JPH11505724A

JPH11505724A - 生物活性ペプチド及び核酸の同定方法

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Publication number: JPH11505724A
Application number: JP8536119A
Authority: JP
Inventors: イェンセン、マルティン・ローランド; ペデルセン、フィン・スコウ; モウリツセン、ソレン; ヒンデルソン、ペーター; ドゥーフ、モーゲンス; ソレンセン、ミヒャエル・シャンドルフ; ダルム、イベン; ルンド、アンデルス・ヘンリック
Original assignee: エム・アンド・イー・バイオテク・エー／エス
Priority date: 1995-06-02
Filing date: 1996-05-31
Publication date: 1999-05-25
Also published as: EP0832207B1; DE69610310T2; PT832207E; EP1041143A2; ES2151167T3; DE69610310D1; GR3035017T3; AU5893396A; DK0832207T3; EP1041143A3; KR19990022157A; EP0832207A1; WO1996038553A1; AU699568B2; ATE196312T1; CA2222879A1

Abstract

(57)【要約】生物活性ペプチドおよび核酸を以下のステップ：（ａ）それぞれが、完全又は部分的にランダムなＤＮＡ配列を含有する適当なベクターのプールを生成するステップと、（ｂ）単一のリボ核酸、及び場合によってはペプチドが発現するように、又は限られた数の異なるランダムなリボ核酸及びペプチドがそれぞれの細胞によって発現されるように、多数の同一の真核細胞中に、前記ベクターを効率的に形質導入するステップと、（ｃ）それらのいくつかが、一定の表現型特性を変えたかどうかを調べるために、前記形質導入された細胞をスクリーニングするステップと、（ｄ）前記変化した細胞を選択及びクローニングするステップと、（ｅ）前記表現型が変化した細胞中のベクターＤＮＡを単離及び配列決定するステップと、（ｆ）該ＤＮＡ配列からリボ核酸及びペプチド配列を導き出すステップとを具備する方法により同定する。より大きなタンパク質、好ましくは抗体分子またはそのフラグメントに、該ペプチドを導入または融合してもよい。これは、このような、より大きなタンパク質をコードするＤＮＡ配列に、ランダムＤＮＡ配列を導入または融合することによって得られるであろう。

Description

【発明の詳細な説明】生物活性ペプチド及び核酸の同定方法本発明は、生物活性を有する新たなペプチド及び翻訳後修飾ペプチド並びに核酸の新規同定方法に関する。発明の背景過去５年間に、数多くの異なるランダムペプチド配列を発現、試験及び同定するための技術が劇的に発展した。このようなペプチドライブラリーは新たな生物活性ペプチドの同定のために使用されえ、従って、この技術は医薬開発の分野に刺激的でかつ非常に有望な新しい時代をもたらした。公知のペプチドライブラリー技術は、現在、２つの根本的に異なるグループに分けられる：ランダムペプチドを化学的に生成するランダム合成ペプチドライブラリー、及びランダムペプチドを部分的に又は完全にランダムなＤＮＡ配列によりコードし、かつ引き続きリボソームにより合成するランダム生合成ペプチドライブラリー。合成ペプチドライブラリー数多くのペプチドを含有する合成ペプチドライブラリーと組合せて、ペプチド化学により生成することができ、これは可溶性の形で合成されうるか（Ｒ．Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４、８４〜８６、１９９１）又はペプチド樹脂ビーズ上に固定化されたままであってよい（Ａ．Ｆｕｒｋａら、Ｉｎｔ．Ｊ．ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ．３７、４８７〜４９３、１９９１；Ｋ．Ｓ．Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４、８２〜８４、１９９１）。これらのアプローチのいずれかを用いて、種々のレセプターリガンドが単離されてきた。固相固定化ペプチドライブラリーと比較した場合の可溶性ペプチドライブラリーの利点は、可溶性ペプチドがより立体障害されずに問題のレセプターに結合しうることである。他方で、フルカ（Ｆｕｒｋａ）ら、１９９１年及びラム（Ｌａｍ）ら、１９９１年によりそれぞれ提案された合成ペプチドライブラリー技術における最も重要な改善点は、それぞれのビーズ上に一種類のみのペプチド配列を有するというアプローチであった（「１ビーズ−ペプチド」）。このことは、シングルビーズ上での活性ペプチドリガンド候補の直接選択、及び最終的には例えば、エドマン分解を用いる配列決定を可能にする。この技術を用いて、Ｄ−アミノ酸又は他の非天然アミノ酸からなるペプチドを包含する活性ペプチドを同定することができる（Ｂ．Ｇｉｓｓｅｌら、Ｊ．ＰｅｐｔｉｄｅＳｃｉｅｎｃｅ、ＩｎＰｒｅｓｓ、１９９５）。生合成ペプチドライブラリーファージ表面上でペプチドを発現することができるバクテリオファージ発現ベクターが構築されている（Ｓ．Ｅ．Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｓｃｉ．アメリカ合衆国、８７、６３７８〜６３８２、１９９０）。それぞれのペプチドは、ファージゲノムの、ランダムに突然変異された領域によってコードされ、従って、レセプターを結合することが分かった、バクテリオファージからの該当するＤＮＡ領域の塩基配列を決定すれば、ペプチドリガンドのアミノ酸配列が明らかになる。ペプチドリガンドを含有するファージは、レセプターに強く結合するファージのためのファージ集団を濃縮するパンニング操作を繰り返すことにより検出される（Ｊ．Ｋ．Ｓｃｏｔｔ，ＴＩＢＳ、１７、２４１〜２４５、１９９２）。同様のペプチドライブラリーを発現するために、細菌も使用されてきた。固体担体上に固定化されうる抗体のような移出されたタンパク質に、ペプチドを融合することができる。固体担体を適当な可溶性レセプターを用いてスクリーニングすることにより、ペプチドリガンド候補を生成する細菌クローンを同定することができる（Ｍ．Ｇ．Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．