JP2000504220A - トランス支配性細胞内作用因子ペプチドおよびｒｎａ分子のスクリーニング方法 - Google Patents

トランス支配性細胞内作用因子ペプチドおよびｒｎａ分子のスクリーニング方法

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Abstract

(57)【要約】 ランダム化されたプールから、生細胞内で選別された、細胞内トランスドミナントエフェクタペプチドおよびRNA 分子についてスクリーニングする方法並びに組成物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 トランス支配性細胞内作用因子ペプチド およびＲＮＡ分子のスクリーニング方法 発明の分野 本発明の技術分野は、選択したトランス支配性作用因子（effector）ペプチド およびＲＮＡ分子を任意抽出集合物から生細胞内でスクリーニングする方法であ る。 発明の背景 細胞内のシグナル発生経路は、表現型として細胞生理学的に表すことができる 変化を生じる作用因子の刺激からしばしば始まる。細胞内シグナル発生経路が病 理学的に果たす重要な役割にもかかわらず、大抵の事例では、開始刺激と最終的 な細胞反応以外はシグナル発生経路についてほとんど分かっていない。 歴史的にはシグナルのトランスダクションは生化学または遺伝学によって解析 されてきた。生化学的アプローチでは“飛び石”的態様で経路を分析する。すな わち、経路の一つの端で作用するか、または必要とされる分子を見つけ出し、分 析可能な量を分離し、続いて分離したものの上流または下流の経路にある次の分 子の決定を試みる。遺伝学的アプローチは古典的には“暗闇の鉄砲”である。す なわち、シグナル発生経路における変異体を誘発または誘導し、遺伝的交差によ って遺伝子座をマッピングするか、またはｃＤＮＡライブラリーを用いて変異を 補足することによって理解する。生化学的アプローチの限界は、研究中の構成成 分に関する膨大な予備知識を必要とし、さらにそのような研究をインビトロで事 後に実施する必要があるということである。純粋な遺伝学的アプローチの限界は 、当該遺伝子を特定しクローニングする前に当該経路を誘導し、さらにその性状 を明らかにしなければならないことである。 シグナル系を調節する薬剤について化合物の分子ライブラリーをスクリーニン グすることによって臨床的に重大な意義をもつ重要な発見が得られた。例えば、 シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）およびＦＫ５０６はＴ細胞活性化の抑制物質につい ての標準的な薬剤スクリーニングで選別された。これらの２つの薬剤は完全に異 なる細胞性蛋白（それぞれシクロフィリンおよびＦＫ５０６結合蛋白(ＦＫＢＰ) ）と結合し、一方どちらの薬剤の作用も実質的に同じ（強力で特異的なＴ細胞活 性化の抑圧；これは表現型として転写因子（例えばＮＦ−ＡＴおよびＮＦ−κＢ ）依存ｍＲＮＡ産生の抑制として認められる）であるということは注目に値する 。小型ペプチドライブラリーのスクリーニングもまた、生物活性についてのイン ビトロアッセイは成功であった。広範囲のシグナル経路を調節することができる 小型のペプチドの例に関する文献は極めて豊富である。例えば、ＨＩＶ−１エン ベロープ蛋白由来のペプチドは、細胞性カルモジュリンの作用を封鎖することが 示された。 慣用的なインビトロスクリーニングの主たる限界は配送である。極めて微量の 薬剤が個々の細胞反応を調節するために必要であり、一方、そのような微量を細 胞の必要な場所に配送するためには、標的細胞または標的系を比較的高濃度の薬 剤に曝すことが必要である。そのような高濃度の作用によって標的反応は覆い隠 されるか、妨げられる可能性がある。 したがって、本発明の目的は、生物活性を有する化合物をスクリーニングする ために、任意抽出ライブラリーを細胞内に効果的に導入する方法および組成物を 提供することである。 関連文献 Mannら、Cell，33:153-168(1983)；Pearら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90 (18):8392-6(1993)およびWO/19478号には、開示した方法に関して配送ベクター として有用なＢＯＳＣおよびＢＩＮＧレトロウイルス系について記載されている 。 Scott & Craig(Current Opinion in Biotechnology 6:40-48(1994))は任意抽 出ペプチドライブラリーについて概説している。Huppら(1995)は、ｐ５３の後期 配列特異的ＤＮＡ結合機能を活性化させる小型ペプチドについて記載している。 Palzkillら(1994)は、ＴＥＭ−１ラクタマーゼに導入された任意配列のライブラ リーから機能的シグナル切断部位を選別することについて報告している。発明の要旨 本発明は、トランス支配性生物活性薬剤（例えば医薬）をスクリーニングする 方法および組成物を提供する。本発明は、生細胞内の分子または標的にアクセス し、所望の表現型作用をもつ生物学的に活性な薬剤の直接的選別を提供する。 本発明の特徴の一つでは、細胞の表現型を変えることができるトランス支配性 生物活性薬剤のスクリーニング方法が提供される。本方法は以下のａ）、ｂ）の 工程を含む。ａ）核酸の各々が異なるヌクレオチド配列を含む、任意抽出した候 補核酸の分子ライブラリーを複数の細胞に導入し、ｂ）トランス支配性生物活性 薬剤が存在するが故に表現型の変化を示す細胞について該複数の細胞をスクリー ニングする。本方法はまた、ｃ）表現型の変化を示す細胞を分離し、ｄ）該細胞 から候補核酸を分離するという工程を含むことができる。 本発明はさらに、候補核酸または候補核酸の発現生成物のどちらかを用いて標 的分子を分離する方法を提供する。 さらに別の特徴では、本発明の候補核酸が融合パートナーに連結される。 また別の特徴では、本発明は、細胞の表現型を変えることができるトランス支 配性生物活性薬剤をスクリーニングする方法を提供する。本方法は、ａ）核酸の 各々が異なるヌクレオチド配列を含む、任意抽出候補核酸を第一の複数の細胞に 導入し、ｂ）第一の複数細胞を第二の複数細胞と接触させ、さらにｃ）表現型の 変化を示す細胞について該第二の複数の細胞をスクリーニングするという工程を 含む。 さらに別の特徴では、本発明は、異なる任意抽出核酸を含むレトロウイルスの 分子ライブラリー、およびレトロウイルスライブラリーを含む細胞ライブラリー を提供する。 図面の簡単な説明 図１：ＰＣＲによるレトロウイルスＤＮＡ構築物での任意ペプチドライブラリ ーの作製 図２：プライマー開始ＤＮＡ合成によるレトロウイルスＤＮＡ構築物での任意 ペプチドライブラリーの作製 図３：呈示構造の細胞での固有位置を知るための呈示構築物 図４：レトロウイルス構築物の模式図 発明の詳細な説明 本発明は、シグナル発生経路に影響を与える化合物を創出し、効果的に細胞に 導入し、さらにこれをスクリーニングする方法および組成物を提供する。当該経 路について推定されるシグナル発生事象および認識可能な標的細胞の生理学的変 化以外には殆どまたは全く知識は不要である。本開示方法は従来のライブラリー 検索方法とは概念的に全く異なり、細胞内シグナル発生機構にアクセスするため のインビボ戦略である。本発明はまた、当該経路の構成物の分離、当該経路の性 状を明らかにするための手段および薬剤開発のための模範化合物を提供する。 本発明は、当該薬剤を含む細胞の表現型を変えることができる当該生物活性を 有する薬剤の候補物質をスクリーニングする方法を提供する。本発明の方法は、 ただ１つのインビボ工程で大量の任意の（ランダム）オリゴヌクレオチドおよび それらの対応する発現産物の迅速なスクリーニングが可能であるということで、 慣用的なスクリーニング技術をはるかに凌ぐ改善を提供する。したがって、該ラ ンダムオリゴヌクレオチドを細胞に配送し、さらに当該細胞をスクリーニングす ることによって、該候補薬剤を採集またはインビトロで合成することなく極めて 効果的なスクリーニングが達成される。さらに本発明では、細胞欠損自体につい て先行する多くの知識が無くともスクリーニングが可能である。 したがって、本発明は、細胞の表現型を変えることができるトランス支配性生 物活性薬剤について候補薬剤をスクリーニングする方法を提供する。 本明細書の“生物活性を有する候補薬剤”または“候補薬”または“候補発現 産物”という用語は、細胞の表現型をトランス支配的に変える能力について検査 を受ける候補核酸の発現産物を意味する。以下で述べるように、生物活性を有す る候補薬剤は候補核酸の発現産物であり、ペプチドおよび核酸（例えばＤＮＡ、 メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム成分など ）を含む幾つかの種類の化学物質を包含する。したがって、生物活性を有する候 補薬剤（発現産物）は、候補核酸の翻訳産物（すなわちペプチド）または候補核 酸の転写産物（すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ）のどちらかであろう。 好ましい実施態様では、生物活性を有する候補薬剤は、候補核酸の翻訳産物で ある。この実施態様では、候補核酸は細胞内に導入され、細胞はこの核酸を発現 させてペプチドを形成する。したがって、この実施態様では、生物活性を有する 候補薬剤はペプチドである。一般に、長さが約４アミノ酸から約１００アミノ酸 の範囲のペプチド、好ましくは約５から約５０の範囲のペプチド、より好ましく は約６から約３０の範囲のペプチド、特に好ましくは約６から約２０の範囲のペ プチドを用いることができる。 好ましい実施態様では、生物活性を有する候補薬剤は候補核酸の転写産物で、 したがってまた核酸である。転写産物は、一次転写産物または二次転写産物のど ちらかであろう。すなわち、レトロウイルスの逆転写酵素を用いて一次ＤＮＡが 生成され、これは後に二本鎖ＤＮＡに変換される。さらに、一次ＤＮＡを用いて 、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイムまたはその部分を含むＲＮＡ 転写物が細胞内で生成される。 少なくとも生物活性を有する候補薬剤は候補核酸の任意抽出発現産物を含む。 すなわち、全ての生物活性を有する候補薬剤は、下記で規定されるように任意抽 出部分を有し、それは本明細書で概略するスクリーニング方法の基礎となる。さ らに、生物活性を有する候補薬剤はまた、該任意抽出部分に対する融合パートナ ーを含むことができる。 好ましい実施態様では、生物活性を有する候補薬剤は融合パートナーに連結さ れる。本明細書の“融合パートナー”または“官能基”は、生物活性を有する候 補薬剤と結合し、ライブラリー中の当該種類の全構成物に共通の機能および能力 を付与する配列を意味する。融合パートナーは、異種（すなわち当該ホスト細胞 にとって本来存在すべきものではない）でも、合成（いずれの細胞にとっても本 来存在しない）でもよい。適切な融合パートナーは、ａ）呈示構造（これは下記 で規定するように構造的に制限された形態または安定な形態の生物活性を有する 候補薬剤を提供する）、ｂ）標的集中(targeting)配列（下記で規定するように 細胞内または細胞外小区画に生物活性を有する候補薬剤を集中させることができ る）、ｃ）救助配列（下記で規定するように、生物活性を有する候補薬剤または それらをコードする核酸の精製または分離を可能にする）、ｄ）安定化配列（該 生物活性を有する候補薬剤またはそれをコードする核酸に安定性または分解に対 する防御（例えばタンパク分解に対する抵抗性）を付与する）、ｅ）二量体化配 列（ペプチドの二量体化を可能にする）、またはｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）およびｅ ）または必要な場合にはリンカー配列のいずれかの組合せを含むが、これらに限 定されるものではない。 好ましい実施態様では、融合パートナーは呈示構造である。本明細書の“呈示 構造”とは、生物活性を有する候補薬剤と融合させた場合、該候補薬剤に構造的 に制限された形態をもたせる配列を意味する。蛋白は構造的に制約を加えられた ドメインによって互いに強く相互反応する。自由に回転するアミノ末端およびカ ルボキシ末端を有する小型のペプチドは当技術分野で知られているように強力な 機能を有するが、そのようなペプチド構造を薬理学効果を有する薬剤に変換する ことは、ペプチドの模倣合成のための側鎖配置を予想することができないので困 難である。したがって、構造的に制約を受ける構造をもつペプチドを呈示するこ とは、後に医薬品を創出するためにも、標的蛋白と該ペプチドとのより高い親和 性をもつ相互作用を得るためにも有用であろう。この事実は、細菌ファージ系で 生物学的に創出された短いペプチドを用いる順列組合せ式(combinatorial)ライ ブラリーの創出システムにおいて認められた。多くの研究者が、任意抽出ペプチ ド構造を呈示する小さなドメイン分子を構築した。 生物活性を有する候補薬剤が核酸であれペプチドであれ、呈示構造は好ましく はペプチド候補薬剤とともに用いられる。したがって、合成呈示構造物（すなわ ち人工ペプチド）は構造的に制限されたドメインとして任意抽出ペプチドを呈示 することができる。一般にそのような呈示構造は、任意抽出ペプチドのＮ−末端 に結合された第一の部分、および該ペプチドのＣ−末端に結合された第二の部分 を含む。すなわち、このペプチドは該呈示構造に挿入される。ただし下記に該略 するように変型も作製可能である。任意抽出発現産物の機能的な分離を高めるた めに、呈示構造物は、標的細胞内で発現されたとき最低限の生物活性を有するよ うに選択またはデザインされる。 好ましい呈示構造物は、外部ループ上にそれを呈示することによって該ペプチ ドへのアクセス能力を最大にできる。したがって、適切な呈示構造は、ミニボデ ィー構造、ベータシートターン上ループと螺旋コイル幹構造（この場合構造にと って重要でない残基は任意抽出される）、ジンクフィンガードメイン、システイ ン連結（ジスルフィド）構造、トランスグルタミナーゼ連結構造、環状ペプチド 、Ｂループ構造、大量の螺旋または螺旋の束、ロイシンジッパーモチーフなどを 含むが、これらに限定されるものではない。 好ましい実施態様では、呈示構造は、任意抽出ペプチドを外部ループ上に呈示 することを可能にする螺旋コイル構造である（例えば、Myszkaら、Biochem.，33 :2382-2373(1994)を参照のこと、この文献は参照により本明細書に含まれる）。 この系を用いて、研究者らは、高い親和性で相互に作用することができるペプチ ドを適切な標的を用いて分離した。一般に螺旋コイル構造では、８から２０の任 意抽出部位が許容される。 好ましい螺旋コイルの呈示構造は以下の通りである： ＭＧＣＡＡＬＥＳＥＶＳＡＬＥＳＥＶＡＳＬＥＳＥＶＡＡＬＧＲＧＤＭＰＬＡＡ ＶＫＳＫＬＳＡＶＫＳＫＬＡＳＶＫＳＫＬＡＡ ＣＧＰＰ。下線部は、先に規定し たように螺旋コイルロイシンジッパー領域である（Martinら、EMBO J.，13(22): 5303-5309(1994)を参照されたい、この文献は参照により本明細書に含まれる） 。太字のＧＲＧＤＭＰ部分はループ構造を表し、任意抽出ペプチド（すなわち生 物活性を有する候補薬剤で一般に本明細書では（Ｘ）mと表示され、ここでＸは アミノ酸残基で、ｎは少なくとも５または８の整数である）で適切に置換される とき種々の長さとなることができる。太字部分の置換は、下線部に制限エンドヌ クレアーゼ部位をコードする（これは任意抽出オリゴヌクレオチドをこれらの位 置に直接取り込ませることを可能にする）ことによって促進される。例えば、好 ましい実施態様は、二重下線部のＬＥ部位にＸｈｏＩ部位を、さらに二重下線部 のＫＬ部位にＨｉｎｄＩＩＩ部位を作出する。 好ましい実施態様では、呈示構造はミニボディーである。“ミニボディー”と は、本質的に抗体の最小相補領域から成る。ミニボディー呈示構造は、折り畳ま れた蛋白において三次構造のただ１つの面に沿って呈示される２つの任意抽出領 域を提供する(Blanchilら、J．Mol．Biol.，238(2):649-59(1994)およびその中 に引用されている文献を例えば参照のこと、これらの文献は参照により本明細書 に含まれる）。研究者らは最小ドメインが溶液中で安定であることを示し、順列 組合せ式ライブラリーでファージ選別系を用いて前炎症性サイトカインＩＫ−６ に対して高い親和性（Ｋｄ＝１０-7）を示すペプチド領域をもつミニボディーを 選別した。 好ましいミニボディー呈示構造は以下のとおりである： ＭＧＲＮＳＱＡＴＳＧＦＴＦＳＨＦＹＭＥＷＶＲＧＧＥＹＩＡＡＳＲＨＫＨＮＫ Ｙ ＴＴＥＹＳＡＳＶＫＧＲＹＩＶＳＲＤＴＳＱＳＩＬＹＬＱＫＫＫＧＰＰ。太字 の下線部は任意抽出可能な領域である。イタリック体のフェニルアラニンは第一 の任意抽出用領域において不変でなければならない。完全なペプチドが螺旋コイ ルの実施態様で３−オリゴヌクレオチドの変型体としてクローン化され、したが って２つの異なる任意抽出用領域が同時に取り込まれることを可能にする。この 実施態様は末端の非回文的ＢｓｔＸｌ部位を利用する。 好ましい実施態様では、呈示構造は、一般にジスルフィド結合が形成され、そ の結果構造的に制限される配列を含む、２つのシステイン残基を含む配列である 。この実施態様は、標的を狙う分泌配列が用いられる場合に特に好ましい。当業 者には理解されるように、スペーサーまたは連結配列が有ろうと無かろうと、い ずれの数のランダム配列もシステイン残基に接することができる。他の実施態様 では、有効な呈示構造は任意領域それ自体によって創出できる。例えば、ランダ ム領域はシステイン残基と“ドープ”することができ、これは、呈示構造と類似 する高度に架橋された構造を適切な酸化還元条件下で生じることができる。同様 に、任意抽出領域は、βシートまたはα螺旋構造を付与するために一定の数の残 基を含むように制御することができる。 好ましい実施態様では、融合パートナーは標的集中配列である。当業者には理 解されるところであるが、蛋白の細胞内集中化は有効濃度を高め、さらに機能を 決定するための単純な方法である。例えば、ミトコンドリア膜に集中させたとき ＰＡＦＩはＢＣＬ−２の抗アポプトシス作用を抑制することができる。同様に、 膜結合ＳｏｓはＴリンパ球においてＲａｓ仲介シグナル発生を誘発することがで きる。これらのメカニズムは、リガンドに対する検索スペースを限定するという 原理に基づくと考えられる。換言すれば、細胞質膜に蛋白を集中させることによ って、細胞質の三次元的構造と異なりそのリガンドに対する検索がその膜に近い 当該限定された空間に限定されるということである。また別には、蛋白の濃度は 、集中化の性状によって簡単に高めることができる。蛋白を核に閉じ込めること によってそれらをより小さな空間に閉じ込め、それによって濃度を高めることが できる。最後に、リガンドまたは標的は特定の小区画に簡単に集中させることが 可能で、抑制物質は適切に集中させなければならない。 したがって適切な標的集中配列は、発現産物を予め定めた分子または分子の種 類に結合させることができ、一方、発現産物の生物活性を保持することができる 結合配列（例えば、関連する種類の酵素を標的として狙う酵素抑制物質または基 質）；それ自体または同時結合蛋白の選択的分解のシグナルを発生する配列；お よび予め定めた細胞部位（これは、ａ）細胞内（例えばゴルジ、小胞体、核、核 仁、核膜、ミトコンドリア、クロロプラスト、分泌小胞、リソゾームおよび細胞 膜、並びにｂ）分泌シグナルを介する細胞外部位を含む）に発現生成物の候補物 質を構成物として集中させることができるシグナル配列を含むが、これらに限定 されるものではない。特に好ましい集中部位は、細胞内の部位または分泌を介す る細胞外の部位である。 好ましい実施態様では、標的集中配列は核集中化シグナル（ＮＬＳ）である。 一般にＮＬＳは短い陽性荷電（塩基性）のドメインで、ＮＬＳが生じる完全な蛋 白を細胞の核に誘導するために役立つ。ただ１つの塩基性ＮＬＳを含む多数のＮ ＬＳアミノ酸配列が報告された。これらは、例えばＳＶ４０（サルのウイルス） の大型Ｔ抗原（Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val）(Kalderonら、Cell，39:499-509 (1984))；ヒトのレチン酸レセプター−β核集中化シグナル（ＡＲＲＲＲＰ）； ＮＦκＢｐ５０ (ＥＥＶＱＲＫＲＱＫＬ、Ghoshら、Cell，92:1019(1990))；Ｎ ＦκＢｐ６５ (ＥＥＫＲＫＲＴＹＥ、Nolanら、Cell，64:661(1991));および他 のもののＮＬＳ（例えばBoulikas，J．Cell．Biochem.，55(1):32-58(1994)を参 照のこと、これらの文献は参照により本明細書に含まれる）、並びにゼノプス（ アフリカツメガエル）の蛋白、ヌクレオプラスミン（Ala Val Lys Arg Pro AlaA la Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Leu Asp）(Dingwallら、Ce1 1，30:449-458(1982)およびDingwallら、J．Cell．Biol.，107:641-849(1988)) のＮＬＳによって例証された二重塩基性ＮＬＳである。所在場所決定に関する多 くの研究によって、合成ペプチドに取り込まれたＮＬＳまたは通常は細胞の核を 標的としないレポーター蛋白に埋め込まれたＮＬＳは、これらのペプチドおよび レポーター蛋白を核に集中させることが明らかにされた（例えば、Dingwall & L askey，Ann．Rev．Cell Biol.，2:367-390(1986); Bonnerotら、Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA，84:6795-6799(1987);Galileoら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA， 87:458-462(1990)を参照のこと）。 好ましい実施態様では、標的集中配列は膜固着シグナル配列である。多くの細 胞内の事象が形質膜で発生するという事実の他に、多くの寄生虫および病原体が 膜に結合するという理由からこれは特に有用である。したがって、膜結合ペプチ ドライブラリーは、これらの過程における重要な成分の特定とともに、有効な抑 制物質の発見のためにも有用である。本発明は、任意抽出発現産物を細胞外また は細胞質の空所に呈示する方法を提供する（図３参照）。細胞外呈示のためには 、膜固着領域が該ペプチド呈示構造物のカルボキシ末端に提供される。任意抽出 発現産物領域は細胞表面に発現され、他の表面分子（それらの機能に影響を与え る）または細胞外媒体に存在する分子と該発現産物が結合できるように細胞外空 所に呈示される。そのような分子の結合は、該分子と結合するペプチドを発現す る細胞に機能を付与する。細胞質領域は天然のものでもよく、また任意抽出発現 産物の細胞外領域が結合する細胞に機能（キナーゼ、ホスファターゼの活性化、 機能の発揮のための他の細胞成分との結合）を付与するドメインを含んでいても よい。同様に、任意抽出発現産物を含む領域は、細胞質内領域およびトランスメ ンブレン領域にも含まれ、細胞外領域は定常機能を維持するか、または限定され た機能を有する。 膜固着配列は当技術分野で周知で、哺乳類のトランスメンブレン分子の遺伝学 的幾何学構造を基にしている。ペプチドはシグナル配列によって膜に挿入（ｓｓ ＴＭと本明細書では呼ぶ）され、疎水性トランスメンブレンドメイン（本明細書 ではＴＭ）を必要とする。トランスメンブレン蛋白は、トランスメンブレンドメ インの５’コード領域が細胞外に存在し、３’側配列が細胞内に存在するように 膜に挿入される。もちろん、これらトランスメンブレンドメインが可変領域の５ ’に配置される場合は、それらは細胞内ドメインとしてそれを固着させるように 機 能し、これはいくつかの実施態様では望ましいことであろう。ｓｓＴＭおよびＴ Ｍは広範囲の膜結合蛋白について知られており、したがってこれらの配列は、特 定の蛋白由来のペアーとして、または異なる蛋白から得られた各成分とともに利 用でき、また別にはこの配列は合成でもよく、さらに人工的配送ドメインとして 合致するものに完全に由来していてもよい。 膜固着配列（ｓｓＴＭおよびＴＭの両方を含む）は広範囲の蛋白について知ら れており、これらのいずれも用いることができることは当業者には理解されると ころであろう。特に好ましい膜固着配列は、ＣＤ８、ＩＣＡＭ−２、ＩＬ−８Ｒ 、ＣＤ４およびＬＦＡ−１に由来するものを含むが、これらに限定されるもので はない。 有用な配列は以下に由来する配列を含む：１）クラスＩ統合膜蛋白、例えばＩ Ｌ−２レセプターベータ鎖（残基１−２６がシグナル配列で、残基２４１−２６ ５がトランスメンブレン残基、Hatakeyamaら、Science 244:551(1989)およびvon Heljneら、Eur．J．Biochem.，174:871(1988)を参照）、およびインスリンレセ プターベータ鎖（残基１−２７がシグナル、残基９５７−９６９がトランスメン ブレンドメインで、残基９６０−１３８２が細胞質ドメイン、Hatakeyamaら、上 掲書およびEbinaら、Cell，40:747(1985)を参照）；２）クラスII統合膜蛋白、 例えば中性エンドペプチダーゼ（残基２９−５１がトランスメンブレンドメイン 、２−２８が細胞質ドメイン、Malfroyら、Biochem．Biophys．