунктов, где случайно модифицированные нуклеотидные последовательности связаны с нуклеотидной последовательностью, кодирующей, по меньшей мере, один партнер слияния.

35. Способ по п.34, где указанный партнер слияния служит для способствования экспрессии и/или очистки/выделения и/или дополнительной стабилизации продукта экспрессии.

36. Способ по п.35, где партнер слияния включает в себя метку для очистки, такую как Шк₆-метка, тус-метка, последовательностьмишень биотинилирования ВδΡ, ВпА, Ди-метка, ΕκΖ и СδΤ.

37. Способ по п.34 или 35, где партнер слияния является сигналом сортинга или нацеливающей последовательностью.

38. Способ по п.37, где сигнал сортинга является сигнальным пзтчем или сигнальным пептидом.

39. Способ по п.37 или 38, где сигнал сортинга вызывает экспорт экспрессируемого пептида из клетки или в клеточную мембрану или, когда существенно идентичные клетки являются эукариотическими клетками, в эндоцитоплазматический ретикулум, в аппарат Гольджи, в лизосомы, в секреторные пузырьки, в митохондрии, в пероксисомы или в ядро.

40. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно предусматривающий стадию выяснения трехмерной структуры идентифицированного модулятора.

41. Способ получения реплицируемого экспрессирующего вектора, причем указанный способ предусматривает стадии идентификации модулятора с использованием способа по любому из предыдущих пунктов и затем

ί) выделения или синтеза последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует указанный модулятор, и ίί) конструирования реплицируемого экспрессирующего вектора, содержащего оперон, который содержит, в 5'-3'-направлении и в функциональной связи, 1) промотор для запуска экспрессии этой последовательности нуклеиновой кислоты, 2) необязательно нуклеотидную последовательность, кодирующую лидерный пептид, 3) последовательность указанной нуклеиновой кислоты и 4) необязательно сигнал терминации.

42. Способ получения трансформированной клетки, несущей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую модулятор, определенный в любом из пп.1-40, причем указанный способ предусматривает трансформацию подходящей клетки-хозяина экспрессирующим вектором, полученным в соответствии со способом по п.41.

43. Способ получения модулятора, определенного в любом из пп.1-40, причем указанный способ предусматривает

Ι) выращивание трансформированной клетки, полученной с использованием способа по п.42, в культуральной среде в условиях, которые способствуют экспрессии этой клеткой случайно модифицированной нуклеотидной последовательности, и

ΙΙ) последующий сбор продукта экспрессии из этой клетки и/или культуральной среды, или

Ι;·ι) идентификацию модулятора с использованием способа по любому из пп.1-40 и

ΙΠ) последующий синтез модулятора с использованием химического синтеза на основе последовательности, определенной в стадии (е).

44. Способ выделения и/или идентификации биомолекулы-мишени, причем указанный способ предусматривает получение модулятора по способу п.43 и последующее использование этого модулятора в качестве аффинного лиганда в стадии аффинной очистки таким образом, чтобы выделить биомолекулу-мишень из подходящего образца.

45. Способ по п.44, где стадия аффинной очистки представляет собой стадию аффинной хроматографии, стадию аффинной массспектрометрии или стадию иммунной копреципитации.

46. Способ выделения и/или идентификации биомолекулы-мишени, причем указанный способ предусматривает получение пептидного модулятора по способу п.42 и последующее использование этого модулятора в качестве зонда в отношении библиотеки кДНК, полученной из существенно идентичных клеток, или использование этого модулятора в качестве наживки в дигибридной или тригибридной системе.

47. Способ по любому из пп.44-46, где биомолекула-мишень является пептидом или нуклеиновой кислотой.

48. Способ по п.47, причем указанный способ дополнительно предусматривает стадию определения аминокислотной последовательности указанного пептида или нуклеотидной последовательности указанной нуклеиновой кислоты.

49. Способ по любому из пп.44-48, причем указанный способ дополнительно предусматривает стадию выяснения трехмерной структуры биомолекулы-мишени.

50. Способ отбора химического соединения в качестве потенциального лекарственного средства в разработке лекарственных средств, причем указанный способ предусматривает стадии анализа библиотеки химических соединений на взаимодействие с биомолекулоймишенью, которая была бе поуо выделена в соответствии со способом по любому из пп. 44-49, и отбора соединений, которые значимо взаимодействуют с этой биомолекулоймишенью.

51. Способ по п.50, где библиотека химических соединений была получена при помощи химического синтеза после первоначальной идентификации членов этой библиотеки с использованием основанного на структуре или основанного не на структуре компьютерного моделирования лекарственных средств.

52. Способ получения лекарственного продукта, причем указанный способ предусматривает стадии

A) выбора химического соединения при помощи способа по п.50 или 51,

B) проведения преклинических испытаний с указанным химическим соединением для оценки его пригодности в качестве лекарственного продукта,

C) вступления, если химическое соединение признано пригодным в стадии В), в клинические испытания с использованием указанного химического соединения для получения разрешения выхода на рынок для лекарственного продукта, включающего в себя указанное соединение-прототип в качестве фармацевтически активного вещества, и

Ό) при получении разрешения выхода на рынок, смешивания данного химического соединения с фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем или разбавителем и распространения полученного таким образом лекарственного продукта.

53. Способ разработки лекарственного продукта, причем указанный способ предусматривает, что модулятор, идентифицированный с использованием способа по любому из пп. 1-40, служит в качестве соединения-прототипа в фазе разработки лекарственных средств, или способ, в котором биомолекула-мишень, выделенная/идентифицированная по любому из пп.4449, служит в качестве зонда взаимодействия для идентификации возможных кандидатов на лекарственное средство в фазе разработки лекарственных средств.