アメリカ合衆国、８９、１８６５〜１８６９、１９９２）。種々の、活性を有すると推測される化合物の大きなプールを生成するための、他に記載された方法は、ランダム化されたリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドからなるライブラリー、いわゆるアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）ライブラリーの使用によるものである。アプタマーは、ランダム化されたＤＮＡを含有するプラスミドベクターから、大腸菌内で作成される。これらのライブラリーから、生物活性を有する構造が同定された（Ｌ．Ｃ．Ｂｏｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ、３５５、５６４〜５６６、１９９２）。発明の目的生物活性ペプチド及び核酸、又はそれら各々の細胞標的タンパク質を同定するための先行技術の方法を使用するためには、一定の生物学的プロセスに含まれる分子メカニズムに関する詳しい知識を持つことが必要である。これらのメカニズムが理解される場合に、引き続き、前記の方法を用いて、関与する標的（レセプター、酵素等）のアンタゴニスト又はアゴニストを開発することができる。本発明により解決されるべき問題は、一般に、前記の詳しい知識の必要性を克服することである。発明の要約本発明により、ペプチド配列又はリボ核酸を、多くの部分的に又は完全にランダムなペプチド及びリボ核酸を含有する生合成的に発現された真核性ライブラリーから同定する。本発明に関して、「ペプチド」なる用語は、より大きなタンパク質（例えば抗体）中に導入された又はこれに融合されたペプチド配列も包含すると理解すべきである、ペプチド及びリボ核酸は、細胞中へ有効に形質導入されたランダムＤＮＡ配列から、細胞によって合成される。ライブラリー中のペプチド又はリボ核酸のいくつかは、それらが発現される細胞中の重要な生物学的機能に影響を及ぼすであろう。このような物質の存在により表現型を変える細胞を単離し、引き続き、その化学的構造を、それらをコードするＤＮＡの塩基配列決定により明らかにすることができる。このようなペプチドは、治療的に又は将来の医薬開発のための先導化合物として、おそらく使用することができ、又はこれらは、細胞の生物学的機能に変化を生じせしめる新たな標的タンパク質を同定するために使用することができる。このような標的タンパク質は、最終的に、例えば従来の薬剤化学又は合成ペプチドライブラリーによる医薬の開発に使用することができる。従って、本発明の方法は、次の工程よりなる：（ａ）それぞれが、完全又は部分的にランダムなＤＮＡ配列を含有する適当なベクターのプールを生成し、（ｂ）単一のリボ核酸、及び場合によってはペプチドが発現するように、又は限られた数の異なるランダムなリボ核酸及びペプチドがそれぞれの細胞によって発現されるように、多数の同一の真核細胞（例えば哺乳動物細胞）中に、前記ベクターを効率的に形質導入し、（ｃ）それらのいくつかが、一定の表現型特性を変えたかどうかを調べるために、前記形質導入された細胞をスクリーニングし、（ｄ）前記変化した細胞を選択及びクローニングし、（ｅ）前記表現型が変化した細胞中のベクターＤＮＡを単離及び配列決定し、（ｆ）該ＤＮＡ配列からＲＮＡ及びペプチド配列を導き出す。図面の簡単な説明図１は、標準レトロウイルスペプチド発現ベクターの略図である。プラスミド型ベクター（上）は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有し、これは、Ａｋｖマウス白血病ウイルスからのバックボーン（Ｒ、Ｕ５、ＰＢＳ、＠、ＰＰＴ、Ｕ３及びＲ）、及びネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）の翻訳を誘導するＥＭＣウイルスからの内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）が後続する、ペプチド翻訳カセットを有するレトロウイルスＲＮＡ（中央）の発現を誘導する。標的細胞中のベクタープロウイルス（下）は、再生された、レトロウイルスの末端反復配列−ＬＴＲ（Ｕ３、Ｒ及びＵ５）を含有する。ＣＭＶプロモーター配列は、有効な初期ＰＣＲ突然変異誘発及び増幅のための特有の標識を提供する。挿入されたペプチド発現カセットを含まないベクターの大きさは４．０ｋｂである。好ましい態様の説明全ての現在公知のペプチドライブラリー技術に固有の要求は、得られたレセプター又は酵素が細胞の一定の表現型特性を調節するメカニズムについて詳細な知識が必要であるということである。さらに、二種のペプチドライブラリーのどちらかでリガンドが選択されうる前に、このレセプター又は酵素を比較的純粋な形で得なければならない。最終的に、ペプチドリガンドと推定されるリガンドが同定された場合に、該リガンドが所望の細胞表現型特性に対してアンタゴニスト又はアゴニスト効果を発揮するかどうかを確定するために、機能的アッセイを行わねばならない。本発明による方法は、この重大な問題を克服する。従って、本発明の方法により、細胞の内部又は表面上で現象を生じせしめるメカニズム、レセプター、シグナル経路、酵素等のつながりを知る必要はない。それというのも、これは、得られる生物学的効果又はスクリーニングされる表現型特性であるからである。これは、次の工程によって達成される：（ａ）それぞれが、完全又は部分的にランダムなＤＮＡ配列を含有する適当なベクターのプールを生成し、（ｂ）単一のリボ核酸およびペプチド種のみが発現するように（「１細胞−１リボ核酸またはペプチド」）、又は任意に、限られた数の異なるランダムなリボ核酸及びペプチドがそれぞれの細胞によって発現されるように、多数の同一の真核細胞（例えば哺乳動物細胞）中に、前記ベクターを効率的に形質導入し、（ｃ）それらのいくつかが、一定の表現型特性を変えたかどうかを調べるために、前記形質導入された細胞をスクリーニングし、（ｄ）前記変化した細胞を選択及びクローニングし、（ｅ）前記表現型が変化した細胞中のベクターＤＮＡを単離及び配列決定し、（ｆ）該ＤＮＡ配列からＲＮＡ及びペプチド配列を導き出す。単離されたＤＮＡ配列によりコードされるＲＮＡ又はペプチドは、前記した、細胞の表現型変化の原因でありえ、それ故生物活性を有するかもしれない。例えば、導入前には完全に同一である生物学的に興味深い細胞の細胞質中で、例えば実施例１に記載したレトロウイルスベクター系を用いて、導入されたペプチを発現する。