Res．Commun.，1 44:59(1987)）；３）タイプIII蛋白、例えばヒトチトクロームＰ４５０ＮＦ２５ （Hatakeyama、上掲書）；および４）タイプIV蛋白、例えばヒトＰ−糖蛋白（Ha takeyama、上掲書）。特に好ましいものは、ＣＤ８およびＩＣＡＭ−２である。 例えば、ＣＤ８およびＩＣＡＭ−２由来のシグナル配列は転写物の５’末端の最 も端に存在する。これらは、ＣＤ８の場合はアミノ酸１−３２から成り (ＭＡＳ ＰＬＴＲＦＬＳＬＮＬＬＬＬＧＥＳＩＬＧＳＧＥＡＫＰＱＡＰ；Nakauchiら、PN AS USA，82:5128(1985))、さらにＩＣＡＭ−２の場合はアミノ酸１−２１から成 る（ＭＳＳＦＧＹＲＴＬＴＶＡＬＦＴＬＩＣＣＰＧ；Stauntonら、Nature(Londo n)，338:61(1989)）。これらのリーダー配列は該構築物を膜に配送し、一方、任 意の候補物質の領域の３’に配置された疎水性トランスメンブレンドメインは膜 に該構築物を固着させるために機能する。これらのトランスメンブレンドメイン はＣＤ８のアミノ酸１４５−１９５（ＰＱＲＰＥＤＣＲＰＲＧＳＶＬＧＴＧＬＤ ＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡＬＬＬＳＬＵＩＴＬＩＣＹＨＳＲ；Nakauc hi、上掲書）を含み、ＩＣＡＭ−２のアミノ酸２２４−２５６（ＭＶＩＩＶＴＶ ＶＳＶＬＳＬＦＶＴＳＶＬＬＣＦＩＦＧＱＨＬＲＱＱＲ；Staunton、上掲書）を 含む。 また別には、膜固着配列はＧＰＩアンカーを含む。これは、グリコシル−ホス ファチジルイノシトール結合を介して該分子と脂質二重層との間で共有結合を生 じる。例えば、ＤＡＦではＰＮＫＧＳＧＴＴＳＧＴＴＲＬＬＳＱＨＴＣＦＴＬＧ ＬＬＧＴＬＶＴＭＧＬＬＴ（アンカー部位のセリンは太字）（Homansら、Nature ，333(6170):260-72(1988); Motranら、J．Biol．Chem.，266:1250(1991)）。こ れを実施するために、Ｔｈｙ−１由来のＧＰＩ配列をトランスメンブレン配列の 代わりに可変領域の３’にカセットとして収容することができる。 同様に、ミリスチル化配列は膜固着配列として役立つ。ｃ−ｓｒｃをミリスチ ル化することによって形質膜にこれが補充されることが分かっている。当該蛋白 の最初の１４アミノ酸が専らこの機能をもたらす場合には、これは簡単で効果的 な膜への集中方法である：ＭＧＳＳＫＳＫＰＫＤＰＳＱＲ(Crossら、Mol．Cell. Biol.，4(9):1634(1984); Spencerら、Science 262:1019-1024(1993)、両文献と もに参照により本明細書に含まれる）。すでに、このモチーフはレポーター遺伝 子の集中化に有効で、ＴＣＲのゼータ鎖を固着させるために用いることができる ことが示された。構築物を形質膜に集中させるために、このモチーフは可変領域 の５’に配置される。他の改変（例えばパルミトイル化）も形質膜に構築物を固 着させるために用いることができる；例えばＧ蛋白共役レセプターキナーゼＧＲ Ｋ６配列由来のパルミトイル化配列（ＬＬＱＲＬＦＳＲＱＤＣＣＧＮＣＳＤＳＥ ＥＥＬＰＴＲＬ、パルミトイル化されているシステインは太字)）(Stoffeら、J ．Biol．Chem.，269:27791(1994)、ロドプシン由来のパルミトイル化配列（ＫＱ ＦＲＮＣＭＬＴＳＬＣＣＧＫＮＰＬＧＤ）（Barnstableら、J．Mol．Neurosci. ，5(3):207(1994))およびｐ２１Ｈ−ｒａｓ１蛋白由来パルミトイル化配列（Ｌ ＮＰＰＤＥＳＧＰＧＣＭＳＣＫＣＶＬＳ）(Caponら、Nature， 302:33(1983))。 好ましい実施態様では、標的集中配列はリソゾームを標的とする配列で、例え ばリソゾーム分解配列（例えばＬａｍｐ−２（ＫＦＥＲＱ；Dice，Ann．N.Y．Ac ad．Sci.，674:58(1992)）、またはＬａｍｐ−１由来リソゾーム膜配列(ＭＬＩ ＰＩＡＧＦＦＡＬＡＧＬＶＬＩＶＬＩＡＹＬＩＧＲＫＲＳＨＡＧＹＯＴＩ;Uthay akumarら、Cell．Mol．Biol．Res.，41:405(1995))もしくはＬａｍｐ−２由来リ ソゾーム膜配列（ＬＶＰＩＡＶＧＡＡＬＡＧＶＬＩＬＶＬＬＡＹＦＩＧＬＫＨＨ ＨＡＧＹＥＱＦ ;Koneckiら、Biochem．Biophys．Res．Comm.，205:1-5(1994)） （これらリソゾーム膜配列はともにトランスメンブレンドメインをイタリック体 で、細胞質の標的集中シグナルは下線で示されている）を含む。 また別には、標的集中配列はミトコンドリア集中配列でもよく、以下の配列を 含む：ミトコンドリアマトリックス配列（例えば酵母のアルコールデヒドロゲナ ーゼIII（ＭＬＲＴＳＳＬＦＴＲＲＶＱＰＳＬＦＳＲＮＩＬＲＬＱＳＴ (Schatz ，Eur．J．Biochem.，165:1-6(1987))；ミトコンドリア内部膜配列（酵母チトク ロームｃオキシダーゼサブユニットIV、ＭＬＳＬＲＱＳＩＲＦＦＫＰＡＴＲＴＬ ＣＳＳＲＹＬＬ(Schatz，上掲書))；ミトコンドリア膜間隙配列、酵母チトクロ ームｃ１ (ＭＦＳＭＬＳＫＲＷＡＱＲＴＬＳＫＳＦＹＳＴＡＴＧＡＡＳＫＳＧＫ ＬＴＱＫＬＶＴＡＧＶＡＡＡＧＩＴＡＳＴＬＬＹＡＤＳＬＴＡＥＡＭＴＡ(schar tz，上掲書))；またはミトコンドリア外膜配列、酵母７０ｋＤ外膜蛋白 (ＭＬＳ ＦＩＴＲＮＫＴＡＩＬＡＴＶＡＡＴＧＴＡＩＧＡＹＹＹＹＮＱＬＱＱＱＱＱＲＧ ＫＫ(Schartz，上掲書))。 標的集中配列はまた小胞体配列でもよく、カルレチキュリン由来配列（ＫＤＥ Ｌ；Pelham，Royal Society London Transactions B:1-10(1992)）またはアデノ ウイルスＥ３／１９Ｋ蛋白由来配列 (ＬＹＬＳＲＲＳＦＩＤＥＫＫＭＰ;Jackson ら、EMBO J.，9:3153(1990))が含まれる。 さらに標的集中配列はまた、ペルオキシソーム配列（例えばルシフェラーゼ由 来のペルオキシソームマトリックス配列；ＳＫＬ(Kellerら、PNSAS USA，4:3264 (1987))；ファルネシル化配列（例えばＰ２１Ｈ−ｒａｓ１；ＬＮＰＰＤＥＳＧ ＰＧＣＭＳＣＫＣＶＬＳ（ファルネシル化システインは太字）(Capon，上掲 書)；ゲラニルゲラニル化配列（例えば蛋白ｒａｂ−５Ａ；ＬＴＥＰＴＱＰＴＲ ＮＱＣＣＳＮ（ゲラニルゲラニル化システインは太字）（Farnsworth，PNAS USA ，91:11963(1994)）；または破壊配列 (サイクリンＢ１（ＲＴＡＬＧＤＩＧＮ(K lotzbucherら、EMBO J.，1:3053(1996))を含む。 好ましい実施態様では、標的集中配列は候補翻訳産物を分泌させることができ る分泌シグナル配列である。可変ペプチド領域の５’に配置され、細胞外空所へ 分泌させるためにペプチド領域から切断される分泌シグナル配列は数多く知られ ている。分泌シグナル配列および無関係な蛋白へ移すことができるそれらの移転 能力はよく知られている(Silhavyら、Microbiol．Rev.，49:398-418(1985)を例 えば参照のこと) 。これは、ホスト細胞以外の標的細胞（例えばレトロウイルス 感染細胞）の表面に結合し、または該標的細胞の生理に影響を与えることができ るペプチドの創出に特に有用である。好ましいアプローチでは、融合生成物は、 分泌シグナルペプチドー呈示構造−任意抽出発現産物領域−呈示構造を一連の状 態で含むように構成される（図３参照）。この態様では、ペプチドライブラリー を発現するようにさせた細胞の近辺で増殖した標的細胞は分泌されたペプチドに 浸される。ペプチドの存在に反応して（例えば表面レセプターとペプチドが結合 することによって、または内部に侵入し細胞内標的と結合することによって）生 理学的な変化を示した標的細胞および分泌細胞は、多様な選別形式のいずれか、 および定められた作用を引き起こすペプチドによって存在場所が決定される。典 型的な作用は、デザイナーサイトカインの作用（すなわち造血幹細胞を分裂させ 、それらの全能性を維持させることができる幹細胞因子）、癌細胞に自発的アポ プトシスを起こさせる因子の作用、標的細胞の細胞表面に結合してそれらを特異 的に標識する因子の作用などを種々含む。 適切な分泌配列は知られており、以下のものを含む（下線無し−下線有りの結 合間で切断される）：ＩＬ−２由来シグナル (ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡ ＬＶＴＮＳ;Villingerら、J．Immunol.，155:3946(1995))、成長ホルモン由来シ グナル（ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧLＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＦＰＴ；Roska mら、Nucleic Acids Res.，7:30(1979)）；プレプロインスリン由来シグナル（ ＭＡＬＷＭＲＬＬＰＬＬＡＬＬＡＬＷＧＰＤＰＡＡＡＦＶＮ；Bellら、Nature, 284:26(1980)）；およびインフルエンザＨＡ蛋白由来シグナル (ＭＫＡＫＬＬＶ ＬＬＹＡＦＶＡＧＤＱＩ；Sekiwawaら、PNAS USA，80:3563)。特に好ましい分泌 シグナル配列は分泌サイトカインＩＬ−４由来のシグナルリーダー配列で、これ は以下のようなＩＬ−４の最初の２４アミノ酸を含む：ＭＧＬＴＳＱＬＬＰＰＬ ＦＦＬＬＡＣＡＧＮＦＶＨＧ。 好ましい実施態様では、融合パートナーは救助配列である。救助配列は、候補 薬剤またはそれをコードする核酸のどちらかを精製または分離するために用いる ことができる配列である。したがって例えばペプチド救助配列は、精製配列、例 えばＮｉ親和性カラムで使用するＨｉｓ8タグ、および検出、免疫沈澱もしくは ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞の仕分け;fluorescence-activated cell sorting）を 含む。適切なエピトープタグは、ｍｙｃ（市販の９Ｅ１０抗体とともに使用する ）、細菌酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチニル化標的、ｆｌｕタグ、ｌａｃＺおよび をＧＳＴを含む。 また別には救助配列は、ＰＣＲ、関連技術またはハイブリダイゼーションによ るレトロウイルス構築物の迅速で容易な分離を可能にするプローブ標的部位とし て役立つ固有のオリゴヌクレオチド配列でもよい。 好ましい実施態様では、融合パートナーは、生物活性を有する候補薬剤または それをコードする核酸に安定性を付与する安定化配列である。したがって例えば 、ペプチドは、バシャフスキーのＮ−末端ルールにしたがって偏在化に対してペ プチドを保護するために開始メチオニンの後ろにグリシンを取り込ませ（ＭＧま たはＭＧＧＯ）、したがって細胞質内での半減期の長期化によって安定化できる 。同様に、Ｃ−末端の２つのプロリンはペプチドにカルボキシペプチダーゼ作用 に対する耐性を付与する。プロリンの前の２つのグリシンの存在は、両プロリン に可撓性を付与し、さらに当該ジプロリンで開始する事象を防止して候補ペプチ ド構造に分裂するのを防ぐ。したがって、好ましい安定性配列はＭＧ（Ｘ）nＧ ＧＰＰで、式中Ｘはいずれかのアミノ酸で、ｎは整数で少なくとも４である。 実施態様の一つでは、融合パートナーは二量体化配列である。二量体化配列は 、通常の生理学的条件下では結合状態を維持するために充分な親和性を有する、 １つの任意ペプチドと別の任意ペプチドの非共有結合を可能にする。これは、も し １細胞につき２つのペプチドが生成され、これが続いて二量体化されて１０8（ １０4×１０4）の有効ライブラリーを形成するならば、任意ペプチドの小さなラ イブラリー（例えば１０4）を効果的に大きなライブラリーにすることを可能に する。それはまた、必要な場合にはより大きい任意ペプチドまたはより構造的に 複雑な任意ペプチド分子の形成を許容する。二量体は同種二量体でも異種二量体 でもよい。 二量体化配列は、自己凝集するただ１つの配列でもよいし、またはその各々が 異なるレトロウイルス構築物で生成された２つの配列でもよい。すなわち、二量 体化配列１を有する第一の任意ペプチドおよび二量体化配列２を有する第二の任 意ペプチドの両方を核酸はコードするが、その態様は、細胞に導入し当該核酸を 発現させたとき二量体化配列１は二量体化配列２と結合し、新しい任意のペプチ ド構造を形成するものである。 適切な二量体化配列は広範囲の配列を含むであろう。極めて多くの蛋白―蛋白 相互作用部位が知られている。さらに、二量体化配列はまた、標準的方法（例え ば酵母２ハイブリッド系、慣用的な生化学的親和性結合実験）を用いるか、また は本発明の方法を用いても解明することができる。 融合パートナーは、生物学的に許されるか、および活性が許すならば当該構造 のいずれの場所（すなわちＮ−末端、Ｃ−末端、内部）に配置してもよい。 好ましい実施態様では、融合パートナーはリンカーまたは繋ぎ配列を含む。種 々の標的集中配列（例えば膜集中配列）と構築物の他の成分（例えば任意抽出候 補薬剤）との間の望ましいリンカーは、障壁のない潜在標的と候補化合物が相互 に作用することを許容する。例えば、生物活性を有する候補薬剤がペプチドの場 合、有用なリンカーは、グリシン―セリンポリマー（例えば（ＧＳ）n、（ＧＳ ＧＧＳ）nおよび（ＧＧＧＳ）nを含む、式中ｎは整数で少なくとも１である）、 グリシン―アラニンポリマー、アラニン―セリンポリマー、並びに他の可撓性リ ンカー（例えばシェーカーカリウムチャネルのための繋ぎ）および当業者が周知 の多様な他の可撓性リンカーを含む。グリシン―セリンポリマーは、これらのア ミノ酸は両方とも比較的構造性が弱く、したがって成分間で中性の繋ぎとして機 能することができるので好ましい。第二に、セリンは親水性で、したがって球状 グリシン鎖であるはずのものを可溶化させることができる。第三に、同様な鎖が 組換え蛋白（例えば一本鎖抗体）のサブユニットを結合させる際に効果的である ことが示された。 さらに、呈示構造を含む融合パートナーを改変し、任意抽出し、および／また は成熟させて任意抽出発現産物の呈示の方向性を変えることができる。例えば、 ループの基部の決定基を改変して、任意抽出アミノ酸配列は維持しながら内部ル ープのペプチド三次元構造を僅かに改変することができる。 好ましい実施態様では、融合パートナーを組み合わせて用いられる。したがっ て、例えば呈示構造、標的集中配列、救助配列および安定化配列をいずれの数で 組合せてもよく、リンカーとともにまたはリンカー無しで用いることもできる。 下記でより完全に説明するように、ランダムおよび／または偏り含有ライブラリ ーを受容するためのクローニング部位を含む基本ベクターを用いて、ライブラリ ーの５’および３’に種々の融合パートナーとともにカセットとして収容させる ことができる。表１では、以下のように幾つかの可能な組合せを（呈示構造は特 定されていない）概略する。任意核酸ライブラリーのための可変クローニング部 位としてＶを使用し、さらに各融合パートナーをもう１つの文字で表して（すな わち、Ｎは核集中化配列）、各構築物を核酸の場合は５’から３’方向に、蛋白 の場合はＮ−末端からＣ−末端方向に読む一連の対応文字として表すことができ る。例えばＮＶまたは可変領域の下流でクローニングするならばＶＮである。こ こで意図されるとおり、融合パートナー配列は可変領域のいずれかの側の部位で カセットとしてクローニングされる。Ｃは細胞質を表し（すなわち集中化配列は 無し）、Ｅは救助配列（例えばｍｙｃエピトープ）で、Ｇはリンカー配列で（Ｇ １０は１０アミノ酸のグリシン―セリン鎖で、Ｇ２０は２０アミノ酸のグリシン ―セリン鎖である）、Ｍはミリスチル化配列で、Ｎは核集中化配列で、ｓｓＴＭ はトランスメンブレン固着配列のためのシグナル配列である。ＴＭはトランスメ ンブレン固着配列で、ＧＰＩはＧＰＩ膜固着配列で、Ｓは分泌シグナル配列等々 である。当業者には理解されるところであるが、下記の表の他にいくらでも組合 せは可能である。 当業者には理解されるところであるが、これら配列モジュールの多数の組合せ および変型が用いられる。さらに、本明細書で考察するように、新しい表面を共 同で構成するか、または２つの別の分子を１つにするかいずれかの形態によって 、構築物内に１つ以上の可変領域を含むことが可能である。 好ましい実施態様では、呈示構造に連結された生物活性を有する候補薬剤は、 上記の可変領域のクローニング部位、Ｖに付加される。また別には、呈示構造は 使用されず、“自由選択(free)”または“無制約(non-constrained)”ペプチド または発現産物が与えられる。 好ましい実施態様は以下を含む： ａ）細胞内、膜固着、被連結（すなわち繋がれた）自由選択ペプチド型： ＭＲＰＬＡＧＧＥＨＴＭＡＳＰＬＴＲＦＬＳＬＮＬＬＬＬＧＥＳＩＩＬＧＳＧＰ ＱＲＰＥＤＣＲＰＲＧＳＶＫＧＴＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡＬ ＬＬＳＬＩＩＴＬＩＣＹＨＳＲ −ＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧ ＳＧＧＳＧＧＧ−（Ｘ）n−ＧＧＰＰ。これは、ネズミＣＤ８由来の分泌シグナ ル（太字）、ＣＤ８のトランスメンブレン領域（下線）および、可撓性（グリシ ン）および可溶性（セリン）を提供するために（イタリックで示す）リンカーを 含む。（Ｘ）nは任意ペプチドを表し、式中ｎは約６より大きい整数である。こ の構造を利用する好ましい実施態様は、下記に述べるように、例えば制約を受け ないペプチド構造をもつ偏り含有ＳＨ−３ドメイン結合ペプチドライブラリーを 用いて偏り含有ペプチドを利用する。なぜならば、多数の表面レセプターシグナ ル発生系がシグナル発生装置の部分としてＳＨ−３ドメインを利用しているから である。 ｂ）細胞内、膜固着、被連結螺旋コイル型： ＭＲＰＬＡＧＧＥＨＴＭＡＳＰＬＴＲＦＬＳＬＮＬＬＬＬＧＥＳＩＩＬＧＳＧＰ ＱＲＰＥＤＣＲＰＲＧＳＶＫＧＴＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡＬ ＬＬＳＬＩＩＴＬＩＣＹＨＳＲ ＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳ ＧＧＳＧＧＧＣＡＡＬＥＳＥＶＳＡＬＥＳＥＶＡＳＬＥＳＥＶＡＡＬ−（Ｘ）n −ＬＡＡＶＫＳＫＬＳＡＶＫＳＫＬＡＳＶＫＳＫＬＡＡＣＧＰＰ。これは、下線 付きイタリック体で示したように螺旋コイル構造をもつ。 ｃ）表面連結式細胞外、無制約型： ＭＲＰＬＡＧＧＥＨＴＭＡＳＰＬＴＲＦＬＳＬＮＬＬＬＬＧＥＳＩＩＬＧＳＧＧ Ｇ−（Ｘ）n−ＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＧＰＱＲＰＥＤＣＲＰＲＧＳＶＫＧＴＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡ ＬＬＬＳＬＩＩＴＬＩＣＹＨＳＲ ＧＧＰＰ。 ｄ）表面連結式細胞外、制約型： ＭＲＰＬＡＧＧＥＨＴＭＡＳＰＬＴＲＦＬＳＬＮＬＬＬＬＧＥＳＩＩＬＧＳＧＧ ＧＣＡＡＬＥＳＥＶＳＡＬＥＳＥＶＡＳＬＥＳＥＶＡＡＬ−（Ｘ）n−ＬＡＡＶ ＫＳＫＬＳＡＶＫＳＫＬＡＳＶＫＳＫＬＡＡＣ ＧＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧ ＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＧＰＱＲＰＥＤＣＲＰＰＧＳＶＫＧＴＧＬＤＦ ＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＩＣＶＡＬＬＬＳＬＩＩＴＬＩＣＹＨＳＲ ＧＧＰＰ。 ｅ）分泌、無制約型： ＭＲＰＬＡＧＧＥＨＴＭＡＳＰＬＴＲＦＬＳＬＮＬＬＬＬＧＥＳＩＩＬＧＳＧＧ Ｇ−（Ｘ）n−ＧＧＰＰ。 ｆ）分泌、制約型： ＭＲＰＬＡＧＧＥＨＴＭＡＳＰＬＴＲＦＬＳＬＮＬＬＬＬＧＥＳＩＩＬＧＳＧＧ ＧＡＡＬＥＳＥＶＳＡＬＥＳＥＶＡＳＬＥＳＥＶＡＡＬ−（Ｘ）n−ＬＡＡＶＫ ＳＫＬＳＡＶＫＳＫＬＡＳＶＫＳＫＬＡＡ ＣＧＰＰ。 上記で述べたように生物活性を有する候補薬剤は候補核酸によってコードされ る。本明細書でいう“候補核酸”は核酸を意味し、レトロウイルス配送手段が用 いられる場合は一般にＲＮＡで、候補核酸は発現されて生物活性を有する候補薬 剤を産生する。すなわち候補核酸は、生物活性を有する候補薬剤および、存在す る場合は融合パートナーもコードする。さらに、一般に該候補核酸は、必要に応 じて翻訳または転写を達成するために余分な配列を充分に含んでいる。ペプチド ライブラリーのためには、一般に候補核酸は、任意抽出ペプチドのフレーム通り の発現を可能にするように配置されたクローニング部位、およびそれが存在する 場合には何らかの融合パートナー（例えば呈示構造）を含む。例えば、呈示構造 が用いられる場合は、該呈示構造は一般に開始ＡＴＧを親ベクターの一部分とし て含むであろう。ＲＮＡライブラリーについては、一般に候補核酸は、当該ＲＮ Ａ構造物が迅速適切に発現されるようにＲＮＡ合成の開始部位がデザインされて いる内部ＣＭＶプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターまたは細胞特異的プロモー ターを用いて構築される。このＲＮＡはレトロウイルスの合成方向でアンチセン スＲＮＡとして発現され、例えばオリエンテーション特異的ターミネーター配列 により周知のように終了する。上流の転写による干渉は、自己不活化欠失（ある 種のレトロウイルス発現系の一般的特性）により標的細胞内で軽減される。 一般に、候補核酸は細胞内で発現されて候補核酸の発現産物を産生する。上記 に概略したように、発現産物は、翻訳産物（すなわちペプチド）または転写産物 （すなわち核酸）を含む。 生物活性を有する候補薬剤および候補核酸は任意抽出されるが、完全に任意抽 出されるか、またはそれらは任意抽出において、例えばヌクレオチド／残基頻度 について（一般的にまたは固有の場所について）偏りを有する。本明細書でいう “任意抽出”とは、各核酸およびペプチドが本質的にそれそれ任意のヌクレオチ ドおよびアミノ酸から成ることを意味する。下記でより完全に説明するように、 候補発現産物を生じる候補核酸は化学的に合成され、したがっていずれの場所で あれいずれのヌクレオチドも取り込むことができる。したがって、候補核酸が発 現されペプチドを生成する場合は、いずれのアミノ酸残基もいずれの場所であれ 取り込まれる。合成工程は任意抽出核酸を創出するようにデザインされ、全ての 長さの核酸について可能な全てまたはほとんどの組合せを形成できる。このよう にして任意抽出候補核酸ライブラリーが形成される。 このライブラリーは、蓋然的に充分な範囲の細胞反応をもたらすために構造的 に充分に多様な任意抽出発現産物集団を提供し、所望の反応を示す１つまたは２ つ以上の細胞を提供する。したがって、相互反応ライブラリーは、その中の少な くとも１つが、シグナル発生経路の完了にその活性が必要である何らかの分子、 蛋白または他の因子に対する親和性を与える構造をもつことができるように十分 に大きくなければならない。相互反応ライブラリーの必要とされる絶対的サイズ を計測することは困難であるが、自然界は免疫反応に関するヒントを提供してい る。すなわち、１０7−１０8個の異なる抗体の多様性によって生物が出会う潜在 的な抗原の殆どと相互作用するために十分な親和性を有する少なくとも１つの組 合せが得られる。インビトロの選別技術に関する刊行物によってまた、標的に対 する親和性を有する構造を見出すためには１０7から１０8のライブラリーサイズ が十分であるということが示された。長さが７から２０アミノ酸のペプチドの全 ての組合せを含むライブラリー（例えばレトロウイルスでの発現のために本明細 書で提唱するようなもの）は、２０7（１０9）から２０20をコードする潜在能力 を有する。したがって、１０7から１０8／ｍｌのレトロウイルス粒子のライブラ リーに関しては、本方法は、７アミノ酸について理論的に完全に相互作用するラ イブラリーの“実働”サブセットおよび上記２０20ライブラリーについては形態 的サブセットを可能にする。したがって、好ましい実施態様では、本方法におい ては少なくとも１０6、好ましくは少なくとも１０7、より好ましくは少なくとも １０8および最も好ましくは少なくとも１０9の異なる発現産物が同時に分析され る。好ましい方法はライブラリーサイズおよび多様性を最大にする。 オリゴヌクレオチド合成によってコードされるいずれのライブラリー系でも、 最終的にペプチド構造に取り込まれるコドンを完全に制御することは不可能であ ることを理解することが重要である。これは、終止シグナルをコードするコドン （ＴＡＡ、ＴＧＡ、ＴＡＧ）の場合において特に当てはまる。任意領域としてＮ ＮＮで合成する場合、コドンが終止コドンであるチャンスは３．６４または４． ６９％である。したがって、１０残基のペプチドの場合はペプチドの４６．７％ が未完成のまま終止するという受け入れがたい高い蓋然性が存在する。自由選択 ペプチド構造についてはこれはおそらく障害ではない。しかしより大きな構造（ 例えば本明細書で意図するようなもの）については、そのような終止は無益なペ プチド発現をもたらすであろう。これを軽減するために、任意の残基をＮＮＫと してコードする（ここでＫはＴまたはＧである）。これによって全ての出現し得 るアミノ酸のコードが可能になる（その相対的表現はわずかに変化するが）。