これらは、例えば実施例１で記載されている如く構築された、ランダムなＤＮＡ配列を含有するベクターのプールから発現される。適当な比の感染レトロウイルス及び非感染細胞を用いて、レトロウイルスベクターのプールから誘導された単一ＤＮＡコピーのみを各細胞中に導入する。この「１細胞−１核酸又はペプチド」概念による主要な利点は、ペプチドの導入の際に表現型が変化した細胞をクローニング及び選択方法により単離しうること及び引き続き、表現型変化を引き起こす活性ペプチドを同定しうることである。これは、ペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを例えばポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）技術により単離すること及びＤＮＡ配列を引き続き同定することにより達成される。初期スクリーニング操作の間に、数多くのレトロウイルスベクターを、個々の細胞がいくつかの異なるリボ核酸又はペプチドを発現することができるそれぞれの細胞中に導入することができる。引き続き、表現型が変化した細胞クローンを単離すれば、該クローン中の全てのレトロウイルスＤＮＡをＰＣＲにより単離することができ、ウイルスを産生するために通常使用されるパッケージング細胞へ再トランスフェクションするために、該ＰＣＲ産物を用いることができる。引き続き、「１細胞−１リボ核酸又はペプチド」概念を用いて、これらのパッケージング細胞から単離されたレトロウイルスベクターを、新たな生物学的に興味深い細胞に対して形質導入するために使用することができる。最後に、第２のクローニング操作後に、活性物質を前記のようにして同定することができる。さらに、この方法により単離された生物活性リボ核酸、ペプチド又はタンパク質は、医薬開発のための貧化合物（ｂａｄｃｏｍｐｏｕｎｄ）として又は生物活性の原因であるタンパク質標的を単離及び同定するという目的で、親和性リガンドとして使用されうる。このような標的タンパク質は、医薬開発における非常に有効な道具である。小さなベクター（３ｋｂより小さいＤＮＡ）を使用することには、連結及びクローニングステップなしに、簡単なＰＣＲ−突然変異誘発及び増幅が可能になるという大きな利点がある。小さなベクターを用いることの他の重要な利点は、標的細胞のプール中のベクターをＰＣＲにより直接増幅でき、かつパッケージング細胞中へ再トランスフェクションしうることであり、これによって、時間のかかる擬陽性の分析又は混入した細胞の分析が不要となり、複数回の選択が可能になる。誘導されたランダムプラスミドクローンの直接配列分折は、発現ライブラリーの不規則性を保証するために使用される。ランダムペプチドライブラリーを発現することができる標準ベクターを、図１に図示した。あるいは、ランダムなＤＮＡ配列の導入の際に、表現型が変化したことが明らかとなった細胞は、ランダム化されたリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドからなる既述のライブラリー（いわゆるアプタマーライブラリー）と同様に、導入されたＤＮＡから転写されたリボ核酸分子との相互作用の結果として、変化したのかもしれない。従って、このようなリボ核酸分子も生物活性を有するであろう。さらに、観察された効果は、炭水化物原子団の生物活性、又は細胞中に発現されたペプチド上の他の翻訳後修飾の生物活性によるものでありうる。その場合、ライブラリー中のペプチド上に適当な精製標識を用いれば、これらを精製し、問題となる翻訳後修飾の正確な化学構造を分析することが可能となるであろう。ほ乳類細胞中へ安定に遺伝子を移入するために一般に使用される非ウイルス的方法の効率は非常に低いので、このような方法により、ほ乳類細胞中でペプチド発現ライブラリーを確立することはできないであろう。さらに、非ウイルス的方法は、一般に、細胞ゲノム中へＤＮＡを複数組み込ませ、「１細胞−１リボ核酸又はペプチド」概念と一致しない。必要な、高効率の単一遺伝子コピー移入を達成するためには、ウイルスベクターを使用すべきである。ごく最近、レトロウイルスベクターを用いて構成されたｃＤＮＡ発現ライブラリーが記載された。このようなライブラリーから、サイトカイン及び細胞成長因子が単離された（Ａ．ＪＭ．Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．アメリカ合衆国、８４、８２７７〜８２８１、１９８７、Ｂ．Ｙ．Ｗｏｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６８、５５２３〜３１、１９９４、Ｊ．Ｒ．Ｒａｙｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１４、８８０〜８８７、１９９４）。レトロウイルスベクターを用いるのではないが、トランスフェクトした真核細胞中で、周知のペプチドを発現することも以前に確立された（Ｍ．Ｓ．Ｍａｌｎａｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３５７、７０２〜７０４、１９９２、Ｅ．Ｏ．Ｌｏｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５３、１４８７〜１４９４、１９９４）。生物活性ペプチド又はリボ核酸を同定する目的で、ランダムペプチドのライブラリーをほ乳類細胞中に、発現させることは今まで行われていない。免疫学は、本発明による方法を使用することができる重要な生物学的分野である。Ｔ細胞は、抗原がＭＨＣ分子に結合された場合にのみタンパク質抗原のフラグメントを認識する。２種のＭＨＣ分子（クラスＩ及びＩＩ分子）は、Ｔ細胞に抗原フラグメントを提示する。実質的に全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩ分子により提示されるペプチドは、８〜９アミノ酸の長さであり、一般に細胞のサイトゾル中のタンパク質から誘導される。これらは、自己のタンパク質、ウイルス性タンパク質、トランスフェクションによりサイトゾル中に導入されるペプチド又は腫瘍抗原であってよい。このように、ペプチド又はＴ細胞エピトープを同定し得るということは、例えばワクチン開発に関して又は癌の免疫療法においてかなり興味深い。しかしながら、このようなフラグメントの同定には、間題となる腫瘍細胞から誘導され、アフィニティー精製された多量のＭＨＣ分子、及び高度質量分析法、ＨＰＬＣ及び機能性Ｔ細胞アッセイを何度も組み合わせることが必要であり、非常に困難で、要求が厳しく、時には不可能な課題である。