し かし重要なことは、２つの終止残基ＴＡＡおよびＴＧＡがコードされることは防 止される。したがって、１０アミノ酸のペプチドをコードするライブラリーは、 未完成で終止するチャンスは１５．６％であろう。ペプチド発現生成物を生じる ようにデザインされていない候補核酸については、これは必要ではない。実施態 様の１つでは、ライブラリーは完全に任意抽出で、いずれの場所においても配列 優先性または定常性は存在しない。好ましい実施態様では、ライブラリーは偏り を有している。すなわち、配列内のいくつかの場所は定常性を保持しているか、 または一定数の可能性から選択される。例えば、好ましい実施態様では、ヌクレ オチドまたはアミノ酸残基は限定された種類の中から任意抽出される。例えば疎 水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏りを有する（小型または大型）残基を指 向するか、複数のシステインを作出する方向を指向するか、架橋を指向するか、 ＳＨ−３ドメインのためにプロリンを指向するか、燐酸化などのためにセリン、 スレオニン、チロシンまたはヒスチジンを指向するか、またはプリンを指向する ものである。 好ましい実施態様では、偏りは、既知の種類の分子と相互作用するペプチドま たは核酸を指向する。例えば、生物活性を有する候補薬剤がペプチドである場合 は、細胞内シグナル発生の多くは、他のポリペプチドと相互作用するポリペプチ ドの短い領域を介し小さなペプチドドメインによって達成されることが分かって いる。例えば、ＨＩＶエンベロープの細胞質ドメインの短い領域が細胞のカルモ ジュリンの作用を阻害することが以前に示された。Ｆａｓ細胞質ドメインの領域 （これはスズメバチのマストパラン毒素と相同性を示す）は、致死的アポプトシ ス性機能またはＧ蛋白誘発機能をもつ短いペプチド領域に限定できる。マゲイニ ン（アフリカツメガエル由来の天然ペプチド）は強力な抗癌および抗菌活性を有 する。蛋白キナーゼＣアイソザイム（βＰＫＣ）の短いペプチドフラグメントは 、アフリカツメガエルの卵母細胞における刺激後のβＰＫＣの核移転を阻害する ことが示された。さらに、短いＳＨ−３標的ペプチドは、ＳＨ−３蛋白との特異 的結合についての偽の基質として用いられた。勿論のこと、この分野では多数の 文献が有り、上記は生物活性を有する利用可能なペプチドの少しのリストである 。したがって、細胞内シグナル発生経路で活性を有する小さなペプチドの潜在能 力については多くの先例が有る。さらに、多くの分子の作動薬および拮抗薬も同 様に、生物活性を有する候補薬剤の偏向任意抽出の基礎として用いることができ る。 したがって、多数の分子または蛋白ドメインが、生物活性を有する候補薬剤の 偏向任意抽出の創出の出発点として適している。一般的な機能、構造または親和 性を付与する数多くの小型分子ドメインが知られている。さらに、当業者には理 解されるところであるが、少しのアミノ酸相同性をもつ領域は強い構造相同性を もつ可能性がある。これら分子、ドメインおよび／または対応するコンセンサス 配列の多くは既知で、ＳＨ−２ドメイン、ＳＨ−３ドメイン、プレックストリン (Pleckstrin)、致死ドメイン、プロテアーゼ切断／認識部位、酵素抑制因子、酵 素基質、Ｔｒａｆなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。同様に 、本発明での使用に適したドメインを含む多数の既知の核酸結合蛋白が存在する 。例えば、ロイシンジッパーコンセンサス配列が知られている。 最終発現産物が核酸の場合は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１２、 より好ましくは少なくとも１５、最も好ましくは少なくとも２１個のヌクレオチ ドの場所が任意抽出に必要で、任意抽出が完全でない場合はさらに多くの場所が あることが好ましい。同様に、少なくとも５、好ましくは少なくとも６、より好 ましくは少なくとも７個のアミノ酸の場所が任意抽出には必要で、ここでもまた 、任意抽出が完全な場合より少ないときはその数が多いほど好ましい。 好ましい実施態様では、偏向を有するＳＨ−３ドメイン結合オリゴヌクレオチ ド／ペプチドが作製される。ＳＨ−３ドメインは短い標的モチーフ（ＳＨ−３ド メイン結合ペプチド、直鎖配列で約１０から１２残基）を認識することが示され たが、これは標的ＳＨ−３ドメインに対して高い親和性をもつ短いペプチドとし てコードされる。ＳＨ−３ドメイン結合蛋白に対するコンセンサス配列が提唱さ れている。したがって、好ましい実施態様では、以下の偏りでオリゴヌクレオチ ド／ペプチドが作製される。 １．ＸＸＸＰＰＸＰＸＸ、式中Ｘは任意抽出残基である。 ２．（残基の場所１１から−２の場所の中で）； この実施態様では、Ｎ−末端が接する領域が結合親和性について最も強い作用 を有すると提唱され、したがって完全に任意抽出される。“Ｈｙｄ”は疎水性残 基（すなわち−Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ）を指向する 偏向を示す。疎水性に偏向している残基をコードするために、“ｓｂｋ”コドン に偏った構造が用いられる。遺伝暗号内のコドンの調査によって、これが一般に 疎水性残基をコードすることが確認されるであろう。ｓ＝ｇ、ｃ；ｂ＝ｔ、ｇ、 ｃ；ｖ＝ａ、ｇ、ｃ；ｍ＝ａ、ｃ；ｋ＝ｔ、ｇ；ｎ＝ａ、ｔ、ｇ、ｃ。 細胞の表現型を変化させることができる生物活性を有するトランス支配性薬剤 をスクリーニングするために、候補核酸が細胞に導入される。本明細書にいう“ 〜に導人される”とは、核酸が、その後続いて発現されるために適切な態様で細 胞に入ることを意味する。導入の方法は、下記で考察するように標的となる細胞 の種類によって様々に記載されている。代表的な方法には、ＣａＰＯ4沈澱、リ 補核酸は、（下記に概略するように例えばレトロウイルス導入によって）ホスト 細胞のゲノムに安定的に組み込むことができるが、また一時的もしくは安定的に 細胞質に存在することもできる（すなわち、標準的な調節配列、選択マーカーな どを利用する慣用的なプラスミドを使用する）。医薬品として重要な多くのスク リーニングはヒトまたはモデル哺乳動物の細胞標的を必要とするので、そのよう な標的に核酸感染(transfect)させることができるレトロウイルスベクターが好 ましい。 好ましい実施態様では、候補核酸は、このような細胞に感染するレトロウイル ス粒子の部分である。一般に、感染は、感染強化試薬であるポリブレンを用いる ことによって促進される。ポリブレンは多価陽イオンをもち標的細胞とウイルス の結合を促進する。感染は、一般に各細胞がただ１つの構築物を発現するように 細胞数に対するウイルス粒子の比を利用して最適化される。感染はポアソン分布 に従う。 好ましい実施態様では、候補核酸はレトロウイルスベクターを用いて細胞に導 入される。これまでのところ、最も有効な遺伝子伝達方法は、外因性核酸の取り 込みに対する天然の細胞性障壁を迂回するために遺伝子操作ウイルス（例えばレ トロウイルス）の能力を利用する。組換えレトロウイルスの使用は、ＮＩＨ３Ｔ ３細胞に由来するＰｓｉ−２株および類似のレトロウイルスパッケージング系を 用いてリチャード・マリガンとデービッド・バルチモアによって切り開かれた(M annら、Cell，33:153-159(1993)を参照されたい、この文献は参照により本明細 書に含まれる）。そのようなヘルパー不完全パッケージング株は、組換えゲノム のパッケージング、プロセッシング、逆転写および組み込みに必要な全てのトラ ンス蛋白（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を産生することができる。シス配置で ψパッケージングシグナルを有するこのようなＲＮＡ分子は成熟ビリオン中にパ ッケージされる。レトロウイルスは多くの理由のために好ましい。第一に、それ らの誘導は容易である。第二に、アデノウイルス仲介遺伝子配送と異なり、レ トロウイルスからの発現は長期的である（アデノウイルスは組み込まれない）。 アデノ介在ウイルスは遺伝子および調節ユニットのためのスペースが限られてお り、それらの組み込み能力に関していくらかの矛盾が存在する。したがってレト ロウイルスは、とりわけ長期的発現、ゲノムの柔軟性および安定な組み込みとい う点においてこれまでのところで最善の妥協方法を提供する。レトロウイルスの 主要な利点は、ホストゲノムへのそれらの組み込みによって細胞分裂を介してそ れらが安定的に伝達されることが可能であるということである。これによって、 多くの独立した成熟過程（例えば造血細胞の成熟過程）を経る細胞の種類で、レ トロウイルス構築物は残留し、発現を続ける。 特に適切なレトロウイルス核酸感染系は文献に記載されている(Mannら、上掲 書；Pearら、PNAS USA，90(18):8392-6(1993);Kitamuraら、PNAS USA，92:9146- 9150(1995)；Kinsellaら、Human Gene Therapy，7:1405-1413; Hofmannら、PNAS USA，93:5185−5190; Choateら、Human Gene Therapy，7:2247(1996); WO94/19 478号；およびこれらに引用されている文献、これらは全て参照により本明細書 に含まれる）。 本発明の実施態様の１つでは、ライブラリーは、実施例で一般的に説明するよ うにレトロウイルスＤＮＡ構築物の中心要素で作製される。当技術分野で周知の 技術を用いて標準的なオリゴヌクレオチド合成を実施して、生物活性を有する候 補薬剤の任意の部分を作製する(Eckstein，「オリゴヌクレオチドと類似体、実 施方法」（Oligonucleotides and Analogues，A Practical Approach)、IRL Pre ss 刊、オックスフォード大学出版部、(1991)を参照）。ライブラリーは市販品 を購入してもよい。１０9の固有配列を有するライブラリーは上記のＤＮＡ構築 物の中心要素で容易に作製できる。ＤＮＡライブラリーの作製後、ライブラリー を第一のプライマーにクローニングする。第一のプライマーは“カセット”とし て役立つ。これをレトロウイルス構築物に挿入する。第一のプライマーは一般に 多数の成分を含むが、例えば、必要な調節配列（例えば翻訳、転写、プロモータ ーなど）、融合パートナー、制限エンドヌクレアーゼ（クローニングおよびサブ クローニング）部位、終止コドン（好ましくは３つの全てのフレームで）、第二 の鎖のプライミングのために相補性を有する領域（任意領域では欠失または挿入 が生じる可能性があるので、好ましくは終止コドン領域の末端）などである。 続いて第二のプライマーを付加するが、これは一般に、第一のプライマーによ る合成開始のために相補性領域の全てまたはいくらか、および場合によってサブ クローニングのために第二の固有の制限部位に必要な配列から成る。ＤＮＡポリ メラーゼを添加し、二本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。二本鎖オリゴヌクレ オチドは適切なサブクローニング用制限エンドヌクレアーゼで切断し、標的レト ロウイルスベクターで下記のようにサブクローニングする。 多数の適切なレトロウイルスベクターが用いられる。一般に、レトロウイルス ベクターは以下を含むことができる：内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の制 御下にある選択可能マーカー遺伝子（これは２シストロン性オペロンを許容し、 したがって均質に高レベルでペプチドを発現する細胞の選別を大きく促進する） ；５’ＬＴＲに対してセンスまたはアンチセンス方向で配置された第二の遺伝子 の発現を駆動するプロモーター。適切な選別遺伝子には、ネオマイシン、ブラス トシジン、ブレオマイシン、ピューロマイシンおよびヒグロマイシン耐性遺伝子 とともに、自家蛍光マーカー（例えば緑色蛍光蛋白）、酵素マーカー（例えばｌ ａｃＺ）および表面蛋白（例えばＣＤ８）などが含まれるが、これらに限定され るものではない。 好ましいベクターには、ネズミ幹細胞ウイルス（ＭＡＳＣＶ）(Hawleyら、Gen e Therapy．1:136(1994))および改変ＭＦＧウイルス(Rivereら、Genetics，92:6 733(1995))を基にしたベクター、並びにｐＢＡＢＥ（実施例で概略）が含まれる 。レトロウイルス構築物の一般的な模式図は図４に示す。 レトロウイルスは、誘発可能で構造性のプロモーターを含むことができる。例 えば、選別工程の一定の相の間でのみペプチド発現を誘発しなければならない状 況が存在する。例えば、ある種の例で前炎症性サイトカインを提供する場合には 、当該ペプチド発現の誘発を含む必要がある。これは、過剰発現された前炎症性 薬剤は長期間の場合細胞増殖に対して決定的影響を与える可能性が予想されるた めである。したがって、構造的発現は望ましくなく、当該ペプチドは、当該表現 型が必要とされるときに選別工程の当該相でのみ発現され、続いてレトロウイル ス発現を停止させることによって当該ペプチドを閉め出し、当該作用を確認する か または産生細胞の長期的生存を確保する。多くの誘発可能および構造性プロモー ターが知られている。 さらに、標的細胞にただ１つのベクターを組み込んだ後、誘発可能なレトロウ イルス挿入物を発現させることができるレトロウウイルスベクターを構築するこ とが可能である。重要なことであるが、完全な系がただ１つのレトロウイルス内 に含まれる。３’ＬＴＲエンハンサー／プロモーターレトロウイルス欠損変異体 の自己不活化（ＳＩＮ）特性を取り込んだＴｅｔ−誘発可能レトロウイルスがデ ザインされた(Hoffmanら、PNAS USA，93:5185(1996))。細胞内でのこのベクター の発現は、テトラサイクリンまたは他の活性な類似体の存在下では実質的に検出 不能である。しかしながら、Ｔｅｔの非存在下では、発現は誘発後４８時間以内 に最大になり、誘発可能レトロウイルスを居留させる細胞集団全体が均質な発現 増加を示し、感染細胞集団内で発現が均質に調節されていることを示す。関連す る同様な系は変異ＴｅｔＤＮＡ結合ドメインを利用するが、これはＴｅｔの存在 下でＤＮＡに結合し、Ｔｅｔの非存在下で除去された。これらの系のどちらも適 切である。 この方法において、該プライマーは、それぞれが、異なるペプチドをコードし 得る異なるランダムヌクレオチド配列を含むフラグメントのライブラリーを創り 出す。次いで、連結産物をE．coli のような細菌にトランスフォームして、得ら れるライブラリーから DNA を調製する。この方法は、Kitamura 著 PNAS USA（9 2:9146-9150 頁，1995 年）に一般的に概説されており、引用により特に本明細 書の内容とするものである。 レトロウイルスパッケージ系はライブラリーDNA を送り込むことにより、感染 性ウイルスに転換される。特に制限するものではないが、適当なレトロウイルス パッケージ系細胞系には次のものがある：Bing及び BOSC23 細胞系(WO94/19478 、Soneokaらの論文 (Nucleic Acid Res．23(4):628頁(1995年))、Finer らの論 文(Blood 83:43頁(1994年))に記載されている。)、PhiNX-eco及びPhiNX-ampho 等の Pheonix パッケージ系（下記文献に記載されている。）292T+gagpol 及び レトロウイルス；PA317；及び Markowitz らの論文に概説されている細胞系(Vir ology167:400 頁(1998 年)，Markowitz らの論文(J．Virol，82:1120 頁(1988年 )，Liらの論文(PNAS USA 93:11658 頁(1996 年))，Kinsell らの論文(Human Ge neTherapy7：1405 頁(1996 年))に記載されている。なお、これらの文献は引用 により本明細書の内容とするものである。 好ましい系には、PhiNX-eco 及び PhiNX-ampho 又は類似の細胞系があり、該 細胞系は次の２種の細胞系である。該細胞系は、WO94/19478に記載されているBi ng及び BOSC23 細胞系を基礎とするものであり、それは Ｔ293 細胞系を基礎と するものである (アデノウイルスＥ１ａで形質転換した、ヒト胎児性腎臓系（株 ）であり、ネオマイシンで共選択される温度感受性Ｔ抵原を有している。)。こ の細胞系の独特の特性は、リン酸カルシウム介在トランスフェクション又は脂質 ベーストランスフェクションプロトコールのいずれかで高度にトランスフェクシ ョンされ得ることであり、50%を超える 293Ｔ細胞を、プラスミド DNA で過渡的 にトランスフェクションできる。その結果、該細胞系は細胞性環境となることが でき、そこではレトロウイルスの構造タンパク質及びゲノム−ウイルスRNAが急 速に一体化し、ヘルパー−欠損性ウイルスを創り出す。したがって、293T 細胞 は、狭宿主性又は広宿主性のいずれかのウイルスに関し、gag-polo 及びエンベ ロープ タンパク質を産生することができる安定な統合された欠損性構築物を創り出すこ とができる。これらの細胞系はそれぞれ BOSC23 及び Bing と呼ばれている。こ れらの細胞系の有用性は、それが小スケールの実験に用いる少量の組換えウイル スを一過的に産生し得ることである。該細胞系は、月単位から日の単位でウイル スを創り出すという点でこれまでの安定な系を上回る利点を提供する。 広く使用されてきたこれまで２年間に、これら第１世代の細胞系には問題が２ つあることが明かになった。第１は gag-polo 及びエンベロープの発現が不安定 で、該細胞系ではレトロウイルス産生能力に関し注意深いチェックが求められる 点であり、第２は、タンパク質の産生に用いられるベクターの構造がヘルパーウ イルス産生について十分に‘安全’とは考えられない点であり、かつ第３は、こ れらの細胞系の一つが不注意にもハイグロマイシン含有レトロウイルスを伴なっ ていることが示されたことである。前記BING及びBOSC23細胞系は、本発明で有用 であるが、これらの潜在的に問題となる組織のすべてがPhiNX第２世代細胞系に 用いられる。これらの細胞系は、下記の改良を加えることにより、さらに 293Ｔ 細胞のベースとされる。それぞれの細胞に基づく gag-polo 産生をモニターする 能力を、gag-polo 構築物の読取り枠の下流に、IRES-CDS 表面マーカー発現カセ ットを導入することにより付与したことである。また、さらにCD8のような他の 表面マーカーを加えるのも有用である。IRES（内部リボゾーム挿入部位）配列は 、一本鎖 mRNA 転写物から二次又は三次的なタンパク質の翻訳を許容する。その 結果、CD8の発現は細胞間gag-poloの直接の反映であり、かつgag-poloを産生す る産生細胞集団の能力の安定を流動細胞数測定により容易に測定することができ る。第２に、該gag-polo及びエンベロープ構築物を調製するために、非モロニー （non-Moloney）プロモーターを使用して、導入レトロウイルス構築物を伴なう 潜在的組換えを最小限に留め、かつ gag-polo 及びエンベロープに関し異なるプ ロモーターを使用して、これらの相互間組換え潜在性を最小化した。使用したプ ロモーターは CMV 及び RSV である。２種の細胞系、PHEONIX-ECO 及びPHEONIX- AMPHOを創作した。gag-poloを、共選択マーカーであるハイグロマイシンととも に導入し、かつ前記エンベロープタンパク質を、共選択マーカーであるディプセ リア（diptheria）抵抗性とともに導入した。最後に、求められたもの ではないが、該細胞をスクリーニングし、均一な分布においてgag-polo及びenv を産生する比較的稀な細胞タイプを見出した。この細胞系は、さらにテナガザル 白血病ウイルスエンベロープ、又は精嚢VSV-Gタンパク質のような他のエンベロ ープタンパク質とともにレトロウイルスを偽型化するために入手することができ 、すなわち、また異種栄養性又は再ターゲティングエンベロープを加えることが できるのである。 PHEONIX-ECO及びPHEONIX-AMPHOの双方をヘルパーウイルス産生に関し試験し、 ヘルパーウイルスを含まないことを確実なものとした。双方の細胞系は、レトロ ウイルスの産生に使用することができる安定な細胞系を創造するために、エピゾ ームを伴なうことができる。両細胞系は、流動細胞数測定により gag-polo(CD8) 及びエンベロープ発現の安定性を容易に測定することができ、試験の数ケ月後も 、該細胞系は安定性を示し、かつ第１世代細胞系、BOSC23 及びBingが示した力 価の減損を示さなかった。該力価の減損は部分的に gag-polo 及びエンベロープ の発現誘導プロモーターの選択に起因する。また、両細胞系を用いて、数日間一 過的にウイルスを産生することができる。その結果、これらの新しい細胞系は、 レトロウイルス遺伝子転移実験に関し、一過性、エピゾーム安定性及びライブラ リー作成に十分適応する。最後に、これらの細胞系により産生された力価を試験 した。エピゾーム構築物を伴なう場合、標準的なポリブレン強化レトロウイルス 感染を用いると、107/mlに近づく又は超える力価が、PHEONIX-ECO 及び PHEONIX -AMPHO の双方で見られ。一過的に産生されるウイルスが形成された場合、力価 はこの価の通常1/2〜1/3である。 これらの細胞系は、ヘルパーウイルスを含まず、エピゾームを伴なう、レトロ ウイルスを長期安定的に産生するものであって、gag-polo 及びエンベロープを 安定的に産生し、かつ経時的な力価の減損を示さない。加えて、PhiNX-eco 及び PhiNX-ampho は107/ml に近づく又は超える力価を生じることができ、エピゾー ムを伴なう構築物を有する場合、そのウイルスの濃度は、108/ml〜109/ml にも 増加させることができる。 好ましい実施態様において、前記細胞系及びレトロウイルスを産生する他の方 法を、一過的なトランスフェクションによるウイルスの産生に用いることができ る。前記ライブラリーを拡張するために、該ウイルスを直接使用し、又は他のレ トロウイルス産生細胞系に感染させて使用することができる。 ウイルスの濃縮を下記のように行ってもよい。一般に、例えば NIH3T3 細胞の ような指示細胞のレトロウイルス含有上清を用いて力価を測定し、次いで、感染 の表現型を発現する細胞のパーセンテージを測定する。該ウイルスの濃度を、希 釈ファクターにより感染した細胞のパーセンテージを多重化し、かつ入手可能な 標的細胞の数を考慮して求める。もし、該レトロウイルスが lacZ のようなレポ ーター遺伝子を含むならば、組換えウイルスの感染、統合及び発現を、lacZ 発 現について組織学的に染色することにより、又は流動細胞数測定(FACS)により測 定する。一般に、相対的に高価又は外来の装置により濃縮しない限り、産生細胞 の最良いものから生じるレトロウイルスカ価であっても、107/mlを超えない。し かしながら、最近、レトロウイルスと同じ大きさの粒子はブラウン運動によって は大きく動かないという理由で、流体力学的に、多くのウイルスは細胞と接触し て感染プロセスを開始するのではないと予測されている。しかし、細胞を多孔性 フィルターの上で育て又は置き、かつレトロウイルスを漸進的な重力沈降流(gra vitometricflow)により既存の細胞に移行させた場合、常に、細胞の回りに高濃 度のウイルスを効果的に維持することができる。その結果、多孔性膜上で細胞を 感染させ、かつレトロウイルスの上清を既存の細胞に流すことにより、10倍に達 する高度感染が見られた。これにより濃縮後、108の力価が可能になる。 レトロウイルス構築物の一部である、候補となる核酸を該細胞に導入し、細胞 の表現型を変え得るトランスドミナントな生物活性作用物質をスクリーニングす る。 当業者が評価するように、本発明で用いる細胞のタイプは広範囲である。基本 的には、どのような哺乳類の細胞でも使用することができ、マウス、ラツト、霊 長類及びヒト細胞が特に好ましいのであるが、当業者が評価するように、偽型化 による該細胞系の改良により、すべての真核細胞、好ましくは高次真核細胞の使 用が可能になる。さらに詳細に後述するように、スクリーンを、該細胞が生物活 性作用物質の存在下で選択可能な表現型を示すように設定する。さらに詳細に後 述するように、細胞内にトランスドミナントな生物活性作用物質が存在すること を結論付けるような変化した表現型を示す細胞の選択を可能にするように、適当 なスクリーンを設計できる限り、病状の広範囲な形態と関連付けられた細胞タイ プは特に有用である。 したがって、これに限られるものではないが、適当な細胞タイプに含まれるの は、すべてのタイプの腫瘍細胞（特に、メラノーマ、骨髄性白血病、肺、乳房、 卵巣、結腸、腎臓、前立腺、膵臓及び精巣のガン、心筋、内皮細胞、上皮細胞、 リンパ細胞 (Ｔ細胞及びＢ細胞）、マスト細胞、好酸球、血管内細胞、肝細胞、 単核白血球を含む白血球、例えば、造血性、神経系、皮膚、肺、腎臓、肝臓及び 筋幹細胞のような幹細胞 (スクリーニングにおいて区別化ファクター及び非区別 化ファクターとして用いるものである。)、砕骨細胞、軟骨細胞、及び他の関連 組織細胞、ケラチノサイト、メラニン形成細胞、肝臓細胞、腎臓細胞及び脂肪細 胞である。また、適当な細胞には、公知の研究用細胞があり、制限を意図するも のではないが、ジョルダンT細胞、NIH3T3 細胞、CHO、Cosなどがある (ATCC細胞 系カタログ参照)。なお、この記載は引用により特に本明細書の内容とするもの である。 実施態様において、前記細胞は遺伝学的に操作でき、すなわち、例えば、標的 とする分子を含む外来性核酸含むことができる。 好ましい実施態様において、最初の複数の細胞をスクリーニングする。すなわ ち、候補の核酸を導入された細胞を、変化した表現型を探すためにスクリーニン グする。その結果、この実施態様においては、トランスドミナントな生物活性作 用物質の効果が、それを形成した同じ細胞内１こ見られる。すなわち自己分泌効 果である。 本明細書において「複数の細胞」とは、おおよそ約 106の細胞から108又は109 を意味し、106の細胞から108が好ましい。この複数の細胞とは、細胞ライブラリ ーを含み、そこでは一般に該ライブラリー内の各細胞が、多くのレトロウイルス 分子のライブラリー、すなわち異なる候補の核酸を含んでいるのである。当業者 により評価されるであろうが、該ライブラリー内の若干の細胞はレトロウイルス を含まないこともあり、かつ若干の細胞は一より多いレトロウイルスを含むこと もある。レトロウイルス感染以外の方法を用いて、候補である核酸を複数の細 胞に導入した場合、その細胞ライブラリーの個々の細胞内における、候補となる 核酸の分布は幅広く変化し得る。その理由は、一般に、エレクトロポーレーショ ンなどを行う間、細胞に入る核酸の数をコントロールするのは困難だからである 。 好ましい実施態様において、該候補となる核酸を最初の複数の細胞に導入し、 かつ候補となる生物活性作用物質の効果を、最初の複数の細胞は異なる、二次又 は三次の複数の細胞において、すなわち異なる細胞のタイプにおいてスクリーニ ングする。すなわち、トランスドミナントな生物活性作用物質の効果は、第２細 胞の関する細胞外効果、すなわち、内分泌又はパラ分泌効果に起因する。これは 標準的な技術を用いて行う。最初の複数の細胞は１種の倍地中又は倍地上で生育 することができ、該倍地は二次の複数の細胞を生育を達成することを可能にし、 かつ該効果を測定することを可能にした。それに代わり、細胞間の直接的な接触 を行うことができる。例えば、「接触」とは機能的な接触であり、直接及び間接 の双方を含んでいる。この実施態様において、最初の複数の細胞をスクリーニン グすることも、又はしないこともできる。 所望ならば、該細胞を候補となる核酸の発現に適する条件に処理し (例えば、 誘導可能なプロモーターを用いる場合)、候補となる発現生成物（翻訳又は転写 生成物のいずれか。）を産生させる。 その結果、本発明の方法は、ランダム化された候補となる核酸の分子ライブラ リーを、複数の細胞、細胞ライブラリーに導入することを含むものである。各核 酸は異なる、一般的にランダム化されたヌクレオチド配列を含む。次いで、該複 数性の細胞を、後にさらに十分概説するように、変化した表現型を示す細胞を求 めてスクリーニングする。該変化した表現型は、トランスドミナントな生物活性 作用物質の存在に起因するものである。 本明細書において、「変化した表現型」、「変更された生理機能」又は他の文法的 な相当語は、細胞の表現型が何らか形態で変ったこと、好ましくは検出可能及び ／又は測定可能な形態で変わったことを意味する。当業者が評価するように、本 発明の利点は細胞タイプの広い変形、及び本発明を用いてテストし得る潜在的な 表現型の変化である。したがって、観察、検出又は測定し得る、いかなる表現型 の変化も、本件においてスクリーニング技術の基礎とし得る。特に制限するも のではないが、適当な表現型の変化には、細胞形態学的変化、細胞生育、細胞の 生存能力、支持体又は他の細胞への付着力、及び細胞の比重のような明白な物理 的変化、１種以上の RNA、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカイン又は他の 分子の発現の変化、１種以上の RNA、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカイ ン又は他の分子の平衡状態（すなわち、半減期）の変化、１種以上の RNA、タン パク質、脂質、ホルモン、サイトカイン又は他の分子の局在性の変化、１種以上 の RNA、タンパク質、脂質、ホルモン、サイトカイン、レセプター又は他の分子 の生物活性又は特異的活性の変化、イオン、サイトカイン、ホルモン、成長因子 又は他の分子の分泌における変化、細胞膜電位、極性、統合性又は輸送における 交互変化、ウイルスの感染性、感受性、潜伏性、接着性及び取り込み、並びにバ クテリオファージの変化などがある。本明細書において「表現型が変化し得る」 とは、前記生物活性作用物質が、検出可能及び／又は測定可能な形態で細胞の表 現型を変え得ることを意味する。 さらに詳細に後述するように、変化した表現型は広範囲の様々な方法で検出す ることができ、それは一般に、変化している表現型に依存し、対応する。一般に 、変化した表現型を、例えば、細胞形態の電子顕微鏡的アッセイ、標準的な細胞 生存性アッセイ (細胞死の増加及び細胞生存性の増加の双方を含み、例えば、ウ イルス、細菌、又は細菌性又は合成毒素を介する細胞死に現在抵抗性である細胞 に対するものである。)、標準的なラベルアッセイ（例えば、特定の細胞又は分 子の存在又はレベルを調べる蛍光定量的指示薬アッセイ、FACS 又は他の染料染 色技術を含む。)、細胞を殺した後に行う、目標化合物の発現の生物化学的検出 などである。さらに詳細に後述するように、あるケースでは、変化した表現型は 、ランダム化された核酸を導入した細胞中で検出され、他の実施態様では、変化 した表現型は最初の細胞からの分子的シグナルに応答している第２の細胞で検出 される。 細胞の変化した表現型はトランスドミナントな生物活性作用物質の存在を示す 。本明細書の「トランスドミナント」とは、生物活性作用物質が、変化した表現 型をもたらす第２分子に作用することにより、間接的に変化した表現型を生じさ せることをいう。すなわち、トランスドミナント発現生成物は、遺伝学用語又は 生化学用語で定義される、シスではなく、トランス現象である効果を有する。ト ラ ンスドミナント効果は、分離され、かつ識別可能な標的に関する分子の存在（コ ード化されたペプチド又は RNA）による識別可能な効果であって、コード化され たその存在自体に関する効果ではないのである。それ自体、トランスドミナント 効果は、細胞又は生理学的な系で標的分子又は回路に関し、薬理学的な試薬によ る多くの周知な効果を含んでいる。例えば、β−ラクタム抗体は、細菌細胞にお けるペプチドグリカン合成について、ペニシリン結合性タンパク質への結合及び その機能の停止によるトランスドミナント効果を有している。ペプチドによる例 示的トランスドミナント効果には、その機能に重要な領域で IkB-αに結合する ことにより、NF-kB のシグナル発生を阻害する能力がある。その能力は、十分な 量のペプチド（又は分子）の存在下で、通常、IkB-αのリン酸化及び／又は分解 を介して、NF-kB の活性化を導くシグナル発生回路を、前記ペプチド又は分子の 結合により IkB−αにおける作用を阻害するものである。他の例では、通常、活 性化されて IgE を分泌するシグナル発生回路をペプチドの存在下で阻害する。 または、通常、静止状態である脂肪組織細胞のシグナル発生回路を活性化し、脂 肪を代謝する。または、ペプチドの存在下で、例えば、ある種のウイルスの複製 に関連する細胞内メカニズムを阻害する。該ウイルスには、HIV-1 又はヘルペス ビリダエ科に属するもの、又は気道合胞体ウイルスがある。 分子回路のタンパク質に関するトランスドミナント効果は、タンパク質又は分 子が既に示している生化学的能力を強化又は低下させる、公知の又は未知の機能 のタンパク質又は分子内における配列のランダム化、変化又は突然変異と明瞭に 区別されるものである。例えば、酵素的に切断するタンパク質（β−ラクタム、 β−ラクタマーゼ）を、β−ラクタム抗生物質に対し作用し及び切断するこの酵 素の能力を強化し又は低下させる、その構造内部の配列を突然変異させることに より、その活性を強化し又は低下させることができる。これはタンパク質に対す るシス突然変異を呼ばれるであろう。β−ラクタム抗生物質に関するこのタンパ ク質の効果は、該タンパク質が既に示した活性である。同様に、細胞外へのこの タンパク質の送出を強化するリーダー配列における突然変異は、β−ラクタム分 子をさらに容易に遭遇させ得るものであり、すなわち、タンパク質の安定性を強 化する該配列内の突然変異で、該タンパク質における、シス突然変異と呼ばれる であろうものである。比較を行うために、このタンパク質のトランスドミナント なエフェクターは、β−ラクタマーゼと独立な試薬であって、β−ラクタマーゼ への良好な結合性により、β−ラクタマーゼの機能を強化させ又は低下させるよ うな形態で、β−ラクタマーゼと結合する試薬を含む。 これらの要素は、それ自身分離可能なドメインとして個別に現れるけれども、 一般に、シス効果は分子内における効果であり、相互に作用する要素は、それそ れ共有性の結合をする。トランス効果（何らかの細胞条件下において、所望の効 果を示すというという点において、トランスドミナントである。）は、明瞭な分 子間の効果であり、この効果は、分子Ａ（分子Ｂに共有的にリンクするものでは ない。）は、分子Ｂに結合するか、又は分子Ｂの活性に関連する効果を有する。 それとして、最も知られている薬理学的試薬はトランスドミナントなエフェクタ ーである。 好ましい実施態様において、一旦、変化した表現型を有する細胞を検出し、該 細胞を変化した表現型がない複数の細胞群から単離する。この単離はかなり多く の方法で達成することができ、当該技術分野で公知であり、かつ幾つかの例にお いては、アッセイ又はスクリーニングに依存するであろう。適当な単離技術には 、これに限定するものではないが、FACS、補体を用いる溶解選択、細胞クローニ ング、蛍光体によるスキャニング、「生存(survival)」タンパク質の発現、細胞表 面タンパク質又は物理的に単離するために蛍光化又は標的化し得る他の分子の誘 導された発現、非蛍光性分子を蛍光性分子に変える酵素の発現、無又は低生育の 背景に対する過剰生育、細胞死及びDNAの単離又は他の細胞生命力指示染料など がある。 好ましい実施態様において、候補となる核酸及び／又は生物活性作用物質は、 これに陽性の細胞から単離する。これは多くの方法で達成することができる。好 ましい実施態様において、レトロウイルス構築物と共通なDNA領域に対する、又 は先に定義したレスキュー配列のようなライブラリーの特定の構成部分に対する 、プライマーの相補性を利用して、特有なランダム配列を「救済(rescue)」する 。それに代わり、該生物活性作用物質をレスキュー配列を用いて単離する。した がって、例えば、エピトープタグ又は精製配列を含むレスキュー配列を使用して 、 免疫沈降法又は親和性カラムを用いて、生物活性作用物質を取り出すことができ る。幾つかの例では、後に概説するように、生物活性作用物質と標的分子との間 に十分強力な結合性相互作用がある場合、主な標的分子も取り出すことができる 。それに代わり、該ペプチドを質量分析器を用いて検出することができる。 一旦、救済した後、生物活性作用物質及び／又は生物活性核酸の配列を決定す る。続いて、この情報は多くの形態で使用することができる。 好ましい実施態様において、前記生物活性作用物質を再合成し、標的細胞に再 導入することにより、その効果を確認する。これはレトロウイルスを用いて行う ことができ、また、その代わりに、標的細胞に非常に高い取り込みを可能にする 、HIV−1 TAt タンパク質、並びに類似及び関連タンパク質への融合を用いても よい。例えば、下記文献を参照のこと：Fawellらの論文（PNAS USA 91:664 (199 4年)）;Frankel らの論文(Cell 55:1189(1988年)); Savion らの論文.，(J．Bio l.Chem.256:1149(1981 年)); Derossi らの論文.，(J.Biol.Chem,269:10444(199 4年));及び Baldin らの論文( EMBO J．9:1511(1990 年))。なお、引用によりこ れらの文献はすべて本明細書の内容とする。 好ましい実施態様において、生物活性作用物質の配列を用い、さらに候補とな る生物活性作用物質を創り出す。例えば、生物活性作用物質の配列を、（バイア スされた）ランダム化の第２ラウンドの基礎とし、増加した又は改質した生物活 性を有する生物活性作用物質を開発することができる。それに代わり、ランダム 化の第２ラウンドで生物活性作用物質の親和性を変えることもできる。さらに、 生物活性作用物質の特定されたランダム領域を他の示された領域に挿入すること 、又は他の示された領域の一定領域の配列を変化させ、生物活性作用物質の高次 構造／形態を変更することが好ましいかもしれない。また、リガンド領域の一末 端を一定に保ち、かつ他の末端をランダム化して該ペプチドの結合をシフトさせ ることにより、結合ポケットの突然変異誘発と類似する方法で、潜在的な結合部 位を検討するのが好ましいかもしれない。 好ましい実施態様において、前記生物活性作用物質又は生物活性核酸の何れか がコードする場合、それを用いて標的分子を同定する。すなわち、該分子は生物 活性作用物質と相互作用するものである。当業者が評価するように、主な標的分 子が存在することがあり、これは該生物活性作用物質が直接結合し、又は作用し 得るもので、また二次的な標的分子、つまり該生物活性作用物質により影響され るシグナル発生回路の一部であることがある。これらを有効化された標的と呼ぶ ことができる。 好ましい実施態様において、生物活性作用物質を用いて、標的分子を取り出す 。例えば、本明細書中に概説するように、標的分子がタンパク質である場合、エ ピトープタグ又は精製配列を用い、生化学的手段（共−免疫沈澱法、親和性カラ ムなど）を介して主な標的分子を生成することが可能である。それに代わり、細 菌で発現し、かつ精製される場合、該ペプチドは標的細胞タイプの mRNA から調 製された細菌の cDNA 発現ライブラリーに対するプローブとして使用することが できる。また、ペプチドは、酵母、又は咄乳動物２又は３種のハイブリッド系の いずれかにおいて「エサ」として使用することができる。このような相互作用ア プローチ法はDNA結合性タンパク質及び相互作用性タンパク質成分の単離に非常 に有用であった。該ペプチドを他の薬理学的な活性剤と結合させて、問題のシグ ナル伝達経路の上位的な関係を研究することができる。また、ラベルしたペプチ ド生物活性作用物質を合成的に調製し、それを用いて、該ペプチド結合するそれ らのcDNAを対象として、バクテリオファージ内に発現されたcDNAをスクリーニン グすることが可能である。さらに、レトロウイルスライブラリーを介する cDNA クローニングを用い、該ペプチドにより誘導された効果を「補足」することがで きる。このような戦略において、該ペプチドは、特定のシグナル発生回路の重要 なファクターを確率諭的に滴定し続けることが求められるであろう。この分子又 は活性を、cDNAライブラリー内からの cDNA 過剰発現により満たした場合、それ により前記標的のクローニングを行うことができる。同様に、前記酵母又はバク テリオファージ系のいずれかでクローン化された cDNA を、該ペプチドが作用す る系においてこれらが作用し、相補的に機能することを確認するこの方法におい て、哺乳類の細胞に再導入することができる。 一旦、一次の標的分子を同定すれば、二次標的分子をその一次標的をエサとし て用い、同じ方法で同定することができる。この方法において、シグナル発生回 路を解析することができる。同様に、また、二次標的分子に特異的な生物活性作 用物質を見出し、多くの生物活性作用物質をシグナル回路で作用することを可能 にすることができる。例えば、組み合わせ治療に関するものである。 本発明のスクリーニング法は、幅広い条件下で、多くの細胞タイプをスクリー ニングするのに有効であろう。一般に、該宿主細胞は疾患状態にある細胞であり 、かつこれらは細胞に好ましくない結果をもたらす条件下で試験し、またスクリ ーニングされる。適当な生物活性作用物質を見出した場合、望ましくない効果を 減じ、又は取り除くことができる。それに代わり、通常、好ましい結果を、疾患 状態又はシグナル発生回路を伴なう細胞機構を解明することにより、減じ又は除 去することができる。 好ましい実施態様において、本発明の方法はガンに関する応用に有用である。 腫瘍細胞を急速かつ特異的に殺す能力は、ガンの化学療法の有用なコマである。 一般に、本発明の方法を用いることで、ランダムライブラリーをどの腫瘍細胞( 一次又は培養されたもの) にも導入することができ、かつ同定されるペプチドは それ自身でアポトーシス、細胞死、細胞分裂能の喪失又は細胞生育の低下をもた らす。これは新たに、アンジオスタチン（血管壁の生育を阻害する。）のような 公知のペプチド剤に偏向されたランダム化により、起こり得るものである。それ に代わり、本発明の方法は他のガン治療法（例えば、薬剤又は放射線照射）と組 み合わせ、該細胞を感作し、かつそれにより、二次薬剤に暴露した後に、急速か つ特異的なアポトーシス、細胞死、細胞分裂能の喪失又は細胞生育の低下をもた らすことができる。同様に、本発明の方法は、公知のガン治療法を組み合わせて 使用し、アゴニストをスクリーニングして、より効果的で、毒性の低い治療法を 作り出すことができる。これは、化学療法剤ががタキソールのような製造に非常 に費用がかかるものである場合、特に好ましい。 v-Abl，v-Src，v-Rasなどのような公知のガン遺伝子は、ある種の細胞にトラ ンスフェクションされた場合、異常な細胞生育を引き起こす形質転換を誘導する 。また、これはマイクロテタスターゼに伴なう主な問題である。したがって、好 ましい実施態様において、非形質転換細胞をこれらのガン遺伝子でトランスフェ クションし、次いで、ランダムライブラリーをこれらの細胞に導入し、この形質 転換状態を逆転又は訂正する生物活性作用物質を選択することができる。細胞 のガン遺伝子形質転換のシグナル特性の一つに、接触阻害及び軟質寒天上での成 長能力の減損がある。形質転換性ウイルスを構築して、IRES-puro レトロウイル スベクターに v-Abl，v-Src，又は v-Ras 含有させる、標的 3T3 細胞に感染さ せ、ピューロマイシン選択を行う場合、すべての 3T3 細胞をハイパー形質転換 させて、プレートから離す。該細胞を新鮮な倍地で洗浄して、除去することがで きる。これはスクリーニングの基礎として役立つ。その理由は、生物活性作用物 質を発現する細胞はプレート上に付着して残り、コロニーを形成するからである 。 同様に、特定の腫瘍タイプの生育及び／又は拡散は、特定の腫瘍の表面にある レセプターに結合する、成長ファクター及びサイトカイン(PDGF，EGF，ヘレグリ ンなど)からの剌激的な応答により強化される。好ましい実施態様において、本 発明の方法を用いて、腫瘍細胞を剌激する成長ファクター又はサイトカインの能 力をブロッキングできる生物活性作用物質を見出すことにより、腫瘍の成長及び ／又は拡散を阻害又は停止させる。成長ファクター又はサイトカインを加え、ラ ンダムライブラリーを特定の腫瘍細胞に導入し、続いて、問題となる成長ファク ター又はサイトカインに対する、これらの腫瘍細胞の結合性、シグナル発生性の 表現上の及び／又は機能的応答をブロックする生物活性作用物質の選択を行う。 同様に、ガン細胞の拡散（浸潤及び転移）はガン治療の成功を限定する重要な 問題である。特定の腫瘍細胞の浸潤及び/又は転移を阻害する能力は、ガンの治 療において重要な前進となるであろう。高度の転移潜在性を有する公知の腫瘍細 胞（例えば、メラノーマ、肺細胞ガン、乳ガン及び卵巣ガン）は、それらに導入 されたランダムライブラリー、及び転移又は浸潤アッセイで選択された、特定の 腫瘍細胞の転移及び浸潤を阻害するペプチドを有することができる。転移性表現 型の阻害に関する具体的な適用は、転移のより具体的な阻害を可能にするもので あり、ジヌクレオシドジホスフェートキナーゼをコードする、サプレッサー遺伝 子 NM23 がある。したがって、この遺伝子の細胞内ペプチドアクチベータは転移 をブロックし、かつその上方抑制（レポーター遺伝子との融合による。）のスク リーニングは興味深いものである。また、多くのガン遺伝子は、転移を促進する 。また、突然変異した RAS ガン遺伝子、v-MOS，v-RAF，A-RAF，v-SRC 及び v-F MSを不活性化し又は妨げるペプチドは、抗−転移物質として作用するであろう。 ま た、細胞内作用で、転移で必要とされるプロテアーゼの組み合わせの放出をブロ ックするペプチドには、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ及びウロキナ ーゼなどがあり、効果的な抗−転移物質となることができる。 好ましい実施態様において、本発明のランダムライブラリーは、腫瘍細胞に導 入されて、腫瘍サプレッサー遺伝子を不活性化するするものであり、かつノック アウトの再活性化又は補償作用による好結果の逆転が、通常の表現型の回復によ りスクリーニングされるであろう。主要な例には、p53-不活性化突然変異の逆転 があり、すべてのガンの50％以上存在する。p53の作用は複雑で、転写因子とし ての作用を有するので、おそらく、ペプチドから誘導されたペプチド又は小分子 が突然変異を逆転することができる多くの潜在的な形態がある。一の例を挙げる と、すぐ下流のサイクリン依存性キナーゼp21CPI1/WAF1 の上方抑制であろう。 このような逆転の有用性は、多くの異なる公知のp53突然変異に作用するであろ う。現在、これは遺伝子治療によりアプローチされている。このように作用する １種以上の小分子は好ましいであろう。 他の例には、brac-1 又はbrac-2 の構造的機能、及びアデノーマポリポーシス コリ遺伝子（ACP）及びドロソフィアデイスク大遺伝子(discs-large gene)(Dig) のような乳ガンにおいて重要な他の腫瘍サプレッサー遺伝子の構造的機能を回復 する生物活性作用物質のスクリーニングがある。このACP及びDigは細胞間接合部 の構成成分である。brac-1 の突然変異は、遺伝的な卵巣ガン及び乳ガンにおい て重要であり、本発明の追加的適用を構成する。 好ましい実施態様において、本発明の方法を用い、患者のガンから新しい細胞 系を創り出す。プログラムされた細胞死の最終的な共通回路を阻害するレトロウ イルス配送短ペプチドは、短期性及び可能な長期性細胞系の確立を可能にするで あろう。インビトロ培養及びヒト白血病細胞の感染の条件を確立する。生理学的 及び薬理学的研究を可能とするのに十分な長期間培養において、特定の腫瘍細胞 の維持を可能にする方法について、実際の需要がある。現在、幾つかのヒト細胞 系が、細胞の現実の生理機能をかなり変える Ebstein-Barr ウイルスのような形 質転換性作用物質の使用により確立されている。時折、細胞はそれ自身で生育す るが、しかしこれはランダムな現象である。プログラムされた細胞死（アポトー シス）は、細胞の非炎症性崩壊を引き起こす細胞内の特徴的な変化を生じさせる 最後の共通回路を最終的に活性化する、細胞内の複雑なシグナル発生回路を介し て起きる。腫瘍細胞が、高いアポトーシス指数、すなわちインビボでアポトーシ スを導入する傾向を有することは周知である。細胞を培養する場合、悪性の細胞 成長を起こすインビボ刺激が除かれ、細胞は容易にアポトーシスを起こす。目標 は、例えば、一次ヒト白血病細胞のような多くの一次腫瘍細胞から細胞系を確立 する技術を開発することである。この技術はこれらの細胞でシグナル発生回路の 本来の構成を変えることなく、再現され得る方法でなければならない。アポトー シスを阻害するペプチドをコードする核酸を導入することにより、インビトロに おける細胞の高い生存率、かつその結果、一次ヒト腫瘍細胞においてシグナル変 換回路を研究する機会を達成するものである。加えて、これらの方法は一次細胞 、すなわち非腫瘍細胞に使用できるものである。 好ましい実施態様において、本発明の方法は心血管の適用に有用である。好ま しい実施態様において、心筋を、通常の有害な条件下で細胞の損傷及び死を子防 するするためにスクリーニングすることができる。該条件とは、制限するもので はないが、毒性薬剤（特に化学療法の薬剤）の存在、例えば、アドリアマイシン を用いる治療に続く心臓疾患の防止；酸素欠乏症、例えば、環状動脈閉塞の固定 化；及び活性化されたリンパ細胞からの攻撃による自己免疫細胞障害（例えば、 後ウイルス性新生児心筋症及び狼瘡）がある。候補となる生物活性作用物質を心 筋に挿入し、該細胞を傷害にさらし、かつ生物活性作用物質を選択して下記の現 象のかなりの又はすべてを防止する。下記の現象とは、アポトーシス、膜の脱分 極 (すなわち、発作の不整脈潜在性の現象)、細胞肥大、又は特定細胞内イオン の漏出、二次メッセンジャー及び活性化分子（例えば、アラキドン酸及び／又は リゾホスファチジン酸）がある。 好ましい実施態様において、本発明の方法を用いて、心筋における低下した不 整脈の潜在性をスクリーニングする。該スクリーニングには、候補となる生物活 性作用物質をコードする、候補となる核酸の導入、次に不整脈発作の適用が続き 、これに細胞膜の特定の脱分極をブロックする生物活性作用物質のスクリーニン グを伴なう。これはパッチクランプを用いて、すなわち蛍光技術を介して検出で き る。同様に、心筋におけるチャンネル活性（例えば、カリウム及び／又は塩化物 チャンネル）を、収縮性を強化し、かつ不整脈を予防し又は低下させるために、 本発明の方法を用いて制御することができる。 