さらに、大抵のペプチド抗原は、個々のペプチドがＭＨＣ分子上に非常に微量しか存在しないために、同定することができない。実施例２中で、本発明による方法が、前記Ｔ細胞エピトープの同定のために使用されうることを証明する。生物学的に重要な表面分子を発現する細胞系も、本発明によるランダムペプチドライブラリーを用いて形質導入されうる。このような分子の例は、Ｔ細胞の活性化のために重要であることが知られているＢ７補助刺激分子、又は炎症組織への炎症細胞のホーミングに関与することが知られているタンパク質のセレクチン（ｓｅｌｅｃｔｉｎ）類であってよい。表現型が変化した（例えばＢ７をアップレギュレート−又はダウンレギュレートする）細胞を実施例３に記載したように選択し、クローニングすることができる。ＰＣＲによって形質導入ＤＮＡを単離した後に、単離したＤＮＡで新規の細胞を形質導入して、観察を確認することができる。引き続き、ペプチド配列をＤＮＡ配列から導き出すことができる。特異的モノクロナール抗体又はＦ（ａｂ）フラグメントは細胞の細胞質中で発現することができ、そこで生物活性を発揮しうることが他者によって記載された（Ｔ．Ｍ．Ｗｅｒｇｅら、ＦｅｂｓＬｅｔｔｅｒｓ、２７４、１９３〜１９８、１９９０）。本発明により、完全に又は部分的にランダムなペプチド配列を、抗体Ｆ（ａｂ）フラグメントの可変領域中に導入することもできる。従って、ランダムペプチド配列を含有するＦ（ａｂ）のライブラリーは、それぞれ全てが単一の抗体特異性を発現するような細胞クローン中で発現させることができる。引き続き、生物学的に変化した細胞を単離し、クローニングし、生物学的タンパク質中に含まれる標的タンパク質を精製するために、同定された細胞内Ｆ（ａｂ）フラグメントを使用することができる、引き続き、このような標的タンパク質を、前記標的タンパク質を修飾することができる医薬を開発するために使用することができる。本発明を次の例により説明する：実施例１細胞内真核性ペプチドライブラリーの構築ランダムペプチド配列を発現することができるレトロウイルスベクターを構築する。従来のランダムオリゴヌクレオチド合成を用いて、ベクター中で使用されるランダムＤＮＡ配列を生成した場合には、数多くの終始コドンが必然的に導入される。さらに、遺伝暗号の縮重により、コードされたアミノ酸の不均一分布が結果として生じる。ランダムコドン合成によりランダムＤＮＡ配列を生成することによってこれを避け：固相オリゴヌクレオチド合成のために使用される適当な量の樹脂（場合により、適当なベクタークローニング部位に相当するＤＮＡ配列をすでに含有している）を２０の異なる部分に分ける。第１の部分において、従来の固相化学合成で、アミノ酸（アラニン）をコードするコドンに相当する３個の塩基を合成する。第２の部分において、システインをコードするコドンを合成等する。２０の部分のそれぞれに、天然の各アミノ酸に相当するコドンを結合させてから、全ての部分を混合し、再び樹脂を２０の等しい大きさの部分に分ける。次いでコドン合成を再び繰り返し、（例えば６〜１０のランダムアミノ酸に相当する）所望のランダム化されたＤＮＡ配列が合成されるまで全ての操作を繰り返す。これは、完全にランダムなオリゴヌクレオチド合成において、２０の天然アミノ酸をコードするブロックされた及び保護されたトリヌクレオチドホスホルアミダイトを用いることによっても達成されうる（Ｊ．Ｓｏｎｄｅｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．アメリカ合衆国、８９、３５８１〜５、１９９２）。最後に、他の適当なベクタークローニング部位を、最終的に樹脂から切断される前に、全てのオリゴヌクレオチド上で合成することができる。制限切断及び連結反応により、適当な位置にランダム配列を有するベクターのプールを生成するために、またはＰＣＲ−突然変異誘発により、優先的に効率の悪い連結反応工程を避けるために、ランダム合成オリゴヌクレオチドのプールを使用することができる、この方法は、ＰＣＲ−媒介部位特異的突然変異誘発の原理に従うが（Ｓ．Ｐｅｒｒｉｎら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８、７４３３〜３８、１９９０）、方法論は生成物の複雑な混合物を供給するように適合させた。すなわち、ユニーク末端ベクタープライマーと共に、ランダム配列と隣接したベクター配列を有するランダムオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用する。複雑さを保持するために、大量の鋳型および大量のベクター、及びランダム化されたプライマーを使用し、複数の独立したＰＣＲ反応をプールすることによって、産物の多様性を保証する。引き続き、残存するベクターセグメントを含む、重複したＰＣＲフラグメントを標準的ＰＣＲにより生成する。最後に、他のユニークな一組の末端プライマーを用いて、この重複セグメントを、ランダムＤＮＡを含有するＰＣＲフラグメントと連結する。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素により生成されたＤＮＡフラグメントは、３ ′ＤＮＡ鎖において付加的なヌクレオチドを含有しているかもしれない。これらの余分なヌクレオチドは、重複する末端を有する２つのＰＣＲ生成物を１つのフラグメントへと結合するのに有害であろう。クレノウＤＮＡポリメラーゼ酵素の添加することによって、前記酵素の３′→５′エキソヌクレアーゼ活性で、これらのヌクレオチドを除去することができ、結合効率を増加させる。あるいは、ＰＣＲ反応のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチド中に認識配列が組みこまれた制限酵素で消化することにより、ＰＣＲ生成物を平滑断端にすることができる。（Ｌｕｎｄら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４、８００〜８０１、１９９６）により開発された温度循環法の使用によって、連結反応の効率は増大させることができ、連結反応生成物をパッケージング細胞へ直接トランスフェクションするために使用し得る。多様性を保持するために、ＰＣＲで産生された線状ベクターＤＮＡをパッケージング細胞にトランスフェクションするために直接使用し、異なるベクターのプールを含有するビリオンを一時的状態下で採取する。