好ましい実施態様において、本発明の方法を用いて、心筋の強化された収縮特 性のスクリーニングを行い、かつ心臓疾患の潜在性を低下させる。本発明のライ ブラリーの導入に続き、蛍光技術を用いてミオシン重合／解重合の変化速度を測 定することができる。この現象の変化速度を増加させる生物活性作用物質は、ジ ギタリスで見られた効果と類似する、全体の心筋のより収縮性がある応答をもた らす。 好ましい実施態様において、本発明の方法は、不整脈を防止するために心筋に おいて細胞及び心筋細胞膜のカルシウムサイクルを制御する作用物質を同定する のに有用である。生物活性作用物質を選択して、ナトリウム−カルシウム交換、 ナトリウムプロトンポンプ機能、及びカルシウム−ATPase活性を制御する。 好ましい実施態様において、本発明の方法は、脳卒中 (及び腎臓不全及び肢虚 血を引き起こす他の閉塞現象)、及び心筋梗塞を促進する狭心症を引き起こす、 動脈における塞栓現象を減少させる作用物質を同定するのに有用である。例えば 、生物活性作用物質は血小板及び白血球の付着を減少させ、かつそれにより塞栓 現象を少なくする。この背景における付着は、本発明のライブラリーを内皮細胞 (静止状態の細胞、又はサイトカインにより活性化された細胞（例えば IL-1）及 び成長因子（例えば、PDGF/EGF)）に挿入し、次いで下記1)、2) 及び3) のいず れかのペブチドをスクリーニングすることにより阻止することができる。ここで 1) のペプチドは、内皮細胞の表面上における付着性分子の発現を下方制御する ものであり (結合アッセイ)、2) のペプチドは、これらの細胞の表面上における 付着性分子の活性化をブロックするものであり（シグナルアッセイ）かつ3) の ペプチドは、付着性細胞上の同族のレセプターに結合するレセプターをブロック するペプチドを、自己分泌する形態で放出するものである。 また、塞栓現象は、内皮細胞の表面上でタンパク質分解酵素を活性化し、血液 の塊を溶解できる活性な酵素を放出することにより、取り扱うことができる。本 発明のライブラリーを内皮細胞に送り出し、次いで標準的な蛍光アッセイを行う 。 このアッセイは、公知の物質に対する細胞表面上のタンパク質分解活性のモニタ ーを可能にするものである。次いで、特定の基質に対する特定の酵素を活性化す る、生物活性作用物質を選択することができる。 好ましい実施態様において、血管炎及び後−梗塞形成の背景における動脈の炎 症を、白血球及び単核白血球の走化性応答を低下させることにより、制御するこ とができる。これを、細胞上の走化レセプター及びその応答回路をブロッキング することにより達成することができる。候補となる生物活性ライブラリーをこれ らの細胞に挿入し、かつ多様なケモカイン(例えば、IL8族のケモカイン、RANTES )に対する走化性の応答を、細胞転移アッセイにおいて阻害できる。 好ましい実施態様において、環状動脈血管形成手術後の動脈再狭窄を、血管内 膜細胞、及び毛細血管及び／又は動脈内皮細胞の増殖を制御することにより、コ ントロールすることができる。候補となる生物活性作用物質ライブラリーをこれ らの細胞タイプに挿入し、特定の刺激に応答する増殖をモニターすることができ る。応用の一つに、その増殖を止める平滑筋肉細胞におけるc-myc及び他のガン 遺伝子の発現又は機能をブロックする細胞内ペプチドが有り得る。第２の応用に は、そのアポトーシスを選択的に誘導する、血管平滑筋細胞におけるライブラリ ーの発現がある。これらのペプチドから誘導された小分子の適用には、標的とさ れる薬剤の送り出しが要求される。これは、ステント、ヒドロゲルコーティング 及び注入ベースカテーテルシステムを用いて達成できる。また、エンドセリン− 1A レセプターを下方制御するペプチド、又は強力な血管収縮薬及び血管平滑筋 細胞マイトジェンエンドセリン−１の放出をブロックするペプチドを治療学に関 する候補とすることができる。これらの細胞の生育を阻害するライブラリー、又 は血小板（PDGF）及び単核白血球のような、自己分泌成長ファクターを放出する ことが知られている、その循環における他の細胞の付着を妨げるライブラリーか ら、ペプチドを単離することができる。 毛細血管及び血管成長のコントロールは、虚血領域(成長)への血流量の増加を 促進するため、また腫瘍への血液供給を遮断（血管形成阻害）するために、重要 な目標である。候補となる生物活性作用物質ライブラリーを毛細血管内皮細胞に 挿入し、その成長をモニターすることができる。低酸素の緊張及び血管形成ファ クターの段階の変化のような刺激はその応答を制御でき、かつ適当な表現型を産 生するペプチドを単離することができる。また、血管形成に重要である、血管内 皮細胞成長ファクターの拮抗作用のスクリーニングは有用であろう。 好ましい実施態様において、本発明の方法は、LDL 及び HDL 代謝を制御する ペプチドを見出す、アテローム硬化産生機構における低下をスクリーニングする 際に有用である。候補となるライブラリーを適当な細胞(肝細胞、単核白血球、 内皮細胞を含む。)に挿入し、LDL の低放出又は LDL の低合成を導き、又は HDL の高放出又は HDL の強化された合成を逆方向に導くペプチドを選択することが できる。また、生物活性作用物質を候補となるライブラリーから単離することが できる。、該作用物質には、酸化された LDL の産生を低下させるもの、アテロ ーム硬化に関連し、かつアテローム硬化の病変部から単離されたものがある。こ れは、その発現の低下、減少させる系又は酵素の活性化、又はマクロファージ中 の 15−リポオキシゲナーゼのような酸化 LDL の産生に関連する酵素の活性又は 産生のブロッキングにより生じさせることができる。 好ましい実施態様において、本発明の方法を、食品摂取機構のコントロール、 又は代謝を制御するレセプターシグナル発生回路の応答を低下させることを介し て、肥満症を制御するスクリーニングの際に使用する。ニューロペプチドＹ(NPY )、コレシストキニン及びガラニンレセプターの応答を制御又は阻害する、生物 活性作用物質が特に好ましい。候補となるライブラリーをそのなかでクローン化 されたレセプターを有する細胞に挿入し、阻害性のペプチドを選択することがで きる。該ペプチドは、ガラニン及び NPY に対するシグナル性応答をブロックす る、自己分泌形態で分泌される。同様な方法で、レプチンレセプターを制御する ペプチドを見出すことができる。 好ましい実施態様において、本発明の方法は、神経生物学的な適応において有 用である。候補となるライブラリーは、抗−アポトーシス、神経機能の保存及び 神経死の予防に関するスクリーニングに有用である。最初のスクリーニングは細 胞培養において行うことができるであろう。応用の一つに、脳卒中から生じる小 脳の虚血におけるアポトーシスによる神経死の予防がある。アポトーシスは神経 アポトーシス阻害タンパク質（NAIP）によりブロックされることが知られており 、 その上位抑制がスクリーニングされ、すなわちどの組み合わせステップが行われ ても、神経アポトーシスを選択的にブロックするペプチドを得ることができる。 他の適用には、アルツハイマー症及びハンチングトン症のような神経変性症があ る。 好ましい実施態様において、本発明の方法は、骨の生物学的な適応において有 用である。破骨細胞は、古い骨の破壊による骨の再形成において鍵となる役割を 果たすことが知られており、その結果、造骨細胞が新しい骨を作ることができる 。骨粗鬆症において、このプロセスの不均衡がある。破骨細胞の過剰な活性を候 補となるライブラリーをこれらの細胞に挿入し、下記 1)、2)及び 3)を生じる生 物活性作用物質を探すことにより制御することができる。1)はこれらの細胞によ るコラーゲンの低い処理、2)は骨小片上の低い窩孔形成、及び 3)は骨フラグメ ントからのカルシウムの低い放出である。 また、本発明の方法を用いることにより、骨の形態形成タンパク質の作用物質 、(例えば、副甲状腺ホルモン及びカルシトニンと類似する形態で)新しい骨の形 成を剌激し、制御し、又は強化する擬似的なホルモンをスクリーニングすること ができる。骨粗鬆症においては、骨折の貧弱な治癒だが、これらを使用し、新し い骨折の治癒速度を速めることができる。さらに、結合組織器官の細胞系は、候 補となるライブラリーとして扱うことができ、かつ標的造骨細胞に関する、これ らの成長、増殖、コラーゲン剌激活性及び／又はプロリン取り込み能力をスクリ ーニングすることができる。その代わりに、候補となるライブラリーを造骨細胞 又は軟骨細胞において直接発現することができ、かつコラーゲン又は骨の増加し た産生をスクリーニングすることができる。 好ましい実施態様において、本発明の方法は、皮膚生物学的な適応において有 用である。各種の刺激に対するケラチノサイトの応答は、これらの細胞における 乾癖、増殖的変化をもたらし得る。候補となるライブラリーを活性な乾癖プラー クから除去された細胞に挿入し、これらの細胞の成長速度を低下させる生物活性 作用物質を単離することができる。 好ましい実施態様において、本発明の方法は、ケロイド形成(すなわち、過剰 な瘢痕)の制御又は阻害において有用である。候補となるライブラリーを、この 条件で、個体から単離した皮膚結合組織細胞に挿入し、増殖、コラーゲン形成、 又はプロリン取り込みを減少させる生物活性作用物質を単離する。この作業から 得た結果を拡張して、火傷を負った患者に起きる過剰な瘢痕を治療することがで きる。 共通なペプチドモチーフが、ケロイドの作業の流れに見出される場合、それを瘢 痕化後火傷を低下させる形態で広く使用することができる。 同様に、皮膚及び四肢における糖尿病性の潰瘍、及び他の慢性的治癒不全の条 件での傷の治癒は、皮膚及び真皮層に存在する、細胞に対する付加的な成長シグ ナルを提供することにより制御することができる。成長ファクター擬似体は、実 際、この条件で非常に有用であろう。候補となるライブラリーを皮膚結合組織細 胞に挿入し、低酸素の緊張、低 pH 及び炎症媒介物質の存在のような、激しい条 件下でこれらの細胞の成長を促進する生物活性作用物質を単離することができる 。 本発明の化粧品への適用は、皮膚メラニン形成細胞において、メラニン産生を コントロールすることを含む。天然のペプチド、アルブチンは、チロシンヒドロ キシラーゼ阻害剤であり、メラニン合成において鍵となる酵素である。候補とな るライブラリーをメラニン形成細胞に挿入し、細胞におけるメラニンの合成を増 加させることができる。これらの条件下でメラニンの合成を阻害する生物活性作 用物質を単離することができる。 好ましい実施態様において、本発明の方法は、内分泌学的な適応において有用 である。レトロウイルスペプチドライブラリー技術をすべての内分泌、成長ファ クター、サイトカイン、又はケモカインネットワークに広く適用することができ る。これらは、レセプターを結合又は二量体化し、かつ公知の表現型又は機能的 な結果をもたらす、シグナルカスケードを活性化する、内分泌、パラ分泌又は自 己分泌のいずれかの様式で作用する、シグナル発生ペプチド又はタンパク質を含 むものである。この方法は、所望のホルモン(例えば、インシュリン、レプチン 、カルシトニン、PDGF、EGF、EPO、GMCSF、IL1-17、擬似体)を擬態するか、又は その作用を阻害するペプチドを単離できるように適用する。これは、ホルモンの 放出を阻害するか、特定のレセプター又はキャリアータンパク質(例えば、CFR 結合タンパク質)との結合をブロックするか、又はそのホルモンに対する特定の 標 的細胞の細胞内応答を阻害することの何れか１つによるものである。通常、産生 する細胞からホルモンの産生又は放出を増加させるぺプチドの選択は、ホルモン 欠乏の条件に広範囲な適用を有し得るものである。 好ましい実施態様において、本発明の方法は、感染症への適応において有用で ある。候補となるライブラリーは、ウイルス潜伏(CMV，EBV，HBV のようなヘル ペスウイルス、及び HIV のような他のウイルス)及びその再活性化は、重大な問 題であり、特に免疫抑制(AIDS 感染の患者及び移植患者)された患者には重要で ある。これらのウイルスの再活性化及び拡散をブロックする能力は、重要な課題 である。潜伏性ウイルス感染を宿している又は疑われていると公知な細胞系は、 特定のウイルスで感染させ、次いで、再活性及びウイルスの複製を引き起こすと 見られているこれらの細胞に剌激を与えることができる。これに続き、倍地及び 表現型変化があるスコア細胞でウイルス力価を測定する。候補となるライブラリ ーを、次いで前記条件下でこれらの細胞に挿入し、ウイルスの成長及び／又は拡 散をブロック又は減少させるペプチドを単離することができる。化学療法を行つ ている場合、また、これらの実験はこの結果に関し、部分的にのみ有効な薬剤を 用いて行い、かつこれらの薬剤の殺ウイルス効果を強化する生物活性作用物質を 単離することができる。 多くの例の一つに、HIV-1 感染をブロックする能力がある。HIV-1 は CD4、及 びレセプターと結合した、幾つかの７膜貫通 G-タンパク質の一つである共−レ セプターを要求する。マクロファージの感染の場合、CCR-5 が要求される共−レ セプターであり、CCR-5 へのブロックがHIV-1感染に対する抵抗性をもたらす強 力な証拠がある。この記述に関し証拠となる２種の細胞系がある。第１に、CCR- ５の天然のリガンド、CC ケモカイン RANTES、MIP1a 及び MIP1b が、HIV に対 する抵抗性を仲介するCD8+に応答性であることが知られている。第２に、CCR-5 の突然変異対立遺伝子がホモ接合体の個体がHIV感染に完全に抵抗性なことであ る。したがって、CCR-5／HIV 相互作用の阻害剤は生物学者及び医療関係者双方 に取り、著しく興味ぶかいものであろう。外来細胞固着構築物がこのような発見 にすばらしい道具を提供する。膜貫通、タグ化エピトープ、グリシン−セリン係 留構築物(ssTM V G20 E TM)中に、一般配列 CNNNNNNNNNNC 又はC-(X)n-Cのラン ダム、 環化ペプチドライブラリーを配置することができる。そして、このライブラリー を含むレトロウイルスを用いてCCR-5 を発現する細胞系を感染させることができ る。CCR-5 の抗体を使用する場合、FACS を用い、レセプターに対するこの抗体 の結合性に基づき所望の細胞を分類することができる。該抗体に結合しないすべ ての細胞は、この抗体の結合部位の阻害剤を含んでいると推定できるのである。 レトロウイルス構築物中のこれらの阻害剤を、さらにHIV-1挿入を阻害する能力 についてアッセイすることができる。 ウイルスは、細胞に結合する特定のレセプターを用いて細胞に侵入し（例えば 、HIV はCD4 を用い、コロナウイルスは CD13 を用い、マウス白血病ウイルスは 輸送タンパク質を用い、かつ麻疹ウイルスは CD44 を用いる。）、かつ細胞と融 合（HIV はケモカインレセプターを用いる。）することが知られている。候補と なるライブラリーは、これらのウイルスを受容することが知られている標的細胞 に挿入され、かつこれらのウイルスと結合し、かつ特定の標的細胞と融合する能 力をブロックする生物活性作用物質を単離することができる。 好ましい実施態様において、本発明は、感染性生物に用いることが認められる 。細胞内生物には、例えば、放線菌、リステリア、サルモネラ、ニューモシステ ィス、エルシニア、レーシュマニアがある。T.cruzi は、持続しかつ細胞内で複 製し、免疫抑制された患者において活性化した。現在、これらの生物に部分的に のみ有効か、又は有効でない薬剤が市販され、かつ開発されている。候補となる ライブラリーをこれらの生物に感染(前−又は後−感染)している特定の細胞に挿 入し、かつマゲイニンに似た細胞内「抗生性ペプチド」に類似する態様で、これ らの生物の細胞内崩壊を促進する生物活性作用物質を選択することができる。さ らに、それ自身では不十分な効力しか有していないが、候補となるライブラリー から得られる特定のペプチドと組み合わせた場合、相乗的な機構を介し著しく強 力になる、既に研究中の薬剤の殺特性を強化するペプチドを選択することができ る。最後に、鍵となる生物の現象を阻害することにより、その細胞内ライフサイ クルを終わらせるような態様で、これらの細胞内生物の代謝を変化させる生物活 性作用物質を単離することができる。 広範囲に使用されている抗生薬剤は、組織特異毒性に依存する特定の投与量を 有する。例えば、腎臓毒性が、ゲンタマイシン、トブラマイシン及びアンホテリ シンの使用に見られ、肝臓毒性が、INH 及びリファムピンの使用に見られ、骨髄 毒性がクロラムフェニコールに見られ、かつ血小板毒性がチカルシリンなどに見 られる。これらの毒性はその使用に限られる。候補となるライブラリーを、抗生 物質により細胞損傷又はアポトーシスを引き起こす特異的変化が生じている、特 定の細胞タイプに導入し、これらの細胞が、特定の抗生物質で処理された場合に 、保護を与える生物活性作用物質を単離することができる。 さらに、本発明を、抗生物質輸送機構をブロックする生物活性作用物質をスク リーニングするのに用いることができることが認められる。特定の抗生物質の血 流からの急速な分泌は、その有効性を限られたものにする。例えば、ペニシリン を、腎臓及び脳の脈絡集網における特定の輸送機構により、急速に分泌させる場 合である。プロベネシドは、この輸送をブロックし、かつ血清及び組織の濃度を 上昇させることで知られている。候補となる作用物質を、抗生物質の活性な輸送 機構を有することが知られている腎臓の細胞及び脈絡集網の細胞から誘導された 特定の細胞に挿入することができる。次いで、特定の抗生物質の活発な輸送をブ ロックする生物活性作用物質を分離して、それによりこれらの薬剤の血清半減期 を延長することができる。 好ましい実施態様において、本発明の方法は、薬剤毒性及び薬剤耐性の適応に おいて有用である。薬剤特性は重大な臨床的問題である。それは特定の組織とし てそれ自体又は細胞の損傷として示され得るし、薬剤の有効性を限定する結果を 伴なうこともある。その例には、高い投与量のガン化学療法における骨髄の減量 、気道及び消化管にリンクする上皮細胞に対する損傷、及び髪の脱毛がある。特 定の例を挙げると、アドリアマイシン誘導心筋細胞の死、シスプアチニン誘導腎 臓毒性、ビンクリスチン誘導消化管の運動性疾患、及びサイクロスポリン誘導の 腎臓損傷がある。候補となるライブラリーを、特有な薬剤誘導表現型又は機能応 答を伴なう、特定細胞タイプに導入できるが、この際、薬剤と、該薬剤に晒され た場合に毒性変化に対する特定細胞タイプを逆転し、又は保護する、単離された 作用物質との存在下で行う。これらの効果は、興味深い細胞の薬剤誘導アポトー シスをブロッキングすることで示され、その結果、最初のスクリーニングは、高 濃 度の薬剤の存在下で細胞の生存率について行うか、又は組み合わせ化学療法で使 用される薬剤の組み合わせについて行うことになる。 薬剤毒性は、特定細胞に高度に毒性である、肝臓又は腎臓で産生される特定の 代謝産物に起因するか、又は投与された薬剤の代謝をブロック又は強化する、肝 臓における薬剤の相互作用に起因するのである。毒性代謝物を産生することが知 られている薬剤に、これらの細胞を晒すのに続き、候補となるライブラリーを、 肝臓又は腎臓の細胞に導入することができる。肝臓及び腎臓の細胞が薬剤を代謝 する形態を変化させる、生物活性作用物質を分離し、特定の毒性代謝産物の発生 を阻止する特定の作用物質を同定することができる。代謝産物が生じたら、それ に続き質量分析を行い、かつ顕微鏡により、表現型の変化を評価することができ る。また、このようなスクリーニングは、該毒性代謝産物に特異的に感受性であ る、リードアウト細胞と協同培養された、培養肝細胞で実施するものである。適 用は、薬剤代謝における酵素の逆転(毒性の制限)阻害物質を含むものである。 多重薬剤耐性、及びそれによる腫瘍細胞選択、増殖及び再発は、ガン患者の罹 病率及び死亡率を導いてゆく。候補となるライブラリーを、特定又は多重薬剤耐 性を示した腫瘍細胞系(一次及び培養されたもの)に導入することができる。次い で、細胞を興味の対象である特定の薬剤、又は組み合わせ化学療法で用いた複数 の薬剤にさらした場合に、薬剤感受性を付与する生物活性作用物質を、同定する ことができる。これらの細胞のアポトーシス開始は、膜の透過性変化、細胞間イ オン及び蛍光マーカーの放出により読み取ることができる。多重薬剤耐性が膜の 輸送体を含む細胞に、前もって蛍光輸送体基質を充填し、これらの細胞で蛍光薬 剤の通常の流出をブロックするペプチドを求めて選択を行うことができる。候補 となるライブラリーは、わずかに特徴付けられる又は最近発見された耐性の細胞 間機構を逆転する、又は LRP(肺抵抗性タンパク質)を含む機構のような、現在、 ほとんど又は全く化学感受性体が存在しない場合の機構に寄与するペプチドのス クリーニングに特に適している。このタンパク質は、卵巣ガン、転移性の悪性メ ラノーマ、及び急性骨髄白血病において、多重薬剤耐性に関連するものである。 特に興味がある例には、単一細胞における２以上の重要な耐性機構を逆転し、ほ とんどの薬剤耐性細胞のサブセットにおいて起こり、また重要な標的である作用 物質のスクリーニングがある。適用に含まれるのは、MRP(多重薬剤耐性関連タン パク質)及び転移性メラノーマにおける耐性細胞の処理に関するLRP の双方のペ プチド阻害剤をスクリーニングすること、急性骨髄白血病におけるp-糖タンパク 質及びLRP 双方の阻害剤をスクリーニングすること、及び汎耐性細胞を処理する ３種すべてのタンパク質の阻害( どのような機構でもよい。)をスクリーニング することである。 好ましい実施態様において、本発明の方法は既存の薬剤または開発薬剤の性能 を改良するのに有益である。経口投与された薬剤の第一パス代謝はそれらの経口 生体利用能を制限し、低下された効力をもたらすだけでなく、所望の効果のため に更に多くの薬剤を投与する必要をもたらし得る。こうして、第一パス代謝に関 与する酵素の可逆的インヒビターはこれらの薬剤の効力を増進するのに有益な佐 剤であり得る。第一パス代謝は肝臓中で起こり、こうして相当する異化酵素のイ ンヒビターがコグネイト薬剤の作用を増進し得る。可逆的インヒビターは関係す る薬剤と同時、またはわずかに前に送出されるであろう。特に問題のあるイソ酵 素のインヒビター（あらゆるメカニズム、例えば、タンパク質ダウンレギュレー ション並びに活性の直接の抑制による）に関する肝細胞中の候補ライブラリーの スクリーニングが重要であろう。これらとして、シトクロムP450のCYP3A4イソ酵 素が挙げられ、これらは抗HIV 薬剤サキナバー及びインジナバーの第一パス代謝 に関与する。その他の適用として、薬剤に応じて、UDP-グルクロニルトランスフ ェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、エポ キシドヒドロラーゼ、及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼの可逆的インヒ ビターが挙げられる。スクリーンは培養肝細胞または肝臓ミクロソーム中で行わ れ、肝臓中で行われる特定の修飾を認識する抗体、または同時培養リードアウト 細胞（代謝産物が末形質転換薬剤とは異なる生理活性を有した場合）を伴い得る 。薬剤を修飾する酵素は、スクリーニングが薬剤の変化を欠如した場合には必ず しも知られている必要はないであろう。 好ましい実施態様において、本発明の方法は免疫生物学、炎症反応、及びアレ ルギー反応用途に有益である。Ｔリンパ球応答の選択的調節は特定の方法で免疫 介在性疾患を変調するために所望される目標である。候補ライブラリーは特定の Ｔ細胞サブセット(TH1、TH2、CD4+、CD8+、等)に導入でき、これらのサブセット を特徴付ける応答（サイトカイン発生、細胞毒性、単核白血球により提示される 酵素に応答する増殖、等）がライブラリーの員により変調される。既知のＴ細胞 サブセット生理応答を増大または低下する薬剤が選択し得る。このアプローチは 、1)寛容状態を誘発したい（自己抗原を有する細胞を認識することからＴ細胞サ ブセットを抑制するペプチドを選択したい）場合の自己免疫疾患、2)IgG 産生細 胞の刺激を減少したい(IgE 産生へのスイッチを誘発するサイトカインを刺激す る特定のＢ細胞のＴ細胞サブセットからの放出を阻止するペプチドを選択したい ）場合のアレルギー疾患、3)選択的免疫抑制を誘発したい（外来抗原に対する宿 主Ｔ細胞の増殖性応答を減少するペプチドを選択したい）場合の移植患者、4)増 殖を抑制し、または特定のＴ細胞腫瘍を化学療法及び／または放射線に感作した い場合のリンパ増殖性状態、5)Fas リガンドを有する腫瘍細胞により細胞毒性Ｔ 細胞の死滅を抑制したい場合の腫瘍監視、及び6)疾患を生じるＴ細胞の増殖及び 得られる標的組織（夫々、軟骨、結合組織、乏突起膠細胞、腸内皮細胞）の選択 的破壊を抑制したい（それらの選択的アポトーシスを促進したい）場合のＴ細胞 介在性炎症性疾患、例えば、慢性関節リウマチ、結合組織疾患(SLE)、多発性硬 化症、及び炎症性膀胱疾患を含む幾つかの症状に有益であろう。 Ｂ細胞応答の調節は、特定のＢ細胞サブセットによりつくられ、分泌された免 疫グロブリンの型及び量の一層選択的調節を可能にするであろう。候補ライブラ リーはＢ細胞に挿入でき、特定の免疫グロブリンの放出及び合成を抑制する生理 活性薬剤が選択し得る。これは自己抗体の過剰産生及びIgE の如き抗体を生じる アレルギーの発生を特徴とする自己免疫疾患に有益であり得る。また、外来また は自己の特定の抗原への特定の免疫グロブリンサブクラスの結合を抑制または増 進する薬剤が同定し得る。