ランダムペプチド翻訳カセットを含有する小さな複シストロン性単一転写ベクターの後ろには、ネオマイシン（Ｎｅｏ）耐性遺伝子の翻訳を誘導する、ＥＭＣウイルスからの内部リボソームエントリ部位（ＩＲＥＳ）が続いた、該Ｎｅｏ遺伝子は、必要であれば、力価試験及び非−形質導入細胞の除去を可能にするための選択マーカーとして機能する。利用可能な他の関連ベクターでは、フレオマイシン及びヒグロマイシンＢ耐性のような他の選択可能遺伝子を使用し、ＩＲＥＳ成分の後ろにペプチド翻訳カセットを有する。あるいは、ペプチド発現カセットのみを有し、選択マーカーが欠如した、より小さなベクターでさえも使用することができる。小さなベクター（４ｋｂより小さいＤＮＡ）の使用は、連結反応及びクローニングステップがない、簡易なＰＣＲ−突然変異誘発及び増幅が可能になるという大きな利点を有する。小さなベクターを用いることの他の重要な利点は、標的細胞のプール中のベクターをＰＣＲによって直接増幅することができ、かつパッケージング細胞中へ再トランスフェクションし得ることであり、このように、複数回の選択によって、時間のかかる擬陽性分析又は混入細胞分析を排除することが可能になる。誘導されたランダムプラスミドクローンを直接配列分析することは、発現ライブラリーの不規則性を保証するために使用される。ランダムペプチドライブラリーを発現することができる標準ベクターを図１に図示した。ベクタープールの多様性を保持するために、多くのベクターＲＮＡ転写物をレトロウイルス粒子中へキャプシド化すべきである。レトロウイルスベクター中の対応するＰＢＳと対をなすｔＲＮＡを発現するＤＮＡ構築物で、パッケージング細胞をトランスフェクションすることにより、ウイルス粒子を含有する機能性ベクターの生成を、一時的状態下で１０倍増大させることができる。新たなパッケージング細胞系は、全てのレトロウイルスタンパク質をコードする構築物を単回トランスフェクションした後に生じる。複製能を有するウイルスが発生する危険性を減らすために、及び最大発現を得るために、ベクターは、次の簡略化されたアウトラインを有する：プロモーター−ｇａｇ−ｐｏｌ転写物− ＩＲＥＳ−フレオマイシン耐性遺伝子−ＩＲＥＳ−ｅｎｖ−ポリアテニレーションシグナル前記ベクターの利点の１つは、フレオマイシン耐性遺伝子により、高い発現のための選択が可能になることと、ベクター転写物全体のサイズが、レトロウイルス粒子中へのキャプシド化を制限し、それにより複製能を有するウイルスが発生する危険性が減少する。ＲＮＡ転写物をキャプシド化するためのサイズの限界は、約１０ｋｂである。伝統的なパッケージング細胞系に加えて、対応するミニウイルスベクターを有するセミパッケージング細胞系が使用される。セミパッケージング細胞系は、互いに相補的な、２つの突然変異されたｇａｇ−ｐｏｌ転写物をコードするベクターからなる。２つの異なるｇａｇ−ｐｏｌ転写物を使用すれば、野生型ウイルスが生じる危険性が減少する。さて、セミパッケージング細胞系中の各細胞は、外皮タンパク質以外、レトロウイルス粒子の生成のために必要な全てのレトロウイルスタンパク質を含有し、これらのタンパク質はミニウイルスベクターにより供給される。このベクターは次のようなアウトライン：ＬＴＲ−ＰＢＳ−パッケージングシグナル−ランダムペプチド−ＩＲＥｓ−ｅｎｖ−ポリプリントラクト− ＬＴＲを有する複シストロン性ベクターである。このベクターは、ミニウイルス −ベクターで感染させる前に、セミ−パッケージングが外皮タンパク質を生成しないように、セミ−パッケージング細胞に形質導入することができるであろう。従って、セミパッケージング細胞の感染は、レセプター干渉により制限されない。ペプチド配列の「不規則性」に対する制限は、ほ乳類細胞ライブラリー中での有効な配列の数を限定する目的のために及び例えばＮ−グリコシル化部位の導入又は所望に応じて全ての発現されたペプチドを翻訳後修飾するために導入されうる。そのペプチド自体の精製及び同定を容易にするために、精製標識（例えばｐｏｌｙ−Ｈｉｓ又は他のもの）を発現されたペプチド中へ包含しうる。これは、ペプチド配列からは明らかでなかった翻訳後修飾を同定するために必要である。真核細胞の集団を、多数のランダムペプチドのライブラリーをコードするランダムＤＮＡ配列を含有する遺伝子構造を有するレトロウイルスに感染させる。初めに、真核細胞と比較して過剰の数のウイルスを使用することができる。このことによって、それぞれの真核細胞内で、多数の異なるペプチドの発現が起こる。これらの細胞は、引き続き前記のようにスクリーニングすることができ、ＤＮＡを例えばＰＣＲにより単離し、他の細胞を再感染するために使用することができる。ランダムＤＮＡ配列を含有するレトロウイルスの数と細胞の数の適当な比を選択すれば、それぞれの細胞は、異なるランダムＤＮＡ配列を用いて形質導入される（「１細胞−１リボ核酸又はペプチド」）。このことは、最終的に、活性ペプチドの同定を可能にする。任意に、翻訳された配列中に適当なシグナル配列を組み込むことにより、細胞中の異なるコンパートメントへペプチドを標的化してもよい。実施例２ほ乳類細胞内発現ライブラリーの使用によるＴ細胞エピトープの同定インターロイキン２（Ｉｌ−２）依存性細胞系、ＣＴＬＬ−２を、マウス主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子、Ｋ^bを用いてトランスフェクトする。引き続き、この細胞系を、実施例１に記載したレトロウイルスペプチドライブラリーに感染させる。このＣＴＬＬ−２ペプチドライブラリーは広範囲のランダムペプチドを発現し、Ｋ^bに結合するペプチドのために重要であることが知られている適当なＫ^b結合アンカー残基が、レトロウイルスペプチド配列中に導入されれば、Ｋ^bに結合したペプチドの多くのライブラリーが、ＣＴＬＬ−２細胞の表面上に提示される。従来の細胞免疫技術を用いて、適当なウイルス抗原に対して、Ｋ^b拘束Ｔ細胞ハイブリドーマを生成する（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｃｏｌｉｇａｎら、ＮＩＨ）。このようなハイブリドーマは、抗原認識の際にＩｌ−２を分泌する。引き続き、未知のＫ^b結合ウイルスＴ細胞エピトープを認識するＴ細胞ハイブリドーマを、Ｋ^b ＣＴＬＬ−２ライブラリーの試料とともにインキュベートする。ハイブリドーマがペプチドを認識すれば、ハイブリドーマにより分泌されたＩｌ−２によって、ペプチドを提示するＣＴＬＬ−２細胞が刺激され、増殖する。この方法で、未知のウイルスＴ細胞エピトープを発現するＣＴＬＬ−２細胞を選択し、クローニングすることができる。ＰＣＲ技術用いて、このクローンから、問題となるペプチドエピトープをコードするＤＮＡ配列を単離することができ、次いで従来のＤＮＡ塩基配列決定を行う。