最後に、特定の細胞型のレセプターへの特定の免疫グ ロブリンサブクラスの結合を抑制する薬剤が選択し得る。 同様に、サイトカイン産生に影響する薬剤が、一般に２種の細胞系を使用して 選択し得る。例えば、マクロファージ、単球等からのサイトカイン産生が評価し 得る。同様に、サイトカイン、例えば、エリトロポエチン及びIL1-17を模擬する 薬剤、またはTNF-αの如きサイトカインを結合する薬剤が選択でき、その後にそ れらがそれらのレセプターを結合する。 単核白血球(ML)による抗原プロセシングが、外来タンパク質を認識し、排除す る免疫系の能力において重要な初期工程である。候補薬剤がML細胞系に挿入でき 、外来ペプチド及びクラスIIMHCの状況下でそれらの細胞表面でMLによりＴ細胞 に提示される外来ペプチドの配列の細胞内プロセシングを変化する薬剤が選択し 得る。特別なＴ細胞サブセットの免疫応答を増進するライブラリーの員（例えば 、ペプチドは実際にワクチンとして作用するであろう）をさがすことができ、ま たはMHC に一層しっかりと結合し、こうして天然産ペプチドを置換するライブラ リー員をさがすことができるが、それにもかかわらず、その薬剤はそれ程免疫原 性ではないであろう（特定のＴ細胞クローンに刺激性ではないであろう）。この 薬剤は実際に免疫寛容性を誘発し、かつ／または外来タンパク質に対する免疫応 答を低下するであろう。このアプローチは移植、自己免疫疾患、及びアレルギー 疾患に使用し得る。 炎症性媒介物質（サイトカイン、ロイコトリエン、プロスタグランジン、血小 板活性化因子、ヒスタミン、神経ペプチド、並びにその他のペプチド及び脂質媒 介物質）の放出が、異常免疫応答を維持し、増幅する際の主要要素である。候補 ライブラリーはML、マスト細胞、好酸球、及び特定の炎症応答に関与するその他 の細胞に挿入でき、媒介物質のこれらの型の夫々の合成、放出及びそのコグネイ トレセプターへの結合を抑制する生理活性薬剤が選択し得る。 好ましい実施態様において、本発明の方法はバイオテクノロジー用途に有益で ある。また、哺乳類細胞中の候補ライブラリー発現はその他の医薬関連用途、例 えば、タンパク質発現の調節、タンパク質折り畳み、またはタンパク質分泌につ いて考えられる。一つのこのような例はCHO 細胞またはその他の細胞中のタンパ ク質医薬品の商用生産であろう。増大された細胞成長速度（おそらく、成長因子 を模擬し、または成長因子シグナル伝達経路のアゴニストとして作用するペプチ ド）、病原体耐性（前節を参照のこと）、シアリル化またはグリコシル化（グリ コトランスフェラーゼをブロックし、または細胞中のタンパク質の輸送をリルー ト(reroute)することによる）、オートクレーブ処理培地での成長を可能にする こと、または無血清培地中の成長について選択する生理活性薬剤をもたらす候補 ライブラリーが全て生産性を増大し、タンパク質医薬品の生産のコストを低減す るであろう。 循環細胞の表面で示されたランダムペプチドが臓器、組織、及び細胞特異性ペ プチドターゲッティング配列を同定するための手段として使用し得る。細胞表面 にターゲッティングされたライブラリーを発現する動物の血流に導入されたあら ゆる細胞が特定の臓器及び組織ターゲッティングに選択し得る。次いで同定され た生理活性薬剤配列が抗体、酵素、薬剤、イメージング剤(imaging agent)また は臓器ターゲッティングが所望される物質にカップリングし得る。 本発明を使用して選択し得るその他の薬剤として、1)リポーター遺伝子を有す る細胞系を使用して、転写因子の活性をブロックする薬剤、2)正常な細胞機能の 不在、哺乳類の二つのハイブリッド系または検出のための蛍光共鳴エネルギー転 移メカニズムを使用して、細胞中の２種の既知タンパク質の相互作用をブロック する薬剤、及び3)ランダムペプチドをタンパク質結合領域につないで立体的に近 い分子との相互作用、即ち、シグナリング経路内の相互作用を可能にしてその効 果を関係する機能性領域に局在化することにより同定し得る薬剤が挙げられる。 以下の実施例は上記の本発明を使用する方法を更に充分に記載し、同様に本発 明の種々の局面を実施するために意図されている最良の様式を示すのに利用でき る。これらの実施例は本発明の真の範囲を限定するのに利用できるのではなく、 説明の目的のために示されることが理解される。本明細書に引用された全ての文 献は参考としてそのまま含まれる。 実施例 実施例１ 概念の証明実験 幾つかの系を使用して、本明細書に概説されたレトロウイルス構築物が選択可 能な表現型をもたらすことができることを証明した。アポトーシスからのBcl2及びCPP32 保護 Bcl2及びCPP32 ペプチドは腫瘍壊死因子及びシクロヘキシミドにより誘発され るアポトーシスを抑制することができることが知られている。Apotag アッセイ:TUNEL（TdT媒介dUTP- フルオレセインnick末端標識）ベーリン ガー・マンハイムキット、カタログ番号16879 5 MFGLacZ プラスミド、BCL2プラスミド、またはCPP32 プラスミドで一過性感染 した3T3 細胞を６時間のhTNFa(50ng/ml培地)及びシクロヘキシミド(100ng/ml培 地)による誘発の時点で50％の集密度まで増殖させた。細胞を６時間で洗浄し、 誘発後の24時間で回収した。全ての培地を洗浄液とともに細胞から溜めることに より細胞を回収し（アポトーシスの細胞、浮遊細胞を回収するため）、細胞をト リプシン処理した。細胞を回転させ、１％のBSA を含むPBS で洗浄し、エッペン ドルフ管に移し、洗浄を１回繰り返した。 細胞を室温で30分間にわたって４％のパラホルムアルデヒドで固定し、PBS/BS A中で洗浄し、次いで氷の上で透過緩衝液中で２分間再度懸濁させた。透過後に 、細胞をPBS/BSA 中で２回洗浄し、フルオレセイン処理したdUTP、未標識ヌクレ オチド混合物及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)を含む 標識緩衝液とともに37℃で１時間インキュベートした。細胞をPBS/BSA で２回洗 浄し、PBS/BSA 中で再度懸濁させ、分析のためにFACS管に移した。また、サンプ ルを蛍光顕微鏡のもとに視覚化した。結果は、in vivoのMSCVレトロウイルスプ ロモーターからの3T3 細胞中のBc12またはCPP32 ペプチドの発現が腫瘍壊死因子 及びシクロヘキシミドにより誘発されるアポトーシスを抑制することができるこ とを示した。アポトーシスについて分析するための固定細胞のプロピジウムヨージド染色：(S herwood 及びSchimke，Methods in Cell Biology．48: 77-87．1995) MFGLacZ、Bcl2、またはCPP32で一過性感染した3T3 細胞を上記のようにして塗 布し、TNF/CXH で処理し、上記のようにして回収し、洗浄した。次いで細胞を４ ℃のPBS 中70％のエタノール中で再度懸濁させ、４℃で一夜保った。FACSに供 する時、細胞を以下のようにしてプロピジウムヨージドで染色した。細胞を10秒 間14,000 RPMで回転させ、PBS/BSA で１回洗浄した。次いで細胞を染色溶液(10m g/ml プロピジウムヨージドとともに50mg/ml RNaseA(無DNase)を含むPBS)50ml中 で再度懸濁させ、37℃で少なくとも１時間インキュベートした。次いで細胞をペ レットにし、10mg/ml プロピジウムヨージドを含むPBS/BSA 溶液中で再度懸濁さ せ、FACS染色により分析した。結果は、3T3 細胞中のBCL2またはCPP32 ペプチド の発現が細胞のPI染色により測定して腫瘍壊死因子及びシクロヘキシミドにより 誘発されるアポトーシスを抑制することができることを示し、本発明者らの先の 結果を拡張した。細胞形態学を研究するためのBAF3細胞のエチジウムブロミド／アクリジンオレン ジ染色 BAF3細胞を無インサート(WIN)またはLacZ(ZIN)、Bcl2(BIN)、CPP32ペプチド(C IN)、もしくはスクランブルしたペプチド対照(PIN)をコードするＤＮＡを含むWZ L IRES NEOレトロウイルスベクターで感染させた。細胞を上記レトロウイルスベ クターによる感染後にG418中で選択し、生存細胞を５mg/ml FAS 抗体で刺激した 。刺激後、細胞をエチジウムブロミド及びアクリジンオレンジ（夫々、２mg/ml) で染色し、紫外線フィルターを使用して蛍光顕微鏡のもとに視覚化した。250 の 細胞をカウントし、アポトーシスである細胞の％を計算した。TNF/CXH で刺激し た3T3 細胞で得られた結果と同様に、CPP32 をコードするベクターはFAS誘発ア ポトーシスを抑制することができる。また、ペプチド対照はBCL2またはCPP32 ペ プチドで見られた効果のほぼ半分のこの系中の効果を有していた。CPP32 活性の酵素アッセイ ：CPP32 アッセイキット：クロンテクCPP32 比色アッ セイキット（カタログ番号K2027-2): 3T3 細胞をパートＩ、節Ｃに記載されたベクターで感染させ、アッセイの前に G418培地中で選択した。集密付近の3T3 細胞の６ウェルプレートを上記のように してTNF/CXH で刺激し、以下のようにして刺激後30分、１時間、２時間及び４時 間で回収した。細胞をトリプシン処理し、上記のようにして回収した。エッペン ドルフ管に移した後、細胞を回転させ、冷却した細胞溶解緩衝液50ml中で再度懸 濁させた。細胞を氷の上で10分間インキュベートし、次いでDTT を含む2X反応緩 衝液50mlを夫々の管に添加した。比色結合基質(DEVD-パラニトロアニリド、最終 濃度50mM) 5mlを夫々の管に添加し、37℃で30分間インキュベートした。サンプ ルを96ウエルプレートに移し、405 のO.D.で分光光度計で読み取った。結果は、 WIN 細胞からの細胞抽出物が比色検出可能な形態pNA へのDEVD-pNA基質の開裂に より測定して２時間でCPP32 酵素活性を増大したことを示した。４時間までに、 細胞は死滅し始め、その活性が低下される。BCL2またはCPP32 ペプチドインヒビ ターを含む細胞では、活性のこの上昇は見られない。BCL2の場合、それは酵素の 上流のアポトーシスのためであるべきである。CPP32 インヒビターペプチドでは 、それは酵素活性の直接の抑制のためであるべきである。これらのin vitroの結 果は上記の細胞死滅アッセイで見られた結果と一致する。PKC インヒビターを使用する局在化研究 マウス10T1/2クローン８細胞を、細胞質から核へのPKC のトランスロケーショ ンを生じることが知られているPMA で刺激した。このトランスロケーションは作 用の部位でRAC(活性化タンパク質キナーゼＣのレセプター)タンパク質と称され るタンパク質への結合により媒介されると考えられる。未感染クローン８細胞を 、Flu-エピトープ(MGGGYPYDVPDYAGSLZ)標識スクランブルペプチド対照またはイ ンヒビターペプチド(GKQKTKTIKGPP)（これは全てのPKC イソ酵素のC2領域と同じ である）をコードする配列を含むpBabe puroレトロウイルス構築物で感染された 細胞と比較した。次いで本発明者らはPKCaに特異性の抗体を使用して免疫組織化 学により細胞を分析し、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合された二次 抗体で視覚化した。 この実験を以下のようにして二つの異なる細胞密度で行った。 1.細胞を22mm平方のポリリシン被覆カバースリップに2,000 の細胞/cm2で塗布し 、２日間増殖させた。3/20で、細胞は集密付近であった。細胞を低密度で再度塗 布し、3/27で同じ条件で分析した。 2．PMAを37℃で30分間にわたって培地に10-5Mで添加した。 3.細胞をSCB 緩衝液（使用前に37℃に前もって温めた生理緩衝液）ですすぎ、次 いで37℃で20分間にわたってSCB 緩衝液中3.7％のグルタルアルデヒドに入れた 。 4.次いで細胞をSCB 緩衝液中で洗浄し、室温で10分間にわたってSCBT(0.1％のト リトンX-100を含むSCB)とともにインキュベートした。 5.カバースリップを６ウェルプレートから除去し、室温で0.1％のトゥイーン／P BS 中で浸漬洗浄し、カバーされた容器中のパラフィルムの上に置いた。 6.カバースリップを保湿環境中で室温で攪拌しながらPBS 中1.5％のヤギブロッ キング血清とともにインキュベートした。 7.溶液をカバースリップから吸引して除き、次いでカバースリップをPBS で洗浄 した。一次抗PKCa抗体をカバースリップの上に置き、上記のようにして室温で30 分間インキュベートした。抗体の1:500 希釈液を全ての実験に使用した。 8.次いでカバースリップをPBS で３回洗浄し、次いでサンタ・クルーズABC イム ノステイン・システムズ・キット中に用意されたビオチン結合第二工程抗体とと もに室温で30分間インキュベートした。 9.次いでカバースリップを室温で30分間にわたってアビジンビオチン酵素試薬（ キットとともに供給された）中でインキュベートした。次いでカバースリップを ６ウェルプレートにもどして置いた後PBS 中で10分間洗浄した。 10．カバースリップを0.5％のトリトンX-100/PBS で30秒間すすぎ、DBA 溶液中 で５分間インキュベートした。反応をウェルへの蒸留水の添加により停止した。 11．次いでカバースリップをアルコール及びキシレンで脱水し、パーマネントで スライドに取付け、視覚化し、光学顕微鏡により写真撮影した。 結果は、基本的に、対照クローン８細胞が主として細胞質染色及び核周囲の染 色を示し、一方、PMA 誘導細胞が核酸へのトランスロケーションを一定に示すこ とを示した。スクランブルペプチドをコードする構築物で感染された細胞は同様 の染色を示した。PKC のC2領域と同じペプチドをコードする構築物で感染された 細胞は対照及びPMA 誘導細胞の両方で主として細胞質染色及び核周囲の染色を示 し、このペプチドがPMA による細胞の刺激後に活性化PKCaからそのRAC タンパク 質のトランスロケーションを特異的に抑制することができることを示唆した。ま た、同様に感染された細胞を使用して遺伝子活性に対するペプチド発現の下流の 結果を見ることが可能である。細胞を、PKCb2.1、PKC2.1ペプチド、優性の陰性r as タンパク質対照、これらのウイルスの組み合わせを発現するレトロウイルス で感染させ、またはウイルスで全く感染させなかった。細胞を1O0ng/mlのPMA、P DGF-AA、またはPDGF-BB で刺激した。ｍＲＮＡを調製し、ノーザンブロットをfo s 遺伝子発現（PKC活性化により誘発された）または負荷対照ｍＲＮＡ（その発 現はPKC により誘発されたシグナリング系により作用されないことが知られてい る）であるリボソームタンパク質POについて行った。PKC ペプチドはfos 遺伝子 ｍＲＮＡの発現を著しく低下し得る。実際に、予期しない結果は、或る条件下で 、ｍＲＮＡ発現の活性化があることであった。この後者の結果は、新規な結果が 細胞内のペプチドの発現後に生じ得ることを確認する。 実施例２ pBabe Puroレトロウイルスライブラリー及びアポトーシス 一連のレトロウイルス構築物を標的細胞集団内のランダム化かつバイアス化ペ プチドの発現のために設計した。ペプチドはレトロウイルスプロモーターから発 現される。翻訳単位は幾つかの重要な成分を有する。アミノ末端のイニシエータ ーメチオニンの後のグリシンはペプチドを安定化し、VarshavskyのＮ末端ルール に従って、細胞質半減期を増進する。幾つかの構築物において、９アミノ酸flu エピトープ標識がとり込まれて、エピトープのモノクローナル抗体を使用するこ とにより、希有ペプチド及びそれがアフィニティーを有するあらゆる分子の共沈 を可能にした。グリシンはランダム／バイアス化発現産物をコードする領域の前 後にコードされて或る種の分子可撓性を与える。二つのカルボキシ末端プロリン がコードされてカルボキシペプチダーゼに対する安定性を与える。 大きなライブラリーの構築のために、２種のプライマーをつくった（図１に図 示される）。ランダムペプチドプライマーと称される第一プライマーは、1)ベク タープライミングのための相補領域、2)上記領域、及び3)ランダムまたはバイア ス化発現産物領域からなり、長さ10アミノ酸のペプチドをコードする30塩基配列 として表された。加えて、本発明者らはランダム領域の微量欠失または挿入の場 合に全ての三つの読み取り枠中に終止コドンを挿入した。プライマーの設計は殆 どの読み取り枠中のグリシン／プロリン終結を確実にする。第二プライマーはベ クター中の下流であり、特異なNotI部位を含むプラスミドの領域を開始する。こ れらのプライマーは、夫々が異なるペプチドを夫々潜在的にコードする異なるヌ クレオチド配列を含む、フラグメントのライブラリーをつくるのに使用される。 フラグメントのこれらのファミリーをプロマイシン選択配列、３'LTR、及びバク テリア複製起点を含むベクターフラグメントにつなぐ。次いで結合産物をE.coli にエレクトロポレーションし、ＤＮＡを得られたライブラリーから調製する。こ の技術を使用して、本発明者らは2 x 108までの特異なインサートを有する独立 のランダムライブラリーを構築した。多数の個々のインサートの配列決定は、そ れらがプライマー１により特定された構造を有し、コードされたペプチドがラン ダムであることを実証する。こうしてつくられたこのようなライブラリーは合計 1013の予想ペプチドのサブセットを含む。レトロウイルスペプチドライブラリーの生成 pBabe Puroベクター中でペプチドライブラリーを生成するためのスキームが図 ２に示される。PCR 用のプライマーを合成し、通常のプロトコルに従って精製し 、脱保護した。pBabe Puroレトロウイルス構築物中のポリリンカー配列に相補性 のプライマー１は配列５' GCT TAG CAA GAT CTC TAC GGT GGA CCK NNK NNK NNK NNKNNKNNK NNK NNK NNK NNC CCC ACT CCC ATG GTC CTA CGT ACC ACC ACA CTG GG 3'を有する。Ｎはその四つの塩基のいずれかを表し、ＫはＧまたはＴに限定さ れる。プライマー２は配列5'GCT TAG CAA GAT CTG TGT GTC AGT TAG GGT GTG G3 'を有し、pUC18 複製起点内の配列に相補性である。プライマー１、プライマー ２、鋳型としてのpBabe Puro、及びBarnes(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91,2 216-2220 頁に記載された128 Taq：１ディプ・ベントの比のTaq DNAポリメラー ゼ（プロメガ）とディープ・ベントＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド ・バイオラブズ）の混合物を使用して、PCR を８ラウンドにわたって行った。増 幅PCR 産物を精製し、制限酵素Bgl II及びNot I(プロメガ)で消化し、再度精製 し、pBabe Puroの相当するBam HI-Not Iフラグメントとつないだ。形質転換後に 、得 られたライブラリーは約2x108 のクローンを含み、その80％より多くがインサー トを含んでいた。pMSCV-PC 及びpBabeMN-PCレトロウイルス構築物ライブラリー オリゴヌクレオチドを合成し、通常のプロトコルに従って精製した。“ライブ ラリー”オリゴヌクレオチドは配列5'CTG GAG AAC CAG GAC CAT GGG C(NNK)10GG G CCC CCT TAA ACC ATT AAA T3'または5' CTG GAG AAC CAG GAC CAT GGG CNN K NN KNN KCC TCC CNN KCC TNN KNN KGG GCC CCC TTA AAC CAT TAA AT3'を有する 。そのライブラリーオリゴヌクレオチドの3'末端に相補性の第三オリゴヌクレオ チド（“コンスタント”）は配列5' TCA TGC ATC CAA TTT AAT GGT TTA AG3'を 有する。図３に示されるように、夫々のライブラリーオリゴヌクレオチドはコン スタントオリゴヌクレオチドにアニールされ、シーケナーゼ（米国バイオケミカ ル）またはクレノー（プロメガ）で二本鎖ＤＮＡに変換され、制限酵素Bst XI（ ニュー・イングランド・バイオラブズ）で消化され、精製され、適当なBst XI消 化レトロウイルス構築物とつながれる。形質転換効率はつながれたＤＮＡ１マイ クログラム当たり約2x108クローンであり、その90％より多くがインサートを含 む。代表的なレトロウイルスが図４に示される。また、下記のレトロウイルスヌ クレオチド配列を参照のこと。呈示構築体を含むレトロウイルスベクター ファクター依存系のペプチドライブラリー感染およびアポトーシス−耐性系の派 生 該Baf/3 細胞系は、IL-3の不在下で急速なアポトーシスを生ずるIL-3依存性細 胞である。従って、このことが、優性エフェクタペプチドに関して魅力ある細胞 系としている。アポトーシスを阻害するペプチドを発現する細胞は、死細胞のバ ックグラウンドに対して容易に選別される。我々は、この細胞系をペプチド選択 性を立証するためのモデルとして選択する。 5x108 個の立のペプチド挿入断片を含むレトロウイルスライブラリーを、BOSC 23細胞にトランスフェクションし、適当な力価5x105 /mlを有するレトロウイル スに変えた。12mlのウイルス上澄を用いて、6x108 Baf/3 細胞を感染させた（個 々の感染において、1x106 細胞の感染当たり2ml）。IL-3の存在下で、感染後３ 日間成育させて、レトロウイルスの組み込みおよびペプチド発現させた。３日後 に、IL-3を取り出し、該細胞を２週間成育させた。２週間後、６ウエル中の１ウ エルは、IL-3の不在下で生存する細胞を派生し、アポトーシス−阻害性ペプチド の存在を示した。このようにして誘導されたペプチドは、正の優性によるIL-3独 立性を生じ（即ち、IL-3の正の調節性を模倣または阻止し）または阻害（即ち、 IL-3の取り出しの際に該アポトーシス過程を阻害）することにより、IL-3独立性 を生じることができる。実施例３:pMSCVpc ベクターの構築およびアポトーシス 該レトロウイルスベクターpMSCVpc を、コザック(Kozak)翻訳開始配列をコー ドする配列、ライブラリー挿入断片をクローニングするためのBstXl サイト、Nr utおよびXholサイト並びに全体で３つの読み取り枠中の終止コドンを含む挿入断 片を、pMSCV neo のEcoRI およびBamHI サイトにクローニングすることにより調 製した。BstXl 制限消化 200μgのpMSCVpc ベクターDNA を、全体積400μｌ中で、40μ１の10x NEバッ ファー(NEBuffer)3および30μlのBstXl(10単位／μl)と併合した。このサン プルを55℃にて一夜インキュベートし、フェノール抽出し、Xholで消化し、次い で10、15、20および25% の酢酸カリウム溶液を使用した、酢酸カリウムによる段 階的勾配により精製した。このDNA を、40% の回収率で沈殿させた。ライブラリー挿入断片の調製 オリゴヌクレオチド合成 以下の配列をもつオリゴヌクレオチド(OL)を合成した。 OL-1：5'-CTG GAG AAC CAG GAC CAT GGG CAA GAG AAA GGG CGA TGA GGT GGA TGG AGT GGG GCC CCC T TA AAC CAT TAA AT-3' この下線を施した領域は、配列：MGKRKGDEVDGVGPP を有するペプチドをコードす る。このペプチドは、レトロウイルスを含む細胞内で発現された場合に、Fas-媒 介およびスタウロスポリン(Staurosporin)誘発アポトーシスを阻害することが示 された。 OL-2：5'-CTG GAG AAC CAG GAC CAT GGG CAA GAG AAA GGG CNN KNN KNN KGA KNN KGT GGG GCC CCC TTA AAC CAT TAA AT-3' 可変領域:N＝A，C，G，T（等モル）;K=G，T（等モル） 各コドンのＫ位置のＧまたはＴへの限定は、終止コドンの生成およびコドン利 用傾向(bias)を減ずる。下線を施した領域は、配列MGKRKGXXXD/EXVGPP をもつラ ンダム化ペプチドをコードする。 OL-3P5'-TCA TGC ATC CAA TTT AAT GGT TTA AG-3' OL-3の15個の3'-塩基は、OL-1およびOL-2の15個の3'-塩基に対して相補的であ る。 OL-1およびOL-2は１μＭの規模で合成し、一方でOL-3は標準的な40nM規模で合 成した。全てのオリゴヌクレオチドは、製造業者（アプライドバイオシステムズ (Applied Biosystems)等の指示に従って、トリチル化処理、脱保護およびOPC カ ラム上で精製することにより合成した。各オリゴヌクレオチドを、EDTAを含まな い10mMのトリス(Tris)200 μl、pH 8.5中に再懸濁した。そのDNA 濃度は260 nm における吸光度を測定することにより決定した。 PCR を、50pMのOL-1またはOL-2および50pMのOL-3を使用して実施した。フェノ ール抽出およびエタノール沈殿を実施し、得られたDNA を、エチジウムブロミド 染色と共に、10% の未変性の10% アクリルアミドゲル上で泳動させた。 