これによって、最終的に、未知のウイルスＴ細胞エピトープの同定がなされる。実施例３タンパク質の細胞表面発現を調節する生物活性ペプチド又はリボ核酸の同定免疫調節膜分子、Ｂ７を発現する細胞を、例１に記載されたように構成されたランダムペプチドライブラリーに感染させる。この例では、ランダム８−ｍｅｒペプチドライブラリーを導入する。特異的モノクローナル抗体を用いて、Ｂ７の発現を慣例の方法により分析するＢ７をアップ−又はダウン−調節する細胞を、例えば蛍光活性化細胞選別を用いてポジティブに、又は例えばリシスと組み合わせた適当な抗体を用いてネガティブに、補体により選択することができる。Ｂ７の発現において変化を示す細胞を慣例の方法によりクローニングし、レトロウイルスベクターにより導入されたＤＮＡをＰＣＲ及び１組のレトロウイルス特異的プライマーを用いて単離する。ペプチド配列又はあるいは前記ＤＮＡに相当するＲＮＡは、Ｂ７の発現及び従ってＴ細胞の活性化を修飾することができうる。これを引き続き慣例のＴ細胞検定で試験することができる。実施例４免疫調節分子Ｂ７を修飾することができるＦ（ａｂ）フラグメントの同定免疫グロブリン分子の可変重鎖（Ｖ_H）並びに可変軽鎖（Ｖ_L）遺伝子フラグメントをコードするレトロウイルスライブラリーを作成する。得られるＦ（ａｂ）フラグメントの抗原結合部位に相当する両者の遺伝子フラグメントの遺伝子領域は、さらに、実施例１に記載したような部分的にランダムな遺伝子配列を含有する。これは、Ｆ（ａｂ）フラグメントの抗原結合部位中に、多数の多様なペプチド配列をもたらす。従って、レトロウイルスベクターライブラリーは、異なる抗原結合特性を有する多数の異なるＦ（ａｂ）フラグメントをコードする。引き続き、各細胞が例えば細胞質中に、単一のＦ（ａｂ）フラグメント種を発現するように、このライブラリーを細胞クローン中に形質導入する。引き続き、表現型が変化した細胞をクローニングし、細胞内（Ｆａｂ）フラグメント中のペプチドの配列を実施例１に記載したようにして同定する。引き続き、この抗体を従来の方法により大規模に生成し、細胞表現型の生物学的変化の原因である細胞標的タンパク質をアフィニティー精製するために使用することができる。これは、例えばオリジナルの非修飾細胞クローンから生成されたライゼートから行うことができる。あるいは、レトロウイルスＦ（ａｂ）ライブラリーを、例えばｐｏｌｙ−Ｈｉｓ標識又は他の適当な標識を用いて構築することができる。この方法で、アフィニティークロマトグラフィーにより、表現型が変化した細胞から、抗体及び相当する標的を直接単離することができる。引き続き、単離された標的を、例えば従来のクローニング方法と組み合わせたＮ−末端アミノ酸配列決定により同定することできる。このような標的タンパク質は、さらなる医薬開発のための非常に重要な医薬標的である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年９月５日【補正内容】請求の範囲１．（ａ）それぞれが、調べられるＤＮＡ配列を含有する適当なベクターのプールを生成するステップと、（ｂ）単一のリボ核酸、及び場合によってはペプチドが発現するように、又は限られた数の異なるリボ核酸及びペプチドがそれぞれの細胞によって発現されるように、多数の同一の真核細胞中に、前記ベクターを効率的に形質導入するステップと、（ｃ）それらのいくつかが、一定の表現型特性を変えたかどうかを調べるために、前記形質導入された細胞をスクリーニングするステップと、（ｄ）前記変化した細胞を選択及びクローニングするステップとを具備する生物活性ペプチド及び核酸の同定方法であって、ステップ（ａ）における適当なベクターのプールが、（１）完全にランダムな合成ＤＮＡ配列；（２）利用可能な配列数を制限する目的で、および／または発現されたペプチドに翻訳後修飾を導入する目的でランダム性に対ずる制限を導入してもよい、合成ランダムＤＮＡ配列；（３）発現されるペプチドの精製および単離を促進させるために、精製標識のコーディング配列に結合された、（１）または（２）のような合成ランダムＤＮＡ配列；（４）タンパク質のコーディング配列に結合された（１）、（２）または（３）のような合成ランダムＤＮＡ配列からなる群から選択される、完全または部分的にランダムなＤＮＡ配列を含有することを特徴とし、且つ（ｅ）表現型が変化した細胞中のベクターＤＮＡを単離及び配列決定し、該配列決定されたベクターＤＮＡから生物活性リボ核酸またはペプチドの配列を導き出すこと、あるいは（ｆ）表現型が変化した細胞中で発現された生物活性リボ核酸またはペプチドを用いて、前記リボ核酸またはペプチドに対するリガンド分子を単離することのいずれかによって特徴付けられる方法。２．請求項１に記載の方法であって、前記ペプチドが、タンパク質、好ましくはＦ（ａｂ）フラグメント又は抗体分子に導入または融合されたペプチド配列である方法。３．請求項１または２に記載の方法であっで、ランダムペプチドライブラリーのアミノ酸配列が、コドンスプリット合成により生成された合成ＤＮＡ配列／オリゴヌクレオチドによりコードされ、この際、定義されたＤＮＡコドンはランダムに合成される方法。４．請求項１または２に記載の方法であっで、ランダムペプチドライブラリーのアミノ酸配列が、従来のランダムオリゴヌクレオチド合成により生成された、合成ＤＮＡ配列／オリゴヌクレオチドによりコードされる方法。５．請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、ＰＣＲ−媒介部位特異的変異誘発によって、ランダムＤＮＡ配列を発現ベクターに導入し、それによりライブラリーの複雑さを保証する方法。６．請求項５に記載の方法であって、３′−５′エキソヌクレアーゼによるＰＣＲ生成物の３′末端の平滑断端化を利用して、このような２つのＰＣＲ生成物の結合効率を至適化する方法。７．請求項１〜６の何れかに記載の方法であって、ベクター中へのＤＮＡフラグメントを最適に連結せしめるために、温度循環連結反応を使用し、パッケージング細胞中へトランスフェクションするためのライブラリーが高度の多様性を保持している方法。８．請求項１〜７の何れかに記載の方法であって、１つのＤＮＡ配列のみがそれぞれの細胞中へ導入されるように、ランダムＤＮＡ配列を真核細胞の数へ導入し、その際、１つの細胞は、１つのリボ核酸、及び場合によっては１つのペプチドを発現し、従って、特定の配列を単離して、分析することができる方法。９．