これらサンプルを定量し、連結し、標準的方法(Current Protocols in Molecu lar Biology,第1.8.4章参照)を利用して、エレクトロコンピーテント(electroco mpetent)TOP10F E．コリ(インビトロゲン(Invitrogen))にエレクトロポレーショ ンした。テスト形質転換はpUC DNA１μｇ当たり、形質転換体5x109 を生成した 。形質転換後、該形質転換効率は、LB-ampプレート(100μg/mlアンピシリン)に 希釈液をプレーティングし、生存コロニーを計数することにより決定した。OL-2 から生成した該ライブラリー挿入断片に対して、連結における4:1 なる挿入断片 ：ベクターモル比は、該連結で使用したベクターDNA 1μｇ当たり3.98x107形質 転換体なる形質転換効率、およびベクター１μｇ当たり4.8x107 個の形質転換体 なる大規模形質転換効率を与えた。該ベクターのみによる連結は、40倍も少ない 形質転換体を与えた。OL-1挿入断片の連結による形質転換由来の10コロニーを採 取し、培養し、そのDNA を調製し、配列決定して、正確なクローンを同定した。 該OL-2ライブラリーSOC/形質転換混合物の残りを、500 μｌのLB-amp(100μg/ mlアンピシリン)中に接種し、振盪しながら(300rpm)、37℃にてインキュベート した。該ライブラリー培養物の、Abs500を追跡した。該培養物が0.8(約５時間) なるAbs600に達した時点で、100 μｌを取り出し、ペレット化し、10mlのLB/15% グリセロール中に再懸濁し、lmlのアリコート内で-80℃にて保存した（0.8なるA bs600は約109 細胞/ml なる細胞濃度に等しい。従って、4.8x107 を含むライブ ラリーについては、各凍結アリコートは200 個のライブラリー当量を含むであろ う）。ライブラリーの多様性の分析 上でプレーティングした生存コロニーを、PCR によりスクリーニングし、プラ イマーで該縮重領域をフランキングして、挿入断片を含むクローンの割合を決定 した(>90%)。８個の挿入断片−含有クローンを採取し、該縮重およびフランキン グ非−縮重領域のヌクレオチド配列を決定した。各ヌクレオチドは、約25% の頻 度でＮ位置に示され、一方ＧまたはＴ（ＡまたはＣではない）は約50% の頻度で Ｋ位置に示された。該縮重領域に生成した終止コドンの頻度も、この方法で測定 できる。ライブラリーレトロウイルスの発生およびジャーカット細胞の感染 第０日目：トランスフェクション用のフェニックスレトロウイルスプロデューサ ー(Phoenix Retrovirus Producer)細胞の調製：トランスフェクションの18-24時 間前に、フェニックス細胞を、プロデューサー細胞成長培地(DMEH:10% FCS，1% のペニシリン-ストレプトマイシン，1%グルタミン)中で、60mmのプレート当たり 1,500,000~2,000,000 細胞あて均一にプレーティングした。細胞を20時間に渡り 、該プレート上に付着させた。 第１日目：一時的なトランスフェクション：トランスフェクションの時点で70-8 0%密集しているフェニックス細胞を、最高のトランスフェクション頻度で得る。 HBS(2XHBS=8.OgのNaCl，6.5gのHEPES,10mlのNa2HPO4母液(500mlの水中に5.25gの 二塩基),pHは７に調節され、最終体積500 mlであり、最終pH7に調節されたもの ）中で、該フェニックス細胞に適用するために、該DNA を調製した。トランスフ ェクションの約５分前に、クロロキン（シグマ(Sigma)社）を、25μＭまで各プ レートに添加した（クロロキン母液はddH2O 中50mM; 3ml の培地+1mlDNA，２μ ｌを添加）。15mlの円錐型管に以下のものを添加した(6cmプレート当たり，全体 で５プレート，全ての試薬は室温にある)。 ５μｇのライブラリーDNA(DNAは管の側壁に１滴添加した) １μgのpMSCVpc lacZウイルスベクター 438μlのddH2O(DNA は、管の底で、水で洗浄した) 61μｌの2MCaCl2(Mallinkrodt,カタログ#4180;水を補充，滅菌フィルタに通し て、４℃にて密に蓋をして保存) 500μｌの全体積。 サンプルを指で叩いて十分に混合した。５μgのpMSCVpc lacZおよび該OL-1ベ クターDNA によるトランスフェクションを、それぞれ負および正のコントロール として使用するために実施した。0.5ml の2xHBS を各管に素早く添加し、エジェ クトボタンを押したまま、該溶液を自動ピペッターを使用して、10秒間激しく発 泡させた（この実際の発泡時間は2xHBS の各バッチに依存する）。このHBS/DNA 溶液を、各フェニックス細胞プレート中の培地に滴下により（穏やかにかつ迅速 に）均一に分散させた。これらプレートを顕微鏡下で観測し、均一に分散された 沈殿DNAの小さな（コショウ状の）黒色の粒子が観測された。該プレートを37℃ のインキュベータに入れ、数回前後に振盪させて、該DNA/CaPO4粒子を均等に分 布させた。トランスフェクションの6-8 時間後に、該培地を３mlの新たなDMEM,1 0% FCS と交換した。この培地の交換前に、該DNA 沈殿は大きくなり、顕微鏡下 でより明確に肉眼視できた。 第２日目：第二の培地交換 トランスフェクションの24時間後に、該培地を再度３mlの新たなDMEM，10% FC S と交換した。該細胞を32℃に維持した（該ウイルスは、32℃でインキュベーシ ョンを実施した場合により安定であるが、37℃でのインキュベーションが最適で ある）。 第３日目：ジャーカットEcoR細胞の形質導入 滅菌アクロディスク(Acrodisc)0.45μシリンジフィルタ(Gelman Sciences)を1 0mlの滅菌シリンジに取付け、その注入ストッパーを無菌状態で、該シリンジバ レルから取り外した。トランスフェクションの48時間後に、該ウイルスの上澄を 該フェニックス細胞から除去し、かつ該シリンジバレルに添加した。該ストッパ ーを再度配置し、該ウイルス上澄を清浄な無菌の円錐管に滴状に押し出した。該 フェニックス細胞プレートをX-Gal 染色のために取っておいた（以下の記載参照 のこと）。ポリブレン(polybrene)を各ウイルス上澄に(Sigma;2.5mg/ml、ddH20 =500X 中；-20 にて保存）、最終濃度５mg/ml で添加し、4.5x108 個のジャーカ ットEcoR細胞（ジャーカット細胞は、エコトロピックレトロウイルスレセプタを 安定に発現する）を1400 rpmにて５分間ペレット化し、９mlの該OL-2ライブラリ ーウイルス上澄中に再懸濁させた。これらの細胞を１mlのアリコート中に分散さ せ、あるいは5x108 個の細胞を24ウエルプレートの各ウエルに入れた。1.5x108 個のジャーカットEcoR細胞を、同様に各3mlの該lacZウイルス上澄およびOL-1 ウイルス上澄で処理した。各細胞プレートをパラフィルム内に包み、マイクロプ レートキャリヤ(DuPont)に入れ、2500 rpmにて90分間、32℃にて、DuPont/Sorva 11 RT 6000B 卓上型遠心機で遠心処理した。この遠心後、該細胞を顕微鏡下で観 測した。融合したジャーカット細胞（各々5-10個の非−融合細胞程度の大きさ） を表す、大きな不規則形状の物体の存在は、上首尾の感染を示唆した。該プレー トからパラフィルムを除去し、これを32℃に維持した。更に32℃にて16時間維持 した後、該細胞は、穏やかな圧潰により各ウエルの底から剥がれ、これを15mlの 円錐状管に添加した。該管を1400 rpmにて５分間遠心処理して、該細胞をペレッ ト化した。細胞３ウエル毎に、該細胞を5mlの新たなRPMI，10% FCS 中に再懸濁 し、60mmのプレート（１プレート当たり３ウエル）に添加した。１mlの新たなRP MI，10% FCS を、該24ウエルプレート中に残されている各細胞のウエルに添加し た。プレートを37℃にて72時間維持し、この時点で、各ウイルスで形質導入した 該細胞を併合し、ジャーカット細胞のアリコートをX-Gal で染色した。末使用の ウイルス上澄を、後の形質導入のために-80℃にて保存したが、その力価は各凍 結−解凍サイクルに対して1/2 に低下した。トランスフェクション効率の決定 トランスフェクションしたフェニックス細胞および形質導入したジャーカット 細胞両者をX-Gal で染色して、該トランスフェクションおよび形質導入効率を評 価した。上記のような、該pMSCVpc lacZウイルスベクターおよび該ライブラリー ウイルスベクターによる同時のトランスフェクションの目的は、トランスフェク ションおよび形質導入の間接的評価を可能ならしめることであった。溶液の調製 ：PBS/0.10% グルタルアルデヒド。グルタルアルデヒド母液（Sigma カタログ#G 5882）は25% または250X溶液である；染色母液：i）300mM/25Xフェロシアネート 溶液；25.3gのK4Fe(CN)6.3H2O(Mallinckrodt)+2.48gのMgCl2(Sigma)，200 mlの H20中；４℃にて保存；ii）300mM/25X のフェリシアネート溶液，19.75gのK3Fe( CN)6(Sigma)+2.48gのMgCl2，200mlのH20中；４℃にて保存；iii）X-Gal(分子プ ローブ）は、DMF 中 40mg/ml溶液として調製；暗所で-20℃にて保存；iv）１Xフ ェロ／フェリシアネート溶液；４mlの300mM/25X フェロシアネート溶液 と4 mlの300mM/25X フェリシアネート溶液とを、196mlのPBS に添加；１カ月間 まで４℃にて保存；v)活性染色溶液；各時点で細胞を染色する；100μｌの40mg/ ml X-Gal を各3mlの1Xフェロ／フェリシアネート溶液に添加する；洗浄液；フェ ニックスおよび他の接着細胞に対するPBS;ジャーカットおよび他の非−接着性細 胞に対する、PBS中の1% FCS。 該培地をフェニックス細胞の該60mmプレートから除去し、または5x105 個のジ ャーカット細胞を、15mlの円錐状管内で1400 rpmにて５分間ペレット化した。固 定液2mlを、該フェニックス細胞の各60mmプレートに添加し、またはジャーカッ ト細胞を１mlの固定液に再懸濁した。細胞を固定液中に２分間放置した。フェニ ックス細胞に対しては、固定液を注ぎだし、該細胞を３回PBS で洗浄（初めの２ 回の洗浄は迅速に、第三の洗浄では、該PBS を該細胞上に３分間放置）した。ジ ャーカット細胞に対しては、該固定液は、5-10mlのPBS/1% FCSを各円錐状管に添 加することによりクエンチングし、各管を５回転倒させ、かつ前と同様にしてペ レット化した。３mlの活性染色溶液を、フェニックス細胞の各60mmプレート上に 層状に展開させ、あるいは5x105 個のジャーカット細胞の各細胞ペレットを、１ mlの活性染色溶液中に再懸濁し、24ウエルプレートのウエルに入れた。全ての細 胞は、37℃にてインキュベートした。これらの細胞を、24時間後に顕微鏡観察し た。該フェニックス細胞のトランスフェクション効率を、視野中の青色の細胞の 割合として見積もった。該ジャーカット細胞の形質導入効率は、血球計数装置中 の青色の細胞を計数することにより評価した。５μgのlacZベクターによるトラ ンスフェクションは50% の青色のフェニックス細胞を生成した。生成したウイル スによるジャーカット細胞の形質導入は、30% の青色のジャーカット細胞を生成 した。１μgのlacZウイルスベクターの５μｇのライブラリーウイルスベクター による同時トランスフェクションは、5-10% の青色のフェニックス細胞を生成し た。生成したウイルスによるジャーカット細胞の形質導入は、3-10% の青色のジ ャーカット細胞を生成した。IgM 抗-Fasによるジャーカット細胞の選別 ヒトFas(Kamiya Biomedical 社；カタログ#MC-060)に対するCH-11 IgM 抗体の IgM 抗-Fas Aの新鮮なバッチの力価をテストして、アポトーシスの誘発の有効性 を決定した。5x105 個のジャーカットEcoR細胞を1500 rpmにて５分間ペレット化 し、１mlのRPMI/2.5%FCS+50 ng/ml，10ng/ml,2.0ng/mlおよび最終濃度0.5ng/ml のCH-11抗体の連続希釈液中に再懸濁した。抗体の各希釈液中の細胞を24ウエル プレートのウエル中に、37℃にて48時間入れ、この時点で４mlのアクリジンオレ ンジ／エチジウムブロミド(Sigma；PBS 中各々100 μg/ml；暗所で４℃にて保存 )を、氷上で100 mlの細胞に添加した。細胞を、蛍光を読み取るのに適したフィ ルタの組み合わせを使用して、20xの対物レンズの観測下で、血球数計数器によ り調べた。 ２．各サンプルからの100 個の細胞を計数し、以下の組に属する細胞数を記録し た。 1.正常な核をもつ生細胞（組織化された構造の明るい緑色のクロマチン） 2.初期アポトーシス(EA;著しく凝結されまたは断片化された明るい緑色のクロマ チン) 3.末期のアポトーシス(LA;著しく凝結されまたは断片化された明るいオレンジ色 のクロマチン) 4.壊死性細胞(N；組織化された構造の明るいオレンジ色のクロマチン) ％アポトーシス細胞は、EA+LA/計数した全細胞数x100として計算した。CH-11 抗 体10ng/ml使用して、ジャーカットEcoR細胞の>95%アポトーシスを立証した。ライブラリー−発現ジャーカットのIgM 抗-Fas選別 9.6x106個のOL-2ライブラリー−形質導入されたジャーカット細胞をペレット 化し、96mlのRPMI/2.5％FCS+10 ng/mlCH-11 抗体中に再懸濁した。1x105 個の細 胞を含む１mlのアリコート中の細胞を、４つの24ウエルプレートの各ウエルに分 配した。4.8x106 個のlacZ−形質導入されたジャーカットおよびOL-1−形質導入 されたジャーカットを同様に処理し、各々２つの24ウエルプレートのウエルに分 配した。プレートは37℃にて５時間維持した。該プレートを、毎日バクテリアま たは酵母による汚染についてチェックした。任意の汚染されたウエルから、細胞 を取り出し、2mlの10N Na0Hを空のウエルに添加して、他のウエルへの汚染の広 がりを減じた。2-3 日後の顕微鏡観察では、全くまたは殆ど生きた細胞は観測さ れず、このことは、栄養分が全く枯渇していないことを示す、該培地の赤色によ り確認された。最初のIgM 抗-Fas処理の５日後に、１mlのRPMI/20%FCS を各ウエ ルに添加した。該細胞を37℃にて、更に10-14 日間放置した。該プレートを頻繁 に汚染についてチェックし、上記のように処理した。RPMI/20％FCS を添加した1 0日後に、該OL-1−形質導入した細胞の殆ど全てのウエルが、細胞の生きたコロ ニーを含んでおり、このことは栄養分に枯渇した培地のオレンジ色により確認さ れた。lacZ−形質導入した細胞の全てのウエル中の培地は、赤色のままであり、 該ウエルの何れにおいても、細胞の成育は殆ど観測されなかった。該OL-2ライブ ラリー−形質導入した細胞の選択されたウエルは、生細胞および栄養分に枯渇し た培地を含んでいた。次の２週間の間に、有意な細胞成長が起こった全てのウエ ルから細胞を取り出し、該細胞を直接顕微鏡下で観測することにより評価し、か つ該細胞培地の栄養分の枯渇の増大を監視した。各ウエルからの細胞を、５mlの 新たなRPMI/10%FCS 中に再懸濁し、50mmの皿中で、37℃にて2-3日間放置した。RNA の単離 OL-2ライブラリー−形質導入ジャーカット細胞の各生存ウエル集団から（17ウ エル）、同様にOL-1−形質導入細胞の５つの生存ウエル集団から、製造業者のプ ロトコール(Boehringer-Mannheim，カタログ#1 787 896)に従って、mRNAキャプ チャーキット(capture Kit)を使用して、RNA を単離した。簡単に説明すれば、 各皿からの5x105 個の細胞を、1400 rpmにて５分間、エッペンドルフチューブ内 でペレット化し、PBS で２回洗浄し、200 mlの溶解バッファー中に再懸濁し、１ mlのシリンジに取り付けられた21ゲージの針に６回通して剪断させた。ビオチン 処理したオリゴ(dT)20の1:20希釈液2mlを各サンプルに添加し、３分間37℃にて インキュベートした。この混合物を各チューブから取り出した。各チューブを３ 回200mlの洗浄バッファーで洗浄した。また、90%FCS/10%DMSO中の細胞は、各々1 x106 個の細胞を含む１mlのアリコートとして、液体窒素中で保存した。選別された細胞からのペプチドーコード挿入断片のRT PCRレスキュー PCR を、チタンTitan)TM RT-PCRシステム(Boehringermannheim，カタログ#1 8 55 476)を使用し、２つのプライマーを使用して実施した。5'pBL プライマーは 配列：5'-GAT CCT CCC TTT ATC CAG-3'を有し、全てのpMSCVpc をベースとする ベクターおよびレトロウイルスmRNAのヌクレオチド1364-1381に対して相補的で あり、該クローン化された挿入断片の丁度上流側にある。3Aプライマーは配列： 5'-CTA CAG GTG GGG TCT TTC-3'を有し、全てのpMSCVpc をベースとするベクタ ーおよびレトロウイルスmRNA中の配列に対して相補的である。リクローニングによりレスキューされたペプチドーコード挿入断片 各PCR-レスキューされたサンプルを、フェノールクロロホルムで抽出し、エタ ノール沈殿させ、25mlの10mMTris、pH 8.5中に再懸濁した。３mlの非変性DNA ゲ ルを担持した染料を、10mlの各サンプルに添加し、オリゴヌクレオチド定量標準 物質および10塩基対ラダーを含む、10% アクリルアミドミニゲル上を、上記のよ うに泳動させた。各レーンは、予想された分子量216 塩基対をもつ、一つの顕著 なバンドおよび小さなバックグラウンドバンドを含んでいた。各サンプルの重量 モル濃度は、前と同様にNIH イメージ(NIH Image)を使用して定量した。各サン プルをBstx1 による制限消化に付し、フェノール抽出し、エタノール沈殿させ、 25mlの10mMTris、pH 8.5中に再懸濁させた。これらの精製されたサンプルを10% アクリルアミドゲルに担持させ、上記のように定量した。全てのサンプルが55塩 基対の、該制限消化挿入断片に対して予想された分子量をもつ顕著なバンドと、 該制限酵素により除去された、該レスキューされたDNA 挿入断片の末端の各々に 対応する、100 塩基対および51塩基対のバンドを含んでいた。各制限消化され、 PCR レスキューされた挿入断片を、4:1 なる挿入断片／ベクターモル比にて、10 0ngのpMSCVpc ベクターDNA と連結し、沈殿させ、かつ前と同様にエレクトロ形 質転換(electrotransformed)した。各形質転換に対して生存コロニーを、該5'pB L および3Aプライマーを使用して、PCR スクリーニングした。各形質転換に対し て、８〜10挿入断片含有コロニーを、一夜培養し、その培養物をプールし、かつ 一回の微量DNA調製を各プールに対して実施した。 Fas-選別ペプチドクローン：全てのペプチドは配列：MET GLY LYS ARG LYS GL YXXX XXX XXX D/E XXX VAL GLY PRO PRO を有する。該XXX XXX XXX D/E XXXアミ ノ酸のみを上に記載し、各DNA 配列を下に記載する。 第一のライブラリー選別ウエルから： L1B3の個々のクローン，Fas-選別第二のライブラリー選別ウエルから： L2A5の個々のクローン，Fas-選別実施例３：pBabe ピューロ(puro)ペプチドライブラリーにより形質導入された NIH 3T3 細胞のスタウロスポリン選別A. ライブラリーの構築 ：該pBabe ピューロランダムペプチドライブラリーの構築 は、本特許の初めに記載した。該ランダム化ペプチドは以下の配列：MGXXXXXXXX XXGGPPを有する。このライブラリーの多様性はDNA 挿入断片レベルで、2x108 で ある。B. ライブラリートランスフェクション ：トランスフェクションを、Fas-選別につ いて記載したように、但し107 個のフェニックス細胞を含む15cmのプレート内で 実施した。該DNA 溶液を、50μｇのライブラリ−DNA、５μｇのlacZベクター、4 340μｌのddH2O、610μｌの2MCaCl2および5000μｌの2xHBS からなる、各プレー トに添加した。C. ライブラリー形質導入 ：形質導入の24時間前に、2x107 個のNIH 3T3細胞を、 各々10個の15cmプレート中の、25mlのDMEM、10% 子牛血清中にプレーティングし た。5mlのライブラリーウイルス上澄を各プレートに添加（前と同様にポリブレ ンを追加）した。形質導入の24時間後に培地を25mlの新鮮なDMEM、10% BCS に交 換した。細胞を、形質投入の48時間後にX-gal で染色した。この形質導入効率は 40-50%であると見積もられた。D. スタウロスポリン選別 ：ストレプトマイセス(Streptomyces)sp.由来のアルカ ロイドであるスタウロスポリンは、ATP サイトに結合するタンパクキナーゼの、 強力な広いスペクトルを有する阻害剤である。血清を含まない培地中の１μＭの スタウロスポリンのNIH 3T3 細胞への添加は、24時間以内に>90%のアポトーシス を誘発した。この誘発率は、該Fas 選別について記載したように、エチジウムブ ロミド／アクリジンオレンジによる二重染色によって決定した。 2x106 個のライブラリー形質導入されたNIH 3T3 細胞を、各々10個の15cmプレ ートにプレーティングした。細胞を24時間付着させ、この時点でスタウロスポリ ンを、血清を含まないDMEM中に１μＭまで添加した。lacZ−形質導入したNIH 3T 3細胞およびBCL-2-形質導入したNIH 3T3 細胞を、それぞれ負および正のコント ロールとして使用した。スタウロスポリン処理の24時間後に、該培地を25mlの新 鮮なDMEM、10% BCS で置換した。この培地を１週間に渡り、２日毎に、生存細胞 が健全であると思われる（典型的な3T3 の形態）まで交換した。この時点で血清 を含まない培地中の１μＭのスタウロスポリンを再度添加した。培地洗液を前と 同様に、DMEM、10% BCS で置換した。Stp 処理を、全体として３回の処理に対し て、再度実施し、この時点で生存しているライブラリー形質導入細胞の数は、la cZ形質導入細胞よりも大きいが、BCL-2-形質導入細胞よりも小さいように思われ た。E. モロニー転移 ：該第二のスタウロスポリン処理後、各プレートからの生存細胞 のアリコートを、野性型のモロニーマウス白血病ウイルス上澄（フェニックス細 胞を該レトロウイルスベクタ−pZapでトランスフェクションすることによって生 成）で感染させた。このウイルスを、１週間（2-3 日毎に該細胞の再−プレーテ ィング）に渡り、該培養物を介して増殖させた。細胞を前と同様にプレーティン グし、RNA の単離およびPCR レスキューに進む前に、スタウロスポリンで処理し た。F.RNA の単離 ：各プレートにおいて生存している細胞のアリコートを、90% FCS 、10% DMEMに再懸濁し、液体窒素中で保存した。RNA をトライゾール(Trizol)試 薬（Gibco BRL，カタログ#15596-026）を使用して調製した。簡単に言えば、１m lのトライゾール試薬を添加し、10cm2の細胞単層とし、５分間室温にてインキュ ベートした。細胞溶解物を15mlの円錐状チューブに移した（注：この時点では、 特にDEPC処理溶液およびガラス製品を使用した）。0.2mlのクロロホルムを、使 用した１mlのトライゾール試薬につき添加した。チューブを15秒間振盪し、３分 間室温にてインキュベートし、12000xg で、15分間４℃にて遠心分離した。この RNA 含有上部水性相を取り出し、使用した１mlのトライゾール当たり0.5mlのイ ソプロパノールを、初期均質化のために添加した。サンプルを室温にて10分間混 合かつインキュベートし、次いで前と同様に、遠心分離処理した。上澄を取り出 し、得られたRNA ペレットを、75% エタノールで洗浄(１mlのトライゾール当た り１ml)した。このサンプルを攪拌し、7500xgにて５分間４℃にて遠心分離処理 した。このRNA ペレットを10分間風乾し、RNase を含まない水中に再懸濁し、10 分間60℃にてインキュベートして、該ペレットを溶解させた。RNA 濃度は260 nm における吸光度を測定することにより決定した。G.PCR レスキュー ：PCR レスキューは、プライマー5'pBL およびSV40ダウン(dow n)を使用してFas 選別と同様に実施した。この第二のプライマーは以下の配列： 5'CTG ACA CAC ATT CCA CAG 3'を有し、該pBabe ピューロレトロウイルスベクタ ーの位置1424-1441 に対して相補的である。PCR 反応生成物をフェノール−クロ ロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、該レトロウイルスベクタ−pWZL neo と連結する前に、Bam HIおよびSalIで消化した。添付図は、代表的なPCR 生成挿 入断片の10% アクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。 レーン１：10塩基対ラダー レーン２：スタウロスポリン選別細胞集団由来の末消化PCR 挿入断片 レーン３：同一の細胞集団由来の、モロニーレスキューおよびスタウロスポリ ン選別後の、末消化PCR 挿入断片 レーン４および５：制限消化後の、レーン２および３と同一H. 