請求項１〜８までの何れかに記載の方法であって、例えばレトロウイルス又はワクシニアウイルスから選択される適当なウイルスベクターの使用により、ランダムＤＮＡ配列を真核細胞中へ導入する方法。１０．請求項９に記載の方法であって、使用するベクターがレトロウイルスベクターである方法。１１．請求項１０に記載の方法であって、ＰＣＲを基礎とする、ランダムＤＮＡ配列の生成を促進せしめるために、前記レトロウイルスベクターが非相同末端を有している方法。１２．請求項１１に記載の方法であって、前記非相同末端が２つの異なるプロモーターを含有している方法。１３．請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法であって、前記レトロウイルスベクターが、５‘−ＬＴＲのウイルスプロモーターに代えて、ＣＭＶプロモーターを含有している方法。１４．請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、ランダムＤＮＡ配列が、線状ＰＣＲ生成物として生成され、非ウイルストランスフェクション法により、ウイルスパッケージング細胞中へ直接導入される方法。１５．請求項９〜１４までのいずれか１項に記載の方法であって、擬陽性を排除し、および／または「１細胞−１核酸又は１ペプチド」の概念を可能にする目的で、ＰＣＲにより、細胞中に導入されるウイルスＤＮＡを直接増幅し、新たな標的細胞の再トランスフェクションに使用する方法。１６．請求項９〜１５までのいずれか１項に記載の方法であって、ベクター中のＰＢＳに対応する機能性ｔＲＮＡ遺伝子で、一時的トランスフェクションをすることにより、レトロウイルスパッケージング細胞系のウイルス力価を増大させる方法。１７．請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、３つのポリタンパク質／タンパク質、ｇａｇ−ｐｏｌ、薬剤耐性遺伝子及びｅｎｖ遺伝子に翻訳される、単一の転写物を発現するベクターから構築されたパッケージング細胞系を用いる方法。１８．請求項９〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、細胞のトランスフェクションよりもむしろ形質導入後にベクター発現を可能にする、対応するミニウイルス／ベクターを有するセミパッケージング細胞系を用いる方法。１９．請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、発現されたペプチドのランダムな性質に対して、例えばグリコシル化部位及びアンカー残基のような適切な制限を導入する方法。２０．請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法であって、生物活性ペプチド又はタンパク質が、生物活性タンパク質および生物活性を生じせしめる標的タンパク質を直接単離することを可能にする精製標識も含有する方法。２１．請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法であっで、適当なシグナルペプチド、他のリーダー分子、あるいはさらに認識配列が、発現されたランダムペプチド又はランダムペプチド配列を含有する発現されたタンパク質に融合するように、導入されたＤＮＡでコードされ、これらを特定の細胞コンパートメントに誘導させることが可能である方法。２２．請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、ライブラリーベクターから同時に発現される、より大きなタンパク質をコードするＤＮＡ配列中に、ランダムＤＮＡ配列を導入又は融合する方法。２３．請求項２２に記載の方法であって、前記タンパク質が、分泌タンパク質、細胞内タンパク質及び膜タンパク質、例えばシグナル形質導入分子からなる群から選択される方法。２４．請求項２２または２３に記載の方法であって、前記タンパク質が、完全に又は部分的に抗体分子の重鎖および／または軽鎖から誘導される方法。２５．請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法であって、Ｔ細胞エピトープを同定するために使用される方法。２６．請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法であって、タンパク質の細胞表面発現を調節する生物活性ペプチドを同定するために使用される方法。２７．医薬開発のための先導化合物としての、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法により同定されたリボ核酸又はペプチドの使用。２８．前記のリボ核酸又はペプチドと相互作用する細胞リガンドを単離するための、請求項１〜２６までのいずれか１項に記載の方法により同定されたリボ核酸又はペプチドの使用。２９．前記タンパク質に含まれる、特定のアミノ酸配列と相互作用する細胞リガンドを単離するための、請求項１〜２４までのいずれか１項に記載の方法により同定された、特定のアミノ酸配列を含有する、タンパク質の使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者モウリツセン、ソレンデンマーク国、デーコー−3460 ビルケロド、リンデバングスベイ 24 (72)発明者ヒンデルソン、ペーターデンマーク国、デーコー−1777 コペンハーゲン・ブイ、イェリックハウスガデ３ (72)発明者ドゥーフ、モーゲンスデンマーク国、デーコー−8240 リスコフ、エルメベイ４ (72)発明者ソレンセン、ミヒャエル・シャンドルフデンマーク国、デーコー−8000 アールフス、１・ティーブイ、ビボルグベイ 33 (72)発明者ダルム、イベンデンマーク国、デーコー−2970 ホルスホルム、オルガスベイ 13 (72)発明者ルンド、アンデルス・ヘンリックデンマーク国、デーコー−8000 アールフス・シー、ローゼンクランツガデ１【要約の続き】たは融合することによって得られるであろう。