二次的スクリーニング ：レスキューされた挿入断片を含む、pWZlneo ベクター をフェニックス細胞にトランスフェクションし、得られたウイルスを、NIH 3T3 細胞の形質導入のために使用した。 RNA 調製およびPCR レスキュー前に、スタウロスポリン選別を、前と同様に３ 回繰り返した。I. 最初の９個のスタウロスポリン選別正の配列： 最初の正の９種の配列は以下の通りである。2P1 の配列 4P1 の配列 5P1 の配列 6P1 の配列 7P1 の配列 8P1 の配列 9P1 の配列 10P1 の配列 実施例４：シクナリング(Signaling)におけるNF-kB およびNFATの利用 NFkB/IKB複合体は、古典的な前−炎症性第二メッセンジャー系であり、多数の 前−炎症性過程およびサイトカインの正の調節因子として関与することが知られ ている。これらはIL-1、IL-5、IL-8およびTNF-αを包含するが、これらに限定さ れない。また、抗−炎症性インターロイキン、例えばIL-4は滑液線維芽細胞にお けるNF-kB の直接的ダウンモジュレーション(downmodulation)およびIL-6生産の 付随するダウンレキュレーションに導く可能性がある。該NF-kB/IKB 複合体は、 広範な、急性段階の、迅速応答性、翻訳活性化系である。これは多くのテストし た細胞型において機能するが、細胞の型および開始刺激の性質に依存して異なる 結果に導く。NF-kB の活性化因子はLPS、TNF-α、IL-1、Ｔ細胞活性化の誘発物 質、タンパク合成阻害剤、ホルボールエステル、およびａ-IgM を包含する。他 の誘発物質はウイルス、例えばアデノウイルス、HTLVI、サイトメガロウイルス 、センダイウイルス、および単純庖疹Ｉ、細胞損傷を引き起こす薬物、例えば紫 外線およびパーオキサイド、およびホスファターゼ阻害剤、例えばオカダイック 酸(okadaic acid)を含む。これらの誘発物質はPKA およびPKC-依存性経路、二本 鎖RNA 依存性キナーゼ、というのは他の経路を介して作用する。NF-kB の薬理的 調節因子、例えばサリチレート類およびグルココルチコイドは、IKB-αの劣化を 防止することにより作用し、あるいはIKB-αのアップレギュレーション(upregul ation)および定常状態レベルに導き、結果としてこの決定的なファクタの活性化 を阻止するように作用する。 NF-kB(k 遺伝子座のＢサイトに結合する核ファクタ）は、IKB(NF-kB の阻害剤 ）と複合化した不活性化形態で、多くの細胞の細胞質中に存在する。細胞の受け 取 る幾つかの刺激因子は細胞性シグナリングメカニズムによって処理され、IKB の 特異的ホスホリル化およびその分解に組み込まれる。IKB-α機能の調節は、分子 のアミノ末端のシグナル応答エレメント(Signal Response Element：SRE)を通し て起こる。セリン残基32および36のホスホリル化は、ユビキチン化装置による該 IKB-α分子の認識、核へのNF-kB の遊離およびIKB の分解に導く。従って、IKB のホスホリル化／分解状態に依存して、NF-kB は細胞質中に維持されるか、ある いは該核に放出される。該核において、NF-kB は、多くの特徴付けされた遺伝子 の該調節領域近傍に見られる、共通DNA モチーフに結合し、そこで転写調節因子 として機能する。感染性諸疾患の観点から重要なことに、NF-kB がヒト免疫不全 症ウイルス(HIV)の主な活性化因子である。適当な誘発遺伝子は、TNF-αおよびI L-6を包含する。 生化学的に、NF-kB は、２つのポリペプチドp50 およびp65 のヘテロダイマー として定義され、これらはそれぞれ対応する分子量50および65kDを有する。p50 は未だに確立されていないメカニズムによる、105 kDプリカーサタンパクから得 られる。p65 は、IKB に対するレセプタであり、この分子を介してIKB はNF-kB に対してその阻害／調節作用を及ぼす。これらは、始原型の転写ファクタであり 、該ファクタは古典的なRel/NF-kB ファクタの大きな群を規定する。 NF-kB の該p5O およびp65 成分のクローニングは、Rel と呼ばれる一群の関連 ファクタの発見に導く。該p50 およびp65 両者はそのアミノ末端に、300 アミノ 酸のモチーフ(Rel)をもち、該モチーフは元々プロトオンコジーヌc-rel および ショウジョウバエの軸−決定遺伝子、ドーサル(Dorsal)において記載された。p5 0およびp65 によって明らかとなったポリペプチド群は、オーバーラップDNA-結 合特異性、識別組織分布、および複雑な調節現象を有し、p105(p50)はアンキリ ン−モチーフ含有Rel タンパクの代表であり、これらは細胞質で処理されて、カ ルボキシル末端を欠くより小さなタンパクとなる。p105のカルボキシ末端は、IK B に対する構造的および機能的相同性（アンキリン−モチーフをも有する）およ びシスおよびトランス両者におけるIKB-様の活性を及ぼす。p65 は分岐カルボニ ル末端をもつRel タンパクの第二の群の代表であり、これら領域は転写活性ドメ インをコードすることが示唆されている。Rel ドメインの該300 アミノ酸は４つ の需要な機能を果たす。即ち、1)該ドメインのほぼアミノ末端の1/3 におけるDN A-結合、2)該ドメインのカルボニル部分におけるダイマー化、3)アンキリン−含 有IKB-様タンパクとの相互作用、および4)該Rel ドメインの該カルボニル末端に おける核−局在化シグナル。p50 において、該Rel ドメインは、また転写活性化 ドメインをも含む。 NFAT、即ち活性化Ｔ細胞の該核ファクタ(NFAT)はＴ細胞活性化のための即時型 相応答ファクタである。サイクロスポリンA(CsA)によるNFATの阻害は、IL-2生産 の遮断および細胞の活性化の喪失に導く。NFAT、即ちＴ細胞によって行われる前 −炎症性事象の決定的な成分は、翻訳においてCsA により封鎖されるファクタで もある。NFATのクローニングに際して、これがDNA 結合に関与する分子の領域を 含み、タンパクのRel 群に対して有意の相同性をもつことが明らかとなった。構 造上の考察に基づいて、相同性の比較、および作用の類似するモード、並びに該 分子のゲノム構造は、NF-kB およびNFAT群における類似するイントロン／エキソ ン境界の存在を示しており、従ってNFATが実際に、直系であることからファクタ の該Rel 群に属し、かつbZIP群の前−炎症性転写調節因子との相互作用は、該NF -kB/bZIP相互作用に共通する規則の一般的な組に従うであろう。 我々は、NFATが、HIV-1(S．Kinoshita & G.P.N.,投稿中)の活性化におけるマ イトジェンに対する、前−炎症性応答に関与しており、またHIV-1 のNF-kB サイ トとオーバーラップしたサイトに対するNFATの結合が、この過程の原因となるこ とを示した。この研究は他の研究者の研究を啓発し、NFATが、ATF-2/Jun および GM-CSFとの相互作用において、TNF-αの活性化を調節できる。興味深いことなが ら、NFATはまた、マスト細胞のIL-4、前-炎症性サイトカインの重要な調節因子 、例えばIL-1β、TNF-αおよびIL-6の遊離の調節にも関与しているものと考えら れる。これら系におけるNFATの活性は、全てCsA により薬理的に調節されること が示されている。かくして、NFATは元々Ｔ細胞特異的ファクタとして発見された が、これは後に即時型相応答活性、並びにIL-4の直接的調節のホストたり得るこ とが見出されている。 従って、NFATおよびNF-kB の拡張されたRel 群は、前−炎症性作用の阻害およ び調節に対する魅力あるターゲットとなっている。これらの多数の調節経路への 関与およびこれらが行うbZIPタンパクとの特異的相互作用を含む、かかる過程に おける決定的なその役割は、阻害に対してこれらを、魅力ある特異的ターゲット としている。TNF- αおよびIL-1プロモータ活性の検出のためのレポーター遺伝子 我々は、最小のプロモータおよび２つのIgk NF-kB サイトにより作動する、レ トロウイルスをベースとするルシフェラーゼリポータ−遺伝子系を設計した。こ こに提示される構築体において、導入された欠損Ｉは以前に報告されたものより も広範なものであった。というのは、初期の実験が、残留エンハンサー活性が一 般的に入手できる欠損構築体(Nolan，Saksela & Baltimore,末公開)中に存在す ることが示されたからである。設計されたベクターは、pSinII-luc（該構築体バ ックボーン中の残留プロモータ活性をテストするための、レトロウイルスセンス 配向にあるルシフェラーゼ遺伝子を含む）、pSinII-fosluc（pSinII lucと同等 であるが、構築体バックボーン中の残留エンハンサー活性をテストするための、 最小fos プロモータエレメントを含む）およびpSinII-2kBfosluc（NF-kB 活性に 対するリポーターとして、該fos 最小プロモータに5'近接するクローン化された 2Igk kB とpSinII-fosluc から誘導される）であった。これら３種のベクターを 1x106 7OZ/3 細胞の感染のために使用した。7OZ/3 は、元々NF-kB の初期の特徴 付けにおいて使用された、マウスpreB細胞系である。48時間後に、該感染細胞を ２つの部分（LPS で刺激する部分および末刺激部分）に分けた。６時間後に、細 胞抽出物を調製し、ルシフェラーゼ活性につきアッセイした（~104細胞の抽出液 を各点で使用した）。この結果により、SinII-luc が何も示さず、SinII-fosluc がほぼ１倍の増加を示し、またSinII-2kBfosluc が、ルシフェラーゼ活性におけ る４倍の誘導を示すことが分かった。従って、レトロウイルスをベースとするリ ポーター構築体は、天然のクロマチンにおけるNF-kB 活性を高感度で伝えるのに 使用できる。今や、リポーター遺伝子技術とエフェクタペプチドのレトロウイル ス放出とを組み合わせることが可能となった。末刺激細胞および刺激コントロー ル(未感染のSinII-luc)は、殆どまたは全く活性を示さなかった。重要なことに 、レトロウイルス放出は、他のトランスフェクション手順に関する問題である、 NF -kB 活性の有意なバックグラウンド誘発をもたらさなかった。該SinII-luc pSin II-foslucコントロールは、該構築体中に、有意の残留プロモータまたはエンハ ンサー活性を示さない。読み取りを妨害する可能性のある、内在性ゲノム遺伝子 座または内在性エンハンサー活性由来の有意なリードスルーは、検出されなかっ た。これら後者の結果は、lacZおよびフローサイトメトリーを利用した遺伝子探 索レトロウイルスを用いる以前の研究と一致している。これら研究において、ラ ンダム組み込み事象の0.1%が、該組み込まれた構築体の内在性シス-調節を示し た。 これらの構築体の設計は、Ｔ細胞、マクロファージ、および滑液細胞内のTNF- αおよびIL-1プロモータの迅速な生成およびそのテストのための基礎として利用 されるであろう。我々は、FACS−ベースアッセイのために、ルシフェラーゼの代 わりに、該lacZまたはGFP cDNAを組み込むであろう。我々は、ここで使用した該 最小プロモータの代わりに、TNF-αおよびIL-1プロモータ領域の３〜４ｋｂまで を配置するであろう。これら構築体は内在性TNF-αおよびIL-1プロモータ活性の 代用測定として使用し、またNF-kB またはNFATに並びにTNF-αおよびIL-1のシグ ナリングにとって決定的な、NF-kB またはNFATには無関係な、未知のシグナリン グ経路に作用する、我々のライブラリーからのペプチドに関する探索を可能とす るのに役立つであろう。 使用するＢ細胞系は70Z/3 である。使用すべきＴ細胞は、ヒトジャーカット細 胞である。使用すべきマクロファージ系は分泌されたIL-1のPMA 誘導に対して、 高度に応答性である、Raw 309 およびP388D1系である。使用すべき滑液細胞は、 HIG-82であり、これはIL-1で活性化して、メタロプロテアーゼを誘導し、かつTN Ｆ-αで活性化して、NF-kB を誘導することができる。IL-1によるメタロプロテ アーゼの誘導は、NF-kB を介してコラーゲナーゼおよびこの群の他のメタロプロ テアーゼに作用する。かくして、我々はβ-galがIKB-αと融合し、レトロウイル スを介して細胞に放出され、以下のようにIKB-αを劣化する刺激物質に応答する 。即ち、a)70Z/3 pre-B 細胞はβ-galの野性型IKB-αまたは不活性な優性の負の IKB-αとの融合体を発現するレトロウイルスで感染され、その感染効率は約30% であった。細胞を種々の時間においてLPS で刺激し、次いでFACSによるβ-galの 発 現を測定するために、FDG を担持させた。b)(a)からの細胞を、IKB-α分解の最 大LPS 誘発のために誘発させ、しかもサリチレートまたはコントロールで処理し た。サリチレートは、該優性の負のIKB-αと同じ程度に、β-gal-IKB融合体の分 解を遮断した。IKB- αの、定常状態レベルの生細胞における直接的検出 第一の研究においては、NF-kB 活性化を、上記の我々が新たに開発したIKB-α 可動リポータ系を使用して測定する。この方法において、IKB-αのN-末端は、翻 訳上、該lacZ遺伝子と融合させた。咄乳動物細胞において、β−ガラクトシダー ゼ発現は、細胞毎を基準に、蛍光活性化細胞選別装置(FACS)を使用して測定でき る。β-galとIKB-αとを結合することにより、β-galの安定性は、機能的にIKB- α依存性である。NF-kB を活性化する細胞中のシグナルはIKB の分解に導き、β -galも同様に分解される。上記のように、細胞をβ-gal−IKB-α融合体で感染さ せ、かつNF-kB の活性化に導く刺激物質により該細胞を誘発した。我々は、実時 間ベースで、また代用リポータ遺伝子を経由せずに、IKB-αを分解した細胞を識 別するために、該細胞選別装置を使用することができる。これらの系は、NF-kB 活性化の直接的な阻害剤であることが示されている、該抗−炎症性薬剤のサリチ レート（アスピリン）で処理した後に、応答性であることが明らかにされた。我 々は、このおよびＢ細胞における関連プロトコールを使用して、IKB-αの新規な 突然変異体を選別し、かつ識別シグナリングに応答する該IKB-α分子の新たな領 域を規定した（J．Caldwell & G．Nolan，未発表）。 該リポーターを担持する1x107 個の細胞を、高い効率で、ここに記載する分子 ライブラリーによって感染させる。細胞をLPS、TNF-α、IL-1またはPMA で刺激 し、次いでβ-galを分解しない細胞について、FACSによって選別するのに使用し た。該細胞の成育後、その集団を、前と同様にして再刺激し、再度保存する。細 胞は、該集団が、分解表現型の欠損に対して100%遺伝性となるまで、保存する。 挿入断片をレスキュー処理し、レトロウイルス構築体内で再クローニングし、次 いでトランス−表現型が確認されるまで、再度スクリーニングする。ペプチドは 上記したように配列決定する。NFAT 依存性経路による細胞−死の誘発を利用した、NFAT依存性の選別 我々は、我々のレトロウイルスライブラリーと共に使用可能な、細胞中におけ るNFATシグナリングの封鎖に関して選別するための系を工夫した。この系は、セ ラフィニ(Serafini)およびその共同研究者等による発見に基づいており、ここで 彼等は細胞系の死が、NFATの活性化に依存しているような、細胞系を生成するこ とができた。Ｔ細胞またはNFATの活性化物質により刺激された細胞は、NFATの活 性化およびその核への転座に導く。活性化は、該細胞の急速な死を招くような、 ジフテリア毒素Ａ遺伝子の誘発に導く。このことは、プロピジウム(Propidium) アイオダイドを使用して、細胞の生存率の尺度であることが示される。従って、 大きな集団においては、該シグナリング系を妨害するペプチドによって、NFATの 活性化が封鎖されたこれら細胞は、生存するであろう。セラフィニおよびその共 同研究者等は、Ｔ細胞シグナリングにおける突然変異体について選別する方法を 使用した。我々はこの効果の立証されたNFAT-dipA 系を、我々のペプチド選別に おいて使用する。 再度、細胞を、上記と同様に、適当なペプチドライブラリーで感染し、NFATシ グナリングの封鎖について選別した。上首尾であれば、この基本的方法は、同様 にTNF-αまたはIL-1シグナリングにも適用可能であろう。 シグナリング系の存在が予想され、その目的は前−炎症性および抗−炎症性シ グナリングを与えることにある。上記のように、例えばIL-4は細胞中のIL-6のシ グナリングを封鎖できる。グルココルチコイド発現の誘発は、IKB のアップレギ ュレーションに導き、結果としてNF-kB の活性化を遮断する。抗−酸化剤経路の 活性化は、同様に抗−炎症性であることが周知である。サリチレートは、細胞性 オキシゲナーゼ濃度の調節を通してNF-kB を封鎖する。上に概説した該ペプチド の探索は、細胞内でのこのような経路におけるプレーヤー(players)を見出すか もしれないが、我々はこのような保護カスケードを開始させる、表面分子を探索 することを望む。 分泌されたペプチドおよび拘束されたペプチドに対する構築体中のペプチドラ イブラリーを、Ｔ細胞、マクロファージ、およびＢ細胞系で使用して、NF-kB 誘 発によるOR活性化の封鎖について選別する。刺激物質は封鎖用のTNF-αおよびIL -1を含む。活性化は、該FACSをベースとする系を「逆」に利用する。即ち、我々 は、発現がNF-kB の構成的活性化およびNF-kB リポータ構築体に導くようなペプ チドを探索する。この場合、該リポータ構築体は、lacZまたはGFP を作動させる TNF-αリポータであり得る。この構築体は、同様にlacZまたはGFP を作動させる IL-1であり得る。内在性の遺伝子座については、我々は、何れも前−炎症性応答 体であることが知られている、FACSによるIL-1シグナリング後のVCAMまたはICAM -1発現を誘発する細胞について選別できる。また、正および負の選別両者を利用 できる。拘束されたペプチドを発現する細胞については、該選別は、上記の細胞 内ペプチド同様に簡単である。該ペプチド配列の後の定義により、合成上の拘束 なしに、該ペプチドを合成する必要があり、また該拘束の不在下で該ペプチドが 作用するか否かを決定する必要がある。 分泌されたペプチドについては、該設定はより困難である。というのは、該応 答性細胞が表現型を表示する必要があり、また我々は該ペプチドをその分泌細胞 まで追跡する必要があるからである。この方法に対して、我々は読出しとして、 該ターゲット細胞中の任意のリポータ遺伝子または内在性遺伝子を使用できる。 感染すべきおよび該ペプチドを分泌する該細胞はNIH 3T3 であろう。1x107 個の 3T3 細胞を、上で概説したような全く代表的なライブラリーで感染する。感染後 の細胞は10-20 個の細胞からなるコロニーを形成することができる。この時点に おいては、培地を除去し、該細胞を、媒体中の0.25% の寒天の薄層と共に重層す る。一旦固化された、薄い、多孔性の膜を該細胞上に配置し、次いで我々はこの プレート上に、同様に0.3% 寒天中の該応答性細胞を高密度で重層する。 プレートおよび膜をインジゴブラックで標識する。このようにして、分泌生成 物は該応答性細胞に拡散できる。前−炎症性分泌ペプチドの選別に対しては、48 時間後に、応答性細胞を、該膜上の該プレートからはぎ取り、該膜／細胞／寒天 を、対応するサイズに調節されたニトロセルロース膜上に落とす。細胞を、その 場でザルコシル(Sarcosyl)または他の適当な洗浄剤により溶解し、該膜上で高濃 度塩溶液に適用し、該ニトロセルロースの下部から吸引する。このようにして、 細胞性のタンパクを、該寒天マトリックスから溶出させ、ニトロセルロースと結 合させる。次に、このニトロセルロースを、あらゆるまたは幾つかの異なる細胞 性タンパクの誘発または封鎖のために、「ウエスタン(Western)」のように処理 することができる。初期のテストでは、アッセイの感度を確認するために、β-g alまたはアルカリンホスファターゼ等の酵素を作動する、リポータ遺伝子を使用 する。我々はこのアッセイを完成したので、幾つかの内在性遺伝子座（例えば、 TNＦ-α、NF-kB p65 等）の直接的測定の提供が可能であるはずである。一旦該 膜上の細胞領域が指示されれば、これらは、該プレートおよびアラインメント(a lignment)のインジゴ標識により、該分泌細胞まで逆上って追跡できる。適当な 領域に対応する、NIH 3T3 細胞「パッチ(patches)」を、採取し、展開させ、再 テストすることができる。正のコントロールとして、IL-1またはTNF-αを発現す るウイルスを、初期スケールのモックアップを使用して、前−炎症性ペプチドに 対する検索の感度を較正する。 同様に、前−炎症性シグナリングの封鎖について検索することができる。この 場合、該応答性細胞のプレーティングの24〜36時間後において、我々は前−炎症 性のサイトカイン、例えばIL-1またはTNF-αを、該寒天層に添加する。該寒天／ 応答体は液体中で重層される。従って、このプレートは底から上部に向かって、 分泌細胞／膜／応答性細胞／重層液体となる。この前−炎症性誘発体は、迅速に 該応答性細胞層内に拡散する。抗−炎症性の分泌ペプチドの局所的存在により、 前−炎症性事象から「保護」されているこれらの細胞は、該刺激物質に応答しな い。上記のように、これらは、酵素活性に関するニトロセルロースアッセイによ って、応答体のバックグラウンドに対して検出できる。後者、即ち該ニトロセル ロース上の正のバックグラウンドに対する「ホール」についての探索は、前−炎 症性事象の阻害剤に関するスクリーニングのために利用できる。正のコントロー ルとして、IL-4を発現するウイルスを、初期モックアップで使用して、抗−炎症 性ペプチドに関する探索の感度を較正する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. 細胞の表現型を変更することのできる、トランスドミナント細胞内生物活性 作用物質についてスクリーニングする方法であって、該方法が a) 複数の細胞内に、ランダム化した候補核酸の分子ライブラリーを組み込む 工程と、ここで該核酸各々は異なるヌクレオチド配列を含み、 b) 該複数の細胞を、変更された表現型を呈する細胞についてスクリーニング する工程と、ここで該変更された表現型は、トランスドミナント生物活性作 用物質の存在によるものである、 を含むことを特徴とする、上記スクリーニング方法。 2. 更に、c)該変更された表現型を呈する細胞を単離する工程をも含む、請求の 範囲第１項に記載の方法。 3. 更に、d)該細胞から候補核酸を単離する工程をも含む、請求の範囲第２項に 記載の方法。 4. 更に、e)ターゲット分子を、i)候補核酸；またはii）候補核酸の発現生成物 を使用して、単離する工程を含む、請求の範囲第２または３項に記載の方法。 5. 該ランダム化した候補核酸を、該細胞内で発現させて、複数のランダム化し た候補発現生成物を生成する、請求の範囲第１項に記載の方法。 6. 該ランダム化した候補発現生成物がペプチドである、請求の範囲第５項に記 載の方法。 7. 該ランダム化した候補発現生成物が、核酸転写物である、請求の範囲第５項 に記載の方法。 8. 該核酸が、更に立体配座的に制限された形態で、該発現生成物を呈示するこ とのできる呈示配列をも含む、請求の範囲第１項に記載の方法。 9. 該導入がレトロウイルスベクターによるものである、請求の範囲第１項に記 載の方法。 10．該細胞が哺乳動物細胞である、請求の範囲第１項に記載の方法。 11．該ライブラリーが、少なくとも104 個の異なる核酸を含む、請求の範囲第１ 項に記載の方法。 12．該ライブラリーが、少なくとも105 個の異なる核酸を含む、請求の範囲第１ 項に記載の方法。 13．該ライブラリーが、少なくとも106 個の異なる核酸を含む、請求の範囲第１ 項に記載の方法。 14．該ライブラリーが、少なくとも107 個の異なる核酸を含む、請求の範囲第１ 項に記載の方法。 15．該ライブラリーが、少なくとも108 個の異なる核酸を含む、請求の範囲第１ 項に記載の方法。 16．少なくとも104 個の異なるランダム化された核酸を含むことを特徴とする、 レトロウイルスの分子ライブラリー。 17．少なくとも105 個の異なるランダム化された核酸を含む、請求の範囲第21項 に記載のレトロウイルスの分子ライブラリー。 18．少なくとも106 個の異なるランダム化された核酸を含む、請求の範囲第21項 に記載のレトロウイルスの分子ライブラリー。 19．少なくとも107 個の異なるランダム化された核酸を含む、請求の範囲第21項 に記載のレトロウイルスの分子ライブラリー。 20．少なくとも108 個の異なるランダム化された核酸を含む、請求の範囲第21項 に記載のレトロウイルスの分子ライブラリー。 21．レトロウイルス構築体の分子ライブラリーを含み、該分子ライブラリーが、 少なくとも104 個の異なるランダム化された核酸を含むことを特徴とする、哺 乳動物の細胞ライブラリー。 22．該構築体が、該細胞ゲノムに組み込まれている、請求の範囲第26項に記載の 細胞ライブラリー。
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