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）それぞれが、完全又は部分的にランダムなＤＮＡ配列を含有する適当なベクターのプールを生成するステップと、（ｂ）単一のリボ核酸、及び場合によってはペプチドが発現するように、又は限られた数の異なるランダムなリボ核酸及びペプチドがそれぞれの細胞によって発現されるように、多数の同一の真核細胞中に、前記ベクターを効率的に形質導入するステップと、（ｃ）それらのいくつかが、一定の表現型特性を変えたかどうかを調べるために、前記形質導入された細胞をスクリーニングするステップと、（ｄ）前記変化した細胞を選択及びクローニングするステップと、（ｅ）前記表現型が変化した細胞中のベクターＤＮＡを単離及び配列決定するステップと、（ｆ）該ＤＮＡ配列からリボ核酸及びペプチド配列を導き出すステップとを具備する生物活性ペプチド及び核酸の同定方法。２．請求項１に記載の方法であって、前記ペプチドが、より大きなタンパク質、好ましくはＦ（ａｂ）フラグメント又は抗体分子に導入または融合されたペプチド配列である方法。３．請求項１または２に記載の方法であって、ランダムペプチドライブラリーのアミノ酸配列が、コドンスプリット合成により生成された合成ＤＮＡ配列／オリゴヌクレオチドによりコードされ、この際、定義されたＤＮＡコドンはランダムに合成される方法。４．請求項１または２に記載の方法であって、ランダムペプチドライブラリーのアミノ酸配列が、従来のランダムオリゴヌクレオチド合成により生成された、合成ＤＮＡ配列／オリゴヌクレオチドによりコードされる方法。５．請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、ＰＣＲ−媒介部位特異的変異誘発によって、ランダムＤＮＡ配列を発現ベクターに導入し、それによりライブラリーの複雑さを保証する方法。６．請求項５に記載の方法であって、３′−５′エキソヌクレアーゼによるＰＣＲ生成物の３′末端の平滑断端化を利用して、このような２つのＰＣＲ生成物の結合効率を至適化する方法。７．請求項１〜６の何れかに記載の方法であって、ベクター中へのＤＮＡフラグメントを最適に連結せしめるために、温度循環連結反応を使用し、パッケージング細胞中へトランスフェクションするためのライブラリーが高度の多様性を保持している方法。８．請求項１〜７の何れかに記載の方法であって、１つのＤＮＡ配列のみがそれぞれの細胞中へ導入されるように、ランダムＤＮＡ配列を真核細胞の数へ導入し、その際、１つの細胞は、１つのリボ核酸、及び場合によっては１つのペプチドを発現し、従って、特定の配列を単離して、分析することができる方法。９．請求項１〜８までの何れかに記載の方法であって、例えばレトロウイルス又はワクシニアウイルスから選択される適当なウイルスベクターの使用により、ランダムＤＮＡ配列を真核細胞中へ導入する方法。１０．請求項９に記載の方法であって、使用するベクターがレトロウイルスベクターである方法。１１．請求項９または１０に記載の方法であって、ランダムＤＮＡ配列が、線状ＰＣＲ生成物として生成され、非ウイルストランスフェクション法により、ウイルスパッケージング細胞中へ直接導入される方法。１２．請求項９〜１１までのいずれか１項に記載の方法であって、擬陽性を排除し、および／または「１細胞−１核酸又はペプチド」の概念を可能にする目的で、ＰＣＲにより、細胞中に導入されるウイルスＤＮＡを直接増幅し、新たな標的細胞の再トランスフェクションに使用する方法。１３．請求項９〜１２までのいずれか１項に記載の方法であって、ベクター中のＰＢＳに対応する機能性ｔＲＮＡ遺伝子で、一時的トランスフェクションをすることにより、レトロウイルスパッケージング細胞系のウイルス力価を増大させる方法。１４．請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法であって、３つのポリタンパク質／タンパク質、ｇａｇ−ｐｏｌ、薬剤耐性遺伝子及びｅｎｖ遺伝子に翻訳される、単一の転写物を発現するベクターから構築されたパッケージング細胞系を用いる方法。１５．請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法であって、細胞のトランスフェクションよりもむしろ形質導入後にベクター発現を可能にする、対応するミニウイルス／ベクターを有するセミパッケージング細胞系を用いる方法。１６．請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法であって、発現されたペプチドのランダムな性質に対して、例えばグリコシル化部位及びアンカー残基のような適切な制限を導入する方法。１７．請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、生物活性ペプチド又はタンパク質が、生物活性タンパク質および生物活性を生じせしめる標的タンパク質を直接単離することを可能にする精製標識も含有する方法。１８．請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、適当なシグナルペプチド、他のリーダー分子、あるいはさらに認識配列が、発現されたランダムペプチド又はランダムペプチド配列を含有する発現されたタンパク質に融合するように、導入されたＤＮＡでコードされ、これらを特定の細胞コンパートメントに誘導させることが可能である方法。１９．請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、ライブラリーベクターから同時に発現される、より大きなタンパク質をコードするＤＮＡ配列中に、ランダムＤＮＡ配列を導入又は融合する方法。２０．請求項１９に記載の方法であって、前記より大きなタンパク質が、分泌タンパク質、細胞内タンパク質及び膜タンパク質、例えばシグナル形質導入分子から選択される方法。２１．請求項１９または２０に記載の方法であって、前記より大きなタンパク質が、完全に又は部分的に抗体分子の重鎖および／または軽鎖から誘導される方法。２２．請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、Ｔ細胞エピトープを同定するために使用される方法。２３．請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、タンパク質の細胞表面発現を調節する生物活性ペプチドを同定するために使用される方法。２４．医薬開発のための先導化合物としての、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法により同定されたリボ核酸又はペプチドの使用。２５．前記のリボ核酸又はペプチドと相互作用する細胞リガンドを単離するための、請求項１〜２３までのいずれか１項に記載の方法により同定されたリボ核酸又はペプチドの使用。２６．前記のより大きなタンパク質と相互作用する細胞リガンドを単離するための、請求項１〜２１までのいずれか１項に記載の方法により同定された、特定のアミノ酸配列を含有する、より大きなタンパク質の使用。